DE69935248T2 - Dna-protein fusionen sowie anwendungen derselben - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Im Allgemeinen bezieht sich die Erfindung auf DNA-Protein-Fusionen und ihre Anwendungen, insbesondere zur Selektion erwünschter Proteine und ihrer entsprechenden Nukleinsäuresequenzen.
  • Kürzlich wurde ein kombinatorisches Verfahren zur Isolierung von Proteinen mit erwünschten Eigenschaften aus großen Reservoirs an Proteinen entwickelt (Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302). In diesem Verfahren wird der Proteinteil über eine kovalente chemische Bindung mit seiner kodierenden RNA verknüpft. Aufgrund der kovalenten Natur dieser Verknüpfung sind Selektionsexperimente nicht auf die äußerst milden Reaktionsbedingungen beschränkt, die für Ansätze verwendet werden müssen, die nicht-kovalente Komplexbildung wie Ribosomendisplay umfassen (Hanes & Plückthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 4937-4942; He & Taussig, Nucl. Acids Res. (1997) Bd. 25, S. 5132-5143). Jedoch müssen während des Selektionsverfahrens Vorkehrungen getroffen werden, um RNA-Abbau zu minimieren, da die versehentliche Spaltung von Ribobindungen zu einem unwiederbringlichen Verlust von kodierter Information führen kann. Aus diesem Grund werden diese Selektionsverfahren typischerweise unter Verwendung von Reaktionsmedien und -geräten durchgeführt, die frei von Ribonukleasen oder anderen schädlichen Verunreinigungen sind.
  • Kurzfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum kovalenten Markieren von Proteinen mit ihren kodierenden DNA-Sequenzen bereit. Diese DNA-Protein-Fusionen, die in molekularen Evolutions- und Erkennungsverfahren verwendet werden können, sind chemisch stabiler als RNA-Protein-Fusionen und bieten daher eine Anzahl von Vorteilen (wie unten ausführlicher diskutiert wird).
  • Dementsprechend bietet die Erfindung im Allgemeinen Verfahren zum Erzeugen von DNA-Protein-Fusionen. Ein erstes Verfahren umfasst: (a) Vernetzen eines Nukleinsäure-Primers mit einem RNA-Molekül (vorzugsweise am oder in der Nähe des RNA-3'-Endes), wobei der Primer an einen Peptidakzeptor (z.B. Puromycin) gebunden ist; (b) Translatieren der RNA, um ein Protein-Produkt zu erzeugen, wobei das Protein-Produkt kovalent an den Nukleinsäure-Primer gebunden ist; und (c) reverses Transkribieren der RNA ausgehend von dem Nukleinsäure-Primer, um eine DNA-Protein-Fusion herzustellen.
  • Ein zweites Verfahren umfasst: (a) Erzeugen einer RNA-Protein-Fusion; (b) Hybridisieren eines Nukleinsäure-Primers an die Fusion (vorzugsweise am oder in der Nähe des RNA-3'-Endes); (c) Vernetzen des Nukleinsäure-Primers mit der Fusion; und (d) reverses Transkribieren der RNA der RNA-Protein-Fusion ausgehend von dem Nukleinsäure-Primer, um eine DNA-Protein-Fusion herzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der obigen Verfahren kann das Verfahren zusätzlich das Behandeln des Produkts aus Schritt (c) bzw. Schritt (d) zum Entfernen der RNA umfassen (z.B. durch In-Kontakt-Bringen des Produkts aus Schritt (c) bzw. Schritt (d) mit RNase H unter Bedingungen, die ausreichend sind, um RNA zu verdauen). In zusätzlichen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Nukleinsäure-Primer ein DNA-Primer; der Translationsschritt wird in vitro ausgeführt; und der Nukleinsäure-Primer weist eine Haarnadelstruktur auf. Zudem kann der Primer zusätzlich ein Photovernetzungsmittel wie Psoralen enthalten, und der Primer kann mit einem Oligonukleotid vernetzt werden, das an einen Peptidakzeptor gebunden ist, oder er kann alternativ an ein RNA-Molekül hybridisiert werden, gefolgt von einem Vernetzungsschritt, der durch Photovernetzen bewerkstelligt wird.
  • In zugehörigen Aspekten stellt die Erfindung auch ein Molekül bereit, das eine DNA enthält, die kovalent an ein Protein (vorzugsweise von wenigstens 10 Aminosäuren) über einen Peptidakzeptor (z.B. Puromycin) gebunden ist, wie auch ein Molekül, das eine DNA enthält, die kovalent an ein Protein gebunden ist, in welchem das Protein wenigstens 10 Aminosäuren umfasst.
  • In bevorzugten Ausführungsformen dieser beiden Aspekte umfasst das Protein wenigstens 30 Aminosäuren, mehr bevorzugt wenigstens 100 Aminosäuren, und es kann sogar wenigstens 200 oder 250 Aminosäuren umfassen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein durch die DNA kodiert und wird vorzugs weise vollständig durch die DNA kodiert; das Molekül umfasst zusätzlich eine Ribonukleinsäure, die kovalent an die DNA gebunden ist; das Protein wird durch die Ribonukleinsäure kodiert; und die DNA ist doppelsträngig.
  • In einem anderen verwandten Aspekt stellt die Erfindung eine Population aus wenigstens 105, und vorzugsweise wenigstens 1014 DNA-Protein-Fusionen der Erfindung bereit, wobei jede Fusion eine DNA umfasst, die kovalent an ein Protein gebunden ist.
  • Zusätzlich stellt die Erfindung Selektionsverfahren bereit, die die hierin beschriebenen DNA-Protein-Fusionen verwenden. Ein erstes Selektionsverfahren umfasst die Schritte: (a) Bereitstellen einer Population an DNA-Protein-Fusionen, die jeweils eine DNA umfassen, die kovalent an ein Kandidatenprotein gebunden ist, wobei das Protein durch die kovalent gebundene DNA kodiert wird; und (b) Auswählen einer erwünschten DNA-Protein-Fusion, wodurch das erwünschte Protein oder die erwünschte DNA ausgewählt wird.
