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Hintergrund
der Erfindung
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Manche
Pyrrolobenzodiaziepine (PBDs) verfügen über die Fähigkeit, spezifische DNA-Sequenzen
zu erkennen und sich an diese zu binden, wobei PuGPu die bevorzugte
Sequenz darstellt. Anthramycin, das erste PBD-Antitumorantibiotikum,
wurde 1965 entdeckt (Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 5793–5796 (1965);
Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 5791–5793 (1965)). Seither ist
von einer Reihe von natürlich vorkommenden
PBDs berichtet worden, und über
10 Syntheswege für
verschiedene Analoga wurden entwickelt (Thurston et al., Chem. Rev.
433–465
(1994)). Familienmitglieder umfassen Abbeymycin (Hochlowski et al.,
J. Antibiotics 40, 145–148
(1987)), Chicamycin (Konishi et al., J. Antibiotics 34, 200–206 (1984)),
DC-81 (japanisches Patent 58–180
487; Thruston et al., Chem. Brit. 26, 767–772 (1990)); Bose et al.,
Tetrahedron 48, 751–758
(1992)), Mazethramycin (Kuminoto et al., J. Antibiotics 33, 665–667 (1980)),
Neothramycine A und B (Takeuchi et al., J. Antibiotics 29, 93–96 (1976)),
Porothramycin (Tsunakawa et al., J. Antibiotics 41, 1366–1373 (1988)),
Prothracarcin (Shimizu et al., J. Antibiotics 29, 2492–2503 (1982));
Langley und Thurston, J. Org. Chem. 52, 91–97 (1987)), Sibanomicin (DC-102)
(Hara et al., J. Antibiotics 41, 702–704 (1988)); Itoh et al.,
J. Antibiotics 41, 1581-1284 (1988)), Sibiromycin (Leber et al.,
J. Am. Chem. Soc. 110, 2992–2993
(1988)) und Tomamycin (Arima et al., J. Antibiotics 25, 437–444 (1972)).
PBDs entsprechen der folgenden allgemeinen Formel:
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Sie
unterscheiden sich hinsichtlich Anzahl, Typ und Position der Substituenten,
sowohl in Bezug auf ihre aromatischen A- und Pyrrolo-C-Ringe sowie
hinsichtlich des Sättigungsgrades
des C-Rings. Im B-Ring gibt es entweder ein Imin (N=C), ein Car binolamin
(NH-CH(OH)) oder ein Carbinolaminmethylether (NH-CH(OMe)) an der
N10-C11-Position, die das elektrophile Zentrum darstellt, das für DNA-Alkylierung
verantwortlich ist. Sämtliche
bekannte natürliche
Produkte weisen an der chiralen C11a-Position (S)-Konfiguration auf,
was ihnen, vom C-Ring aus in Richtung A-Ring gesehen, eine Rechtsdrehung
verleiht. Dies verleiht ihnen die geeignete dreidimensionale Form
für Isohelizität mit der
kleinen Furche von B-Form-DNA, wodurch ab der Bindungsstelle gute
Anpassung erzielt wird (Kohn in Antibiotics III, Springer-Verlag,
3–11,
New York (1975); Hurley und Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res.
19, 230–273
(1986)). Ihre Fähigkeit
zur Bildung eines Addukts ermöglicht
es ihnen, das DNA-Prozessing zu unterbrechen, womit sich ihre Verwendung
als Antitumormittel ergibt.
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Die
Synthese und biologische Aktivität
des ungesättigten
C2/C2'-Exo-PBD 80
(UP 2001) wurde von Gregson und Mitarbeitern berichtet (Gregson
et al., Chem. Commun. 797–798
(1999)).
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Offenbarung der Erfindung
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Ein
erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verbindung
der Formel:
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Die
Verbindung gemäß dem ersten
Aspekt ist 1,1'-[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[(11aS)-7-methoxy-2-methyliden-1,2,3,11a-tetrahydro-5H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-on,
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Ein
zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
einer im ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschriebenen
Verbindung in einem Therapieverfahren. Behandelbare Leiden umfassen Erbkrankheiten,
einschließlich
beispielsweise neoplastische Erkrankungen und Alzheimer-Krankheit,
sowie bakterielle, parasitäre
und virale Infektionen. Jedes beliebige Leiden, das durch Genexpressionsregulierung behandelbar
ist, kann mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
behandelt werden. Gemäß diesem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung können die bereitgestellten Verbindungen
an Individuen verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise
in einer "therapeutisch
wirksamen Menge",
die ausreicht, dass sich beim Patienten eine Besserung einstellt.
Eine solche Besserung kann zumindest die Verbesserung zumindest
eines Symptoms darstellen. Die tatsächlich verabreichte Menge sowie
die Häufigkeit
und der Zeitraum der Verabreichung hängen von der Art und Schwere
des Leidens ab. Die Verschreibung der Behandlung, z.B. Dosierungsanweisungen,
liegen in der Verantwortung des behandelnden Allgemeinmediziners
und anderer Ärzte.
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Eine
Verbindung kann je nach zu behandelndem Leiden allein oder in Kombination
mit anderen Behandlungen, entweder gleichzeitig oder nacheinander
verabreicht werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden
Erfindung und zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung können
zusätzlich
zum Wirkstoff, d.h. einer Verbindung gemäß dem ersten Aspekt, einen
pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, Träger, Puffer, Stabilisator oder
andere Materialien umfassen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind. Solche Materialien sollten nichttoxisch sein und die
Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht stören. Die genaue Art des Trägers oder
anderer Materialien hängt
vom Verabreichungsweg ab, der oral oder mittels Injektion, z.B.
kutan, subkutan oder intravenös, sein
kann.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-,
Pulver- oder flüssiger
Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger oder
ein Adjuvens umfassen. Flüssige
pharmazeutische Zusammensetzun gen umfassen im Allgemeinen einen
flüssigen
Träger,
wie z.B. Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische
Kochsalzlösung,
Dextrose oder andere Saccharidlösungen
oder Glykole, wie z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol
können
ebenfalls bereitgestellt sein. Eine Kapsel kann einen festen Träger, wie
z.B. Gelatine, umfassen.
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Bei
intravenösen,
kutanen oder subkutanen Injektionen oder Injektionen an der zu behandelnden
Stelle liegt der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren
wässrigen
Lösung
vor, die pyrogenfrei ist sowie geeigneten pH, geeignete Isotonie
und Stabilität
aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können unter
Verwendung von beispielsweise isotonischen Trägern, wie z.B. physiologischer
Kochsalzlösung,
Ringer-Lösung,
Ringer-Laktat, geeignete Lösungen
herstellen. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien
und/oder andere Additive können
je nach Bedarf zugesetzt werden.
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Ein
dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß dem ersten Aspekt und einen
pharmazeutisch annehmbaren Träger
oder Verdünner
enthält.
Die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen wird in Bezug
auf obigen zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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Ein
vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung
einer Verbindung gemäß dem ersten
Aspekt bereit, um ein Medikament zur Behandlung einer Erbkrankheit,
vorzugsweise einer Proliferationserkrankung, herzustellen. Die Verbindung
der Formel kann zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder
Verdünner
bereitgestellt werden. Die Verbindungen können zur selektiven Abtötung von
oxischen und hypoxischen Tumorzellen in Verfahren zur Behandlung
von Krebserkrankungen, beispielsweise Leukämien und insbesondere soliden
Krebsarten, wie z.B. Kolon-, ZNS-, Nieren- und Lungentumoren, einschließlich kleinzelliger
Bronchialkarzinome und von Melanomen, verwendet werden. Insbesondere
können Verbindungen
gemäß dem ersten
Aspekt zur selektiven Abtötung
von Lungen-, Kolon-, und ZNS-Tumoren sowie von Melanomen verwendet
werden.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung
einer Verbindung gemäß dem ersten
Aspekt zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen,
parasitären
oder bakteriellen Infektion bereit. Die Herstellung eines Medikaments
wird in Bezug auf den obigen fünften
Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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In
weiteren Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung
von Verbindungen gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung bereit.
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Im
Folgenden werden Aspekte der Erfindung unter Bezugnahme auf die
beigefügten
Zeichnungen beschrieben, worin:
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1 ein Syntheseweg für eine Verbindung der vorliegenden
Erfindung ist.
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Bevorzugte
allgemeine Synthesestrategien
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Ein
Schlüsselschritt
in einem bevorzugten Weg zu Verbindungen der vorliegenden Erfindung
ist eine Zyklisierung zur Herstellung des B-Rings, welche die Bildung
eines Aldehyds (oder eines funktionellen Äquivalents davon) an der späteren 11-Position
und einen Angriff darauf durch den Pro-N10-Stickstoff umfasst:
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In
dieser Struktur sind C-Ring-Substitutionen oder -Unsättigungen
nicht dargestellt. R8 steht in Verbindungen
der Formel IV für
O(CH2)nCH2COR'8. R10 ist eine Stickstoffschutzgruppe,
vorzugsweise mit einer Carbamatfunktionalität, die an den Stickstoff des
PBD gebunden ist. Das "maskierte
Aldehyd" -CPQ kann
ein Acetal oder Thioacetal (möglicherweise
zyklisch) sein; in diesem Fall macht die Zyklisierung eine Demaskierung erforderlich.
