DE69931085T2

DE69931085T2 - System und Verfahren zum Separieren von biologischen Zellen

Info

Publication number: DE69931085T2
Application number: DE69931085T
Authority: DE
Inventors: Todd Curtis Green; Raymond P. Goodrich
Original assignee: Gambro Inc
Current assignee: Terumo BCT Inc
Priority date: 1998-01-20
Filing date: 1999-01-19
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2019-01-20
Also published as: EP0973564B1; DE69926313D1; ES2243043T3; US6051146A; WO1999036111A1; DE69926313T2; DE69931085D1; CA2281649C; EP1493459A1; EP0973564A1; JP3299284B2; JP2000514103A; EP1493459B1; CA2281649A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System und ein Verfahren zum Abtrennen von biologischen Zellen. Die Erfindung hat besondere Vorteile in Verbindung mit dem Abtrennen von Tumorzellen aus Blutbestandteilen wie roten Blutkörperchen und/oder Stammzellen.
Auf vielen Gebieten müssen Flüssigkeiten, die Teilchensubstanzen tragen, filtriert oder bearbeitet werden, um entweder ein gereinigtes, flüssiges oder gereinigtes Teilchenendprodukt zu erhalten. In seinem breitesten Sinn ist ein Filter jede beliebige Vorrichtung, die Teilchen aus einer Substanz entfernen oder abtrennen kann. So ist der Begriff "Filter" wie hier verwendet nicht auf ein poröses Mediummaterial beschränkt, sondern umfasst viele verschiedene Arten von Verfahren, bei denen Teilchen entweder voneinander getrennt oder aus einer Flüssigkeit abgetrennt werden.
Auf dem Gebiet der Medizin ist es oft notwendig, Blut zu filtrieren. Vollblut besteht aus verschiedenen flüssigen Bestandteilen und Teilchenbestandteilen. Manchmal werden die Teilchenbestandteile als "gebildete Elemente" bezeichnet. Der flüssige Teil des Bluts besteht großenteils aus Plasma, und die Teilchenbestandteile umfassen in erster Linie rote Blutkörperchen (Erythrozyten), weiße Blutkörperchen (einschließlich Leukozyten) und Thrombozyten. Diese Bestandteile weisen zwar ähnliche Dichten auf, aber ihre durchschnittliche Dichtungsbeziehung ist in der Reihenfolge abnehmender Dichte wie folgt: rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, Thrombozyten und Plasma. Des weiteren stehen die Teilchenbestandteile der Größe nach wie folgt in der Reihenfolge der abnehmenden Größe in Beziehung: weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen und Thrombozyten.
Zusätzlich zu roten und weißen Blutkörperchen (und ihren Teilmengen wie T-Zellen und Stammzellen), Plasma und Thrombozyten enthält Blut auch in einigen Fällen Tumorzellen. Diese Zellen haben im wesentlichen ähnliche Dichten, jedoch unterschiedliche Ausfällungsgeschwindigkeiten. Im Allgemeinen weisen Stammzellen eine Ausfällungsgeschwin digkeit auf, die höher als diejenige von T-Zellen und geringer als diejenige von Tumorzellen ist.
Die meisten gegenwärtigen Reinigungsvorrichtungen verlassen sich auf Dichte- und Größenunterschiede oder Oberflächenchemieeigenschaften zum Abtrennen und/oder Filtrieren von Blutbestandteilen für Transfusions- oder Reinfusionszwecke. Typischerweise werden Blutbestandteile von anderen Blutbestandteilen unter Verwendung einer Zentrifuge abgetrennt oder geerntet. Die Zentrifuge dreht einen Blutbehälter, um die Bestandteile innerhalb des Behälters unter Verwendung der Zentrifugalkraft zu trennen. Bei der Benutzung tritt Blut in den Behälter ein, während er sich mit einer sehr hohen Geschwindigkeit dreht, und die Zentrifugalkraft bildet Schichten der Blutbestandteile, so dass bestimmte Bestandteile getrennt entfernt werden können. Obgleich einige Zentrifugalabtrennungstechniken beim Trennen von manchen Blutbestandteilen voneinander wirksam sind, können viele Zentrifugalabtrennungsverfahren kein stark gereinigtes Endprodukt herstellen.
Bei einer Art des Abtrennungsverfahrens wird eine Sammlung von peripherem Blut (aus einer Arterie oder Vene entnommen) oder eine Sammlung von Knochenmarkblut in einem Zentrifugalabtrennungsverfahren gereinigt, um das, was als Sammlung peripherer Zellen bzw. Sammlung von Knochenmarkzellen bekannt ist, zu isolieren. Die Sammlung der peripheren Zellen oder die Sammlung der Knochenmarkzellen umfasst in erster Linie Plasma, rote Blutkörperchen, Stammzellen und T-Zellen und kann auch Tumorzellen umfassen, wenn das Blut des Spenders solche enthielt.
Bei einem weiteren Typ des Abtrennungsverfahrens wird das zu trennende Blut kontinuierlich durch einen Blutstromkanal geleitet, der einen oder mehrere flache Räume umfasst, wie in dem europäischen Patent 0 057 907 beschrieben ist.
Krebspatienten erhalten oft, nachdem sie sich einer therapeutischen Behandlung wie einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie unterzogen haben, um die kanzerösen Tumorzellen zu eliminieren, eine Transfusion einer Sammlung von peripheren Zellen oder einer Sammlung von Knochenmarkzellen, um Stammzellen zu ersetzen, die als Nebenwirkung der Behandlung zerstört wurden. Um die mit dem Infundieren von Blutbestandteilen von einem Fremdspender verbundenen Risiken zu verringern, sind einige dieser Transfusionen autolog, wobei von dem Patienten gesammelte Blutbestandteile später in den Patienten reinfundiert werden. Die anfänglich von den Krebspatienten gesammelten Blutbestandteile können kanzeröse Tumorzellen enthalten, die dann während der Reinfusion zurück in den Krebspatienten infundiert werden. Diese Reinfusion von Tumorzellen kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlungen verringern, die die Verringerung von kanzerösen Tumorzellen in dem Körper eines Patienten zum Ziel haben. Das Entfernen von Tumorzellen aus der Sammlung von peripheren Zellen oder einer Sammlung von Knochenmarkzellen vor der Transfusion ist jedoch extrem schwierig.
Frühere Versuche, Stammzellen von Tumorzellen vor der Reinfusion abzutrennen, hatten nur begrenzten Erfolg. Bei einem Abtrennungsverfahren, wird ein selektiver Antikörper in eine gesammelte Blutbestandteilsprobe nach Abtrennen einer beträchtlichen Anzahl von Thrombozyten und roten Blutkörperchen aus der Probe eingeführt. Der selektive Antikörper heftet sich chemisch an den Stammzellen an, um sie zu "markieren". Um die markierten Stammzellen von den übrigen Blutbestandteilen abzutrennen, werden die gesammelten Blutbestandteile zwischen ortsfesten Perlen, die mit einem Material beschichtet sind, das sich mit dem selektiven Antikörper chemisch verbindet, geleitet. Diese chemischen Bindungen halten die markierten Stammzellen auf den Perlen zurück, um sie aus den verbleibenden Blutbestandteilen zu filtern.
Um die markierten Stammzellen von den Perlen zu entfernen, schüttelt eine Bedienungsperson die Perlen oder spült eine chemische Lösung durch die Perlen, um die chemischen Bindungen zwischen dem Material und dem selektiven Antikörper zu brechen. Dieses Trennungsverfahren ist jedoch extrem teuer, mühsam und zeitraubend. Des weiteren entfernen die Perlen keine beträchtliche Anzahl von Stammzellen, und eine beträchtliche Anzahl von Tumorzellen verbleibt oft in dem abgetrennten Endprodukt.
Bei einem weiteren Typ des Abtrennungsverfahrens werden Magnetteilchen oder -fluid mit einem angehefteten Antikörper der Sammlung von Blutbestandteilen zugegeben. Der Antikörper bindet sich chemisch mit Stammzellen in der Probe, um die Magnetteilchen und die Stammzellen miteinander zu binden. Um die Stammzellen abzutrennen, wird ein Magnet separator verwendet, um die verbundene magnetische Substanz und die Stammzellen anzuziehen, und eine Substanz wird dann hinzugefügt, um die chemischen Bindungen zwischen den Stammzellen und der magnetischen Substanz zu brechen.