  • Ein zweites Selektionsverfahren umfasst die Schritte: (a) Herstellen einer Population an Kandidaten-DNA-Protein-Fusionen, die jeweils eine DNA umfassen, die kovalent an ein Kandidatenprotein gebunden ist, und eine für ein Kandidatenprotein kodierende Sequenz aufweisen, die sich von einer für ein Referenzprotein kodierenden Sequenz unterscheidet; und (b) Auswählen einer DNA-Protein-Fusion mit einer geänderten Funktion, wodurch das Protein mit der geänderten Funktion oder seine kodierende DNA ausgewählt werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Selektionsschritt entweder das Binden des erwünschten Proteins an einen immobilisierten Bindungspartner oder das Untersuchen auf eine funktionelle Aktivität des erwünschten Proteins. Zudem kann das Verfahren zusätzlich das Wiederholen der Schritte (a) und (b) umfassen.
  • In einem letzten Aspekt stellt die Erfindung einen festen Träger umfassend ein Array aus immobilisierten Molekülen bereit, die jeweils eine kovalent gebundene DNA-Protein-Fusion der Erfindung umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der feste Träger ein Mikrochip.
  • So wie es hierin verwendet wird, bedeutet eine „Population" 105 oder mehr Moleküle (z.B. DNA-Protein-Fusionsmoleküle). Da die Verfahren der Erfindung Selektionen erleichtern, die, falls erwünscht, mit einer großen Anzahl an Kandidatenmolekülen beginnen, bedeutet eine „Population" gemäß der Erfindung vorzugsweise mehr als 107 Moleküle, mehr bevorzugt mehr als 109, 1013 oder 1014 Moleküle und am meisten bevorzugt mehr als 1015 Moleküle.
  • Mit „Auswählen" ist die umfassende Abtrennung eines Moleküls von anderen Molekülen in einer Population gemeint. Wie es hierin verwendet wird, stellt ein „Auswahl"-Schritt wenigstens eine zweifache, vorzugsweise eine 30-fache, mehr bevorzugt eine 100-fache und am meisten bevorzugt eine 1000-fache Anreicherung eines erwünschten Moleküls relativ zu unerwünschten Molekülen in einer Population im Anschluss an den Selektionsschritt bereit. Ein Selektionsschritt kann beliebige Male wiederholt werden, und unterschiedliche Arten von Selektionsschritten können in einem gegebenen Ansatz kombiniert werden.
  • Mit einem „Protein" sind zwei oder mehr beliebige natürlich vorkommende oder modifizierte Aminosäuren gemeint, die über eine oder mehrere Peptidbindungen verbunden sind. „Protein" und „Peptid" werden hierin austauschbar verwendet.
  • Mit „RNA" ist eine Sequenz aus zwei oder mehr kovalent verbundenen, natürlich vorkommenden oder modifizierten Ribonukleotiden gemeint. Ein Beispiel für eine modifizierte RNA, die in diesem Begriff enthalten ist, ist Phosphorothioat-RNA.
  • Mit „DNA" ist eine Sequenz aus zwei oder mehr kovalent verbundenen, natürlich vorkommenden oder modifizierten Desoxyribonukleotiden gemeint.
  • Mit einer „Nukleinsäure" sind zwei oder mehr beliebige kovalent verbundene Nukleotide oder Nukleotid-Analoga oder -Derivate gemeint. Wie er hierin verwendet wird, umfasst dieser Begriff ohne Einschränkung DNA, RNA und PNA.
  • Mit einem „Peptidakzeptor" ist jedes Molekül gemeint, das durch die katalytische Aktivität der ribosomalen Peptidyltransferasefunktion an den C-Terminus einer wachsenden Proteinkette angefügt werden kann. Typischerweise enthalten solche Moleküle (i) ein Nukleotid oder einen Nukleotid-ähnlichen Rest (z.B. Adenosin oder ein Adenosin-Analogon (Dimethylierung an der N-6-Aminoposition ist zulässig)), (ii) eine Aminosäure oder einen Aminosäure-ähnlichen Rest (z.B. jede der 20 D- oder L-Aminosäuren oder beliebige Aminosäureanaloga davon (z.B. O-Methyltyrosin oder jedes der von Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991, beschriebenen Analoga) und (iii) eine Verknüpfung zwischen diesen zwei (z.B. eine Ester-, Amid- oder Keton-Verknüpfung an der 3'-Position oder weniger bevorzugt an der 2'-Position); vorzugsweise bringt diese Verknüpfung die Falte des Rings („pucker of the ring") nicht wesentlich aus der natürlichen Ribonukleotid-Konformation. Peptidakzeptoren können auch ein Nukleophil enthalten, das ohne Einschränkung eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Sulfhydrylgruppe sein kann. Außerdem können Peptidakzeptoren aus Nukleotidmimetika, Aminosäuremimetika oder Mimetika der gemeinsamen Nukleotid-Aminosäure-Struktur zusammengesetzt sein.
  • Mit einer „geänderten Funktion" ist jede qualitative oder quantitative Änderung in der Funktion eines Moleküls gemeint.
  • Mit „Bindungspartner", wie er hierin verwendet wird, ist jedes Molekül gemeint, das eine spezifische, kovalente oder nicht-kovalente Affinität für einen Teil einer erwünschten DNA-Protein-Fusion aufweist. Beispiele für Bindungspartner umfassen ohne Einschränkung Teile von Antigen/Antikörper-Paaren, Protein/Inhibitor-Paaren, Rezeptor/Ligand-Paaren (z.B. Zelloberflächenrezeptor/Ligand-Paaren wie Hormonrezeptor/Peptidhormon-Paare), Enzym/Substrat-Paaren (z.B. Kinase/Substrat-Paare), Lektin/Kohlenhydrat-Paaren, oligomeren oder heterooligomeren Proteinaggregaten, DNA-Bindungsprotein/DNA-Bindungsstelle-Paaren, RNA/Protein-Paaren und Nukleinsäure-Duplexen, -Heteroduplexen oder ligierten Strängen sowie jedes Molekül, das eine oder mehrere kovalente oder nicht-kovalente Bindungen (z.B. Disulfidbindungen) mit einem beliebigen Teil einer DNA-Protein-Fusion bilden kann.
