DE69933989T2 - Biomarker und targets für die diagnose, prognose und behandlung von prostat krankheiten - Google Patents

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Description

  • A. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich grundsätzlich auf den Nachweis, die Diagnose und die Behandlung von menschlichen Erkrankungszuständen Nukleinsäuren, die als Proben zur Diagnostik von Krebs geeignet sind, sowie auf Verfahren, die hiermit in Verbindung stehen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Sonden und Verfahren, die geeignet sind, Krankheiten der Prostata durch Messungen von Genprodukten zu diagnostizieren, identifizieren, sowie deren Verlauf zu überwachen.
  • B. Beschreibung des Standes der Technik
  • Das Prostatakarzinom (PCA) ist die zweithäufigste krebskorrelierte Todesursache von Männern in den Vereinigten Staaten (Boring et al., 1993, Winga et al., 1997). Die zunehmende Häufigkeit von Prostatakrebs im Verlauf der letzten Dekade führte dazu, dass Prostatakrebs der am meisten verbreitete Krebs von allen ist (Carter und Coffey, 1990). Obwohl Prostatakrebs der am häufigsten vorkommende Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten ist (annähernd 210.000 neu diagnostizierte Fälle/Jahr), ist nur wenig über die molekularen Veränderungen, die zu seiner Entstehung und dem Fortschreiten führen, bekannt (Boring et al., 1993). Nach Schätzungen der American Cancer Society steigt die Zahl von Todesfällen aufgrund von PCA mit über 8% jährlich.
  • Eine ungewöhnliche Begleiterscheinung ist es, dass die meisten Prostatatumore keine lebensbedrohlichen Zustände darstellen. Beweise aus Autopsien belegen, dass 11 Millionen amerikanische Männer Prostatakrebs haben (Dbom, 1983). Diese Zahlen stimmen mit der Tatsache überein, dass das Prostatakarzinom einen in die Länge gezogenen normalen Verlauf zeigt, bei dem verhältnismäßig wenige Tumoren während der Lebenszeit des Patienten bis zur klinischen Bedeutung fortschreiten. Sofern der Krebs gut ausdifferenziert, auf das Organ be schränkt und fokal ist, wenn er entdeckt wird, führt eine Behandlung von älteren Patienten nicht zu einer Verlängerung der Lebenserwartung.
  • Für die relativ wenigen Prostatakarzinomen, die natürlich weiter wachsen, ist es unglücklicherweise wahrscheinlich, dass sie zu dem Zeitpunkt, an dem sie klinisch nachgewiesen werden, bereits metastasiert sind. Die Überlebensrate von Individuen mit metastasierendem Prostatakrebs ist ziemlich niedrig. Zwischen diesen beiden Extremen finden sich Patienten mit Prostatatumoren, die metastasieren werden, es aber bislang noch nicht getan haben. Für diese Patienten führt eine chirurgische Entfernung der Prostata zur Heilung und verlängert deren Lebenserwartung. Aus diesem Grund ist es entscheidend, zu bestimmen, in welche Gruppe neu diagnostizierte Patienten fallen, um eine optimale Behandlung und damit das Überleben des Patienten zu gewährleisten.
  • Obwohl bereits klinische und pathologische Zustandsuntersuchungen und histologische Bewertungssysteme (zum Beispiel Gleason) eingesetzt wurden, um eine Prognose für eine Patientengruppe bereitzustellen, wobei die Prognose auf dem Grad der Tumordifferenzierung oder dem Typ der Grandularmuster basierte (Carter und Coffey, 1989; Diamond et al., 1982), sind diese Systeme nicht in der Lage, den Verlauf des Krebses vorherzusagen. Es wurden auch die Verwendung von Computer-basierten Bildanalysen von histologischen Schnitten einer primären Läsion, auf deren „nuclear roundness" als Hilfe im Management der einzelnen Patienten vorgeschlagen (Diamond et al., 1982), jedoch ist dieses Verfahren nur eingeschränkt nutzbar, um den Verlauf der Krankheit zu untersuchen.
  • Vor kurzem durchgeführte Studien, konnten verschiedene, wiederholt auftretende genetische Veränderungen im Prostatakrebs identifizieren, einschließlich den Verlust von Allelen (insbesondere der Verlust der Chromosomen 8p und 16q) (Bova et al., 1993; Macoska et al., 1994; Carter et. al., 1990); eine generalisierte DNA-Hypermethylierung (Isaacs et al., 1994); Punktmutationen oder Deletionen des Retinoblastomgenes (Rb) und des p53 Gens (Bookstein et al., 1990a; Bookstein et al., 1990b; Isaacs et al., 1991); Veränderungen im Expressionsmuster von einzelnen Zell-Zelladhäsionsmolekülen (zum Beispiel E-Cadherin/alpha-Catenin) (Carter et al., 1990; Morton et al., 1993a; Morton et al., 1993b; Umbas et al., 1992) sowie Aneuploidie und Aneusomie von Chromosomen, insbesondere der Chromosomen 7 und 8, die mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) nachgewiesen wurden (Macoska et al., 1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz et al., 1994).
  • Es konnte gezeigt werden, dass die Analyse des DNA-Gehaltes/Ploidie unter Verwendung von Durchflusszytometrie und FISH geeignet ist, um die Aggressivität von Prostatakrebs vorherzusagen (Pearsons et al., 1993; Macoska et al., 1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz et al., 1994; Pearsons et al., 1993, Veltri et al., 1994). Diese Methoden sind jedoch teuer, zeitintensiv und die zuletzt genannte Technologie erfordert die Bereitstellung von zentromerspezifischen Sonden zur Analyse.
  • Es wurde auch berichtet, dass spezifische Kernmatrixproteine mit Prostatakrebs in Verbindung stehen (Partin et al., 1993). Diese Proteinmarker können jedoch ganz offensichtlich nicht zwischen gutartiger Prostatahyperplasie und Prostatakrebs unterscheiden (Partin et al., 1993). Leider haben Marker, die nicht zwischen gutartigen und bösartigen Prostatatumoren unterscheiden können, einen sehr geringen Wert.
  • Eine neuere Entwicklung auf diesem Gebiet war die die Identifikation der Prostata-Mestatase-Suppressor-Gene, KAII, E-Cadherin, alpha-Catenin und GST-pi (Dong et al., 1995; Carter et al., 1990; Morton et al., 1993a; Morton et al., 1993b; Umbas et al., 1992; Cookson et al., 1997; Lee et al., 1997). Insertion eines Wildtyp-KAII-Gens in eine Ratten-Prostatakrebslinie erzeugte einen signifikanten Abfall der metastasierenden Tumorbildung (Dong et al., 1995). Jedoch hängt die Entdeckung von Mutationen von KAII, E-Cadherin, alpha-Catenin und GST-pi von der direkten Probennahme von mutierten Prostatazellen ab (Dong et al., 1996; Umbas et al., 1992; Cookson et al., 1997; Murray et al., 1995). Deshalb muss entweder von einem primären Prostatatumor eine Probe entnommen werden oder ausreichend transformierte Zellen müssen im Blut, in den Lymphknoten oder in anderen Geweben vorhanden sein, um die fehlenden oder abnormalen Gene zu detektieren. Weiterhin kann das Vorhandensein eines deletierten Gens oft durch eine große Zahl an untransformierten Zellen, die in einer gegebenen Gewebeprobe vorhanden sein können, maskiert werden.
  • Die zurzeit am häufigsten eingesetzten Tests auf Prostatakrebs sind digitale, rektale Untersuchung („digital rectal examination", DRE) und Analyse des Serum-Prostata-spezifischen Antigens („prostate specific antigen" PSA). Obwohl PSA seit 1988 (Partin und Oesterling, 1994) breit als ein klinischer Marker für Prostatakrebs eingesetzt worden ist, waren Screening-Programme, die PSA alleine oder in Kombination mit digitaler, rektaler Untersuchung einsetzen, nicht erfolgreich in der Verbesserung der Überlebensrate von Männern mit Prostatakrebs (Partin und Oesterling, 1994). Während PSA spezifisch für das Prostatagewebe ist, wird es von normalen und gutartigen genauso wie maligne Prostataepithelgeweben gebildet, was zu einer hohen Falsch-Positiv-Rate bei der Prostatakrebsdetektion führt.
  • Andere Marker, die bei der Prostatakrebsdetektion eingesetzt werden, umfassen Prostatasäure-Phosphatase (PAP) und Prostata-sezerniertes Protein (PSP). PAP wird von Prostatazellen unter hormoneller Kontrolle sezerniert (Partin und Oesterling, 1994). Es besitzt geringere Spezifizität und Empfindlichkeit als PSA. Als ein Ergebnis wird es heute weniger häufig eingesetzt, obwohl PAP noch einige Anwendungen bei der Beobachtung metastasierender Patienten, bei denen erste Behandlung versagt haben, findet. Im Allgemeinen ist PSP ein empfindlicherer Biomarker als PAP, aber es ist nicht so empfindlich wie PSA (Huang et al., 1993). Wie bei PSA werden die Mengen an PSP in Patienten mit BPH genauso wie mit Prostatakrebs erhöht.
  • Ein weiterer Serummarker, der mit Prostatakrankheit in Verbindung steht, ist das Prostata-spezifische Membran-Antigen (PSMA) (Horoszewicz et al., 1987; Carter et al., 1996; Murphy et al., 1996). PSMA ist ein Typ-II-Zellmembran-Protein und wurde als Folsäure-Hydrolase (FAH) identifiziert (Carter et al., 1996). Antikörper gegen PSMA reagieren mit dem normalen Prostatagewebe genauso wie mit dem Prostatakrebsgewebe (Horoszewicz et al., 1987). Murphy et al. (1995) verwendeten ELISA, um Serum-PSMA bei fortgeschrittenem Prostatakrebs zu detektieren. Jedoch kann PSMA Nutzen bei verschiedenen Umständen besitzen. PSMA wird im metastasierenden Prostatatumor-Kapillarsystem exprimiert (Silver et al., 1997) und es wird berichtet, dass es im Blut von metastasierenden Krebspatienten häufiger ist (Murphy et al., 1996). PSMA-Messenger-RNA (mRNA) wird in einer LNCaP-Prostatakrebszelllinie nach Exposition mit 5-α-Dihydroxytestosteron (DHT) um das 8–10 fache runterreguliert (Israeli et al., 1994).
  • Ein relativ neuer, potentieller Biomarker für Prostatakrebs ist menschliches Kallekrein 2 (HK2) (Piironen et al., 1996). HK2 ist ein Mitglied der Kallekrein-Familie, die von der Prostatadrüse sezerniert wird. Theoretisch können Serumkonzentrationen an HK2 bei der Detektion oder Diagnose von Prostatakrebs nützlich sein, aber die Nützlichkeit dieses Markers muss noch beurteilt werden.
  • Es verbleiben Defizite im Stand der Technik im Hinblick auf die Identifizierung von Genen, die mit der Progression von Krankheiten der Prostata, einschließlich Prostatakrebs und metastasierendem Prostatakrebs, verbunden sind, auf die Entwicklung von diagnostischen Verfahren, um die Progression der Krankheit zu beobachten und der Entwicklung von therapeutischen Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung Prostatakrankheiten und -krebsen. Die Identifizierung von Genen, die differentiell in Prostatakrankheiten exprimiert werden, wäre von erheblicher Wichtigkeit in der Entwicklung eines schnellen, preiswerten Verfahrens, um Prostatakrankheiten, einschließlich Krebs, zu diagnostizieren. Die identifizierten Gene wären auch nützlich in therapeutischen Zusammensetzungen oder in Screeningassays für therapeutische Verbindungen.
  • Die WO 96/21042 A betrifft die Diagnose von metastasierendem Prostatakrebs. Ang et al., Proc Am Med Amer Assoc Cancer Research, 1995, Meeting 86, Gene, die mit metastasierendem Prostatakrebs in Verbindung stehen beschreibt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt das beanspruchte Verfahren der Verwendung von einzigartigen Markern, von denen hier gezeigt wird, dass sie geeignet sind für die Diagnose oder die Identifizierung eines Subjekts mit einem metastasierenden Prostatakrebs-Zustand; bereit. Von den metastasierenden Krebsmarker, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wird gezeigt, dass diese abwesend oder in einen metastasierenden Zustand runterreguliert sind, aber im Prostatagewebe oder -serum von Patienten von denen bekannt ist, dass sie keinen metastasierenden Prostatakrebs haben, gefunden werden. Es wird gezeigt, dass die hier identifizierten Marker zwischen einem Zustand von metastasierendem Prostatakrebs und einem Zustand mit normaler (gesunder) gutartiger Überentwicklung und begrenzten Prostatakrebs unterscheiden. Die Diagnose eines metastasierenden Zustandes, wie hier beschrieben, kann, ist aber nicht beschränkt darauf, die Untersuchung auf das Vorhandensein von spezifischen Markern in einer Prostatagewebeprobe, in einer Serumprobe oder beidem von Subjekten, der verdächtigt ist, eine Prostatakrankheit zu haben, umfassen. Die Möglichkeit zwischen verschiedenen Zuständen der Prostataerkrankungen zu unterscheiden, besitzt wichtige Bedeutung für die Behandlung oder das Management des Zustandes des Subjekts.
  • Die Identifizierung von Markern oder der differentiellen Expression von gewissen Genen oder Genprodukten in der Praxis der Erfindung kann verschiedene Formen annehmen. Zum Beispiel kann man die Expression oder das Fehlen einer Expression an einer mRNA oder anderen RNA-Produkten nachweisen oder man kann die Expression oder das Fehlen einer Expression von einem Protein oder einem Polypeptid in einer bestimmten Zelllinie, Gewebe oder anderen biologischen Proben eines Subjekts nachweisen. Es werden Verfahren zur Identifizierung solcher RNA-Spezies und kodierenden Proteine beschrieben. Die RNA-Spezien und die entsprechenden kodierenden Proteinspezies besitzen zum Beispiel Nutzen als Marker eines Prostataerkrankungszustands und als Ziele für einen therapeutischen Eingriff bei einer Prostataerkrankung.
  • Die identifizierten Marker einer Prostataerkrankung können im Weiteren dazu verwendet werden, spezifische Oligonukleotidsonden und -primere, zum Beispiel für die direkte Hybridisierung mit einer Ziel-mRNA oder zum Einsatz als Primere beim Amplifizieren eines Ziels, welches unter Verwendung einer Enzym-abhängigen Amplifikation identifiziert oder quantifiziert werden soll, zu entwickeln. Sofern solche Sonden und Primere in Verbindung mit einer Nukleinsäurehybridisierung und Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, erlauben sie eine schnel le Analyse von Prostatabiopsie-Kernproben, Serumproben usw. Dies kann Ärzte darin unterstützen, Prostataerkrankungen und insbesondere metastasierenden Prostataerkrankungen zu diagnostizieren und eine optimale Behandlung oder Disease-Management-Programm für Personen mit Prostataerkrankungen in verschiedenen Stadien zu bestimmen. Dieselben Sonden und Primer können auch für eine in situ Hybridisierung oder einen in situ PCR-Nachweis und für die Diagnose von Prostataerkrankungen eingesetzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann in verschiedenen Ausführungsformen als ein Verfahren zum Diagnostizieren eines metastasierenden Prostata-Erkrankungszustandes in einem Subjekt, umfassend die Schritte Erhalt einer Testprobe von einem Prostatagewebe oder -serum oder beidem von dem Subjekt und Detektieren einer Runterregulierung der Expression eines metastasierenden Prostataerkrankungsmarkergens, umfassend Prostata-spezifische Transglutaminase in der Probe, beschrieben werden. Die Runterregulierung kann durch das Fehlen einer positiven Antwort auf ein Standardassay oder einen Standardtest angezeigt werden. Die Runterregulierung kann auch durch direkten Vergleich der Menge der Expression des Markers in einer Testprobe mit der Menge der Expression des Markers in einer Kontrollprobe, erhalten aus Prostatagewebe von einem oder mehreren Individuen, von denen bekannt ist, dass sie keine metastasierende Prostataerkrankung aufweisen. Die Kontrollprobe kann von einem Individuum oder von einem Populationspool sein, von denen bekannt ist, dass sie keine von denen bekannt ist, dass sie keine metastasierende Prostataerkrankung, BPH oder gar begrenzten Prostatakrebs aufweisen. In solch einem Vergleich ist ein Unterschied in der Menge der Expression in der Testprobe verglichen mit der Kontrollprobe ein Anzeichen für einen metastasierenden Prostataerkrankungszustand. Es ist auch eine Ausführungsform der Erfindung, dass die Menge der Expression des offenbarten Markers bestimmt und mit bekannten Niveaus an Expression in normalem Gewebe in Gewebe von Subjekten in anderen Prostataerkrankungszuständen verglichen wird.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung würden als Marker, Produkte eines Prostata-spezifischen Transglutaminase-Gens verwenden. In bestimmten Ausführungsformen dieser Verfahren umfasst das Prostata-spezifische Gen andere Moleküle mit der Sequenz, die hier als SEQ ID Nr: 1 oder sein Komplement oder Polypeptidprodukte, die von einem dieser Nukleinsäuremoleküle exprimiert werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen würde die vorliegende Erfindung den Erhalt oder die Detektion von Ribonukleinsäuren aus den Proben, jeweils die Testproben und möglicherweise den Kontrollproben, umfassen. Ribonukleinsäuren aus biologischen Proben können mittels jedem, im Stand der Technik bekannten Mittel erhalten werden und werden typischerweise eine Gesamt-RNA-Herstellung mit sich bringen. Die so erhaltene RNA wird dann zum Beispiel mittels Kontakt mit einer Sonde, die unter hohen Stringenzbedingungen mit einem RNA-Produkt der Markergene hybridisiert, um ein hybridisiertes Produkt zu ergeben, detektiert. Ein Detektionsverfahren, welches im Allgemeinen von Fachleuten verwendet wird, ist die Northern-Hybridisierung und diese ist das bevorzugte Verfahren zum Nachweis, zur Diagnose und/oder Prognose von Prostataerkrankungen oder -krebs.
  • Mit hohen Stringenzbedingungen sind Bedingungen gemeint, bei denen die Sonde spezifisch mit einer Zielsequenz in einer Menge, die stärker nachzuweisen, ist als nicht-spezifische Hybridisierung, hybridisiert. Hohe Stringenzbedingungen wären dann Bedingungen, die zwischen einem Polynukleotid mit einer exakt komplementären Sequenz oder einer, die nur einige verstreute Mismatches enthält, und einer Zufallssequenz, die zufällig einige wenige Regionen (zum Beispiel 3–10 Basen), die zu der Sonden passen, besitzt. Solche kleinen Regionen der Komplementarität werden viel einfacher flüssig als ein Gesamtlängenkomplement von 14 bis 17 oder mehr Basen und eine hohe Stringenzhydridisierung macht sie einfach unterscheidbar. Relativ hohe Stringenzbedingungen würden zum Beispiel Niedrigsalz- und/oder Hochtemperatur-Bedingungen einschliessen, wie sie bei ungefähr 0,02 M bis ungefähr 0,10 M NaCl oder dem Äquivalent bei Temperaturen von ungefähr 50°C bis ungefähr 70°C bereitgestellt werden. Solch hohe Stringenzbedingungen tolerieren geringe, wenn überhaupt, Mismatches zwischen der Sonde und dem Templat oder Zielstrang und würden insbesondere für den Nachweis der Expression von spezifischen metastasierenden Prostataerkrankungsmarkern geeignet sein. Es ist allgemein bevorzugt, dass die Bedingungen durch die Zugabe von ansteigenden Mengen an Formamid stringenter gemacht werden.
  • In der Praxis dieser Ausführungsform kann man ein Nukleinsäuresegement, das komplementär zu der gesamten Länge der mRNA, die von einem Markergen kodiert wird, ist oder man kann ein kleineres Segment, das zu einem Teil der Marker-RNA komplementär ist, verwenden. Solch kleinere Segmente können ungefähr 14, ungefähr 15, ungefähr 16, ungefähr 17, ungefähr 18, ungefähr 19, ungefähr 20, ungefähr 21, ungefähr 22, ungefähr 23, ungefähr 24, ungefähr 25, ungefähr 25, ungefähr 30, ungefähr 50, ungefähr 75, ungefähr 100 oder sogar mehrere hundert Basen lang sein und können in größeren Segmenten, die andere Funktionen wie Promotoren, Restriktionsenzymerkennungsstellen oder Expressions- oder Nachrichtenverarbeitungs- oder Replikationsfunktionen bereitstellen, enthalten sein. In bevorzugten Ausführungsformen wurden solche Sonden entwickelt, um selektiv an eine mRNA oder ein Produkt davon von Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II zu hybridisieren. Ein Produkt davon würde einen DNA- oder RNA-Strang, der komplementär zu der mRNA ist, einschliessen und somit würde eine geeignete Sonde die Sense- und die Antisense-Orientierung einer bestimmten Sequenz umfassen. Auch bevorzugt ist die Verwendung von Sonden oder Primern, die entwickelt wurden, um selektiv an ein Nukleinsäuresegment mit einer Sequenz aus SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 3 oder den Komplementen davon zu hybridisieren.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch die Bestimmung der Menge an hybridisiertem Produkt umfassen. Solch eine Bestimmung kann eine direkte Bestimmung einer markierten, hybridisierten Sonde, wie zum Beispiel durch Verwendung einer radioaktiven, fluoreszierenden oder einer anderen Markierung auf der Sonde, sein oder sie kann mittels einer Amplifikation einer Zielsequenz und Quantifizierung des amplifizierten Produkts erfolgen. Ein bevorzugtes Verfahren der Amplifikation ist eine reverse Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) wie hier beschrieben. RT-PCR ist ein bevorzugtes Verfahren des Nachweises, der Diagnose und/oder der Prognose von Prostataerkrankungen oder -krebs. In der Praxis eines solchen Verfahrens kann die Amplifikation die Kontaktierung der Zielribonukleinsäuren mit einem Paar an Amplifikationsprimern, die entwickelt wurden, um eine mRNA oder ein Produkt davon von Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II zu amplifizieren, oder sogar die Kontaktierung der Ribonukleinsäuren mit einem Paar an Amplifikationsprimern, die entwickelt wurden, um ein Nukleinsäuresegment, welches die Nukleinsäuresequenz oder das Komplement von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2 oder SEQ ID Nr: 3 enthalten, zu amplifizieren.
  • Der Typ oder die Menge an Prostata-spezifischer Transglutaminase können mittels eines molekularbiologischen Assays zur Bestimmung des Typs oder der Menge an einer Nukleinsäure, die für die Prostata-spezifische Transglutaminase kodiert, bestimmt werden. Solch molekularbiologische Assays werden oft einen direkten oder indirekten Schritt enthalten, der eine Bestimmung der Sequenz von wenigstens einem Teil der Prostata-spezifischen Transglutaminase-kodierenden Nukleinsäure erlaubt, welche mit einem Wildtyp einer Prostata-spezifischen Transglutaminase oder der Expression einer Wildtyp-Sequenz wie SEQ ID Nr: 1 oder anderen akzeptablen normal-allelischen oder polymorphen Sequenzen verglichen werden kann.
  • Es wird angenommen, dass Prostata-spezifische Transgluatminasesequenzen, die diagnostisch oder prognostisch für eine bestimmte Erkrankung sind, wenigstens eine Punktmutation, Deletion, Translokation, Insertion, Duplikation oder andere abweichende Veränderung enthalten. Diagnostische RFLPs werden deshalb auch erwartet. RNase-Schutz-Assays (RPA) können in bestimmten Ausführungsformen auch verwendet werden und ist ein bevorzugtes Verfahren des Nachweises, der Diagnose und/oder der Prognose von Prostataerkrankungen oder -krebs.
  • Diagnostische Verfahren können auf den Schritten Erhalt einer biologischen Probe von einem Subjekt oder Patienten, Kontaktieren der Nukleinsäureprobe der biologischen Probe mit einer isolierten, Prostata-spezifischen Transglutaminase-Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen, die eine Hybridisierung von im wesentlichen komplementären Nukleinsäuren erlauben und Nachweis sowie optional weitere Charakterisierung der so gebildeten hybridisierten komplementären Nukleinsäuren basieren.
  • Die Verfahren können in situ Nachweis von Probenukleinsäuren, die innerhalb der Zellen der Probe lokalisiert sind, einschließen. Die Probenukleinsäuren können auch von den Zellen vor der Kontaktierung getrennt werden. Die Probenukleinsäuren können DNA oder RNA sein.
  • Die Verfahren können die Verwendung isolierter Prostata-spezifischer Transglutaminase-Nukleinsäuresequenzen, die einen radio-, enzymatisch oder fluoreszierend detektierbaren Marker, wobei die hybridisierten komplementären Nukleinsäuren durch den Nachweis des Markers detektiert werden, beinhalten. In bevorzugten Ausführungsformen sind solche Sonden entwickelt, um selektiv mRNA oder ein Produkt davon von eine Prostata-spezifischer Transglutaminase zu hybridisieren. Ein Produkt davon würde einen DNA- oder RNA-Strang einschliessen, der komplementär zu der mRNA ist und somit würde eine geeignete Sonde die Sense- und die Antisense-Orientierungen einer bestimmten Sequenz einschliessen. Auch bevorzugt ist die Verwendung von Sonden oder Primern, die entwickelt wurden, um selektiv mit einem Nukleinsäuresegment mit der Sequenz von SEQ ID Nr: 1 oder Komplementen davon zu hybridisieren.
  • In der Praxis der Erfindung können einige Verfahren den Nachweis der Expression von einem Polypeptidprodukt eines Markergens wie zum Beispiel eines Prostata-spezifischen Transglutaminase-Gens und insbesondere das Expressionsprodukt, welches von SEQ ID NR: 1 kodiert wird, beinhalten. Solch ein Nachweis kann mittels im Stand der Technik bekannter Mittel erfolgen und kann zum Beispiel ein Immunoassy, eine Immunoaffinitätsreinigung oder -nachweis, ein ELISA oder ein Radioimmunoassay beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung kann in bestimmten Ausführungsformen auch als ein Kit zum Einsatz beim Nachweis von metastasierenden Prostataerkrankungszuständen durch Testen einer biologischen Probe beschrieben werden. Ein repräsentatives Kit kann ein oder mehr Nukleinsäuresegmente, wie oben beschrieben, enthalten, die selektiv an Prostata-spezifische Transglutaminase hybridisieren und einen Behälter für jedes der ein oder mehrere Nukleinsäuresegmente. In einigen Ausführungsformen können die Nukleinsäuresegmente in einem einzigen Röhrchen kombiniert sein. In einigen Ausführungsformen würden die Nukleinsäuresegmente entwickelt sein, um selektiv an ein Nukleinsäuresegment, dass die Sequenz oder das Komplement von SEQ ID Nr: 1 beinhaltet, zu hybridisieren. In weiteren Ausführungsformen können die Nukleinsäuresegmente auch ein Paar an Primern zur Amplifikation der Ziel-mRNA einschliessen. Solche Kits können auch jegliche Puffer, Lösungen, Lösungsmittel, Enzyme, Nukleotide oder andere Komponenten für Hybridisierungs-, Amplifikations- oder Nachweisreaktionen enthalten. Bevorzugte Kits enthalten Reagenzien für RT-PCR, in situ Hybridisierung, Northern-Analyse und/oder RPA.
  • In einigen Ausführungsformen kann das Kit zur Anwendung beim Nachweis eines metastasierende Prostataerkrankungszustands in einer biologischen Probe einen Antikörper, der mit einem Prostata-spezifischen Transglutaminase-Polypeptid immunoreagiert und einen Behälter für den Antikörper umfassen. Solch ein Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein und kann in einem Kit mit Reagenzien, sekundären Antikörpern, Markierungsmitteln oder anderen Komponenten zum Nachweis von Polypeptiden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein ELISA-Kit, vorhanden sein.
  • Die Erfindung umfasst weiterhin die Prognose und/oder Diagnose von Prostataerkrankungen durch Messen der Mengen an Nukleinsäureamplifikationsprodukten, die wie oben beschrieben gebildet wurden. Die Mengen an identifizierten Amplifikationsprodukten in einem individuellen Patienten können mit Gruppen an normalen Individuen oder Individuen mit identifizierten Krankheitszuständen verglichen werden. Eine Diagnose kann durch Herausfinden, dass das Niveau des Patienten an Krankheitszustandsmarkern innerhalb des normalen Bereichs oder innerhalb des Bereichs, der für Individuen mit diesem Krankheitszustand beobachtet wurde, fällt, erreicht werden. Weiterer Vergleich mit Gruppen an Individuen mit variierender Krankheitszustandsprogression, wie zum Beispiel metastasierender versus nicht-metastasierender Krebs, kann eine Prognose für den individuellen Patienten bereitstellen. Die Erfindung enthält auch Kits zur Durchführung der oben genannten Prozeduren, die Amplifikationsprimere und/oder Hybridisierungssonden enthalten.
  • Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für Proteine und Peptide, die durch SEQ ID Nr: 1 kodiert werden, sind. Solche Antikörper können nützlich für diagnostische und prognostische Anwendungen beim Nachweis des Krankheitszustandes durch Vergleich eines Patientenniveaus der Expression an Prostataerkrankungsmarkern mit der Expression desselben Markers in normalen oder nicht metastasierenden Individuen. In einigen Ausführungsformen kann die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern durch Einsatz der zuvor genannten Proteine und Polypeptide als Antigene induziert werden. Solche Antikörper können wiederum verwendet werden, um exprimierte Proteine als Marker für menschliche Erkrankungszustände nachzuweisen. Die Niveaus solcher Proteine, die in peripherem Blut oder Prostatagewebeproben eines Patienten vorhanden sind, können mittels konventioneller Verfahren quantifiziert werden. Antikörper-Protein-Bindung kann mittels einer Vielzahl an im Stand der Technik bekannter Mittel wie zum Beispiel Markierung mit fluoreszierenden oder radioaktiven Liganden, nachgewiesen und quantifiziert werden. Die Erfindung enthält ferner Kits zur Durchführung der oben genannten Prozeduren, wobei solche Kits Antikörper, die spezifisch für die oben genannten Proteine und Polypeptide sind, enthalten.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung umfasst den Nachweis und die Diagnose von Erkrankungszuständen, einschließlich BPH und Prostatakrebs, oder metastasierenden Prostatakrebs durch Kombination von Messung der Niveaus von zwei oder mehr Erkrankungszustandsmarkern. Eine Ausführungsform umfasst die kombinierte Messung der Genexpressionsprodukte von SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 14 mit anderen Markern von Prostataerkrankungen, wie PSA, PAP, HK2, PSP94 und PSMA wie in der US-Patentanmeldung SN 08/692,787, auf die hier Bezug genommen wird, veranschaulicht. Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung umfasst Kits zum Nachweis und zur Bestimmung von Niveaus von zwei oder mehr Erkrankungszustandsmarkern in biologischen Proben. Der erfahrene praktische Arzt wird erkennen, dass solche Kits eine Vielzahl von Methoden zum Nachweis und der Mes sung von Erkrankungszustandsmarkern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Oligonukleotidsonden, Primere für die Nukleinsäureamplifikation, Antikörper, die spezifisch an Proteinprodukte von Erkrankungszustandsmarkergene binden und andere Proteine oder Peptide, die spezifisch an Erkrankungszustandsmarkergenprodukte binden, beinhalten können.
  • In einem Aspekt schliesst die vorliegende Offenbarung Kits ein, die zum Nachweis von Prostatazellen in biologischen Proben geeignet sind. So ein Kit kann ein oder mehrere Primerpaare zur Amplifikation von Nukleinsäuren, die den Prostatamarkergenen entsprechen, umfassen. Das Kit kann außerdem Proben von Gesamt-mRNA, die von Gewebe aus verschiedenen physiologischen Stadien, wie normal, BPH, abgegrenzter Tumor und progressiv metastasierender Tumor abgeleitet sind und die zum Beispiel als Kontrollen verwendet werden können, enthält. Das Kit kann außerdem Puffer, Nukleotidbasen und andere Zusammensetzungen, die in einer Hybridisierung und/oder Amplifikationsreaktion eingesetzt werden, enthalten. Jede Lösung oder Zusammensetzung kann in einem Röhrchen oder einer Flasche aufbewahrt sein und alle Röhrchen können in einer abgeschlossenen Box zur kommerziellen Nutzung enthalten sein.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung umfasst Kits zur Verwendung beim Nachweis von Prostataerkrankungszuständen mittels Analyse einer biologischen Probe, umfassend Oligonukleotidsonden, die mit hoher Affinität an die Markern der Prostataerkrankung in einem Northern Blot Assay binden, sowie Behälter für jede dieser Sonden. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Offenbarung ein Kit zum Nachweis von Prostataerkrankungszuständen mittels Analyse einer biologischen Probe, umfassend Antikörper, die spezifisch für die Proteine sind, die von den Nukleinsäuremarkern der Prostataerkrankung kodiert werden, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
  • Wo sich eine Abnahme in der Menge oder Aktivität von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in einem Subjekt als diagnostisch für eine Prostataerkrankung wie zum Beispiel metastasierenden Prostatakrebs, erweist, stellt die vorliegende Offenbarung auch Verfahren zur Behandlung einer Prostataerkrankung, umfassend die Verabreichung einer the rapeutisch effektive Menge einer pharmazeutisch akzeptable Lösung, enthaltend eine Zusammensetzung mit Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II an solch einen Patienten mit Prostataerkrankung. Diese Behandlungen können die Verabreichung einer Zusammensetzung, enthaltend Protein oder Peptide von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II oder Zusammensetzungen, enthaltend DNA-Segmente von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II oder rekombinante Vektoren, die Proteine oder Peptide von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II umfassen. Solche Vektoren können an ein Subjekt in vivo wie durch intravenöse Verabreichung oder ex vivo mittels Transfektion in isolierte Zellen, die kultiviert und dann in das Subjekt infundiert werden, verabreicht werden. Solche Zellen sind vorzugsweise homologe Zellen und abgeleitet von Gewebe oder Serum des Patienten oder sie können heterologe Zellen umfassen.
  • Vektoren, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Plasmidvektoren, nackte DNA, virale Vektoren, einschließlich retrovirale und DNA-Vektoren, wie Adenovirus, Adeno-assoziierter Virus, Vakziniavirus, Sindbis-Virus, Zytomegalovirus, Herpes-Simplex-Virus, defekte Hepatitis-B-Viren und jeder andere Vektor oder jedes andere Vektorsystem, welches hier beschrieben wird oder im Stand der Technik bekannt ist. Vektoren können mittels Mittel, das virale Infektion, Calciumphosphat-Fällung, DEAE-Dextran, Elektroporation direkte Mikroinjektion, DNA-beladene Liposomen und Lipofectamin-DNA-Komplexe, Zell-Beschallung, Genbombardement unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsmikroprojektilen, Polykationen und Rezeptor-vermittelte Transfektion oder jedes andere, hier beschriebene oder im Stand der Technik bekannte Mittel umfasst, aber nicht auf diese beschränkt sind, in Wirtszellen transfiziert werden. Die Verfahren zur Behandlung können auch die Verabreichung von Modulatoren für die Enzymtranskription, Translation, Stabilität oder Aktivität von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II, beinhalten.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Offenbarung ist ein Zell-basierter Assay zur Identifizierung von Verbindungen, die auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II einwirken. Im Spe ziellen umfasst der Assay das Kultivieren einer Zelle, die einen Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für einen Promotor von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II kodiert, der operativ an ein Reportergen unter Bedingungen, die eine Expression und ein quantitatives Assay des Reportergens erlauben, gebunden ist. Die kultivierte Zelle wird mit Verbindungen, die verdächtigt werden, eine regulierende Aktivität für die Herstellung von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II zu besitzen, inkubiert. Diese regulierenden Verbindungen werden mittels ihrer Fähigkeit, die Expression des Reportergens zu modulieren und dadurch auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II einzuwirken, identifiziert. In einigen Aspekten der Offenbarung können die Begriffe „Modulation", „modulieren", „einwirken" und „verändern" einen Anstieg oder eine Abnahme der Expression eines Gens oder einer Genproduktionsaktivität bedeuten.
  • In einer allgemeinen Ausführungsform stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Screening einer Verbindung auf ihre Fähigkeit auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Säugetierzellen einzuwirken. Das Verfahren enthält die folgende Schritte: Bereitstellen eines Expressionskonstrukts, umfassend Promotoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II und ein Reportergen, wobei das Reportergen unter transkriptionaler Kontrolle des Promotors steht, Transfizieren der Säugetierzellen mit dem Expressionskonstrukt, Kontaktieren der transfizierten Zelle mit der Verbindung und Identifizieren einer Verbindung, die die Expression des Reportergens vom Promotor reguliert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reportergen ausgewählt aus der Gruppe, die aus Glühwürmchen-Luziferase, Chlorampicol-Acetyltransferase, β-Galactosidase, grün fluoreszierendes Protein, menschliches Wachstumshormon, alkalische Phosphatase und β-Glucoronidase besteht.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform leitet sich der Promotor für Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II von dem nativen, menschlichen Promotor von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II ab. Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Promotorregionen von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II für die zuvor erwähnten Screening-Verfahren bereit. Zusätzlich wird die Promotorsequenz von menschlichem Semenogelin II in Genbank Zugangsnummer M81651 beschrieben.