Obgleich dieses Abtrennungsverfahren einige Stammzellen und Tumorzellen abtrennen kann, ist es teuer und laborintensiv. Eine beträchtliche Anzahl von Tumorzellen verbleibt in dem abgetrennten Endprodukt und eine beträchtliche Anzahl von Stammzellen wird nicht wiedergewonnen. Des weiteren sind die Substanzen, die der Blutprobe sowohl bei dem Perlenabtrennungsverfahren als auch dem magnetischen Abtrennungsverfahren zugegeben werden, potentiell toxisch, wenn sie zusammen mit den abgetrennten Blutbestandteilen infundiert werden.
Die Zentrifugalausschlämmung ist ein weiteres Verfahren, das für das Abtrennen von Tumorzellen aus Stammzellen verwendet wird. Dieses Verfahren trennt Zellen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, ohne die Verwendung von chemischen Antikörpern ab. Bei einer üblichen Form der Ausschlämmung wird eine Zellcharge in einen Strom eines flüssigen Ausschlämmungspuffers eingeführt. Diese Flüssigkeit, die die Zellcharge in Suspension trägt, wird dann in eine trichterförmige Kammer eingeführt, die sich in einer schnellumlaufenden Zentrifuge befindet. Wenn die zusätzliche flüssige Pufferlösung durch die Kammer strömt, spült die Flüssigkeit kleinere Zellen, die langsamer sedimentieren, in Richtung auf eine Ausschlämmungsgrenze innerhalb der Kammer, während größere Zellen, die schneller sedimentieren, zu dem Bereich der Kammer mit der größten Zentrifugalkraft wandern.
Wenn die Zentrifugalkraft und die durch den Fluidstrom erzeugte Kraft ausgeglichen sind, wird der Fluidstrom erhöht, um Zellen, die langsamer sedimentieren, aus einer Austrittsöffnung in der Kammer zu zwingen, während Zellen, die langsamer sedimentieren, in der Kammer zurückgehalten werden. Wenn der Fluidstrom durch die Kammer erhöht wird, können die immer größer werdenden Zellen, die schneller sedimentieren, aus der Kammer entfernt werden.
So trennt die Zentrifugalausschlämmung Teilchen mit unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten ab. Das Stokes'sche Gesetz beschreibt die Sedimentierungsgeschwindigkeit (SV) eines kugelförmigen Teilchens wie folgt:
worin r der Radius des Teilchens ist, _p die Dichte des Teilchens ist, _m die Dichte des flüssigen Mediums ist, η die Viskosität des Mediums ist und g die Schwerkraft- oder Zentrifugalbeschleunigung ist. Da der Radius eines Teilchens auf die zweite Potenz in der Stokes'schen Gleichung erhoben wird und die Dichte des Teilchens nicht, beeinflusst die Größe einer Zelle eher als ihre Dichte die Sedimentationsrate stark. Dies erklärt, warum größere Teilchen im Allgemeinen während der Zentrifugalausschlämmung in einer Kammer verbleiben, während kleinere Teilchen freigesetzt werden, wenn die Teilchen ähnliche Dichten haben.
Wie im US-Patent Nr. 3,825,175, erteilt an Sartory, beschrieben, weist die Zentrifugalausschlämmung eine Anzahl von Beschränkungen auf. Bei den meisten dieser Verfahren müssen die Teilchen in einen Strom eines Fluidmediums in getrennten diskontinuierlichen Chargen eingeführt werden, um eine ausreichende Teilchenabtrennung zu ermöglichen. So gestatten einige Ausschlämmungsverfahren nur die Abtrennung in Teilchenchargen und erfordern ein zusätzliches Fluidmedium, um die Teilchen zu transportieren. Des weiteren müssen die Strömungskräfte genau gegen die Zentrifugalkraft ausgeglichen werden, um eine ordnungsgemäße Teilchenabtrennung zu erlauben.
Des weiteren findet eine Coriolis-Turbulenzwirkung statt, wenn Flüssigkeit und Teilchen aus einem hohen Zentrifugalfeld in Richtung auf ein niedrigeres Zentrifugalfeld in eine Ausschlämmungskammer strömen. Die Flüssigkeit und die Teilchen kollidieren turbulent mit einer Innenwand der Kammer, die der Drehrichtung der Zentrifuge zugewandt ist. Dieses Phänomen mischt Teilchen innerhalb der Kammer und verringert die Wirksamkeit des Abtrennungsprozesses. Die Coriolis-Turbulenz führt auch die Strömung der Flüssigkeit und Teilchen entlang der Innenwand der Ausschlämmungskammer von dem Einlass direkt zum Auslass im Bypass. So werden Teilchen um das Ausschlämmungsfeld herum geleitet und kontaminieren das Endprodukt.
Wenn die kombinierte Dichte der Teilchen und der Flüssigkeit in der Ausschlämmungskammer beträchtlich höher als die Dichte der Flüssigkeit ist, die in die Kammer eintritt, erhöht sich die Coriolis-Turbulenz. Dies liegt daran, dass die Flüssigkeit mit relativ geringer Dichte, die in die Ausschlämmungskammer eintritt, auf erhöhte Auftriebskräfte trifft, die dazu neigen, den Flüssigkeitsstrom in Richtung auf den Auslass der Ausschlämmungskammer zu beschleunigen. Wenn der beschleunigte Flüssigkeitsstrom auf Tangentialkräfte in der Kammer trifft, kann der Flüssigkeitsstrom eine Coriolis-Turbulenz bilden, die größere, relativ schneller sedimentierende Teilchen wie Tumorzellen um das Ausschlämmungsfeld herum und durch einen Auslass der Kammer hindurch trägt.
Das Mischen der Teilchen mittels der Teilchendichteninversion ist ein zusätzliches Problem, das bei einigen Ausschlämmungsverfahren des Stands der Technik anzutreffen ist. Fluid, das innerhalb der Ausschlämmungskammer strömt, besitzt eine sich verringernde Geschwindigkeit, wenn es in der zentripetalen Richtung von einer Eingangsöffnung in Richtung auf einen Bereich der Kammer mit vergrößertem Querschnitt strömt. Da die Teilchen dazu neigen, sich innerhalb einer strömenden Flüssigkeit in Bereichen mit einer geringeren Strömungsgeschwindigkeit statt in den Bereichen einer hohen Strömungsgeschwindigkeit zu konzentrieren, konzentrieren sich die Teilchen nahe des Bereichs der Kammer mit vergrößertem Querschnitt. Da die Strömungsgeschwindigkeit in der Nähe der Einlassöffnung am größten ist, ist die Teilchenkonzentration in diesem Bereich entsprechend verringert. Die Inversion der Dichte der Teilchen findet statt, wenn die Zentrifugalkraft die Teilchen von einer hohen Teilchenkonzentration in dem Bereich mit vergrößertem Querschnitt in Richtung auf die Eingangsöffnung drückt. Dieser Teilchenumsatz verringert die Wirksamkeit der Teilchenabtrennung mittels Ausschlämmung.
Die Adhäsion der Teilchen ist ein weiteres Problem, das mit der Ausschlämmung und anderen Arten der Teilchenabtrennungsverfahren verbunden ist. Zwei Arten der Adhäsion der Teilchen verringern die Wirksamkeit der Abtrennung der Teilchen. Bei der ersten Art der Adhäsion der Teilchen werden einzelne Teilchen aneinander gebunden, so dass sie als Gruppen von Teilchen wirken. Wenn eine Substanz, die diese Teilchengruppen enthält, in einem Ausschlämmungsverfahren oder einem anderen Abtrennungsverfahren abgetrennt wird, bei dem die Teilchengröße ein Faktor ist, wirkt jede Gruppe von Teilchen als größeres Teilchen und wird zusammen mit größeren Teilchen abgetrennt, statt in kleine einzelne Teilchen abgetrennt zu werden. Bei einer zweiten Art der Adhäsion der Teilchen haften Teilchen an Vorrichtungen, die während eines Abtrennungsverfahrens verwendet werden, wie eine Kunststoffrohrleitung oder eine Ausschlämmungskammer. Dies verringert die Gesamtausbeute an Teilchen, insbesondere, wenn eine kleine Anzahl von Teilchen abgetrennt wird.
Aus diesen und anderen Gründen besteht ein Bedarf, die Teilchenabtrennung zu verbessern.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und ein System, das im Wesentlichen eine oder mehrere der Beschränkungen des verwandten Stands der Technik beseitigt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Verringerung der Adhäsion der biologischen Zellen bei einem Abtrennungsverfahren für biologische Zellen. Dieses Verfahren umfasst das Strömen von Flüssigkeit, die biologische Zellen trägt, in eine Fluidkammer und Abtrennen der biologischen Zellen in der Fluidkammer entsprechend den Unterschieden der Sedimentationsgeschwindigkeit. Ein Polymer wird der Flüssigkeit zugegeben; das Polymer weist die chemische Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H auf, worin A den Ausdruck 0 ≤ A ≤ 150 erfüllt und B den Ausdruck 0 ≤ B ≤ 100 erfüllt. Das Polymer verringert die Adhäsion von einigen der biologische Zellen, um die Abtrennung der biologischen Zellen zu verbessern.