Alternativ dazu kann das maskierte Aldehyd ein Aldehydvor läufer, wie
z.B. der Alkohol -CHOH sein; in diesem Fall umfasst die Reaktion
eine Oxidation, z.B. mit TPAP oder DMSO (Swern-Oxidation).
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Die
maskierte Aldehydverbindung kann durch Kondensieren eines entsprechenden
2-substituierten Pyrrolidins mit einer 2-Nitrobenzoesäure hergestellt
werden:
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Die
Nitrogruppe kann anschließend
zu -NH2 reduziert und durch Umsetzung mit
einem geeigneten Reagens, z.B. eines Chlorformiats, geschützt werden,
wodurch die entfernbare Stickstoffschutzgruppe im Syntheseweg bereitgestellt
wird.
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Ein
Verfahren, welches den Oxidations-Zyklisierungsvorgang umfasst,
ist in Schema 1 veranschaulicht (eine alternative Art der Zyklisierung
wird später
unter Bezug auf Schema 2 beschrieben).
Schema
1
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Die
Imin/Carbinolamin-Bindung im PBD (A) kann durch Standardverfahren
entschützt
werden, um die gewünschte
Verbindung zu ergeben; wenn beispielsweise R10 Alloc
ist, wird das Entschützen
mittels Palladium durchgeführt,
um die N10-Schutzgruppe zu entfernen, gefolgt von Wasserabspaltung,
um das Imin zu erhalten.
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Das
Aussetzen von Alkohol (B) (worin der Pro-N-10-Stickstoff im Allgemeinen
als Carbamat geschützt ist)
gegenüber
Tetrapropylammoniumperruthenat (TPAP)/N-Methylmorpholin-N-oxid (NMO) über A4-Sieben führt zu Oxidation,
begleitet von spontanem B-Ringschluss, um das gewünschte Produkt
zu ergeben. Der TPAP/NMO-Oxidationsvorgang eignet sich insbesondere
für Reaktionen
in kleinerem Maßstab
während
sich Oxidationsverfahren auf DMSO-Basis, insbesondere Swern-Oxidationen,
für die
Arbeit im größeren Maßstab (z.B. > 1 g) besser eignen.
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Der
nichtzyklisierte Alkohol (B) kann durch Umsetzung eines Stickstoffschutzreagens
der Formel D, das vorzugsweise ein Chlorformiat oder Säurechlorid
ist, mit einer Lösung
des Aminoalkohols C, im Allgemeinen in Lösung, im Allgemeinen in Gegenwart
einer Base wie Pyridin (vorzugsweise von 2 Äquivalenten davon) bei mittlerer
Temperatur (z.B. 0 °C)
hergestellt werden. Unter diesen Bedingungen wird üblicherweise
wenig oder gar keine Acylierung beobachtet.
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Der
ausschlaggebende Aminoalkohol C kann durch Reduktion der entsprechenden
Nitroverbindung E durch Auswahl eines Verfahrens, welches das übrige Molekül intakt
lässt,
hergestellt werden. Die Behandlung von E mit Zinn(II)-chlorid in
einem geeigneten Lösungsmittel,
wie z.B. Methanol unter Rückfluss,
ergibt im Allgemeinen nach Entfernen der Zinnsalze das gewünschte Produkt
in hoher Ausbeute.
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Das
Aussetzen von E gegenüber
Hydrazin/Raney-Nickel verhindert die Bildung von Zinnsalzen und kann
zu höheren
Ausbeuten von C führen,
wobei dieses Verfahren weniger verträglich mit der Reihe von möglichen
C-Ring- und A-Ringsubstitutionen ist. Wenn beispielsweise eine C-Ring-Unsättigung
(entweder im Ring selbst oder in R2 oder
R3) gibt, ist dieses Verfahren mitunter
ungeeignet.
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Die
Nitroverbindung der Formel E kann durch Anbindung des geeigneten
o-Nitrobenzoylchlorids an eine Verbindung der Formel F, z.B. in
Gegenwart von K2CO3,
bei –25 °C unter Stickstoffatmosphäre, hergestellt werden.
Verbindungen der Formel F können
ohne weiteres beispielsweise durch Olefinierung des aus L-trans-Hydroxyprolin
abgeleiteten Ketons hergestellt werden. Das Ketonzwischenprodukt
kann auch durch Überführung in
das Enoltriflat zur Verwendung in Palladium-vermittelten Kupplungsreaktionen
genutzt werden.
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Das
o-Nitrobenzoylchlorid wird aus der o-Nitrobenzoesäure (oder
dem Alkylester nach Hydrolyse) der Formel G synthetisiert, die ihrerseits
aus dem Vanillinsäure(oder
ihrem Alkylester-) Derivat H hergestellt wird. Viele davon sind
im Handel erhältlich
und manche von Althuis, T.H. und Hess, H.J. in J. Medicinal Chem.
20(1), 146–266
(1977) offenbart.
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Alternative
Zyklisierung (Schema 2)
Schema
2
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In
Schema 1 war der letzte oder vorletzte Schritt eine oxidative Zyklisierung.
Eine Alternative mittels Thioacetalkupplung wird in Schema 2 gezeigt.
Quecksilbe-vermittelte Demaskierung verursacht Zyklisierung der
geschützten
PBD-Verbindung (A).
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Die
Thioacetalverbindung kann wie in Schema 2 gezeigt hergestellt werden:
der Thioacetal-geschützte
C-Ring [hergestellt durch ein in der Literatur beschriebenes Verfahren,
nämlich
durch das von Langley, D.R. und Thurston, D.E. in J. Organic Chemistry
52, 91–97
(1987) beschriebene Verfahren] wird durch ein in der Literatur beschriebenes
Verfahren an die o-Nitrobenzoesäure
(oder den Alkylester nach Hydrolyse) (G) gebunden. Die resultierende
Nitroverbindung kann aufgrund der Thioacetalgruppe nicht durch Hydrierung
reduziert werden, so dass zum Erhalt des Amins das Zinn(II)-chlorid-Verfahren
eingesetzt wird. Dies wird sodann, beispielsweise mit einem Chlorformiat
oder Säurechlorid,
wie z.B. 2,2,2-Trichlorethylchlorformiat, N-geschützt.
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Acetalhältige C-Ringe
können
als Alternative zu diesem Weg verwendet werden, wobei das Entschützen andere
Verfahren, einschließlich
saurer Bedingungen, umfasst. Dimersynthese(Schema
3)
Schema
3
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PBD-Dimere
können
unter Anwendung der für
die Synthese von geschützten
PBD-Monomeren entwickelten
Strategie synthetisiert werden. Die in Schema 3 veranschaulichten
Synthesewege zeigen Verbindungen, wenn der Dimerlinker die Formel
-O-(CH2)n-O- aufweist.
Die Dimerbildung wird üblicherweise
durchgeführt,
um eine Bis(nitrosäure)
G' zu bilden. Diese
Verbindung kann anschließend
als Verbindung G entweder in obigem Schema 1 oder Schema 2 behandelt
werden.
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Die
Bis(nitrosäure)
G' kann durch Nitrieren
(z.B. mit 70%iger Salpetersäure)
der Bis(carbonsäure)
erhalten werden. Diese kann durch Alkylierung von zwei Äquivalenten
der entsprechenden Benzoesäure
mit dem geeigneten Diiodalkan unter basischen Bedingungen synthetisiert
werden. Viele Benzoesäuren
sind im Handel erhältlich,
und andere können
durch herkömmliche
Verfahren synthetisiert werden. Alternativ dazu können die
entsprechenden Benzoesäureester
durch eine Mitsunobo-Veretherung mit einem geeigneten Alkandiol,
gefolgt von Nitrierung und anschließender Hydrolyse (nicht dargestellt)
miteinander verbunden werden.
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Schützen der
Pro-N10-Position auf der Komponente, die den A-Ring bildet, vor
dem Anbinden der Komponente, die den C-Ring bildet, stellt gegenüber den
oben ausgeführten
einen alternativen Syntheseansatz dar.
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Bevorzugte
Synthesestrategien für
Verbindungen
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Der
Syntheseweg aus Schema 1 ist allgemein auf die Verbindung der vorliegenden
Erfindung anwendbar.
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C2-ungesättigte PBDs
können
aus ihren N10-Carbamat-geschützten
Vorläufern
synthetisiert werden. Üblicherweise
kann Palladium-katalysierte Entfernung von Allylcarbamat angewandt
werden, um das N10-C11-Imin zu bilden, ohne die wichtige C2-Unsättigung
zu beeinträchtigen.
