DE69927350T2

DE69927350T2 - Wasserlösliche paclitaxel konjugate kombiniert mit bestrahlung zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE69927350T2
Application number: DE69927350T
Authority: DE
Inventors: Chun Li; Sidney Wallace; Dong-Fang Yu; David Yang
Original assignee: PG TXL Co LP
Current assignee: PG TXL Co LP
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: US6441025B2; US20040018960A1; US20060135404A1; MY121807A; CY1105547T1; US20080153865A1; CA2303338A1; ES2249888T3; US20030130170A1; US20030073615A1; US20030130178A1; EP1598081A3; AU3455699A; TW200517105A; US20060111273A1; US20030113335A1; WO1999049901A1; DK1028756T3; US20030176320A1; US20030130341A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet pharmazeutischer Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden, speziell betrifft sie das Gebiet pharmazeutischer Präparate aus antikanzerogenen Mitteln wie Paclitaxel (Taxol^TM) und Docetaxel (Taxotere), insbesondere das Wasserlöslich-machen von Paclitaxel, indem das Arzneimittel mit wasserlöslichen Gruppen konjugiert wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Paclitaxel, ein antimikrotubuli-Mittel, das aus den Nadeln und der Borke der pazifischen Eibe, Taxus brevifolia, extrahiert wird, hat eine bemerkenswerte antineoplastische Wirkung bei menschlichem Krebs in Phase I und frühen Phasen II und III der klinischen Prüfung (Horwitz et al., 1993). Dies wurde zuerst im Zusammenhang mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs und Brustkrebs berichtet. Eine bedeutende Aktivität wurde bei kleinzelligem und nicht kleinzelligem Lungenkrebs dokumentiert, bei Kopf- und Halskrebs und bei metastasierendem Melanom. Eine wesentliche Schwierigkeit bei der Entwicklung von Paclitaxel für den Einsatz in klinischen Studien war jedoch seine Wasserunlöslichkeit.
Docetaxel wird halbsynthetisch aus 10-Deacetylbaccatin III, einem nicht cytotoxischen Vorläufer, hergestellt, der aus den Nadeln von Taxus baccata extrahiert und mit einer chemisch synthetisierten Seitenkette verestert wird (Cortes und Pazdur, 1995). Es hat sich gezeigt, dass verschiedene Krebszelllinien, umfassend Brust-, Lungen-, Eierstock- und colorektaler Krebs sowie Melanome auf Docetaxel ansprachen. In klinischen Studien wurde Docetaxel eingesetzt, um ein komplettes oder partielles Ansprechen bei Brust-, Eierstock-, Kopf- und Nackenkrebs sowie malignem Melanom zu erhalten.
Paclitaxel wird typischerweise als konzentrierte Lösung formuliert, die Paclitaxel, 6 mg pro Milliliter Cremophor EL (polyoxyethyliertes Rizinusöl) und dehydrierten Alkohol (50% v/v) enthält und vor der Verabreichung weiterhin gelöst werden muss (Goldspiel, 1994). Paclitaxel (Taxol^TM) hat eine bedeutende Wirkung bei menschlichem Krebs gezeigt, umfassend Brust-, Eierstock-, nicht kleinzelligen Lungen- und Nackenkrebs sowie Kopf und Nackenkrebs (Rowinsky und Donehower, 1995). Es hat auch eine bedeutende Wirkung bei Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs gezeigt, die mit einer Vielzahl chemotherapeutischer Mittel behandelt worden waren (Foa et al., 1994). Wie bei den meisten chemotherapeutischen Mitteln, ist jedoch die maximal tolerierte Dosis von Paclitaxel durch seine Toxizität begrenzt. Beim Menschen ist die stärkste toxische Wirkung von Paclitaxel die Granulozytopenie bei einer Dosis von 100–250 mg/m² (Holmes et al., 1995); die symptomatische periphere Neuropathie ist seine wichtigste nicht hämatologische Toxizität (Rowinsky et al., 1993).
Die Menge an Cremophor EL, die nötig ist, um die erforderliche Dosis von Paclitaxel zu verabreichen, ist bedeutend höher als die, die mit jedem anderen Arzneimittel verabreicht wurde, das in Cremophor formuliert ist. Verschiedene toxische Effekte wurden Cremophor zugeschrieben, umfassend Vasodilatation, Dyspnoe und Hypotonie. Bei dieser Trägersubstanz hat sich auch gezeigt, dass sie starke Hypersensibilität bei Labortieren und Menschen erzeugt (Weiss et al, 1990). Faktisch ist die maximale Dosis von Paclitaxel, die an Mäuse durch Bolusinjektion verabreicht werden kann, durch die akute letale Toxizität der Cremophor-Trägersubstanz bestimmt (Eiseman et al., 1994). Zudem ist bei Cremophor EL, einem Tensid, bekannt, dass es Phtalatweichmacher wie Di(2-ethylhexyl)phtalat (DEHP) aus Polyvinylchlorid-Taschen und intravenösen Verabreichungsschläu chen auswäscht. DEHP ist dafür bekannt, Hepatoxizität bei Tieren hervorzurufen und ist karzinogen bei Nagetieren. Bei diesem Präparat von Paclitaxel hat es sich auch gezeigt, dass es mit der Zeit Stoffteilchen bildet und somit während der Verabreichung eine Filtration erforderlich ist (Goldspiel, 1994). Deswegen sind spezielle Vorkehrungen für die Herstellung und Verabreichung von Paclitaxel-Lösungen zu treffen, um eine sichere Arzneimittelverabreichung an die Patienten zu sichern, und es ist unvermeidlich, dass diese Vorkehrungen höhere Kosten verursachen.
Frühere Versuche, wasserlösliches Paclitaxel zu erhalten, umfassten die Herstellung von Arzneimittelvorstufen von Paclitaxel, indem löslich machende Gruppen wie Succinat, Sulfonsäure, Aminosäuren und Phosphatderivate an die 2'-Hydroxylgruppe oder an die 7-Hydroxylposition gebracht wurden (Deutsch et al., 1989; Mathew et al., Zhao und Kingston, 1991, 1992; Nicolaou et al., 1993; Vyas et al., 1995, Rose et al., 1997). Während einige dieser Arzneimittelvorstufen eine ausreichende Wasserlöslichkeit besitzen, haben wenige eine mit dem Stammarzneimittel vergleichbare Antitumor-Wirkung (Deutsch et al., 1989; Mathew et al., 1992; Rose et al., 1997). Einige von diesen Derivaten sind aufgrund ihrer Instabilität in wässriger Lösung bei neutralem pH-Wert nicht geeignet für i.v.-Injektion. Zum Beispiel berichten Deutsch et al. (1989) von einem 2'-Succinatderivat von Paclitaxel, wobei aber die Wasserlöslichkeit des Natriumsalzes nur etwa 0,1% beträgt, und die Triethanolamin- und N-Methylglucamin-Salze nur zu etwa 1% löslich waren. Zudem wurde berichtet, dass Aminosäureester instabil sind. Ähnliche Ergebnisse wurden von Mathew et al. (1992) berichtet.
Kürzlich berichteten Nicolaou et al. (1993) von der Synthese und biologischen in-vitro-Beurteilung eines neuen Typs einer Arzneimittelvorstufe, die „Protaxole" genannt werden. Diese Verbindungen besitzen eine größere Wasserlöslichkeit und werden durch einen intramolekularen Hydrolysemechanismus in Paclitaxel als das aktive Arzneimittel umgewandelt. Es sind jedoch bis jetzt noch keine in-vivo-Daten hinsichtlich der Antitumor-Aktivität von Protaxolen verfügbar. Greenwald et al. berichteten von der Synthese von hoch wasserlöslichem 2'- und 7-Polyethylenglycolester von Paclitaxel (Greenwald et al., 1994). Unter Einsatz der Strategie der Polymerlinken haben andere konjugiertes wasserlösliches Polyethylenglycol (PEG)-Paclitaxel entwickelt (Li et al., 1996; Greenwald et al., 1996). Obwohl diese Konjugate eine ausgezeichnete Wasserlöslichkeit besitzen, ist ihre therapeutische Wirksamkeit nicht besser als die des freien Paclitaxels. Zudem hat PEG nur zwei reaktive funktionelle Gruppen an jedem Ende seiner Polymerkette, was die Menge an Paclitaxel deutlich reduziert, die PEG tragen könnte ( U.S. 5,362,831 ).
Weitere Versuche zur Lösung dieser Probleme umfassen die Mikroverkapselung von Paclitaxel sowohl in Liposomen als auch in Nanopartikeln (Bartoni und Boitard, 1990). Es wurde berichtet, dass die Liposom-Formulierung genauso effektiv wie freies Paclitaxel ist, es waren jedoch nur Liposom-Formulierungen physikalisch stabil, die weniger als 2% Paclitaxel enthielten (Sharma und Straubinger, 1994). Leider stellte sich heraus, dass die Nanopartikel-Formulierung toxisch war. Deswegen wird immer noch eine wasserlösliche Paclitaxel-Formulierung benötigt, die ohne die durch die Unlöslichkeit des Arzneimittels verursachten Nachteile wirkungsvolle Mengen von Paclitaxel und Docetaxel zur Verfügung stellen kann.
Ein weiteres Hindernis für den weit verbreiteten Einsatz von Paclitaxel sind die begrenzten Quellen, aus denen Paclitaxel hergestellt wird, wodurch die Paclitaxel-Therapie teuer wird. Eine Behandlungsreihe kann zum Beispiel mehrere tausend Dollar kosten. Dazu kommt der Nachteil, dass nicht alle Tumore auf die Paclitaxel-Therapie ansprechen, und das kann an dem Paclitaxel liegen, das nicht in den Tumor hinein gelangt. Deswegen besteht die sofortige Notwendigkeit, wirkungs volle Formulierungen von Paclitaxel und verwandten Arzneimitteln bereitzustellen, die wasserlöslich sind und lange Serum-Halbwertzeiten aufweisen zur Behandlung von Tumoren, Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis sowie für die Prävention der Restenose von Blutgefäßen, die zu Traumatas wie Angioplastie und Stenten führen kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt den Einsatz von Paclitaxel, Docetaxel, Etoposid, Teniposid, Camptothecin oder eines Epothilon konjugiert zu einem wasserlöslichen Polyaminosäure-Polymer, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs bereit, wobei das Medikament in Kombination mit äußerer oder innerer Bestrahlung verabreicht werden muss.