  • Mit einem „festen Träger" ist ohne Einschränkung jede Säule (oder Säulenmaterial), jedes Kügelchen, jedes Reagenzglas, jede Mikrotiterschale, jeder feste Partikel (z.B. Agarose oder Sepharose), jeder Mikrochip (z.B. Silizium-, Silizium-Glas- oder Goldchip) oder jede Membran (z.B. die Membran eines Liposoms oder Vesikels) gemeint, an die ein Affinitätskomplex entweder direkt oder indirekt (z.B. über andere Bindungspartnerintermediate wie andere Antikörper oder Protein A) gebunden werden kann oder in die ein Affinitätskomplex eingeschlossen werden kann (z.B. durch einen Rezeptor oder Kanal).
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Erzeugung von Fusionen zwischen Proteinen und ihren kodierenden cDNAs bereit. Diese Konstrukte weisen eine außerordentlich verbesserte chemische Stabilität auf, zum ersten aufgrund der DNA- Komponente der Fusion und zum zweiten aufgrund der Verknüpfung der DNA- und Protein-Anteile über eine kovalente Bindung. Diese Eigenschaften gestatten eine leichtere Handhabung der Fusionsprodukte und ermöglichen es dadurch, Selektions- und Erkennungsexperimente unter einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen auszuführen. Außerdem erleichtert die vorliegende Erfindung Anwendungen, bei denen ein einzelsträngiger Nukleinsäureanteil zwingend erforderlich ist, z.B. bei Hybridisierungsassays, in denen die kodierenden Fusionen an einem festen Träger immobilisiert werden. Weiterhin können Inkubationen unter harscheren Bedingungen, einschließlich hohem pH, erhöhten Konzentrationen an mehrwertigen Metallionen, ausgedehnter Hitzebehandlung und Exposition gegenüber unterschiedlichen biologischen Materialien, durchgeführt werden. Schließlich ist einzelsträngige DNA relativ resistent gegen die Ausbildung von Sekundärstrukturen, was einen großen Vorteil für Verfahren darstellt, die Nukleinsäurehybridisierungsschritte enthalten oder benötigen.
  • Außerdem ermöglichen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Herstellung von Fusionen, die DNA- und Protein-Komponenten beliebiger Länge umfassen, wie auch Fusionsbibliotheken von hoher Komplexität.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden, detaillierten Beschreibung und aus den Patentansprüchen ersichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen (Typ A1), das die Ligation einer Puromycin-modifizierten, Haarnadel-ähnlichen DNA-Struktur an ein mRNA-Molekül umfasst.
  • 2 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung verzweigter Haarnadelstrukturen.
  • 3 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Synthese von Puromycin-5'-phosphoramidit.
  • 4 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung verzweigter Haarnadelstrukturen.
  • 5 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen, das Photovernetzen eines 5'-Psoralen-modifizierten DNA-Primers an einen geeigneten Linker umfasst, der ein 3'-Puromycin trägt.
  • 6 ist eine schematische Abbildung exemplarischer Verfahren zur chemischen Ligation von mRNA- und DNA-Molekülen.
  • 7 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Synthese von Hydrazid-Phosphoramidit.
  • 8 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Synthese von Hydrazin-Phosphoramidit.
  • 9 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen, das chemisches Vernetzen eines Puromycin-modifizierten Linkers an das 3'-Ende eines mRNA-Moleküls umfasst.
  • 10 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen, das das Psoralen-vermittelte Photovernetzen eines kombinierten Linker/reverse-Transkription-Primer-Konstrukts an das 3'-Ende eines mRNA-Moleküls umfasst.
  • 11 ist eine schematische Abbildung eines alternativen Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen, das die Psoralen-Photovernetzung eines kombinierten Linker/reverse-Transkription-Primer-Konstrukts umfasst.
  • 12 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen, das die Vernetzung eines reverse-Transkription-Primers an ein vorher vorhandenes mRNA-Linker-Konstrukt umfasst.
  • 13 ist eine schematische Abbildung eines Verfahrens zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen, das das Vernetzen eines reverse-Transkription-Primers an eine vorher vorhandene mRNA-Protein-Fusion umfasst.
  • 14 ist eine schematische Abbildung der Oligonukleotid-Konstrukte (SEQ ID NOs: 1-6), die für die Herstellung der hierin beschriebenen, beispielhaften DNA-Protein-Fusionen verwendet wurden.
  • 15 ist eine schematische Abbildung der Herstellung von Typ-C2-DNA-Protein-Fusionen.
  • 16 ist eine Fotografie, die eine Produktanalyse der Typ-C2-DNA-Protein-Fusionen zeigt.
  • 17 ist eine schematische Abbildung der Herstellung von Typ-B3-DNA-Protein-Fusionen.
  • 18 ist eine schematische Abbildung der Herstellung von Typ-B2-DNA-Protein-Fusionen.
  • 19 ist eine Fotografie, die die Resistenzuntersuchung von Typ-B3-DNA-Protein-Fusionen gegenüber Nuklease- und Base-Behandlung zeigt.
  • 20 ist ein Diagramm, das die experimentell bestimmten Halbwertszeiten der RNA- und DNA-Protein-Fusionsprodukte in Gegenwart von Zellmembranpräparationen zeigt.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Es wird jetzt unten eine Anzahl von beispielhaften Verfahren zur Herstellung von DNA-Protein-Fusionen und Beschreibungen ihrer Verwendung bereitgestellt. Diese Beispiele werden zum Zweck der Veranschaulichung der Erfindung und nicht zu deren Einschränkung gegeben.