Unter einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein System zur Verwendung bei der Abtrennung von biologischen Zellen. Eine Fluidkammer ist für das Abtrennen der biologischen Zellen vorgesehen. Die Fluidkammer umfasst einen ersten Abschnitt mit einem Einlass, damit ein biologische Zellen tragender Flüssigkeitsstrom in die Fluidkammer strömen kann, und einen zweiten Abschnitt mit einem Auslass, damit ein Flüssigkeits strom und biologische Zellen aus der Fluidkammer nach dem Abtrennen von mindestens einigen der biologischen Zellen in der Fluidkammer strömen kann, wobei der erste und der zweite Abschnitt einen Innenraum mit einem maximalen Querschnittsbereich an einer Stelle zwischen dem Einlass und dem Auslass bilden, wobei der Innenraum von der Stelle des maximalen Querschnittsbereichs in Richtung auf den Einlass konvergiert. Eine Einlassleitung ist an den Einlass der Fluidkammer gekoppelt. Die Einlassleitung ist für eine Strömungsverbindung mit einer Quelle gestaltet, die die die biologischen Zellen tragende Flüssigkeit enthält. Die Fluidkammer und/oder die Einlassleitung weist bzw. weisen das vorstehend erwähnte Polymer auf.
Es ist liegt auf der Hand, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung beispielhaft sind und eine weitere Erklärung der Erfindung, wie sie beansprucht ist, zur Verfügung stellen sollen.
Die beigefügten Zeichnungen sind enthalten, um die Erfindung noch besser verständlich zu machen. Sie sind in diese Beschreibung aufgenommen und bilden einen Teil derselben. Die Zeichnungen veranschaulichen eine Ausführungsform der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erklären. In den Zeichnungen zeigen
1 eine schematische Darstellung eines Teilchenabtrennungssystems gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
2 eine perspektivische Ansicht einer Fluidkammer und eines Abtrennungsgefäßes, das an einem Zentrifugenrotor, wie in 1 gezeigt, angebracht ist; und
3 eine schematische Ansicht eines gesättigten, in der Fluidkammer von 1 während eines Blutabtrennungsverfahrens gebildeten, gesättigten fluidisierten Teilchenbetts.
Im folgenden wird detailliert Bezug genommen auf die vorliegende bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, von der ein Beispiel in den beigefügten Zeichnungen gezeigt ist.
Wo immer es möglich war, wurden die gleichen Bezugszeichen in den Zeichnungen und der Beschreibung verwendet, um die gleichen oder ähnliche Teile zu bezeichnen.
Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise eine COBE^® SPECTRA^TM Blutbestandteilszentrifuge, die von Cobe Laboratories, Colorado, hergestellt wird. Die COBE^® SPECTRA^TM Zentrifuge umfasst eine dichtungsfreie Ein-Omega/Zwei-Omega-Rohrleitungsverbindung, wie im US-Patent Nr. 4,425,112 offenbart. Obgleich die Ausführungsform der Erfindung in Kombination mit der COBE^® SPECTRA^TM Zentrifuge beschrieben wird, erfolgt diese Bezugnahme nur aus beispielhaften Gründen und soll die Erfindung nicht auf irgendeine Weise einschränken.
Wie für einen Fachmann ersichtlich ist, kann die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise bei einer Vielzahl von Zentrifugenvorrichtungen verwendet werden, die üblicherweise zur Trennung von Blut in seine Bestandeile zum Einsatz kommen. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung mit jeder beliebigen Zentrifugenvorrichtung verwendet werden, und zwar ungeachtet der Tatsache, ob bei der Vorrichtung eine dichtungsfreie Ein-Omega/Zwei-Omega-Rohrleitungsverbindung verwendet wird oder nicht.
Wie hier verkörpert und in 1 veranschaulicht, weist die vorliegende Erfindung ein Teilchenabtrennungssystem 10 mit einem Zentrifugenrotor 12 auf. Vorzugsweise ist der Zentrifugenrotor 12 über einen in 2 gezeigten Arm 14 mit einem Motor (nicht gezeigt) gekoppelt, so dass sich der Zentrifugenrotor um seine Drehachse A-A dreht.
Wie in 2 gezeigt, ist eine Haltevorrichtung 16 an einer oberen Oberfläche des Rotors 12 vorgesehen. Die Haltevorrichtung 16 hält eine Fluidkammer 18 an dem Rotor 12 derart lösbar, dass ein Auslass 20 der Fluidkammer 18 näher an der Drehachse A-A als der Einlass 22 der Fluidkammer angeordnet ist. Die Haltevorrichtung 16 richtet die Fluidkammer 18 vorzugsweise an dem Rotor 12 aus, wobei sich die Längsachse der Fluidkammer 18 in einer Ebene quer zur Drehachse A-A des Rotors befindet. Des weiteren ist die Haltevorrichtung 16 vorzugsweise angeordnet, um die Fluidkammer 18 auf dem Rotor 12 zu halten, wobei der Auslass 20 der Fluidkammer der Drehachse A-A zugewandt ist. Obgleich die Haltevorrichtung 16 die Fluidkammer 18 an einer oberen Oberfläche des Rotors 12 hält, kann die Fluidkammer 18 auch an dem Rotor an anderen Stellen wie unterhalb der oberen Oberfläche des Rotors 12 befestigt sein.
Die Fluidkammer 18 ist vorzugsweise ähnlich wie eine oder identisch zu einer der Fluidkammern gestaltet, die in dem vorstehend erwähnten Patent Nr. 5,674,173 offenbart sind. Wie in 1 und 2 gezeigt, sind der Einlass 22 und der Auslass 20 der Fluidkammer 18 entlang der Längsachse der Fluidkammer 18 angeordnet. Eine Wand der Fluidkammer 18 erstreckt sich zwischen dem Einlass 22 und dem Auslass 20, wodurch der Einlass 22, der Auslass 20 und ein Innenraum der Fluidkammer 18 gebildet werden.
Die Fluidkammer 18 umfasst zwei kegelstumpfförmig geformte Abschnitte, die an dem Bereich der Fluidkammer 18 mit maximalem Querschnitt verbunden sind. Das Innere der Fluidkammer 18 verjüngt sich (es nimmt im Querschnitt ab) von dem Bereich mit maximalem Querschnitt in entgegengesetzten Richtungen in Richtung auf den Einlass 22 und den Auslass 20. Obgleich die Fluidkammer 18 mit zwei Abschnitten mit kegelstumpfförmiger Innengestalt gezeigt ist, kann das Innere jedes Abschnitts paraboloidisch oder von jeder anderen Gestalt mit einem größeren Querschnittsbereich sein, der größer als der Einlass- oder Auslassbereich ist.
Das Volumen der Fluidkammer 18 sollte mindestens groß genug sein, um die Bildung eines gesättigten fluidisierten Teilchenbetts (nachstehend beschrieben) für einen bestimmten Bereich von Strömungsgeschwindigkeiten, Teilchengrößen und Drehgeschwindigkeiten des Zentrifugenrotors 12 aufzunehmen. Die Fluidkammer 8 kann aus einem einzigen Stück Kunststoff oder aus separaten Teilen hergestellt werden, die zur Bildung von separaten Abschnitten der Fluidkammer 18 miteinander verbunden werden können. Die Fluidkamer 18 kann aus einem transparenten oder lichtdurchlässigen Copolyesterkunststoff wie PETG gebildet sein, um das Betrachten des Inhalts innerhalb des Kammerinneren mit Hilfe eines gegebenenfalls vorgesehenen Strobes (nicht gezeigt) während eines Abtrennungsverfahrens zu gestatten.
Wie in 1 gezeigt, ist eine Nut 24 an der Innenfläche der Fluidkammer 18 an einer Stelle des Bereichs mit maximalem Querschnitt ausgebildet. Die Nut 24 wird durch die oberen und unteren Wandflächen, die im wesentlichen rechtwinklig zur Längsachse der Fluidkammer 18 ausgerichtet sind, und einer Innenfläche der Fluidkammer 18 gebildet, die der Längsachse zugewandt ist. Vorzugsweise ist die Nut 24 ringförmig, die Nut 24 kann jedoch auch teilweise die Längsachse der Fluidkammer 18 umgeben.