Alternativ dazu kann das Paar Cadmium-Blei eingesetzt werden, um
ein N10-2,2,2-Trichlorethylcarbamat vom geschützten PBD abzuspalten.
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Durch
die Reduktion der Nitroverbindung E mit Zinn(II)-chlorid wie in
Schema 1 gezeigt wird die C2-Unsättigung
beibehalten, obwohl das Isolieren des Anilins C von den Zinnsalzen
problematisch sein kann.
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Die
Verbindung der Formel F kann in ihrer TBDMS-geschützten Form
verwendet werden, weswegen ein Entschützungsschritt eingebaut werden
muss, um die Aminoalkoholverbindung E herzustellen.
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Der
TBDMS-Ether vom Typ E, der das Produkt der Kupplung der TBDMS-geschützten Verbindung
an das geeignete o-Nitrobenzoylchlorid ist, kann mit AcOH:THF:H2O (3:1:1) behandelt werden. TBAF erwies
sich als ungeeignet für
diese Umwandlung, da die Reaktionsprodukte rasch abgebaut werden.
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Verbindungen
F(II), die C-Ringe bereitstellen, können wie in Schema 4 gezeigt
erhalten werden.
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Im
Handel erhältliches
trans-4-Hydroxy-L-prolin F8 kann N-Alloc-geschützt werden, um das Allylcarbamat
F7 zu ergeben, das anschließend
unter Standardbedingungen verestert werden kann. Hydridreduktion des
Esters F6 ergibt das Diol F5. Selektive TBDMS-Schützung des
Diols ergibt einen Silylether F4, der anschließend mittels Swern- oder TPAP-Oxidation
oxidiert werden kann, um das Keton F3 bereitzustellen.
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Die
in F2 enthaltene C2-Olefinfunktionalität kann eingeführt werden,
indem mit dem Keton F3 eine Wittig-Reaktion durchgeführt wird.
Palladium-vermittelte Abspaltung der N-Alloc-Schutzgruppe (Dangles
O.; Guibé,
F.; Balavoine, G.; Lavielle, S.; Marquet, A.; J. Org. Chem. 52,
4984 (1987)) ergibt Verbindung F(II).
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Alternativer
Weg zu Verbindung C
Schema
5
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Ein
alternativer Weg zu Verbindung C ist entwickelt worden (Schema 5).
Das Amid der Formel C1 kann durch Ausbildung des Säurechlorids
einer N-Troc-geschützten
Anthranilsäure
vom C2-Typ synthetisiert werden. Interessanterweise bilden N-Troc-geschützte Anthranilsäuren keine
Isatosäureanhydride,
was Amidbildungsreaktionen mit Aminen vom F(II)-Typ ermöglicht.
Die gleichzeitige TBAF-vermittelte Abspaltung des 2,2,2-Trichlorethylcarbamats
und der TBDMS-Gruppen von C1 kann den wich- tigen Aminoalkohol C
bereitstellen.
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Alternativer
Weg
Schema
6
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Ein
linearer Weg zur Synthese der Verbindung B aus Schema 1 ist entwickelt
worden, wodurch die Herstellung der C2-ungesättigten PBDs in größerem Maßstab ermöglicht wird,
wie dies in Schema 6 gezeigt wird. Die TBAF-vermittelte Abspaltung
der TBDMS-Gruppe kann verwendet werden, um B(II) aus B1(II) herzustellen.
Die in B1(II) enthaltene wichtige C2-Unsättigung kann eingeführt werden,
indem die Wittig- Olefinierungsreaktion
mit einem Keton vom B2-Typ durchgeführt wird. Swern-Oxidation des
sekundären
Alkohols B3 kann verwendet werden, um das Keton B2 bereitzustellen.
Das Carbamat-geschützte
Anilin B3 kann in zwei Stufen aus der Nitroverbindung B5 hergestellt
werden. Zuerst kann die Nitrogruppe mittels des Raney-Nickel/Hydrazin-Verfahrens
zum Anilin reduziert werden, da einer Verbindung vom B5-Typ die
C2-Unsättigung fehlt.
Dieses Verfahren ist vorteilhafter als das Zinn(II)-chlorid-Verfahren,
da das Produkt leichter zu isolieren ist. Das Anilin B4 kann anschließend ohne
nennenswerte Carbonatbildung am C2-Sauerstoff in hoher Ausbeute
N-Carbamat-geschützt
werden.
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Ein
Amid vom B5-Typ kann durch Anbinden eines Säurechlorids vom G-Typ an das
Schlüssel-Amin KEC5
synthetisiert werden (Schema 7).
Schema
7
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Insgesamt
weist dieser Weg gegenüber
dem vorherigen mehrere Vorteile auf, was dazu führt, dass eine Herstellung
der C2/C3-endo-ungesättigten
PBDs in größerem Maßstab möglich ist.
Erstens ermöglicht katalytische
Hydrierung von KEC4 eine Herstellung des wichtigen Zwischenprodukts
KEC5 in größerem Maßstab, und
zweitens kann dieser effizientere Nitroreduktionsschritt mit einem
Zwischenprodukt durchgeführt werden,
das keine C2-Unsättigung
aufweist. Wichtig ist, dass die während der Horner-Emmons-Reaktion
beobachtete Wanderung der Doppelbindung spontan ist, so dass kein überschüssiges Natriumhydrid
erforderlich ist. Diese Wanderung der Doppelbindung ist auch von
anderen beobachtet worden (Leimgruber, W.; Batcho, A.D.; Czajkowski,
R.C., J. Am. Soc. 90, 5641 (1968)).
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Parr-Hydrierung
von KEC4 zur Abspaltung der Cbz-Schutzgruppe ermöglichte eine Synthese des wichtigen
Aminozwischenprodukts KEC5 in großem Maßstab. Der TBDMS-Ether KEC4
wurde durch selektive Silylierung des primären Alkohols KEC3 hergestellt,
was unter Verwendung von DBU als Silylüberträger erfolgte. Das Diol KEC3
wurde durch Hydridreduktion des Esters KEC2 erhalten, der seinerseits
aus der Carbonsäure
KEC1 synthetisiert wurde. N-Cbz-Schutz von trans-4-Hydroxy-L-prolin (F4) wurde
durch Anpassung eines in der Literatur beschriebenen Verfahrens
erzielt (Bridges, R. J.; Stanley, M.S.; Anderson, M.W.; Cotman, C.
W.; Chamberlain, R. A. J. Med. Chem. 34, 717 (1991)).
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Bei
der Dimersynthese können
die oben dargelegten Wege gegenüber
den allgemeinen Synthesestrategien bevorzugt verwendet werden. Insbesondere
kann die Stickstoff-Schutzgruppe vorteilhafterweise ein Carbamat
sein, da Schutzgruppen von diesem Typ in der letzten Stufe durch
eine Reihe von Verfahren entfernt werden können, die die wichtige C2-Unsättigung
im Allgemeinen nicht beeinträchtigen.
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Allgemeine
Versuchsverfahren
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Schmelzpunkte
(Fp.) wurden auf einer digitalen Schmelzpunktmessvorrichtung Gallenkamp
P1384 bestimmt und sind nicht korrigiert. Infrafrot- (IR-) Spektren
wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer-297-Spektralphotometers
aufgenommen. Die 1H- und 13C-NMR-Spektren
wurde auf einem Jeol-GSX-FT-NMR-Spektrometer mit 270 MHz, das bei
20 °C +/–1 °C betrieben
wurde, gemessen. Die chemischen Verschiebungen sind in Teilen pro
Million Teile (δ,
ppm) im Tieffeld zu Tetramethylsilan (TMS) angegeben. Die Spinmultiplizitäten werden
Folgendermaßen
beschrieben: s (Singulett), bs (breites Singulett), d (Dublett),
dd (Doppeldublett), t (Triplett), q (Quartett), p (Pentuplett) oder
m (Multiplett). Die Massenspektren (MS) wurden mit einem Jeol-JMS-DX-303-GC-Massenspektrometer
(El-Modus: 70eV, Quelle 117–147 °C) aufgezeichnet.