  • Die vorliegende Offenbarung kann verwendet werden, um eine Verbindung auf ihre Fähigkeit, die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in menschlichen Zellen zu regulieren, zu screenen. Eine besonders nützliche Zellpopulation zum Einsatz beim Screening nach der Stimulation von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II sind menschliche Tumorzellen. Am beachtenswertesten ist, dass die vorliegende Offenbarung nützlich für das Screening von Verbindungen, welche auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Prostatakrebszellen einwirken. Die vorliegende Offenbarung ist auch nützlich im Screening von Verbindungen, die auf die Produktion von Semenogelin II in lymphozytischen Krebszellen einwirken. Eine nützliche Porstatakrebszellenpopulation zur Durchführung des Screenings ist die LNCaP-Prostatakrebszelllinie. Andere bevorzugte Zelllinien umfassen DU145, PC-3, C4-2, C4-2Ln and C4-213 (Chung et al., 1994, Cancer Research, 54: 2577–2581).
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Offenbarung Verbindungen bereit, die die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Säugetierzellen beeinflussen. Diese Verbindung wird mittels des Verfahrens, umfassend das Bereitstellen eines Expressionskonstrukts, enthaltend Promotoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II und ein Reportergen, wobei das Reportergen unter transkriptionaler Kontrolle des Promotors steht, Transfizieren der Säugetierzellen mit dem Expressionskonstrukt, Kontaktieren der transfizierten Zelle mit der Verbindung und Identifizieren einer Verbindung, die die Expression des Reportergens vom Promotor reguliert, identifiziert.
  • Vorzugsweise wird die Verbindung aus einer kleinen, chemischen Bibliothek von Molekülen, einer Peptidbibliothek oder aus einer Sammlung von natürlichen Produkten identifiziert.
  • Schließlich stellt noch eine weitere Ausführungsform der Offenbarung ein Verfahren zur Regulierung der Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Säugetierzellen bereit. Dieses Verfahren umfasst den Schritt des Kontaktierens einer Zelle mit einer Verbindung, die auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in der Zelle einwirkt.
  • Beschreibung der erläuternden Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den frühen Nachweis, Diagnose und Prognose von Prostataerkrankungen wie zum Beispiel Prostatakrebs oder benigne Prostatahyperplasie (BPH). Marker für eine Prostataerkrankung in Form von Nukleinsäuresequenzen, die aus mit menschlicher Prostata angereichertem Gewebe isoliert wurden, werden offenbart. Die Marker sind Anzeichen für maligne Transformation von Prostatageweben und sind diagnostisch für potentielle metastasierende Streuung von Prostatatumoren.
  • Fachleute werden erkennen, dass die offenbarten Nukleinsäuresequenzen in einer Vielzahl an Anwendungen beim Nachweis, bei der Diagnose, bei der Prognose und der Behandlung von Prostataerkrankungen nützlich sein werden. Beispiele für solche Anwendungen, die im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen, umfassen die Amplifikation von Markern für Prostataerkrankungen unter Verwendung spezifischer Primere, Nachweis von Markern der Prostataerkrankung mittels Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden und Einbringen von isolierten Nukleinsäuren in Vektoren. Die Expression von RNA, Peptiden oder Polypeptiden aus den Vektoren, die Entwicklung von immunologischen Reagenzien, die Marker-kodierenden Produkten entsprechen und therapeutische Behandlungen von Prostataerkrankungen unter Verwendung von Expressionsvektoren oder Expressionsaktivatoren, die spezifisch für die identifizierten Prostataerkrankungsmarker sind, werden auch betrachtet.
  • A. Nukleinsäuren
  • Wie hierin beschrieben, betrifft ein Aspekt der vorliegenden Offenbarung drei Prostataerkrankungsmarker, die mittels Southern-Differenzierungshybridisierung, Northern-Analyse und quantitativer RT-PCR identifiziert wurden. Dies schließt die Nukleinsäureprodukte von Prostata-spezifischer Transglutaminase (GenBank Zugangs-# L34840, I20492), Cytokeratin 15 (GenBank Zugangs-# X07696) und/oder Semenogelin II (GenBank Zugangs-# M81652 und M81651) ein. Die vorliegende Erfindung ist der erste Bericht über die Unterexpression dieser Genprodukte bei metastasierendem Prostatakrebs.
  • In einer Ausführungsform finden die hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen Verwendung als Hybridisierungssonden und Amplifikationsprimere. Diese Nukleinsäuren können zum Beispiel in der diagnostischen Evaluierung von Gewebe- oder Serumproben eingesetzt werden. In besonderen Ausführungsformen bestehen diese Sonden und Primere aus Oligonukleotiden. Solche Oligonukleotide sollten ausreichend lang sein, um eine spezifische Hybridisierungen mit einer Ziel-RNA oder Ziel-DNA aus einer Gewebe- oder Serumprobe zu erlauben. Die Oligos sind typischerweise 10 bis 20 Nukleotide lang, können aber auch länger sein. Längere Sequenzen, wie zum Beispiel 30, 40, 50, 100, 500 und auch bis zur vollständigen Länge, wie in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 14 offenbart, sind bei einigen Ausführungsbeispielen bevorzugt.
  • Es werden Nukleinsäuremoleküle mit benachbarten Streckungen von 10, 15, 17, 20, 30, 40, 50, 60, 75 oder 100 oder 500 Nukleotiden, die homolog zu einer Sequenz sind, die ausgewählt ist aus SEQ ID Nr: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 14 betrachtet. Moleküle, die unter hochstringenten Bedingungen an diese Sequenzen binden, werden ebenso berücksichtigt. Diese Sonden sind in einer Vielzahl von Hybridisierungsausführungsformen einsetzbar, wie der Southern- und Northern-Blot-Technologie sowie der in situ Hybridisierung. In einigen Fällen ist zu berücksichtigen, dass Sonden verwendet werden können, die mit mehreren Zielsequenzen hybridisieren, ohne dass dadurch ihre Fähigkeit einer effizienten Krankheitsdiagnose beeinträchtigt wird.
  • Zahlreiche Sonden und Primere können aus den offenbarten Nukleotidsequenzen konstruiert werden. Primer können beliebige Länge aufweisen, sind jedoch typischerweise 10 bis 20 Basen lang. Durch Zuordnung numerischer Werte zu einer Sequenz, zum Beispiel ist der erste Rest 1, der zweite Rest 2, etc. kann ein Algorithmus, der alle Primer definiert, vorgeschlagen werden: n bis n + Ywobei n eine ganze Zahl von 1 bis zur letzten Zahl der Sequenz ist und y die Länge des Primers minus 1 (9 bis 99) ist, wobei n + y die letzte Zahl der Sequenz nicht übersteigt. Somit entsprechen für ein 10-faches die Sonden den Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12 ... und so weiter. Für ein 15-faches entsprechen die Sonden den Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17 ... und so weiter. Für ein 20-faches entsprechen die Sonden den Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22 ... und so weiter.
  • Die Verwendung von Hybridisierungssonden, die zwischen 14 und 100 Nukleotiden lang sind, erlaubt die Bildung eines Duplexmoleküles, das sowohl stabil wie selektiv ist. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Streckungen von mehr als 20 Basen in der Länge aufweisen, sind im Allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und so die Qualität und den Grad der im einzelnen erhaltenen Hybridmoleküle zu verbessern. Es ist grundsätzlich zu bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle im Bereich von 20 bis 30 Nukleotiden Länge oder noch länger, falls gewünscht, zu konstruieren. Solche Fragmente können einfach, zum Beispiel durch eine direkte Synthese des Fragmentes mittels chemischer Mittel oder durch das Einbringen ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion hergestellt werden.
  • Entsprechend können die Nukleotidsequenzen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wegen ihrer Fähigkeit selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Streckungen von Genen oder RNAs zu bilden, eingesetzt werden oder sie stellen Primer zur Amplifikation von RNA aus Gewebe oder Serum bereit. Abhängig von der anvisierten Verwendung, wird man wünschen, variierende Bedin gungen der Hybridisierung einzusetzen, um verschiedene Abstufungen der Selektivität der Sonde bezogen auf die Zielsequenz zu erreichen.
  • Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischerweise relativ stringente Bedingungen zur Bildung von Hybriden einsetzen, zum Beispiel, wird man einen relativ niedrigen Salzgehalt und/oder hohe Temperaturen wählen, wie sie zum Beispiel durch ungefähr 0,02 M bis ungefähr 0,10 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 50°C bis ungefähr 70°C bereit gestellt werden. Derart hoch stringente Bedingungen tolerieren wenige, wenn überhaupt, Fehlpaarungen zwischen der Sonde und dem Templat- oder Zielstrang und wären insbesondere geeignet zur Isolierung spezifischer Gene oder zum Nachweis spezifischer RNA-Transkripte geeignet. Es ist allgemein bekannt, dass Hybridisierungsbedingungen durch die Zugabe von zunehmenden Mengen an Formamid noch stringenter gemacht werden können.
  • Für einige Anwendungen, zum Beispiel dem Austausch von Aminosäuren durch ortsspezifische Mutagenese, ist es bekannt, dass niedrigere stringente Bedingungen erforderlich sind. Unter solchen Bedingungen kann eine Hybridisierung erfolgen, obwohl die Sequenzen der Sonden und des Zielstranges nicht perfekt komplementär sind, sondern an einer oder mehreren Positionen Fehlpaarungen aufweisen. Die Bedingungen können durch zunehmende Salzkonzentration und abnehmende Temperatur weniger stringent gemacht werden. Mittelmäßig stringente Bedingungen können zum Beispiel durch 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37°C bis etwa 55°C erreicht werden, während niedrig stringente Bedingungen bei etwa 0,15 M bis 0,9 M Salz und einem Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa 55°C bereitgestellt werden. Die Hybridisierungsbedingungen können so leicht verändert werden und somit hängt das Verfahren der Wahl von dem erwünschten Resultat ab.
  • Die nachfolgende Kodon-Aufstellung kann, in einem ortsspezifischen Mutageneseplan eingesetzt werden, um Nukleinsäuren zu generieren, die die gleiche oder eine leicht veränderte Aminosäuresequenz der anfangs gegebenen Nukleinsäure kodieren:
  • Tabelle 1. Kodon Gebrauch
    Figure 00220001
  • In anderen Ausführungsformen kann die Hybridisierung bei Bedingungen von zum Beispiel 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, bei Temperaturen zwischen annähernd 20°C bis ungefähr 37°C erreicht werden. Weitere eingesetzte Hybridisierungsbedingungen können annähernd 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 μM MgCl2, bei Temperaturen im Bereich von annähernd 40°C bis ungefähr 72°C einschließen.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, in Kombination mit geeigneten Mitteln, wie einem Label, zur Bestimmung der Hybridisierung einzusetzen. Eine Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Stand der Technik bekannt und schließen fluoreszierende, radioaktive, enzymatische oder andere Liganden wie Avidin/Biotin, die in der Lage sind, nachgewiesen zu werden, mit ein. In bevorzugten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, ein fluoreszierendes Label oder ein Enzym-Tag wie Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle von radioaktiven oder auf andere Weise die Umwelt belastenden Reagenzien zu verwenden. Im Fall von Enzym-Tags sind colorimetrische Indikatorsubstanzen bekannt, die eingesetzt werden können, um ein für das menschliche Auge sichtbares oder spektrophotometrisch messbares Detektionsmittel bereitzustellen, um die spezifische Hybridisierung mit den Sonden, die komplementäre Nukleinsäure enthalten, zu identifizieren.
  • Es wird grundsätzlich angestrebt, dass die Hybridisierungssonden, die hierin beschrieben sind, sowohl als Reagenz in Hybridisierungslösungen wie auch in PCRs zum Nachweis der Expression der korrespondierenden Gene geeignet sind als auch in Ausführungsformen, die eine feste Phase einsetzen. In Ausführungsformen, die eine feste Phase einsetzen, ist die zu testende DNA (oder RNA) an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder sonst wie aufgebracht. Diese fixierte Einzelstrangnukleinsäure wird dann einer Hybridisierung mit ausgewählten Sonden und unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen hängen von den bestimmten Umständen ab, insbesondere sind sie abhängig von den erforderlichen Kriterien (zum Beispiel dem G + C-Gehalt, dem Typ der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde usw.). Im Anschluss an ein Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nicht spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung mit Hilfe von Markern nachgewiesen und sogar quantifiziert.
  • Es ist offensichtlich, dass diese Offenbarung nicht auf die bestimmten, hierin beschriebenen Sonden beschränkt ist und es ist insbesondere beabsichtigt, dass hierin auch Nukleinsäuresequenzen umfaßt sind, die mit den offenbarten Se quenzen hybridisierbar sind oder funktionelle Sequenzanaloga dieser Nukleinsäuren sind. Es kann zum Beispiel eine Teilsequenz eingesetzt werden, um die Expression eines strukturell verwandten Gens oder die gesamte genomische Länge oder den cDNA-Klon, von welchem sie abstammt, zu quantifizieren.
  • Bei Anwendungen, in welchen die Nukleinsäuresegmente, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, in Vektoren, wie Plasmide, Cosmide oder Viren eingebracht werden, können diese Segmente mit anderen DNA-Sequenzen wie Promotoren, Polyadenalierungssignalen, Restriktionsenzymstellen, multiplen Klonierungsstellen oder anderen kodierenden Segmenten oder ähnlichem kombiniert werden, so dass die Gesamtlänge erheblich variieren kann. Es wird angenommen, dass ein Nukleinsäurefragment von nahezu jeder Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Einfachheit der Herstellung und der Verwendung des beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokolls limitiert wird.
  • DNA-Segmente, die ein spezifisches Gen kodieren, können in rekombinante Wirtszellen eingebracht werden und für die Expression eines spezifischen strukturellen oder regulatorischen Proteins verwendet werden. Alternativ können durch die Anwendung von gentechnischen Verfahren, Teilbereiche oder Derivate von ausgewählten Genen eingesetzt werden. Upstream-Bereiche, die regulatorische Bereiche, wie Promotorbereiche enthalten, können isoliert und nachfolgend zur Expression von ausgewählten Genen eingesetzt werden.
  • In dem Fall, in dem Expressionsprodukte erzeugt werden sollen, ist es möglich, dass die Nukleinsäuresequenz variiert wird, während ihre Fähigkeit, dasselbe Produkt zu kodieren, erhalten bleibt. Es wird auf die oben erwähnte Kodierungstabelle Bezug genommen, die es dem Fachmann erlaubt, eine beliebige Nukleinsäure, die für ein Produkt einer vorgegebenen Nukleinsäure kodiert, herzustellen.
  • B. Kodierende Proteine
  • Die metastasierenden Krebsmarkergene, die hierin beschrieben sind, können in eine Vielzahl an verschiedenen rekombinanten DNA-Expressionssystemen ein gebracht und exprimiert werden, um große Mengen an Polypeptidprodukt zu erzeugen, das dann gereinigt und dazu eingesetzt werden kann, um Tiere zu impfen und so Antisera zu generieren, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
  • Beispiele für Expressionssysteme, die dem Fachmann wohl bekannt sind, schließen Bakterien wie E. coli, Hefen wie Pichia pastoris, Baculoviren und Säugetierexpressionssysteme wie in Cos- oder CHO-Zellen ein. Es kann ein vollständiges Gen exprimiert werden oder alternativ Fragmente des Gens erzeugt werden, die Teile des Polypeptides kodieren.
  • In bestimmten Anwendungen der Erfindung wurde die Gensequenz, die das Polypeptid kodiert, daraufhin analysiert, ob vermeintliche Transmembransequenzen nachzuweisen sind. Solche Sequenzen sind typischerweise äußerst hydrophob und können leicht unter Verwendung von Standardsoftware für die Sequenzanalyse, wie MacVector (IBI, New Haven, CT), nachgewiesen werden. Die Anwesenheit von Transmembransequenzen ist oft schädlich, wenn ein rekombinantes Protein in vielen Expressionssystemen, insbesondere bei E. coli, synthetisiert werden soll, da es zur Bildung von unlöslichen Aggregaten führt, welche schwierig in die native Konformation des Proteins zu überführen sind. Die Deletion von Transmembransequenzen verändert normalerweise die Konformation der übrigen Proteinstruktur nicht signifikant.
  • Außerdem sind Transmembransequenzen, die schon per Definition in der Membran eingebettet sind, nicht erreichbar. Antikörper gegen solche Sequenzen können sich daher in in vivo- oder in situ-Studien als nicht geeignet erweisen. Die Deletion von Transmembran-kodierenden Sequenzen aus Genen, die für eine Expression verwendet werden, kann mittels Standardtechniken erfolgen. Es können zum Beispiel zufällig platzierte Restriktionsenzymstellen verwendet werden, um das gewünschte Gen-Fragment auszuschneiden oder es kann eine PCR-artige Amplifikation eingesetzt werden, um nur den gewünschten Teil des Gens zu amplifizieren.
  • Computerisierte Sequenzanalysen können eingesetzt werden, um den Bereich der vorhergesagten, hauptsächlichen Antigen-bestimmenden Epitope des Polypeptides zu bestimmen. Software, die in der Lage ist, eine solche Analyse auszuführen, kann kommerziell erworben werden, zum Beispiel MacVector (IBI, New Haven, CT). Die Software verwendet typischerweise Standardalgorithmen wie den Kyte/Doolittle- oder den Hopp/Woods-Ansatz zur Lokalisierung von hydrophilen Sequenzen, die an der Oberfläche eines Proteins gefunden werden können und daher wahrscheinlich als Antigendeterminanten agieren.
  • Sobald diese Analyse durchgeführt ist, können Polypeptide hergestellt werden, die wenigstens die wesentlichen Merkmale der Antigendeterminanten enthalten und die zur Erzeugung von Antisera gegen das Polypeptid verwendet werden können. Minigene oder Genfusionen, die diese Determinanten kodieren, können hergestellt und in Expressionsvektoren unter Verwendung von Standardverfahren, zum Beispiel unter Verwendung der PCR-Klonierungsmethodologie, eingefügt werden.
  • Das Gen oder Genfragment, welches ein Polypeptid kodiert, kann in einen Expressionsvektor unter Verwendung von Standardsubklonierungstechniken eingebracht werden. Es kann ein E. coli Expressionsvektor eingesetzt werden, der das rekombinante Polypeptid als Fusionsprotein produziert, wodurch eine schnelle Affinitätsreinigung des Proteins möglich wird. Beispiele für solche Fusionsproteinexpressionssysteme sind das Glutation-S-Transferasesystem (Pharmacia, Piscalaway, NJ), das Maltose-bindende Proteinsystem (NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT) und das 6 × His-System (Qiagen, Chatsworth, CA).
  • Einige dieser Systeme erzeugen rekombinante Polypeptide, die nur eine geringe Zahl zusätzlicher Aminosäuren umfassen, für die es unwahrscheinlich ist, dass sie die antigenen Fähigkeiten des rekombinanten Polypeptids beeinträchtigen. So fügen zum Beispiel sowohl das FLAG-System als auch das 6 × His-System nur kurze Sequenzen hinzu, von denen bekannt ist, dass sie nur wenig antigen sind und die Faltung des Polypeptids in eine native Konformation nicht negativ beeinflussen. Andere Fusionssysteme sind derart konstruiert, dass sie Fusionsproduk te erzeugen, wobei der Fusionspartner leicht von dem gewünschten Polypeptid abzutrennen ist. In einem Ausführungsbeispiel ist der Fusionspartner mit dem rekombinanten Polypeptid über eine Peptidsequenz, die eine spezifische Erkennungssequenz für eine Protease enthält, verbunden. Beispiele für geeignete Sequenzen sind solche, die von der Tabakätzvirus-Protease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder von dem Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) erkannt werden.
  • Das verwendete Expressionssystem kann auch durch den Bakulovirus-Polyhedronpromoter angetrieben werden. Das Gen, welches das Polypeptid kodiert, kann unter Verwendung von Standardverfahren derart verändert werden, dass es für das Klonieren in den Bakulovirusvektor geeignet ist. Ein Bakulovirusvektor ist der pBlueBac-Vektor (Invitrogen, Sorrento, CA). Der Vektor, der das Gen für das Polypeptid trägt, wird in Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen unter Verwendung eines Standardprotokolls transfiziert und die Zellen werden kultiviert und anschließend verarbeitet, um das rekombinante Antigen zu erzeugen. Siehe Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station; US-Patent-Nr. 4,215,051.
  • Als eine Alternative zu rekombinanten Polypeptiden können synthetische Peptide, die den Antigendeterminanten entsprechen, erzeugt werden. Solche Peptide sind wenigstens sechs Aminosäurereste lang und können bis zu etwa 35 Reste enthalten, was in etwa auch die obere Grenzlänge der automatischen Peptidsynthese-Maschinen ist, wie etwa derer, die von Applied Biosystems bezogen werden können (Foster City, CA). Die Verwendung solch kleiner Peptide zur Impfung, erfordert normalerweise die Konjugation des Peptids an ein immunogenes Trägerprotein, wie Hepatitis-B-Oberflächenantigen, Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder bovinem Serumalbumin. Die Verfahren, um diese Konjugation durchzuführen, sind im Stand der Technik wohl bekannt.
  • Es können ferner Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids erzeugt werden. Diese können zum Beispiel geringe Sequenzvarianten des Polypeptids, die aufgrund natürlicher Variation innerhalb einer Population auftreten, sein oder sie können Homologe, die in anderen Spezies gefunden werden, sein. Es kann sich auch um Sequenzen handeln, die nicht natürlich auftreten, die aber der natürlichen Sequenz ausreichend ähnlich sind, so dass sie ähnlich funktionieren und/oder eine Immunantwort auslösen, welche mit den natürlichen Formen des Polypeptids kreuzreagiert. Solche Sequenzvarianten können unter Verwendung von Standardverfahren der ortsspezifischen Mutagenese, wie sie hierin auch für das Entfernen von Transmembransequenzen beschrieben wurde, hergestellt werden.
  • Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids können auch Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten sein. Deletionsvarianten fehlen ein oder mehrere Reste des nativen Proteins, die nicht essentiell für die Funktion oder Immunogenität sind. Solche Varianten sind beispielhaft mit dem Fehlen der Transmembransequenzen dargestellt. Ein anderer häufiger Typ einer Deletionsvarianten ist eine, der sezernierende Signalsequenzen fehlen, oder der Signalsequenz fehlen, die dafür verantwortlich sind, dass ein Protein an einem bestimmten Teil einer Zelle bindet. Ein Beispiel für die zuletzt genannte Sequenz ist die SH2-Domäne, die eine Proteinbindung an Phosphotyrosinreste induziert.
  • Substitutionsvarianten enthalten typischerweise eine alternative Aminosäure an einer oder mehreren Stellen innerhalb des Proteins und können derart konstruiert sein, eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids, wie die Stabilität gegenüber einer proteolytischen Spaltung, zu verändern. Substitutionen sind vorzugsweise konservierend, was bedeutet, dass eine Aminosäure durch eine Aminosäure von ähnlicher Größe und Ladung ersetzt wird. Konservierende Substitutionen sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen zum Beispiel den Austausch von Alanin gegen Serin, Arginin gegen Lysin, Asparagin gegen Glutamin oder Histidin, Aspartat gegen Glutamat, Cystein gegen Serin, Glutamin gegen Asparagin, Glutamat gegen Aspartat, Glycin gegen Prolin, Histidin gegen Asparagin oder Glutamin, Isoleucin gegen Leucin oder Valin, Leucin gegen Valin oder Isoleucin, Lysin gegen Arginin, Glutamin oder Glutamat, Methionin gegen Leucin oder Isoleucin, Phenylalanin gegen Lysin, Leucin oder Methionin, Serin gegen Threonin, Threonin gegen Serin, Tryptophan gegen Tyrosin, Tyrosin gegen Tryptophan oder Phenylalanin und Valin gegen Isoleucin oder Leucin ein.
  • Insertionsvarianten schließen solche Fusionsproteine ein, die zum Beispiel eine schnelle Reinigung des Polypeptids erlauben. Insertionsvarianten können auch Hybridproteine umfassen, die Sequenzen aus anderen Proteinen oder Polypeptiden enthalten, die homolog zu dem Polypeptid sind. Es kann zum Beispiel eine Insertionsvariante Teile einer Aminosäuresequenz des Polypeptids einer Spezies gemeinsam mit einem Anteil des homologen Polypeptids einer anderen Spezies umfassen. Weitere Insertionsvarianten können solche einschließen, bei denen zusätzliche Aminosäuren innerhalb der kodierenden Sequenz des Peptides eingeführt wurden. Hierbei handelt es sich normalerweise um kleinere Einfügungen als bei den oben beschriebenen Fusionsproteinen und sie werden eingeführt, um zum Beispiel eine Proteasenabspaltungsstelle zu zerstören.
  • Die hauptsächlichen antigenen Determinanten des Polypeptids können über einen empirischen Ansatz identifiziert werden, bei dem Teile des Gens, die das Polypeptid kodieren, in einem rekombinanten Wirt exprimiert werden und die dabei entstehenden Proteine auf ihre Fähigkeit, eine Immunantwort auszulösen, getestet werden. Es kann zum Beispiel eine PCR verwendet werden, um eine Vielzahl von Peptiden zu erzeugen, denen zunehmend länger werdende Fragmente des C-terminalen Endes des Proteins fehlen. Die immunoschützende Aktivität von jedem dieser Peptide identifiziert dann solche Fragmente oder Domänen des Polypeptids, die für diese Aktivität essentiell sind. Weitere Untersuchungen, bei denen nur eine geringe Zahl von Aminosäuren bei jedem Schritt entfernt wird, erlauben dann die Lokalisierung der antigenen Determinanten des Polypeptids.
  • Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung ist die Verwendung von nachahmenden Peptiden. Solche nachahmende Peptide sind Moleküle, die Peptide enthalten, die Elemente einer sekundären Proteinstruktur nachahmen. Siehe zum Beispiel Johnson et al. 1993. Der Grund, nachahmende Peptide einzusetzen, ist, dass das Peptidrückgrat eines Proteins in erster Linie besteht, die Aminosäureseitenketten derart anzuordnen, so dass molekulare Wechselwirkungen, wie die mit Antikörpern und Antigenen, erleichtert werden. Von einem nachahmenden Peptid wird erwartet, dass es molekulare Wechselwirkungen in ähnlicher Weise wie das natürliche Molekül ermöglicht.
  • Erfolgreiche Anwendungen des Konzeptes der nachahmenden Peptide haben sich daher auf Nachahmungen von β-Windungen in Proteinen, die als höchst antigen bekannt sind, konzentriert. Gleichermaßen können β-Windungen innerhalb eines Polypeptides mittels Computer-basierter Algorithmen wie sie hierin besprochen wurden, vorhergesagt werden. Sobald die Bestandteile der Aminosäuren der Windung bestimmt sind, können nachahmende Peptide hergestellt werden, die eine ähnliche räumliche Orientierung der wesentlichen Elemente der Aminosäureseitenketten erreichen.
  • C. Herstellung von Antikörpern, die spezifisch für kodierenden Proteine sind
  • 1. Expression des Proteins von klonierten cDNAs
  • Die cDNA-Spezies, wie sie in SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2 und SEQ ID Nr: 3 spezifiziert sind, kann als Peptid oder Protein exprimiert werden. Die Veränderung von DNA-Segmenten für die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen kann unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren zur rekombinanten Expression durchgeführt werden. Nach hiesiger Auffassung kann nahezu jedes Expressionssystem zur Expression der isolierten cDNA-Spezien oder Nukleinsäuresequenzen der offenbarten Prostataerkrankungsmarkergene verwendet werden.
  • Sowohl cDNA wie genomische Sequenzen sind für eine eukaryotische Expression geeignet, da die Wirtszelle normalerweise die genomischen Transkripte bearbeitet, um eine funktionelle mRNA zur Translation in ein Protein bereitzustellen. Zum Beispiel kann die genomische Sequenz von Semenogelin II, die in SEQ ID Nr: 14 spezifiziert ist, in einem eukaryotischen System mittels Techniken, die allgemein im Stand der Technik bekannt sind, exprimiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Teilsequenzen zur Herstellung von Antikörpern gegen bestimmte Teile eines Genproduktes zu verwenden, auch wenn die Gesamtsequenz des entsprechenden Genproduktes unbekannt bleibt. Es stehen Computerprogramme zur Verfügung, die bei der Auswahl von Bereichen, die eine potentiell immunolo gische Bedeutung haben, unterstützen. Eine Software, die beispielsweise in der Lage ist, eine solche Analyse durchzuführen, ist MacVector (IBI, New Haven, CT) und bereits kommerziell erhältlich. Die Software verwendet typischerweise Standardalgorithmen wie das Kyte/Doolittle- oder Hopp/Woods-Verfahren zur Lokalisierung hydrophiler Sequenzen, die typischerweise auf der Oberfläche von Proteinen gefunden werden und daher mit hoher Wahrscheinlichkeit als antigene Determinanten agieren.
  • Die hierin verwendeten Begriffe „ gentechnisch veränderte" und „rekombinante" Zellen sollen sich auf eine Zelle beziehen, in welche ein exogenes DNA-Segment oder Gen, wie eine cDNA oder ein Gen, von Menschenhand eingefügt wurde. Auf diese Art und Weise sind gentechnisch veränderte Zellen von natürlich auftretenden Zellen unterscheidbar, welche keine rekombinant eingeführten exogenen DNA-Segmente oder Gene enthalten. Rekombinante Zellen umfassen solche, die eine eingefügte cDNA oder genomische Gensequenz besitzen und auch solche, die Gene tragen, die in der Nähe eines heterologen Promotors liegen, der natürlicherweise nicht mit diesem bestimmten eingeführten Gen assoziiert ist. Das heterologe Gen kann in das Wirtsgenom eingefügt oder auf einem Episom gehalten werden.
  • Um ein rekombinant kodierendes Protein oder Peptid in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, unabhängig, ob es eine mutierte oder Wildtypform ist, würde man einen Expressionsvektor herstellen, der eine der beanspruchten isolierten Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines oder mehrerer operativ verbundener Promotoren enthält. Um eine kodierende Sequenz „unter die Kontrolle" eines Promotors zu bringen, wird das 5' Ende in der Transkriptionsinitiationsstelle des transkriptionalen Leserahmens, der grundsätzlich zwischen etwa 1 und etwa 50 Nukleotiden „downstream" (d.h. 3') des gewählten Promotors liegt, positioniert. Der „upstream"-Promotor stimuliert die Transkription der DNA und sorgt für die Expression des kodierenden, rekombinanten Proteins. Dies ist die Bedeutung von „rekombinanter Expression" in diesem Zusammenhang.
  • Zahlreiche Standardverfahren sind verfügbar, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die geeigneten Nukleinsäuren und transkriptionale/translationale Kontrollsequenzen enthalten, um eine Protein- oder Peptidexpression in einer Vielzahl von Wirtsexpressionssystemen zu erreichen. Die Zelltypen, welche für die Expression zur Verfügung stehen, schließen Bakterien wie E. coli und B. subtilis, das mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA transformiert ist, Expressionsvektoren von Plasmid-DNA oder von Cosmid-DNA ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
  • Ausgewählte Beispiele der prokaryotischen Wirte sind E. coli Stamm RR1, E. coli LE392, E. coli 8, E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537) sowie E. coli W3110 (F-, Lambda-, Prototroph, ATCC Nr. 273325), Bazillen wie Bacillus subtilis und andere Enterobakteriaceae wie Salmonella typhimorium, Serratia marcesenses und verschiedene Pseudomonas-Spezien.
  • Im Allgemeinen enthalten Plasmidvektoren ein Replikon und Kontrollsequenzen, die aus Spezien stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind und in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Der Vektor trägt normalerweise eine Replikationsstelle sowie Markersequenzen, die eine phenotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. So ist E. coli zum Beispiel oft mit pBR322, einem Plasmid, das aus einer E. coli Spezies stammt, transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampizillin- und Tetracyclinresistenz und ermöglicht daher eine leichte Identifikation transformierter Zellen. Das pBR-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide oder Phagen müssen außerdem einen Promotor enthalten, oder sollten derart verändert werden, dass sie einen Promotor enthalten, welcher durch den mikrobiellen Organismus zur Expression eigener Proteine verwendet werden kann.
  • Darüber hinaus enthalten Phagenvektoren ein Replikon und Kontrollsequenzen, die mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind und als transformierende Vektoren in Verbindung mit diesen Wirten eingesetzt werden können. Zum Beispiel kann der Phage Lambda GEMTM-11 zur Herstellung eines rekombinanten Phagenvektors verwendet werden, der zur Transformation von Wirtszellen wie E. coli LE392 eingesetzt werden kann.
  • Weitere geeignete Vektoren schließen die pIN Vektoren (Inouye et al., 1985) und pGEX Vektoren ein, die zur Herstellung von löslichen Fusionsproteinen mit Glutation-S-Transferase (GST) zur späteren Aufreinigung und Abtrennungen oder Spaltungen geeignet sind. Weitere geeignete Fusionsproteine sind solche mit β-Galactosidase, Ubiquitin oder ähnlichem.
  • Promotoren, die am häufigsten in rekombinanten DNA-Konstrukten eingesetzt werden, schließen die Promotorsysteme von β-Lactamase (Penicillinase), Laktose und Tryptophan (trp) mit ein. Obwohl dies die am häufigsten verwendeten sind, sind auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und eingesetzt worden und es wurden Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen publiziert, so dass der Fachmann in der Lage ist, sie funktionell mit einem Plasmidvektor zu ligieren.
  • Zur Expression in Saccharomyces wird üblicherweise zum Beispiel das Plasmid YRp7 eingesetzt (Stinchcomb et al., 1979, Kingsman et al., 1979, Tschemper et al., 1980). Das Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit, auf Tryptophan zu wachsen, fehlt, bereitstellt. Dies ist zum Beispiel ATCC Nr. 44076 oder PEP4-I (Jones, 1977). Die Anwesenheit der trp1-Läsion als Eigenschaft des Hefewirtszellgenoms stellt dann eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweis der Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit.
  • Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, Holland et al., 1978) wie die Endolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyrovatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die Kettenterminatoren, die mit diesen Genen assoziiert sind, in den Expressionsvektor 3' von der Sequenz, die zu exprimieren gewünscht ist, einligiert, um für eine Polyadenylierung der mRNA und Termination zu sorgen.
  • Weitere geeignete Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der Transkriptionskontrolle über Wachstumsbedingungen haben, schließen die Promotorregionen der Alkoholdehydrogenase 2, des Isocytochrom C, der sauren Phosphatase, den abbauenden Enzymen, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziiert werden und die im vorangegangenen erwähnten Glyceraldehyd-3-Phosphatatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind, ein.
  • Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch Zellkulturen, die von vielzelligen Organismen abgeleitet sind, als Wirte verwendet werden. Grundsätzlich ist jede Zellkultur einsetzbar, egal ob sie von einem einer Wirbeltierkultur oder einer Kultur von einem wirbellosen Tier abstammt. Neben den Säugerzellen sind auch Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Expressionsvirusvektoren infiziert sind (zum Beispiel Bakulovirus) und Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Expressionsvektorviren infiziert (zum Beispiel Blumenkohlmosaik-Virus, DaMV; Tabakmosaik-Virus, TMV) oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (zum Beispiel Ti Plasmid) transformiert sind, wobei eine oder mehrere Kodierungssequenzen in dem Vektor enthalten sind, umfasst.
  • In einem geeigneten Insektensystem wird zum Beispiel das „Autograph californica nuclear polyhidrosis Virus" (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die isolierten Nukleinsäuresequenzen werden in nicht-essentielle Bereiche (zum Beispiel das Polyhedrin-Gen) des Virus einkloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel den Polyhedrin-Promoter) gestellt. Eine erfolgreiche Insertion der Kodierungssequenzen führt zu einer Deaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Bildung eines nicht-okkludierten, rekombinanten Virus (das heißt dem Virus fehlt die proteinhaltige Umhüllung, die durch das Polyhedrin-Gen kodiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das eingebrachte Gen exprimiert wird (zum Beispiel U.S. Patent-Nr. 4,215,051 (Smith)).