Die Nut 24 hilft, die Coriolis-Turbulenz innerhalb der Fluidkammer 18 zu verteilen. Plötzliche Erhöhungen der Flüssigkeitsströmungsrate während des Teilchenabtrennungsverfahrens können die Fähigkeit des gesättigten fluidisierten Teilchenbetts, den Teilchendurchgang zu behindern, begrenzen. Flüssigkeit, die in die Fluidkammer 18 strömt, kann einem Coriolis-Turbuleneffekt unterzogen werden. Diese Turbulenzströmung verringert die Wirksamkeit der Filtration eines gesättigten fluidisierten Teilchenbetts, das in der Fluidkammer 18 gebildet wird, da die Flüssigkeit und die Teilchen zwischen dem gesättigten fluidisierten Teilchenbett und einer Innenwandfläche der Fluidkammer 18 statt in das Bett selbst strömen können. Die Fluidkammer 18, die die Nut 24 aufweist, wirkt diesen Wirkungen entgegen, indem die Coriolis-Turbulenzströmung in einer Umfangsrichtung teilweise um die Achse der Fluidkammer 18 herum kanalisiert wird. Deshalb verbessert die Nut 24 die Fähigkeit des gesättigten Betts, die Teilchen zu blockieren, insbesondere wenn sich die Flüssigkeitsströmungsraten erhöhen.
Eine Vielzahl von Stufen 26 ist vorzugsweise an der Innenfläche der Fluidkammer 18 zwischen dem maximalen Querschnitt der Kammer 18 und dem Einlass 22 gebildet. Jede Stufe 26 weist eine Basisfläche auf, die im Wesentlichen senkrecht zur Längsachse der Fluidkammer 18 sowie einer Seitenfläche, die orthogonal zur Basisfläche angeordnet ist, ausgerichtet ist. Obgleich 1 eine Ecke zeigt, an der sich die Seitenfläche und die Basisfläche schneiden, kann eine konkave Nut diese Ecke ersetzen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist jede Stufe 26 ringförmig und umgibt die Achse der Kammer 18 vollständig, um einen zylindrisch geformten Bereich zu begrenzen. Alternativ können die Stufen 26 die Achse der Kammer 18 teilweise umgeben.
Das Vorsehen der Stufen 26 in der Fluidkammer 18 verbessert auch die Eigenschaften der Blockierung von Teilchen eines in der Fluidkammer 18 gebildeten, gesättigten fluidisierten Teilchenbetts, insbesondere während Erhöhungen der Rate der Fluidströmung. Die Stufen 26 sorgen für diese Verbesserung, indem sie für Triebkraftumlenkungs- und – umleitungsflächen sorgen, um die Coriolis-Turbulenz in der Fluidkammer 18 zu verringern. Wenn die Coriolis-Turbulenz stattfindet, strömen die Flüssigkeit und die Teilchen entlang einer Innenfläche der Fluidkammer 18, die der Richtung der Zentrifugendrehung zugewandt ist. Deshalb kann die Turbulenz Teilchen zwischen der Innenfläche der Fluidkammer und entweder einem gesättigten fluidisierten Teilchenbett oder einem Ausschlämmungsfeld, das sich in der Fluidkammer 18 befindet, transportieren. So können die Teilchen, die in der Turbulenz strömen, die Fluidkammer 18 verlassen, ohne abgetrennt zu werden.
Die Stufen 26 lenken oder ändern die Triebkraft der Coriolis-Turbulenzströmung der Flüssigkeit und der Teilchen im Allgemeinen in der Umfangsrichtung um die Achse der Fluidkammer 18 herum. So muss eine beträchtliche Anzahl der Teilchen, die ursprünglich in der Turbulenz strömen, in das gesättigte fluidisierte Bett oder das Ausschlämmungsfeld eintreten, um abgetrennt zu werden.
Die Nut 24 und die Stufen 26 sind vorgesehen, um Erhöhungen der Fluidströmungsrate zu erleichtern sowie die Fließgleichgewichtsleistung der Fluidkammer 18 zu verbessern. Während der Abtrennung der Blutbestandteile verringern die Nut 24 und die Stufen 26 die Anzahl der filtrierten Zellen wie Tumorzellen sehr, die sonst ein in der Fluidkammer 18 gebildetes gesättigtes fluidisiertes Teilchenbett im Bypass umgehen würden.
Wie in 1 gezeigt, umfasst das System 10 des weiteren ein erstes Rohr 28, ein zweites Rohr 30, eine Einlassleitung 32 in Fluidverbindung mit dem Einlass 22 der Fluidkammer 18 und einen Dreiwegeverbinder 34 mit drei Schenkeln für das Strömungsverbinden des ersten Rohrs 28, des zweiten Rohrs 30 und der Einlassleitung 32. Das erste Rohr 28 weist eine Kopplung 36 zum Strömungsverbinden des ersten Rohrs 28 mit einer ersten Quelle 38 auf, die Flüssigkeit enthält, welche die voneinander zu trennenden Teilchen trägt. In ähnlicher Weise weist das zweite Rohr 30 Kopplungen 40 zum Strömungsverbinden des zweiten Rohrs 30 mit einer zweiten Quelle 42 auf, die eine Verdünnerflüssigkeit enthält. Die Kopplungen 36 und 40 sind vorzugsweise eine beliebige Art üblicher medizinischer Kopplungsvorrichtungen wie Dorne oder sterile Schlauchverbinder.
Wie in 1 gezeigt, weist das erste Rohr 28 eine erste Schlauchschleife 44 auf und das zweite Rohr 30 weist eine zweite Schlauchschleife 46 auf. Während der Verwendung sind die erste und die zweite Schlauchschleife 44 und 46 in peristaltischen Pumpen (nicht gezeigt) für das jeweilige Pumpen des abzutrennenden Fluids und der Verdünnerflüssigkeit von der ersten bzw. der zweiten Quelle 38 bzw. 42 angebracht.
Eine Leitung 47 ist vorgesehen, um die Strömung der Verdünnerflüssigkeit in das erste Rohr 28 fortzusetzen, nachdem die erste Quelle 38 und der obere Teil des ersten Rohrs 28 leer sind. Die Fluidverbindung des oberen Teils des ersten Rohrs 28 und der Leitung 47 mit dem unteren Teil des ersten Rohrs 28 wird vorzugsweise mittels Quetschventilen (nicht gezeigt) gesteuert. Das fortgesetzte Strömen der Verdünnerflüssigkeit in das erste Rohr 28 gestattet das Einspülen jeglicher verbleibender Teilchen in dem ersten Rohr 28 in die Fluidkammer 18 und gestattet die fortgesetzte Perfusion der Fluidkammer 18 mit der Verdünnerflüssigkeit, um den Abtrennungsprozess in der Fluidkammer 18 fortzusetzen.
Vorzugsweise ist die Dichte der Verdünnerflüssigkeit in der zweiten Quelle 42 niedriger als die Dichte sowohl der Teilchen als auch der Flüssigkeit in der ersten Quelle 38. Wie nachstehend beschrieben, vermischen sich das abzutrennende Fluid und die Verdünnerflüssigkeit in dem Dreiwegeverbinder 34 miteinander, und die Verdünnerflüssigkeit regelt (verringert) die Gesamtdichte der Substanzen, die in der Strömungskammer 18 strömen.
Die Flüssigkeit und die Teilchen in der ersten Quelle 38 sind eine Zellsuspension, die Blutbestandeile wie eine Sammlung peripherer Zellen oder eine Sammlung von Knochenmarkzellen umfasst, die hauptsächlich Plasma, rote Blutkörperchen, Stammzellen und T-Zellen enthält. Falls das Blut des ursprünglichen Spenders Tumorzellen enthält, würde die Zellsammlung in der ersten Quelle 38 auch Tumorzellen aufweisen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verdünnerflüssigkeit in der zweiten Quelle 40 eine Lösung, die Elektrolyte umfasst. Um sicherzustellen, dass die Verdünnungslösung für die Blutbestandteile nicht schädlich ist, besitzt die Elektrolytlösung einen pH von vorzugsweise etwa 5,0 bis etwa 8,0, stärker bevorzugt von etwa 7,0 bis etwa 7,8 und am stärksten bevorzugt etwa 7,4. Beispielsweise ist die Elektrolytlösung eine herkömmliche physiologische Kochsalzlösung, eine Ringer-Lactatlösung oder eine Dextrosekochsalzlösung mit einem pH von etwa 7,4.