Die genauen Molekülmassen
(HRMS) wurden durch Peaküberein stimmung
mit Perfluorkerosin (PFK) als interner Massemarker bestimmt, und
FAB-Massenspektren
wurden aus einer Glycerin/Thioglycerin/Trifluoressigsäure- (1:1:0,1)
Matrix mit einer Sourcetemperatur von 180 °C erhalten. Optische Drehungen an
der Na-D-Linie wurde bei Umgebungstemperatur mittels Perkin-Elmer-141-Polarimeter
erhalten. Die Analysenergebnisse lagen im Allgemeinen innerhalb
von +/–0,2
% der theoretischen Werte. Flash-Chromatographie wurde mit einem
Aldrich-Flash-Chromatographen "Kieselgel-60" (E. Merck, 230–400 mesh)
durchgeführt. Dünnschichtchromatographie
(DC) wurde mittels GF254-Kieselgel (mit
Fluoreszenzindikator) auf Glasplatten durchgeführt. Sämtliche Lösungsmittel und Reagenzien
wurden, sofern nicht anders angegeben, von der Aldrich Chemical
Company Ltd. bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt, wie
sie bereitgestellt wurden. Wasserfreie Lösungsmittel durch Destillation
unter Stickstoffatmosphäre
in Gegenwart eines geeigneten Trocknungsmittels hergestellt und über 4Å-Molekularsieben
oder Natriumdraht gelagert. Petrolether bezieht sich auf die bei
40–60 °C siedende
Fraktion.
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Beispiele
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Beispiel
1: Synthese von 1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[(11aS)-7-methoxy-2
methyliden-1,2,3,11a-tetrahydro-5H-uyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-on]
(218) (siehe Fig. 1a/b)
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Herstellung des Nitrodimerkerns
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1',5'-Bis[2-methoxy-4-(methoxycarbonyl)phenoxy]pentan
(208)
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Reines
Diethylazidodicarboxylat (19,02 ml, 21,04 g, 120,8 mmol) wurde 30
Minuten lang zu einer gerührten
Lösung
von Methylvanillat (207) (20 g, 109,8 mmol) und Triphenylphosphin
(43,2 g, 164,7 mmol) in wasserfreiem THF (400 ml) zugetropft und
das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang bei 0 °C rühren gelassen. Zum kalten Reak tionsgemisch
wurde 20 Minuten lang eine Lösung
von 1,5-Pentandiol (3,83 ml, 4,03 g, 53,0 mmol) in THF (4 ml) zugetropft.
Das Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur rühren
gelassen, und das ausgefallene Produkt (208) wurde mittels Vakuumfiltration
gewonnen. Verdünnung
des Filtrats mit Methanol führte
dazu, dass weiteres Produkt (208) ausfiel. Der vereinigte Niederschlag
(12,3 g, 52 % bezogen auf Pentandiol) wurde ohne weitere Reinigung
in der nächsten
Stufe eingesetzt:
1H NMR (270 MHz,
CDCl,) δ 7.65
(dd, 2H, J = 2.01, 8.42 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 2.01 Hz), 6.87 (d,
2H, J = 8.42 Hz), 4.10 (t, 4H, J = 6.59 Hz), 3.90 (s, 6H), 3.89
(s, 6H), 2.10–1.90
(m, 4H), 1.85–1.26
(m, 2H).
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1',5'-Bis[2-methoxy-4-(methoxycarbonyl)-5-nitrophenoxy]pentan
(209)
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Festes
Kupfer(II)-nitrat-trihydrat (16,79 g, 69,5 mmol) wurde zu einer
gerührten
Lösung
des Bisesters (208) (12 g, 27,8 mmol) in Essigsäureanhydrid (73 ml) bei 0 °C langsam
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 0 °C rühren gelassen,
das Eisbad entfernt und das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur
erwärmen
gelassen; dabei trat eine leichte Exotherme auf ca. 40 °C, begleitet
von NO2-Bildung auf. Nachdem die Exotherme
nachgelassen hatte, wurde weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen und die wässrige Suspension
1 Stunde lang rühren
gelassen. Der resultierende gelbe Niederschlag wurde mittels Vakuumfiltration
gewonnen und an der Luft getrocknet, was die gewünschte Bisnitroverbindung (209)
(14,23 g, 98 %) ergab:
1H NMR (400
MHz, CDCl, + DMSO) δ 7.45
(s, 2H), 7.09 (s, 2H), 4.14 (t, 4H, J = 6.31 Hz), 3.97 (s, 6H),
3.90 (s, 6H), 2.20–1.94
(m, 4H), 1.75–1.70
(m, 2H).
-
1',5'-Bis(4-carboxy-2-methoxy-5-nitrophenoxy)pentan
(210)
-
Eine
Suspension des Esters 209 (9,0 g, 17,2 mmol) in wässrigem
Natriumhydroxid (1 M, 180 ml) und THF (180 ml) wurde rühren gelassen,
bis (nach 2 Tagen) eine homogene Lösung erhalten war. THF wurde
unter reduziertem Druck abgedampft und die resultierende wässrige Suspension
filtriert, um jegliches nichtumgesetztes Ausgangsmaterial zu entfernen.
Das Filtrat wurde auf einen pH von 1 eingestellt, das ausgefal lene Produkt
abfiltriert und luftgetrocknet, was die gewünschte Bissäure (210) (8,88 g) ergab. Aufgrund
des Einschlusses des Natriumsalzes der Säure wurde ein höhere Ausbeute
als die theoretische erzielt. Das Salz kann durch Lösen des
gesamten Materials in THF und Abfiltrieren des unlöslichen
Materials entfernt werden:
1H NMR (400
MHz, CDCl,) δ 7.39
(s, 2H), 7.16 (s, 2H), 4.12 (t, 4H, J = 6.59 Hz), 3.95 (s, 6H),
2.00–1.85
(m, 4H), 1.75–1.67
(m, 2H).
-
Zusammenstellung
des Bisketonzwischenprodukts
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[2-nitro-5-methoxy-1,4-phenylen)carbonyl]]bis[(2S,4R)-2-t-butyldimethylsilyloxymethyl-4-hydroxypyrrolidin]
(211)
-
Eine
katalytische Menge DMF (5 Tropfen) wurde zu einer gerührten Suspension
der Säure
210 (5,39 g, 10,9 mmol) und von Oxalylchlorid (3,47 g, 2,38 ml,
27,3 mmol) in wasserfreiem THF (50 ml) zugesetzt. Es wurde ein anfängliches
Aufschäumen
beobachtet, gefolgt von der Bildung einer homogenen Lösung, wobei sich
jedoch nach Rühren über Nacht
eine Suspension des neu gebildeten Säurechlorids ausgebildet hatte. Überschüssiges THF
und Oxalylchlorid wurden durch Rotationsverdampfen unter reduziertem
Druck entfernt, und das Säurechlorid
wurde in frischem THF (49 ml) resuspendiert. Die Säurechloridlösung wurde
zu einer Lösung
von (2S, 4R)-2-t-ButYldimethylsilyloxymethyl-4-hydroxypyrrolidin
(2) (6,3 g, 27,3 mmol), Triethylamin (4,42 g, 6,09 ml, 43,7 mmol)
und Wasser (1,47 ml) in THF (33 ml) bei 0 °C unter Stickstoffatmosphäre zugetropft.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen
und weitere 3 Stunden lang gerührt. Überschüssiges THF
wurde mittels Rotationsverdampfen unter reduziertem Druck entfernt
und der resultierende Rückstand
zwischen Wasser (300 ml) und Ethylacetat (300 ml) verteilt. Die
Phasen wurden sich trennen gelassen und die wässrige Phase mit Ethylacetat
(3 × 150
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden anschließend mit
Ammoniumchlorid (150 ml), gesättigtem
Natriumbicarbonat (150 ml) und Kochsalzlösung (150 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat
getrocknet. Filtration, gefolgt von Rotationsverdampfen unter reduziertem
Druck ergab das Rohprodukt als dunkles Öl. Das Rohprodukt wurde Flash-Säulenchromatographie
(3 % Methanol, 97 % Chloro form) unterzogen, und Entfernung von überschüssigem Eluens
führte
zur Isolierung von (211) (3,70 g, 37 % Ausbeute):
1H
NMR (270 MHz, CDCl,)δ 7.65
(s, 2H), 6.77 (s, 2H), 4.52 (bs, 2H), 4.40 (bs, 2H), 4.17–4.10 (m,
6H), 3.92 (s, 6H), 3.77 (d, 2H, J = 10.26 Hz), 3.32 (td, 2H, J =
4.40, 21.35 Hz), 3.08 (d, 2H, J = 11.35 Hz), 2.37–2.27 (m,
2H), 2.10–2.00
(m, 6H), 1.75–1.60
(m, 2H), 0.91 (s, 18H), 0.10 (s, 12H).