  • Beispiele für geeignete Säugetierwirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, chinesische Hamster Ovar-Zelllinien (CHO), W138-, BHK-, COS-7-, 293-, HepG2-, 3T3-, RIN- und MDCK-Zelllinien. Zusätzlich können Wirtszelllinien gewählt werden, die die Expression von insertierten Sequenzen modulieren oder verändern und die Genprodukte in einer bestimmten gewünschten Art und Weise prozessieren. Solche Modifizierungen (zum Beispiel Glycosylierung) und Prozessierungen (zum Beispiel Spaltung) von Proteinprodukten können wichtig für die Funktion des kodierenden Proteins sein.
  • Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Bearbeitung und Abänderung von Proteinen. Es können daher geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. Expressionsvektoren, die in Säugetierzellen verwendet werden, umfassen normalerweise einen Startpunkt der Replikation (als Erfordernis), einen Promotor, der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, zusammen mit jeglichen notwendigen Ribosomenbindestellen, RNA-Spleißstellen, einer Polyadenylierungstelle und transkriptionalen Terminatorsequenzen. Der Startpunkt der Replikation kann entweder durch die Konstruktion eines Vektors, der einen exogenen Startpunkt enthält, wie er eventuell von einem SV40-Virus oder einer anderen viralen Quelle (zum Beispiel Polyoma, Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann, oder durch eine aus der Wirtszelle stammenden chromosomalen Replikationsfunktion bereitgestellt werden. Sofern der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, ist der zuletzt genannte oft ausreichend.
  • Die Promotoren können aus dem Genom von Säugetierzellen stammen (zum Beispiel Metallothioninpromotoren) oder von Säugetierviren abstammen (zum Beispiel der Adenovirus-Late-Promotor oder dem Pockenvirus 7.5K Promotor). Weiterhin ist es möglich und kann wünschenswert sein, Promotoren oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gensequenzen assoziiert sind, vorausgesetzt, dass diese Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
  • Eine Vielzahl von viral-basierten Expressionssystemen kann verwendet werden, so zum Beispiel die weit verbreiteten Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten von Simian-Virus40 (SV40) abstammen. Die frühen und spä ten Promotoren des SV40-Virus sind insbesondere geeignet, da beide leicht aus dem Virus als Fragment, das gleichzeitig den viralen Startpunkt der Replikation von SV40 enthält, zu erhältlich sind. Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die ungefähr 250 bp Sequenz, die sich von dem Hind-III-Restriktionsort in Richtung Bgl-IRestriktionsort erstreckt und im viralen Startpunkt der Replikation lokalisiert ist, umfassen.
  • In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird, kann die kodierende Sequenz an einen transkriptions-/translationskontrollierenden Komplex von Adenovirus ligiert werden, zum Beispiel den späten Promotor und die dreiteilige Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in ein Adenovirusgenom unter Verwendung von in vitro oder in vivo Rekombination insertiert werden. Die Insertion in einen nicht-essentiellen Bereich des viralen Genoms (zum Beispiel die Region E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig ist und in der Lage ist, Proteine in einer infizierten Wirtszelle zu exprimieren.
  • Es können auch spezifische Initiationssignale für eine effiziente Translation der beanspruchten, isolierten Nukleinsäurekodierungssequenzen erforderlich sein. Solche Signale schließen das ATG-Initiationskodon und benachbarte Sequenzen ein. Exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationskodon, können zusätzlich benötigt werden. Der Fachmann ist sofort in der Lage dies festzustellen und die notwendigen Signale bereitzustellen. So ist es zum Beispiel wohl bekannt, dass das Initationskodon mit dem Leserahmen in der gewünschten Kodierungssequenz „in-frame" (oder in derselben Phase) sein muss, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Solche exogenen Translationskontrollsignale und InitiationsKodons können vielerlei Ursprung haben und zum Beispiel natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Die Expressionseffizienz kann durch das Einbeziehen von geeigneten Transkriptionsverstärkerelementen oder Transkriptionsterminatoren (Bittner et al., 1987) erhöht werden.
  • In eukaryotischen Expressionssystemen ist es ebenfalls üblicherweise gewünscht, in die Transkriptionseinheit eine geeignetes Polyadenylierungsstelle (zum Beispiel 5'-AATAAA-3') einzubringen, sofern ein solches nicht in dem zu klonierenden Segment enthalten ist. Typischerweise wird die Poly-A-Stelle etwa 30 bis 2.000 Nukleotide „downstream" von der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination platziert.
  • Für eine über einen langen Zeitraum andauernde und ertragreiche Produktion der rekombinanten Proteine ist eine stabile Expression zu bevorzugen. Es können beispielsweise Zelllinien hergestellt werden, die Konstrukte, welche Proteine kodieren, stabil exprimieren. Anstelle von Expressionsvektoren, die virale Replikationsstartpunkte enthalten, zu verwenden, können Wirtszellen mit Vektoren transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (zum Beispiel Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylationsstellen usw.) und einem auswählbaren Marker kontrolliert werden. Nach dem Einführen der Fremd-DNA wird den gentechnisch veränderten Zellen erlaubt, für ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, bevor sie auf ein Selektionsmedium umgestellt werden. Der auswählbare Marker in dem rekombinanten Plasmid überträgt eine Resistenz gegenüber der Auswahl und erlaubt dadurch, Zellen, welche das Plasmid stabil in ihre Chromosomen integriert haben, zu wachsen, um Foci zu bilden. Diese können anschließend kloniert werden und zu Zelllinien expandiert werden.
  • Es können eine Vielzahl von Auswahlsystemen eingesetzt werden, welche die Gene von Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977), von Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase- (Szybalska et al., 1962) und von Adeninphosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980), in entsprechenden tk-, hgprt- oder aprt-Zellen einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Es kann außerdem eine Stoffwechselresistenz als Basis für eine Auswahl auf DHFR, welches eine Resistenz gegen Methotrexat vermittelt (Wigler et al., 1980, O'Hare et al., 1981), GPT, welches eine Resistenz gegen Mycophenolsäure überträgt (Mulligan et al., 1981), Neo, welches eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 überträgt (Colberre-Garapin et al., 1981) und Hygro, welches eine Resistenz gegen Hygromycin überträgt (Santerre et al., 1984), verwendet werden.
  • Es ist außerdem zu berücksichtigen, dass die isolierten Nukleinsäuren, die in der Erfindung verwendet werden, „überexprimiert" sein können, dass heißt in einem erhöhten Maße verglichen mit der natürlichen Expression in der menschlichen Prostatazelle oder auch in Bezug zur Expression von anderen Proteinen in der rekombinanten Wirtszelle exprimiert werden können. Eine solche Überexpression kann durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich einer radioaktiven Markierung und/oder einer Proteinaufreinigung, abgeschätzt werden. Es sind jedoch einfache und direkte Verfahren bevorzugt, zum Beispiel solche, die ein SDS/PAGE und eine Proteinfärbung oder eine Western-Blot-Analyse, gefolgt von quantitativen Analysen, wie densitometrisches Scanning des erhaltenden Gels oder Blots, umfassen. Eine spezifische Erhöhung der Menge des rekombinanten Proteins oder Peptides im Vergleich zu der Menge in der natürlichen menschlichen Prostatazelle weist auf eine Überexpression hin, ebenso wie die relative Häufigkeit des spezifischen Proteins im Verhältnis zu anderen Proteinen, die durch die Wirtszelle produziert werden und um Beispiel in einem Gel sichtbar sind.
  • 2. Aufreinigung von exprimierten Proteinen
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Offenbarung betreffen die Aufreinigung und insbesondere Ausführungsformen, die wesentliche Aufreinigung, eines kodierenden Proteins oder Peptids. Der Begriff „gereinigtes Protein oder Peptid", wie er hierin verwendet wird, soll sich auf eine Zusammensetzung beziehen, die von anderen Komponenten abtrennbar ist, wobei das Protein oder Peptid bis zu jedem Reinheitsgrad im Verhältnis zu der natürlich gewinnbaren Form aufgereinigt werden kann, dass heißt in diesem Fall im Verhältnis zu dessen Reinheit innerhalb eines Prostatazellextrakts. Ein gereinigtes Protein oder Peptid bezieht sich daher auch auf ein Protein oder Peptid, welches frei von der Umgebung ist, in welcher es normalerweise auftreten kann.
  • Generell bezieht sich „ gereinigt" auf eine Protein- oder Peptidzusammensetzung, die einer Fraktionierung unterworfen wurde, um verschiedene andere Komponenten abzutrennen, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen ihre ausdrückliche biologische Aktivität behält. Wenn der Begriff „im Wesentlichen gereinigt" verwendet wird, bezieht sich dies auf eine Zusammensetzung, in welcher das Protein oder Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet, so dass nahezu 50% oder mehr der Proteine die Zusammensetzung bilden.
  • Zahlreiche Verfahren zur Bestimmung des Reinheitsgrades der Proteine oder Peptide sind dem Fachmann im Stand der Technik bekannt. Diese schließen zum Beispiel die Bestimmung der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion ein oder schließen die Ermittlung der Anzahl der Polypeptide innerhalb einer Fraktion mittels SDS/PAGE-Analyse ein. Ein bevorzugtes Verfahren zur Bewertung der Reinheit einer Fraktion berechnet die spezifische Aktivität der Fraktion, um sie mit der spezifischen Aktivität des Ausgangsextraktes zu vergleichen und dabei den Grad der Reinheit zu berechnen, welcher hierin durch die „-fache Reinheitsnummer" angegeben wird. Die tatsächlichen Einheiten, die verwendet werden, um die Aktivitätsmenge darzustellen, sind selbstverständlich abhängig von der speziellen Assay-Technik, die gewählt wurde, um im Anschluss an die Reinigung zu erfolgen, sowie abhängig davon ob oder ob nicht das exprimierte Protein oder Peptid eine nachweisbare Aktivität zeigt.
  • Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren, die zur Proteinreinigung geeignet sind, im Stand der Technik bekannt. Diese schließen zum Beispiel die Fällung mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern oder ähnlichem oder durch Hitzedenaturierung gefolgt von einer Zentrifugation, chromatographischen Schritten wie Ionenaustausch, Gelfiltration, reverse Phase, Hydroxylapatit und Affinitätschromatographie, isoelektrische Fokussierung, Gelelektrophorese und Kombinationen dieser und weiterer Verfahren ein. Wie es allgemein im Stand der Technik bekannt ist, ist davon auszugehen, dass die Reihenfolge beim Durchführen der verschiedenen Aufreinigungsschritte verändert werden kann oder dass bestimmte Schritte übergangen werden können und das Verfahren dennoch eine geeignete Methode zur Herstellung von im Wesentlichen gereinigten Proteinen oder Peptiden darstellt.
  • Es ist kein allgemeines Erfordernis, dass das Protein oder Peptid immer im höchstmöglichen Reinheitsgrad bereitgestellt werden muss. Tatsächlich ist zu berücksichtigen, dass weniger vollständig gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen nützlich sind. Eine teilweise Aufreinigung kann durch den Einsatz von weniger Aufreinigungsschritten in Kombination oder durch die Verwendung von verschiedenen Alternativen, um dasselbe allgemeine Reinigungsprotokoll umzusetzen, erreicht werden. Es ist zum Beispiel anerkannt, dass eine Kationen austauschende Säulenchromatographie, die unter Verwendung einer HPLC-Apparatur durchgeführt wird, im Allgemeinen zu einer höheren Reinheit führt, als wenn dieselbe Technik in einem Niedrigdruckchromatographiesystem eingesetzt wird. Verfahren, die einen niedrigeren Grad in der relativen Reinheit bieten, können Vorteile in Bezug auf die Gesamtgewinnung des Proteinprodukts oder in Bezug auf die Erhaltung der Aktivität des exprimierten Proteins besitzen.
  • Es ist auch bekannt, dass das Wanderverhalten eines Polypeptids unter verschiedenen Bedingungen, manchmal in signifikantem Maße, im SDS/PAGE-System variieren kann (Capaldi et al., 1997). Aus diesem Grund ist es auch einzusehen, dass das scheinbare Molekulargewicht in gereinigten oder teilweise gereinigten Expressionsprodukten unter verschiedenen Elektrophoresebedingungen variieren kann.
  • 3. Antikörperherstellung
  • Für einige Ausführungsformen wird es wünschenswert sein, Antikörper zu produzieren, die mit hoher Spezifität an das/die Polypeptidprodukt(e) der isolierten Nukleinsäure ausgewählt aus SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3 und SEQ ID Nr: 14 oder die offenbarten Prostataerkrankungsmarkergene: Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und Semenogelin II binden. Methoden zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • Verfahren zur Herstellung polykloner Antikörper sind im Stand der Technik wohl bekannt. Zusammengefasst: ein polyklonaler Antikörper wird durch Immunisierung eines Tiers mit einer immunogenen Zusammensetzung und Sammeln des Antiserums von dem immunisierten Tier hergestellt. Eine Vielzahl von Tierarten kann für die Produktion von Antiserum eingesetzt werden. Typischerweise han delt es sich bei dem Tier, das zur Produktion eines Anti-Antiserums eingesetzt wird, um einen Hasen, eine Maus, eine Ratte, einen Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Wegen der verhältnismäßig großen Blutmenge der Hasen, ist ein Hase die bevorzugte Wahl zur Produktion von polyklonalen Antikörpern.
  • Es ist im Stand der Technik bekannt, dass eine vorgegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren kann. Aus diesem Grund ist es oft nötig, das Immunsystem des Wirtes zu stimulieren, was durch das Koppeln eines peptidischen oder polypeptidischen Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind das Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) und das bovine Serumalbumin (BSA). Andere Albumine wie Ovalbumin, Mäuseserumalbumin oder Hasenserumalbumin können ebenso als Träger verwendet werden. Mittel, um ein Polypeptid an ein Trägerprotein zu koppeln, sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und Bis-biazotiertes Benzidin ein.
  • Es ist außerdem im Stand der Technik bekannt, dass die Immunogenität von bestimmten immunogenen Zusammensetzungen durch die Verwendung von unspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, bekannt als Adjuvantien, verstärkt werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien schließen das komplette Freund's Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobakterium tuberculosis enthält), unvollständiges Freund's Adjuvans und Aluminiumhydroxyd-Adjuvans ein.
  • Die Menge der immunogenen Zusammensetzung, die zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von der Art des Immunogens sowie in Abhängigkeit des Tieres, welches für die Immunisierung eingesetzt wird. Eine Vielzahl von Verabreichungsrouten kann für das Immunogen verwendet werden (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Bildung von polyklonalen Antikörpern kann anhand von Blutproben des immunisierten Tieres, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung gesammelt werden, überwacht werden. Eine zweite Boosterinjektion kann auch verabreicht werden. Das Verfahren der Boosterinjektion und der Titerbestimmung wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Sobald ein gewünschtes Maß an Immunogenität erreicht ist, kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum isoliert und aufbewahrt werden und/oder das Tier kann zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MAbs) eingesetzt werden. Zur Gewinnung von polyklonalen Hasen-Antikörpern kann das Tier über die Ohrvene oder alternativ über eine Herzpunktur ausgeblutet werden. Man lässt das gewonnene Blut koagulieren und zentrifugiert es dann, um Serumbestandteile von den ganzen Zellen und Blutgerinseln abzutrennen. Das Serum kann für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden oder es kann die gewünschte Antikörperfraktion mit wohlbekannten Verfahren wie der Affinitätschromatographie unter Verwendung eines anderen Antikörpers oder eines Peptides, das an eine feste Matrix gebunden ist, aufgereinigt werden.
  • Monoklonale Antikörper (MAbs) können ebenso mittels wohlbekannter Techniken, wie sie beispielhaft in US-Patent Nr. 4,196,265 erläutert sind, hergestellt werden. Typischerweise beinhaltet dieses Verfahren die Immunisierung eines geeigneten Tieres mit einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, zum Beispiel einem gereinigten oder teilweise gereinigten exprimierten Protein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird in einer Art und Weise verabreicht, die wirksam die Antikörper-produzierenden Zellen stimuliert.
  • Die Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (MAbs) bedienen sich anfangs grundsätzlich derselben Verfahrensschritte wie die zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern. Nager wie Mäuse und Ratten sind die bevorzugten Tiere. Es können jedoch auch Hasen-, Schaf- oder Froschzellen verwendet werden. Die Verwendung von Ratten weist gewisse Vorteile auf (Goding, 1986), dennoch sind Mäuse bevorzugt und insbesondere BALB/c-Mäuse sind bevorzugt, da sie am häufigsten eingesetzt werden und normalerweise einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen liefern.
  • Den Tieren wird wie oben beschrieben ein Antigen injiziert. Das Antigen kann, falls nötig, wie das Keyhole Limpet Hämocyanin an ein Trägermolekül gekoppelt sein. Das Antigen würde typischerweise mit einem Adjuvans, Freund's vollständigem oder unvollständigen Adjuvans gemischt werden. Boosterinjektionen mit demselben Antigen würden in ungefähren Zweiwochenintervallen durchgeführt werden.
  • Im Anschluss an die Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zur Bildung von Antikörpern, insbesondere B-Lymphozyten (B-Zellen), für die Verwendung in einem Protokoll zu Herstellung von MAb ausgewählt. Solche Zellen können durch die Biopsie der Milz, der Mandeln oder von Lymphknoten oder aus peripheren Blutproben gewonnen werden. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt. Die zuerst genannten werden bevorzugt aus dem Grund, dass sie eine reichhaltige Quelle für Antikörper-produzierende Zellen sind, die in einem sich teilenden Plasmablastenstadium sind. Die zuletzt genannten werden bevorzugt, da periphere Blutzellen leicht zugänglich sind. Oft wird eine Gruppe von Tieren immunisiert und die Milz des Tieres mit dem höchsten Antikörpertiter wird entfernt und die Lymphozyten der Milz durch Homogenisierung der Milz mit einer Spritze gewonnen. Typischerweise enthält die Milz einer immunisierten Maus annäherungsweise 5 × 107 bis 2 × 108 Lymphozyten.
  • Die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten des immunisierten Tieres werden dann mit Zellen einer sich unbegrenzt vermehrenden Myelomzelllinie fusioniert, wobei normalerweise die Myelomzelllinie aus derselben Art wie das immunisierte Tier stammt. Myelomzelllinien, die zur Bildung in Hybridom-bildenden Fusionsverfahren eingesetzt werden, sind vorzugsweise keine Antikörper-produzierenden Zellen, zeigen eine hohe Fusionseffizienz und zeigen Enzymmängel, die es ihnen unmöglich machen, in bestimmten Selektionsmedien zu wachsen, außer das Wachstum wird durch die erwünschte Fusion von Zellen (Hybridome) ermöglicht.
  • Es ist möglich, irgendeine der dem Fachmann bekannten Myelomzellen zu verwenden (Goding, 1986; Campbell, 1984). Beispielsweise können für den Fall, dass das immunisierte Tier eine Maus ist, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul eingesetzt werden. Sofern Ratten verwendet werden, können R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 eingesetzt werden; und die Zellen U-266, GMI500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 können alle in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen eingesetzt werden.
  • Eine bevorzugte Maus-Myelomzelle ist die NS-1 Myelomzelllinie (ebenso bekannt unter P3-NS-1-Ag4-1), die von NIGMX Human Genetic Mutant Cell Repository auf Anfrage nach der Zelllinie mit der Zugriffsnummer GM3573 bezogen werden kann. Eine andere Maus-Myelomzelllinie, die eingesetzt werden kann, ist die 8-Azaguanin resistente, nicht produzierende Maus-Myelomzelllinie SP2/0.
  • Die Verfahren zur Herstellung von Hybriden der Antikörper-produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen normalerweise das Mischen der somatischen Zellen mit den Myelomzellen in einem 2:1-Verhältnis, wobei das Verhältnis zwischen etwa 20:1 bis etwa 1:1 variieren kann und das Ganze in Anwesenheit eines Agens oder von Agenzien (chemisch oder elektrisch), das/die eine Membranfusion fördert/fördern, durchgeführt wird. Von Kohler und Milstein (1975, 1976) wurden auch Fusionsverfahren beschrieben, die das Sendaivirus einsetzen, sowie solche, die Polyethylenglycol (PEG), wie zum Beispiel 37% (v/v) PEG einsetzen, wurden von Gefter et al. (1977) beschrieben. Auch der Einsatz von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist geeignet (Goding, 1986).
  • Fusionsverfahren liefern lebensfähige Hybride gewöhnlich nur in einer sehr geringen Ausbeute, etwa 1 × 10–6 bis 1 × 10–8. Das stellt jedoch kein Problem dar, da die lebensfähigen fusionierten Hybride von den elterlichen, unfusionierten Zellen (insbesondere von nicht fusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unbegrenzt teilen würden) durch das Kultivieren in einem Selektionsmedium abgetrennt werden. Das Selektionsmedium enthält für gewöhnlich ein Agens, das die de novo Synthese von Nukleotiden in dem Gewebekulturmedium unterbindet. Beispielhafte und bevorzugte Agenzien sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wobei Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Sofern Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Tymidin als Nukleotidquellen (HAT Medium) ergänzt. Sofern Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
  • Das bevorzugte Selektionsmedium ist das HAT. Im HAT-Medium überleben nur solche Zellen, die in der Lage sind, Nukleotide nach dem Salvage-Pathway zu verarbeiten. Den Myelomzellen fehlt das Schlüsselenzym des Salvage-Pathways, nämlich zum Beispiel Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), und so können sie nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Weg beschreiten, sie haben jedoch eine begrenzte Lebensdauer in der Kultur und sterben gewöhnlich innerhalb von 2 Wochen. Folglich sind die einzigen Zellen, die in dem Selektionsmedium überleben, solche, die Hybride aus Myeloma- und B-Zellen geformt haben.
  • Eine derartige Kultivierung der Zellen stellt eine Population von Hybridomen bereit, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Üblicherweise wird die Auswahl der Hybridome mittels einer Kultivierung der Zellen nach Einzelklonverdünnung in Mikrotiterplatten, gefolgt von einem Test der individuellen klonalen Überstände (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität durchgeführt. Das Assay sollte sensibel, einfach und schnell, wie Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Zytotoxizitätsassays, Plaqueassays, Dot-Immunobinding-Assays und ähnliche sein.
  • Die ausgewählten Hybridome würden dann seriell verdünnt und zu individuellen, Antikörper-produzierenden Zelllinien geklont werden, wobei die Klone dann unbegrenzt vermehrt werden können, um monoklonale Antikörper MAbs bereitzustellen. Die Zelllinien können auch auf zwei grundsätzlichen Weisen zur MAb-Herstellung eingesetzt werden. Eine Probe der Hybridome kann zum Beispiel in ein histokompatibles Tier derjenigen Art, die auch zur Gewinnung der somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion verwendet wurde, injiziert werden (oft in die Bauchhöhle). Das injizierte Tier entwickelt Tumore, die spezifische monoklonale Antikörper sekretieren, welche von den fusionierten Zellhybriden produziert werden. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie das Serum oder die Bauchwasserflüssigkeit, können dann angezapft werden, um MAbs in hohen Konzentrationen bereitzustellen. Die einzelnen Zelllinien können auch in vitro kultiviert werden, wobei die MAbs auf natürliche Weise in das Kulturmedium sekretiert werden, aus welchem sie dann leicht in hohen Konzentrationen gewonnen werden können. MAbs, die nach einer der beiden Methoden erzeugt wurden, können, sofern es erwünscht ist, unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren wie HPLC oder Affinitätschromatographie weiter gereinigt werden.
  • Große Mengen an monoklonalen Antikörpern können auch durch die Vervielfältigung von Hybridomzellen in vivo erhalten werden. Hierzu werden Zellklone in ein Säugetier, welches mit den elterlichen Zellen histokompatibel ist, zum Beispiel syngenetische Mäuse, injiziert, um das Wachstum von Antikörperproduzierenden Tumoren anzuregen. Wahlweise werden die Tiere mit einem Kohlenwasserstoff, besonders Ölen wie etwa Pristane (Tetramethylpentadekan) vor der Injektion vorbereitet.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können Fragmente der monoklonalen Antikörper der Erfindung aus den wie oben beschrieben produzierten monoklonalen Antikörpern durch Verfahren, welche eine enzymatische Verdauung mit Pepsin oder Papain und/oder die Aufspaltung von Disulfid-Brücken mittels chemischer Reduktion einschließen, erhalten werden. Alternativ können die monoklonalen Antikörperstücke, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, unter Verwendung von automatisierten Peptid-Synthesegeräten synthetisiert werden.
  • Die monoklonale Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung werden mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt, wobei die monoklonalen Antikörper, die wie oben beschrieben erzeugt wurden, zum Beispiel mit einem Enzym in der Anwesenheit eines Kopplungsagens wie Glutaraldehyd oder Periodat zur Reaktion gebracht werden. Konjugate mit Fluorescein-Markern werden in Anwesenheit dieser Kopplungsreagenzien oder durch Umsetzung mit einem Isothiocyanat hergestellt. Konjugate mit Metallchelaten werden auf ähnliche Art und Weise hergestellt. Andere Bestandteile, an welche Antikörper konjugiert werden können, schließen Radionuklide wie 3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu und 99mTc ein. Radioaktiv markierte, monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung werden nach wohlbekannten Verfahren des Standes der Technik hergestellt. So können zum Beispiel monoklonale Antikörper durch den Kontakt mit Natrium- oder Kaliumiodid und einem chemischen Oxidationsmittel wie Natriumhypochlorit oder einem enzymatischen Oxidations mittel, wie Lactoperoxidase, iodiert werden. Monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung können mit Technetium-99 über ein Ligandenaustauschverfahren, wie zum Beispiel durch die Reduktion von Pertechnat mit Zinnlösung, durch Chelieren des reduzierten Technetium an einer Sephadexsäule und das Aufbringen des Antikörpers auf diese Säule oder durch direkte Markierungsverfahren, wie zum Beispiel durch Inkubieren von Pertechnat, einem reduzierenden Agens wie SnCl2, einer Pufferlösung wie Natrium-Kalium-Phthalat-Lösung und dem Antikörper, markiert werden.
  • Es wird vom Fachmann erkannt, dass monoklonale und polyklonale Antikörper, die spezifisch für ein Protein sind, das vorzugsweise von metastasierendem oder nicht-metastasierendem, menschlichen Prostatakrebs exprimiert wird, in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich sein kann. Diese können die Bereitstellung von diagnostischen Kits zum Nachweis oder der Diagnose von menschlichem Prostatakrebs umfassen. Eine alternative Verwendung wäre die Verbindung solcher Antikörper mit therapeutischen Agenzien wie zum Beispiel chemotherapeutischen Agenzien, und einer nachfolgenden Verabreichung an Patienten mit Prostatakrebs, wobei die Prostatakrebszellen spezifisch zur Zerstörung angesteuert würden.
  • D. Immun-Nachweis-Assays
  • 1. Immunodetektionsverfahren
  • In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Immunodetektionsverfahren zur Bindung, Aufreinigung, Entfernen, Quantifizieren oder anderweitig allgemein den Nachweis von biologischen Bestandteilen. Die kodierenden Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um Antikörper, die mit diesen reagieren, nachzuweisen, oder in anders gearteten Ansätzen können Antikörper, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, dazu eingesetzt werden, die kodierenden Proteine oder Peptide nachzuweisen. Die einzelnen Schritte der verschiedenen geeigneten Immunodetektionsverfahren wurden in der wissenschaftlichen Literatur (zum Beispiel Nakamura et al., 1987a, Nakamura et al., 1987b), beschreiben.
  • Im Allgemeinen beinhalten immunbindende Verfahren das Beschaffen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie ein Protein, Peptid oder einen Antikörper enthält, sowie das in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper oder Protein oder Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung unter Umgebungsbedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen ermöglichen.
  • Solche immunbindenden Verfahren schließen Verfahren zum Nachweis oder der Quantifizierung der Menge der reaktiven Bestandteile in einer Probe ein, wobei die Verfahren den Nachweis oder die Quantifizierung von jeglichen Immunkomplexen, die während der Bindungsphase entstanden sind, erfordern. Für die Erfindung würde man eine Probe entnehmen, von der vermutet wird, dass sie ein Prostataerkrankungsmarker-kodierendes Protein, Peptid oder einen entsprechenden Antikörper enthält, und die Probe mit einem Antikörper oder kodierendem Protein oder Peptid je nach Fall in Kontakt bringen und anschließenden die Menge der unter bestimmten Bedingungen gebildeten Immunkomplexe nachweisen oder quantifizieren.
  • In Bezug auf den Antigennachweis kann die analysierte biologische Probe eine beliebige Probe sein, von der vermutet wird, dass sie ein Prostataerkrankungs-spezifisches Antigen enthält. Eine solche Probe kann ein Gewebeschnitt oder eine Einzelprobe der Prostata oder des Lymphknotens, ein homogenisierter Gewebeextrakt, eine isolierte Zelle, eine Zellmembranzubereitung, eine abgetrennte Blutlymphozyte oder eine gereinigte Form einer der oben erwähnten, Protein-enthaltenden Zusammensetzungen oder jede andere biologische Flüssigkeit, die in Kontakt mit Prostatageweben kommt, einschließlich Blut-, Lymph- oder auch Samenflüssigkeit, sein.
  • Das in Kontakt bringen der ausgewählten biologischen Proben mit dem Protein, Peptid oder Antikörper unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der ausreichend zur Bildung von Immunkomplexen ist (primäre Immunkomplexe), ist im Allgemeinen eine einfache Zugabe der Zusammensetzungen zu der Probe und ein Inkubieren der Mischung für einen Zeitraum, der lang genug ist, damit die Antikörper Immunkomplexe mit einem anwesenden Antigen bilden, dass heißt an es binden, können. Nach dieser Inkubationszeit werden die Proben-Antikörperzusammensetzungen wie ein Gewebeschnitt, eine ELISA-Platte, ein Dot-Blot oder ein Western-Blot normalerweise gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen und somit nur den Nachweis von solchen Antikörpern, die spezifisch in dem primären Immunkomplex gebunden sind, zu erlauben.
  • Im Allgemeinen ist der Nachweis einer Immunkomplexbildung im Stand der Technik wohl bekannt und kann über die Anwendung von zahlreichen Verfahren erreicht werden. Diese Verfahren basieren normalerweise auf dem Nachweis von Labeln oder Markern, wie jeglichen radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder enzymatischen Tags oder Labeln, die standardmäßig im Stand der Technik eingesetzt werden. Die US-Patente, die solche Label betreffen, schließen die Nummern 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241 ein. Selbstverständlich sind mit der Verwendung eines zweiten bindenden Ligandens, wie einem zweiten Antikörper oder einem Biotin-/Avidin-Liganden zusätzliche Vorteile verbunden. Dies ist im Stand der Technik bekannt.
  • Das kodierende Protein, Peptid oder der korrespondierende Antikörper, das/der im Nachweis eingesetzt wird, kann selbst an ein nachweisbares Label gebunden sein, wobei man dann einfach das Label nachweisen würde und darüber die Bestimmung der Menge der primären Immunkomplexe in der Zusammensetzung möglich wäre.
  • Alternativ hierzu kann der erste zugegebene Bestandteil, der in dem primären Immunkomplex gebunden wird, durch den Einsatz eines zweiten Bindungsliganden, der eine Bindungsaffinität für das kodierenden Protein, Peptid oder den korrespondierenden Antikörper hat, nachgewiesen werden. In diesen Fällen kann der zweite Bindungsligand an ein nachweisbares Label gebunden sein. Der zweite Bindungsligand ist oft selbst ein Antikörper, weswegen er „sekundärer" Antikörper genannt wird. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten, sekundären Bindungsliganden oder Antikörper unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um die Bildung von sekundären Immunkomplexen zu erlauben, in Kontakt gebracht. Die sekundären Immunkomplexe werden dann gewöhnlich gewaschen, um unspezifisch gebundene markierte sekundäre Antikörper oder Liganden zu entfernen und dann die übrigen Markierungen der sekundären Immunkomplexe nachzuweisen.
  • Weitere Verfahren schließen den Nachweis der primären Immunkomplexe in einem aus zwei Schritten bestehenden Ansatz ein. Ein zweiter Bindungsligand wie ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität zu dem kodierenden Protein, Peptid oder dem korrespondierenden Antikörper hat, wird eingesetzt, um einen sekundären Immunkomplex wie oben beschrieben zu bilden. Nach dem Waschen wird der sekundäre Immunkomplex mit einem dritten, bindenden Ligand oder Antikörper, der Bindungsaffinität zu dem zweiten Antikörper zeigt, unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um die Bildung eines Immunkomplexes (tertiäre Immunkomplexe) zu erlauben, in Kontakt gebracht. Der dritte Ligand oder Antikörper ist an ein nachweisbares Label gebunden, wodurch der Nachweis der tertiären Immunkomplexe, die so gebildet wurden, ermöglicht wird. Ein solches System ermöglicht eine Signalverstärkung, sofern dies erwünscht ist.
  • Immundetektionsverfahren der vorliegenden Erfindung sind offensichtlich zur Diagnose von Zuständen wie Prostatakrebs oder benigner Prostatahyperplasie geeignet. Hierbei wird eine biologische oder klinische Probe, von der vermutet wurde, dass sie entweder das kodierende Protein oder Peptid oder den korrespondierenden Antikörper enthält, verwendet. Diese Ausführungsformen finden jedoch auch Anwendung bei nicht-klinischen Proben, wie zum Beispiel bei der Titierung von Antigen- oder Antikörper-Proben, der Auswahl von Hybridomen und ähnlichem. In der klinischen Diagnose oder bei der Überwachung von Patienten mit Prostatakrebs bedeutet der Nachweis einer reduzierten Menge an Antigen, welches von einer Nukleinsäure für einen Prostataerkrankungsmarker kodiert wird, im Vergleich zu der Menge in entsprechenden biologischen Proben eines gesunden Patienten, dass der Patient Prostatakrebs hat. Diese diagnostischen Verfahren beruhen zum Teil darauf, dass durch die Nukleinsäuren für die Prostatakrebsmarker, die in der vorliegende Erfindung identifiziert wurden, in Proben mit Prostatakrebsgewebe oder peripherem Blut unterexprimiert sind (siehe die Beispiele weiter unten).
  • Als ein Zwischenergebnis kann hieraus abgeleitet werden, dass zumindest einige dieser Marker niedrigere Mengen des kodierenden Proteins produzieren, welches dann ebenfalls als Prostatakrebsmarker verwendet werden kann.
  • Der Fachmann ist vertraut mit der Unterscheidung zwischen einer reduzierten Expression eines Biomarkers, die einen positiven Nachweis darstellt, und Hintergrundexpression eines Biomarkers. In der Tat werden die Expressionslevel des Hintergrunds oft dazu eingesetzt, eine Grenze zu bilden, über der eine reduzierte Anfärbung als signifikant oder positiv zu bewertet wird. Eine signifikante Expression kann durch geringere Menge Antigen in Geweben oder in den Körperflüssigkeiten dargestellt werden oder in einem alternativen Ansatz auch über einen niedrigen Anteil an Zellen, die jeweils ein positives Signal innerhalb eines Gewebes geben.
  • 2. Immunhistochemie
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit sowohl frisch eingefrorenen und Formalin-fixierten Paraffinschnitten zur Immunhistochemie (IHC) eingesetzt werden. Jedes im Stand der Technik beschriebene IHC-Verfahren kann eingesetzt werden, wie zum Beispiel solche, die in „Diagnostic Immunopathology", 2. Auflage, editiert von Robert B. Colvin, Atul K. Bhan und Robert T. McCluskey, Raven Press, New York, 1995, und insbesondere Kapitel 31 dieser Literaturstelle, welches mit Gynecological and Genitourinary Tumors überschrieben ist (Seiten 579–597), von Debra A. Bell, Robert H Young und Robert E. Scully und Verweisen darin, beschrieben sind.
  • 3. ELISA
  • Wie bereits beschrieben, können die kodierenden Proteine und Peptide gemäß der Erfindung als immunogene Substanzen zum Beispiel in Verbindung mit einer Impfstoffentwicklung, bei der Immunhistochemie und in ELISA-Assays eingesetzt werden. Eine offensichtliche Einsatzmöglichkeit der kodierenden Antigene und korrespondierenden Antikörper ist ein Immunoassay zum Nachweis des Marker proteins für eine Prostataerkrankung, welches in der Diagnose und bei der Prognose benötigt wird.
  • Immunoassays sind in ihrer einfachsten und direktesten Form Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunoassays sind die verschiedenen Arten des Enzym-gebundenen Immun-absorbierende Assays (ELISAs, enzyme linked immunosorbant assay) und der Radioimmunoassays (RIA), die im Stand der Technik bekannt sind. Auch besonders geeignet ist der immunhistochemische Nachweis in Gewebeschnitten. Es ist sofort ersichtlich, dass der Nachweis nicht auf solche Techniken beschränkt ist und ebenso Western-Blot, Dot-Blot, FACS-Analysen und ähnliches eingesetzt werden können.