Vorzugsweise ist die Verdünnungslösung eine Substanz, die als ISOLYTE^® S, pH 7,4 (Multi-Electrolyte Injection), hergestellt von McGaw, Inc., bekannt ist. Diese Substanz weist die folgenden Mengen an Elektrolyt in Einheiten von mEq/Liter auf:
Jeweils 100 ml ISOLYTE^® enthalten Natriumchlorid USP (United States Pharmacopeia) 0,53 g, Natriumgluconat USP 0,5 g, Natriumacetat·3H₂O USP 0,37 g, Kaliumchlorid USP 0,037 g, Magnesiumchlorid·6H₂O USP 0,03 g, zweibasiges Natriumphosphat 7H₂O USP 0,012 g, einbasiges Kaliumphosphat NF 0,00082 g und Wasser für die Injektion USP quantum sufficit. Des weiteren kann diese Substanz auch Eisessigsäure USP oder Natriumhydroxid NF umfassen, um den pH derart einzustellen, dass der pH etwa 7,4 beträgt. ISOLYTE^® besitzt eine berechnete Osmolarität von 295 mOsmo/Liter, eine Dichte von 1,005 g/ml bei 25°C und eine Viskosität von 102 cp bei 22°C.
Flüssigkeit und Teilchen in der ersten Quelle 38 und/oder die Verdünnerflüssigkeit in der zweiten Quelle 40 umfassen bis zu etwa 2 Gew.-% eines Polymermaterials zur Verringerung der Adhäsion der Teilchen aneinander und zur Verringerung der Adhäsion der Teilchen an Komponenten des Systems 10. Dieses Polymermaterial ist ein Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Polyethylenoxid-Triblockcopolymer mit der chemischen Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H, worin A den Ausdruck 0 ≤ A ≤ 150 erfüllt und B den Ausdruck 0 ≤ B ≤ 100 erfüllt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt A 75 oder 76 und B 30. Beispielsweise ist das Polymermaterial vorzugsweise PLU-RONIC^® F68 oder PLURACARE^® F68 Prill, hergestellt von der BASF Corp. Wie nachstehend beschrieben, verbessert die Verwendung dieser Polymermaterialien die Teilchen abtrennung in der Fluidkammer 18 und erhöht die Ausbeute der abgetrennten Teilchen, insbesondere wenn die Anzahl der abgetrennten Teilchen klein ist.
Die Flüssigkeit und die Teilchen aus der ersten Quelle 38 und die Verdünnerflüssigkeit aus der zweiten Quelle 40 strömen durch das jeweilige erste Rohr 28 und das zweite Rohr 30 zu dem Dreiwegeverbinder 34. Diese Substanzen vermischen sich in dem Dreiwegeverbinder 34 und strömen durch die Einlassleitung 32 in die Fluidkammer 18. In der Fluidkammer 18, die sich mit dem Rotor 12 dreht, trennen sich die Teilchen gemäß den Unterschieden der Sedimentationsgeschwindigkeit, wobei die schneller sedimentierenden Teilchen in der Fluidkammer 18 verbleiben und es den langsamer sedimentierenden Teilchen gestattet wird, aus der Fluidkammer 18 wie nachstehend beschrieben zu strömen.
Nachdem die Teilchen in der Fluidkammer 18 abgetrennt worden sind, strömen die Flüssigkeit und die Teilchen, die eine relativ langsamere Sedimentationsgeschwindigkeit aufweisen, durch den Flüssigkeitskammerauslass 20 in die Rohrleitung 48. Wie in 1 und 2 gezeigt, ist die Rohrleitung 48 mit einem Einlass 50 eines Abtrennungsgefäßes 52 verbunden, das an dem Zentrifugenrotor 12 angebracht ist. Wie nachstehend beschrieben, trennt das Abtrennungsgefäß 52 die Teilchen von der Flüssigkeit ab.
Benachbart einem äußeren Teil des Zentrifugenrotors 12 weist das Abtrennungsgefäß 52 eine Sammelvertiefung 54 zum Sammeln von Teilchen auf, die in das Abtrennungsgefäß 52 strömen. Die Drehung des Zentrifugenrotors 12 setzt Teilchen in die Sammelvertiefung 54 ab, während die langsamer sedimentierende Flüssigkeit und möglicherweise einige langsamer sedimentierende Teilchen oberhalb einer oberen Grenze der Sammelvertiefung 54 verbleiben.
Die Sammelvertiefung 54 besitzt einen Teilchenkonzentratauslass 56, der mit einer Teilchenkonzentratleitung 58 verbunden ist. Die Teilchenkonzentratleitung 58 entfernt Teilchen, die in der Sammelvertiefung 54 zurückgehalten werden, zusammen mit einem kleinen Teil der Flüssigkeit. Das Abtrennungsgefäß 52 umfasst auch einen Flüssigkeitsauslass 60, der mit einer Flüssigkeitsauslassleitung 62 verbunden ist. Die Flüssigkeitsauslassleitung 62 entfernt Flüssigkeit, die oberhalb einer oberen Grenze der Sammelvertiefung 54 strömt. Des weiteren kann die Flüssigkeitsauslassleitung 62 einige der langsamer sedimentierenden Teilchen entfernen, die an der Sammelvertiefung 54 vorbei strömen.
Vorzugsweise befindet sich der Flüssigkeitsauslass 60 an oder benachbart einem Ende des Abtrennungsgefäßes 52 und der Einlass 50 befindet sich an oder benachbart dem entgegengesetzten Ende des Abtrennungsgefäßes 52. Diese Beabstandung stellt reichlich Zeit für die Abtrennung von Teilchen aus der Flüssigkeit, das Sammeln einer beträchtlichen Anzahl von Teilchen in der Sammelvertiefung 54 und das entsprechende Entfernen einer beträchtlichen Anzahl von Teilchen durch die Teilchenkonzentratleitung 58 sicher.
Bei der in 2 gezeigten, bevorzugten Ausführungsform wird das Abtrennungsgefäß 52 in einer in dem Rotor 12 gebildeten Nut 64 angeordnet. Vorzugsweise ist das Abtrennungsgefäß 52 ein Kanal, der aus einem halbsteifen Material gebildet ist, so dass ein Tal 66 in der Außenwand der Nut 64 die Sammelvertiefung 54 bildet, wenn sich das Abtrennungsgefäß 52 in Reaktion darauf ausdehnt, dass Flüssigkeit und Teilchen in dem Abtrennungsgefäß 52 auf Zentrifugalkräfte stoßen. Wie in 2 gezeigt, weist die obere Oberfläche des Rotors 12 vorzugsweise Rückhaltenuten zur Aufnahme des ersten und des zweiten Rohrs 28 und 30, des Dreiwegeverbinders 34, der Einlassleitung 32, der Rohrleitung 48, der Teilchenkonzentratleitung 58 und der Flüssigkeitsauslassleitung 62 auf.
Wie in 1 gezeigt, ist die Flüssigkeitsauslassleitung 62 fluidtechnisch mit einem Flüssigkeitssammelbehälter 66 zum Sammeln von Flüssigkeit gekoppelt, die aus dem Abtrennungsgefäß 52 entfernt wird, und die Teilchenkonzentratleitung 58 ist fluidtechnisch mit einem oder mehreren Teilchensammelbehältern 70 gekoppelt, um Teilchen, die aus dem Abtrennungsgefäß 52 entfernt werden, zu sammeln. Vorzugsweise umfasst die Teilchenkonzentratleitung 58 eine Rohrleitungsschleife 72, die in einer peristaltischen Pumpe angebracht werden kann, um Teilchen durch die Teilchenkonzentratleitung 58 zu pumpen. Die Pumpe für die Rohrleitungsschleife 72 regelt die Strömungsrate und Konzentration der Teilchen in der Teilchenkonzentratleitung 58. Um die Strömungsraten der Substanzen und die Drehgeschwindigkeit des Rotors 12 während des Betriebs des Systems 10 zu steuern, steuert ein Steuergerät (nicht gezeigt) die Pumpen (nicht gezeigt) zum Pumpen von Sub stanzen durch das erste Rohr 28, das zweite Rohr 30 und die Teilchenkonzentratleitung 58 und steuert einen Motor (nicht gezeigt), um den Zentrifugenrotor 12 zu drehen.