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[2-amino-5-methoxy-1,4-phenylen)carbonyl]]bis[(2S,4R)-2-t-butyldimethylsilyloxymethyl-4-hydroxypyrrolidin]
(212)
-
Eine
Methanollösung
von Hydrazinhydrat (1,25 ml, 1,29 g, 40,2 mmol Hydrazin, 20 ml Methanol)
wurde zu einer Lösung
der Bisnitroverbindung 211 (3,6 g, 3,91 mmol) in Methanol (68 ml)
zugetropft, wobei vorsichtig über
Raney-Nickel (510 mg einer dicken Aufschlämmung) rückflusserhitzt wurde. Nach
5 Minuten Rückfluss
ergab ein DC (10 % MeOH, 90 % Chloroform), dass das Ausgangsmaterial
nicht vollständig
verbraucht war. Das Reaktionsgemisch wurde mit zusätzlichem
Raney-Nickel (ca. 510 mg) und Hydrazin (1,25 ml) in Methanol (20
ml) versetzt, was zum vollständigen
Verbrauch des Ausgangsmaterials führte. Überschüssiges Raney-Nickel wurde zum
Reaktionsgemisch zugesetzt, um nichtumgesetztes Hydrazinhydrat zu
zersetzen, wonach das Reaktionsgemisch abkühlen gelassen wurde. Das Reaktionsgemisch
wurde durch Celite filtriert, um überschüssiges Raney-Nickel zu entfernen,
und das Filterkissen wurde mit zusätzlichem Methanol gewaschen
(Achtung! Raney-Nickel ist luftentzündlich; das Filterkissen sollte
nicht trocknen gelassen werden; zur Zerstörung des Nickels sollte konzentrierte
HCl verwendet werden). Das vereinigte Filtrat wurde mittels Rotationsverdampfung
unter reduziertem Druck eingedampft und der Rückstand in Dichlormethan wiedergelöst. Die
Dichlormethanlösung
wurde (zur Entfernung des zusammen mit dem Hydrazin eingeführten Wassers) über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und eingedampft, um das Produkt (212) als
Schaum (3,37 g. 91 %) zu ergeben:
1H
NMR (270 MHz, CDCl,) δ 6.69
(s, 2H); 6.24 (s, 2H), 4.40–3.40
(m, 28H), 2.40–1.60
(m, 10H), 0.88 (s, 18H), 0.03 (s, 12H).
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-dioxy)dioxy]bis[2-amino-N-allyloxycarbonyl-5-methoxy-1,4-phenylen)carbonyl]]bis[(2S,4R)-2-t-butyldimethylsilyloxymethyl-4-hydroxypyrrolidin]
(213)
-
Eine
Lösung
von Allylchlorformiat (0,806 ml, 0,916 g, 7,6 mmol) in trockenem
Dichlormethan (63 ml) wurde zu einer Lösung von Bisamin 212 (3,27
g, 3,8 mmol) und Pyridin (1,26 g, 1,29 ml, 15,9 mmol) in Dichlormethan
(128 ml) bei 0 °C
unter Stickstoffatmosphäre
zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen
und 16 Stunden lang gerührt.
Zu diesem Zeitpunkt ergab ein DC (10 % MeOH, 90 % Chloroform), dass
die Reaktion beendet war. Das Reaktionsgemisch wurde mit Dichlormethin
(40 ml) verdünnt
und mit gesättigtem
Kupfer(II)-sulfat (2 × 140
ml), Wasser (120 ml) und gesättigtem
Natriumchlorid (120 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft, was
213 als Schaum (3,60 g, 92 %) ergab:
1H
NMR(270 MHz, CDCl,) δ 8.87
(bs, 2H); 7.66 (s, 2H), 6.77 (s, 2H), 6.05–5.80 (m, 2H), 5.40–5.15 (m,
4H), 4.70–4.50
(m, 6H), 4.38 (bs, 2H), 4.20–4.00
(m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.70–3.40
(m, 8H), 2.40–2.20
(m, 2H), 2.10–1.80
(m, 6H), 1.75–1.55
(m, 2H), 0.89 (s, 18H) 0.04 (s, 12H).
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[2-amino-N-allyloxycarbonyl-5-methoxy-1,4-phenylen)carbonyl]]bis[(2S)-2-t-butyldimethylsilyloxymethyl-4-oxo-pyrrolidin]
(214)
-
Eine
Lösung
von Dimethylsulfoxid (1,47 ml, 1,62 g, 20,7 mmol) in trockenem Dichlormethan
(32 ml) wurde 45 Minuten lang zu einer gerührten Lösung von Oxalylchlorid (5,18
ml einer 2 M Lösung
in Dichlormethan, 10,35 mmol) bei –60 °C unter Stickstoffatmosphäre zugetropft.
Nach 30-minütigem
Rühren
bei –50 °C wurde eine
Lösung
des Bisalkohols 213 (3,55 g, 3,45 mmol) in Dichlormethan (53 ml) über einen
Zeitraum von 50 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde vor
dem Zutropfen einer Lösung
von Triethylamin (4,75 g, 6,54 ml, 46,9 mmol) in Dichlormethan (27
ml) 30 Minuten lang bei –60 °C rühren gelassen.
Anschließend wurde
weitere 45 Minuten lang bei –60 °C gerührt und
dann auf 0 °C
erwärmen
gelassen. Das Reaktionsge misch wurde mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt, mit
kalter 1 M HCl (2 × 100
ml) sowie gesättigtem
Natriumchlorid (100 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels
ergab das rohe Bisketon, das mittels Flash-Säulenchromatographie (50 % Ethylacetat,
50 % Petrolether (40–60 °C)) gereinigt
wurde, wodurch das reine Bisketon (214) als blassgelber Schaum (2,54
g, 72 %) erhalten wurde:
1H NMR (270
MHz, CDCl,) δ 8.69
(bs, 2H), 7.78 (s, 2H), 6.75 (s, 2H), 6.05–5.80 (m, 2H), 5.40–5.20 (m,
4H), 4.65–4.60
(m, 4H), 4.20–3.60
(m, 20H), 2.74 (dd, 2H, J = 9.25, 18.1 Hz), 2.51 (d, 2H, J = 17.4
Hz), 2.00–1.90 (m,
4H), 1.75–1.65
(m, 2H), 0.87 (s, 18H), 0.05 (s, 12H).
-
Weiterentwicklung des
Bisketons und Herstellung des Zielmoleküls
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[2-amino-N-allyloxycarbonyl-5-methoxy-1,4-phenylen)carbonyl]]bis[(2S)-2-t-butyldimethylsilyloxymethyl-4-methyliden-2,3-dihydropyrrol] (215)
-
Eine
Lösung
von Kalium-t-butoxid in trockenem THF (0,5 M, 25,2 ml, 12,6 mmol)
wurde zu einer Lösung
von Methyltriphenylphosphoniumbromid (4,50 g, 12,6 mmol) in trockenem
THF (15 ml) zugetropft. Die resultierende gelbe Ylidsuspension wurde
vor Zugabe einer Lösung
des Bisketons 214 (2,48 g, 2,42 mmol) in THF (10 ml) bei 10 °C 2 Stunden
lang bei 0 °C
rühren
gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen
und 1 weitere Stunde lang gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde zwischen Ethylacetat (100 ml) und Wasser
(100 ml) verteilt und die organische Phase mit gesättigtem
Natriumchlorid (200 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels
ergab ein braunes Öl,
das Flash-Säulenchromatographie
(50 % Ethylacetat, 50 % Petrolether (40–60 °C)) unterzogen wurde, um das
Produkt (215) als gelbes Glas (865 mg, 35 %) zu ergeben:
1H NMR (400 MHz, CDCl,) δ 8.90 (bs, 2H), 7.83 (s, 2H),
6.82 (s, 2H), 6.05–5.90
(m, 2H), 5.40–5.20
(m, 4H), 4.99 (bs, 2H), 4.91 (bs, 2H), 4.65–4.60 (m, 4H), 4.20–3.60 (m,
20H), 2.70 (bs, 4H), 2.00–1.90
(m, 4H), 1.75–1.63
(m, 2H), 0.88 (s, 18H), 0.03 (s, 12H).
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis[2-amino-N-allyloxycarbonyl-5-methoxy-1,4-phenylen)carbonyl]]bis[(2S)-2-hydroxymethyl-4-methyliden-2,3-dihydropyrrol]
(216)
-
Eine
Lösung
von TBAF (3,02 ml einer 1 M Lösung
in THF, 3,02 mmol) wurde zum Bissilylether (215) (1,23 g, 1,21 mmol)
in THF (30 ml) bei 0 °C
(Eis/Aceton) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur
erwärmen
gelassen und über
Nacht gerührt.
Am darauffolgenden Tag ergab ein DC (50:50 EtOAc/Pet-Ether (40–60 °C)), dass
das Ausgangsmaterial vollständig
verschwunden war. Es wurde gesättigtes
NH4Cl (150 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch
mit EtOAc (3 × 60
ml) extrahiert, mit gesättigtem
Natriumchlorid (150 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4),
filtriert und im Vakuum eingedampft, um ein gelbes Öl zu ergeben.