  • Typ A1: Matrizen-gelenkte Ligation einer Puromycin-modifizierten Haarnadel-ähnlichen Struktur an eine mRNA
  • Gemäß einem ersten beispielhaften Ansatz werden DNA-Protein-Fusionen erzeugt, indem wie in 1 gezeigt eine Puromycin-modifizierte Haarnadel-ähnliche DNA-Struktur an ein mRNA-Molekül ligiert wird. Der erste Schritt dieses Verfahrens ist die Anlagerung von Puromycin an die Haarnadel, und dieses kann durch eine Anzahl von Verfahren bewerkstelligt werden, von denen eines in 2 gezeigt ist. Durch diesen Ansatz wird eine DNA-Haarnadel mit einer Seitenkette mit endständigem Puromycin synthetisiert, die von dem DNA-Molekül abzweigt. Dieses Konstrukt kann unter Verwendung eines asymmetrisch verzweigten Phosphoramidits (Clontech, Palo Alto, CA) in jeder automatisierten Standard-DNA-Synthese der Haarnadelstruktur (siehe z.B. User Guide to Expedite Nucleic Acid Synthesis System, Perseptive Biosystem, Framingham, MA) erzeugt werden, gefolgt von der Hinzufügung eines 5'-Phosphats unter Verwendung eines chemischen Phosphorylierungsreagenz (Glen Research, Sterling, VA).
  • Nachfolgend wird die Schutzgruppe selektiv von der Verzweigung entfernt (Product Protocol for Asymmetric Branching Phosphoramidite, Clontech, Palo Alto, CA) gefolgt von der Anlagerung des Linkerteils mittels automatisierter Standard-DNA-Synthese. Bevor das Ende des Linkers erreicht wird, wird die Strangorientierung durch Zugabe einiger weniger 5'-Phosphoramidite (Glen Research, Sterling, VA) umgekehrt. Schließlich wird die Synthese durch die Anlagerung des Puromycin-5'-Phosphoramidits, vorzugsweise unter Verwendung des in 3 gezeigten synthetischen Verfahrens, beendet. In 3 können die Schritte (a)-(c) so wie in Greene & Wuts beschrieben ausgeführt werden (Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe (1991) John Wiley & Sons, Inc., New York, New York), und Schritt (d) kann wie bei Beaucage beschrieben ausgeführt werden (Methods in Molecular Biology, Band 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Hrsg. S. Agarwal (1993) Humana Press, Totowa, N.J., S. 33-61).
  • Alternativ kann die Puromycin-modifizierte, verzweigte Haarnadel wie in 4 gezeigt synthetisiert werden. In diesem Verfahren wird die Synthese ausgehend von einem Puromycin-CPG als festem Träger (Glen Research, Sterling, VA) begonnen, indem zuerst der Linkerteil synthetisiert wird, gefolgt vom Einbau des verzweigten Amidits (Clontech, Palo Alto, CA) und dem Hinzufügen des 5'-Anteils der Haarnadel. Nach Entschützen der Verzweigung wird der 3'-Arm der Haarnadel unter Verwendung von Nukleosid-5'-phosphoramiditen (Glen Research, Sterling, VA) hinzugefügt.
  • In beiden der obigen Ansätze wird im nächsten Schritt die mRNA, z.B. unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und unter Verwendung der 3'-Überhänge als Matrize, an die Haarnadel ligiert (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Die ribosomale Translation der RNA führt dann zur Proteinsynthese mit nachfolgender Fusionsbildung (siehe z.B. Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302). In einer besonderen Ausführungsform be findet sich der Verzweigungspunkt in der Schlaufen-Region der Haarnadel. Andere Positionen des Verzweigungspunkts (z.B. innerhalb der Stamm-Struktur) können auch verwendet werden. Während ein dAn-Linker von ungefähr zwischen 10 und 60 Nukleotiden und mehr bevorzugt von ungefähr 30 Nukleotiden verwendet wird, können zusätzlich sowohl die Länge als auch die chemische Zusammensetzung des Linkers (z.B. PEG (Glen Research, Sterling, VA) anstelle von dAn) optimiert werden.
  • In einem letzten Schritt wird der RNA-Anteil des Konstrukts revers transkribiert in cDNA (z.B. wie in Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben) unter Verwendung des Haarnadel-3'-Endes als Primer. Der optionale Verdau der mRNA durch RNase H (siehe z.B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) generiert eine einzelsträngige DNA-Protein-Fusion.
  • Dieses Verfahren ermöglicht auch die Ausbildung verkürzter DNA-Transkripte durch Zugabe von Didesoxynukleosidtriphosphaten während der Transkription (siehe z.B. Sanger, Science (1981) Bd. 214, S. 1205-1210). Solche verkürzten DNA-Protein-Fusionen sind nützlich für Protein-Display-Experimente (Kurnelis et al., U.S.S.N. 60/080,686, eingereicht am 3. April 1998), z.B. wenn nur der 3'-Bereich der ursprünglichen mRNA (jetzt der 5'-Bereich des DNA-Transkripts) zur Hybridisierung mit immobilisierten Oligonukleotid-Sonden verwendet wird).
  • Typ A2: Vernetzen eines Puromycin-modifizierten Linkers mit einer Primer-DNA
  • Als eine Alternative zu dem oben beschriebenen Haarnadel-ähnlichen Konstrukt kann auch eine eng verwandte Struktur durch Photovernetzen einer 5'-Psoralenmodifizierten Primer-DNA mit einem geeigneten Linker, der ein 3'-Puromycin trägt, hergestellt werden. Ein beispielhaftes Vernetzungsverfahren ist in 5 gezeigt. In diesem Verfahren kann der Puromycin-tragende Linker konstruiert werden, wie es z.B. in Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302 beschrieben ist. Der Psoralen-modifizierte Primer kann erzeugt und der Photovernetzungsschritt kann ausgeführt werden, wie es z.B. in Pieles & Englisch, Nucl. Acids Res. (1989) Bd. 17, S. 285-299, beschrieben ist. Die verbleibenden Schritte können wie oben beschrieben ausgeführt werden. Dieser Ansatz verlangt nicht die Verwendung von nicht-standardmäßigen Nukleosid/Puromycin-5'- Phosphoramiditen (d.h. diese wurden während der automatisierten Synthese der Haarnadel-Linker-Struktur verwendet), was einen Vorteil gegenüber dem Haarnadelverfahren bietet. Während ein dAn-Linker von ungefähr zwischen 10 bis 60 Nukleotiden und mehr bevorzugt von ungefähr 30 Nukleotiden verwendet wird, können wiederum wie oben sowohl die Länge als auch die chemische Zusammensetzung des Linkers (z.B. PEG (Glen Research, Sterling, VA) anstelle von dAn) optimiert werden.