  • In einem beispielhaften ELISA werden Antikörper, die die kodierende Proteine der Erfindung binden, auf ausgewählten Oberflächen, die eine Proteinaffinität aufweisen, wie zum Beispiel die Vertiefungen einer Polystrenmikrotiterplatte, immobilisiert. Anschließend wird eine zu testende Zusammensetzung, von der vermutet wird, dass sie Antigene des Prostataerkrankungsmarkers enthält, beispielsweise eine klinische Probe, in die Vertiefungen gegeben. Nach einem Bindungsschritt und einem Waschschritt, um unspezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen, kann das gebundene Antigen nachgewiesen werden. Der Nachweis wird normalerweise durch Zugabe eines zweiten Antikörpers, der für das Zielprotein spezifisch ist, und der mit einem nachweisbaren Label markiert ist, geführt. Diese Form des ELISAs wird „Sandwich-ELISA" genannt. Der Nachweis kann auch über die Zugabe eines zweiten Antikörpers, gefolgt von der Zugabe eines dritten Antikörpers, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper hat und der mit einem detektierbaren Label markiert ist, geführt werden.
  • In einem weiteren exemplarischen ELISA werden die Proben, von denen angenommen wird, dass sie ein Markerantigen der Prostataerkrankung enthalten, auf der Oberfläche einer Vertiefung immobilisiert und anschließend mit den Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht. Nach einem Bindungs- und einem Waschschritt zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Immunkomplexen wird das gebundene Antigen nachgewiesen. Dort wo die anfangs eingesetzten Antikörper mit einem detektierbaren Label markiert sind, können die Immunkom plexe direkt nachgewiesen werden. Die Immunkomplexe können wiederum auch durch die Verwendung eines zweiten Antikörpers, der Bindungsaffinität zu dem ersten Antikörper hat und der mit einem detektierbaren Label markiert ist, nachgewiesen werden.
  • Im anderen ELISA-Typ, in welchem die Proteine und Peptide immobilisiert werden, erfolgt der Nachweis durch Antikörper-Competition. In einem solchen ELISA werden markierte Antikörper in die Vertiefungen gegeben, um eine Bindung mit dem Proteinmarker der Prostataerkrankung zu erlauben und über das Label anschließend nachgewiesen. Die Menge des Markerantigens in einer unbekannten Probe wird dann durch das Mischen der Probe mit markierten Antikörpern vor oder während der Inkubation in der beschichteten Vertiefung bestimmt. Die Anwesenheit von Markerantigen in einer Probe führt zu einer Abnahme der verfügbaren Antikörpermenge, die an die Oberfläche der Vertiefungen binden kann und verringert damit das endgültige Signal. Dieses Verfahren ist geeignet, um Antikörper in einer unbekannten Probe nachzuweisen, wo die unmarkierten Antikörper an die Antigen-beschichteten Vertiefungen binden und so die Menge des verfügbaren Antigenes, welches die markierten Antikörper bindet, reduziert wird.
  • Unabhängig von dem gewählten Typ haben ELISAs bestimmte Merkmale gemeinsam, wie die Beschichtung, die Inkubation oder die Bindung, das Waschen, um unspezifisch gebundene Bestandteile zu entfernen und den Nachweis der gebundenen Immunkomplexe zu führen. Diese sind im Nachfolgenden beschrieben:
    Bei der Beschichtung einer Platte mit entweder Antigen oder Antikörper inkubiert man die Vertiefungen der Platte üblicherweise über Nacht oder für eine bestimmte Dauer mit einer Lösung, die Antigen oder Antikörper enthält. Die Vertiefungen der Platte werden dann gewaschen, um unvollständig absorbiertes Material zu entfernen. Die noch verfügbaren Oberflächen der Vertiefungen werden dann mit unspezifischem Protein, welches unter Berücksichtigung der zu testenden Antisera immunologisch neutral ist, beschichtet. Solche unspezifischen Proteine schließen bovines Serumalbumin (BSA), Casein und Milchpulverlösungen ein. Die Beschichtung blockiert unspezifische Adsorbtionsstellen der immobilisierenden O berfläche und reduziert damit den Hintergrund, der durch unspezifische Bindung des Antiserums an die Oberfläche verursacht würde.
  • Es ist wahrscheinlich bei ELISAs üblicher, ein zweites oder drittes Nachweismittel einzusetzen, als ein direktes Nachweisverfahren durchzuführen. So wird nach der Bindung des Proteins oder Antikörpers an die Vertiefung, nach dem Beschichten mit nichtreaktivem Material, um den Hintergrund zu reduzieren und nach dem Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, diese immobilisierte Oberfläche mit einer Kontrollprobe für menschliche Prostataerkrankung und/oder einer klinischen oder biologischen Probe, die unter Bedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen (Antigen/Antikörper) ermöglichen, zu testen sind, in Kontakt gebracht wird. Der Nachweis der Immunkomplexe erfordert dann einen markierten sekundären Bindungsliganden oder Antikörper oder einen sekundären Bindungsliganden oder Antikörper in Verbindung mit einem markierten tertiären Antikörper oder dritten Bindungsliganden.
  • Mit der Formulierung „unter Bedingungen, die die Bildung von Immunkomplexen (Antigen/Antikörper) erlauben", versteht man Bedingungen, die vorzugsweise eine Verdünnung der Antigene und Antikörper mit einer Lösung wie BSA, bovinem Gamma-Globulin (BGG) und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween einschließen. Die zugesetzten Agenzien helfen auch, den unspezifischen Hintergrund zu verringern.
  • Die „geeigneten" Bedingungen bedeuten außerdem, dass die Inkubation bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne durchgeführt wird, die ausreichend ist, um eine wirksame Bindung zu ermöglichen. Inkubationsschritte finden typischerweise für einen Zeitraum von etwa ein bis zwei bis vier Stunden und vorzugsweise bei Temperaturen in der Größenordnung von 25–27°C oder auch über Nacht bei etwa 4°C statt.
  • Im Anschluss an die Inkubationsschritte in einem ELISA werden die kontaktierten Oberflächen gewaschen, um unkomplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren schließt das Waschen mit Lösungen wie PBS/Tween oder Boratpuffer ein. Im Anschluss an die Bildung von spezifischen Immunkom plexen zwischen der zu testenden Probe und dem ursprünglich gebundenen Material sowie den nachfolgenden Waschschritten, kann auch das Auftreten von minimalen Mengen der Immunkomplexe nachgewiesen werden.
  • Um ein Nachweismittel bereit zustellen werden der zweite oder dritte Antikörper mit einem assoziierten Label, welches den Nachweis ermöglicht, haben. Vorzugsweise wird dieses Label ein Enzym sein, das eine Farbveränderung während der Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat bewirkt. Daher ist es zum Beispiel wünschenswert, den ersten oder zweiten Immunkomplex mit einer Urease, Glucoseoxidase, alkalischen Phosphatase oder einem Wasserstoffperoxidase-konjugierten Antikörper für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die die Bildung weiterer Immunkomplexe begünstigen, zu inkubieren (zum Beispiel Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS-enthaltenden Lösung wie PBS-Tween).
  • Nach der Inkubation mit dem markierten Antikörper und im Anschluss an den Waschschritt, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge des Labels quantifiziert. Hierzu wird zum Beispiel mit einem chromogenen Substrat wie Harnstoff und Bromkresolpurpur oder 2,2'-Azido-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) [ABTS] und H2O2 für den Fall, dass es sich bei dem Enzymlabel um eine Peroxidase handelt, inkubiert. Die Quantifizierung wird dann über die Messung der Farbentwicklung zum Beispiel unter Verwendung eines Spektrophotometers im sichtbaren Bereich ermöglicht
  • 4. Verwendung von Antikörpern für ein Radioimage
  • Die Antikörper, die in dieser Erfindung verwendet werden, werden dazu eingesetzt, die Expression des kodierenden Markerproteins zu quantifizieren und zu lokalisieren. Der Antikörper wird dazu zum Beispiel in einer Reihe von Verfahren markiert und eingesetzt, um die Konzentration der Zellen, die das kodierende Protein produzieren, sichtbar zu machen.
  • Die Offenbarung betrifft auch ein bildgebendes in vivo Verfahren eines pathologischen Prostatazustandes unter Verwendung der oben beschriebenen monoklo nalen Antikörper. Dieses Verfahren beinhaltet insbesondere die Verabreichung von einer für die Bildgebung ausreichenden Menge eines nachweisbar markierten Prostatakrebs-spezifischen monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes davon und eines pharmakologisch wirksamen Trägers an ein Subjekt. Das Verfahren enthält weiter den Nachweis der Bindung des markierten monoklonalen Antikörpers an das erkrankte Gewebe oder im Fall von runterregulierten Markergenen gesundem Gewebe. Der Begriff „in vivo Bildgebung" bezieht sich auf jedes Verfahren, welches den Nachweis eines markieren, monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung oder eines Fragments davon, der spezifisch an ein erkranktes Gewebe, welches im Körper des Patienten lokalisiert ist, bindet, erlaubt. Ein „Subjekt" ist ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch. Eine „ für die Bildgebung ausreichende Menge" bedeutet, die Menge des nachweisbar markierten, monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments desselben, die verabreicht wurde und ausreichend ist, um den Nachweis der Bindung des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes desselben an das erkrankte Gewebe oder der Bindung des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragmentes desselben in größeren Anteilen an gesundes Gewebe verglichen mit erkranktem Gewebe zu ermöglichen.
  • Ein zu berücksichtigender Gesichtspunkt bei der Auswahl eines Radionuklids für eine in vivo Diagnose ist es, dass die Halbwertzeit des Nuklids lang genug ist, so dass es auch nach dem Zeitraum für die maximale Aufnahme durch das Zielobjekt noch nachgewiesen werden kann, und kurz genug ist, so dass die schädliche Strahlenbelastung für den Wirt wie auch die Hintergrundbelastung minimiert wird. Idealerweise fehlt einem Radionuklid, das für in vivo Bildgebung eingesetzt wird, eine partikuläre Emission, wobei es jedoch eine große Zahl an Photonen in einem Bereich von 140–2000 keV produziert, die mit herkömmlichen Gamma-Kameras nachgewiesen werden können.
  • Ein Radionuklid kann entweder direkt oder indirekt unter Verwendung einer intermediären, funktionellen Gruppe an einen Antikörper gebunden werden. Intermediäre, funktionelle Gruppen, die oft zur Bindung von Radioisotopen, die als Metallionen vorliegen, an Antikörper eingesetzt werden, sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Beispiele für Metallionen, die für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, sind 99mTc, 123I, 131I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, 125I, 68Ga, 72As, 89Zr und 201Tl.
  • In Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann der monoklonale Antikörper oder ein Fragment desselben durch mehrere im Stand der Technik bekannte Verfahren markiert werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ebenso paramagnetische Isotope für den Einsatz eines in vivo Nachweises verwenden. Elemente, die besonders für eine durch Kernspintomographiebildgebende Untersuchungen (Magnetic Resonance Imaging, MRI) geeignet sind, schließen 127Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr und 56Fe ein.
  • Die Verabreichung des markierten Antikörpers kann lokal oder systemisch sowie intravenös, intraarteriell, über die Rückenmarksflüssigkeit oder ähnliches erfolgen. Die Verabreichung kann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Körperstelle auch intradermal oder intrakavitar erfolgen. Nachdem genügend Zeit, beispielsweise 30 Minuten bis 48 Stunden, vergangen ist, so dass der monoklonale Antikörper oder ein Fragment desselben an das erkrankte und/oder gesunde Gewebe binden konnte, wird die Region des zu untersuchenden Patienten unter Verwendung von üblichen bildgebenden Verfahren wie MRI, SPECT, planarer Szintigraphie oder sich entwickelnder Abbildungstechniken untersucht. Der exakte Ablauf variiert notwendigerweise in Abhängigkeit von spezifischen Faktoren des Patienten, wie oben schon bemerkt, und hängt auch von der zu untersuchenden Körperstelle, den Verfahren der Verabreichung und dem Typ des Markers ab. Das Festlegen eines bestimmten Ablaufes stellt eine Routinetätigkeit für den Fachmann dar. Die Verteilung der gebundenen, radioaktiven Isotope und ihre Zu- oder Abnahme im Verlauf der Zeit wird dann überwacht und aufgezeichnet. Durch Vergleich der Ergebnisse, die aus Untersuchungen mit klinisch gesunden Individuen stammen, kann das Vorliegen und das Ausmaß von erkranktem Gewebe bestimmt werden.
  • Es ist offensichtlich für den Fachmann, dass ähnliche Ansätze eingesetzt werden können, um die Bildung des kodierenden Markerproteins für eine Prostataerkrankung im menschlichen Patienten mittels Radioimage nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für eine in vivo Diagnostik von Prostataerkran kungen in einem Patienten bereit. Diese Verfahren beinhalten gewöhnlich das Verabreichen einer effektiven Menge eines Prostataerkrankungs-spezifischen Antikörpers an den Patienten, wobei der Antikörper an einen Marker gekoppelt ist, wie zum Beispiel einem radioaktiven Isotop oder einem kernspinaktivem Molekül, welches durch nicht invasive Verfahren nachweisbar ist. Dem Antikörper/Markerkonjugat wird ausreichend Zeit gegeben, um in Kontakt mit reaktiven Antigenen zu kommen, welche im Gewebe des Patientens vorliegen und anschließend wird der Patient einer Nachweisvorrichtung zur Identifizierung des nachweisbaren Markers ausgesetzt.
  • 5. Kits
  • In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Offenbarung Immunodetektionskits für die Verwendung in den eingangs beschriebenen Immunodetektionsverfahren. Nachdem die kodierenden Proteine oder Peptide dazu eingesetzt werden können, Antikörper nachzuweisen, und die korrespondierenden Antikörper dazu eingesetzt werden können, die kodierenden Proteine oder Peptide nachzuweisen, können eine oder beide dieser Komponenten in dem Kit vorliegen. Der Immunodetektionskit wird daher, in geeigneten Behältnissen, ein kodierendes Protein oder Peptid oder einen ersten Antikörper, der an das kodierende Protein oder Peptid bindet, und ein Immunodetektionsreagenz beinhalten.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das kodierende Protein oder Peptid oder der erste Antikörper, der an das kodierende Protein oder Peptid bindet, an einen festen Träger gebunden sein, wie eine Säulenmatrix oder die Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
  • Die Immunodetektionsreagenzien des Kits können in jeder beliebigen Form vorliegen, einschließlich solcher nachweisbarer Marker, die mit dem gegebenen Antikörper oder Antigen assoziiert oder verbunden sind, sowie solcher nachweisbarer Marker, die mit einem sekundären Bindungsliganden assoziiert sind oder an jenen gebunden sind. Beispielhafte sekundäre Liganden sind zum Beispiel solche sekundären Antikörper, die eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder das Antigen haben und solche sekundären Antikörper, die eine Bindungsaffinität für einen menschlichen Antikörper haben.
  • Weitere geeignete Immunodetektionsreagenzien zur Verwendung in den vorliegenden Kits schließen Zwei-Komponentenreagenzien ein, die einen sekundären Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder das Antigen hat, zusammen mit einem dritten Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper hat, wobei der dritte Antikörper mit einem nachweisbaren Marker verknüpft ist, enthalten.
  • Die Kits können außerdem eine geeignet aliquote Zusammensetzung des kodierenden Proteins oder Polypeptidantigens entweder markiert oder unmarkiert enthalten, welches zur Erzeugung einer Standardkurve für das Nachweisassay verwendet werden kann.
  • Die Kits können Antikörper/Markerkonjugate enthalten, die entweder in vollständig konjugierte Form, in Form von Zwischenprodukten vorliegen oder als separate Einheiten, die durch den Verwender des Kits konjugiert werden müssen, vorliegen. Die Komponenten des Kits können entweder in wässrigen Medien oder lyophilizierter Form verpackt sein.
  • Ein Behälter bedeutet, dass die Kits grundsätzlich wenigstens ein Röhrchen, eine Teströhre, eine Flasche, eine Spritze oder ein sonstiges Behältnis beinhalten, in welches der Antikörper oder das Antigen gelagert werden können und vorzugsweise aliquotiert werden. Im Fall, dass ein zweiter oder dritter Bindungsligand oder eine weitere Komponente bereitgestellt werden, wird der Kit normalerweise einen zweiten, dritten oder entsprechend zusätzlichen Behälter, in welchem dieser Ligand oder diese Komponente aufbewahrt wird, beinhalten. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise auch Vorrichtungen zur Aufbewahrung des Behälters mit dem Antikörper, dem Antigen und jedem weiteren Reagenzes in einer abgeschlossenen Form zum Verkauf beinhalten. Solche Behältnisse können gespritzte oder spritzgeformte Plastikbehälter, in welchen die gewünschten Röhrchen gehalten werden, einschließen.
  • E. Nachweis und Quantifizierung der RNA-Spezien
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Identifikation von Prostataerkrankungszellen in einer biologischen Probe durch die Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren, die Prostataerkrankungszellmarkern entsprechen. Die biologische Probe kann jedes Gewebe oder jede Flüssigkeit sein, in welcher Prostataerkrankungszellen oder Zellen von peripherem Blut anwesend sein können. Verschiedene Ausführungsformen umfassen Knochenmarkaspirat, Knochenmarksbiopsie, Lymphknotenaspirat, Lymphknotenbiopsie, Milzgewebe, Feinnadel-Aspirat, Hautbiopsie oder Gewebebiopsien von Organen. Andere Ausführungsformen umfassen Proben, bei denen die Körperflüssigkeit peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Ascite, serumhaltige Flüssigkeit, Pleuralergüsse, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl oder Urin sein kann.
  • Die Nukleinsäure, die als ein Templat zur Amplifikation eingesetzt wird, wurde gemäß Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) aus Zellen isoliert, die in der biologischen Probe enthalten sind, isoliert. Die Nukleinsäure kann als genomische DNA oder als fraktionierte oder Gesamtzelluläre-RNA vorliegen. Sofern RNA eingesetzt wird, kann es wünschenswert sein, die RNA in eine komplementäre cDNA zu überführen. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der RNA um Gesamtzellen-RNA und diese wird direkt als Templat für die Amplifikation eingesetzt.
  • Primerpaare, die selektiv an die Nukleinsäure, die den Prostatakrebs-spezifischen Markern entsprechen, binden, werden mit der isolierten Nukleinsäure unter Bedingungen, die eine selektive Hybridisierung erlauben, in Kontakt gebracht. Sobald sie hybridisiert sind, wird der Nukleinsäure/Primerkomplex mit einem oder mehreren Enzym(en), das/die eine Templat-abhängige Nukleinsäuresynthese ermöglicht/ermöglichen, in Kontakt gebracht. Mehrere Runden der Amplifikation, die auch als „Zyklen" bezeichnet werden, werden durchgeführt, bis eine ausreichende Menge des Amplifikationsproduktes erzeugt wurde.
  • Als Nächstes wird das Amplifikationsprodukt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen kann der Nachweis mittels visueller Mittel erfolgen. Alternativ kann der Nachweis eine indirekte Identifikation des Produktes über eine Chemolumineszenz, eine radioaktive Szintigraphie von eingelagerten radioaktiven Markern oder fluoreszierenden Markern einschließen oder er kann sogar über ein System, welches elektrische oder thermische Impulssignale verarbeitet (Affymax Technology; Bellus, 1994) erfolgen.
  • Im Anschluss an den Nachweis kann man die Ergebnisse, die in einem vorgegebenen Patienten erfasst wurden, mit einer statistisch signifikanten Referenzgruppe aus normalen Patienten und Prostatakrebspatienten vergleichen. Auf diese Weise ist es möglich, die Menge des nachgewiesenen Markers mit den verschiedenen klinischen Zuständen zu korrelieren.
  • 1. Primere
  • Der Begriff Primer, wie er hierin verwendet wird, schließt jede Nukleinsäure, die in der Lage ist, die Synthese einer naszierenden Nukleinsäure in einem Templat-abhängigen Verfahren zu initiieren, ein. Typischerweise sind Primer Oligonukleotide mit einer Länge von zehn bis zwanzig Basenpaaren. Es können jedoch auch längere Sequenzen verwendet werden. Primer können als Doppelstrang oder Einzelstrang vorliegen, obwohl die Einzelstrangform bevorzugt ist.
  • 2. Templat-abhängige Amplifikationsverfahren
  • Es sind eine Reihe von Templat-abhängigen Amplifikationsverfahren, um eine Markersequenz innerhalb eines Templats zu amplifizieren, verfügbar. Das am besten bekannte Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (im nachfolgenden als PCR bezeichnet), welche ausführlich in den US-Patent-Nummern 4,683, 195; 4,683,202 und 4,800,159 sowie in Innis et al., 1990, beschrieben ist.
  • In Kürze: bei einer PCR werden zwei Primersequenzen hergestellt, die komplementär zu Bereichen auf gegenüberliegenden, komplementären Strängen der Markersequenz sind. Es wird ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten zusammen mit einer DNA-Polymerase, zum Beispiel Taq-Polymerase, zu der Reaktionsmischung gegeben. Wenn die Markersequenz noch in der Probe vorliegt, werden die Primer an den Marker binden und die Polymerase wird die Primer entlang der Markersequenz durch Zufügen von Nukleotiden verlängern. Durch das Anheben oder Absenken der Temperatur der Reaktionsmischung werden die verlängerten Primere von der Markersequenz dissoziiert, um Reaktionsprodukte zu bilden. Überschüssige Primere werden an die Marker und die Reaktionsprodukte binden und der Ablauf wiederholt sich.
  • Eine reverse Transkriptase-PCR-Amplifikation kann durchgeführt werden, um die Menge von amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Verfahren, um RNA in cDNA revers zu transkribieren, sind weithin bekannt und in Sambrook et al., 1989, beschrieben. Alternative Verfahren zur reversen Transkription verwenden thermostabile DNA-Polymerasen. Solche Verfahren sind in WO 90/07641, eingereicht am 21. Dezember 1990, beschrieben. Polymerase Kettenreaktionsverfahren sind im Stand der Technik weit verbreitet. Die besonders bevorzugten Verfahren der RT-PCR sind in der US-Patentanmeldung mit der Nummer 08/692,787 beschrieben und können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden. In der späteren Anwendung wird DNA-freie gesamtzelluläre RNA mit beliebigen Hexameren und Oligo-dt „geprimt" und revers transkribiert, um cDNA zu produzieren. Die cDNAs von jeder Reaktion werden auf den amplifizierbare β-Actin cDNA Gehalt normalisiert und eine Gen-spezifische PCR-Amplfikation an Pools an normalisierten cDNA-Proben wird durchgeführt. Der lineare Bereich der Ampflifikation von PCR-Produkten wird empirisch bestimmt, um eine quantitativen Vergleich zwischen den amplifizierten Proben zu ermöglichen.
  • Ein weiteres Amplifikationsverfahren ist das Ligase-Kettenreaktionsverfahren („LCR"), welches in der europäischen Anmeldung EP 320 308 offenbart ist. Bei LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare vorbereitet. In Anwesenheit der Zielsequenz binden die einzelnen Paare gegenüberliegende, komplementäre Stränge des Ziels, so dass sie aneinander angrenzen. In Gegenwart einer Ligase werden die zwei Sondenpaare zu einer Einheit verbunden. Durch Temperaturzyklen wie bei der PCR werden die ligierten Einheiten von der Zielsequenz dissozi iert und dienen dann als neue „Zielsequenzen" zur Ligierung von überschüssigen Sondenpaaren. Das US-Patent 4,883,750 beschreibt ein Verfahren ähnlich dem der LCR zur Bindung von Sondenpaaren an Zielsequenzen.
  • Eine Qbeta-Replikase, wie sie in der PCT-Anmeldung PCT/US87/00880 beschrieben ist, kann ebenso als noch ein weiteres Amplifikationsverfahren eingesetzt werden. In diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die einen komplementären Bereich zu der Zielsequenz hat, in Anwesenheit einer RNA-Polymerase zu einer Probe gegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, so dass diese dann nachgewiesen werden kann.
  • Ein isothermisches Amplifikationsverfahren, in welchem Restriktionsendonukleasen und Ligasen eingesetzt werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen, die in einem Strang der Restriktionsstelle 5'-[alpha-thio]-Triphosphatnukleotide enthalten, zu erreichen, kann in der vorliegenden Erfindung ebenso für die Amplifikation der Nukleinsäuren eingesetzt werden (Walker et al., 1992).
  • Ein weiteres Verfahren, eine isothermische Amplifikation der Nukleinsäuren durchzuführen, ist die „Strand Displacement Amplification" (SDA), welche mehrere Runden eines Strangersatzes und einer Synthese, nämlich Nick-Translation, involviert. Ein ähnliches Verfahren, genannt „Repair Chain Reaction" (RCR), umfasst die Anlagerung mehrerer Sonden innerhalb eines Bereichs, der zur Amplifikation ausgesucht wurde, mit einer nachfolgenden Reparaturreaktion, in welcher lediglich zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen beiden Basen können als biotinylierte Derivate zum leichten Nachweis zugegeben werden. Ein ähnlicher Ansatz ist auch in der SDA gewählt. Ziel-spezifische Sequenzen können auch durch die Verwendung einer zyklischen Sondenreaktion (CPR, „cyclic probe reaction) nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Sonde, die am 3'- und 5'-Ende Sequenzen von unspezifischer DNA aufweist und im Mittelbereich die Sequenz einer spezifischen DNA umfasst, an eine DNA hybridisiert, die in der Probe vorliegt. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Sonde, die nach der Verdauung freigesetzt werden, als unterschiedliche Produkte identifiziert. Das Originaltemplat wird an eine weitere, im Kreislauf vorliegende Sonde angelagert und die Reaktion wird wiederholt.
  • Noch ein weiteres Amplifikationsverfahren ist in der britischen Anmeldung GB 2 202 328 und in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben und kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. In der zuerst genannten Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer PCR-ähnlichen, Templat- und Enzym-abhängigen Synthese eingesetzt. Die Primere werden durch die Markierung mit einer Capture-Einheit (zum Beispiel Biotin) und/oder einer Nachweiseinheit (zum Beispiel ein Enzym) markiert. In der an zweiter Stelle genannten Anmeldung wird ein Überschuss an markierten Sonden zu der Probe gegeben. In Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach dem Spalten wird die Zielsequenz wieder intakt freigesetzt, um durch eine im Überschuss vorliegende Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Probe weist auf die Anwesenheit der Zielsequenz hin.
  • Ein weiteres Nukleinsäureamplifikationsverfahren umfasst Transkriptions-basierte Amplifikationssysteme (TAS), einschließlich der Nukleinsäure-basiertem Amplifikation (NASBA) und 3SR (Kwoh et al., 1989); Gingeras et al., PCT-Anmeldung WO 88/10315). Bei der NASBA können die Nukleinsäuren durch eine standardmäßige Phenol/Chloroformextraktion, Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, die Behandlung mit Lysispuffern und Minispinsäulen zur Isolation von DNA und RNA oder einer Guanidiniumchloridextraktion von RNA zur Amplifikation hergestellt werden. Diese Amplifikationstechnik umfasst das Annealing eines Primers, der Zielsequenz-spezifische Sequenzen besitzt. Während der anschließenden Polymerisation werden Hybride aus DNA/RNA mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut durch Hitze denaturiert werden. In jeder Runde wird durch Hinzufügung eines zweiten, Zielsequenz-spezifischen Primers und nachfolgender Polymerisation aus der einzelsträngigen DNA eine doppelsträngige. Die Doppelstrang-DNA-Moleküle werden dann mehrfach durch eine Polymerase, wie die T7- oder SP6-Polymerase transkribiert. In einem isothermischen zyklischen Reaktionsverlauf werden die RNAs in doppelsträngige DNA revers transkribiert und dann erneut von einer Polymerase wie T7 oder SP6 transkribiert. Die entstehenden Produkte sind, egal ob verkürzt oder vollständig, Ziel-spezifische Sequenzen.
  • Davey et al., Europäische Anmeldung EP 329822 , offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren, das eine zyklische Synthese von Einzelstrang-RNA („ssRNA"), ssDNA und Doppelstrang-DNA („dsDNA") beinhaltet, die dann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die ssRNA ist ein erstes Templat für ein erstes Primeroligonukleotid, welches durch reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann aus dem entstandenen DNA:RNA-Duplex durch die Wirkung einer Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die spezifisch RNA aus Duplexen mit DNA oder RNA angreift) entfernt. Die dabei entstandene ssDNA ist das zweite Templat für einen zweiten Primer, der auch die Sequenz eines RNA-Polymerasepromoters (beispielhaft dem T7 RNA-Polymerase) 5' zu seinen homologen Bereichen mit der Vorlage umfasst. Dieser Primer wird dann durch eine DNA-Polymerase verlängert (zum Beispiel durch das große „Klenow"-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I), was zu einem Doppelstrang-DNA(dsDNA)-Molekül mit einer zu der ursprünglichen RNA identischen Sequenz zwischen den Primeren führt, und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz hat. Diese Promotorsequenz kann dann von einer geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um zahlreiche RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann im Zyklus wieder verwendet werden, um dadurch zu einer sehr schnellen Amplifikation zu führen. Durch eine geeignete Auswahl an Enzymen kann diese Amplifikation im isothermischen Bereich und ohne Zugabe von Enzym zu jedem Zyklus durchgeführt werden. Da der Prozess zyklisch abläuft, kann die Startsequenz entweder als DNA oder als RNA ausgewählt werden.
  • Miller et al., PCT Anmeldung WO 89/06700, offenbaren ein Nukleinsäureamplifikationsschema, das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primersequenz an einen ausgewählten DNA-Einzelstrang („ssRNA") basiert, gefolgt von der Transkription von zahlreichen RNA-Kopien dieser Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, dass heißt es werden keine neuen Vorlagen aus den entstandenen RNA-Transkripten produziert. Weitere Amplifikationsverfahren schließen „race" und „one-sided PCR" ein (Frohmann, 1990 und Ohara et al., 1989).
  • Verfahren, die auf der Ligierung von zwei oder mehr Oligonukleotiden in Gegenwart der Nukleinsäure mit Sequenz des entstehenden „Dioligonukleotids" und dadurch das Dioligonukleotid amplifizieren, basieren, können auch in einem Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden (Wu et al., 1989).
  • 3. Separationsverfahren
  • Im Anschluss an die Amplifikation kann es wünschenswert sein, die Amplifikationsprodukte von dem Templat und überschüssigem Primer abzutrennen, um zu bestimmen, ob eine spezifische Amplifikation erfolgt ist. In einer Ausführungsform werden die Amplifikationsprodukte durch Agarose, Agarose-Acrylamid oder Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren abgetrennt (siehe Sambrook et al., 1989).
  • Alternativ können chromatographische Techniken eingesetzt werden, um eine Abtrennung zu bewirken. Es gibt eine Vielzahl von Chromatographien, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Absorptions-, Partitions-, Ionenaustausch- und Molekularsiebchromatographie, so wie zahlreiche Spezialtechniken, die Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie (Freifelder, 1982) einschließen, einsetzen.
  • 4. Identifikationsverfahren
  • Die Amplifikationsprodukte müssen visualisiert werden, um die Amplifikation der Markersequenzen zu bestätigen. Ein typisches Visualisierungsverfahren schließt das Färben eines Gels mit Ethidiumbromid und die Visualisierung unter UV-Licht ein. Alternativ können die Amplifikationsprodukte, sofern sie mit radioaktiv markierten oder fluorometrisch markierten Nukleotiden versehen sind, im Anschluss an die Auftrennung einem Röntgenfilm ausgesetzt werden oder unter einem geeigneten anregenden Spektrum visualisiert werden.
  • In einer Ausführungsform wird die Visualisierung indirekt erreicht. So wird im Anschluss an die Auftrennung der Amplifikationsprodukte eine markierte Nuklein säuresonde mit der amplifizierten Markersequenz in Kontakt gebracht. Die Sonde ist vorzugsweise mit einem Chromophor konjugiert, kann aber auch radioaktiv markiert sein. In einer anderen Ausführungsform ist die Sonde an einen Bindungspartner, wie einen Antikörper oder ein Biotin, konjugiert, wobei das Gegenstück zu dem Bindungspaar eine nachweisbare Einheit trägt.
  • Der Nachweis erfolgt in einer Ausführungsform durch Southern-Blot und Hybridisierung mit einer markierten Sonde. Die Techniken, die im Southern-Blot zusammengefasst sind, sind dem Fachmann wohl bekannt und können in vielen Standardwerken zu molekularbiologischen Protokollen nachgelesen werden (siehe Sambrook et al., 1989). In Kürze, es werden die Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Gel wird dann mit einer Membran wie Nitrocellulose in Kontakt gebracht, um einen Transfer der Nukleinsäure und eine nichtkovalente Bindung zu ermöglichen. Nachfolgend wird die Membran mit einer chromophor-konjugierten Sonde, die in der Lage ist, mit einem Zielamplifikationsprodukt zu hybridisieren, inkubiert. Der Nachweis erfolgt, in dem die Membran einem Röntgenfilm ausgesetzt wird oder durch ein Ionen-emittierendes Nachweisgerät.
  • Ein Beispiel für das Vorangegangene ist im US-Patent Nr. 5,279,721 beschrieben, welches ein Gerät und Verfahren zur automatisierten Elektrophorese und zum Transfer von Nukleinsäuren offenbart. Das Gerät erlaubt eine Elektrophorese und das Blotten ohne einen externen Eingriff auf das Gel und ist ideal geeignet, um das Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung auszuführen.
  • 5. Andere Assays
  • In Abhängigkeit von der spezifischen Situation können andere Verfahren zum genetischen Screening angewendet werden, um Mutationen in genomischen DNA-, cDNA- oder RNA-Proben akkurat nachzuweisen.
  • Historisch betrachtet ist eine Vielzahl verschiedener Verfahren, einschließlich der denaturierenden Gradientengel-Elektrophorese („DGGE"), der Restriktionsenzym-Polymorphismus-Analyse und des enzymatischen Spaltungsverfahrens sowie anderen, angewendet worden, um Punktmutationen nachzuweisen. Die übli cheren Verfahren umfassen zurzeit die direkte Sequenzierung von Zielbereichen, die mittels PCRTM (siehe oben) amplifiziert wurden, und Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (single-strand conformation polymorphism, „SSCP").
  • Ein anderes Verfahren zum Screening von Punktmutationen basiert auf der RNase-Spaltung von Basenpaar-Fehlpaarungen in RNA/DNA- und RNA/RNA-Heteroduplexen. Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Fehlpaarung (mismatch)" als ein Bereich mit einem oder mehr ungepaarten oder fehlgepaarten Nukleotiden in einem doppelsträngigen RNA/RNA-, RNA/DNA- oder DNA/DNA-Molekül definiert. Diese Definition schließt demnach Fehlpaarungen aufgrund von Insertions/Deletions-Mutationen, genauso wie einbasige oder mehrbasige Punktmutationen ein.
  • US-Patent Nr. 4,946,773 beschreibt ein RNase-A-Fehlpaarung-Spaltungsassay, dass das Annealing von einzelsträngigen DNA- oder RNA-Testproben an eine RNA-Sonde und anschließende Behandlung der Nukleinsäureduplexe mit RNase A umfasst. Nach der RNase-Spaltungsreaktion wird die RNase durch proteolytische Verdauung und organische Extraktion inaktiviert. Die Spaltungsprodukte werden mittels Erhitzen denaturiert und mittels Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamid-Gelen analysiert. Für den Nachweis von Mismatches, werden die Einzelstrang-Produkte der RNase A-Behandlung elekrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt und mit ähnlich behandelten Kontrollduplexen verglichen. Proben, die kleinere Fragmente (Spaltungsprodukte) enthalten, die nicht in der Kontrollduplex zu sehen, werden als positiv gewertet.
  • Zurzeit erhältliche RNAse-Fehlpaarung-Spaltungsassays, einschließlich solcher, die gemäß US-Patent Nr. 4,946,773 durchgeführt werden, benötigen radiomarkierte RNA-Sonden. Myers und Maniatis beschreiben in US-Patent Nr. 4,946,773 den Nachweis von Basen-Fehlpaarungen unter Verwendung von RNase A. Andere Forscher haben die Verwendung von E. coli Enzyms RNase I in Fehlpaarungsassays beschrieben. RNase I wäre ein wünschenswertes Enzym, um es beim Nachweis von Basenpar-Fehlpaarungen einzusetzen, wenn Komponenten gefunden würden, die das Ausmaß der nicht-spezifischen Spaltung sen ken und die Frequenz der Spaltung der Fehlpaarungen erhöhen. Der Einsatz von RNase I zum Nachweis von Fehlpaarungen wird in der Literatur von Promega Biotech beschrieben. Promega vermarktet ein Kit, welches RNase I enthält und welches – wie in deren Literatur gezeigt – drei von vier bekannten Fehlpaarungen spaltet, sofern der Enzymgehalt ausreichend hoch ist.