Reinigung mittels Flash-Säulenchromatographie
(97 % CHCl3 % MeOH) ergab den reinen Alkohol (216)
(916 mg, 96 %):
1H NMR (400 MHz, CDCl,) δ 8.61 (bs,
2H), 7.58 (s, 2H), 6.79 (s, 2H), 6.05–5.90 (m, 2H), 5.40–5.20 (m,
4H), 5.01 (bs, 2H), 4.93 (bs, 2H), 4.65–4.60 (m, 4H), 4.20–3.60 (m,
20H), 2.76 (dd, 2H, , J = 8.42, 15.74 Hz), 2.47 (d, 2H, J = 15.93
Hz), 2.00–1.90
(m, 4H), 1.80–1.63
(m, 2H).
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis(11S,11aS)-10-(allyloxycarbonyl)-11-hydroxy-7-methoxy-2-methyliden-1,2,3,10,11,11a-hexahydro-5H-pyrrolo[2,1-c][1,4-benzodiazepin-5-on]
(217)
-
Eine
Lösung
von Dimethylsulfoxid (0,57 ml, 0,63 g, 8,07 mmol) in trockenem Dichlormethan
(17 ml) wurde 40 Minuten lang zu einer gerührten Lösung von Oxalylchlorid (2,02
ml einer 2 M Lösung,
4,04 mmol) bei –45 °C unter Stickstoffatmosphäre zugetropft.
Das Reaktionsgemisch wurde 40 Minuten lang bei -45 °C rühren gelassen,
gefolgt von der Zugabe des Diols 216 (0,89 g, 1,12 mmol) in Dichlormethan
(17 ml) über
einen Zeitraum von 15 Minuten bei derselben Temperatur. Nach weiteren
60 Minuten wurde eine Lösung
von Triethylamin (1,31 ml, 9,42 mmol) in Dichlormethan (9 ml) 40
Minuten lang zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei –45 °C 40 Minuten
lang rühren
gelassen, bevor es 45 Minuten lang auf Raumtemperatur erwärmen gelassen wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser verdünnt, und die Phasen wurden
sich trennen gelassen. Die organische Phase wurde mit 1 M HCl (2 × 40 ml)
sowie gesättigtem
Natriumchlorid (40 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels
ergab das Rohprodukt, das mittels Flash-Säulenchromatographie (1 % Methanol,
99 % Chloroform) gereinigt wurde, um das Produkt 217 (0,175 g, 20
%) zu ergeben:
1H NMR(400 MHz, CDCl,) δ 7.22 (s,
2H), 6.65 (s, 2H), 5.82–5.70
(m, 2H), 5.58 (d, 2H, J = 9.70 Hz), 5.25–5.00 (m, 8H), 5.75–4.35 (m,
4H), 4.30 (d, 2H, J = 16.10 Hz), 4.15 (d, 2H, J = 17.03 Hz), 4.01
(t, 4H, J = 6.32 Hz), 3.90 (s, 6H), 3.64 (t, 2H, J = 8.70 Hz), 3.00–2.85 (m,
2H), 2.71 (d, 2H, J = 16.29 Hz), 2.00–1.85 (m, 4H), 1.70–1.60 (m,
2H).
-
1,1'-[[(Pentan-1,5-diyl)dioxy]bis(11aS)-7-methoxy-2-methyliden-1,2,3,11a-tetrahydro-5H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiaziepin-5-on]
(218)
-
Eine
katalytische Menge Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (13 mg,
11,2 mmol) wurde zu einer gerührten
Lösung
des Bisalloccarbinolamins (217) (170 mg, 0,22 mmol), von Triphenylphosphin
(5,7 mg, 21,6 mmol) und Pyrrolidin (31 mg, 37,3 ml, 0,45 mmol) in
DCM (13 ml) bei 0 °C
(Eis/Aceton) unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde auf Raumtemperatur erwärmen
gelassen und der Reaktionsablauf mittels DC (95 % CHCl3/MeOH)
verfolgt. Nach 2 Stunden ergab ein DC, dass die Reaktion beendet
war, wodurch ein unter UV-Licht hell fluoreszierender Punkt auftrat.
Das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck abgedampft und der resultierende Rückstand
Flashchromatographie (99 %:98 % CHCl3/MeOH)
unterzogen, was das Bisimin-Zielmolekül 218 als blassgelbes Glas
(84,5 mg, 75 %) ergab, das wiederholt unter Vakuum mit CHCl3 eingedampft wurde, um die Iminform bereitzustellen:
1H NMR (400 MHz, CDCl,) δ 7.68 (d, 2H, J = 4.39 Hz),
7.49 (s, 2H), 6.80 (s, 2H), 5.19 (bs, 2H), 5.16 (bs, 2H), 4.28 (bs,
4H), 4.15–4.00
(m, 4H), 3.92 (s, 6H), 3.90–3.80
(m, 2H), 3.12 (dd, 2H, , J = 8.97, 15.93 Hz), 2.95 (d, 2H, J = 15.93
Hz), 2.00–1.85
(m, 4H), 1.72–1.67
(m, 2H).
-
Zytotoxizitätsdaten
-
Zur
Veranschaulichung sind nachstehend die Zytotoxizitätsdaten
für 80
(UP2001) angeführt.
-
In-vitro-Zytotoxizitätsstudien
von NCI
-
Das
National Cancer Institute (NCI) in Bethesda, Maryland, USA verfügt über ein
Invitro-Zytotoxizitäts-Screeningverfahren,
das aus ungefähr
60 menschlichen Tumorzelllinien besteht, gegen welche die Verbindungen
in mindestens 5 Konzentrationen getestet werden, die sich jeweils
um den Faktor 10 unterscheiden. Dabei wird eine 48-Stunden-Daueraussetzungsvorschrift
angewandt, wonach die Lebensfähigkeit
oder das Wachstum der Zellen mit einem SRB-Proteinassay abgeschätzt wird.
-
Verfahren
-
Die
Testverbindungen wurden gegen etwa 60 menschliche Tumorzelllinien
getestet. Die NCI-Screeningverfahren wurden detailliert von Monks
und Mitarbeitern (Monks, A. et al., Journal of the National Cancer Institute
83, 757 (1991)) beschrieben. Kurz gefasst wurden Zellsuspensionen
gemäß dem jeweiligen
Zelltyp und der erwarteten Zielzelldichte verdünnt (5.000–40.000 Zellen pro Well, bezogen
auf die Zellwachstumseigenschaften) und mit Pipetten (100 μl) zu 96-Well-Mikrotiterplatten
zugesetzt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang zur Stabilisierung
bei 37 °C
vorinkubiert. Verdünnungen
mit der doppelten beabsichtigten Testkonzentration wurden zum Zeitpunkt
Null in 100-μl-Aliquoten
zu den Wells zugesetzt. Die Testverbindungen wurden in fünf 10fach-Verdünnungen
(10–4,
10–5,
10–6,
10–7 und
10–8 μM) bewertet.
Die Testverbindungen wurden 48 Stunden lang in 5%iger CO2-Atmosphäre
mit 100 % Feuchtigkeit inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit
einem Sulforhodamin-B-Test getestet. Ein Plattenleser wurde verwendet,
um die optische Dichte abzulesen, und ein Mikrocomputer rechnete
die Ablesungen in LC50-Werte um, was die
erforderliche Dosis zur Abtötung
der Hälfte
der Zellen darstellt.
-
Die
in den Beispielen 5 bis 8 angeführten
Ergebnisse sind LC50-Werte, die unter 10 μM liegen,
was als Trennlinie zwischen Zytotoxizität und Nicht-Zytotoxizität herangezogen
wird.
-
NCI-Hohlfaserassay für vorbereitende
In-vivo-Tests
-
Die
biologische Testabteilung des Developmental-Therapeutics-Programms
des NCI hat ein In-vivo-Screeninggerät zum Vortesten auf potenzielle
Antikarzinomaktivität
von Verbindungen entwickelt, die durch das großmaßstabliche In-vitro-Screeningverfahren
identifiziert wurden. Für
diese Tests werden menschliche Tumorzellen in Polyvinyliden- (PVDF-)
Hohlfasern gezüchtet,
und eine Probe jeder der Zelllinien wird in eine von zwei physiologischen
Kompartimenten (intraperitoneal und subkutan) in Mäuse implantiert.
Jede der Testmäuse
erhielt insgesamt 6 Fasern (3 intraperitoneal und 3 subkutan), die
jeweils 3 bestimmte Karzinomzelllinien darstellten. Diese Mäuse werden
mit potenziellen Antikarzinomverbindungen in jeweils 2 Testdosen über den
intraperitonealen Weg unter Verwendung eines QD × 4 Behandlungsplans behandelt.