  • Außerdem kann bei jedem der Typ-A1- und Typ-A2-Verfahren die Ligationsreaktion zwischen dem mRNA- und dem DNA-Anteil des Konstrukts durch einige alternative Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann neben der oben beschriebenen enzymatischen Ligation mit T4-DNA-Ligase dieser Schritt unter Verwendung chemischer Verfahren bewerkstelligt werden. In einem besonderen Beispiel kann das 5'-Ende der Haarnadel unter Verwendung des geeigneten Phosphoramidits mit einer (oder mehreren) Aminogruppen modifiziert werden (Clontech, Palo Alto, CA). Nach Periodatoxidation des 3'-Endes der RNA können die zwei Substrate mittels einer reduktiven Aminierungsreaktion verbunden werden. Dies ist als Schema „A" in 6 veranschaulicht und wird z.B. in Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) Bd. 84, S. 648-652, beschrieben. Alternativ kann dieser chemische Ligationsschritt mit Carbohydrazid oder Hydrazin modifizierte Strukturen zur Hydrazonbildung oder zur reduktiven Aminierung einschließen. Diese Ansätze sind als Schema „B" bzw. „C" in 6 veranschaulicht und werden in Gosh et al. (Anal. Biochem. (1989) Bd. 178, S. 43-51) bzw. Proudnikov & Mirzabekov (Nucl. Acids Res. (1996) Bd. 24, S. 4535-4542) beschrieben. Hydrazidphosphoramiditsynthese kann wie in 7 gezeigt und Hydrazinphosphoramiditsynthese kann wie in 8 gezeigt ausgeführt werden und wie in Greene & Wuts (Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe (1991) John Wiley & Sons, Inc., New York, New York (Schritte (a) und (c)), Proudnikov & Mirzabekov (Nucl. Acids Res. (1996) Bd. 24, S. 4535-4542 (Schritt (b)) und Beaucage (Methods in Molecular Biology, Bd. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Hrsg. S. Agarwal (1993) Humana Press, Totowa, N.J., S. 33-61 (Schritt (e)) beschrieben.
  • Typen B1-B3: Chemisches Vernetzen an das 3'-Ende einer mRNA
  • Noch ein weiterer Ansatz zur Erzeugung von DNA-Protein-Fusionen umfasst das chemische Vernetzen eines Puromycin-modifizierten Linkers an das 3'-Ende eines mRNA-Moleküls. Solch ein Vernetzen kann mit einer Anzahl von Ansätzen bewerkstelligt werden.
  • Ein beispielhafter Ansatz ist in 9 schematisch gezeigt. In diesem Ansatz („B1") wird ein Oligonukleotid synthetisiert, das eine reaktive Gruppe trägt (z.B. eines der oben beschriebenen Aminoderivate, Hydrazide oder Hydrazine), die zwischen dem Primer- und dem Linkerbereich angeordnet ist. Duplexbildung zwischen der RNA und der Primerstelle findet in unmittelbarer Nachbarschaft zu dieser reaktiven Gruppe statt, die dann mit dem Periodat-oxidierten 3'-Ende der RNA reagieren gelassen wird, was zu einer Vernetzung führt (wie in 6 gezeigt und wie oben beschrieben). Diese Reaktion kann durch reduktive Aminierung (6, Schema „A" oder „C"; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) Bd. 84, S. 648-652; Proudnikov & Mirzabekov, Nucl. Acids. Res. (1996) Bd. 24, S. 4535-4542) oder Hydrazonbildung erfolgen (6, Schema "B"; Gosh et al., Anal. Biochem. (1989) Bd. 178, S. 43-51). Nachfolgend zur Translation und zur Fusionsbildung (Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302) wird der Primer durch reverse Transkriptase an der RNA-Matrize verlängert, und ein optionaler RNase-H-Verdauschritt wird durchgeführt, wodurch die DNA-Protein-Fusion erzeugt wird (9).
  • Wie oben in den Verfahren A1 und A2 wird die Strangrichtung der terminalen Nukleotide des Linkeranteils umgekehrt, was durch die Verwendung von 5'-Phosphoramiditen (Glen Research, Sterling, VA) während der Synthese erreicht werden kann.
  • In noch einem weiteren beispielhaften Vernetzungsansatz („B2"), ist eine photoreaktive Psoralengruppe als eine reaktive Gruppe in dem Linker enthalten (10). Solch ein Konstrukt kann unter Verwendung eines Psoralen-modifizierten Desoxynukleotid-Phosphoramidits (Pieles et al., Nucleic Acids Res. (1989) Bd. 17, S. 8967-8978) oder durch Einbau eines verzweigten Phosphoramidits (Clontech, Palo Alto, CA), an das ein Standard-Psoralen-Phosphoramidit angefügt ist (Glen Research, Sterling, VA), synthetisiert werden. Nachfolgend zur Hybridisierung des Linkers an die Ziel-RNA wird die Ausbildung der Quervernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht, z.B. wie in Pieles und Englisch beschrieben (Nucl. Acids Res. (1989) Bd. 17, S. 285-299), erreicht. Das entstehende Konstrukt wird dann der Translation und Fusionsbildung unterzogen (Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad.
  • Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302). Reverse Transkription und Verdau mit RNase H ergibt die endgültigen DNA-Protein-Fusionen.
  • Alternativ kann das Vernetzen unter Verwendung eines kombinierten Linker/reverse-Transkriptase-Primerkonstrukts wie in 11 dargestellt („B3") bewerkstelligt werden. In einer Variante des obigen Ansatzes wird die Psoralengruppe nicht direkt zwischen dem Linker- und dem Primerbereich angefügt, sondern mit einem kurzen DNA-Abzweig verbunden. Dieser DNA-Teil hybridisiert auch an die Ziel-RNA und stellt folglich eine optimierte, doppelsträngige Umgebung für das Psoralen bereit, um zu reagieren (Pieles und Englisch, Nucl. Acids Res. (1989) Bd. 17, S. 285-299). Die Herstellung der DNA-Protein-Fusionen unter Verwendung dieses Psoralenkonstrukts können wie oben beschrieben ausgeführt werden.