  • Das RNase-Schutzassay wurde erstmals eingesetzt, um die Enden von spezifischen mRNA-Zielen in Lösung nachzuweisen und zu kartieren. Das Assay hängt davon ab, dass es in der Lage ist, radiomarkierte RNA-Sonden mit hochspezifischer Aktivität, die komplementär zu der interessierenden mRNA mittels in vitro Transkription einfach zu produzieren. Ursprünglich waren die Template für die in vitro Transkription rekombinante Plasmide, die Bakteriphage-Promotoren enthalten. Die Sonden werden mit zellulären Gesamt-RNA-Proben gemischt, um eine Hybridisierung mit ihren komplementären Zielen zu ermöglichen, und dann wird die Mischung mit RNase behandelt, um den Überschuss an nicht-hybridisierter Sonde zu zerstören. Wie ursprünglich gedacht, ist die eingesetzte RNase auch spezifisch für Einzelstrang-RNA, so dass eine hybridisierte Doppelstrang-Sonde vor Zerstörung geschützt ist.
  • Nach Deaktivierung und Entfernung der RNase wird die geschützte Sonde (welche in ihrer Menge proportional zu der Menge an vorhandener Ziel-mRNA ist) gewonnen und auf einem Polyacrylamid-Gel analysiert.
  • Der RNase-Schutzassay (RNase Protection Assay, RPA) ist adaptiert dafür, Einzelbasen-Mutationen nachzuweisen. Bei diesem Typ an RNase A-Fehlpaarung-Spaltungsassay werden radio-markierte RNA-Sonden, die in vitro aus Wildtyp-Sequenzen transkribiert wurden, an komplementäre Zielbereiche, die sich von Testproben ableiten, hybridisiert. Das Testziel enthält im Allgemeinen DNA (entweder genomische DNA oder DNA, die mittels Klonens in Plasmiden oder mittels PCRTM amplifiziert wurde), obwohl RNA-Ziele (endogene mRNA) gelegentlich eingesetzt wurden. Falls Unterschiede zwischen der hybridisierten Sonde und dem Ziel bei den Einzelnukleotid (oder größer)-Sequenzen auftreten, kann die daraus resultierende Unterbrechung der Crickson-Watson-Wasserstoffbindung an dieser Position (Fehlpaarung, „mismatch") festgestellt werden und in einigen Fällen durch Einzelstrang-spezifische Ribonuklease gespalten werden. Bis heute wurde RNase A fast ausschließlich zur Spaltung von Einzelbasen-Fehlpaarungen eingesetzt, obwohl RNase I kürzlich als auch geeignet für die Fehlpaarungsspaltung gefunden wurde. Es gibt neue Beschreibungen zur Verwendung des MutS-Proteins und anderen DNA-Reparaturenzymen zum Nachweis von Einzelbasen-Fehlpaarungen.
  • 6. Kit-Bestandteile
  • Alle wesentlichen Materialien und Reagenzien, die für den Nachweis der Prostataerkrankungsmarker in einer biologischen Probe erforderlich sind, können in einem Kit zusammengefasst werden. Das Kit umfasst im Allgemeinen ein vorab ausgewähltes Paar von Primeren für einen oder mehrere spezifische Marker. Beispielsweise kann ein Kit Primer und/oder Sonden zur Verwendung in jeglichem biologischen Assay, der den Fachleuten bekannt ist, wie RT-PCR, in situ Hybridisierung, Northern-Analyse und/oder RPA, einschließen, um die RNA-Marker in normalem Gewebe, BPH-Gewebe, begrenztem Tumorgewebe oder metastasierend wachsendem Tumorgewebe oder einer beliebigen Kombination aus diesen nachzuweisen. Des Weiteren können geeignete Enzyme zur Amplifikation der Nukleinsäuren einschließlich verschiedener Polymerasen (RT, Taq, etc.), Desoxynukleotide und Puffer, um die notwendigen Reaktionsgemische für die Amplifikation bereitzustellen, beinhaltet sein. Bevorzugte Kits können auch Primer zum Nachweis einer Kontroll-, nicht differentiell exprimierten RNA, wie beispielsweise β-Actin enthalten.
  • Die Kits werden gewöhnlich in geeigneter Form, verschiedene Behälter für jedes der individuellen Reagenzien und Enzyme sowie für jedes markerspezifische Primerpaar enthalten. Bevorzugte Primerpaare zur Amplifikation der Nukleinsäuren sind derart ausgewählt, dass sie die Sequenzen, die hier als SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 14 bezeichnet sind, amplifizieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden Kits Hybridisierungssonden umfassen, die spezifisch für differentiell exprimierte Marker sind. Die Sonden sind derart gestaltet, dass sie an eine Sequenz oder das Komplementär einer Sequenz, hier in bezeichnet als SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3 oder SEQ ID Nr: 14, hybridisieren. Solche Kits umfassen im Allgemeinen verschiedene Behälter für die individuellen Reagenzien und Enzyme sowie für jeden Marker eine spezifische Hybridisierungssonde in einer geeigneten, dicht verschließbaren Form.
  • F. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Wie oben beschrieben, legen Ergebnisse den Schluss nahe, dass Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und Semenogelin II eine Rolle bei Prostakrebsen spielen. Die vorliegende Offenbarung umfasst eine Zell-basierte Assaytechnik zur Identifizierung und Evaluierung von chemischen Verbindungen und Reagenzien, die Einfluss auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und Semenogelin II besitzen und dadurch chemotherapeutische Verbindungen zur Verwendung in der Behandlung von Prostatakrebs identifizieren. Von diesem Zell-basierten Assay wird auch angenommen, dass es genauso gut bei der Bewertung von Verbindung bezüglich ihrer Stimulation der Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II bei Prostakrebsen ist.
  • Im Speziellen werden Zellen mit einem Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die einen Promotorbereich von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II, welche an ein Reportergen, welches wiederum prüfbare Produkte kodiert, gebunden sind, kodieren, transfiziert. Die Zellen werden unter Bedingungen, welche eine Expression des prüfbaren Produkts erlauben, kultiviert. Der Promotorbereich von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II wird vorzugsweise aus genomischer DNA geklont, kann aber auch de novo synthetisiert werden.
  • Nach der Transfektion mit dem Expressionsvektor werden die mit wenigstens einer Verbindung, von der angenommen wird, dass sie eine regulative Aktivität auf die Expression von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II besitzt, inkubiert. Chemische Reagenzien und Faktoren können über ihre Fähigkeit, die Expression an dem Reportergen und dadurch die Produktion des prüfbaren Produkts zu senken oder zu erhöhen, identifiziert wer den. Solche chemischen Verbindungen werden aus kleinen chemischen Bibliotheken, Peptidbibliotheken und/oder Sammlungen natürlicher Produkte ausgewählt.
  • Die vorliegende Offenbarung unterscheidet sich von anderen Techniken zur Identifikation von chemischen Verbindungen, dadurch dass sie spezifisch chemische Verbindungen, Reagenzien, Faktoren und andere Substanzen, welche einen Einfluss auf die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II durch Zellen besitzen, identifiziert. Diese Reagenzien werden durch ihre Fähigkeit, die Aktivität von Promotoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II zu beeinflussen, identifiziert. Eine Abnahme der Aktivität der Promotoren wird über eine entsprechende Abnahme der Produktion der Produkte des Reportergens bestimmt. Eine Zunahme der Aktivität der Promotoren wird über eine entsprechende Zunahme der Produktion der Produkte des Reportergens bestimmt. Somit ist eine Abnahme der Produktion von beispielsweise Glühwürmchen Luziferase unter Kontrolle eines Promotors von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II ein Anzeichen dafür, dass die Aktivität des Promotors von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II durch die untersuchte Verbindung vermindert wird. Eine Zunahme der Produktion von Glühwürmchen-Luziferase ist ein Anzeichen dafür, dass die Aktivität des Promotors von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II durch die untersuchte Verbindung stimuliert wird. Dieser Einfluss auf die Produktion des prüfbaren Produkts spiegelt den Einfluss von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II, der in einer Zelle, die mit der Verbindung behandelt wurde, auftreten würde.
  • Wenn schließlich Krebspatienten mit chemischen Verbindungen behandelt werden, von denen gezeigt wurde, dass sie die Aktivität der Promotoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II erhöhen, wird die Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II durch Tumore und/oder periphere Blutzellen stimuliert. Aus diesem Grund können Verbindungen, die mittels dieser Assaytechnik identifiziert wurden und die die Aktivität der Promotoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II erhöhen in der Behandlung von Prostakrebsen, die metastasierend sind, und anderen Zuständen, bei denen eine Erniedrigung der Produktion von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II erzeugt wird und zu schädigenden Wirkungen führt, eingesetzt werden.
  • 1. Prostataerkrankungsgen-Promotoren
  • Eine Technik, die heutzutage häufig von Fachleuten auf dem Gebiet der Proteinherstellung eingesetzt wird, ist der Erhalt einer „rekombinanten" Version des Proteins, seine Expression in einer rekombinanten Zelle und der Erhalt des Proteins aus solch einer Zelle. Diese Techniken basieren auf dem „Klonieren" eines DNA-Moleküls, welches das Protein kodiert, aus einer DNA-Bibliothek, dass heißt auf dem Erhalt eines spezifischen DNA-Moleküls, das sich von anderen Bereichen der DNA unterscheidet. Dies kann zum Zweck der vorliegenden Erfindung mittels Klonierens eines genomischen DNA-Moleküls, das den Promotor von einer Prostata-spezifischen Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II enthält, erzielt werden. Alternativ kann in Kenntnis der Promotorsequenz von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II der Promotor gemäß Standardtechniken synthetisiert werden.
  • Der erste Schritt in einem Klonierungsverfahren ist das Screening einer geeigneten DNA-Bibliothek, wie beispielsweise im vorliegenden Fall einer Tumor-abgeleiteten Bibliothek. Das Screeningverfahren kann ein Expressionsscreeningprotokoll, welches Antikörper, die gegen das Protein gerichtet sind, verwendet, oder ein Aktivitätsassay sein. Alternativ kann das Screening auf der Hybridisierung von Oligonukleotidsonden, die nach einer Betrachtung der Bereiche der Aminosäuresequenz des Proteins, oder aus den DNA-Sequenzen von Genen, die ähnliche Proteine kodieren, hergestellt wurden. Die Durchführung eines solchen Screeningprotokolls ist den Fachleuten wohl bekannt und detailliert in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Nukleotidsequenzen, die in Übereinstimmung mit SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 3 und/oder SEQ ID Nr: 14 sind, können als Sonden oder bei der Herstellung von Antikörpern, wie in den vorhergehenden Abschnitten zu Screeningprotokollen beschrieben, eingesetzt werden. Zusätzlich ist ein 4409 bp Fragment des Promotorbereichs von Semenogelin II in den Nukleotiden 1 bis 4409 von SEQ ID Nr: 14 gezeigt.
  • 2. Reportergene
  • Ein Reportergen ist ein Gen, welches ein Produkt produziert mit einem sofort identifizierbaren und prüfbaren Phänotyp. Ein Fachmann wird jedoch andere geeignete Reportergene finden, welche genauso gut bei der vorliegenden Erfindung funktionieren. Beispiele für solche Reportergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Glühwürmchen-Luziferase (Promega, Madison, WI), Chloramphenicolacetyltransferase (Promega), β-Galactosidase (Promega), grün fluoreszierendes Protein, (Clontech, Palo Alto, CA), menschliches Wachstumshormon (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL), alkalische Phosphatase (Clontech) und β-Glucoronidase (Clontech)
  • 3. Expressionskonstrukte
  • Die Expressionskonstrukte, die im Allgemeinen als Vektoren bezeichnet werden, die in dem offenbarten Zell-basierten Assay der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, variieren beträchtlich. Die Vektoren können „Standard"expressionsvektoren, nämlich Plasmide, die ein oder mehr Effektorgene und regulative Elemente, die für die Expression der Effektorgene in Zellen benötigt werden, enthalten. Plasmidexpressionsvektoren umfassen jegliches Plasmid-, Cosmid- oder Phagekonstrukt, das in der Lage ist die Expression von kodierenden Genen in Säugetierzellen, wie pUC oder BluescriptTM Plasmidserien, zu unterstützen. Alternativ können diese Vektoren komplexer sein, wie zum Beispiel virale Vektoren, die später beschrieben werden.
  • Die regulierenden Elemente eines Expressionsvektors umfassen wenigstens einen Promotor, in diesem Fall den Promotor von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II und ein Reportergen (wie oben beschrieben) und können weiterhin Strukturen umfassen, die bei der Replikation assistieren, wie zum Beispiel Ausgangspunkte der Replikation. Zusätzlich enthalten fast alle Expressionsvektoren Mehrzweckklonbereiche, die zahlreiche Restriktionsenzymorte besitzen. Eines wird auch typischerweise ein Polyadenylsignal, um eine ordentliche Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken, enthalten. Die Natur des Polyadenylierungssignal wird nicht als wesentlich angenommen, um die Erfindung erfolgreich durchzuführen und jegliche der Sequenzen kann eingesetzt werden. Beispiele schließen SV40- und Rinderwachstumshormon Poly-A Stellen ein Diese Elemente können zur Verstärkung des Messageniveaus und zur Minimierung des Überlesens vom Konstrukt in andere Sequenzen dienen. Schließlich besitzen Expressionsvektoren typischerweise selektierbare Marker, die oft in der Form von Antibiotika-Resistenzgenen vorliegen, die eine Selektion von Zellen, die diese Vektoren tragen, erlauben.
  • Wie oben ausgeführt umfasst in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Expressionskonstrukt einen Virus oder hergestelltes Konstrukt aus einem viralen Genom. Die Fähigkeit von bestimmten Viren, in Zellen über Rezeptor-vermittelte Endocytose zu gelangen und in manchen Fällen in die Wirtszellenchromosomen zu integrieren, macht sie zu attraktiven Kandidaten für den Gentransfer in Säugetierzellen.
  • a. Retroviren
  • Die Retroviren sind eine Gruppe an einzelsträngigen RNA-Viren, die durch eine Fähigkeit, in infizierten Zellen ihre RNA mittels eines Verfahrens der reversen Transkription (Coffin, 1990) in doppelsträngige DNA zu überführen. Die erhaltene DNA integriert sich als ein Provirus stabil in zelluläre Chromosomen und lenkt die Synthese von viralen Proteinen. Die Integration führt zu der Retention der viralen Gensequenz in der aufnehmenden Zelle und ihrer Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene – gag, pol und env – die Capsidproteine, Polymeraseenzyme bzw. Umhüllungsverbindungen kodieren. Eine Sequenz, die strangaufwärts vom gag-Gen gefunden und als ψ bezeichnet wird, fungiert als Signal für die Verpackung des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungs-(long terminal repeat, RPT)sequenzen sind an den 5'- und 3'-Enden des viralen Genoms vorhanden. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancersequenzen und werden auch für die Integration in das Wirtszellengenom benötigt (Coffin, 1990).
  • Um einen retroviralen Vektor zu konstruieren, wird eine Nukleinsäure, die einen Promotor von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II kodiert, an die Stelle von bestimmten viralen Sequenzen in das virale Genom insertiert, um einen Virus zu produzieren, der Replikations-defekt ist. Um Virionen zu produzieren wird eine Verpackungszelllinie, enthaltend gag, pol und env-Gene aber keine LTR- und ψ-Komponenten, konstruiert (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, welches eine menschliche cDNA zusammen mit den retroviralen LTR- und ψ-Sequenzen in diese Zelle eingeführt wird (beispielsweise mittels Calciumphosphatpräzipitation), ermöglicht die ψ-Sequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in virale Partikel verpackt wird, welche dann in das Kulturmedium sekretiert werden (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann gesammelt, optional aufkonzentriert und dann für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage eine Vielzahl von Zelltypen zu infizieren. Integration und stabile Expression benötigen die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
  • Ein neuer Ansatz, der kürzlich ein spezifisches Targeting von Retrovirusvektoren ermöglicht, wurde basierend auf der chemischen Modifikation eines Retrovirus durch chemische Addition von Galactose-Resten an die virale Umhüllung entwickelt. Diese Modifikation könnte die spezifische Infektion von Zellen, wie zum Beispiel Hepatozyten via Asialoglycoprotein-Rezeptoren, erlauben, sollte dies gewünscht sein.
  • Ein anderer Ansatz zum Targeting von rekombinanten Retroviren wurde entwickelt, bei dem biotinylierte Antikörper gegen ein retrovirales Umhüllungsprotein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor eingesetzt wurden. Die Antikörper wurden über die Biotin-Komponenten unter Verwendung von Streptavidin (Roux et al., 1989) gekoppelt. Bei Verwendung von Antikörpern gegen Haupt-Histokompatibilitätskomplex Klasse I und Klasse I Antigene, wurde die Infektion einer Vielzahl von menschlichen Zellen, die solche Oberflächen-Antigene hervorbringen, mit einem ecotropen Virus in vitro gezeigt (Roux et al., 1989).
  • b. Adenoviren
  • Menschliche Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Tumorviren mit einer Genomgröße von nahezu 36 kB (Tooz, 1981). Adenoviren wurden weit als Modell für die eukaryotische Genexpression untersucht und charakterisiert, wodurch sie zu einem attraktiven System für die Entwicklung von Adenoviren als Gentransfersystem wurden. Diese Gruppe von Viren ist leicht zu vermehren und zu manipulieren und sie zeigen in vitro und in vivo ein breites Wirtsspektrum. In lytisch infizierten Zellen sind Adenoviren in der Lage, die Wirtsproteinsynthese abzuschalten, die zelluläre Maschinerie zur Synthese großer Mengen an viralen Proteinen zu leiten, große Mengen an viralen Virusproteinen zu produzieren und ausgiebige Mengen Virus zu produzieren.
  • Die E1-Region des Genoms schließt E1A und E1B ein, die Proteine kodieren, die für die Transkriptionsregulation des viralen Genoms sowie einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die E2-Expression, einschließlich E2A und E2B, erlaubt die Synthese der viralen replikativen Mechanismen, zum Beispiel DNA-bindende Proteine, DNA-Polymerase und ein terminales Protein, welches die Replikation anstößt. Die E3-Genprodukte verhindern eine Zytolyse durch zytotoxische T-Zellen und Tumornekrosefaktor und scheinen für die virale Verbreitung wichtig zu sein. Wirkungen, die mit dem E4-Protein verbunden sind, schließen die DNA-Replikation, die späte Genexpression und die Wirtszellabschaltung ein. Die späten Genprodukte schließen die meisten der Virionkapsidproteine ein und diese werden nur exprimiert, nachdem die meisten der Abläufe zur Verarbeitung eines einzelnen primären Transkriptes des Major Late Promotors erfolgt ist. Der Major Late Promotor (MLP) zeigt eine hohe Effizienz während der späten Phase der Infektion (Strafford-Perricaudet und Perricaudet, 1991).
  • Da nur ein geringer Anteil des viralen Genoms in cis erforderlich zu sein scheint (Tooze, 1981), bieten Adenovirus-abgeleitete Vektoren ein hervorragendes Potential zur Ersetzung von großen DNA-Fragmenten, sofern sie in Verbindung mit Zelllinien wie 293 Zellen eingesetzt werden. Ad5-transformierte menschliche embryonale Nierenzelllinien (Graham et al., 1977) wurden entwickelt, um essen tielle virale Proteine in trans bereitzustellen. Die Charakteristika von Adenoviren lassen sie als gute Kandidaten für die Verwendung beim Gentransfer in vitro als auch in vivo erscheinen (Grunhaus und Horwitz, 1992).
  • Die besonderen Vorteile eines Adenovirussystems beim Transport fremder Proteine in eine Zelle beinhalten die Fähigkeit, relativ große Stücke der viralen DNA durch fremde DNA ersetzen zu können, die strukturelle Stabilität der rekombinanten Adenoviren, die Sicherheit der adenoviralen Verabreichung an Menschen und die Abwesenheit jeglicher bekannter Assoziationen einer Adenovirusinfektion mit Krebs oder bösartigen Tumoren, die Fähigkeit, hohe Titer des rekombinanten Viruses zu erzeugen; und die hohe Infektiösität des Adenovirus.
  • Weitere Vorteile der adenoviralen Vektoren gegenüber Retroviren beinhaltet das höhere Maß der Genexpression. Zusätzlich ist die Adenovirusreplikation, anders als bei retroviralen Sequenzen, unabhängig von einer Wirtsgenreplikation. Da die Adenovirus-transformierenden Gene in der E1-Region leicht entfernt werden können und trotzdem effiziente Expressionsvektoren bereitgestellt werden, können onkologische Risiken von Adenovektoren vernachlässigt werden können (Grunhaus und Horwitz, 1992).
  • Im Allgemeinen basiert ein adenovirales Gentransfersystem auf rekombinant veränderten Adenoviren, die durch die Deletion eines Teiles ihres Genoms, wie E1, replikationsinkompetent gemacht wurden und die dennoch ihre Infektionskompetenz behalten. Sequenzen, die relativ große fremde Proteine kodieren, können exprimiert werden, sofern zusätzliche Deletionen im adenoviralen Genom gemacht werden. Beispielsweise können Adenoviren, aus denen sowohl E1- und E3-Regionen entfernt wurden, bis zu 10 kb fremder DNA aufnehmen und sie können zu hohen Titern in 293-Zellen herangezogen werden (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Eine anhaltende Expression von Transgenen im Anschluss an eine adenovirale Infektion wurde auch beschrieben.
  • c. Andere virale Vektoren als Expressionskonstrukte
  • Andere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Es können Vektoren eingesetzt werden, die von Viren wie dem Vacciniavirus (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), dem adeno-assoziierten Virus (AAV) (Ridgeway 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Hermonat und Muzycska, 1984) und Herpesviren abgeleitet sind. Diese Viren bieten mehrere attraktive Eigenschaften für den Gentransfer in verschiedene Säugetierzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
  • Mit der kürzlichen Entdeckung von defekten Hepatitis-B-Viren wurden neue Einsichten in die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener viraler Sequenzen gewonnen. In vitro-Untersuchungen zeigten, dass das Virus die Fähigkeit zur helferabhängigen Verpackung und reversen Transkription trotz einer Deletion von bis zu 80% seines Genoms beibehalten hatte (Horwich et al., 1990). Dies wies darauf hin, dass ein großer Teil des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden könnte. Der Hepatotropismus sowie die Persistenz (Integration) sind besonders attraktive Eigenschaften für den Gentransfer in Leberzellen. Chang et al. führten kürzlich das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen in das Hepatits-B-Virusgenom der Enten an die Stellen der Polymerase, Oberflächen- und Voroberflächen-kodierenden Sequenzen ein. Dieses wurde mit einem Wildtypvirus in eine vom Vogel abstammende Hepatomzelllinie kotransfiziert. Das Kulturmedium, welches hohe Titer des rekombinanten Virus enthielt, wurde verwendet, um primäre Entenkükenhepatozyten zu infizieren. Eine stabile CAT-Genexpression konnte für wenigstens 24 Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden (Chang et al., 1991).
  • d. Alternative Bereitstellungssysteme
  • Um eine Expression von Reportergenkonstrukten zu bewirken, muss der Expressionsvektor in eine Zelle überführt werden. Wie oben beschrieben läuft ein Mechanismus zur Überführung über die virale Infektion, wobei der Expressionsvektor in einem infizierten Adenovirus-Partikel einkapsidiert ist.
  • In der vorliegenden Erfindung werden auch einige nicht-virale Verfahren zum Transfer von Expressionsvektoren in kultivierte Säugetierzellen berücksichtigt. Dies schließt eine Kalziumphosphatpräzipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 198; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Sene, 1982; Fraley und Kaplan, 1979) und Lipofektamin-DNA-Komplexe, Zellbeschallung (Fechheimer et al., 1987), Genbombardement unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsmikroprojektilen (Yang et al., 1990), Polykationen (Boussif et al., 1995) und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988), ein.
  • In einer Ausführungsform kann das Expressionskonstrukt auch einfach aus einem nackten rekombinanten Vektor bestehen. Die Übertragung des Konstruktes kann auf jede Art, wie sie oben beschrieben ist, die physikalisch oder chemisch die Zellmembran durchdringt, durchgeführt werden. Beispielsweise injizierte Dubensky et al. (1984) erfolgreich Polyomavirus-DNA in Form eines CaPO4-Präzipitates in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen, um eine aktive virale Replikation und akute Infektion zu zeigen. Benvenisty und Neshif (1986) zeigten außerdem, dass eine direkte intraperitoneale Injektion eines CaPO4-präzipitierten Plasmids in der Expression von transfizierten Genen resultiert. Es ist angestrebt, dass die DNA, die ein Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, auf ähnliche Weise übertragen werden kann.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung zum Transfer von einem nackten DNA-Expressionsvektor kann Partikelbombardement beinhalten. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, um ihnen das Durchdringen von Zellmembranen und den Eintritt in Zellen ohne diese zu töten, zu ermöglichen (Klein et al., 1987). Verschiedene Geräte zur Beschleunigung von kleinen Partikeln sind entwickelt worden. Eines dieser Geräte beruht auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Stroms, welcher wiederum die Triebkraft bereitstellt (Yang et al., 1990). Die eingesetzten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen wie Wolfram- und Goldkugeln.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann der Expressionsvektoren in einem Liposom eingekapselt sein. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipiddoppelmembran und einem inneren wässrigen Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben viele Lipidschichten, die durch wässrige Medien getrennt sind. Die Liposomen bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Übermaß an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstanordnung, bevor sich geschlossene Strukturen bilden oder sie Wasser einschließen und gelöste Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten aufgelöst werden (Ghosh und Bachhawat, 1991). Ebenso sind Lipofektamin-Nukleinsäurekomplexe zu erwägen.
  • Die Liposomen-vermittelte Polynukleotidbereitstellung und Expression von fremder DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen. Wong et al. (1980) zeigten die Durchführbarkeit einer Liposomen-vermittelten Bereitstellung und Expression von fremder DNA in kultivierten Hühnerembryonen-, HeLa- und Hepatoma-Zellen. Nicolau et al. (1987) gelang erfolgreich ein Liposomen-vermittelter Gentransfer in Ratten nach einer intravenösen Injektion.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die Liposomen mit einem hämaglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert werden. Hierfür wurde gezeigt, dass dies eine Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Eintritt der Liposomen-verkapselten DNA in die Zelle fördert (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen können die Liposomen in Verbindung mit nuklearen, nichthistonhaltigen chromosomalen Proteinen (HMG-1) komplexiert oder eingesetzt werden (Kato et al., 1991). In noch weiteren Ausführungsformen können die Liposomen in Verbindung mit sowohl HVJ und HMG-1 komplexiert oder eingesetzt werden. Sofern solche Expressionsvektoren erfolgreich für die Übertragung und Expression eines Polynukleotids in vitro und in vivo eingesetzt wurden, sind sie auch für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Im Falle, dass ein Bakteriophage-Promotor in einem DNA-Konstrukt eingesetzt ist, ist es außerdem wünschenswert, in dem Liposom eine geeignete bakteriophage Polymerase einzuschließen.
  • Ein anderer Mechanismus zum Transfer von Expressionsvektoren in Zellen, ist eine Rezeptor-vermittelte Bereitstellung. Dieser Ansatz zieht Vorteil aus der selektiven Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose in nahezu allen eukaryotischen Zellen. Aufgrund der Zelltyp-spezifischen Verteilung von verschiedenen Rezeptoren, kann die Bereitstellung höchst selektiv sein (Wu und Wu, 1993). Vehikel zum Rezeptor-spezifischen Gen-Targeting bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zellrezeptor-spezifischen Liganden und einem DNA-bindenden Reagenz. Verschiedene Liganden wurden zum Rezeptor-vermittelten Gentransfer eingesetzt. Die am intensivsten charakterisierten Liganden sind Asialorosomucoid (ASOR) (Wu und WU, 1987) und Transferrin (Wagner et al., 1993). Kürzlich wurde ein synthetisches Neoglycoprotein, welches denselben Rezeptor wie ASOR erkennt, als ein Genbereistellungsvehikel verwendet (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994). Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) wurde auch verwendet, um Gene an schuppenartige Karzinomzellen (Myers, EP 0273085 ) bereitzustellen.
  • In anderen Ausführungsformen kann das Bereitstellungssystem einen Liganden und ein Liposom umfassen. Nicolau et al. (1987) setzten zum Beispiel Lactosyl-Ceramid, ein Galactose-terminales Asialgangliosid, eingebracht in Liposomen ein und beobachteten einen Anstieg in der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten. Aus diesem Grund ist es machbar, dass ein adenoviraler Expressionsvektor durch eine Vielzahl an Rezeptor-Ligand-Systeme, mit und ohne Liposomen, auch spezifisch in einem Zelltyp wie Lungen-, Epithel- oder Tumorzellen bereitgestellt werden kann. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) kann zum Beispiel als Rezeptor für eine vermittelte Bereitstellung in Zellen, die eine Hinaufregulierung des EGF-Rezeptors, wie Tumorzellen, zeigen. Galactose kann verwendet werden verwendet werden, um Asialoglycoprotein-Rezeptoren auf Leberzellen zu targetieren. Außerdem können Antikörper zu CD5(CLL), CD22 (Lymphoma), CD25 (T-Zellen-Leukämie) und MAA (Melanom) auf ähnliche Weise als zielende Einheiten eingesetzt werden.
  • G. Therapeutika
  • Die Rolle, die Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und Semenogelin II in der Ätiologie von metastasierendem Prostatakrebs spielen, ist bis heute noch nicht ganz verstanden. Jedoch basierend auf der Bestätigung der aktiven Rolle von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Prostataerkrankungen stellt die vorliegende Offenbarung eine metastasierende Prostatakrebs-Therapie durch Bereitstellung des geeigneten Wildtypgens bereit. In diesen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II an ein Tier mit einer Prostataerkrankung in der selben Weise verabreicht wie andere Erkrankungssuppressoren bereitgestellt werden, gefolgt von der Identifikation eines Zelltyps, dem Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II fehlt oder der abnorme Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II aufweist.
  • In alternativen Aspekten, bei denen die Gehalte oder die Aktivität an Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II zu hoch sind, wird eine Inhibierung Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II oder der Gene, die Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II kodieren, als eine therapeutische Therapie angenommen. Inhibitoren wären jedes Molekül, dass die Aktivität oder Mengen an Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II oder eines Gens, welches Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II kodiert, reduziert und schließt Antisense, Ribozyme und ähnliches genauso wie kleine Molekülinhibitoren ein.
  • 1. Gentherapie
  • Der allgemeine Ansatz, um die Aspekte der vorliegenden Offenbarung, betreffend metastasierende Prostakrebs-Therapeutika, zu erreichen, ist die Bereitstellung einer Zelle mit einem Protein von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II und dadurch die Möglichkeit zu geben, die richtige regulative Aktivität der Proteine wirksam werden zu lassen. Während es denkbar ist, dass das Protein direkt bereitgestellt wird, schließt eine bevorzugte Ausführungsform die Bereitstellung einer Nukleinsäure, die ein Protein von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II kodiert an die Zelle ein. Nach der Bereitstellung wird das Polypeptid mittels der Transkriptions- und Translationsmaschinerie der Zelle genauso wie jedes, das mittels eines Expressionskonstrukts bereitgestellt wird, synthetisiert. Durch Bereitstellung von Antisense, Ribozymen oder anderen Inhibitoren ist die bevorzugte Durchführungsform auch die Bereitstellung einer Nukleinsäure, die das Konstrukt kodiert, an die Zelle. Alle diese Ansätze werden hier von dem Begriff „Gentherapie" umfasst.
  • In gewissen Ausführungsformen der Offenbarung kann die Nukleinsäure, die das Gen kodiert, stabil in das Genom der Zelle integriert werden. In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Nukleinsäure stabil in der Zelle als ein separates, episomales Segment der DNA gehalten werden. Solche Nukleinsäuresegmente oder „Episomen" kodieren Sequenzen, die ausreichen, den Erhalt und Replikation unabhängig von oder in Synchronisation mit dem Wirtszellenzyklus erlauben. Wie das Expressionskonstrukt an eine Zelle geliefert wird und wo in der Zelle die Nukleinsäure verbleibt, hängt von dem Typ des eingesetzten Genkonstrukts ab.
  • a. DNA-Breitstellung unter Verwendung von viralen Vektoren
  • Die Fähigkeit von bestimmten Viren, Zellen zu infizieren oder in die Zelle mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose zu gelangen und die in das Wirtszellengenom integrieren und virale Gene stabil und effizient exprimieren, hat sie zu attraktiven Kandidaten für den Transfer von fremden Genen in Säugetierzellen gemacht. Bevorzugte Gentherapievektoren der vorliegenden Offenbarung werden im Allgemeinen virale Vektoren sein.
  • Obwohl einige Viren, die fremdes, genetisches Material akzeptieren, in ihrer Zahl an Nukleotiden, die sie aufnehmen können und in der Bandbreite an Zellen, die sie infizieren, limitiert sind, haben diese Viren gezeigt, dass sie erfolgreich eine Genexpression hervorrufen können. Adenoviren, die ihr genetisches Material nicht in das Wirtsgenom integrieren und deshalb keine Wirtsreplikation zur Genexpression benötigen, sind jedoch ideal für eine schnelle, effiziente, heterologe Genexpression geeignet. Techniken zur Herstellung Replikations-defekter, infizierender Viren sind im Stand der Technik wohl bekannt.
  • Selbstverständlich wird man bei der Verwendung von viralen Bereitstellungssystemen wünschen, das Virion ausreichend zu reinigen, um es im wesentlich frei von unerwünschten Verunreinigungen, wie defekte, störende virale Teilchen oder Endotoxine oder andere Pyrogene, so dass keine ungünstigen Reaktionen in der Zelle, im Tier oder dem Individuum, welches das Vektorkonstrukt erhält, auftreten. Ein bevorzugtes Mittel zur Reinigung des Vektors umfasst Schwebedichtegradienten, wie zum Beispiel Cäsiumchloridgradienten-Zentrifugation.
  • i. Adenovirale Vektoren
  • Ein bestimmtes Verfahren zur Bereitstellung der Expressionskonstrukte schließt die Verwendung eines Adenovirusvektors ein. Obwohl Adenovirusvektoren bekannt dafür sind, eine geringe Kapazität für die Integration in die genomische DNA zu besitzen, wird dieses Merkmal durch die hohe Effizienz des Gentransfers, der durch diese Vektoren geliefert wird, ausgeglichen. „Adenovirusexpressionsvektor" schließt solche Konstrukte ein, die Adenovirussequenzen enthalten, die ausreichen, um (a) die Verpackung des Konstrukts zu unterstützen und (b) schließlich Gewebe-spezifisch transformierende Konstrukte, die hierin geklont wurden, zu exprimieren.
  • Der Expressionsvektor umfasst eine gentechnisch hergestellte Form des Adenovirus. Das Wissen über die genetische Organisation des Adenovirus, ein 36 kb, linearer, doppelsträngiger Virus, ermöglicht die Substitution von großen Teilen der adenoviralen DNA mit fremden Sequenzen bis zu 7 kb (Grunhaus und Horwitz, 1992). Im Gegensatz zu einem Retrovirus führt die adenovirale Infektion von Wirtszellen nicht zu einer chromosomalen Integration, weil adenovirale DNA auf eine episomale Weise, ohne potentielle Gentoxizität replizieren kann. Adenoviren sind auch strukturell stabil und es wurde keine Genom-Umordnung nach ausgiebiger Amplifikation festgestellt.
  • Adenovirus ist aufgrund seines mittelgroßen Genoms, der Einfachheit der Manipulation, dem hohen Titer, breiten Zielzellen-Bereich und hoher Infektiösität besonders für den Einsatz als Gentransfervektor geeignet. Beide Enden des viralen Genoms enthalten 100–200 Basenpaar-invertierte Wiederholungen („base pair inverted repeats, ITRs), welche cis-Elemente sind, die für die virale DNA-Expression und Verpackung benötigt werden. Die frühen (early, E) und späten (late, L) Bereiche des Genoms enthalten verschiedene Transkriptionseinheiten, die durch das Einsetzen der viralen DNA-Replikation geteilt werden. Die E1-Region (E1A und E1B) kodiert Proteine, die für die Transkriptionsregulation des viralen Genoms sowie einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die E2-Expression (E2A und E2B) führt zu der Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind an der DNA-Replikation, spätes Gen-Expression und Wirtszellen-Shutoff (Renan, 1990) beteiligt. Die späten Genprodukte schließen die meisten der Virionkapsidproteine ein und diese werden nur exprimiert, nachdem die meisten der Abläufe zur Verarbeitung eines einzelnen primären Transkriptes des Major Late Promotors (MLP) erfolgt ist. Der MLP (angeordnet bei 16.8 m.u.) zeigt eine hohe Effizienz während der späten Phase der Infektion und die gesamte mRNAs, die von diesem Promotor freigesetzt werden, besitzen eine 5'-dreigeteilte Leadersequenz (5'-tripartite leader sequenz, TPL), welche sie zu bevorzugten RNAs für die Translation macht.