Die vorliegende Erfindung strebt danach, Nachteile im Stand der Technik zu beseitigen, indem sie Zusammensetzungen einsetzt, die ein chemotherapeutisches und/oder antiangiogenes Arzneimittel, wie Paclitaxel, Docetaxel oder weitere aufgeführte Taxoide, konjugiert zu einem wasserlöslichen Polyaminosäure-Polymer enthalten. Eine Zusammensetzung beinhaltend ein Konjugat aus Paclitaxel und Polyglutaminsäure hat überraschende Antitumoraktivität bei tierexperimentellen Modellen, und weiterhin wird diese Zusammensetzung hier als eine neue Art von Taxan vorgestellt, das pharmazeutische Eigenschaften hat, die sich von denen des Paclitexels unterscheiden. Diese Zusammensetzungen sind überraschenderweise wirkungsvoll als Antitumormittel gegen beispielhafte Tumormodelle, und es wird erwartet, dass sie mindestens so wirkungsvoll wie Paclitaxel, Docetaxel oder andere Taxoide gegen eine der Krankheiten oder Zustände sind, von denen bekannt ist, dass Taxane oder Taxoide gegen sie wirkungsvoll sind. Die Zusammensetzungen stellen wasserlösliche Taxoide bereit, um die Nachteile zu beseitigen, die mit der Unlöslichkeit der Arzneimittel selbst verbunden sind, und sie werden außerdem die Vorteile der verbesserten Wirksamkeit und geregelten Freisetzung haben, so dass Tumore bei tierexperimentellen Modellen nach einer einzigen intravenösen Verabreichung beseitigt werden können. Poly-L-Glutaminsäure-konjugiertes Paclitaxel hat das Zuführen an den Tumor verbessert und bietet eine geregelte Freisetzung.
Die hier beschriebenen Verfahren dienen üblicherweise dazu, wasserlösliche Polymerkonjugate aus therapeutischen Mitteln herzustellen. Mittel mit einer freien Hydroxylgruppe werden durch gleiche chemische Reaktionen zu den Polymeren konjugiert, wie es hier für Paclitaxel beschrieben ist. Solch eine Konjugation gehört zu den Fertigkeiten eines Fachmannes auf chemischem Gebiet und würde sich als solches im Rahmen der beanspruchten Erfindung bewegen. Jene Mittel umfassen Etoposid, Teniposid, Camptotheccin und die Epothilone. Wie hier eingesetzt, ist mit „konjugiert zu einem wasserlöslichen Polymer" die kovalente Bindung des Arzneimittels mit dem Polymer oder dem Chelator gemeint.
Es versteht sich auch, dass die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten wasserlöslichen Konjugate zusammen mit anderen Arzneimitteln, umfassend andere Antitumor- oder Antikrebsmittel, verabreicht werden können. Solche Kombinationen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Das wasserlösliche Paclitaxel, Docetaxel oder andere Taxoide, oder in bevorzugten Ausführungsformen das erfindungsgemäße Poly-L-Glutaminsäure-konjugierte Paclitaxel (PG-TXL), kann bei bestimmten Behandlungstypen mit einem Platin-Arzneimittel, einem Antitumormittel, wie zum Beispiel Doxorubicin oder Daunorubicin oder anderen Arzneimitteln kombiniert werden, die in Kombination mit Taxol^TM eingesetzt werden. Das Konjugat wird mit äußerer oder innerer Bestrahlung kombiniert, das heißt, mit Strahlung die durch eine externe Strahlungsquelle verabreicht oder die systemisch verabreicht wird, durch Injektion oder Einnahme radioaktiver Stoffe, wie einer Radioisotope enthaltenden Formulierung.
Die Konjugation chemotherapeutischer Arzneimittel zu Polymeren ist ein interessanter Ansatz, systemische Toxizität zu reduzieren und die therapeutische Breite zu verbessern. Polymere mit einer Molekülmasse größer als 30 kDa diffundieren nicht ohne weiteres durch normale Kapillaren und glomeruläres Endothelium, wodurch sie normales Gewebe vor irrelevanter, durch Arzneimittel vermittelte Toxizität schonen (Maeda und Matsumura, 1989; Reynolds, 1995). Andererseits steht fest, dass maligne Tumoren oft ein ungeordnetes kapillares Endothelium und eine größere Permeabilität als das Gefäßsystem des normalen Gewebes besitzen (Maeda und Matsumura, 1989; Fidler et al., 1987). Tumoren fehlt oft ein lymphatisches Gefäßsystem, um große Moleküle zu entfernen, die in das Tumorgewebe streuen (Maeda und Matsumura, 1989). Somit kann ein Polymer-Arzneimittelkonjugat, das normalerweise in dem Gefäßsystem bleiben würde, selektiv von den Blutgefäßen aus in die Tumore streuen, was zu einer Ansammlung von aktivem therapeutischem Arzneimittel im Tumor führt. Die wasserlöslichen Polymere, wie in bevorzugten Ausführungsformen PG-TXL, können pharmakologische Eigenschaften besitzen, die sich von den nicht konjugierten Arzneimitteln unterscheiden (das heißt Paclitaxel). Polymer-Arzneimittelkonjugate können zusätzlich als Arzneimitteldepots für eine verzögerte Freisetzung agieren, wobei sie eine Verlängerung der Exposition für Tumorzellen schaffen. Schließlich können wasserlösliche Polymere (beispielsweise, wasserlösliche Polyaminosäuren) dazu verwendet werden, die Arzneimittel zu stabilisieren sowie sonst unlösliche Verbindungen löslich zu machen. Es wurde gegenwärtig eine Varietät synthetischer und natürlicher Polymere im Hinblick auf ihre Fähigkeit untersucht, die tumorspezifische Arzneimittelabgabe zu verbessern (Kopecek, 1990, Maeda, Matsumura, 1989). Die Erfinder kennen jedoch nur wenige, die gegenwärtig einer klinischen Bewertung unterzogen werden, umfassend SMANCS in Japan und HPMA-Dox in GB (Maeda, 1991; Kopecek und Kopeckova, 1993).
In der vorliegenden Offenbarung, versteht man unter einem Taxoid jene Verbindungen, die Paclitaxele und Docetaxel und weitere chemische Substanzen umfassen, die das Taxanskelett haben (Cortes und Pazdur, 1995) und die aus natürlichen Quellen, wie der Eibe oder aus Zellkulturen, oder chemisch synthetisierten Molekülen isoliert werden können, und ein bevorzugtes Taxan ist eine Chemikalie der allgemeinen Formel C₄₇H₅₁NO₁₄, umfassend [2aR-[2aα,4β,4αβ,6β,9α(αR*,βS*),11α,12α,12aα,12bα]]-β-(Benzoylamino)-α-hydroxybenzenpropionsäure 6, 12b,bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11, 12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7,11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz-[1,2-b]oxet-9-yl-ester. Es versteht sich, dass Paclitaxel und Docetaxel gegen bestimmte Tumortypen jeweils wirkungsvoller sind als die anderen Arzneimittel und dass in der Praxis der vorliegenden Erfindung jene Tumoren, die mehr auf ein besonderes Taxoid ansprechen, mit dem wasserlöslichen Taxoid- oder Taxankonjugat behandelt würden.