Trägerkontrollen
bestehen aus 6 Mäusen,
die nur den Verbindungsverdünner
erhalten. Die Faserkulturen werden am Tag nach dem letzten Behandlungstag
gesammelt. Zur Untersuchung der Antikarzinomeigenschaften wird die
lebensfähige
Zellmasse für
jede der Zelllinien unter Verwendung eines Formazinfarbstoff- (MTT)
Umwandlungstests bestimmt. Daraus kann der prozentuelle T/C unter
Verwendung der mittleren optischen Dichte von Proben, die mit der
Verbindung behandelt wurden, dividiert durch die mittlere optische
Dichte der Trägerkontrollen
ermittelt werden. Zusätzlich
dazu kann die Nettozunahme der Zellmasse für jede der Proben bestimmt
werden, da eine Probe der Faserkulturen am Tag der Implantation
in Mäuse
auf lebensfähige
Zellmasse getestet wird. Somit können
die zytostatischen und zytoziden Fähigkeiten der Testverbindung überprüft werden.
-
Im
Allgemeinen wird jede der Verbindungen gegen mindestens 12 menschliche
Zelllinien getestet. Dies ergibt insgesamt 4 Versuche, da jedes
der Experimente 3 Zelllinien enthält. Die Daten werden für jede der
2 Verbindungsdosen als prozentueller T/C gegen jede der Zelllinien
angeführt,
wobei für
die intraperitonealen und subkutanen Proben getrennte Werte ermittelt
werden.
-
Die
Verbindungen werden für
weitere In-vivo-Tests in subkutanen Standard-Xenograftmodellen,
bezogen auf mehrere Hohlfasertestkriterien ausgewählt. Die
Kriterien umfassen: (1) prozentueller T/C von 50 oder weniger in
10 von 48 möglichen
Testkombinationen (12 Zelllinien × 2 Stellen × 2 Verbindungsdosen);
(2) Fernaktivität
(intraperitoneal verabreichtes Arzneimittel/subkutan verabreichte
Kultur) in zumindest 4 von 24 möglichen
Kombinationen; und/oder (3) eine Nettozellabtötung von 1 oder mehr der Zelllinien
in jeder der Implantationsstellen. Zur Vereinfachung der Bewertung
wurde ein Punktesystem entwickelt, das eine rasche Bewertung der
Aktivität
einer bestimmten Verbindung ermöglicht.
Dazu wird jeder der Verbindungsdosen ein Wert von 2 zugeteilt, was
zu einer 50%igen oder stärkeren
Reduktion der lebensfähigen
Zellmasse führt.
Die intraperitoneal und subkutan verabreichten Proben werden getrennt
bewertet, sodass die Kriterien (1) und (2) ausgewertet werden können. Verbindungen
mit einem kombinierten IP- und SC-Punktewert von 20, einem SC-Punktewert
von 8 oder einer Nettozellabtötung
von einer oder mehreren Zelllinien werden Xenograft-Tests zugewiesen.
Dieser Vergleich zeigte, dass es eine sehr geringe Wahrscheinlichkeit
gibt, dass eine aktive Verbindung übersehen wird, wenn der Hohlfasertest
als Anfangs-In-vivo-Screeningverfahren verwendet wurde. Zusätzlich zu
diesen Kriterien können
andere Faktoren (z.B. einzigartige Struktur, Wirkmechanismus) zur
Zuordnung einer Verbindung zum Xenograft-Testen führen, ohne
dass die Verbindung diesen Kriterien entspricht.
-
Menschliche Xenograft-Studien
des NCI
-
Diese
werden an athymischen Nacktmäusen
mit beeinträchtigtem
Immunsystem durchgeführt.
Das zu testende menschliche Tumorgewebe wird in ihre Körperflanken
implantiert, und während
die Kontrollmäuse keine
Behandlung erhalten, werden die anderen unterschiedlichen, intraperitoneal
verabreichten Dosen der Testverbindung ausgesetzt. Die Ergebnisse
sind als Toxizität
der Verbindung, als Ausmaß an
Tumorwachstum und als Hemmung des Wachstums ausgedrückt.
-
Beispiel 3(a): In-vitro-Zytotoxizität
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Verbindung
80 wurde der In-vitro-Zytotoxiziätsstudie
des NCI unterzogen. Die Ergebnisse (LC50; μM) sind nachstehend
angeführt.
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Das
PBD-Dimer UP2001 (80) zeigte wirksame und selektive Zytotoxizitätsaktivität gegenüber der
Lungenkarzinomzelllinie NCI-N460, der Kolonzelllinie HCC-2998, der
ZNS-Karzinomzelllinie SNB-75 und der Melanomzelllinien MALME-3M
(sehr wirksam, 0,08 μM)
und UACC-62 (sehr wirksam 0,07 μM),
was auf seine Fähigkeit,
DNA zu vernetzen, zurückführbar ist.
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Beispiel 3(b): Hohlfasertest
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Verbindung
80 wurde dem NCI-Hohlfasertest unterzogen; die Ergebnisse sind nachstehend
angeführt.
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UP2001
ist aufgrund seines kombinierten IP- und SC-Punktewerts (54), der
weit über
20 lag, wobei sein SC-Punktewert mehr als 8 betrug, ausgewählt worden.
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Beispiel 3(c): Menschliche
Xenograft-Studien
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Menschliche
Xenograft-Studien wurden auf dem UP2001 von der oben beschriebenen
biologischen Testabteilung des NCI durchgeführt.
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Athymische
Nacktmäuse
mit den MD-MB-435-Xenografts (menschlicher Brusttumor), Ovcar-3 (menschlicher
Ovarialtumor), UACC-62 (menschliches Melanom) oder OV-CAR-5 (menschlicher
Ovarialtumor) wurden mit Dosen von 0,67 (hoch), 0,45 (mittel) und
0,3 (niedrig) mg/kg/Injektion einmal alle 4 Tage insgesamt 3 mal
(6 Mäuse
pro Dosis bei 20 Kontrollmäusen)
behandelt.
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UP2001
(80) wurde durch Messung der Toxizität des Arzneimittels und dessen
Fähigkeit
zur Verlangsamung des Tumorwachstums bewertet.
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Die
Toxizität
ist durch die Anzahl an Mäusen,
die aufgrund der Behandlung starben, angegeben. % T/C stellt die
Tiefe der Tumoren in den "Test"-Mäusen (T)
(mit Greifzirkeln gemessen), verglichen mit den unbehandelten Kontrollmäusen (C),
dar und ist in Prozent angegeben. % Wachstumsverzögerung stellt
die Verlängerung
der verstrichenen Zeit dar, die erforderlich ist, damit Tumoren
eine willkürliche
Größe von 250
mg erreichen.
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In
den MDA-435-Xenograften schränkte
UP2001 das Tumorwachstum in den behandelten Mäusen auf nur 3 % des in der
Kontrollpopulation beobachteten Tumorwachstums ein. Zusätzlich dazu
wurde eine 41%ige Verlangsamung der Zeit beobachtet, in der die
Tumormasse 250 mg erreicht. Sogar bei geringer Dosis wurde eine
gewisse Toxizität
gegenüber
den Wirten beobachtet.
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Eine
gute Dosisantwort wurde für
UP2001 (80) in den Ovcar-3-Xenograften festgestellt. Bei der hohen Dosis
betrug das Tumorwachstum in den behandelten Mäusen, verglichen mit jenem
der Kontrollpopulation, lediglich 7 %. Bei der mittleren Dosis betrug
der Wert 20 %, und bei der niedrigen Dosis wiesen die Tumoren der
behandelten Mäuse
46 % der Größe der Kontrolltumoren
auf. Bei der hohen Dosis wurde eine 73%ige Wachstumsverzögerung bis
zur Erreichung einer Tumormasse von 250 mg beobachtet. Keine der
Mäuse starb durch
die Aussetzung gegenüber
UP2001 (80).
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Eine ähnliche
Dosisantwort gegenüber
Tumorwachstum wurde in den UACC-62-Xenografts für UP2001 (80) beobachtet. Bei
der hohen Dosis wiesen die behandelten Tumoren 22 % der Größe der Kontrolltumoren
auf. Bei der mittleren Dosis betrug die Größe der behandelten Tumoren
28 % jener der Kontrolltumoren, und bei der niedrigen Dosis wiesen
die behandelten Tumoren 67 % der Größe der Kontrolltumoren auf. Erneut
starb keine der Mäuse
durch Aussetzung gegenüber
UP2001 (80).
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Ergebnisse
für den
menschlichen Ovarialtumor OVCAR-5 waren weniger eindeutig; eine
etwa 50%ige Tumorgrößenreduktion
wurde beobachtet sowie eine gewisse Wachstumsverzögerung,
wobei die Aktivität
bei geringeren Konzentrationen stärker zu sein schien. Dabei
wurden jedoch durch die Aussetzzung gegenüber UP2001 (80) Mäuse getötet.
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UP2001
(80) wurde auch gegenüber
dem menschlichen ZNS-Tumor SF-295 getestet. Athymische Nacktmäuse mit
SF-295 wurden mit Dosen von 0,40, 0,27 und 0,18 mg/kg pro intravenös verabreichter
Injektion einmal täglich
insgesamt 5 mal behandelt.