Alternativ sind die Komponenten des Systems 10, wie das erste Rohr 28, das zweite Rohr 30, die Zuflussleitung 32, die Fluidkammer 18, die Rohrleitung 48, das Abtrennungsgefäß 52 und die Teilchenkonzentratleitung 58, mindestens teilweise aus einem Polymermaterial gebildet, um die Adhäsion der Teilchen an Komponenten des Systems 10 zu verringern. Dieses Polymermaterial umfasst das vorstehend beschriebene Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Polyethylenoxid-Triblockcopolymer, das die chemische Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H hat, worin A den Ausdruck 0 ≤ A ≤ 150 erfüllt und B den Ausdruck 0 ≤ B ≤ 100 erfüllt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt A 75 oder 76 und B beträgt 30. Beispielsweise ist das Polymermaterial bevorzugt PLURONIC^® F68 oder PLURACARE^® F68 Prill, hergestellt von der BASF Corp. Die Verwendung dieser Polymermaterialien für Komponenten des Systems 10 verbessert die Teilchenabtrennung in der Fluidkammer 18 und erhöht die Ausbeute an abgetrennten Teilchen, insbesondere, wenn die Anzahl der abgetrennten Teilchen klein ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Abtrennen von Blutbestandteilen und zum Abtrennen von Tumorzellen aus einer Zellsuspension wird nachstehend unter Bezugnahme auf 1 bis 3 erörtert. Obgleich die Erfindung im Zusammenhang mit einem Blutbestandteilsabtrennungsverfahren und einem Tumorzellenabtrennungsverfahren beschrieben wird, liegt auf der Hand, dass die Erfindung in ihrem breitesten Sinn nicht dadurch begrenzt ist. Die Erfindung kann zur Abtrennung einer Anzahl von unterschiedlichen Arten von biologischen Zellen verwendet werden.
Anfänglich wird peripheres Blut oder Knochenmarkblut von einem Patienten gesammelt, und dieses Blut wird in einem Zentrifugenabtrennungsverfahren gereinigt, um das, was als die Sammlung peripherer Zellen bzw. die Sammlung von Knochenmarkzellen bekannt ist, zu isolieren. Während dieses anfänglichen Zentrifugierungsverfahrens, wird Plasma, das reich an Thrombozyten ist, und ein Teil der roten Blutkörperchen und dichterer weißer Blutkörperchen aus dem Blut abgetrennt, um eine Sammlung von peripheren Blutzellen oder eine Sammlung von Knochenmarkzellen zu erhalten, die hauptsächlich Plasma, rote Blutkörperchen, Stammzellen und T-Zellen enthalten. Des weiteren umfasst diese Sammlung sehr wahrscheinlich einige Thrombozyten und Tumorzellen, falls das Blut des Spenders solche Zellen enthält. Wie nachstehend detaillierter beschrieben und in 3 gezeigt, werden bestimmte Teilchen wie rote Blutkörperchen "R" und möglicherweise einige T-Zellen "T" verwendet, um ein gesättigtes fluidisiertes Teilchenbett in der Fluidkammer 18 zu bilden. Falls die Anzahl der roten Blutkörperchen "R" in der Sammlung peripherer Zellen nicht ausreicht, um das gesättigte Bett zu bilden, werden der ersten Quelle 38 vorzugsweise zusätzliche rote Blutkörperchen derart zugegeben, dass die Anzahl der roten Blutkörperchen die Anzahl der Stammzellen, T-Zellen und eventueller Tumorzellen in der ersten Quelle 38 übersteigt.
Die anfängliche Abtrennung des peripheren Bluts oder Knochenmarks wird vorzugsweise mit einer Zentrifuge (nicht gezeigt) durchgeführt, die von dem System 10 getrennt ist, wie einem Zweistufen- oder Einstufenzentrifugenabscheider. Bei einer alternativen Ausführungsform kann der Zentrifugenrotor 12 eine Struktur umfassen, um für eine anfängliche Blutbestandteilsabtrennung mit dem Zentrifugenrotor 12, wie in dem vorstehend angegebenen US-Patent Nr. 5,674,173 offenbart, zu sorgen.
Die Sammlung abgetrennter peripherer Zellen oder die Sammlung abgetrennter Knochenmarkzellen wird in die erste in 1 gezeigte Quelle 38 verbracht und die erste Quelle 38 wird mit dem ersten Rohr 28 gekoppelt. Des weiteren wird die zweite Quelle 42, die die Verdünnerflüssigkeit enthält, mit dem zweiten Rohr 30 gekoppelt. Der Zentrifugenrotor 12 wird um die Drehachse A-A gedreht und die Blutbestandteile und die Verdünnerflüssigkeit werden von der ersten und der zweiten Quelle 38 und 42 und durch das erste bzw. zweite Rohr 28 bzw. 30 gepumpt.
Beispielsweise wird der Zentrifugenrotor 12 mit einer Drehzahl von etwa 2.400 UpM gedreht, um etwa 776 g am Fluidkammereinlass 20 und etwa 466 g am Fluidkammerauslass 22 zu erzeugen. Wenn möglich, wird die höchste durchführbare Drehzahl des Rotors 12 verwendet, um den dynamischen Bereich der bei dem Verfahren verwendeten Strömungsraten zu maximieren. Die Gleichgewichtsströmungsraten stehen in einer quadratischen Beziehung zu der Drehzahl.
Wenn die Blutbestandteile und die Verdünnerflüssigkeit in den Dreiwegeverbinder 34 strömen, vermischen sie sich miteinander und strömen über die Einlassleitung 32 in die Fluidkammer 18. Obgleich die Blutbestandteile und die Verdünnerflüssigkeit vorzugsweise während des Abtrennungsverfahrens in dem Dreiwegeverbinder 34 gemischt werden, könnten die Substanzen auf andere Weise gemischt werden. Beispielsweise könnte die Verdünnerflüssigkeit der ersten Quelle 38 zugegeben werden, um die Verdünnerflüssigkeit und die Blutbestandteile in der ersten Quelle 38 zu mischen. Dieses Mischen könnte auch vor oder zu Beginn eines Abtrennungsverfahrens durchgeführt werden.
Die Drehung des Zentrifugenrotors 12 und die Strömungsrate der Substanzen, die in die Fluidkammer 18 eintreten, werden gesteuert, um Teilchen in der Fluidkammer 18 zu akkumulieren, während Flüssigkeiten wie das Plasma und die Verdünnerflüssigkeit aus der Fluidkammer 18 strömen. Wie schematisch in 3 gezeigt, bildet sich ein fluidisiertes Teilchenbett, das rote Blutkörperchen "R" und möglicherweise einige T-Zellen "T" enthält, schließlich in dem Bereich der Fluidkammer 18 mit dem größten Querschnitt. Wenn mehr rote Blutköperchen "R" und T-Zellen "T" in das Teilchenbett strömen, erreicht es einen Zustand der Sättigung.
Wie in 3 gezeigt, strömen Plasma, Verdünnerflüssigkeit und alle langsamer sedimentierenden Thrombozyten durch das gesättigte Teilchenbett, während das Teilchenbett die relativ schneller sedimentierenden Stammzellen "S" und Tumorzellen "M" in einem Bereich der Fluidkammer 18 zurückhält, der sich zwischen dem Bett und dem Fluidkammereinlass 22 befindet. Die Stammzellen "S" befinden sich genau unter dem gesättigten fluidisierten Bett und die schneller sedimentierenden Tumorzellen "M" befinden sich näher an dem Einlass 22. Zusätzlich zu den Stammzellen "S", die normalerweise einen als CD34+ bekannten Antikörper exprimieren, kann das gesättigte fluidisierte Teilchenbett auch alle oder eine beträchtliche Anzahl von anderen Blutteilchen, die den CD34+ Antikörper exprimieren, zurückhalten, da diese Teilchen normalerweise ähnliche Sedimentationsgeschwindigkeiten aufweisen. Einige kleinere Stammzellen "S" können sich in dem gesättigten fluidisierten Teilchenbett befinden oder durch das Bett zusammen mit dem Plasma und der Verdünnerflüssigkeit strömen, statt unter dem Bett zu bleiben.
Wenn rote Blutkörperchen "R" und T-Zellen "T" weiter in die Fluidkammer 18 strömen und in das gesättigte fluidisierte Bett eintreten, strömen die roten Blutkörperchen "R" und die T-Zellen "T" aus dem Auslass 20. Da das fluidisierte Teilchenbett gesättigt ist, ist die Rate, mit der rote Blutkörperchen und T-Zellen "T" in den Einlass 22 eintreten, gleich der Rate, mit der die roten Blutkörperchen "R" und die T-Zellen "T" durch den Auslass 20 hindurchtreten. Der Strom von roten Blutkörperchen "R" und T-Zellen "T" trägt auch einen Teil der Anzahl der Stammzellen "S" mit sich. Im Allgemeinen tritt eine größere Anzahl der Stammzellen "S" aus der Fluidkammer 18 aus, wenn die Anfangsanzahl der roten Blutkörperchen "R" und/oder der weißen Blutkörperchen größer ist.