Paclitaxel, Docetaxel oder die anderen Taxoide werden zu einem wasserlöslichen Polyaminosäure-Polymer konjugiert, und das Polymer wird vorzugsweise an die 2'- oder 7-Hydroxyl-Gruppe oder beide, von Paclitaxel, Docetaxel oder von anderen Taxoiden konjugiert. Polyglutaminsäure (PG) ist ein Polymer das einige Vorteile in der vorliegenden Erfindung bereitstellt. Erstens enthält es eine große Anzahl von Seitenketten-Carboxyl-funktionellen Gruppen für die Anlagerung des Arzneimittels. Zweitens kann PG durch lyosomale Enzyme auf einfache Weise zu ihrer nicht toxischen Basiskomponente, L-Glutaminsäure, D-Glutaminsäure und DL-Glutaminsäure abgebaut werden. Schließlich wurde von Natriumglutamat berichtet, dass es das Auftreten von durch Paclitaxel hervorgerufene Neuropathie verhindert und somit höhere Dosierungen von Paclitaxel ermöglicht, die toleriert werden. (Boyle et als., 1996). Bevorzugte Polymere umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Poly-L-Glutaminsäure, Poly-D-Glutaminsäure, Poly-D,L-Glutaminsäure, Poly-L-Asparaginsäure, Poly-D-Asparaginsäure, Poly-D,L-Asparaginsäure, Poly-L-Lysin, Poly-D-Lysin, Poly-D,L-Lysin, Copolymere der oben genannten Polyaminosäuren mit Polyethylenglykol, Polycaprolacton, Polyglycolsäure, Polymilchsäure sowie Poly-2-Hydroxyethyl-L-Glutamin, Chitosan, Carboxymethyldextran, Hyaluronsäure, menschliches Serumalbumin und Alginsäure, wobei Polyglutaminsäuren besonders bevorzugt sind. Am unteren Ende des Molekulargewichts haben die erfindungsgemäßen Polymere bevorzugt ein Molekulargewicht von etwa 1.000, etwa 2.000, etwa 3.000, etwa 4.000, etwa 5.000, etwa 6.000, etwa 7.000, etwa 8.000, etwa 9.000, etwa 10.000, etwa 11.000, etwa 12.000, etwa 13.000, etwa 14.000, etwa 15.000, etwa 16.000, etwa 17.000, etwa 18.000, etwa 19.000, etwa 20.000, etwa 21.000, etwa 22.000, etwa 23.000, etwa 24.000, etwa 25.000, etwa 26.000, etwa 27.000, etwa 28.000, etwa 29.000, etwa 30.000, etwa 31.000, etwa 32.000, etwa 33.000, etwa 34.000, etwa 35.000, etwa 36.000, etwa 37.000, etwa 38.000, etwa 39.000, etwa 40.000, etwa 41.000, etwa 42.000, etwa 43.000, etwa 44.000, etwa 45.000, etwa 46.000, etwa 47.000, etwa 48.000, etwa 49.000, bis etwa 50.000 kd. Am oberen Ende des Molekulargewichts haben die erfindungsgemäßen Polymere vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 51.000, etwa 52.000, etwa 53.000, etwa 54.000, etwa 55.000, etwa 56.000, etwa 57.000, etwa 58.000, etwa 59.000, etwa 60.000, etwa 61,000, etwa 62.000, etwa 63.000, etwa 64.000, etwa 65.000, etwa 66.000, etwa 67.000, etwa 68.000, etwa 69.000, etwa 70.000, etwa 71.000, etwa 72.000, etwa 73.000, etwa 74.000, etwa 75.000, etwa 76.000, etwa 77.000, etwa 78.000, etwa 79.000, etwa 80.000, etwa 81.000, etwa 82.000, etwa 83.000, etwa 84.000, etwa 85.000, etwa 86.000, etwa 87.000, etwa 88.000, etwa 89.000, etwa 90.000, etwa 91.000, etwa 92.000, etwa 93.000, etwa 94.000, etwa 95.000, etwa 96.000, etwa 97.000, etwa 98.000, etwa 99.000, bis etwa 100.000 kd. Innerhalb dieser Bereiche sind die Bereiche der Molekulargewichte für die Polymere vorzugsweise von etwa 5.000 bis etwa 100.000 kd, wobei etwa 20.000 bis etwa 80.000 bevorzugt sind, oder sogar etwa 25.000 bis etwa 50.000 besonders bevorzugt sind.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist, dass eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, wie PG-TXL auch mit einem zweiten lipophilen oder schlecht löslichen Antitumormittel wie beispielsweise Camptothecin, Epithilon, Cisplatin, Melphalan, Taxotere, Etoposid, Teniposid, Fludarabin, Verapamil oder Cyclosporin, oder sogar mit wasserlöslichen Mitteln wie 5-Fluorouracil (5 FU) oder Fluorodeoxyuridin (FUDR), Doxorubicin oder Daunomycin konjugiert werden kann.
Es versteht sich, dass die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Zusammensetzungen in einer pharmazeutisch zulässigen Trägerlösung dispergiert sein können, wie nachstehend beschrieben. Solch eine Lösung wäre steril und aseptisch und kann Wasser, Puffer, isotonische Mittel oder weitere Bestandteile enthalten, die den Fachleuten bekannt sind und die keine allergische oder andere schädliche Reaktion hervorrufen würden, wenn sie einem Tier oder einem Menschen verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann Polyethylenglykol, Polyglutaminsäuren, Polyaspartinsäuren, Polylysin oder eine chelatbildende Verbindung, vorzugsweise DTPA umfassen. Es versteht sich außerdem, dass ein Radionuklid als ein Antitumormittel oder Arzneimittel eingesetzt werden kann, und dass die vorliegende pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutische Menge eines chelatierten radioaktiven Isotops umfassen kann.
Ein Verfahren zur Behandlung von Krebs bei einer Person, umfasst das Erhalten einer Zusammensetzung enthaltend ein chemotherapeutisches Arzneimittel wie Paclitaxel, Docetaxel oder ein anderes Taxoid, konjugiert zu einem wasserlöslichen Polymer, das in einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung dispergiert wird und das Verabreichen der Lösung an die Person in einer Menge, die wirkungsvoll zur Behandlung des Tumors ist. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten Paxli taxel, Docetaxel oder andere Taxoide, die zu einer wasserlöslichen Polyaminosäure konjugiert sind, umfassend aber nicht darauf beschränkt, Poly-L-Asparaginsäure, Poly-D-Asparaginsäure oder Poly-D,L-Asparaginsäure, Poly-L-Lysinsäure, Poly-D-Lysinsäure oder Poly-DL-Lysinsäure und besonders bevorzugt Poly-L-Glutaminsäure, Poly-D-Glutaminsäure oder Poly-D,L-Glutaminsäure. Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wirkungsvoll gegen jeden Krebstyp sind, gegen den die unkonjugierten Taxoide sich als wirkungsvoll zeigen, der Krebstyp umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Brustkrebs, Eierstockkrebs, malignes Melanom, Lungenkrebs, Kopfund Nackenkrebs. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch gegen Magenkrebs, Prostatakrebs, Kolonkrebs, Leukämie oder Kaposi-Sarkom eingesetzt werden. Der hier verwendete Begriff „Behandlung" von Krebs ist so zu verstehen, dass jedes medizinische Management einer Person gemeint ist, die einen Tumor hat. Der Begriff schließt jedes Hemmen des Tumor- oder des Metastasenwachstums oder jeden Versuch, das Tumor- oder Metastasenwachstum zu hemmen, zu verlangsamen oder zu unterbinden ein. Das Verfahren umfasst das Töten einer Krebszelle durch nicht apoptotische sowie apoptotische Mechanismen des Zelltods. Das Verfahren zur Behandlung eines Tumors kann eine gewisse Schätzung der Aufnahme von Paclitaxel oder Docetaxel im Tumor vor der Verabreichung einer therapeutischen Menge des Arzneimittels umfassen, durch Verfahren, die umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind: Bolusinjektion oder Infusion sowie intraarterielle, intravenöse, intraperitoneale oder intratumorale Verabreichung des Arzneimittels.
Es versteht sich außerdem, dass die erfindungsgemäßen Taxoid- oder Taxanzusammensetzungen in Kombination mit anderen Arzneimitteln, wie einem Angiogenese Hemmer (AGM-1470) (Oliver et al., 1994) oder anderen Antikrebs-Arzneimitteln, wie Methotrexat eingesetzt werden können.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung, enthaltend Polyglutaminsäuren, die an die 2'- oder 7-Hydroxyl-Position oder an beide, von Paclitaxel, Docetaxel oder anderen Taxoiden konjugiert sind, oder sogar eine Zusammensetzung enthaltend wasserlösliche Polyaminsäuren, die an die 2'- oder 7-Hydroxyl oder beide von Paclitaxel, Docetaxel oder anderen Taxoiden konjugiert sind.
Die hier verwendeten Begriffe „eine Polyglutaminsäure" oder „Polyglutaminsäuren" umfassen Poly-L-Glutaminsäure, Poly-D-Glutaminsäure und Poly-D,L-Glutaminsäure, die Begriffe „eine Polyasparaginsäure" oder „Polyasparaginsäuren" umfassen Poly-L-Asparaginsäure, Poly-D-Asparaginsäure, Poly-D,L-Asparaginsäure, die Begriffe „ein Poly-Lysin" oder „Polylysin" umfassen Poly-L-Lysin, Poly-D,L-Lysin, und die Begriffe „eine wasserlösliche Polyaminosäure" oder „wasserlösliches Polymer von Aminosäuren" umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polylysin und Aminosäureketten, beinhaltend Mischungen aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und/oder Lysin. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Begriffe „eine wasserlösliche Polyaminosäure", „wasserlösliche Polyaminosäuren", oder „wasserlösliches Polymer von Aminosäuren" Aminosäureketten, die Kombinationen von Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure und/oder Lysin, sowohl mit der D- und/oder L -Isomerkonformation enthalten. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, enthält eine solche „wasserlösliche Polyaminosäure" eine oder mehr Glutaminsäuren, Asparaginsäuren, und/oder Lysinreste. Solche „wasserlöslichen Polyaminosäuren" können auch jede natürliche, modifizierte oder unübliche Aminosäure enthalten, die hier beschrieben ist, solange die Mehrzahl der Reste, d.h. mehr als 50%, Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure und/oder Lysin umfassen. In bestimmten Ausführungsformen wird ein wasserlösliches Polymer aus Aminosäuren, welches mehr als einen unterschiedlichen Typ von Aminosäurenrest enthält, hier manchmal als ein „Copolymer" bezeichnet.
In bestimmten Ausführungsformen können verschiedene Substitutionen natürlich vorkommender, unüblicher oder chemisch modifizierter Aminosäuren in der Aminosäurenzusammensetzung der „wasserlöslichen Polyaminosäuren" und insbesondere in den Polyglutaminsäuren durchgeführt werden, um ein erfindungsgemäßes Taxoid-Polyaminosäurenkonjugat herzustellen und trotzdem Moleküle zu erhalten, die gleiche oder anderweitige gewünschte Löslichkeitseigenschaften und/oder therapeutische Wirksamkeit haben. Eine Polyaminosäure, wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polylysin oder eine wasserlösliche Aminosäurenkette oder ein Polymer enthaltend eine Mischung aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und/oder Lysin kann an dem unteren Ende des Aminosäurensubstitutionsbereichs jeweils etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19, etwa 20, etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 24 oder etwa 25 oder mehr Glutaminsäure-, Asparaginsäure- oder Lysinreste haben, die durch jede natürlich vorkommende, modifizierte oder ungewöhnliche hier beschriebene Aminosäure substituiert sind. Bei anderen Aspekten der Erfindung kann eine Polyaminosäure wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polylysin oder eine Polyaminosäurekette, die eine Mischung von einigen dieser Aminosäuren oder von allen dreien enthält, kann am unteren Ende jeweils etwa 1%, etwa 2%, etwa 3%, etwa 4%, etwa 5%, etwa 6%, etwa 7%, etwa 8%, etwa 9%, etwa 10%, etwa 11%, etwa 12%, etwa 13%, etwa 14%, etwa 15%, etwa 16%, etwa 17%, etwa 18%, etwa 19%, etwa 20%, etwa 21%, etwa 22%, etwa 23%, etwa 24% bis etwa 25% oder mehr Glutaminsäure-, Asparaginsäure- oder Lysinreste haben, die durch eine der hier beschriebenen, natürlich vorkommenden, modifizierten oder ungewöhnlichen Aminosäuren ersetzt sind.