  • Typen C1 und C2: Vernetzen des reverse-Transkription-Primers an vorher vorhandene mRNA-Linker-Konstrukte
  • Ein anderes Verfahren zum Erzeugen von DNA-Protein-Fusionen ist schematisch in 12 gezeigt. In diesem Ansatz wird RNA zu Beginn wie zuvor beschrieben an ein Linker-Molekül ligiert (Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302). In einem nachfolgenden Schritt wird ein geeigneter Primer, der ein 5'-photovernetzendes Reagenz (z.B. Psoralen, Glen Research, Sterling, VA) trägt, an das RNA-Linker-Produkt angelagert. Bestrahlung mit Licht erzeugt eine kovalente Quervernetzung zwischen den zwei Oligonukleotidsträngen (wie z.B. in Pieles & Englisch, Nucl. Acids Res. (1989) Bd. 17, S. 285-299 beschrieben). Wie in den obigen Verfahren vom Typ A1, A2 und B1-B3 kann die Translation und die Fusionsbildung durchgeführt werden, gefolgt von einem reversen Transkriptionsschritt und einem optionalen Verdauschritt mit RNase H, um DNA-Protein-Fusionen zu ergeben (12).
  • Alternativ können wie in 13 gezeigt, die anfänglichen Schritte des obigen Verfahrens in umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden. Dieser Ansatz ermöglicht es, dass Translation und Fusionsbildung vor dem Vernetzen und der reversen Transkription durchgeführt werden. Dementsprechend gestattet dieses Verfahren die Verwendung zuvor beschriebener und wohl etablierter Reaktionsbedingungen und -komponenten für die Translation und die RNA-Protein-Fusionsbildung.
  • Experimentelle Ergebnisse
  • Oben beschriebene, beispielhafte Verfahren wurden durchgeführt, um DNA-Protein-Fusionsbildung zu demonstrieren. Diese Experimente machten von den in 14 abgebildeten Oligonukleotiden Gebrauch.
  • Die Muster-RNA-Substrate 1: GGG ACA AUU ACU AUU UAC AAU UAC AAU GGA CUA CAA GGA CGA UGA CGA UAA GGG CGG CUG GUC CCA CCC CCA GUU CGA GAA GGC AUC CGC U (SEQ ID NO: 7); 2: GGG ACA AUU ACU AUU UAC AAU UAC AAU GGA CUA CAA GGA CGA UGA CGA UAA GGG CGG CUG GUC CCA CCC CCA GUU CGA GAA GGC AUC CGC UCU UUC ACU AUA (SEQ ID NO: 8); und 3: GGG ACA AUU ACU AUU UAC AAU UAC AAU GGA CUA CAA GGA CGA UGA CGA UAA GGG CGG CUG GUC CCA CCC CCA GUU CGA GAA GGC AUC CGC UAU UUA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A (SEQ ID NO: 9) wurden mittels T7-Transkription (Megashortscript transcription kit, Ambion, Austin, TX) unter Verwendung geeigneter dsDNA-Matrizen synthetisiert. Nachfolgend zur Transkription wurden die RNAs mittels denaturierender Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt.
  • Die modifizierten Oligonukleotide 4: 5' pd(AAA AAA AAA ACG GCT ATA TAA AAA AAA CC)-Pu (SEQ ID NO: 10); 5: 5' Psoralen C2-TAG CCG TTT TTT TTT TAG CGG ATG C (SEQ ID NO: 11); 6: 5' d(cgt agg cga gaa agt gat)-Verzweigung [Psoralen C6]-d(AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CC)-Pu (SEQ ID NO: 12); und 7: 5'ggt caa gct ctt-Verzweigung [5' Psoralen C6-TAG CGG ATG C 3'] Abstandshalters CC-Pu (SEQ ID NO: 13) [[Großbuchstaben = Standard-DNA-3'-Phosphoramidite; Kleinbuchstaben = DNA-5'-Phosphoramidite; Abstandshalter = Abstandshalter-9-Phosphoramidit; Pu = Puromycin-CPG (alle von Glen Research, Sterling, VA); Verzweigung = asymmetrisches, verzweigendes Amidit (Clontech, Palo Alto, CA)] wurden an einem Expedite Synthesizer Model 8909 (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) gemäß den empfohlenen Anleitungen für die entsprechenden Phosphoramidite synthetisiert. Für die verzweigten Konstrukte 6 und 7 wurde die Hauptkette als erstes synthetisiert und mit einem abschließenden Blockierschritt („capping step") abgeschlossen. Als nächstes wurde die Lävulinyl-Schutzgruppe von der Verzweigungseinheit durch Behandlung für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,5 M Hydrazin-Monohydrat in Pyridin/Essigsäure entfernt. Die automatische Synthese wurde dann fortgesetzt, und die Seitenkettensequenzen (angezeigt in eckigen Klammern) wurden angefügt. Die Oligos wurden für 8 Stunden bei 55°C in konzentriertem Ammoniumhydroxid vollständig entschützt und mittels denaturierender Gelelektrophorese gereinigt.