  • In einem aktuellen System wird rekombinantes Adenovirus aus einer homologen Rekombination zwischen einem Shuttle-Vektor und einem Provirus-Vektor hergestellt. Aufgrund der möglichen Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren kann Wildtyp-Adenovirus mit diesem Verfahren hergestellt werden. Aus diesem Grund ist es kritisch, einen einzelnen Klon des Virus aus einem individuellen Plaque zu isolieren und seine genomische Struktur zu untersuchen.
  • Herstellung und Propagation der aktuellen Adenovirus-Vektoren, welche Replikations-defizient sind, hängen von einer einzigartigen Helferzelllinie, genannt 293, ab, welche aus menschlichen embryonalen Nierenzellen durch Ad5 DNA-Fragmente transformiert worden sind und konstitutiv E1-Proteine (E1A und E1B, Graham et al., 1977) exprimiert. Da die E3-Region aus dem Adenovirusgenom entbehrlich ist (Jones und Shenk, 1978) tragen die aktuellen Adenovirus- Vektoren durch die Hilfe von 293-Zellen entweder in der E1, der D3 oder in beiden Regionen fremde DNA (Graham und Prevec, 1991). In der Natur kann Adenovirus ungefähr 105% des Wildtyp-Genoms verpacken (Gosh-Choudry et al., 1987) und somit für ungefähr 2 kb DNA zusätzlich Kapazität schaffen. Kombiniert mit den ungefähr 5,5 kb an DNA, die in den E1- und E3-Regionen ersetzbar ist, beträgt die maximale Kapazität des aktuellen Adenovirus-Vektors unter 7,5 kb oder 15% der gesamten Länge des Vektors. Mehr als 80% des Adenovirus-Genoms verbleibt in dem Vektor-Rückgrat.
  • Helferzelllinien können von menschlichen Zellen wie menschliche, embryonale Nierenzellen, Muskelzellen, blutbildenden Zellen oder anderen menschlichen embryonalen Mesenchym- oder Epithelialzellen stammen. Alternativ können die Helferzellen von den Zellen anderer Säugetierspezies stammen, die für den menschlichen Adenovirus permissiv sind. Solche Zellen schließen zum Beispiel Verozellen oder andere embryonale Mesenchym- oder Epithelialzellen von Affen ein. Wie oben beschrieben ist die bevorzugte Helferzelllinie 293.
  • Vor kurzem haben Racher et al. (1995) verbesserte Verfahren zum Kultivieren von 293-Zellen und zum propagieren von Adenovirus offenbart. In einer Version werden natürliche Eizellenaggregate durch Impfen von individuellen Zellen in 1 Liter silikonisierten Kreiselkolben (Techne, Cambridge, UK), die 100–200 ml Medium enthalten, gewachsen. Nach Rühren bei 40 rpm wird die Zelllebensfähigkeit mit Trypsan Blau geschätzt. In einer anderen Version werden Fibra-Cel-Träger (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) wie folgt eingesetzt. Ein Zell-Impfmaterial wird in 5 ml Medium resuspendiert, zu dem Träger (50 ml) in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und ortsfest unter gelegentlichem Rühren für 1 bis 4 Stunden gehalten. Das Medium wird dann durch 50 ml frisches Medium ersetzt und Rühren wird gestartet. Zur Virusherstellung wird den Zellen ermöglicht, auf ungefähr 80% Zulauf zu wachsen und nach dieser Zeit wird das Medium ersetzt (auf 25% des endgültigen Volumens). Adenovirus wird bei einem MOI von 0,05 zugegeben. Die Kulturen werden über Nacht stehen gelassen und anschließend wird das Volumen auf 100% erhöht. Rühren wird für weitere 72 h fortgeführt.
  • Außer der Bedingung, dass der Adenovirusvektor Replikations-defekt oder zumindest bedingungsweise defekt ist, wird angenommen, dass der Adenovirusvektor nicht entscheidend für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung ist. Der Adenovirus kann jeder der 42 bekannten Serotypen oder Untergruppen A–F sein. Adenovirus Typ 5 der Untergruppe C ist das bevorzugte Startmaterial, um den bedingungsmäßig Replikations-defekten Adenovirus zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies liegt daran, dass Adenovirus Typ 5 ein menschlicher Adenovirus ist, über den eine große Menge an biochemischen und genetischen Informationen bekannt ist und der historisch für die meisten Konstrukte, die Adenovirus als Vektor verwenden, eingesetzt wurde.
  • Wie oben angegeben ist der typische Vektor gemäß der Erfindung Replikations-defekt und wird keine Adenovirus-E1-Region aufweisen. Aus diesem Grund ist es am einfachsten, das transformierende Konstrukt an der Position von der aus die E1-kodierenden Sequenzen entfernt wurden, einzuführen. Jedoch ist die Insertionsstelle des Konstrukts innerhalb des Adenovirus nicht kritisch für die Erfindung. Die Polynukleotide, die die interessierenden Gene kodieren, können auch anstelle der entfernten E3-Region in E3-Ersetzungsvektoren wie von Karlson et al. (1986) oder in die E4-Region, wenn eine Helferzelllinie oder ein Helfervirus den e4-Defekt komplementieren, insertiert werden.
  • Das Wachstum und die Manipulation von Adenoviren ist den Fachleuten wohlbekannt und zeigt einen breiten Wirtsbereich in vitro und in vivo. Diese Gruppe an Viren kann in hohen Titern, zum Beispiel 109 bis 1011 Plaque-bildenden Einheiten pro ml, erhalten werden und ist höchst infektiös. Der Lebenszyklus eines Adenovirus benötigt nicht die Integration in das Wirtszellengenom. Die fremden Gene, die durch das Adenovirus bereitgestellt werden, sind episomal und besitzen aus diesem Grund eine geringe Gentoxizität gegenüber den Wirtszellen. Keine Nebeneffekte sind in den Studien über Impfung mit Wildtyp-Adenovirus beschrieben worden (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), was ihre Sicherheit und ihr therapeutisches Potential als in vivo Gentransfervektoren zeigt.
  • Adenovirusvektoren sind in der eukaryotischen Genexpression (Levero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) und Impfstoffentwicklung (Grunhaus und Horwitz, 1992; Graham und Prevec, 1992) eingesetzt worden. Vor kurzem legten Tierversuche nahe, dass rekombinantes Adenovirus in der Gentherapie (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991, Strafford-Perricaudet et al., 1991; Rich et al., 1993) eingesetzt werden könnte. Untersuchungen zur Verabreichung von rekombinantem Adenovirus an verschiedene Gewebe, schließen Trachee-Instillation (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), Muskelinjektion (Ragot et al., 1993) periphere intravenöse Injektionen (Herz und Gerard, 1993) und stereotaktische Inokulation in das Gehirn (Le Gal La Salle et al., 1993) ein. Rekombinantes Adenovirus und Adeno-assoziierter Virus können beide nichtteilende, menschliche Primärzellen infizieren und transformieren.
  • ii. AAV-Vektoren
  • Adeno-assoziierter Virus (AAV) ist ein attraktives Vektorsystem zum Einsatz in der Zelltransduktion der vorliegenden Erfindung, da es eine hohe Integrationsfrequenz besitzt und es kann nicht teilende Zellen infizieren. Dies macht es geeignet, um Gene in Säugetierzellen, zum Beispiel in Gewebekulturen (Muzycka, 1992) oder in vivo zu überführen. AAV hat einen breiten Wirtsbereich zur Infektiösität (Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 19886; Lebkowski et al., 1988; Mc-Laughlin et al., 1988. Details, die die Herstellung und Verwendung von rAAV-Vektoren betreffen, sind in den US-Patenten 5,139,941 und US 4,797,368 beschrieben.
  • Studien, die den Einsatz von AAV in der Genbereitstellung zeigen, umfassen La-Face et al. (1988); Zhou et al. (1993); Flotte et al. (1993); und Walsh et al. (1994). Rekombinante AAV-Vektoren sind erfolgreich in der in vitro und in vivo Transduktion von Markergenen eingesetzt worden (Kaplitt et al., 1994; Lebkowski et al., 1988; Samulski et al., 1989; Yoder et al., 1994; Zhou et al., 1994; Hermonat and Muzyczka, 1984; Tratschin et al., 1985; McLaughlin et al., 1988) und von Genen, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind (Flotte et al., 1992; Luo et al., 1994; Ohi et al., 1990; Walsh et al., 1994; Wei et al., 1994).
  • AAV ist ein abhängiger Parvovirus, weil es Coinfektion mit einem anderen Virus (entweder Adenovirus oder ein Mitglied der Herpes-Virus-Familie) benötigt, um eine produktive Infektionen in kultivierten Zellen einzugehen (Muzycka, 1992). In der Abwesenheit einer Coinfektion mit einem Helfervirus integriert das AAV-Wildtypgenom über seine Enden in das menschliche Chromosom 19, wo es in einem latenten Zustand eines Provirus verbleibt (Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). rAAV ist jedoch nicht auf Chromosom 19 zur Integration beschränkt solange das AAV Rep Protein auch exprimiert wird (Shelling und Smith, 1994). Wenn eine Zelle, die einen AAV-Provirus trägt, mit einem Helfervirus superinfiziert wird, wird das AAV-Genom von dem Chromosom oder einem rekombinanten Plasmid „gerettet" und eine normale, produktive Infektion wird begründet (Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1988, Kotin et al., 1990; Myzycka, 1992).
  • Typischerweise wird rekombinantes AAV (rAAV) mittels Cotransfektion eines Plasmids, welches das interessierende Gen flankiert von den beiden AAV-terminalen Wiederholungen (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989) enthält, mit einem Expressionsplasmid, welches die kodierenden Sequenzen des Wildtyp-AAV ohne terminate Wiederholungen, zum Beispiel pIM45 (McCarty et al., 1991) enthält, hergestellt. Die Zellen werden auch mit Adenovirus oder Plasmiden, die Adenovirusgene, die für die AAV-Helferfunktion benötigt werden, infiziert oder transfiziert. rAAV-Virusvorräte, die auch solche eine Weise gemacht wurden, sind mit Adenovirus kontaminiert, welche physikalisch von den rAAV-Teilchen getrennt werden müssen (zum Beispiel mittels Cäsiumchlorid-Dichtezentrifugation). Alternativ können Adenovirusvektoren, die die AAV-kodierenden Regionen oder Zellenlinien, die die AAV-kodierenden Regionen enthalten und alle Adenovirushelfergene eingesetzt werden (Yang et al., 1994; Clark et al., 1995). Zelllinien, die die rAAV-DNA als ein integriertes Provirus tragen, können auch eingesetzt werden (Flotte et al., 1995).
  • iii. Retrovirale Vektoren
  • Retroviren geben aufgrund ihrer Fähigkeit ihre Gene in Wirtsgenome zu integrieren, Anlass zur Hoffnung Gen-bereitstellende Vektoren zu sein, die große Mengen an fremden genetischen Material transferieren, ein breites Spektrum an Spe zies und Zelltypen infizieren sowie in speziellen Zelllinien verpackt werden zu können (Miller, 1992).
  • Die Retroviren sind eine Gruppe an Einzelstrang-RNA-Viren, die durch eine Fähigkeit charakterisiert sind, ihre RNA mittels eines Verfahren der reversen Transkription (Coffin, 1990) in Doppelstrang-DNA in infizierten Zellen zu überführen. Die erhaltene DNA integriert dann stabil als ein Provirus in zelluläre Chromosomen und leitet die Synthese von viralen Proteinen. Die Integration führt zu einer Retention der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene gag, pol und env, die Capsidproteine, Polymeraseenzym und Umhüllungskomponenten kodieren. Eine Sequenz, die strangaufwärts vom gag-Gen gefunden wird, fungiert als Signal für die Verpackung des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungs-(long terminal repeat, RPT)sequenzen sind an den 5'- und 3'-Enden des viralen Genoms vorhanden. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancersequenzen und werden auch für die Integration in das Wirtszellengenom benötigt (Coffin, 1990).
  • Um einen retroviralen Vektor zu konstruieren, wird eine Nukleinsäure, die das interessierende Gen kodiert, an die Stelle von bestimmten viralen Sequenzen in das virale Genom insertiert, um einen Virus zu produzieren, der Replikations-defekt ist. Um Virionen zu produzieren wird eine Verpackungszelllinie, enthaltend gag, pol und env-Gene aber keine LTR- und Verpackungskomponenten, konstruiert (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, welche eine cDNA zusammen mit den retroviralen LTR- und Verpackungssequenzen. in diese Zelle eingeführt wird (beispielsweise mittels Calciumphosphatpräzipitation) ermöglicht die Verpackungssequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in virale Partikel verpackt wird, welche dann in das Kulturmedium sekretiert werden (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann gesammelt, optional aufkonzentriert und dann für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage eine Vielzahl von Zelltypen zu infizieren. Integration und stabile Expression benötigen jedoch die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
  • Bedenken bei der Verwendung von defekten Retrovirus-Vektoren ist das potentielle Auftreten von Wildtyp-Replikations-fähigen Viren in den Verpackungszellen. Dies kann die Folge von Rekombinationsereignissen sein, bei denen die intakte Sequenz des rekombinanten Virus strangaufwärts der gag-, pol-, env-Sequenz, die in das Wirtszellengenom integriert sind, insertiert. Neue Verpackungszelllinien sind nun erhältlich, die die Wahrscheinlichkeit der Rekombination stark reduzieren (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
  • Genbereitstellung mittels retroviraler Vektoren der zweiten Generation ist auch berichtet worden. Kasahara et al. (1994) haben eine gentechnisch hergestellte Variante des Moloney-Mäuse-Leukämievirus hergestellt, der normalerweise nur Mauszellen infiziert, und ein Umhüllungsprotein modifiziert, an das der Virus spezifisch bindet. Menschliche Zellen, die den Erythropoetin(EPO)-Rezeptor tragen, wurden infiziert. Dies wurde mittels Insertion eines Teils der EPO-Sequenz in ein Umhüllungsprotein erreicht, um ein chimäres Protein mit einer neuen Bindungsspezifität zu erzeugen.
  • iv. Andere virale Vektoren
  • Andere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Offenbarung eingesetzt werden. Es können Vektoren eingesetzt werden, die von Viren wie Vacciniavirus (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), Sinbis-Virus, Zytomegalovirus und Herpes-Simplex-Viren abgeleitet sind. Sie bieten mehrere attraktive Eigenschaften für verschiedene Säugetierzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
  • Durch die kürzliche Entdeckung von defekten Hepatitis-B-Viren wurde neue Einsicht in die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener viraler Sequenzen gewonnen. In vitro-Untersuchungen zeigten, dass das Virus die Fähigkeit zur helferabhängigen Verpackung und reversen Transkription trotz einer Deletion von bis zu 80% seines Genomes beibehalten hatte (Horwich et al., 1990). Dies wies darauf hin, dass ein großer Teil des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden könnte. Chang et al. führte kürzlich das Chloramphenicolace tyltransferase (CAT) Gen in das Hepatits-B-Virusgenom von Enten an die Stelle der Polymerase, Oberflächen- und Voroberflächen-kodierenden Sequenzen ein. Dieses wurde mit einem Wildtypvirus in eine vom Vogel abstammende Hepatomzelllinie cotranfiziert. Eine stabile CAT-Genexpression konnte für wenigstens 24 Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden (Chang et al., 1991).
  • In bestimmten weiteren Ausführungsformen wird der Gentherapie-Vektor HSV sein. Ein Faktor, der HSV attraktiv als Vektor macht, ist die Größe und Organisation des Genoms. Da HSV groß ist, ist die Einführung von multiplen Genen oder Expressionscassetten weniger problematisch als in anderen, kleineren viralen Systemen. Zusätzlich macht die Verfügbarkeit von verschiedenen viralen Kontrollsequenzen mit variierender Leistung (zeitlich, Stärke, etc.) es möglich, die Expression in einem größeren Ausmaß als in anderen Systemen zu kontrollieren. Es ist auch ein Vorteil, dass das Virus relativ wenige gespleißte Nachrichten besitzt, was die genetischen Manipulationen weiter vereinfacht. HSV ist relativ leicht zu manipulieren und kann in hohen Titer gezüchtet werden. Aus diesem Grund ist die Bereitstellung ein geringeres Problem im Hinblick auf die benötigten Volumina, um ein ausreichendes MOI zu erzielen, und im Hinblick auf ein reduziertes Muss an Wiederholungsdosierungen.
  • v. Modifizierte Viren
  • In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung sind die Nukleinsäuren, die bereitgestellt werden sollen, zusammen mit einem infizierten Virus beherbergt, der gentechnisch hergestellt wurde, um einen spezifischen Bindungsliganden zu exprimieren. Die Viruspartikel werden deshalb spezifisch an die zugehörigen Rezeptoren der Zielzelle binden und den Inhalt an die Zelle liefern. Ein neuer Ansatz, der entwickelt wurde, um ein spezifisches Targeting der Retrovirus-Vektoren zu erlauben, wurde kürzlich basierend auf der chemischen Modifikation eines Retrovirus mittels der chemischen Addition von Lactose-Resten an die virale Umhüllung entwickelt. Diese Modifikation kann die spezifische Infektion von Hepatozyten über Sialoglycoproteinrezeptoren ermöglichen.
  • Ein anderer Ansatz zum Targeting von rekombinanten Retroviren wurde entwickelt, bei dem biotinylierte Antikörper gegen ein retrovirales Umhüllungsprotein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor eingesetzt wurden. Die Antikörper wurden über die Biotin-Komponenten unter Verwendung von Streptavidin (Roux et al., 1989) gekoppelt. Bei Verwendung von Antikörpern gegen Haupt-Histokompatibilitätskomplex Klasse I und Klasse I Antigene, wurde die Infektion einer Vielzahl von menschlichen Zellen, die solche Oberflächen-Antigene hervorbringen, mit einem ecotropen Virus in vitro gezeigt (Roux et al., 1989).
  • b. Andere Verfahren zur DNA-Bereitstellung
  • In verschiedenen Ausführungsformen der Offenbarung wird DNA als ein Expressionskonstrukt an eine Zelle bereitgestellt. Um die Expression eines Gens zu bewirken, muss das Expressionskonstrukt in eine Zelle geliefert werden. Wie hier beschrieben ist der bevorzugte Mechanismus für die Bereitstellung über virale Infektion, bei der das Expressionskonstrukt in einen infektiösen, viralen Partikel eingekapselt ist. Jedoch werden verschiedene nicht-virale Verfahren für den Transfer von Expressionskonstrukten in Zellen durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung kann das Expressionskonstrukt nur aus nackter, rekombinanter DNA oder Plasmiden bestehen. Die Übertragung des Konstrukts kann auf jede Art, wie sie oben beschrieben ist, die physikalisch oder chemisch die Zellmembran durchdringt, durchgeführt werden. Einige dieser Techniken können, wie später beschrieben, erfolgreich für den in vivo oder ex vivo Einsatz adaptiert werden.
  • i. Liposom- und Nanokapsel-vermittelte Transfektion
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt in einem Liposom gefangen sein. In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung von Liposomen und/oder Nanopartikeln für die Einführung von Proteinen, Peptiden oder Reagenzien, Stimulatoren, Inhibitoren oder Gentherapievektoren einschließlich Wildtyp-Vektoren und Antisense-Vektoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Wirtszellen in Betracht gezogen. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipiddoppelmembran und einen inneren wässrigen Mediumanteil gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben viele Lipidschichten, die durch wässrige Medien getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Übermaß an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstanordnung, bevor sich geschlossene Strukturen bilden oder Wasser umschließen und gelöste Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten aufgelöst werden (Ghosh und Bachhawat, 1991). Ebenso ist ein Expressionskonstrukt, das mit Lipofektamin komplexiert ist, zu erwägen /Gibco BRL).
  • Liposom-vermittelte Nukleinsäure-Bereitstellung und Expression von fremder DNA in vitro ist sehr erfolgreich von (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987) gewesen. Wong et al. (1980) zeigten die Durchführbarkeit einer Liposomen-vermitt kultivierten Hühnerembryonen-, HeLa- und Hepatoma-Zellen.
  • Liposomen werden aus Phospholipiden gebildet, die in einem wässrigen Medium dispergiert sind und spontan multilamellare, konzentrische Doppelschicht-Vesikel (auch als multilamellare Vesikel „MLVs" bezeichnet) bilden. MLVs besitzen im Allgemeinen Durchmesser von 25 mm bis 4 μm. Beschallung von MLVs führt zu der Bildung von kleinen unilamellaren Vesikeln („small unilamellar vesicles, SUVs) mit Durchmessern im Bereich von 200 bis 500 Å, umfassend im Kern eine wässrige Lösung.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die Liposomen mit einem hämaglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert werden. Hierfür wurde gezeigt, dass dies eine Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Eintritt der Liposomen-verkapselten DNA in die Zelle fördert (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen können die Liposomen in Verbindung mit nuklearen, nichthistonhaltigen chromosomalen Proteinen (HMG-1) komplexiert oder eingesetzt werden (Kato et al., 1991). In noch weiteren Ausführungsformen können die Liposomen in Verbindung mit sowohl HVJ und HMG-1 komplexiert oder eingesetzt werden. In anderen Ausführungsformen, kann das Bereitstellungsvehikel einen Liganden und ein Liposom enthalten. Im Falle, dass ein bakterieller Promotor in einem DNA-Konstrukt eingesetzt ist, ist es außerdem wünschenswert, in dem Liposom eine geeignete bakterielle Polymerase einzuschließen.
  • Nanokapseln können im Allgemeinen Verbindungen auf eine stabile und reproduzierbare Weise einschließen. Um Nebeneffekte aufgrund von intrazellulärer polymerer Überladung zu vermeiden, sollten solche ultrafeinen Partikel (mit einer Größe von ungefähr 0,1 μm) unter Verwendung von Polymeren, die in der Lage sind in vivo zersetzt zu werden, entwickelt werden. Bioabbaubare Polyalkylcyanoacrylat-Nanopartikel, die diese Voraussetzung erfüllen, werden zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen und solche Partikel können einfach hergestellt werden.
  • Liposomen wechselwirken mit Zellen über vier verschiedene Mechanismen: Endocytose durch Phagozyten des retikuloendotheliales Systems wie Makrophagen und Neutrophile, Adsorption auf der Zelloberfläche entweder über nichtspezifische schwach hydrophobe oder elektrostatische Kräfte oder mittels spezifischer Wechselwirkungen mit Komponenten auf der Zelloberfläche, Fusion mit der Plasmazellmembran durch Insertion der Lipid-Doppelschicht des Liposoms in die Plasmamembran unter spontaner Freisetzung des liposomalen Inhalts in das Zytoplasma und mittels Transfers der liposomalen Lipide in zelluläre oder subzelluläre Membrane oder vice versa ohne jede Assoziation des Liposomeninhalts. Variation der Liposomenformulierung kann den Mechanismus, der operativ ist, ändern, obwohl mehr als einer zur selben Zeit operativ sein kann.
  • ii. Elektroporation
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Expressionkonstrukt mittels Elektroporation in die Zelle eingeführt. Elektroporation umfasst das Aussetzen einer Suspension von Zellen und DNA an eine elektrische Hochspannungsentladung.
  • Die Transfektion von eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Elektroporation ist ziemlich erfolgreich gewesen. Maus Prä-B Lymphozyten sind mit menschlichen kappa-Immunoglobulin Genen transfiziert worden (Potter et al., 1984) und Ratten-Heptazyten sind mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen auf diese Weise transfiziert worden (Tur-Kaspa et al., 1986).
  • iii. Calciumphosphatpräzipitation
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung wird das Expressionskonstrukt mittels Calciumphosphatpräzipitation in die Zellen eingeführt. Menschliche KB-Zellen sind mit Adenovirus 5 DNA unter Anwendung dieser Technik transfiziert worden (Graham und Van Der Eb, 1973). Ebenso sind auf diese Weise Maus L(A9), Maus C127-, CHO-, CV-1-, BHK-, N1IH3T3 und HeLa-Zellen mit dem Neomycin-Markergen (Chen und Okayama, 1987) transfiziert worden und Ratten-Hepatozyten sind mit einer Vielzahl an Markergenen transfiziert worden (Rippe et al., 1990).
  • iv. DEAE-Dextran-Behandlung
  • In einer anderen Ausführungsform wird das Expressionskonstrukt unter Verwendung von DEAE-Dextran gefolgt von Polyethylenglykol an die Zelle geliefert. Auf diese Weise sind Reporter-Plasmide in Maus-Myelom- und Erythroleukämie-Zellen eingeführt worden (Gopal, 1985).
  • v. Partikelbombardement
  • Eine andere Ausführungsform der Offenbarung zum Transfer eines nackten DNA-Expressionskonstrukts in Zellen kann Partikelbombardement umfassen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, um ihnen das durchdringen von Zellmembranen und den Eintritt in Zellen ohne diese zu töten, zu ermöglichen (Klein et al., 1987). Verschiedene Geräte zur Beschleunigung von kleinen Partikeln sind entwickelt worden. Eines dieser Geräte beruht auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Stroms, welcher wiederum die Treibkraft bereitstellt (Yang et al., 1990). Die eingesetzten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen wie Wolfram- und Goldkugeln.
  • vi. Direkte Mikroinjektion oder Schallbeladung
  • Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen die Einführung des Expressionskonstrukts mittels direkter Mikroinjektion oder Schallbeladung ein. Direkte Mikroinjektion ist verwendet worden, um Nukleinsäure-Konstrukte in Xenopus Oozyten (Harland und Weintraub, 1985) einzuführen. LTK–-Fibroblasten sind mit dem Thymidin-Kinase-Gen mittels Schallbeladung transfiziert worden (Fechheimer et al., 1987).
  • vii. Adenoviral-unterstützte Transfektion
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung wird das Expressionskonstrukt mittels Adenovirus-unterstützter Transfektion in die Zelle eingeführt. Erhöhte Transfektionseffizienzen sind in Zellsystem beobachtet worden, die Adenovirus-gekoppelte Systeme verwenden (Kelleher und Vos, 1994; Cotten et al., 1992; Curiel 1994).
  • viii. Rezeptor-vermittelte Transfektion
  • Noch weitere Expressionskonstrukte, die eingesetzt werden können, um den Gewebe-spezifischen Promotor und das transformierende Konstrukt bereitzustellen an die Zielzellen bereit zu stellen, sind Rezeptor-vermittelte Bereitstellungsvehikel. Diese ziehen Vorteil aus der selektiven Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose, die in den Zielzellen auftritt. Aufgrund der Zelltyp-spezifischen Verteilung von verschiedenen Rezeptoren, addiert dieses Bereitstellungsverfahren einen anderen Grad an Spezifität zu der vorliegenden Erfindung. Spezifische Vehikel im Hinblick auf andere Säugetierzelltypen sind von Wu und Wu (1993) beschrieben worden.
  • Bestimmte Rezeptor-vermittelte Gentargeting-Vehikel umfassen einen Zellrezeptor-spezifischen Liganden und ein DNA-bindendes Reagenz. Andere enthalten einen Zellrezeptor-spezifischen Liganden, an den das bereitzustellende DNA-Konstrukt operativ befestigt wurde. Verschiedene Liganden sind für den Rezeptor-vermittelten Gentransfer verwendet worden (Wu und Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EP 0273085 ), welche die Durchführbarkeit dieser Technik zeigen. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird der Ligand ausgewählt sein, um einen Rezeptor, der spezifisch auf der neuroendokrinen Zielzellenpopulation exprimiert wird, zu entsprechen.
  • In anderen Ausführungsformen kann die DNA-Bereitstellungs-Vehikelkomponente eines Zell-spezifischen Gentargeting-Vehikels ein spezifischen Bindungsliganden in Kombination mit einem Liposom enthalten. Die zu bereitstellenden Nukleinsäuren sind innerhalb des Liposoms beherbergt und der spezifische Bindungsligand ist funktionell in die Liposommembran eingebracht. Das Liposom wird deshalb spezifisch an die Rezeptoren der Zielzelle binden und den Inhalt an die Zelle liefern. Solche Systeme wurden als funktionale Verwendungssysteme, bei denen, zum Beispiel, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) in der Rezeptor-vermittelten Bereitstellung einer Nukleinsäure an Zellen, die eine Hinaufregulierung des EGF-Rezeptors aufweisen, gezeigt.
  • In noch weiteren Ausführungsformen kann die DNA-Bereitstellungs-Vehikelkomponente des Vehikels zur gezielten Bereitstellung ein Liposom selber sein, welches vorzugsweise ein oder mehr Lipide oder Glykoproteine, die die Zell-spezifische Bindung leiten, enthalten. Nicolau et al. (1987) setzten zum Beispiel Lactosyl-Ceramid, eine Galactose-terminales Asialgangliosid, eingebracht in Liposomen ein und beobachteten einen Anstieg in der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Gewebe-spezifischen transformierenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung spezifisch in Zielzellen auf eine ähnliche Weise bereitgestellt werden können.
  • 2. Antisense
  • In den oben diskutierten, alternativen Ausführungsformen können die eingesetzten Nukleinsäuren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II sogar Antisense-Konstrukte kodieren, die unter intrazellulären Bedingungen an die Nukleinsäuren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II hybridisieren. Der Begriff „Antisense-Konstrukt" soll sich auf Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide be ziehen, die komplementär zu den Basensequenzen einer Ziel-DNA oder -RNA sind. Targeting von doppelsträngiger (ds) DNA mit einem Antisense-Konstrukt führt zu einer Tripel-Helix-Bildung und Targeting von RNA führt zu einer Doppelhelix-Bildung. Antisense-Nukleinsäuren binden, wenn sie in eine Zielzelle eingeführt worden sind, spezifisch an ihr Zielpolynukleotid, zum Beispiel Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II und beeinträchtigen die Transkription, die RNA-Verarbeitung, den Transport, die Translation und/oder die Stabilität. Antisense-RNA-Konstrukte oder DNA, die solche Antisense-RNAs kodiert, können eingesetzt werden, um die Gentranskription oder Translation oder beides von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in den Zellen der vorliegenden Offenbarung zu inhibieren.
  • Antisense-Konstrukte können entwickelt werden, um den Promotor und andere Kontrollbereiche, Exons, Introns oder auch die Grenze zwischen Exons und Introns in einem Gen zu binden. Antisense-RNA-Konstrukte oder DNA, die solche Antisense-RNAs kodiert, können eingesetzt werden, um die Gentranskription oder Translation oder beides in einer Wirtszelle, entweder in vitro oder in vivo, wie zum Beispiel in Tierzellen, einschließlich einem menschlichen Subjekt, zu inhibieren. Nukleinsäuresequenzen, die „komplementäre Nukleotide" enthalten, sind solche, die eine Basenpaarung gemäß den Standardregeln der Komplementarität von Watson-Crick erlauben. Dies bedeutet, dass das größere Purin sich mit dem kleineren Pyrimidin paart, um Guaninpaarungen mit Cytosin (G:C) und Adenin mit Thymin (A:T) im Fall von DNA zu ermöglichen bzw. Adenin mit Uracil (A:U) im Fall von RNA zu paaren. Das Einfügen von weniger häufig auftretenden Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Methyladenin, Hypoxanthin und anderer in die hybridisierenden Sequenzen stört die Paarung nicht.
  • Der hierin verwendete Begriff „komplementär" umfasst Nukleinsäuresequenzen, die im Wesentlichen komplementär über ihre gesamte Länge sind und nur wenige Basenfehlpaarungen haben. So werden zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen aus fünfzehn Basen als komplementär bezeichnet, wenn sie ein komplementäres Nukleotid an dreizehn oder vierzehn aus fünfzehn Positionen mit nur einer Fehlpaarung aufweisen. Selbstverständlich sind Nukleinsäuresequenzen, die „voll ständig komplementär" sind, solche Nukleinsäuresequenzen, die über ihre gesamte Länge vollständig komplementär sind und keine Fehlpaarungen haben.
  • Andere Sequenzen mit einem niedrigeren Grad an Homologie sind ebenso zu berücksichtigen. Beispielsweise könnte ein Antisense-Konstrukt, welches eine begrenzte Region von hoher Homologie aufweist, jedoch auch nicht-homologe Regionen (zum Beispiel ein Ribozym) enthält, gestaltet werden. Solche Moleküle würden, obwohl sie weniger als 50% Homologie hätten, unter geeigneten Bedingungen an die Zielsequenz binden.
  • Während alle oder Teile der Gensequenzen von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 16 und/oder Semenogelin II im Zusammenhang mit der Konstruktion von Antisense eingesetzt werden können, sind kurze Oligonukleotide leichter herzustellen und sie erhöhen die in vivo Verfügbarkeit. Jedoch steigt sowohl die Bindungsaffinität als auch die Sequenzspezifität eines Antisense-Oligonukleotids an sein komplementäres Ziel mit steigender Länge an. Man kann einfach durch Testen der Konstrukte in vivo feststellen, ob die Funktion des endogenen Gens beeinflusst wird oder ob die Expression verwandte Gene mit komplementären Sequenzen beeinflusst wird, und somit, ob eine gegebene Antisense-Nukleinsäure wirksam beim Targeting der entsprechenden Wirtszellen ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, Antisense-Konstrukte zu verwenden, die weitere Elemente, zum Beispiel solche, die C-5-Propinpyrimidin einschließen. Oligonukleotide, die C-5 Propinanaloga des Uridins und Cytidins enthalten, stellten bereits ihre hohe Affinität, RNA zu binden, und ihre Fähigkeit starke Antisense-Inhibitoren der Genexpression zu sein, unter Beweis.
  • 3. Ribozyme
  • Ein anderes Verfahren zur Inhibierung der Expression von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II, welches von der vorliegenden Offenbarung in Betracht gezogen wird, ist über Ribozyme. Obwohl Proteine traditionell für die Katalyse von Nukleinsäuren eingesetzt wurden, ist eine andere Klasse an Makromolekülen aufgetaucht, die sich zu diesem Bestreben als nützlich erwiesen haben. Ribozyme sind RNA-Protein-Komplexe, die Nukleinsäuren auf eine ortsspezifische Weise spalten. Ribozyme besitzen spezifische katalytische Domänen, die Endonuclease-Aktivität aufweisen (Kim und Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster und Symons, 1987). Zum Beispiel beschleunigen eine Vielzahl an Ribozyme Phosphoester-Transferreaktionen mit einem hohen Grad an Spezifität, wobei oftmals nur einer der zahlreichen Phosphoester in einem Oligonukleotidsubstrat gespalten wird (Cech et al., 1981; Michel und Westhof, 1990; Reinhold-Hurek und Shub, 1992). Diese Spezifizität wurde der Bedingung, dass das vor der chemischen Reaktion Substrat über spezifische Basenpaar-Wechselwirkungen an die interne Guide-Sequenz („IGS") des Ribozyms bindet, zugeordnet.
  • Ribozym-Katalyse ist in erster Linie als Teil von Sequenz-spezifischen Spaltungs-/Ligationsreaktonen, die Nukleinsäure beinhalten, beobachtet worden (Joyce, 1989; Cech et al., 1981). In dem US-Patent Nr. 5,354,855 ist, zum Beispiel offenbart, dass bestimmte Ribozyme als Endonukleasen mit einer Sequenzspezifität, die größer ist als die von bekannten Ribonukleasen, und sich derer von DNA-Restriktionsenzymen nähert. Aus diesem Grund kann die Sequenz-spezifische Ribozym-vermittelte Inhibierung einer Genexpression insbesondere für therapeutische Anwendungen geeignet sein (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990; Sioud et al., 1992). Kürzlich ist berichtet worden, dass Ribozyme genetische Veränderungen in einigen Zelllinien, an die sie verabreicht wurden, auslösten. Die veränderten Gene umfassten Onkogene H-ras, c-fos und Gene von HIV. Das meiste dieser Arbeit umfasste die Modifikation einer Ziel-mRNA basierend auf einem spezifischen Mutanten-Kodon, das durch ein spezifisches Ribozym gespalten wird.