Bei weiteren Aspekten der Erfindung kann eine Polyaminosäure wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure oder Polylysin am oberen Ende des Aminosäuren substitutionsbereichs jeweils etwa 25%, etwa 26%, etwa 27%, etwa 28%, etwa 29%, etwa 30%, etwa 31%, etwa 32%, etwa 33%, etwa 34%, etwa 35%, etwa 36%, etwa 37%, etwa 38%, etwa 39%, etwa 40%, etwa 41%, etwa 42%, etwa 43%, etwa 44%, etwa 45%, etwa 46%, etwa 47%, etwa 48%, etwa 49% bis etwa 50% oder so Glutaminsäure-, Asparaginsäure- oder Lysinreste haben, die durch eine der hier beschriebenen, natürlich vorkommenden, modifizierten oder ungewöhnlichen Aminosäuren ersetzt sind, solange die Mehrzahl der Reste Glutaminsäure und/oder Asparaginsäure und/oder Lysin enthält. Bei der Aminosäurensubstitution der verschiedenen wasserlöslichen Aminosäurenpolymere werden Reste mit einem Hydrophilieindex von +1 oder mehr bevorzugt.
Bei bestimmten Aspekten der Erfindung kann die Menge des Antitumor-Arzneimittels, die pro wasserlösliches Polymer konjugiert ist, variieren. Am unteren Ende kann eine solche Zusammensetzung etwa 1%, etwa 2%, etwa 3%, etwa 4%, etwa 5%, etwa 6%, etwa 7%, etwa 8%, etwa 9%, etwa 10%, etwa 11%, etwa 12%, etwa 13%, etwa 14%, etwa 15%, etwa 16%, etwa 17%, etwa 18%, etwa 19%, etwa 20%, etwa 21%, etwa 22%, etwa 23%, etwa 24%, bis etwa 25% (w/w) Antitumor-Arzneimittel relativ zur Masse des Konjugats enthalten. Am oberen Ende kann solch eine Zusammensetzung etwa 26%, etwa 27%, etwa 28%, etwa 29%, etwa 30%, etwa 31%, etwa 32%, etwa 33%, etwa 34%, etwa 35%, etwa 36%, etwa 37%, etwa 38%, etwa 39% bis etwa 40% oder mehr (w/w) Antitumor-Arzneimittel relativ zur Masse des Konjugats enthalten. Bevorzugte Antitumor-Arzneimittel umfassen Paclitaxel und Docetaxel.
Bei bestimmten weiteren Aspekten der Erfindung kann die Zahl der Moleküle des Antitumor-Arzneimittels, die pro wasserlösliches Polymer konjugiert ist, variieren. Am unteren Ende kann solch eine Zusammensetzung etwa 1, etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 11, etwa 12, etwa 13, etwa 14, etwa 15, etwa 16, etwa 17, etwa 18, etwa 19 bis etwa 20 oder mehr Moleküle des Antitumor-Arzneimittels pro Molekül wasserlösliches Polymer enthalten. Am oberen Ende kann eine solche Zusammensetzung etwa 21, etwa 22, etwa 23, etwa 24, etwa 25, etwa 26, etwa 27, etwa 28, etwa 29, etwa 30, etwa 31, etwa 32, etwa 33, etwa 34, etwa 35, etwa 36, etwa 37, etwa 38, etwa 39, etwa 40, etwa 41, etwa 42, etwa 43, etwa 44, etwa 45, etwa 46, etwa 47, etwa 48, etwa 49, etwa 50 etwa 51, etwa 52, etwa 53, etwa 54, etwa 55, etwa 56, etwa 57, etwa 58, etwa 59, etwa 60, etwa 61, etwa 62, etwa 63, etwa 64, etwa 65, etwa 66, etwa 67, etwa 68, etwa 69, etwa 70, etwa 71, etwa 72, etwa 73, etwa 74, bis etwa 75 oder mehr Moleküle oder mehr Antitumor-Arzneimittel pro Molekül wasserlösliches Polymer enthalten.
Die bevorzugte Anzahl von Antitumor-Arzneimittelmolekülen, die pro Molekül wasserlösliches Polymer konjugiert sind, beträgt etwa 7 Moleküle von Antitumor-Arzneimittel pro Molekül wasserlösliches Polymer.
Wasserlösliche Aminosäurepolymere mit verschiedenen Substitutionen von Resten, die mit Paclitaxel, Docetaxel oder weiteren Taxoiden konjugiert werden, werden als „biologisch funktionelle Äquivalente" bezeichnet. Diese „biologisch funktionellen Äquivalente" sind Teil der Definition von „wasserlösliche Polyaminosäuren", die zu Taxoiden konjugiert werden und können durch die hier beschriebenen Tests sowie durch jeden einsetzbaren Test identifiziert werden, die den Fachleuten zur Messung der verbesserten Wasserlöslichkeit relativ zu dem unkonjugierten Taxoid oder Taxoiden bekannt ist, die eingesetzt werden, um die besondere wasserlösliche Aminosäurepolyrner-Taxoid-Zusammensetzung herzustellen. Bei weiteren Aspekten der Erfindung können „biologisch funktionelle Äquivalente" von wasserlöslichen Aminosäure-Taxoidpolymeren außerdem durch verbesserte Antitumorzellaktivität relativ zur Antitumorzellaktivität des unkonjugierten wasserlöslichen Aminosäurepolymers identifiziert werden, das zur Herstellung der besonderen wasserlöslichen Aminosäurepolymer-Taxoid-Zusammensetzung durch die hier beschriebenen Tests sowie durch jeden anwendbaren Test, der dem Fachmann bekannt ist, eingesetzt wird. Der Begriff „biologisch funktionelle Äquivalente", der hier verwendet wird, um diesen Aspekt der Erfindung zu beschreiben, wird weiterhin in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung beschrieben.
Sofern nicht anderweitig definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie allgemein für einen Fachmann verständlich ist, an den sich diese Erfindung richtet. Auch sollte der hier verwendete Begriff „ein" so verstanden werden, dass er die Bedeutung „ein oder mehr" umfasst. Obwohl alle Verfahren und Materialien, die denen gleichen oder mit denen identisch sind, die hier beschrieben werden, in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nachfolgend beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A chemische Struktur von Paclitaxel.
1B chemische Struktur und Reaktionsschema für die Herstellung von PG-TXL.
2 hydrolythischer Abbau von PG-TXL wie in PBS bestimmt, in Abhängigkeit von der Zeit, bei verschiedenen pH-Werten. -♢- stellt den Prozentsatz von freigesetztem Paclitaxel dar, -o- stellt den hergestellten Metaboliten-1 dar.
3 chemische Struktur und Reaktionsschema für die Herstellung von Glutaminsäure enthaltende Polyaminosäuren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung geht aus wasserlösliche Formulierungen von Paclitaxel und Docetaxel und die überraschende Wirksamkeit dieser Formulierungen gegen Tumorzellen in vivo hervor. Poly-L-Glutaminsäure-konjugiertes Paclitaxel (PG-TXL), das Mäusen verabreicht wurde, die Eierstockkrebs (OCA-I) („Ovarian Carcinoma") hatten, führte zu einer erheblichen Verzögerung des Tumorwachstums im Vergleich zur gleichen Dosis von Paclitaxel ohne PG. Mäuse, die nur mit Paclitaxel behandelt wurden oder mit einer Kombination aus freiem Paclitaxel und PG, zeigten zunächst ein verzögertes Tumorwachstum, aber die Tumoren fingen wieder an, auf Größen zu wachsen, die vergleichbar mit einer unbehandelten Kontrollgruppe nach 10 Tagen waren. Weiterhin wurde bei der maximal tolerierten Dosis (MTD) des PG-TXL-Konjugats (160 mg Äquiv. Paclitaxel/kg) das Wachstum von Tumoren komplett unterdrückt, die Tumoren schrumpften, und die nach der Behandlung zwei Monate lang beobachteten Mäuse blieben tumorfrei (MTD: definiert als die maximale Dosis, die 15% oder weniger Körpergewichtsverlust innerhalb von zwei Wochen nach einer einzigen i.v.-Injektion produziert). In einer parallelen Studie wurde die Antitumoraktivität von PG-TXL bei Ratten mit Mammaadenokarzinom (13762F) untersucht. Wiederum wurde die komplette Ausrottung des Tumors bei 40–60 mg equiv. Paclitaxel/kg beobachtet. Diese überraschenden Ergebnisse zeigen, dass das Polymer-Arzneimittel-Konjugat PG-TXL gut eingenistete solide Tumoren sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten nach einer einzigen intravenösen Injektion ausrottet.
Zusätzlich zu den bemerkenswerten Antitumordaten (Brust, Eierstock usw.) bei gen-identischen Mäusen wurde neulich eine gute Aktivität von PG-TXL gegen menschlichen Brustkrebs (MDA-435) und Eierstockkrebs (SKOV3ip1) bei nackten Mäusen beobachtet. Nackte Mäuse sind spezielle Tiere mit einem unvollständigen Immunsystem, bei denen menschliche Tumoren wachsen können.
Die Verteilung von PG-TXL innerhalb des Plasmas unterscheidet sich von dem freien Paclitaxel. Während Paxlitaxel eine extrem kurze Zeit im Plasma von Mäusen verbleibt, scheint PG-TXL für einen viel längeren Zeitraum dort zu verbleiben. Bei näherer Betrachtung bietet dies einen klaren Vorteil dadurch, dass, wenn Tumore dem Arzneimittel länger ausgesetzt sind, dies zu einem verbesserten Ansprechverhalten führen kann. Die Umwandlungsrate von PG-TXL zu Paclitaxel ist langsam, mit weniger als 1% der Radioaktivität von radiomarkiertem PG-TXL, das als radioaktives Paclitaxel innerhalb von 48 Stunden nach der Injektion des Paxlitaxel-Polymer-Komplexes gewonnen wird. Diese Entdeckung legt nahe, dass das Arzneimittel PG-TXL in einer Weise den Tod in die Tumorzellen hineinbringen kann, die nicht einfach auf die allmähliche Freisetzung von Paclitaxel selbst beruht.