  • Die DNA-Sequenzen 8: d(TTT TTT TTT TAG CGG ATG C) (SEQ ID NO: 14) und 9: d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT) (SEQ ID NO: 15) wurden von Oligos etc. (Wilsonville, OR) gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Typ-C2-DNA-Protein-Fusionsbildung
  • Typ-C2-DNA-Protein-Fusionsbildung wurde wie folgt gezeigt (15). RNA 1 und Linker 4 wurden an Matrizen-DNA 8 hybridisiert und wie zuvor beschrieben (Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302) mittels T4-DNA-Ligase enzymatisch ligiert. Nach Reinigung durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel wurde das entstandene mRNA-Linker-Konstrukt als eine Matrize für die in vitro-Translation unter Verwendung des Kaninchen-Reticulozyten-Lysat-Kits von Ambion verwendet. Die Reaktionsmischungen enthielten 50 pmol ligierte mRNA 10, 10 mM Kreatinphosphat, 150 mM Kaliumacetat, 0,5 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM jeder Aminosäure außer Methionin, 150 μCi [35S]-Methionin (Amersham, Arlington Heights, IL) und 67% v/v des Lysats in einem Gesamtvolumen von 300 μl und wurden für 30 Minuten bei 30°C durchgeführt. Um die nachfolgende Fusionsbildung zu begünstigen, wurden KCl und MgCl2 in Endkonzentrationen von 590 mM bzw. 50 mM in einem Volumen von 500 μl hinzugegeben. Die Inkubation wurde für 60 Minuten bei 20°C fortgeführt. Die Produkte wurden isoliert, indem das Lysat in 10 ml Bindungspuffer (100 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,25% v/v Triton X-100) verdünnt wurde und indem 10 mg Oligo-dT-Cellulose Typ 7 (Pharmacia, Piscataway, NJ) hinzugegeben wurden. Die Proben wurden 60 Minuten lang bei 4°C rotiert, und der feste Träger wurde dann mit 5 ml eiskaltem Bindungspuffer, der frei von EDTA war, gewaschen, gefolgt von Elution mit 100-μl-Aliquots Wasser. Das Fusionsprodukt fand sich in den Fraktionen 2 und 3, und diese Fraktionen wurden vereinigt. Die gesamte Ausbeute an Fusion 11 wurde über Szintillationszählung des eingebauten [35S]-Methionins bestimmt und betrug 1,6 pmol (3,2% der eingesetzten RNA).
  • Zur Umwandlung der RNA-Protein-Fusionen 11 in DNA-Protein-Fusionen 13 wurden die folgenden Reaktionen durchgeführt (15). Zunächst wurden 20 μl des obigen Oligo-dT-gereinigten Materials 11 mit 0,5 μl Primern 5 (50 μM) und 6 μl Erststrangpuffer („first strand buffer", Superscript II Kit von Gibco BRL; 250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 KCl, 15 mM MgCl2) gemischt und kurz für 2 Minuten auf 80°C erhitzt, gefolgt vom langsamen Abkühlen auf 0°C. Die Photovernetzungsbildung durch Psoralen wurde durch Bestrahlen der Probe für 15 Minuten bei 0°C mit λ > 310 nm hervorgerufen [450 W Mitteldruckimmersionslampe (ACE Glass, Vineland, NJ) ausgestattet mit einer Pyrex-Absorptionsmanschette in einer Quartz-Immersionskammer]. Als nächstes wurden 0,6 μl einer dNTP-Mischung (jeweils 25 mM), 3 μl 0,1 M DTT und 0,4 μl (80 Einheiten) Superscript II reverse Transkriptase hinzugegeben, und die cDNA-Synthese wurde für 60 Minuten bei 42°C durchgeführt. Der RNA-Anteil wurde dann durch fortgesetzte Inkubation bei 37°C für 60 Minuten nach Zugabe von 0,5 μl (1 Einheit) RNase H (Promega, Madison, Wisconsin) entfernt. Schließlich wurde die doppelsträngige DNA 14 erzeugt, indem 50 pmol Primer 9 hinzugegeben und für weitere 60 Minuten bei 42°C inkubiert wurde. Kontrollreaktionen mit nicht-vernetzten Proben wurden wie in 15 gezeigt durchgeführt. Die Produktanalyse wurde mittels Elektrophorese auf denaturierenden 6%igen TBE-Harnstoff-Gelen (Novex, San Diego, CA) durchgeführt, gefolgt von Sichtbarmachung der [35S)-markierten Produktbanden durch Exposition auf einem Phosphorimager-Schirm (16).
  • Die Proben wurden auf dem Gel in der gleichen Reihenfolge, wie sie in 15 erscheinen, aufgetragen, beginnend mit RNA-Protein-Fusion 11 und entsprechend der Abfolge im Reaktionsweg, in welchem photovernetzt wurde bzw. nicht photovernetzt wurde. Wie in 16 gezeigt, entsprechen die Gelmobilitäten gut dem erwarteten Verhalten und bestätigen klar die Struktur der DNA-Protein-Fusion 13.
  • Typ-B3-DNA-Protein-Fusionsbildung
  • Die Typ-B3-DNA-Protein-Fusionsbildung wurde wie folgt gezeigt (17). Das verzweigte Linkerkonstrukt 7 (5 μM) wurde an die Ziel-RNA 3 (2,5 μM) in 25 mM Tris-Puffer pH 7,0, der 100 mM NaCl enthielt, angelagert und durch Bestrahlen für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Borsilikatglasfläschchen (Kimble/Kontes, Vineland, NJ) unter Verwendung einer Mehrwellenlängen-UV-Handlampe vom Modell UVGL-25 (UVP, Upland, CA), die auf Langwelle gestellt war, vernetzt. Die Produktanalyse wurde mittels Elektrophorese auf einem 6%igen TBE-Harnstoff-Polyacrylamidgel gefolgt von Sichtbarmachung durch UV-Abschattung („UV shadowing") durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen eine nahezu quantitative Um wandlung des Ausgangsmaterials (Gel „A" in 17). Die photoligierte Produkt-RNA wurde für die in vitro-Translation ohne weitere Abtrennung von verbliebener unligierter RNA und überschüssigem Linker verwendet. In vitro-Translations- und Fusionsbildungsreaktionen wurden wie oben für Typ C2 beschrieben durchgeführt, mit 100 pmol Ausgangs-RNA in einem Gesamtvolumen von 300 μl. Nach Reinigung an Oligo-dT-Cellulose wurden 5,5 pmol RNA-Fusion 15 erhalten. Ihre Umwandlung in einzelsträngige und doppelsträngige DNA-Protein-Fusionen 16 bzw. 17 wurde durch reverse Transkription (Superscript II Kit, Gibco BRL, Grand Island, NY) und RNase-H-Behandlung (Promega, Madison, WI) wie für Typ-C2-Fusionen beschrieben durchgeführt (Gel „B" in 17).