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UP2001
(80) zeigte heilende Eigenschaften gegen SF-295-Xenografts. Bei
der hohen und der mittleren Dosis waren alle überlebenden Mäuse am Tag
27 des Versuchs tumorfrei. Bei der niedrigen Dosis waren 3 von 4
Mäusen
am Tag 27 tumorfrei. Eine gewisse Toxizität wurde mit der Behandlung
in Zusammenhang gebracht, da 2 Mäuse
bei der hohen Dosis, 1 bei der mittleren Dosis und zwei bei der
niedrigen Dosis starben. Die höheren
Intensitäten
des Injektionsplans können
sich durch die festgestellte höhere
Sterblichkeitsrate widerspiegeln.
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Beispiel 4: weitere Ergebnisse
für das
PBD-Dimer SJG-136 (UP2001 80)
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Die
Verbindung 80 wurde weiteren Tests unterzogen.
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Der
erste Test, der von G.B. Jones et al. in Anti-Cancer Drug Des. 5,
249 (1990) beschrieben und hierin durch Verweis aufgenommen ist,
bestimmt die Auswirkung der Testverbindung auf die DNA-Helixschmelztemperatur.
Dieser Test dient dazu, Aufschlüsse über die
Festigkeit und das Ausmaß der
Vernetzung von DNA-Strängen
durch die Testverbindung zu geben (nämlich als Maß für die Stabilisierung
der DNA nach erfolgter Ligandenbindung).
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Die
Schmelztemperatur wurde für
ein 1:5-Molverhältnis
von [Ligand]:[DNA] bestimmt, wobei die Kalbsthymus-DNA-Konzentration
100 mM in wässrigem
Natriumphosphatpuffer (10 mM Natriumphosphat + 1 mM EDTA, pH 7,00 ± 0,01)
beträgt.
Für die
Kalbsthymus-Konzentration bei einem pH von 7,00 ± 0,01 beträgt die Schmelztemperatur
67,83 ± 0,06 °C (Mittelwert
von 30 Einzelbestimmungen).
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Bei
einem 1:5-Molverhältnis
von [PBD]:[DNA] erhöht
das PBD-Dimer 80 die Helixschmelztemperatur (ΔT
m)
der Kalbsthymus-DNA um beispiellose 33,6 °C nach 18-stündiger
Inkubation bei 37 °C.
Unter identischen Bedingungen stellt das Dimer DSB-120 mit unsubstituiertem
C-Ring:
ein ΔT
m von 15,1 °C bereit, was die außergewöhnliche
Wirkung der Einführung
einer C2/C2'-Unsättigung
zeigt. Übereinstimmend
mit anderen PBD-Dimeren zeigt 80 seine stärkste Wirkung in den GC-reichen
oder Hochtemperaturbereichen der DNA-Schmelzkurven. Auf ähnliche Weise wie DSB-120 stellt
80 etwa 60–80
% seiner Stabilisierungswirkung ohne vorherige Inkubation bereit,
was auf eine kinetische Wirkung im PBD-Reaktivitätsprofil schließen lässt. Die
vergleichenden ΔT
m-Kurven zeigen jedoch, dass ausschließlich auf
Basis der Konzentration SJG-136 ≥ 10-mal
wirk samer als DSB-120 ist. Sogar bei einem [PBD]:[DNA]-Molverhältnis von 1:100
weist SJG-136 nach wie vor eine signifikant bessere DNA-Bindungsaffinität auf als
das Monomer Tomamycin bei einem 1:5-Molverhältnis von [PBD]:[DNA].
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Die
Ergebnisse für
das [PBD]:[DNA]-Verhältnis
von 1:5 sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst (sämtliche ΔTm-Werte ± 0,1–0,2°C).
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Die
in obiger Tabelle angeführten
Daten zeigen, dass SJB-136 (80) gemäß diesem speziellen Test das bis
dato wirksamste DNA-Stabilisierungsmittel ist.
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Mit
dem zweiten Test wurde die Zytotoxizität von SJG-136 (80) in der menschlichen
Ovarialzelllinie A2780 und deren Cisplatin-resistenten Sublinie
A2780cisR bestimmt und diese Daten mit der Zytotoxizität des verwandten
Dimers DSB-120 (siehe oben) und von Cisplatin verglichen. Bezogen
auf die Ausgangslinie ist von der A2780cisR-Linie bekannt, dass sie über erhöhte GSH-Werte,
einen erhöhten
Reparaturwert von DNA-Cisplatinaddukten und eine geminderte Fähigkeit
zur Aufnahme von Cisplatin verfügt
(M. Smellie et al. Br. J. Cancer 70, 48 (1994)).
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Die
durch 96-stündiges
Inkubieren der Zellen mit den Verbindungen bei 37 °C erzielten
Ergebnisse sowie die Bestimmung der Zellanzahl unter Verwendung
von Sulforhodamin B sind in nachstehender Tabelle angeführt.
- a Dosis der Verbindungen, die erforderlich
ist, um das Zellwachstum im Vergleich zu Kontrolle, um 50% zu hemen.
- b RF ist der Resistenzfaktor (LC50-resistent/Ausgangslinie)
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Der
LC50-Wert für 80 in der A2780-Zelllinie
beträgt
nur 23 pM, was, verglichen mit DSB-120 (LC50 =
7,2 nM), einem 320fachen Anstieg der Zytotoxizität entspricht. Interessanter
ist jedoch, dass während
DSB-120 eine reduzierte Wirksamkeit in der Cisplatin-resistenten
A2780cisR (LC50 = 0,21 mM) aufweist, ist
SJG-136 mit einem ähnlichen
LC50-Wert (24 pM), verglichen mit der normalen
A2780, fast 9.000-mal wirksamer bei dieser Zelllinie, was einen
Resistenzfaktor von 1,1 ergibt. Die Tatsache, dass sowohl DSB-120
als auch Cisplatin für dieses
Paar von Zelllinien einen Resistenzfaktor von 2,92 bzw. 32 ergeben,
stellt einen Hinweis darauf dar, dass SJG-136 potenziell zur Behandlung
von Cisplatin-resistenten Erkrankungen dienen kann.
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Beispiel 5: Ovarialkarzinom-Zytotoxizitätstest
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Die
Verbindung 80 (und Anthramycin als Vergleich) wurde von Dr. Lloyd
R. Kellands Gruppe am Institute of Cancer Research, Sutton, GB,
auf ihre zytotoxische Aktivität
in Ovarialzelllinien überprüft. Die
untersuchten fünf
Zelllinien waren SKOV-3, A2780/A2780cisR und CH1/CH1cisR (cisR kennzeichnet
eine Cisplatin-resistente Zelllinie).
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Einzelne
lebensfähige
Zellen wurden in ein Wachstumsmedium (160 μl) in 96-Well-Mikrotiterplatten
pipettiert und über
Nacht binden gelassen. Die PBDs wurden anschließend unmittelbar vor der Zugabe
zu den Zellen in Wells in vierfacher Ausführung in DMSO gelöst (was
Arzneimittelkonzentrationen von 20 mM ergab). Die Arzneimittelendkonzentrationen
in den Wells lagen wie folgt im Bereich von 100 μM bis 2,5 nM: 100, 25, 10, 2,5,
1 μM, 250,
100, 25, 10, 2,5 nM (die Arzneimittel wurden im Wachstumsmedium
verdünnt
und anschließend
40 μl zum
bestehenden Wellvolumen von 160 μl
zugesetzt, was die obigen Endkonzentrationen ergab). Nach 96 Stunden
wurde das Medium entfernt und die restlichen Zellen durch 30-minütiges Aussetzen
gegenüber
10%iger Trichloressigsäure
auf Eis fixiert. Die Wells wurden sodann 3 bis 4 mal mit Leitungswasser
gewaschen, über
Nacht luftgetrocknet und mit 100 μl
in 1%iger Essigsäure
gelöstem
Sulforhodamin B (0,4 %) versezt. Färbung wurde weitere 10 bis
15 Minuten ermöglicht,
anschließend
die Wells 3 bis 4 mal mit 1%iger Essigsäure gewaschen, luftgetrocknet
und anschließend
zu Tris-Base (100 μl
von 10 mM) zugesetzt. Die Platten wurden geschüttelt und Extinktionsablesungen
bei 540 nm mittels Plattenleser vorgenommen. Unter Verwendung des
Quattro-Pro-Softwarepakets
wurden die LC50-Werte aus Diagrammen der
Konzentration über der
prozentuellen Extinktion (verglichen mit 8 unbehandelten Wells)
ermittelt.
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UP2001
(80) zeigt in pikomolaren/subnanomolaren Mengen über die gesamte Gruppe der
Ovarialzelllinien Zytotoxizität.
Die Wirksamkeit des Moleküls
hängt wahrscheinlich
mit seinen Vernetzungseigenschaften – in Verbindung mit der Wirkung
der Exo-Sättigung – zusammen.