Ein weiterer Nachweis für die Wirkung von PG-TXL ist, dass kurz nach der Injektion relativ große Mengen an Radiaktivität des radiomarkierten PG-TXL in dem Tumorgewebe erscheinen. Nur geringe Mengen der Radioaktivität innerhalb des Tumorgewebes beruhen jedoch auf die Freisetzung von freiem Paclitaxel. Weiterhin nimmt der Prozentsatz der Radioaktivität innerhalb des Tumorgewebes, welcher auf Paclitaxel selbst zurückzuführen ist, nicht nennenswert zu, was wieder nahe legt, dass PG-TXL ein minimales Pro-Arzneimittel für die allmähliche Freisetzung von Paclitaxel ist. Die Aufnahme von PG-TXL gegenüber Paclitaxel wurde auch bei einem spezialisierten Zelltransportsystem beim menschlichen Colon-Adenokarzinom untersucht. Während die dem radiomarkierten PG-TXL zu geordnete Radiaoktivität sofort Zutritt in die Zellen erlangte, waren nur 10% freies Paclitaxel. Diese Daten verhalten sich parallel zu denen, die in Studien zur Gewebeverteilung gefunden wurden und legen wiederum nahe, dass es verschiedene Mechanismen oder Wege gibt, durch die PG-TXL den Tod von Krebszellen herbeiführen kann, die sich von denen von Paclitaxel unterscheiden.
In einer anderen Studie wurde entdeckt, dass frisch zubereitetes PG-TXL nicht das Wachstum von Paclitaxel-abhängigen Zelllinien unterstützt, wodurch nahe gelegt ist, dass freies Paclitaxel nur langsam aus dem Polymer-Paclitaxel-Komplex freigesetzt wird und dass der Polymer-Paclitaxel-Komplex selbst sich nicht pharmakologisch wie „Taxol^TM" verhält. Das Altern fördert den Abbau von PG-TXL und erhöht die relative Fähigkeit des entstandenen Materials, das Wachstum von Paclitaxel-abhängigen Zellen zu unterstützen, aber in einem geringeren Ausmaß verglichen mit freiem Paclitaxel.
Neueste Analysen von Tumorgeweben von Mäusen, die mit Paclitaxel behandelt wurden, legen wie erwartet nahe, dass dieses Arzneimittel die Bildung vieler apoptotischer Körper innerhalb des Tumors selbst verursacht. Die Apoptose ist ein Mechanismus, bei dem Zellen selbst-herbeugeführten Tod oder programmierten Zelltod begehen, ein natürlicher Prozess, der von einem Organismus bei der Wundheilung und bei der Gewebeumbildung verwendet wird. Tumore von Mäusen, die mit PG-TXL behandelt wurden, hatten viel weniger apoptotische Körper im Vergleich zu freiem Paclitaxel, hatten aber ein erhöhtes Auftreten von Tumornekrosen und Ödeme, was nahe legte, dass Paclitaxel und PG-TXL auf zwei deutlich unterschiedlichen Wegen zum Tumorzelltod führen können.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Inklusion von Molekülen in der polymeren Zusammensetzung, die wirkungsvoll sind, die therapeutische Zusammensetzung auf einen Krankheits- oder Tumorort oder auf ein bestimmtes Organ oder Gewebe anzusetzen. Viele solcher zielgerichteten Moleküle sind auf dem Fachgebiet bekannt und können zu den erfindungsgemäßen wasserlöslichen Antitumor-Zusammensetzungen konjugiert werden. Beispiele solcher Moleküle oder Mittel würden umfassen, wären aber nicht darauf beschränkt, Antikörper wie Antitumor-Antikörper; Antizellenrezeptor-Antikörper; gewebsspezifische Antikörper; hormonelle Mittel wie Octreotid, Estradiol und Tamoxifen; Wachstumsfaktoren; Zelloberflächenrezeptor-Liganden; Enzyme; hypoxische Mittel wie Misonidazole und Erythronitroimidazole; und antiangiogene Mittel.
Die neuen Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen erhebliche Fortschritte im Vergleich zu Verfahren und Zusammensetzungen des Standes der Technik dar, da die wasserlöslichen Paclitaxele entworfen werden, um die Wirksamkeit einer auf Paclitaxel basierenden Antikrebstherapie zu verbessern, indem wasserlösliche Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, die von wasserlöslichem Paclitaxel oder von geregelt freigesetztem Paclitaxel abgeleitet sind, die auch andere Antitumoreigenschaften als unmodifiziertes Paxlitaxel aufweisen. Bei solchen Zusammensetzungen ist es nicht nötig, Lösungsmittel einzusetzen, denen Nebenwirkungen zugeordnet werden, die bei den früheren Zusammensetzungen von Paclitaxel auftraten. Außerdem ist radiomarkiertes Paclitaxel, welches nachweislich eine Anti-Tumoraktivität beibehält, auch nützlich bei der bildlichen Darstellung von Tumoren. Weiterhin ist es durch die vorliegende Erfindung möglich, zu bestimmen, ob Paclitaxel von einem besonderen Tumor durch Szintigraphie, Single-Photon-Emissionscomputertomographie (SPECT) oder Positronenemissionstomographie (PET) aufgenommen wird. Diese Bestimmung kann dann dazu eingesetzt werden, die Wirksamkeit einer Antikrebs-Behandlung vorherzusagen. Diese Information kann hilfreich sein, indem die anwendende Fachkraft bei der Auswahl der Patienten geleitet wird, die sich einer Therapie von Chelator-Paclitaxel unterziehen.
Die Struktur von Paclitaxel ist in 1 gezeigt.
Da Modifizierungen und Änderungen in der Struktur des wasserlöslichen Polymers, wie einer wasserlöslichen Polyaminosäure der vorliegenden Erfindung, vorgenommen werden können und dennoch Moleküle erhalten werden, die die gleichen oder anderweitige wünschenswerte Eigenschaften besitzen, befinden sich auch solche „biologisch funktionellen Äquivalente" oder „funktionellen Äquivalente) im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Zum Beispiel erkennt ein Fachmann, dass in einer Polyaminosäurenstruktur bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert werden können, umfassend wasserlösliche Aminosäurenpolymere wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure oder Polylysin, ohne bemerkenswerten Verlust der interaktiven Bindungskapazität bei Strukturen wie zum Beispiel einer chemotherapeutischen und/oder einem antiangiogenen Arzneimittel wie Paclitaxel oder Docetaxel oder dergleichen. Zusätzlich können Aminosäuresubstitutionen bei einer wasserlöslichen Polyaminosäure, die zu einem chemotherapeutischen und/oder antiangiogenen Arzneimittel wie Paclitaxel oder Docetaxel oder ähnlich konjugiert ist, wie beispielhaft gezeigt durch PG-TXL, aber nicht darauf beschränkt, vorgenommen werden, und sie können immer noch Teile der pharmakologischen Eigenschaften oder alle hier offenbarten neuen pharmakologischen Eigenschaften behalten. Da es die interaktive Kapazität und die Beschaffenheit eines Proteins ist, die die biologische funktionelle Aktivität des Proteins definieren, können bestimmte Aminosäurensequenzsubstitutionen in einer Polyaminosäurensequenz gemacht werden, und man kann dennoch eine Polyaminsäure mit gleichen (agonistischen) Eigenschaften erhalten. Somit kamen die Erfinder zu dem Schluss dass verschiedene Änderungen in der Sequenz der wasserlöslichen Polyaminosäuren eines Arzneimittelkonjugats vorgenommen werden können, wie bei PG-TXL, aber ohne Be schränkung darauf, ohne bemerkenswerten Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit und Aktivität.
Was den Begriff funktionelle Äquivalente betrifft, so weiß jeder Fachmann, dass zu der Definition eines „biologisch funktionellen Äquivalents einer wasserlöslichen Polyaminosäure" das Konzept gehört, dass es eine Beschränkung für die Anzahl der Veränderungen gibt, die innerhalb eines Abschnitts des Moleküls gemacht werden können und doch zu einem Molekül mit einem einwandfreien Niveau an äquivalenter biologischer Aktivität führen. Das biologisch funktionelle Äquivalent von wasserlöslichen Polyaminosäuren wird somit hier als diejenigen wasserlöslichen Polyaminosäuren definiert, bei denen bestimmte, nicht die meisten oder alle, Aminosäuren durch nichtwasserlösliche Aminosäuren substituiert werden können, unabhängig davon ob sie natürlich, ungewöhnlich oder chemisch modifiziert sind.
Wenn insbesondere wasserlösliche Polyaminosäuren mit kürzerer Länge betroffen sind, wird in Erwägung gezogen, dass weniger Aminosäuren innerhalb des vorhandenen Peptids geschaffen werden sollten. Längere Domänen können eine Zwischenzahl von Änderungen haben. Die längsten wasserlöslichen Polyaminosäureketten, wie sie hier beschrieben werden, haben die größte Toleranz für eine große Anzahl von Änderungen. Natürlich kann eine Mehrzahl von verschiedenen wasserlöslichen Aminosäuren wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure oder Polylysin, auf die man sich jedoch nicht beschränkt, mit verschiedenen Substitutionen einfach hergestellt und erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Es versteht sich auch von selbst, dass dort, wo bestimmte Reste sich als besonders wichtig für die biologischen oder strukturellen Eigenschaften einer Polyaminosäure zeigen, können solche Reste im Allgemeinen nicht ausgetauscht werden können. Auf diese Weise werden funktionelle Äquivalente hier als jene wasserlösli chen Polyaminosäuren definiert, die einen wesentlichen Betrag ihrer nativen biologischen Aktivität bewahren.