Da die Verdünnerflüssigkeit eine geringere Dichte als das Plasma und andere Blutbestandteile aufweist, die durch das erste Rohr 28 strömen, verringert das Vermischen der Verdünnerflüssigkeit und der Blutbestandteile in dem Dreiwegeverbinder 34 die Gesamtdichte der kombinierten Suspension der Flüssigkeiten und der Teilchen in der Fluidkammer 18. Dies verringert die Coriolis-Turbulenz des Plasmas und der Verdünnerflüssigkeit, die durch die Fluidkammer 18 strömen, da die gemischte Flüssigkeit eine Dichte aufweist, die näher an derjenigen der Gesamtdichte der Substanzen in der Fluidkammer 18 liegt. Mit anderen Worten, wenn die Gesamtdichte der Substanzen in der Fluidkammer 18 näher an der Dichte der Flüssigkeiten liegt, die in die Fluidkammer 18 eintreten, verringert dies die Auftriebskräfte, die dazu neigen, die Flüssigkeit in Richtung auf den Fluidkammerauslass 20 zu bewegen.
Im Gegensatz hierzu bewirken die Auftriebskräfte, wenn die Gesamtdichte der Substanzen in der Fluidkammer 18 relativ hoch ist, dass die Flüssigkeiten geringerer Dichte in einer Coriolis-Turbulenz entlang der Innenwandfläche der Fluidkammer strömen, die der Drehrichtung des Rotors 12 zugewandt ist. Diese Coriolis-Turbulenz der Flüssigkeit trägt schneller sedimentierende Teilchen wie die Tumorzellen "M" in Richtung auf den Fluidkammerauslass 20 und gestattet es deshalb, dass diese Teilchen aus der Fluidkammer 18 strömen und sich mit den langsamer sedimentierenden Teilchen wie roten Blutkörperchen, T-Zellen und Stammzellen mischen. Da die Coriolis-Turbulenz bei der vorliegenden Er findung verringert ist, kann eine größere Menge der schneller sedimentierenden Tumorzellen "M" aus den Blutbestandteilsteilchen abgetrennt werden.
Das Verdünnen der Blutbestandteile mit Verdünnerflüssigkeit gestattet es, dass die Blutbestandteile in dem ersten Rohr 38 in die Fluidkammer 18 gepumpt und mit einer schnelleren, konstanteren Strömungsgeschwindigkeit getrennt werden, während Teilchen in die Fluidkammer 18 eintreten und danach, während reine Verdünnerflüssigkeit in die Fluidkammer 18 eintritt. Im Gegensatz hierzu gestatten, wenn die Blutbestandteile in der Fluidkammer 18 ohne Verdünnung abgetrennt werden, die Viskosität und die Dichte des Plasmas keine so hohen Strömungsraten. Des weiteren können einige der Tumorzellen durch den Fluidkammerauslass 20 aufgrund der hohen Suspensionsdichten in der Kammer, kombiniert mit der geringen Dichte der reinen Verdünnerflüssigkeit, die den letzten Zellen in die Kammer 18 folgt, durch den Fluidkammerauslass 20 gezwungen oder getragen werden.
Während der Teilchenabtrennung wird das Pumpen der Blutbestandteile in das erste Rohr 28 und das Pumpen der Verdünnerflüssigkeit in das zweite Rohr 30 derart gesteuert, dass die Strömungsrate der Verdünnerflüssigkeit die Strömungsrate der Blutbestandteile übersteigt. Beispielsweise beträgt das Verhältnis der Strömungsrate der Verdünnerflüssigkeit zu der Strömungsrate der Blutbestandteile vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20, stärker bevorzugt etwa 2 bis etwa 8 und am stärksten bevorzugt etwa 6. Das starke Verdünnen der Blutbestandteile mit der Verdünnerflüssigkeit gestattet die Abtrennung der Tumorzellen und der Blutteilchen mit einer erhöhten Strömungsrate.
Obgleich die Verdünnerflüssigkeit und die Blutbestandteile vorzugsweise in dem Dreiwegeverbinder 34 während eines Teilchenabtrennungsverfahrens gemischt werden, sind andere Mischungsgestaltungen möglich. Die Fluidkammer könnte beispielsweise modifiziert werden, um separate Einlässe für Blutbestandteile und Verdünnerflüssigkeit aufzuweisen. Des weiteren könnte die Verdünnerflüssigkeit nur während bestimmter Teile des Abtrennungsverfahrens zugegeben werden. Die Verdünnerflüssigkeit könnte den Blutbestandteilen in der ersten Quelle 38 auch vor oder zu Beginn des Abtrennungsverfahrens zugegeben werden.
Schließlich strömen alle Blutbestandteile von der ersten Quelle 38 zur Fluidkammer 18 und die erste Quelle 38 erreicht einen leeren Zustand. Danach wird eine Menge der Verdünnerflüssigkeit allein in die Fluidkammer 18 eingeleitet, um die Gesamtdichte der Substanzen in der Fluidkammer 18 noch weiter zu verringern und dadurch die Coriolis-Turbulenz zu verringern. Beispielsweise werden 250 ml reine Verdünnerflüssigkeit in die Fluidkammer 18 eingeleitet, nachdem die erste Quelle 38 leer ist. Die Verdünnerflüssigkeit spült etwas von den gewünschten Teilchen aus der Fluidkammer 18 heraus.
Nachdem die Blutbestandteile aus der ersten Quelle 38 erschöpft sind und das Verdünnerfluid eine ausreichende Anzahl von gewünschten Zellen aus der Kammer 18 ausgespült hat, um die Suspensionsdichte in der Kammer 18 weiter herabzusetzen, werden die verbleibenden Stammzellen "S" und andere gewünschte Teilchen in der Fluidkammer 18 geerntet. Während des Erntens wird die Strömungsrate der Verdünnerflüssigkeit in Inkrementen allmählich derart erhöht, dass Teilchen mit relativ niedrigerer Sedimentationsgeschwindigkeiten aus der Fluidkammer 18 gespült werden. Die Strömungsgeschwindigkeit der Verdünnerflüssigkeit wird vorzugsweise auf relativ langsame und allmähliche Weise und mit einer relativ konstanten (linearen) Rate erhöht. Das langsame Erhöhen der Strömungsgeschwindigkeit der Verdünnerflüssigkeit auf diese Weise verringert die Wahrscheinlichkeit einer Coriolis-Turbulenz, die durch plötzliche Erhöhungen der Strömungsrate verursacht wird.
Wenn das Ernten fortgesetzt wird, wird die Strömungsrate der Verdünnerflüssigkeit erhöht, bis sie beispielsweise etwa 50 % bis etwa 100 % höher ist als die kombinierte Strömungsgeschwindigkeit der Blutbestandteile und der Verdünnerflüssigkeit vor dem Ernten. Vorzugsweise verbleibt ein fluidisiertes Bett von Teilchen während eines beträchtlichen Teils des Erntens. Die verringerte Gesamtdichte der Substanzen in der Fluidkammer 18 verringert die Wahrscheinlichkeit der Coriolis-Turbulenz während des Erntens der Teilchen. Vorzugsweise wird die Erhöhung der Strömungsrate bis kurz vor den Zeitpunkt fortgesetzt, zu dem Tumorzellen "M" beginnen, aus dem Fluidkammerauslass 20 auszutreten.
Die Verdünnerflüssigkeit, Plasma, rote Blutkörperchen, T-Zellen, Stammzellen und alle anderen Materialien, die aus dem Fluidkammerauslass 20 strömen, werden durch die Zwi schenrohrleitung 48 zum Einlass 50 des Abtrennungsgefäßes 52 geleitet. In dem Abtrennungsgefäß 52 hält die Zentrifugalkraft, die durch die Drehung des Rotors 12 verursacht wird, die Teilchen in der Sammelvertiefung 54 zurück, während die Verdünnerflüssigkeit und das Plasma durch den Flüssigkeitsauslass 60 und die Flüssigkeitsauslassleitung 62 strömen. Dies trennt die roten Blutkörperchen, die Stammzellen und andere Teilchen aus der Verdünnerflüssigkeit und dem Plasma ab.
Die Teilchen und ein Teil der Flüssigkeiten strömen durch die Teilchenkonzentratleitung 58 zu einem oder mehreren Teilchensammelbehältern 70, und die Verdünnerflüssigkeit und das Plasma strömen durch die Flüssigkeitssammelleitung 62 zu dem Flüssigkeitssammelbehälter 66. Nachdem die erste Quelle 38 leer ist und die gewünschten Zellen in den Sammelbehältern 70 gewonnen wurden, beendet eine Bedienungsperson (ein Verfahrenstechniker) die Drehung des Rotors 12 und entfernt gegebenenfalls Tumorzellen und alle anderen Zellen aus der Fluidkammer 18 zum Testen oder für andere Zwecke.