  • Einige verschiedene Ribozym-Motive sind im Zusammenhang mit RNA-Spaltungsaktivität beschrieben worden (Symons, 1992). Beispiele, von denen erwartet wird, dass sie äquivalent in der Runterreglierung von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II funktionieren, schließen Sequenzen der Gruppe 1 selbstspleissender Introns, einschließlich des Tobacco Ringspot Virus (Prody et al., 1986), Avocado Sunblotch Viroid (Palukaitis et al., 1979; Symons, 1981) und Lucerne Transient Streak Virus (Forster and Symons, 1987), ein.
  • Andere geeignete Ribozyme umfassen Sequenzen von RNase P mit RNA-Spaltungsaktivität (Yuan et al., 1992, Yuan und Altman, 1994, US-Patent Nrn. 5, 168,053 und 5,624,824), Haarnadel-Ribozym-Strukturen (Berzal-Herranz et al., 1992; Chowrira et al., 1993) und Hepatitis Delta Virus basierende Ribozyme (US-Patent Nr. 5,625,047). Die allgemeine Entwicklung und Optimierung von Ribozym-gesteuerter RNA-Spaltungsaktivität ist im Detail diskutiert worden (Haseloff und Gerlach, 1988, Symons, 1992, Chowrira et al., 1994; Thompson et al., 1995).
  • Die andere Variable bei der Ribozym-Entwicklung ist die Auswahl der Spaltungsstelle auf einer gegebenen Ziel-RNA. Ribozyme werden auf eine gegebene Sequenz mittels Annealing an eine Stelle über komplementäre Basenpaar-Wechselwirkungen ausgerichtet. Zwei Streckungen von homologen Sequenzen flankieren die oben definierte, katalytische Ribozym-Struktur. Jede Streckung an homologer Sequenz kann in der Länge von 7 bis 15 Nukleotiden variieren. Die einzige Voraussetzung zur Definition der homologen Sequenzen ist die, dass sie auf der Ziel-RNA durch eine spezifische Sequenz, welche der Spaltungsort ist, getrennt sind. Für Hammerkopf-Ribozym ist die Spaltungsstelle auf der Ziel-RNA ein eine Dinukleotidsequenz, die ein Uracil (U) gefolgt von entweder einem Adenin, Cytosin oder Uracil (A, C oder U) enthält (Perriman et al., 1992; Thompson et al., 1995). Die Frequenz, mit der dieses Dinukleotid in einer gegebenen RNA auftritt, ist statistisch 3 von 16. Aus diesem Grund sind für eine gegebene ZielmessengerRNA mit 1000 Basen 187 Dinukleotid-Spaltungsstellen statistisch denkbar.
  • Die große Zahl an möglichen Spaltungsstellen in Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II, die an die ansteigende Zahl an Sequenzen mit gezeigter katalytischer RNA-Spaltungsaktivität gekoppelt ist, zeigt an, dass eine große Zahl an Ribozymen, die das Potential besitzen, Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II runter zu regulieren, vorhanden ist. Zusätzlich können aufgrund der Variation in der Sequenz innerhalb von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II Ribozyme entwickelt werden, die spezifisch Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II spalten. Die Entwicklung und Prüfung der Ribozyme auf effiziente Spaltung von einer Ziel-RNA ist ein den Fachleuten wohl bekanntes Verfahren. Beispiele an wissenschaftlichen Methoden zur Entwicklung und Prüfung von Ribozymen wurden von Chowrira et al. (1994) und Lieber und Strauss (1995), auf die hiermit Bezug genommen wird, beschrieben. Die Identifizierung von operativen und bevorzugten Sequenzen zum Einsatz in auf Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und Semenogelin II gerichtete Ribozyme ist einfach eine Frage der Herstellung und Prüfung einer gegebenen Sequenz und ist eine routinemäßig durchgeführte „Screening"-Methode, die den Fachleuten gut bekannt ist.
  • 4. Homologe Rekombination
  • Obwohl genetische Transformation tendenziell ganz effizient ist, wird sie auch von Problemen im Hinblick auf zufällige Insertion begleitet. Zufällige Integration kann zur Inaktivierung von essentiellen Genen oder fehlerhafter Expression der eingeführten Gene führen. Zusätzliche Probleme, die mit der genetischen Transformation verbunden sind, umfassen Mosaik aufgrund von multiplen Integrationen und technische Schwierigkeiten, die in Verbindung mit der Herstellung von Replikation-defekten virale Vektoren, auftreten.
  • Einige dieser Nachteile können durch Verwendung einer Technik, die als homologe Rekombination bekannt ist überwunden werden (Koller und Smithies, 1992). Diese Technik erlaubt die präzise Modifikation von existierenden Genen, überwindet die Probleme von positionellen Effekten und insertionaler Inaktivität und ermöglicht die Inaktivierung von spezifischen Genen, genauso wie den Austausch von einem Gen gegen ein anderes. Verfahren zur homologen Rekombination sind in US-Patent Nr. 5,614,396 beschrieben.
  • Deshalb umfasst ein bevorzugtes Verfahren zur Bereitstellung von transgenen Konstrukten die Verwendung von homologer Rekombination. Homologe Rekombination basiert, wie Antisense, auf der Neigung von Nukleinsäure, Basenpaare mit komplementären Sequenzen zu bilden. In diesem Zusammenhang dient die Basenpaarung dazu, die Wechselwirkung von zwei Nukleinsäuremolekülen zu vereinfachen, so dass ein Strangbruch und eine Reparatur stattfinden können. In anderen Worten, der „homologe" Aspekt des Verfahrens basiert auf Sequenzhomologie, um zwei komplementäre Sequenzen in engen Kontakt zu bringen, während der „Rekombinations"aspekt dafür steht, dass eine komplementäre Sequenz von einer anderen mittels Brechens von bestimmten Bindungen und Bilden von anderen ersetzt wird.
  • In der Praxis wird die homologe Rekombination wie folgt eingesetzt: Zunächst wird eine Stelle für die Integration innerhalb der Wirtszelle ausgewählt. Sequenzen, die homolog zu der Integrationsstelle sind, werden dann in ein genetisches Konstrukt eingebracht, die das ausgewählte, in das Genom zu integrierende Gen flankieren. Flankieren bedeutet in diesem Zusammenhang einfach, dass die homologen Zielsequenzen beide „upstream" (5') und „downstream" (3') des ausgewählten Gens lokalisiert sind. Diese Sequenzen sollten einigen Sequenzen, die upstream oder downstream vom Zielgen sind, entsprechen. Das Konstrukt wird dann in die Zelle eingeführt und ermöglicht so die Rekombination zwischen den zellulären Sequenzen und dem Konstrukt.
  • Aus praktischen Gründen wird das genetische Konstrukt normalerweise deutlich mehr als Vehikel fungieren, um das Gen in das Genom einzuführen. Zum Beispiel ist es wichtig in der Lage zu sein, Rekombinanten auszuwählen und deshalb ist es üblich, dass in dem Konstrukt ein selektierbares Markergen eingebracht ist. Dieses Gen ermöglicht die Auswahl von Zellen, die das Konstrukt in ihre genomische DNA integriert haben, durch Verleihung von Widerstand gegenüber verschiedenen biostatischen und bioziden Wirkstoffen. Zusätzlich kann diese Technik eingesetzt werden, um bestimmte Gene „auszuknocken" (löschen) oder zu unterbrechen. Deshalb schließt ein anderer Ansatz zur Inhibierung von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und Semenogelin II die Verwendung von homologer Rekombination oder „Knock-out-Technologie" ein. Dies wird durch Einbringen einer mutierten oder größtenteils gelöschten Form des heterologen Gens zwischen die flankierenden Bereiche innerhalb des Konstrukts, erzielt.
  • Die Anordnung eines Konstrukts, um eine homologe Rekombination zu bewirken, kann wie folgt aussehen.
    ...Vektor·5'-flankierende Sequenz·ausgewähltes Gen·ausgewähltes Markengen·flankierende Sequenz-3'·Vektor
  • Somit ist bei Verwendung dieser Art von Konstrukt möglich, in einem rekombinatorischen Ereignis, (i) endogene Gene „auszuknocken", (ii) einen auswählbaren Marker zur Identifizierung eines solchen Ereignisses bereit zustellen und (iii) ein Transgen zur Expression einzuführen.
  • Eine weitere Verbesserung des homologen Rekombinationsansatzes umfasst die Verwendung eines „negativ" auswählbaren Markers. Ein Beispiel für die Verwendung des Cytosindeaminase-Gens in einem negativen Auswahlverfahren ist im US-Patent Nr. 5,624,830 beschrieben. Der negative Auswahlmarker führt anders als der auswählbare Marker zum Tod der Zellen, die den Marker exprimieren. Aus diesem Grund wird er eingesetzt, um unerwünschte Rekombinationsereignisse zu identifizieren. Bei dem Wunsch homologe Rekombinanten unter Verwendung eines auswählbaren Markers auszuwählen, ist es schwierig im anfänglichen Screeningschritt die homologen Rekombinanten, die aus zufälligen, nicht Sequenz-spezifischen Ereignissen hervorgegangen sind, genau zu identifizieren. Die Rekombinanten können auch das auswählbare Markergen enthalten und das heterologe, interessierende Protein exprimieren, werden aber bei aller Wahrscheinlichkeit nicht den gewünschten Phänotyp besitzen. Durch Anbringen eines negativ auswählbaren Markers an das Konstrukt, aber außerhalb der flankierenden Bereiche, ist man in der Lage gegen viele zufällige Rekombinationsereignisse, die den negativ auswählbaren Marker einbringen, auswählen. Homologe Rekombination sollte nicht den negativ auswählbaren Marker einführen, da er außerhalb der flankierenden Sequenzen liegt.
  • 5. Markergene
  • In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung werden spezifische Zellen mit spezifischen, genetischen Markern markiert, um Informationen über das Schicksal der markierten Zellen zu liefern. Aus diesem Grund stellt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Kandidaten-Screening- und Auswahlverfahren bereit, welche auf Ganzzellen-Assays basieren und welche, vorzugsweise ein Reportergen einsetzen, dass auf seine rekombinanten Wirte einen leicht zu detektierenden Phänotyp überträgt, der nur unter Bedingungen auftritt, bei denen ein allgemeiner DNA-Promotor, der strangaufwärts des Reportergens angeordnet ist, funktionsfähig ist. Im Allgemeinen kodieren Reportergene ein Polypeptid (Markerprotein), welches ansonsten nicht durch die Wirtszelle hergestellt wird und welches mittels Analyse der Zellkultur, zum Beispiel mittels fluorometrischer, Radioisotopen- oder spektrophotometrischer Analyse der Zellkultur, nachweisbar ist.
  • In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird ein genetischer Marker bereit gestellt, der mittels Standard-Genanalyse-Techniken, wie zum Beispiel DNA-Amplifikation mittels PCRTM oder Hybridisierung unter Verwendung von fluorometrischen, Radioisotopen oder spektrophotometrischer Sonden nachweisbar ist.
  • a. Screening
  • Beispielhafte Enzyme schließen Esterasen, Phosphatasen, Proteasen (Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder Urokinase) und andere Enzyme, die in der Lage sind, über ihre Aktivität nachgewiesen zu werden, ein und sind den Fachleuten wohlbekannt. Vorgesehen für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung ist grün fluororeszierendes Protein (GFP) als Marker für die transgene Expression (Chalfie et al., 1994). Der Einsatz von GFP verlangt kein exogen zugegebenes Substrat, sondern nur Belichtung mit nahem UV oder blauem Licht und besitzt somit signifikantes Potential für den Einsatz bei der Beobachtung der Genexpression in lebenden Zellen.
  • Andere spezielle Beispiele sind die Enzym-Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), welche mit einem radiomarkierten Substrat, Glühwürmchen- und bakterieller Luziferase und den bakteriellen Enzymen β-Galactosidase und β-Glucuronidase eingesetzt werden kann. Andere Markergene aus dieser Klasse sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • b. Auswahl
  • Ein weitere Klasse an Reportergenen, welche einer Wirtszelle nachweisbare Charakteristika verleiht, sind solche, die Polypeptide kodieren, allgemein Enzyme, die ihre Transformanten resistent gegen Toxine machen. Beispiele dieser Klasse an Reportergenen sind die neo-Gene, die Wirtszellen vor toxischen Mengen des Antibiotikums G418 schützen, das Gen, welches Streptomycin-Resistenz verleiht (US-Patent Nr. 4,430,434), das Gen, welches Hygromycin-B-Resistenz verleiht (Santerre et al., 1984; US-Patent Nr. 4,727,028, 4,960,704 und 4,559,302), ein Gen, welches Dihydrofolat kodiert und Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Alt et al., 1978), das Enzym HPRT zusammen mit vielen weiteren, die im Stand der Technik bekannt sind (Kaufman, 1990).
  • 6. Ausschneiden von Transgenen
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung ist eine Rettung des Gens von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II gewünscht. Die vorliegende Erfindung zieht die Verwendung von Orts-spezifischen Rekombinationssystemen in Betracht, um spezifische Gene aus einem Genom zu isolieren und um spezifische Konstrukte aus dem Genom auszuschneiden.
  • Mitglieder der Integrase-Familie sind Proteine, die an eine DNA-Erkennungssequenz binden und sind an der Erkennung, Synapse, Spaltung, Strangaustausch und Religation von DNA beteiligt. Zurzeit umfasst die Familie der Integrasen 28 Proteine aus Bakterien, Phage und Hefe, welche eine Invariante His-Arg-Tyr-Triade (Abremski und Hoess, 1992) gemeinsam haben. Vier der am häufigsten eingesetzten ortsspezifischen Rekombinationssysteme für eukaryotische Anwendungen umfassen: Cre-loxP aus Bakteriophage PI (Austin et al., 1981); FLP-FRT aus dem 2t-Plasmid von Saccharomyces cerevisiae (Andrews et al., 1985); R-RS von Zygosaccharomyces rouxii (Maeser und Kahmann, 1991) und gin-gix aus Bakteriophage Mu (Onouchi et al., 1995). Die Cre-loxP- und FLP-FRT-Systeme sind in einem größeren Ausmaß entwickelt worden als die letzten zwei Systeme. Das R-RS-System benötigt wie die Cre-loxP- und FLP-FRT-Systeme nur das Protein und seine Erkennungsstelle. Die gin-Rekombinase vermittelt selektiv DNA-Inversion zwischen zwei invers orientierten Rekombinationsstellen (gix) und benötigt die Unterstützung von drei zusätzlichen Faktoren: negatives Supercoiling, eine Enhancer-Sequenz und sein Bindungsprotein Fis.
  • Die vorliegende Offenbarung betrachtet die Verwendung von einem Cre/Lox-ortsspezifischen Rekombinationssystem (Sauer, 1993, erhältlich über Gibco/BRL, Inc, Gaithersburg, Md.), um spezifische Gene aus einem Genom zu isolieren und um spezifische transgene Konstrukte aus dem Genom auszuschneiden. Das Cre (verursacht Rekombination)-loxP (Locus des Cross-Over(x))-Rekombinationssystem, welches aus Bakteriophage P1 isoliert wurde, benötigt nur das Cre-Enzym und dessen loxP-Erkennungsstelle auf beiden Partnermolekülen (Sternberg und Hamilton, 1981). Die loxP-Stelle besteht aus zwei symmetrischen 13 bp Proteinbindungsbereichen, die durch einen 8 bp Spacerbereich getrennt sind, der durch die Cre-Rekombinase, einem 35 kDa Protein, erkannt wird. Nukleinsäuresequenzen für loxP (Hoess et al., 1982) und Cre (Sternberg et al., 1986) sind bekannt. Wenn die zwei loxP Orte cis zueinander sind, findet eine Entfernungsreaktion statt. Wenn die beiden jedoch trans zueinander sind, findet ein Integrationsereignis statt. Das Cre-Protein katalysiert ein ortsspezifisches Rekombinationsereignis. Dieses Ereignis ist bidirektional, dass heißt Cre katalysiert die Insertion von Sequenzen an einer LoxP-Stelle oder schneidet Sequenzen, die zwischen zwei LoxP-Stellen angeordnet sind, aus. Wenn ein Konstrukt für eine Insertion auch zwei flankierende LoxP-Stellen aufweist, wird die Einführung des Cre-Proteins oder ein Polynukleotid, das das Cre-Protein kodiert, in die Zelle die Entfernung der Konstrukt-DNA katalysieren. Diese Technologie wird in dem US-Patent Nr. 4,959,317 beschrieben, auf welches hiermit in seiner Gänze Bezug genommen wird.
  • Eine anfängliche in vivo Studie in Bakterien hat ergeben, dass das Cre loxP-flankierte DNA extrachromosomal in Zellen, die Rekombinase exprimieren, ausschneidet. (Abremski et al., 1988). Eine Hauptfrage in Bezug auf dieses System war, ob ortsspezifische Rekombination in Eukaryoten durch ein bakterielles Protein gefördert werden kann. Sauer (1987) hat jedoch gezeigt, dass das System DNA S. cerevisae mit dem gleichen Grad an Effizienz ausschneidet wie in Bakterien.
  • Weitere Untersuchungen mit dem Cre-loxP-System, insbesondere des ES-Zellensysteme in Mäusen hat die Nützlichkeit der Ausschneidereaktion für die Herstellung von einzigartigen transgene Tieren gezeigt. Homologe Rekombination, gefolgt von Cre-vermittelter Deletion einer loxP-flankierten neo-tk-Cassette wurde verwendet, um Mutationen in ES-Zellen einzuführen. Diese Strategie wurde für eine Gesamtzahl von 4 Runden in der derselben Linie wiederholt, um aus Allele der rep-3- und mMsh2-Loci, welches Gene sind, die in einer DNA Fehlpaarungsreparatur involviert sind, zu verändern (Abuin und Bradley, 1996). Auf ähnliche Weise wurde ein Transgen, welches aus 35S Promoter/Luziferase-Gen/loxP/35S Promoter/hpt-Gen/loxP (luc+hyg+) besteht, in Tabak eingeführt. Anschließende Behandlung mit Cre führte zur Deletion des hyg-Gens (luc+hyg+) mit einer Effizienz von 50% (Dale and Ow, 1991). Transgene Mäuse, die die lg leichte κ-Konstante-Kette besitzen und mit einem loxP-flankierten neo-Gen targetiert sind, wurden in Cre-produzierenden Mäusen gezüchtet, um den auswählbaren Marker aus dem frühen Embryo zu entfernen (Lakso et al., 1996). Dieser allgemeine Ansatz zur Entfernung von Markern stammt aus Bedenken, die von regulierenden Gruppen und Konsumenten, die sich mit der Einführung von neuen Genen in eine Population beschäftigen.
  • Ein analoges System, welches für den Einsatz in der vorliegenden Offenbarung vorgesehen ist, ist das FLP/FRT-System. Dieses System wurde eingesetzt, um das Histone-4-Gen in Maus-Es-Zellen mit einer FRT-flankierten neo-Cassette, gefolgt von einer Deletion des Markers mittels FLP-vermittelter Rekombination, zu targetieren. Das FLP-Protein konnte aus einem induzierbaren Promotor, der das FLP antreibt oder durch Verwendung des Proteins selber (Wigley et al., 1994) erhalten werden.
  • Die vorliegende Offenbarung sieht auch die Verwendung von Rekombinations-aktivierenden Genen (RAG) 1 und 2 zum Ausschneiden von spezifischen, trans genen Konstrukten aus dem Genom genauso wie die Isolierung spezifischer Gene aus dem Genom vor. RAG-1 (GenBank Zugangsnummern M64796 und M33828) erkennt spezifische Rekombinationssignalsequenzen (RRSen) und katalysiert V(D)J-Rekombination, die für die Anordnung von Immunoglobin- und T-Zellen-Rezeptorgene erforderlich ist (Schatz et al., 1989; Oettinger et al., 1990; Cumo und Oettinger, 1994). Für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung wird das interessierende, transformierende Konstrukt derart hergestellt, dass es flankierende RSSen enthält. Nach der Transformation kann das transformierende Konstrukt, welches sich im Inneren der RSSen befindet, aus dem Genom durch Übergangsexpression von RAG-1 und RAG-2 in der transformierten Zelle entfernt werden.
  • H. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • 1. Pharmazeutisch akzeptable Träger
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren für die Behandlung von Krebs bereitgestellt. Die vorliegende Offenbarung sieht die Verwendung von Verbindungen mit stimulierender Aktivität, um die Expression aus den Promotoren von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II zu erhöhen, um somit der Runterexpression von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in Prostatagewebezellen oder peripheren Blutzellen, die in metastasierenden Erkrankungen beobachtet werden, entgegen zu wirken, vor. Die Behandlungsverfahren umfassen die Behandlung eines Individuums mit einer effektiven Menge an einer Verbindung die Prostata-spezifische Transglutaminase-, Cytokeratin 15- und/oder Semenogelin II stimuliert. Eine effektive Menge ist im Allgemeinen als die Menge beschrieben, die ausreicht, um nachweisbar und wiederholt die Menge an Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II in einer Zelle zu erhöhen.
  • Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine effektive Menge an dem Protein, Peptid, epitoper Kernregion, Stimulator, Inhibitor und ähnliches von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder wässrigem Medium. Wässrige Zusammensetzungen von Gentherapievektoren, die irgendeine der vorgenannten Verbindungen exprimieren, sind auch vorgesehen. Der Begriff „pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare Objekte, die keine abstoßende, allergische oder andere unpassende Reaktion auslösen, sofern sie einem Tier oder einem Menschen wie vorgesehen verabreicht werden.
  • Die Verabreichung der Verbindung an einen Patienten folgt allgemeinen Protokollen die Verabreichung von Chemotherapeutika, die die Toxizität, falls vorhanden, der Verbindung berücksichtigen. Es ist vorteilhaft, dass die Behandlungszyklen so oft wie nötig wiederholt werden.
  • Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine effektive Menge an der Verbindung gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder wässrigem Medium. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inocula bezeichnet. Der hierin verwendete Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" schließt jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien oder Ähnliches ein. Der Einsatz solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Ausgenommen den Fall, dass ein konventionelles Medium oder Agens mit der aktiven Substanz inkompatibel ist, wird deren Verwendung in der therapeutischen Zusammensetzung berücksichtigt. Zusätzliche aktive Bestandteile können ebenso in der Zusammensetzung inkorporiert sein. Zur Verabreichung an Menschen sollten die Formulierungen Sterilitäts-, Pyrogenizitäts-, allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards wie von dem „FDA-Büro für Biologische Standards" verlangt, einhalten.
  • Das biologische Material sollte ausgiebig dialysiert werden, um unerwünschte, niedermolekulargewichtige Moleküle zu entfernen, oder für eine einfachere Formulierung in ein gewünschtes Vehikel, wo erforderlich, gefriergetrocknet werden. Die aktiven Verbindungen werden dann im Allgemeinen zur parenteralen Verabreichung, dass heißt zur Injektion via intravenöser, intramuskulärer, subkutaner, intralesionaler oder sogar intraperitonealer Routen, formuliert. Die Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung, die eine Prostata-spezifische Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II enthält, als eine aktive Verbindung oder aktiver Inhaltsstoff ist den Fachleuten im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt. Typischerweise können solche Zusammensetzungen als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt werden. Es können auch feste Formen, die zur Herstellung von Lösungen oder Suspensionen nach Zugabe einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, hergestellt werden. Die Formulierungen können auch emulgiert sein.
  • Die pharmazeutischen Formulierungen, die als Injektionen geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen, Formulierungen mit Sesamöl, Erdnussöl oder wässrigem Propylenglykol und sterile Pulver für die Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen aus dem Stehgreif. In all diesen Fällen muss die Form steril und flüssig sein. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss gegen kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, geschützt sein.
  • Lösungen mit den aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch akzeptables Salz können in Wasser, welches geeigneterweise mit einem Tensid wie Hydroxypropylcellulose gemischt ist, hergestellt werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen, in Mischungen davon oder in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Lager- und Anwendungsbedingungen enthalten diese Formulierungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
  • Ein Protein, Peptid, Agonist oder Antagonist von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II gemäß der vorliegenden Offenbarung kann in neutraler oder in Salzform in eine Zusammensetzung formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Säurezugabesalze (die mit den freien Aminogruppen des Proteins gebildet werden) und werden mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäuren, oder organische Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure oder Ähnliches gebildet. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- und Eisenhydroxide und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procaine und Ähnliches stammen. Im Fall des Einsatzes von Peptidtherapeutika kann die Technologie der US-Patente 4,608,251, 4,601,903, 4,599,231, 4,599,230, 4,596,792 und 4,578, 770 verwendet werden.
  • Der Träger kann auch ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, welches zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssige Polyethylenglykol sowie Ähnliches), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle. Die genaue Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Umhüllung, wie zum Beispiel Lecithin, durch Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch den Einsatz von Tensiden aufrecht erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Agenzien, wie zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal oder Ähnliches, erbracht werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Agenzien, wie zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid zuzufügen. Verlängerte Absorption von injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Agenzien, die die Absorption verlängern, wie zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen erbracht werden.
  • Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbringen der aktiven Verbindungen in die benötigte Menge an geeignetem Lösungsmittel mit, wie benötigt, verschiedenen anderen Inhaltsstoffen, die zuvor aufgezählt wurden, gefolgt von einer filtrierten Sterilisation hergestellt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen von verschiedenen, sterilisierten aktiven Inhaltsstoffen in ein steriles Vehikel, welches das Grunddispersionsmedium und die benötigten anderen Inhaltsstoffe aus den oben aufgezählten enthält, hergestellt. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen, sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, welche ein Pulver an aktiven Inhaltsstoffen plus jeglichen zusätzlichen, gewünschten Inhaltsstoff ergeben, aus einer steril-gefilterten Lösung davon. Die Herstellung von mehr oder höher konzentrierten Lösungen zur direkten Injektion wird auch berücksichtigt, wobei die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel vorschwebt, um zu einer extrem schnellen Penetration und einer Bereitstellung von hohen Konzentrationen an aktiven Agenzien an einen kleinen Tumorbereich zu gelangen.
  • Nach der Formulierung werden die Lösungen auf eine Weise verabreicht, die kompatibel mit der Dosierungsformulierung ist und in solchen Mengen, die therapeutisch effektiv sind. Die Formulierungen sind einfach in einer Vielzahl an Dosierungsformen zu verabreichen, wie zum Beispiel injizierbare Lösungen, wie oben beschrieben, aber es können auch Arzneimittel-freisetzende Kapseln oder Ähnliches eingesetzt werden.
  • Zur parenteralen Verabreichung, beispielsweise in einer wässrigen Lösung, sollte die Lösung geeignet gepuffert sein und das flüssige Verdünnungsmittel sollte mit ausreichend Salzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese bestimmten wässrigen Lösungen sind besonders zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und intraperitonealen Verabreichung geeignet. In diesem Zusammenhang geeignet einsetzbare sterile wässrige Medien sind den Fachleuten im Lichte der vorliegenden Offenbarung wohlbekannt. Zum Beispiel kann eine Dosis in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst und entweder zu 1000 ml Hypodermoklyse-Fluid gegeben oder in die vorgeschlagene Stelle der Infusion injiziert (siehe zum Beispiel „Remington's Pharmaceutical Science" 15te Auflage, Seiten 1035–1038 und 1570–1580).
  • Der Begriff „Einheitsdosis" bezieht sich auf physikalisch festgelegte Einheiten, geeignet für die Verwendung in einem Patienten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der therapeutischen Zusammensetzung, die derart berechnet ist, dass sie eine erwünschte Antwort erzeugt, wie oben beschrieben, in Verbindung mit ihrer Verabreichung, dass heißt einer geeigneten Route und Behandlungsablauf beinhaltet. Die zu verabreichende Menge sowohl gemäß der Zahl der Behandlungen und Einheitsdosen hängt von dem zu behandelnden Subjekt und dem gewünschten Schutz ab. Die Person, welche für die Verabreichung verantwortlich ist, wird in jedem Fall die geeignete Dosis für das individuelle Subjekt bestimmen.
  • Die aktiven Protein-abgeleiteten Peptide oder Agenzien von Prostata-spezifische Transglutaminase-, Cytokeratin 15- und/oder Semenogelin II können in einer therapeutischen Mischung formuliert werden, die ungefähr 0,0001 bis 1,0 Milligramm oder ungefähr 0,001 bis 0,1 Milligramm oder ungefähr 0,1 bis 1,0 oder sogar ungefähr 10 Milligramm pro Dosis oder so enthalten. Multiple Dosen können auch verabreicht werden.
  • Zusätzlich zu den Verbindungen, die zur parenteralen Verabreichung, wie zum Beispiel eine intravenöse oder intramuskuläre Injektion, formuliert sind, umfassen andere pharmazeutisch akzeptablen Formen zum Beispiel Tabletten oder andere Feststoffe zur oralen Verabreichung, liposomale Formulierungen, mit der Zeit freisetzende Kapseln und andere Formen, die zur Zeit eingesetzt werden.
  • Es können auch nasale Lösungen oder Sprays, Aerosole oder Inhalationsmittel in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Nasale Lösungen sind üblicherweise wässrige Lösung, die so hergestellt werden, dass sie über die nasalen Passagen als Tropfen oder Sprays verabreicht werden können. Nasale Lösungen werden so hergestellt, dass sie in vielen Belangen nasalen Sekretionen ähnlich sind, so dass die normale ciliäre Aktivität erhalten bleibt. Aus diesem Grund sind wässrige nasale Lösungen üblicherweise isotonisch und leicht gepuffert, um einen pH von 5,5 bis 6,5 beizuhalten. Zusätzlich können antimikrobielle Konservierungsmittel, die ähnlich sind zu denen, die in Zubereitungen für die Augen eingesetzt werden, und geeignete Arzneimittelstabilisatoren, falls notwendig, in die Formulierung eingebracht werden. Verschiedene kommerzielle nasale Zubereitungen sind bekannt und enthalten zum Beispiel Antibiotika und Antihistamine. Sie werden in der Asthmaprophylaxe eingesetzt.
  • Zusätzliche Formulierungen, die für andere Arten der Administration geeignet sind, umfassen Suppositorien und Pessarien. Ein rektales Pessarium oder Suppositorium kann auch verwendet werden. Suppositorien sind feste Dosierungsformen mit unterschiedlichem Gewicht und Form. Die medizinische Behandlung umfasst üblicherweise die Einführung in das Rektum oder die Harnröhre. Nach der Einführung erweichen, schmelzen oder lösen die Suppositorien sich in den Höhlenflüssigkeiten auf. Im Allgemeinen werden für Suppositorien traditionelle Bindemittel und Träger eingesetzt, die zum Beispiel Polyalkylenglykole oder Triglyceride umfassen können. Solche Suppositorien können aus Mischungen, die den aktiven Inhaltsstoff in einem Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1%–2%, enthalten, gebildet werden.
  • Orale Formulierungen umfassen Excipienten, die normalerweise eingesetzt werden, wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat oder Ähnliches. Die Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung oder Pulver. In bestimmten, definierten Ausführungsformen enthalten orale pharmazeutische Zusammensetzungen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen assimilierbaren, essbaren Träger oder sie können in harten oder weichen Gelatine-Kapseln eingebracht sein oder sie können in Tabletten gepresst werden oder sie können auch direkt in das Essen einer Diät eingebracht werden. Zur oralen therapeutischen Verabreichung können die aktiven Verbindungen mit Excipienten eingebracht werden und in der Form von Tabletten zum Einnehmen, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten oder Ähnliches verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten wenigstens 0,1% der aktiven Verbindung enthalten. Die Prozentzahlen der Zusammensetzungen und Zubereitungen können natürlich variiert werden und können geeignet zwischen 2 bis ungefähr 75 Gewichts-% der Einheit betragen oder bevorzugt zwischen 25–60%. Die Menge an aktiven Verbindungen in solch therapeutisch nützlichen Zusammensetzung ist derart, dass eine geeignete Dosis erhalten wird.
  • Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und ähnliches können auch das Folgende enthalten: ein Bindemittel, wie Gum Tragacanth, Gum Acacia, Maisstärke oder Gelatine; Excipienten wie zum Beispiel Dicalciumphosphat; ein Sprengmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und Ähnliches; ein Schmiermittel wie zum Beispiel Magnesiumstearat und ein Süßungsmittel wie zum Beispiel Sucrose Lactose oder Saccharin kann zugegeben werden oder ein Geschmacksmittel wie Pfefferminze, Wintergrünöl oder Kirschgeschmack. Wenn die Einheitsdosisform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den oben genannten Materialien einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Umhül lung oder um auf andere Weise die physikalische Form der Einheitsdosis zu verändern. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem umhüllt sein. Ein Sirup oder ein Elixier kann die aktiven Verbindungen, Sucrose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und Geschmacksmittel wie Kirsche oder Orangengeschmack enthalten.
  • 2. Kombinationstherapien
  • Therapien gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Kombinationstherapien, die die Behandlung mit Zusammensetzungen mit Pro-Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 und/oder Semenogelin II genauso wie mit Standardchemo- oder Radiotherapien einschließen. Chemotherapeutika umfassen, sind aber nicht beschränkt auf zum Beispiel Cisplatin (CDDP), Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Bisulfan, Nitrosurea, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicomycin, Mitomycin, Etoposid (VP16), Tamoxifen, Taxol, Transplatin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin und Methotrexat. Auch können Röntgen- und γ-Bestrahlung von kombinierten Therapien umfasst sein.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1:
  • Identifikation von Prostatamarkern unter Verwendung von Southern-Differenzierungshybridisierung
  • Prostata-angereicherte cDNAs wurden von Clontech erworben. Die cDNAs wurden unter Verwendung von Adapter-Primern, die an beiden Enden der cDNAs angebracht sind, amplifiziert. Die amplifizierten cDNAs wurden in den pGEM-T Plasmidvektor (Promega) mittels T-A Kloning und Transformation, um eine cDNA-Bibliothek zu erzeugen, einkloniert. Transformierte Zellen wurden plattiert und eine Gesamtmenge an 200 Kolonien wurde zufällig aus der Prostata-angereicherten cDNA-Bibliothek ausgesucht. Die cDNA-Insertionen wurden aus den Plasmidtemplaten unter Verwendung von T7- und SP6-Primern mittels PCR amplifiziert. P-Actin- und PSA-Insertionen wurden als Kontrollen auch hergestellt. Die Insertionen wurden auf gleichen 2% Agarosegelen laufen gelassen und auf Nylonmembrane übertragen. 32P-markierte cDNA-Sonden wurden separat aus normaler Prostata-RNA und Pools an RNA aus 11 anderen Geweben (Leber, Bauchspeicheldrüse, Bauchhoden, Thymus, Hirn, Milchdrüse, Sklettmuskel, Niere, Lunge, Dünndarm und Milz) hergestellt Die zwei Membrane (jeweils mit einer identischen Menge an cDNA von individuellen Klonen) wurden getrennt mit den zwei Sonden (normale Prostata oder Pool an anderen Geweben) hybridisiert. Klone, die nur an die Prostata-cDNA-Sonde hybridisierten wurden als potentielle Prostata-spezifische Gene identifiziert.
  • Beispiel 2:
  • Northern-Analyse von Prostatamarkern
  • Eine Northern-Analyse wurde durchgeführt, um zu überprüfen, dass die Gene spezifisch in Prostatagewebe exprimiert worden sind. Gesamtzellen-RNA wurde aus menschlichen Gewebeproben isoliert und Northern-Blots (gemäß Sambrook et al., 1989) hergestellt. Die cDNA-Klone, die als potentielle Prostata-spezifische Gene identifiziert worden sind, wurden mit 32P als Sonden markiert und gegen die Northern-Blots hybridisiert. UC-Klon #51 (Prostata-spezifische Transglutaminase) Message wird verglichen mit Milz, Thymus, Bauchhoden, Eierstöcken, Dünndarm, Kolon und peripherem Blut bevorzugt in Prostata-Gewebe exprimiert. UC-Klon #57 (Semenogelin II) Message wird verglichen mit dem Fehlen von nachweisbarer Expression in Geweben, die Milz, Thymus, Bauchhoden, Eierstöcken, Dünndarm, Kolon und peripherem Blut entnommen wurden, vorzugsweise in normalem Prostata-Gewebe exprimiert.