Aminosäuresubstitutionen basieren im Allgemeinen auf die relative Gleichheit der Aminosäureseitenkettensubstituenten, zum Beispiel ihre Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und dergleichen. Eine Analyse der Größe, Gestalt und Typ der Aminosäureseitenkettensubstituenten offenbart, dass Arginin, Lysin und Histidin alle positiv geladene Reste sind; dass Alanin, Glycin und Serin alle die gleiche Größe haben; und dass Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin alle eine allgemein gleiche Form aufweisen. Auf der Basis dieser Betrachtungen werden deshalb Arginin, Lysin und Histidin; Alanin, Glycin und Serin; und Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin; hier als biologisch funktionelle Äquivalente definiert.
Um mehr quantitative Änderungen zu bewirken, kann der hydropathische-Index von Aminosäuren betrachtet werden. Jeder Aminosäure wurde auf der Basis ihrer Hydrophobie und ihren Ladungseigenschaften ein hydropathischer-Index zugeordnet, welche wie folgt sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2.5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Die Wichtigkeit des hydropathischen Aminosäureindex beim Verleihen von interaktiver biologischer Funktion an ein Protein und entsprechend an eine Polyaminosäure wird im Allgemeinen im Stand der Technik verstanden (Kyte & Doolittle, 1982, der hiermit als relevant eingeführt wird). Es ist bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert werden können, die einen gleichen hydropathischen Index oder „score" haben und noch eine gleiche biologische Aktivität bewahren. Aufgrund der durchgeführten Änderungen auf der Ba sis des hydropathischen Indexes wird die Substitution von Aminosäuren bevorzugt, deren hydropathische Indices sich innerhalb von ±2 befinden, jene, die sich innerhalb von ±1 befinden sind besonders bevorzugt und jene, innerhalb von ±0,5 sind darüber hinaus besonders bevorzugt.
Auf dem Fachgebiet versteht es sich auch von selbst, dass die Substitution gleicher Aminosäuren auf der Basis der Hydrophilie wirkungsvoll durchgeführt werden kann. Wie ausführlich im U.S.-Patent 4,554,101 erläutert, ergaben sich folgende Hydrophilie-Werte für Aminosäurereste: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,5 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4) Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Triptophan (–3,4). Bei den Änderungen auf der Basis gleicher Hydrophilie-Werte ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Werte innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, jene, die innerhalb von ±1 liegen, sind besonders bevorzugt und jene die innerhalb von ±0,5 liegen, sind darüber hinaus besonders bevorzugt. Folglich werden, bezogen auf die Hydrophilie, Arginin, Lysin, Asparaginsäure und Glutaminsäure hier als biologisch funktionelle Äquivalente definiert, insbesondere in wasserlöslichen Aminosäurepolymeren.
Zusätzlich zu den 20 „Standard"-Aminosäuren, die durch den genetischen Code zur Verfügung gestellt werden, werden auch modifizierte oder ungewöhnliche Aminosäuren für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung betrachtet. Eine Tabelle exemplarischer, aber nicht begrenzender, modifizierter oder ungewöhnlicher Aminosäuren wird nachfolgend zur Verfügung gestellt.
Tabelle 1 – Modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren
Die pharmazeutischen Präparate von Paclitaxel oder Docetaxel, die für den injektierbaren Einsatz geeignet sind, umfassen sterile Wasserlösungen oder -dispersionen und sterile Pulver für die Herstellung steriler injektierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril und fluid für die Injektion sein. Unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen muss sie stabil sein und gegen die Infektionsaktion von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen aufbewahrt werden. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmedium sein, dass beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen), deren geeignete Mischungen und Pflanzenöle enthält. Die Vorbeugung gegen die Aktion von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle Mittel und Mittel gegen Pilze erfolgen, zum Beispiel durch Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen ist es vorzuziehen, isotonische Mittel mit einzuschließen, zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid.
Sterile injektierbare Lösungen werden hergestellt, indem die aktiven Verbindungen in der vorgeschriebenen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit verschiedenen anderen oben aufgezählten Bestandteilen eingebracht wird, worauf eine Sterilfiltration folgt.
Dispersionen werden im Allgemeinen hergestellt, indem die verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in ein steriles Vehikel eingebracht werden, welches das Basis-Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile von denen enthält, die vorstehend aufgezählt wurden. Falls sterile Pulver zur Herstellung von sterilen injektierbaren Lösungen verwendet werden, sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des aktiven Bestandteils plus jeden zusätzlich gewünschten Bestandteil aus einer vorher sterilgefilterten Lösung liefern.
Wie hier eingesetzt, umfasst der „pharmazeutisch zulässige Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle Mittel und Mittel gegen Pilze und isotonische Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Außer wenn insoweit irgendein herkömmliches Medium oder Mittel inkompatibel mit dem aktiven Bestandteil ist, wird über seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen nachgedacht. Es können auch zusätzliche aktive Bestandteile in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Der Ausdruck „pharmazeutisch zulässig" bezieht sich ebenfalls auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine allergische oder ähnliche bedauerliche Reaktion verursachen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen verabreicht werden.
Für die parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung sollte beispielsweise die Lösung im Bedarfsfall in geeigneter Weise gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zuerst mit ausreichender physiologischer Kochsalzlösung oder Glukose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind besonders geeignet für die intravenöse und intraperitoneale Verabreichung. In diesem Zusammenhang sind den Fachleuten vor dem Hintergrund der vorliegenden Offenbarung sterile wässrige Medien bekannt, die eingesetzt werden können.
Die nachfolgenden Beispiele sind mit eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darzustellen. Die Fachleute sollten erkennen, dass die in den nachfolgenden Beispielen offenbarten Techniken Techniken darstellen, die von dem Erfinder entdeckt wurden, damit sie bei der Durchführung der Erfindung gut funktionieren, und sie können somit als bevorzugte Modi für die Durchführung der Erfindung angesehen werden. Vor dem Hintergrund der vorliegenden Offenbarung sollten die Fachleute jedoch erkennen, dass viele Veränderungen in den spezifischen Ausführungsformen vorgenommen werden können, die offenbart sind und dennoch ein gleiches oder dasselbe Ergebnis erhalten wird.
Beispiel 1
Polyglutaminsäure-Paclitaxel (PG-TXL)
Synthese von Polyglutaminsäure-Paclitaxel (PG-TXL)
PG wurde als ein Träger für Paclitaxel ausgewählt, weil sie leicht durch lysosomale Enzyme abgebaut werden kann, stabil im Plasma ist und ausreichend funktionelle Gruppen für die Anlagerung von Arzneimitteln enthält. Mehrere Antitumor-Arzneimittel, umfassend Adriamycin (Van Heeswijk et al., 1985; Hoes et al., 1985), Cyclophosphamid (Hirano et al., 1979), Ara-C (Kato et al., 1984) und Melphalan (Morimoto et al., 1984) wurden mit PG konjugiert. Polyasparaginsäure kann jedoch mit Antitumor-Arzneimittel unter Verwendung des hier für PG-TXL beschriebenen Reaktionschematas konjugiert werden.
Das Reaktionsschema wird in 1B veranschaulicht. Das Natriumsalz der Poly-L-Glutaminsäure) (PG) wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Bezogen auf die Viskosität hatte das Polymer ein molekulares Gewicht von 36.200 und einen Zahlenmittelwert des Molekulargewichts (M_n) von 24.000, wie durch Kleinwinkel-Laserlichtstreuung (LALLS: „low-angle laser light scattering") bestimmt wurde. Die Lot-spezifische Polydispersität (M_w/M_n) betrug 1,15, wobei M_w das Gewichtsmittel des Molekulargewichts ist. PG-Natriumsalz (MW 34 K, Sigma, 0,35 g) wurde erst in PG in seine Protonenform umgewandelt. Der pH-Wert der wässrigen Natriumsalzlösung wurde auf 2,0 unter Einsatz von 0,2 M HCl eingestellt. Der Niederschlag wurde aufgefangen, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um 0,29 g PG zu erhalten.
22 mg Paclitaxel (0,026 mmol, Molverhältnis PG/Paclitaxel = 17), 15 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,073 mmol) und ein Spurengehalt von Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden einer Lösung von PG (75 mg, Wiederholungsein heit FW 170, 0,44 mmol) in trockenem N,N-Dimethylformamid (DMF) (1,5 ml) zugefügt. Paclitaxel wurde von Hande Tech (Houston, TX) bezogen, und die Reinheit betrug 99% und mehr wie sich durch HPLC-Test bestätigte.
Die Reaktion fand 12–18 Stunden bei Zimmertemperatur statt. Die Dünnschichtchromatographie (TLC, Siliciumdioxid) zeigte eine komplette Umwandlung von Paclitaxel (Rf = 0,55) in ein Polymerkonjugat (Rf = 0, CHCl₃/MeOH = 10 : 1). Zum Stoppen der Reaktion wurde die Mischung in Chloroform gegossen. Der entstandene Niederschlag wurde aufgefangen und im Vakuum getrocknet, um 70 mg Polymer-Arzneimittelkonjugat zu erhalten. Durch Veränderung des Gewichtsverhältnisses von Paclitaxel zu PG in den Ausgangsmaterialien, können Polymerkonjugate verschiedener Paclitaxel-Konzentrationen synthetisiert werden.
Das Natriumsalz von PG-TXL-Konjugat wurde durch Auflösen des Produktes in 1,0 M NaHCO₃ erhalten. Die wässrige Lösung von PG-TXL wurde gegen destilliertes Wasser (MWCO 10.000) dialysiert, um ein niedriges Molekulargewicht aufweisende kontaminierende Substanzen und überschüssiges NaHCO₃-Salz zu entfernen. Die Lyophilisierung des Dialysats ergab 98 mg Produkt in Form eines weißen Pulvers. Der Gehalt an Paclitaxel in diesem Polymerkonjugat, bestimmt durch UV, betrug 20–22% (w/w). Ausbeute: 98% (Umwandlung in Polymergebundenes Paclitaxel, UV). Die Löslichkeit in Wasser > 20 mg Paclitaxel/ml. Ein ähnliches Verfahren kann zum Synthetisieren von PG-TXL mit höherem Gehalt an Paclitaxel eingesetzt werden (bis zu 35%) durch einfaches Erhöhen des Verhältnisses von Paclitaxel zu eingesetzter PG.