Wenn die Blutkomponenten in der ersten Quelle 38 und/oder die Verdünnerflüssigkeit in der zweiten Quelle 42 das vorstehend erwähnte Polymer mit der chemischen Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H aufweisen, verringert das Polymer die Adhäsion von mindestens einigen der Teilchen wie der roten Blutkörperchen, T-Zellen und Stammzellen. Insbesondere verringert das Polymer das Verbinden der roten Blutkörperchen miteinander. Dies verbessert das Abtrennen der Teilchen in der Fluidkammer 18, da die einzelnen Teichen nicht aneinander oder an den Komponenten des Systems 10 haften. Deshalb erhöht die Verwendung des Polymers die Anzahl der roten Blutkörperchen, T-Zellen und/oder Stammzellen, die in den Teilchensammelbehältern 70 gesammelt wurden, insbesondere, wenn die erste Quelle 38 anfänglich eine geringe Anzahl dieser Teilchen umfasst.
Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung kann das Polymer zum Verbessern der Teilchenabtrennung verwendet werden, wenn die Teilchen in der Fluidkammer 18 gemäß den Unterschieden der Sedimentationsgeschwindigkeit ohne Bildung eines gesättigten fluidisierten Teilchenbetts in der Fluidkammer 18 getrennt werden. Das Polymer kann bei spielsweise verwendet werden, wenn die Teilchen in der Fluidkammer 18 mittels Ausschlämmung getrennt werden.
Wenn die vorliegende Erfindung verwendet wird, um biologische Zellen, einschließlich roter Blutkörperchen, abzutrennen, wirken die roten Blutkörperchen als einzelne, unabhängige sedimentierende Teilchen ohne eine beträchtliche Verbindung der roten Blutkörperchen. Die Verwendung der Verdünnerflüssigkeit verringert die Dichte und Viskosität der Substanzen, die in die Fluidkammer 18 strömen und begrenzt dadurch das Auftreten von roten Blutkörperchen bei der Verbj dindung der roten Blutkörperchen. Die Zugabe des vorstehend erwähnten Triblock-Copolymers zu den Substanzen, die in die Fluidkammer 18 strömen, begrenzt auch die Neigung der roten Blutkörperchen, sich miteinander zu verbinden, indem die Adhäsion der roten Blutkörperchen aneinander verringert wird. Da die Verbindung der roten Blutkörperchen verringert ist, bilden die roten Blutkörperchen mindestens einen Teil des gesättigten fluidisierten Teilchenbetts statt wie schneller sedimentierende Teilchen zu wirken.
Bei der vorliegenden Erfindung blockieren die roten Blutkörperchen in dem gesättigten Bett den Durchtritt der schneller sedimentierenden Tumorzellen. Da die das Bett bildenden, roten Blutkörperchen sich so verhalten, als ob sie eine schnellere Sedimentationsgeschwindigkeit als Stammzellen haben, gestatten es die roten Blutkörperchen, dass die Stammzellen durch das gesättigte Bett hindurchtreten. Die Gewinnung der Stammzellen und das Filtern der Tumorzellen werden verbessert, wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen verwendet wird. Im Gegensatz dazu werden bei der Ausschlämmung rote Blutkörperchen typischerweise vor der auf der Strömungsrate beruhenden Abtrennung entfernt.
Es liegt für Fachleute auf der Hand, dass verschiedene Modifikationen und Abänderungen der Gestaltung und Methodik der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne den Umfang oder den Geist der Erfindung zu verlassen. Beispielsweise könnte die vorliegende Erfindung zum Abtrennen von Tumorzellen von roten Blutkörperchen verwendet werden und die Zellsuspension in der ersten Quelle 38 umfasst möglicherweise keine T-Zellen und/oder Stammzellen. Angesichts des Vorstehenden ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung Modifikationen und Abänderungen dieser Erfindung abdeckt, vorausgesetzt, sie fallen unter den Umfang der nachfolgenden Ansprüche.

Claims

Verfahren zur Verringerung der Adhäsion biologischer Zellen in einem Verfahren zur Trennung biologischer Zellen, umfassend die Schritte: Rotieren einer Fluidkammer (18) um eine Rotationsachse; Einströmenlassen einer biologische Zellen tragenden Flüssigkeit in die Fluidkammer (18); Trennen der biologischen Zellen in der Fluidkammer (18) gemäß den Unterschieden in der Sedimentationsgeschwindigkeit; und Ausströmenlassen mindestens einiger der biologischen Zellen aus der Fluidkammer (18); dadurch gekennzeichnet, dass der Flüssigkeit in der Fluidkammer (18) ein Polymer der chemischen Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H zugesetzt wird, in der A die Formel 0 ≤ A ≤ 150 erfüllt und B die Formel 0 ≤ B ≤ 100 erfüllt, wobei das Polymer die Anhaftung mindestens einiger der biologischen Zellen verringert, um die Trennung der biologischen Zellen zu verbessern.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem A die Formel 75 ≤ A ≤ 76 erfüllt und B 30 ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Schritt der Trennung des Fluids den Unterschritt der Herstellung eines gesättigten Fließbettes aus biologischen Zellen in der Fluidkammer (18) einschließt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Schritt der Trennung das Filtrieren der biologischen Zellen durch Ausschlämmen einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die biologischen Zellen rote Blutkörperchen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die biologischen Zellen T-Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die biologischen Zellen Stammzellen sind.
System (10) zum Einsatz bei der Trennung biologischer Zellen, wobei das System (10) umfasst: eine Fluidkammer (18) zur Trennung biologischer Zellen, wobei die Fluidkammer (18) umfasst: einen ersten Teil mit einem Kammereinlass (22), der so konfiguriert ist, dass ein biologische Zellen tragender Flüssigkeitsstrom in die Fluidkammer (18) strömen kann, und einen zweiten Teil mit einem Kammerauslass (20), der so konfiguriert ist, dass Flüssigkeit und mindestens einige der biologischen Zellen nach der Trennung mindestens einiger der biologischen Zellen in der Fluidkammer (18) aus der Fluidkammer (18) austreten können, wobei der erste und der zweite Teil einen Innenraum mit einer maximalen Querschnittsfläche an einer Stelle zwischen dem Kammereinlass (22) und dem Auslass (20) bilden, wobei der Innenraum von der Position der maximalen Querschnittsfläche zum Kammereinlass (22) hin konvergiert, und eine Einlassleitung (32), die an den Kammereinlass (22) angeschlossen ist, wobei die Einlassleitung (32) so konfiguriert ist, dass sie an eine Quelle angeschlossen ist, welche die die biologischen Zellen tragende Flüssigkeit enthält, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Fluidkammer (18) und der Einlassleitung (32) ein Poly mer der chemischen Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H enthält, in der A die Formel 0 ≤ A ≤ 150 erfüllt und B die Formel 0 ≤ B ≤ 100 erfüllt.
System (10) nach Anspruch 8, bei dem A die Formel 75 ≤ A ≤ 76 erfüllt und B 30 ist.
System (10) nach Anspruch 8 oder 9, das außerdem ein Trenngefäß (52) mit einer Sammelvertiefung (54) zur Zurückhaltung der biologischen Zellen darin umfasst, wobei das Trenngefäß (52) einen Gefäßeinlass (50), einen Auslass (56) für das biologische Zellkonzentrat zur Entfernung mindestens der biologischen Zellen aus der Sammelvertiefung (54) und einen Flüssigkeitsauslass (60) zur Entfernung mindestens der Flüssigkeit aus dem Trenngefäß (52) umfasst, wobei der Gefäßeinlass (50) in Strömungsverbindung mit dem Kammerauslass (20) ist und das Trenngefäß (52) das Polymer der chemischen Formel HO-(CH₂CH₂O)A-(CHCH₃CH₂O)B-(CH₂CH₂O)A-H umfasst.
System (10) nach einem der Ansprüche 8 bis 10, das außerdem umfasst: eine erste Leitung (28), die für die Strömungsverbindung zur die die biologischen Zellen tragende Flüssigkeit enthaltenden Quelle konfiguriert ist; eine zweite Leitung (30), die für die Strömungsverbindung zu einer zusätzlichen eine Verdünnerflüssigkeit enthaltenden Quelle konfiguriert ist und einen Dreiwegeverbinder (34) mit einem ersten Schenkel, der mit der ersten Leitung (28) verbunden ist, einem zweiten Schenkel, der mit der zweiten Leitung (30) verbunden ist, und einem dritten Schenkel, der mit der Einlassleitung (32) verbunden ist, damit die die biologischen Zelle tragende Flüssigkeit und die Verdünnerflüssigkeit sich mischen und in die Fluidkammer (18) fließen können.