  • Beispiel 3:
  • DNA-Sequenzen von Prostatamarkern
  • Die Nukleotidsequenzen von Prostata-exprimierten Klonen wurden mittels Dideoxy-Terminationssequenzierung unter Verwendung von automatisierten Sequenzern von entweder ABI oder Pharmacia durchgeführt. Die DNA-Sequenz von UC- Klon #51 (SEQ ID NR: 1) ist in der Sequenz identisch zu der Sequenz von Prostata-spezifischer Transglutaminase (GenBank Zugangs#n L34840, 120492). Die DNA-Sequenz von Klon #56 (SEQ ID NR: 2) ist in der Sequenz identisch zu der Sequenz von Cytokeratin 15 (GenBank Zugangs# X07696). Ein drittes Prostata-spezifisches Gen, UC-Klon #57 (SEQ ID NR: 3) ist in der Sequenz identisch zu der Sequenz von Semenogelin II (GenBank Zugangs# M81652). Die identifizierten Sequenzen sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • TABELLE 2. DNA-Sequenzen der Prostatamarker UC-Klon #51 (SEQ ID NR: I) Prostata-spezifische Transglutaminase, GenBank Zugangs#n L34840, 120492
    Figure 01210001
  • UC-Klon #56 (SEQ ID Nr: 2) Cytokeratin 15, GenBank Zugangs# X07696
    Figure 01220001
  • UC-Klon #57 (SEQ ID Nr: 3) Semenogelin II, GenBank Zugangs# M81652
    Figure 01230001
  • Beispiel 4
  • Relative Quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion
  • Die Erfinder haben die Identifizierung von Genkandidaten, die partielle cDNA Fragmente waren, mittels Southern Differenzierungshybridisierung beschrieben. Dies erforderte die Verwendung eines relativ quantitativen Ansatzes, um unabhängig die differentielle Expression der mRNAs, von denen sich diese partiellen cDNA-Fragmente ableiten, zu bestätigen. Das Hauptziel des beschriebenen Screeningprotokols ist die Bestimmung der Veränderungen in der relativen Abundanz von mRNA.
  • Die Protokolle der reversen Transkription-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR), die in den folgenden Beispielen beschrieben sind, sind als Mittel entwickelt worden, um die relative Abundanz von mRNA-Spezies, die in verschiedenen Geweben, Organen und Zellen exprimiert werden, zu bestimmen. Das Protokoll, welches bei Prostata-Gewebe angewendet wurde, ist in der US-Anmeldung 08/692,787 beschrieben worden. Obwohl das vorliegende Beispiel zur Identifizie rung und Bestätigung von differentieller Expression bei verschiedenen physiologischen Zustände in Prostata Gewebe und peripheren Blutzellen gemacht wird, können die hier beschriebenen Verfahren bei jedem Typ an Gewebe eingesetzt werden, um ein sensibles Verfahren zur Identifizierung von differentieller Expression bereitzustellen.
  • In der Praxis dieses Verfahrens wird Gesamtzellen-RNA zunächst unter Verwendung reverser Transkriptase, die mit zufälligen Hexameren präpariert ist, in cDNA überführt. Dieses Protokoll führt zu einer cDNA-Population, zu der jede RNA gemäß ihren relativem Anteil in der ursprünglichen Gesamtzellen-RNA beigetragen hat.
  • Falls zwei RNA-Spezies sich um das Zehnfache in ihren ursprünglichen relativen Abundanzen in der Gesamtzellen-RNA unterscheiden, dann wird die cDNA, die sich von diesen beiden RNAs ableitet auch um das Zehnfache in ihren relativen Abundanzen in der erhaltenen Population an cDNA unterscheiden. Dies ist eine Konservierung der relativen Proportionalität bei der Überführung von RNA in cDNA.
  • Da beide, Reverse Transkription und PCR, auf solch eine Weise unter Erhalt der Proportionalität durchgeführt werden können, ist es möglich, die relative Abundanz einer mRNA Spezie in zwei oder mehr GesamtzellenRNA-Populationen durch anfängliches Überführen der RNA in cDNA und anschließender Amplifikation mittels PCR eines Fragments der cDNA, die sich von der spezifischen mRNA ableitet, zu vergleichen. Das Verhältnis der amplifizierten Massen an den gezielten cDNAs ist sehr nahe oder identisch zu den Verhältnissen der mRNAs in den ursprünglichen Gesamtzellen-RNA-Populationen.
  • Zwei bevorzugte Verfahren zur RNA-Isolierung sind das Guanidiniumthiocyanat-Verfahren, welches im Stand der Technik bekannt ist, und Kits zur RNA-Isolierung, welche von Qiagen, Inc. (Chatworth, CA) hergestellt werden, wobei die Kits aus Gründen der Einfachheit bevorzugt sind.
  • Die RNAs werden von DNaseI verdaut, um alle genomische DNA zu entfernen, die zusammen mit der Gesamtzellen-RNA isoliert wurde. Vor der Verdauung mit DNaseI befindet sich die RNA in einer partikulären Suspension mit 70% Ethanol. Ungefähr 50 μg RNA (bestimmt mit OD260/280) wird aus der Suspension entfernt und ausgefällt. Diese RNA wird in DEPC-behandeltem, sterilem Wasser resuspendiert. Dazu werden 1 OX DNaseI Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.4, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl), 10 Einheiten RNase-Inhibitor (GIBCO-BRL Cat#15518-012) und 20 Einheiten DNaseI (GIBCO-BRL # 18068-015) gegeben. Das Volumen wird mit zusätzlichem DEPC-behandeltem Wasser auf 50 μl eingestellt. Die Reaktion wurde bei 37°C für 30 min inkubiert. Nach der Verdauung von DNaseI, werden die RNAs mit den organischen Lösungsmitteln Phenol und Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Fällung mit Ethanol. Dies stellt die zweite Ethanol-Fällung von isolierter RNA dar. Empirische Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass die wiederholte Ausfällung die Leistung der RNA in der folgenden RT-Reaktion verbessert.
  • Anschließend an die Verdauung mit DNaseI wird ein Aliquot der RNA-Suspension in Ethanol entfernt und in Drittel aufgeteilt. Ein unterschiedliches Verfahren wird mit jedem der aliquoten Drittel durchgeführt.
  • Die drei Verfahren sind: (1). Ein OD260/280 wird unter Verwendung eines Standardprotokolls erhalten und wird eingesetzt, um die vorhandene Menge an RNA und seine voraussichtliche Qualität zu bestimmen. (2). Ein Aliquot wird auf einem Agarose-Gel laufen gelassen und die RNA wird mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Beobachtung, dass die 28S- und die 18S-RNAs als diskrete Banden sichtbar sind und dass nur eine geringe Anfärbung oberhalb des Punktes, zu dem die 28S rRNA gewandert ist, auftritt, deutet an, dass die RNA relativ intakt ist. Während es nicht kritisch für die Assayleistung ist, dass die untersuchten RNAs komplett frei von partieller Zersetzung sind, ist es wichtig zu bestimmen, dass die RNA nicht so zerstört ist, dass sie einen signifikanten Effekt auf die Erscheinung der 28S rRNA ausübt. (3). Die Gesamtzellen-RNAs werden unter Verwendung eines PCR-basierten Tests, der bestätigt, dass die Behandlung mit DNaseI tatsächlich die kontaminierende genomische DNA komplett verdaut hat, laufen gelassen. Es ist sehr wichtig, vollständige Verdauung der genomischen DANN zu überprüfen, da genomische DNA als Templat in PCR-Reaktionen fungieren kann, was zu falschen positiven Signalen in dem im Folgenden beschriebenen relativen quantitativen RTPCR-Assay führen kann. Das Assay auf kontaminierende genomische DNA verwendet Gen-spezifische Oligonukleotide, die ein 145 Nukleotide langes Intron (Intron #3) in dem Gen, welches Prostata-spezifisches Antigen (PSA) kodiert, flankieren. Dies ist ein Einzelkopie-Gen ohne Pseudogene. Es ist ein Mitglied der Kallikrein-Genfamilie von Serin-Proteasen. Allerdings sind die Oligonukleotide, die in diesem Assay eingesetzt werden, spezifisch für PSA. Die Sequenzen dieser Oligonukleotide sind:
    5'CGCCTCAGGCTGGGGCAGCATT 3', SEQ ID NO: 4
    und
    5' ACAGTGGAAGAGTCTCATTCGAGAT 3', SEQ ID NO: 5.
  • In dem Assay auf kontaminierende genomische DNA werden 500 ng bis 1.0 μg von jeder der DNaseI-behandelten RNAs als Templat in einer Standard-PCR (35–40 Zyklen unter den im Folgenden beschriebenen Bedingungen), bei der die oben beschriebenen Oligonukleotide als Primer eingesetzt werden, verwendet. Menschliche genomische DNA wird als geeignete positive Kontrolle verwendet. Diese DNA kann von einem kommerziellen Anbieter bezogen werden. Ein positives Signal in diesem Assay ist die Amplifikation eines 242 Nukleotid genomische DNA-spezifischen PCR-Produkts aus der untersuchten RNA-Probe, die auf einem Ethidiumbromid angefärbten Elektrophoresegel visualisiert ist. Es sollte dort kein Anzeichen für genomische DNA sein, wie von diesem Assay in den RNAs, die in dem unten beschriebenen RT-PCR-Assay eingesetzt sind, angezeigt wird. Anzeichen für kontaminierende genomische DNA führen zu einer erneuten Verdauung der RNA durch DNaseI und zu einer erneuten Bewertung der DNase-behandelten RNA mittels Bestimmung ihres OD260/280-Verhältnisses, Untersuchung auf elektrophoretischem Gel und erneutes Testen auf Kontamination mit genomischer DNA unter Verwendung des beschriebenen PCR Assays.
  • Die in der PCR eingesetzten Standardbedingungen (wie im letzten Absatz erwähnt) sind: IX GIBCO-BRL PCR-Reaktionspuffer [20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl], 1,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem der vier dNTPs, 200 nM jeden Oligonukelotidprimers, Konzentration des Templats wie geeignet und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase pro 100 μl Reaktionsvolumen. Unter Verwendung dieser Bedingungen wird die PCR mit 35–40 Zyklen an 94°C für 45 s, 55–60°C für 45 s und 72°C für 1 Minute.
  • Reverse Transkriptionsreaktionen werden unter Verwendung von des „SuperscriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthese"-Kits, welches von GIBCO-BRL LifeTechnologies (Gaithersburg, MD) hergestellt wird, durchgeführt. SuperscriptTM ist eine Klonform von M-MLV reverser Transkriptase, deren endogene RNase H Aktivität entfernt wurde, um ihre Arbeitsleistung zu erhöhen. In dem vorliegenden Beispiel werden die veröffentlichten Protokolle der Hersteller verwendet für die cDNA-Synthese, die mit zufälligen Hexameren „geprimt" ist. Die cDNA-Synthese kann auch mit einer Mischung an zufälligen Hexameren (oder anderen kleinen Oligonukleotiden mit zufälliger Sequenz) und oligo dT „geprimt" werden. Die Zugabe von Oligo-dT erhöht die Effizienz der Überführung von RNA in cDNA in der Nähe des polyA-Schwanzes. Als Templat werden entweder 5 oder 10 Mikrogramm RNA (abhängig von der Verfügbarkeit) verwendet. Nachdem die RT-Reaktion gemäß des Protokolls, dass durch GIB CO-BRL bereitgestellt wurde, abgeschlossen ist, wird RT-Reaktion mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 μl verdünnt.
  • In den vorliegenden Beispiele werden cDNAs, die aus Gesamtzellen-RNAs hergestellt wurden, auf gleiche Konzentrationen an amplifizierbarem β-Actin-cDNA normalisiert. Ein μl von jeder verdünnten RT-Reaktion wird einer PCR unterworfen, wobei Oligonukleotide verwendet werden, die spezifisch für β-Actin als Primere sind. Diese Primere wurden derart entwickelt, dass sie Introns kreuzen und die Differenzierung von cDNA und genomischer DNA erlauben. Diese β-Actin spezifischen Oligonukleotide besitzen die Sequenzen:
    5' CGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC 3', SEQ ID NO: 6
    und
    5' GAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAG 3', SEQ ID NO: 7
  • PCR wird unter Standardbedingungen wie zuvor beschrieben für entweder 19 oder 20 Zyklen durchgeführt. Das erhaltene PCR-Produkt ist 415 Nukleotide lang. Das Produkt wird mittels PCR unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese gefolgt von Anfärbung mit Ethidiumbromid untersucht. Das amplifizierte cDNA-Fragment wird dann mittels Bestrahlung mit Ultraviolettlicht unter Verwendung eines Transilluminators sichtbar gemacht. Ein Weißlicht-Bild des belichteten Gels wird mit einem IS-1000 Digital Imaging System, welches von Alpha Innotech Corporation hergestellt wird, festgehalten. Das festgehaltene Bild wird unter Verwendung der 2.0 oder 2.1 Version des Softwarepakets, welches durch den Hersteller geliefert wird, analysiert, um die relativen Menge an amplifizierter β-Aktin-cDNA in jeder RT-Reaktion zu bestimmen.
  • Um die verschiedenen cDNAs zu normalisieren, wird Wasser zu den konzentriertesten cDNAs (wie durch das im letzten Absatz beschriebene Assay bestimmt) gegeben. PCR unter Verwendung von 1 μl der erneut verdünnten und eingestellten cDNA wird unter Verwendung von β-Aktin-Oligonukleotiden als Primere wiederholt. Die Zahl der Zyklen an PCR muss auf 21 oder 22 Zyklen erhöht werden, um die verringerten Konzentrationen der erneut verdünnten cDNAs zu kompensieren. Mit diesem empirischen Verfahren können die cDNAs mittels Verdünnung derart eingestellt werden, dass sie grob die gleiche Menge an amplifizierbarer cDNA enthalten. Manchmal muss dieses Verfahren wiederholt werden, um akzeptable Endnormalisierung zu ergeben. Durch Teilung der optischen Dichte aller beobachteten Banden durch die einer bestimmten Bande, kann eine Normalisierungsstatistik erstellt werden, die akkuratere Vergleiche der relativen Abundanzen der RNAs, die in dem normalisierten Panel an cDNA untersucht wird erlaubt.
  • Sobald Normalisierungsstatistiken abgeleitet sind, kann die PCR unter Verwendung verschiedener Gen-spezifischer Oligonukleotide als Primere durchgeführt werden, um die relativen Abundanzen von anderen mRNAs, die als cDNAs in dem normalisierten Panel an verdünnten RT-Reaktionsprodukten vertreten sind, zu bestimmen. Die relativen Intensitäten der Banden werden eingestellt und auf β-Aktin-Expression mittels Multiplizieren der Intensitätsmengen mit der abgeleiteten Normalitätsstatistik eingestellt und normalisiert.
  • Um die quantitativen Unterschiede in der mRNA-Expression zu bestimmen, ist es notwendig dass die Daten in den linearen Bereichen der entsprechenden PCR-Amplifikationskurven gesammelt werden. Dies ist technisch schwierig, da die zurzeit eingesetzten Mittel der DNA-Quantifizierung nur sensitiv genug sind, die PCR-Produkte zu quantifizieren, wenn sie sich Konzentrationen nähern, bei denen die Produktstränge anfangen mit den Primern um das Annealing zu konkurrieren. Dies bedeutet, dass die PCR-Produkte nur ganz am Ende des linearen Bereichs der Amplifikationskurve nachgewiesen werden können. Voraussagen bei welchem Produktzyklus das PCR-Produkt quantifiziert werden soll, sind technisch schwierig.
  • Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zweistufiger Ansatz verwendet, um die mRNA-Abundanzniveaus mittels RT-PCR zu quantifizieren. In der ersten Stufe werden Pools an cDNAs, die durch Kombination von gleichen Mengen an normalisierter cDNA hergestellt wurden, untersucht, um zu bestimmen, wie mRNA-Abundanzen in dem durchschnittlichen Individuum mit einem bestimmten physiologischen Zustand variieren. Dies reduziert die Zahl der verglichenen Proben auf eine sehr kleine Zahl wie zwei bis vier. In den hier beschriebenen Studien werden zwei Pools untersucht. Diese sind Pools von normalen Individuen und solchen Individuen mit metastasierender Prostata-Erkrankung. Jeder Pool kann eine große Zahl an Individuen enthalten. Während dieser Ansatz Unterschiede zwischen den Individuen diskriminiert, kann er leicht breite Muster der differentiellen Expression wahrnehmen. Der große Vorteil bei der Untersuchung von zusammengefassten cDNAs ist der, dass dies die simultane Ansetzung von vielen gleichen PCR-Reaktionen erlaubt.
  • Die individuellen Duplikate können geerntet und bei unterschiedlichen Zyklusnummer der PCR untersucht werden. In einem bevorzugten Verfahren werden vier gleiche PCR-Reaktionen angesetzt. Ein Duplikat wird bei 31, 34, 37 und 40 PCR-Zyklen gesammelt. Gelegentlich werden PCR-Reaktionen auch bei 28 Zyklen gesammelt.
  • Die Untersuchung der PCRs bei unterschiedlichen Zyklusnummern führt zu folgenden Vorteilen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass eines RT-PCRs im optimalen Bereich der Amplifikationskurven vorliegt, um die relativen mRNA-Abundanzen verlässlich zu vergleichen. Zusätzlich wird die optimale Zyklusnummer bekannt sein, so dass Studien mit größeren Probengrößen mit größerer Wahrscheinlichkeit gelingen. Dies ist die zweite Stufe eines zweistufigen Ansatzes, der genommen wurde, um mRNA-Abundanzniveaus mittels RT-PCR relativ zu bestimmen. Die Durchführung der RT-PCR mit den zusammengefassten Proben ermöglicht eine viel effizientere Anwendung der RT-PCR als Proben, die von Individuen stammen. Ein weiterer Vorteil ist, dass Röhrchen für Röhrchen eine Variabilität der PCR abgezogen und kontrolliert werden kann, weil die meisten Studien multiple Datenpunkte aufgrund der Duplikation ergeben.
  • Wie in dem zuvor beschriebenen Protokoll, welches Individuen einschließt, ist der erste Schritt in diesem Protokoll die Normalisierung der zusammengefassten Proben, um gleiche Menge an amplifizierbarer cDNA zu enthalten. Dies geschieht unter Verwendung von Oligonukleotiden, die die Amplifikation von β-Aktin leiten. In diesem Beispiel wurde eine PCR-Amplfikation eines cDNA-Fragments, welches von β-Aktin-mRNA aus Pools von normalen Individuen und Individuen mit metastasierendem Prostata-Krebs stammt, durchgeführt. Diese Studie wurde als vier identische PCR-Reaktionen angesetzt. Die Produkte dieser PCRs wurden gesammelt und einer Elektrophorese nach 22, 25, 28 und 31 PCR-Zyklen unterzogen. Quantifizierung dieser Banden mittels des IS 1000 Systems zeigten, dass die PCRs noch in den linearen Bereichen ihrer Amplifikationskurven bei 22, 25 und 28 Zyklen waren, dass sie diese Linearität bei 31 Zyklen verloren hatten. Dies ist bekannt, da die Verhältnisse der Bandintensitäten konstant und intern konsistent für die Daten, die nach 22 und 28 Zyklen erhalten wurden, bleiben, aber diese Verhältnisse werden bei 31 Zyklen gestört. Diese Quantifizierung erlaubt auch die Derivatisierung von Normalisierungsstatistiken der drei Pools relativ zueinander auf exakt dieselbe Weise wie es zuvor für die Individuen gemacht wurde.
  • Diese Studie wurde dann unter Verwendung von Gen-spezifischen Primeren für ein anderes Gen als β-Aktin wiederholt. Die Intensitäten der relevanten Banden wurden unter Verwendung von IS 1000 quantifiziert und auf das Signal von β-Aktin normalisiert.
  • Die zentrale, zu beantwortende Frage bei der Analyse der Daten ist, ob die PCRs in den linearen Bereichen ihrer Amplifikationskurven untersucht worden sind. Ein Test für dies kann durch die Bestimmung, ob die Proportionalität der PCR-Produkte mit ansteigender Zahl an PCR-Zyklen konserviert wurde, entworfen werden. Falls das Verhältnis zwischen den beiden Pools eines gegebenen PCR-Produkts bei steigender Zykluszahl konstant bleibt, dann ist das ein starkes Anzeichen, dass die PCRs in den linearen Bereichen ihrer Amplifikationskurven waren als diese Beobachtungen gemacht wurden. (Dies ist eine bessere Konservierung als häufig beobachtet. In einigen Studien wurden Daten erwartet, wenn die Verhältnisse ähnlich, aber nicht identisch waren). Diese Konservierung der Proportionalität wurde bei 40 Zyklen verloren. Dies deutet darauf hin, dass diese PCRs sich den Plateauphasen ihrer Amplifikationskurven nähern. Die abschließende Hauptbetrachtung, um relative mRNA-Abundanzen mit RT-PCR zu quantifizieren, ist Röhrchen-zu-Röhrchen-Variabilität in PCR. Dies kann aus verschiedenen Faktoren, einschließlich ungleichmäßiges Heizen und Kühlen im Thermocycler, Fehler in den PCR-Röhrchen und Bedienerfehler resultieren. Um diese Quelle der Variation zu kontrollieren wurde das Cole-Parmer digitale Thermoelement Model # 8402-00 eingesetzt, um die Thermocycler, die in diesen Studien eingesetzt wurden, zu kontrollieren. Nur geringe Variationen in der Temperatur wurden beobachtet.
  • Das RT-PCR Protokoll, welches zusammengefasste cDNAs untersucht, wird intern auf Röhrchen-zu-Röhrchen-Variabilität, welche aus jeglicher Quelle stammen mag, untersucht. Durch Untersuchung der Abundanz der PCR-Produkte bei einigen unterschiedlichen Zyklusnummern, kann bestimmt werden, dass die Masse an dem erwarteten PCR-Produkt geeignet ansteigt mit steigender PCR-Zyklusnummer. Nicht nur das zeigt, dass die PCRs in der linearen Phase der PCR, wo die Daten am verlässlichsten sind, untersucht werden, es zeigt, dass jede Reaktion mit dem gleichen Templat konsistent mit der Daten der umgebenden Zykluszahlen ist. Falls da eine unerklärlich Quelle an Variation wäre, würde die Erwartung, dass die PCR-Produktmasse geeignet mit der ansteigenden Zykluszahl ansteigt nicht getroffen werden. Dies würde künstliche Variation in den Ergebnissen zeigen. Interne Duplikation und Konsistenz der Daten, die sich auch verschiedenen Zyklusnummern ableiten, kontrolliert vom System stammende Variation in den Röhrchen-zu-Röhrchen-Ergebnissen.
  • Wie in den vorangegangenen Absätzen beschrieben, überwindet das RT-PCR Protokoll, das zusammengefasstes cDNA-Templat verwendet, die letzten beiden Hürden, um relativ quantitative RT-PCR zu ermöglichen. Diese Hürden sind das Erfordernis die PCR-Produkte zu untersuchen, während ihre Reaktionen in den linearen Bereichen ihrer Amplifikationskurven sind und das Erfordernis Röhrchen-zu-Röhrchen-Variation in PCR zu kontrollieren. Das beschriebene Protokoll untersucht PCR-Produkt bei drei bis vier verschiedenen Zyklusnummern. Dies gewährleistet, dass die PCRs in ihren linearen Bereichen quantifiziert werden und wie im letzten Absatz beschrieben, Kontrolle für Röhrchen-zu-Röhrchen-Variation, vorliegt.
  • Zusätzlich ist die Zyklusnummer an PCR, die notwendig ist, um β-Aktin-cDNA in den verdünnten RT-Reaktionen nachzuweisen, Üblicherweise zwischen 19 und 22 Zyklen, ist sie ausreichend gering, um jeglichen Beitrag, den genomische DNA zu der Abundanz des amplifizierbaren β-Aktin-Templat leisten könnte, abzuziehen.
  • Für die Gene, die in dieser Studie isoliert wurden, wurde Gesamtzellen-RNA aus metastasierenden Prostatakrebs- oder Leukozytenfilm-Zellen wie oben beschrieben isoliert. cDNA wurde aus eins bis fünf μg von jeder isolierten RNA gemacht. Alle cDNAs wurden auf ähnliche Mengen an β-Aktin-cDNA mittels RT-PCR normalisiert. Die RT-PCR-Produkte wurden durch Agarose einer Elektrophorese unterzogen.
  • Für relativ quantitative RT-PCR mit einem externen Standard wurde eine Quantifizierung von Bandenintensitäten auf Ethidiumbromid angefärbten Gelen unter Verwendung des IS-1000 Image Analysis Systems, welches von Alpha Innotech Corp hergestellt wird, durchgeführt. Eine Normalisierungsstatistik wurde für jede cDNA-Probe erstellt indem der Durchschnitt aller β-Aktin-Signale durch das β-Aktin-Signal jeder einzelnen cDNA-Probe geteilt wird. Die Daten für jede Probe wurden dann normalisiert, indem die beobachtete Dichte mit der individuellen Normalisierungsstatistik multipliziert wurde. Normalisierte Werte sagen Unterschiede in den Steady-State-Abundanzen der entsprechenden mRNAs in ursprünglichen Gesamtzellen-RNA-Proben voraus.
  • Dieses Protokoll führt zu der Entdeckung, dass die Expression von zwei cDNAs, UC-Klon #51 (SEQ ID NR: I), UC-Klon #56 (SEQ ID NR: 2) bei metastasierendem Prostatakrebs runterreguliert ist und die Expression von einer cDNA, UC-Klon #57 (SEQ ID NR: 3), im peripheren Blut von metastasierenden Prostatakrebs-Patienten runterreguliert ist.
  • Für UC-Klon #51 (SEQ ID NR: 1) wurde mittels relativ quantitativer RT-PCR bei 32 Zyklen an Amplifikation bestätigt, dass es in metastasierendem Prostatakrebs-Gewebe verglichen mit normalem Prostata- und Organ-begrenzten Prostatakrebs, einschließlich BPH, runterreguliert ist. Die Daten wurden gegen β-Aktin-mRNA normalisiert. Dieses Gen war bis zu dem Punkt seiner Expression runterreguliert, wo es in metastasierenden Prostatakrebs-Patienten vollständig inhibiert war verglichen mit normalen und BPH-Individuen. Solch ein klarer Kontrast in der Regulation macht dieses Gen zu einem exzellenten Marker für den Nachweis von malignen Prostatatumoren in Biopsieproben, die eine Mischung aus normalen, benignen und malignen Prostata-Zellen enthalten.
  • Für UC-Klon #56 (SEQ ID Nr: 2) wurde mittels relativ quantitativer RT-PCR bei 32 Zyklen an Amplifikation bestätigt, dass es in metastasierendem Prostatakrebs-Gewebe verglichen mit normalem Prostata- und Organ-begrenzten Prostatakrebs, einschließlich BPH, runterreguliert ist. Die Daten wurden gegen β-Aktin-mRNA normalisiert. Dieses Gen war in metastasierenden Prostatakrebs- Patienten verglichen mit normalen und BPH-Individuen runterreguliert und ist deshalb ein geeigneter Marker für metastasierenden Prostatakrebs.
  • UC-Klon #57 (SEQ ID NR: 3) war in Prostatakrebs-Gewebe verglichen mit normaler Prostata nicht differentiell reguliert. Jedoch zeigte relative quantitative RT-PCR des UC-Klons #57 (Semenogelin II), bestimmt bei 40 Zyklen der Amplifikation, dass die Expression des Gens im Blut der Individuen mit metastasierendem Prostatakrebs runterreguliert war verglichen mit normalen Individuen. Fachleute werden die Nützlichkeit eines metastasierenden Prostatamarker, der einfach aus peripherem Blut im Gegensatz zu einer Gewinnung aus einer Prostatagewebe-Biopsie erhalten werden kann, erkennen.
  • Von den Genen, die mit diesen Primern quantifiziert wurden, sind Prostata-spezifische Transglutaminase (GenBank Zugangs#n L34840, I20492) und Cytokeratin 15 (GenBank Zugangs# X07696) häufiger in normalen und BPH-Drüsen und werden als Tumorunterdrücker betrachtet. Semenogelin II (GenBank Zugangs# M81652 und M81651) ist häufiger im peripheren Blut von Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs und wird als Progressionsmarker betrachtet.
  • Die Oligonukleotide, die in der relativ quantitativen RT-PCR eingesetzt werden, sind in Tabelle 3 aufgeführt. Diese Sequenzen werden hierin als SEQ ID Nr: 8 bezeichnet, welche GenBank Zugangs#n L34840, I20492 entspricht, Prostata-spezifische Transglutaminase Nt 548–571, SEQ ID Nr: 9, welche GenBank Zugangs#n L 34840, I 20492 entspricht, Prostata-spezifische Transglutaminase Nt 742–765 (Antisense-Strang), SEQ ID Nr: 10, welche GenBank Zugangs# X07696 entspricht, Cytokeratin 15 Nt 1337–1359; SEQ ID Nr: 11, welche GenBank Zugangs# X07696 entspricht, Cytokeratin 15 Nt 1568–1608 (Antisense-Strang); SEQ ID Nr: 12, welche GenBank Zugangs# M81652 entspricht, Semenogelin II Nt 1089–1116; SEQ ID Nr: 13, welche GenBank Zugangs# M81652 entspricht, Semenogelin II Nt 1697–1724 (Antisense-Strang).
  • TABELLE 3. Oligonukleotide, die in den relativ quantitativen RT-PCR-Bereichen dieser Studien verwendet wurden.
  • Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die Expression von Genen zu untersuchen:
  • Prostata-spezifische Transglutaminase (SEQ ID Nr: 1), GenBank Zugangs# L34840, I20492.
    • 5' GGGGGCTGCCAGAAGTATCAAATG 3', SEQ ID NO: 8
    • 5' TGCCACCTTCGTAGTCCCCAGTCC 3', SEQ ID NO: 9
  • Cytokeratin 15 (SEQ ID Nr: 2), GenBank Zugangs# X07696
    • 5' TCTTCAGGAGGTGGTGGTAGCAG 3', SEQ ID NO: 10
    • 5' GAGAGGCAGAGGGGGAATAGAGC 3', SEQ ID NO: 11
  • Semenogelin II (SEQ ID Nr: 3), GenBank Zugangs# M81652 und M81651
    • 5' ACATCTCAACTGTGGAGAAAAGGGCATC 3', SEQ ID NO: 12
    • 5' TGATCATCTTGGGCAACCTCATGCTCAG 3', SEQ ID NO: 13
  • Kontrollen, die eingesetzt wurden, um die relativ quantitative RT-PCR zu normalisieren.
  • Prostata-spezifisches Antigen (PSA)
    • 5' CGCCTCAGGCTGGGGCAGCATT 3', SEQ ID NO: 4
    • 5' ACAGTGGAAGAGTCTCATTCGAGAT 3', SEQ ID NO: 5.
  • β-Aktin
    • 5' CGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC 3', SEQ ID NO: 6
    • 5' GAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAG 3', SEQ ID NO: 7
  • Eine Zusammenfassung der durchgeführten Experimente, um die zuvor erwähnten Gene als Prostataerkrankungsmarker zu bestätigen, ist in Tabelle 4 gezeigt.
  • TABELLE 4 Gene, deren mRNAs eine Abundanz, die bei Prostataerkrankungen verglichen mit normalen Individuen variiert.
    Figure 01360001
  • Es ist offensichtlich, dass die Gene und Genprodukte (RNAs und Proteine) für die oben beschriebenen Marker für Prostataerkrankungen vom Umfang der hier beschriebenen Offenbarung umfasst sind. Es ist auch offensichtlich, dass die Diagnose und Prognose von Prostataerkrankungen mittels Nachweis der Nukleinsäureprodukte dieser Gene auch vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Serologische und andere Assays, um diese mRNA-Spezies oder ihre Translationsprodukte nachzuweisen sind auch gekennzeichnet. Es ist offensichtlich, dass diese Assays nützlich sind beim Diagnostizieren von metastasierenden Krebsen, die aus der Prostata oder anderen Geweben stammen.
  • Fachleute werden bemerken, dass eine natürlich auftretende genetische Variation zwischen den Individuen existiert. Als ein Ergebnis können einige Individuen Genprodukte von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II synthetisieren, die von den Sequenzen, die in den oben genannten Genbank-Nummern verankert sind, abweichen. Wir schließen in unsere Definition von „synthetisieren Gene von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II" solche Produkte ein, die durch Gene von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II kodiert werden, die aber in der Sequenz von den oben beschriebenen abweichen, mit ein. Fachleute werden erkennen, dass maßvolle Variationen in der DNA-Sequenz die Identität eines Genprodukts als von den synthetisierten Genen von Prostata-spezifischer Transglutaminase, Cytokeratin 15 oder Semenogelin II stammend nicht signifikant überdecken.
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Claims (23)

  1. In vitro Verfahren zum Diagnostizieren eines metastasierenden Prostata-Erkrankungszustands in einem Subjekt, umfassend die Schritte von: (a) Vergleichen der Menge der Expression in einer oder mehreren Testproben, die aus Gewebe des Subjekts erhalten wurden, eines metastasierenden Prostata-Erkrankungsmarkers umfassend Prostata-spezifische Transglutaminase, mit der Menge der Expression desselben Markers in einer Kontrollprobe, erhalten aus Prostatagewebe von einem oder mehreren Individuen von denen bekannt ist, dass sie keine metastasierende Prostataerkrankung aufweisen; und (b) Nachweisen eines Unterschieds der Expression des Markers in der Testprobe, verglichen mit der Kontrollprobe; wobei ein Unterschied in der Menge der Expression an Prostata-spezifischer Transglutaminase in einer Testprobe diagnostisch für metastasierende Prostataerkrankung ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Markergen ein Prostata-spezifisches Transglutaminase-Gen ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Prostata-spezifische Transglutaminase-Gen für die als SEQ ID NO: 1 bezeichnete Sequenz oder ihr Komplement kodiert.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, weiter definiert als den Schritt von Erhalten oder Nachweisen von Ribonukleinsäuren aus den Proben umfassend.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Nachweisen weiter definiert ist als in Kontakt bringen der Ribonukleinsäuren mit einer Sonde, die unter Bedingungen hoher Stringenz mit an RNA Produkt der Markergene hybridisiert, um ein hybridisiertes Produkt zu erhalten.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Nachweisen durch Northern-Hybridisierung oder in situ Hybridisierung erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, weiter umfassend Bestimmen der Menge an hybridisiertem Produkt.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Sequenz der Sonde so ausgewählt ist, um spezifisch an eine Prostata-spezifische Transglutaminase oder Produkt davon zu binden.
  9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Sequenz der Sonde so ausgewählt ist, um spezifisch an eine Prostata-spezifische Transglutaminase-mRNA oder Produkt davon zu binden.
  10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Oligonukleotid-Sonde so ausgewählt ist, um an eine isolierte Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1 oder ihr Komplement zu binden.
  11. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Ribonukleinsäuren amplifiziert werden, um Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte zu bilden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Amplifikation mittels RT-PCR erfolgt.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Amplifikation ein in Kontakt bringen der Ribonukleinsäuren mit einem Paar von Amplifikationsprimern umfasst, die so aufgebaut sind, um eine Prostata-spezifische Transglutaminase mRNA zu amplifizieren.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Amplifikation ein in Kontakt bringen der Ribonukleinsäuren mit einem Paar von Amplifikationsprimern umfasst, die so aufgebaut sind, um ein Nukleinsäuresegment, umfassend ein nachweisbares Segment einer Nukleinsäure, die die Sequenz oder das Komplement SEQ ID NO: 1 aufweist, zu amplifizieren.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das nachweisbare Segment von ungefähr 100 Basen in seiner Länge bis ungefähr der Länge der kodierenden Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, weiter als den Unterschied in der Menge an Expression eines Prostata-spezifische Transglutaminase Polypeptids nachweisend definiert.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Nachweis mittels eines Immuntests erfolgt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Immuntest ein ELISA ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Immuntest ein Radioimmuntest ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid durch die SEQ ID NO: 1 kodiert wird.
  21. In vitro Verfahren zum Diagnostizieren eines metastasierenden Prostata-Erkrankungszustands in einem Subjekt, umfassend: in Kontakt bringen einer Prostata-Gewebeprobe, die von einem Subjekt erhalten wurde, mit einem Antikörper, der mit Prostata-spezifischer Transglutaminase immunreaktiv ist, um einen Immunkomplex zu bilden; Nachweisen des Immunkomplexes; Vergleichen der Menge des Immunkomplexes mit der Menge an Immunkomplex, der unter identischen Bedingungen mit demselben Antikörper und einer Kontroll-Prostatagewebeprobe aus einem oder mehreren Subjekten, von denen bekannt ist, dass sie keine metastasierende Prostataerkrankung aufweisen, gebildet wird; wobei eine Abnahme der Menge des Immunkomplexes in Prostatagewebe aus dem Subjekt relativ zu dem Kontroll-Prostatagewebe für eine metastasierende Prostataerkrankung anzeigend ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Immunkomplex in einem Westernblot-Test nachgewiesen wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Immunkomplex in einem ELISA nachgewiesen wird.
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