Charakterisierung von Polyglutaminsäure-Paclitaxel (PG-TXL)
Auf einem Beckman DU-70-Spektrophotometer wurden unter Verwendung der gleichen Konzentration von wässriger PG-Lösung als Referenz ultraviolette Spektren erhalten. PG-TXL zeigte die charakteristische Paclitaxel-Absorption mit λ_max-Verschiebungen von 228 bis 230 nm. Die Konzentration von Paclitaxel im PG-TXL-Konjugat wurde auf der Basis der Standardkurve bewertet, die mit bekannten Konzentrationen von Paclitaxel in Methanol bei einer Absorption von 228 nm unter der Voraussetzung erzeugt worden war, dass das Polymer-Konjugat in Wasser bei 230 nm und das freie Arzneimittel in Methanol bei 228 nm die gleiche molare Extinktion haben und beide dem Lambert-Beerschen Gesetz folgen.
Es wurden H-NMR-Spektren mit einem GE-Modell GN 500 (500 MHz)-Spektrometer in D₂O aufgenommen. Beide, sowohl die PG-Komponenten, als auch die Paclitaxel-Komponenten waren erkennbar. Die Verbindung von polymerkonjugiertem Paclitaxel wird zu schwach aufgelöst, um mit ausreichender Sorgfalt gemessen zu werden. Resonanzen bei 7,75 bis 7,36 ppm sind den aromatischen Komponenten von Paclitaxel, Resonanzen bei 6,38 ppm (C₁₀-H), 5,97 ppm (C₁₃-H), 5,63 ppm (C₂'-Hd), 5,55–5,36 ppm (C₃'-H und C₂-H, m), 5,10 ppm (C₅-H), 4,39 ppm (C₇-H), 4,10 (C₂₀-H), 1,97 ppm (OCOCH₃), und 1,18–1,20 ppm (C-CH₃) werden tendenziell den aliphatischen Komponenten von Paclitaxel zugeordnet. Andere Resonanzen wurden durch die Resonanzen von PG verdunkelt. PG-Resonanzen bei 4,27 ppm (H-α), 2,21 ppm (H-γ), und 2,04 ppm (H-β) sind in Übereinstimmung mit dem Spektrum von reiner PG. Obwohl ein Maximum bei 5,63 ppm tendenziell dem C-2'-Proton des C-2'-Esters zugeordnet werden könnte, war das C-2'-Proton von unsubstituiertem Paclitaxel bei 4,78 ppm auch vorhanden, wodurch nahe gelegt wird, dass das erhaltene Konjugat Paclitaxel-Substitutionen sowohl an der C-2'- als auch an der C7-Position enthält. Eine 100 mg/ml-Lösung des Konjugats ergibt eine klare, visköse, noch fließfähige Flüssigkeit. Durch die Prozedur wird durchweg PG-TXL-Konjugat hergestellt, das 20 Gew.-% Paclitaxel enthält, d.h. etwa 7 Paclitaxel-Moleküle sind an jeder Polymerkette gebunden.
Gel-Permeationschromatographie-Studien von Polyglutaminsäure-Paclitaxel (PG-TXL)
Das relative Molekulargewicht von PG-TXL wurde durch Gel-Permeationschromatographie (GPC) charakterisiert. Das GPC-System bestand aus zwei LDC-Modell-III-Pumpen, die mit einer Gradientenvorlage, einer PL-Gel-GPC-Kolonne und einem Waters-990-Photodiodenarray-Detektor gekoppelt waren. Das Eluierungsmittel (DMF) lief bei 1,0 ml/min mit einem Ultraviolett (UV)-Ermittlungsset bei 270 nm. Für das Natriumsalz von PG-TXL wurde eine für die Analyse von wasserlöslichem Polymer geeignete TSK-Gel-Kolonne eingesetzt, und das System wurde mit 0,2 mMol PBS (pH 6,8) bei 1,0 ml/min eluiert. Die Konjugation von Paclitaxel an PG ergab eine Zunahme des Molekulargewichts von PG-TXL, wie durch die Verschiebung der Retentionszeit von 6.4 min für PG auf 5,0 min für PG-TXL-Konjugat gezeigt. Das Rohprodukt enthielt Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht (Retentionszeit 8,0 bis 10,0 min und 11,3 min), die effektiv entfernt werden können, indem PG-TXL in sein Natriumsalz umgewandelt wird, worauf eine Dialyse folgt.
Hydrolytischer Abbau eines Polyglutaminsäure-Paclitaxel (PG-TXL)-Konjugats
Um Erkenntnisse über die Kinetik der Freisetzung von Paclitaxel und der zugeordneten molekularen Spezies von PG-TXL zu erlangen, wurde die hydrolitische Stabilität von PG-TXL in PBS bei verschiedenen pH-Werten getestet. Bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) ergab sich, dass die Inkubation von PG-TXL in PBS-Lösungen Paclitaxel und verschiedene andere Arten produziert, umfassend eine, die eine größere Hydrophobie als Paclitaxel hat (Metabolit I). Die Tatsache, dass diese Arten alle von Paclitaxel abgeleitet wurden, bestätigte sich durch ähnliche Abbaustudien, in denen PG-[³H]TXL eingesetzt wurde. Basierend auf seine Retentionszeit in der HPLC ist der Metabolit-1 wahrscheinlich 7-epipaclitaxel, ein biologisch aktives Isomeres von Paclitaxel. Tatsächlich übertraf die Menge an Metabolit-1, der in PBS zurück gewonnen wurde, die von Paclitaxel nach 5 Tagen und einem Tag Inkubation jeweils bei einem pH-Wert von 7,4 und 9,5 (6). Bei einem pH-Wert von 5,5 und 7,4 zeigten die Freisetzungsprofile des Metaboliten 1 eine Kinetik in der Größenordnung von Pseudo-Null und gaben eine Verzögerungszeit an, die von 3 Tagen (pH 5,5) bis 7 Stunden (pH 7,4) variierte, wodurch nahe gelegt ist, dass der Metabolit-1 ein sekundäres Produkt ist. Offenbar ist PG-TXL in saurer stabiler Lösung als in basischer Lösung.
Beispiel 2
Synthese von Polyglutaminsäure-Camptothecin (PG-CPT)-Konjugat
Die Synthese von PG-CPT folgte einer ähnlichen Reaktion wie vorstehend für die Synthese von PG-TXL beschrieben. Es wurden 20 mg CPT (Hande Tech.), 34 mg DCC und ein Spurengehalt von DMAP als Katalysator in 80 mg PG-Polymer in 2,5 ml trockenes DMF verbracht. Nach dem Rühren bei Zimmertemperatur über Nacht wurde die Reaktionsmischung in Chloroform gegossen und der Niederschlag aufgefangen. Der getrocknete Niederschlag wurde wieder in Natriumkarbonatlösung aufgelöst, gegen 0,05 M Phosphatpuffer (pH 4,5) dialysiert, filtriert und lyophilisiert. Der Gehalt an CPT im Polymerkonjugat wurde durch ein Fluoreszenzspektrometer (Perkin-Elmer-Modell MPF-44A) bestimmt, wobei eine Emissionswellenlänge von 430 nm und eine Wellenlänge für die Anregung von 370 nm verwendet wurde. Gehalt: 2% bis 5% (w/w), Löslichkeit: > 200 mg Konjugat/ml.
Beispiel 3
Synthese von Polylysin (PL)-TXL-Konjugat (PL-TXL)
Alle zugänglichen funktionellen Aminogruppen von Polylysin (Molekulargewicht > 30.000, Sigma) werden durch die Reaktion von Polylysin mit Bernsteinsäureanhydrid, mit Glutarsäureanhydrid oder DTPA in funktionelle Carbonsäuregruppen umgewandelt. Die verbliebene nicht reagierte NH₂-Gruppe von Polylysin wird durch die Reaktion des modifizierten Polymers mit Essigsäureanhydrid blockiert. TXL, Docetaxel, andere Taxoide, Etoposid, Teniposid, Camptothecin, Epothilon oder andere Antitumor-Arzneimittel werden gemäß den vorstehend beschriebenen Methoden für die Synthese von PG-TXL zu dem sich ergebenden Polymer konjugiert.
Beispiel 4
Synthese weiterer Polyaminosäuren, die zum Konjugieren von TXL eingesetzt werden
Glutaminsäure enthaltende Polyaminosäure-Copolymere können durch Copolymerisation von N-Carboxyanhydriden (NCAs) entsprechender Aminosäuren mit γ-Benzyl-L-Glutamat NCA synthetisiert werden. Das entstandene Benzylglutamat enthaltende Copolymer wird durch Entfernen der Benzylschutzgruppe zu Glutaminsäure enthaltendes Copolymer umgewandelt (15). TXL, Docetaxel, andere Taxoide, Etopsid, Teniposid, Camptothecin, Epothilon oder weitere Antitumor-Arzneimittel werden gemäß den vorstehend beschriebenen Methoden für die Synthese von PG-TXL und PG-CPT zu dem sich ergebenden Polymer konjugiert.
Beispiel 5
Verbesserung des Tumor-Radio-Ansprechverhaltens eines Murinen Ovarialkarzinoms durch ein Poly-L-Glutaminsäure-Paclitaxel-Konjugat Einführung
Die Kombination von Chemotherapie und Strahlentherapie bei der Behandlung einer Variation von Tumoren hat eine wesentliche Verbesserung hinsichtlich des kompletten Ansprechverhaltens und der Überlebensraten gebracht (Rotman, 1992). Sowohl die in-vitro- als auch die in-vivo-Studien haben gezeigt, dass Paclitaxel das Tumor-Radio-Ansprechverhalten stark verbessern kann. In Tierstudien reichen die Verbesserungsfaktoren von 1,2 bis mehr als 2,0, in Abhängigkeit vom Tumortyp, von der Arzneimittelkonzentration und vom Dosierungsplan. Diese Studie untersuchte die Radiosensibilisierungseffekte von Poly-L-Glutaminsäure-Paclitaxel (PG-TXL).
Experimentelle Verfahren
PG-TXL wurde wie hier beschrieben, aus Poly-L-Glutaminsäure (Sigma, Viskosität, molekulares Gewicht: 31K) synthetisiert. Das Konjugat enthielt 20% Paclitaxel (w/w), das über Esterbindungen mit PG gekoppelt ist. Weibliche C3Hf/Kam-Mäuse wurden intramuskulär in das rechte Hinterbein mit 5 × 10⁵ Eierstock-OCa-1-Karzinomzellen beimpft. Sobald die Tumore 8 mm im Durchmesser erreicht hatten, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in 12 Gruppen aufgeteilt, wobei jede Gruppe aus 6–12 Mäusen bestand. Den Mäusen in den Gruppen 1–5 wurde Salzlösung, nur 14 Gy-Strahlung oder nur PG-TXL bei Dosierungen von 47,80 oder 120 mg Äq. Paclitaxel/kg gegeben. Den Mäusen in den Gruppen 6–9 wurde PG-TXL bei 47 mg Äq. Paclitaxel/kg und 14 Gy örtliche Strahlung 2, 24, 48 und 144 h nach den Behandlungen mit PG-TXL. Gruppe 10 bekam PG-TXL bei 80 mg Äq. Paclitaxel/kg und 14 Gy 24 Stunden nach der PG-TXL-Behandlung. Die Gruppen 11 und 12 bekamen PG-TX1 bei 120 mg Äq. Paclitaxel/kg und 14 Gy 24 h vor oder 24 h nach der PG-TXL-Behandlung. PG-TXL wurde in einer einzigen intravenösen Injektion verabreicht. Die örtliche Gamma-Bestrahlung des Tumors lieferte ein ¹³⁷Cs-Bestrahlungsgerät bei einer Dosisrate von 7 Gy pro Minute. Die Tumorwachstumsverzögerung wurde durch Messung von drei orthogonalen Tumordurchmessern bis die Tumore einen Durchmesser von 14 mm erreichten, bestimmt.
Ergebnisse und Diskussion
Die Radiosensibilisierungseffekte von PG-TXL waren dosisabhängig. Bei der niedrigeren PG-TXL-Dosis von 47 mg Äq Paclitaxel/kg wurde ein subadditiver Effekt beobachtet. Die durchschnittlichen Verbesserungsfaktoren variierten von 0,54 bis 0,75 in Abhängigkeit von der zeitlichen Koordinierung der Strahlungsabgabe. Es wurde jedoch ein superadditiver Effekt bei höheren Dosierungen von PG-TXL beobachtet. Die durchschnittlichen Verbesserungsfaktoren nahmen von 0,75 bis 1,8 und 4,2 zu, wenn PG-TXL 24 h vor der Bestrahlung gegeben wurde, und die PG-TXL-Dosierungen wurden von 47 auf 80 und 120 mg Äq. Paclitaxel/kg erhöht (Tabelle 7). Die subadditive Wirkung der Chemoradiation, die bei PG-TXL bei der niedrigen Dosis beobachtet wurde, könnte einer unangemessenen Zelltötung und einer schnellen Repopulation überlebender Zellen zugeschrieben werden. Bei höheren Dosierungen kann PG-TXL profunde Effekte auf die Population zyklischer Tumorzellen und/oder auf die Reoxidation haben, was zu einer wesentlichen Verbesserung der Radiosensibilisierungswirkung führt. Interessanterweise wurde ein superadditiver Effekt mit einem Verbesserungsfaktor von 4,3 beobachtet, wenn die Tumore vor der Behandlung mit PG-TXL bei 120 mg Äq. Paclitaxel/kg bei 14 Gy bestrahlt wurden (Tabelle 7). Dieses Ergebnis steht in Kontrast zu früheren Beobachtungen, dass Paclitaxel Strahlungswiderstand induziert, wenn es nach der Bestrahlung gegeben wurde (Ingram und Redpath, 1997). Tabelle 7 Die Wirkung von PG-TXL auf das Radio-Ansprechverhalten von Murinem Ovarialem OCa-1-Tumor

a. Die absolute Wachstumsverzögerung ist definiert als die Zeit in Tagen, die Tumore in behandelten Gruppen benötigen, um von 8 auf 14 mm zu wachsen minus der Zeit in Tagen, die Tumore bei mit Salzlösung behandelten Gruppen benötigen, um von 8 auf 14 mm zu wachsen.
b. Die normalisierte Wachstumsverzögerung wird als die Zeit in Tagen definiert, die Tumore benötigen, um von 8 auf 14 mm in Mäusen zu wachsen, die mit der Kombination von PG-TXL und Strahlung behandelt wurden minus der Zeit in Tagen, die Tumore benötigen, um von 8 auf 14 mm in Mäusen zu wachsen, die nur mit PG-TXL behandelt wurden.
c. Verbesserungsfaktoren werden erhalten, indem die normalisierte Wachstumsverzögerung in Mäusen, die mit PG-TXL plus Bestrahlung behandelt wurden, durch die absolute Wachstumsverzögerung bei nur mit Bestrahlung behandelten Mäusen dividiert wird.
d. Die Bestrahlung wurde 24 h vor der PG-TXL-Behandlung verabreicht. Bei allen anderen Kombinationsgruppen wurde die Bestrahlung 24 h nach der Behandlung mit PG-TXL verabreicht.
e. Daten, die auf Tumore basieren, die am Tag 120 wieder gewachsen waren. Für beide Gruppen waren die Tumore bei 2 von 6 Mäusen am Tag 120 noch nicht messbar.

Schlussfolgerung
Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass PG-TXL in Kombination mit Radiotherapie wirkungsvoll entweder vor oder nach der Bestrahlung verwendet werden kann, um die Radiosensibilisierung zu verbessern. Weiterhin legen diese Ergebnisse nahe, dass die Konjugation von Radiosensibilisierungsmittel und Antitumor-Arzneimittel an wasserlösliche Polymerträger eine verbesserte Radiosensibilisierungswirkung bieten kann. Vor dem Hintergrund der vorliegenden Offenbarungen wird ein Fachmann erkennen, dass die Dosis von PG-TXL und der anderen hier offenbarten Zusammensetzungen sowie die Bestrahlungsdosis, die entweder äußerlich oder innerlich verabreicht wird (d.h. Strahlung, die durch eine äußere Bestrahlungsquelle oder systemisch beispielsweise durch Injektion oder Aufnahme radioaktiver Materialien wie eine ein Radioisotop enthaltende Formulierung verabreicht wird) variiert werden können. Behandlungspläne und Dosierungen können bei einem Patienten auf Patientenbasis variiert werden, wobei zum Beispiel Faktoren wie das Gewicht und das Alter des Patienten, der behandelte Tumortyp, der Ernst der Krankheitssituation, frühere und/oder gleichzeitig laufende therapeutische Maßnahmen, die Art der Verabreichung und dergleichen berücksichtigt werden, die leicht durch einen Fachmann bestimmt werden können. Zum Beispiel ist festzustellen, dass ein bevorzugter Bereich von Dosierungen von PG-TXL bei etwa 0,5 × bis etwa 2 × die maximal tolerierte Dosis von TXL in äquivalenten Dosierungen von Paclitaxel liegen würde. Die verabreichte Menge an PG-TXL kann in Form von Unterdosierungen über den Verlauf der Strahlungstherapie gestreut werden. Weiterhin ist festzustellen, dass ein bevorzugter Strahlungsbereich etwa 50 bis etwa 70 Gray (Gy) sein könnte, der über etwa 5 bis etwa 7 Wochen verabreicht würde oder etwa 10 Gray pro Woche. Bevorzugte Verabreichungspläne würden das Verabreichen von PG-TXL etwa 1 bis etwa 2 Tage vor der Bestrahlung oder etwa 1 bis etwa 2 Tage nach der Bestrahlung umfassen. Pläne zum Verabreichen von PG-TXL und von anderen Polymer-Antitumor-Arzneimitteln oder Chelator-Antitumor-Zusammensetzungen können natürlich durch Festlegen von einem Fachmann zum maximalen Wohl jedes Patienten variiert und/oder wiederholt werden.
LITERATURHINWEISE

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Claims

Verwendung von Paclitaxel, Docetaxel, Etoposid, Teniposid, Camptothecin oder eines Epothilon, konjugiert zu einem wasserlöslichen Polyaminosäure-Polymer, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs, wobei das Medikament in Kombination mit äußerer oder innerer Bestrahlung verabreicht werden muss.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das konjugierte Paclitaxel, Docetaxel, Etoposid, Teniposid, Camptothecin oder Epothilon im Vergleich zum entsprechenden unkonkugierten Arzneimittel eine oder mehr Eigenschaften zunehmender Wasserlöslichkeit, Wirksamkeit und Akkumulation in einem Tumor aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Polymer ausgewählt ist aus Polyglutaminsäuren, Polyasparaginsäuren und Polylysinen.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Polymer ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 100000 Dalton hat.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Polymer ein Molekulargewicht von etwa 20000 bis etwa 80000 Dalton hat.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Polymer ein Molekulargewicht von etwa 25000 bis 50000 Dalton hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polymer eine Polyglutaminsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Konjugat etwa 1 bis etwa 40 oder mehr Gew.-% Paclitaxel, Docetaxel, Etoposid, Teniposid, Camptothecin oder eines Epothilon umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Konjugat Paclitaxel oder Docetaxel umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Medikament für einen Patienten eingesetzt wird, der Brustkrebs, Eierstockkrebs, ein malignes Melanom, Lungenkrebs, Magenkrebs, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Kopf- und Nackenkrebs; Leukämie oder ein Kaposi Sarkom hat.