  • Typ-B2-DNA-Protein-Fusionsbildung
  • Die Typ-B2-DNA-Protein-Fusionsbildung wurde wie in 18 skizziert gezeigt. Genauer gesagt wurde der oben skizzierten Prozedur für Typ-B3-Fusionen folgend RNA 2 mit Linker 6 vernetzt. Nach denaturierender Polyacrylamidelektrophorese wurde das ligierte Produkt 18 in 12%iger Ausbeute isoliert. In-vitro-Translation, Fusionsbildung und Herstellung der DNA-Proteinfusionen 19 wurden durchgeführt wie oben für Typ-B3-Fusionen beschrieben, mit ähnlichen Ausbeuten der Fusionsbildung.
  • DNA-Protein-Fusions-Stabilitätstests
  • Um die Nuklease- und Base-Resistenz der DNA-Fusionen im Vergleich zu der korrespondierender RNA-Fusionen zu bewerten, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Zu 10 μl DNA-Fusion 16 (Typ B3) oder RNA-Fusion 15 in reverse-Transkription-Puffer wurden entweder 0,2 μl (0,4 Einheiten) RNase H, 0,2 μl (2 Einheiten) RNase I, 0,2 μl (0,6 Einheiten) T4 DNA-Polymerase (3'-5'-Exonuklease-Aktivität) oder 2,5 μl 2,0 M NaOH gegeben. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann auf einem 4-12% NuPage-Gel analysiert (Novex, San Diego, CA), gefolgt von Autoradiographie. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt und bestätigen die erhöhte Stabilität der DNA-Fusionen gegenüber Ribonukleasen und Basebehandlung.
  • Um die Stabilität der DNA-Fusionskonstrukte in biologischen Medien zu testen, wurden 5 nM von entweder RNA-Fusionen 11 oder 12 oder DNA-Fusionen 13 oder 14 (Typ C2) mit 3 μg/μl CHO-K1-Zellmembranen (Receptor Biology, Beltsville, MD) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2 und 10 mM DTT bei Raumtemperatur inkubiert. Zusätzliche Proben der RNA-Fusionen 11 und 12 wurden hergestellt, die 20 mM Vanadylribonukleosidkomplex („VRC") enthielten, um Ribonukleaseaktivität zu inhibieren. Aliquots wurden nach 0, 5, 15, 30, 60, 120 Minuten und 24 Stunden entnommen und durch Elektrophorese auf 4-12% NuPage-Gelen (Novex) gefolgt von Exposition auf einem Phosphorimager-Schirm analysiert. Die relativen Mengen der verbleibenden Fusionen wurden gegen die Inkubationszeit aufgetragen, und die Halbwertszeiten wurden aus den resultierenden Kurven graphisch ermittelt. Wie in 20 gezeigt, zeigten alle Konstrukte mehr als 50% Zerfall während des anfänglichen 2-Stunden-Zeitraums außer dsDNA-Fusion 14, die unter den untersuchten Bedingungen vollständig stabil schien. Nach einer 24 Stunden-Inkubation waren alle Fusionskonstrukte aufgrund von entweder Nuklease- oder Proteaseaktivität vollständig abgebaut.
  • In-vitro-Selektion der erwünschten Proteine
  • Die hierin beschriebenen DNA-Protein-Fusionen können in jedem Selektionsverfahren für erwünschte Proteine verwendet werden, einschließlich molekularer Evolutions- und Erkennungsansätze. Beispielhafte Selektionsverfahren werden z.B. in Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302, beschrieben.
  • Verwendung
  • Die hierin beschriebenen DNA-Protein-Fusionen können in jeder Anwendung verwendet werden, die zuvor beschrieben wurde oder für RNA-Protein-Fusionen vorgesehen ist. Kommerzielle Verwendungen umfassen die Isolierung von Polypeptiden mit erwünschten Eigenschaften durch in-vitro-Evolutionsverfahren (siehe z.B. Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700; Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) Bd. 94, S. 12297-12302)), das Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken, die von zellulärer mRNA abgeleitet sind (siehe z.B. Lipovsek et al., U.S.S.N. 60/096,818, eingereicht am 17. August 1998), und das Klonieren neuer Gene auf Grundlage von Protein-Protein-Interaktionen (Szostak et al., U.S.S.N. 09/007,005 und U.S.S.N. 09/247,190; Szostak et al., WO 98/31700) wie auch die Verwendung dieser Fusionen in Proteindisplayexperimenten (Kuimelis et al., U.S.S.N. 60/080,686 und U.S.S.N. 09/282,734). Außerdem können die hierin beschriebenen DNA-Protein-Fusionen in Bindungs- und molekularen Erkennungsassays verwendet werden, die biologische Materialien einschließen, die mutmaßlich Ribonukleasen enthalten, wie ganze Zellen, Lysate oder biologische Flüssigkeiten. Diese DNA-Protein-Fusionen können für jeden geeigneten therapeutischen, diagnostischen oder Forschungszweck verwendet werden, insbesondere in pharmazeutischen und landwirtschaftlichen Bereichen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001

Claims (55)

  1. Verfahren zum Erzeugen einer DNA-Protein-Fusion, wobei das Verfahren umfasst: (a) Vernetzen eines Nukleinsäure-Primers mit einem RNA-Molekül, wobei der Primer an einen Peptidakzeptor gebunden ist; (b) Translatieren der RNA, um ein Protein-Produkt zu erzeugen, wobei das Protein-Produkt kovalent an den Nukleinsäure-Primer gebunden ist, und (c) reverses Transkribieren der RNA ausgehend von dem Nukleinsäure-Primer, um eine DNA-Protein-Fusion herzustellen.
  2. Verfahren zum Erzeugen einer DNA-Protein-Fusion, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erzeugen einer RNA-Protein-Fusion; (b) Hybridisieren eines Nukleinsäure-Primers an die Fusion; (c) Vernetzen des Nukleinsäure-Primers mit der Fusion; und (d) reverses Transkribieren der RNA der RNA-Protein-Fusion ausgehend von dem Nukleinsäure-Primer, um eine DNA-Protein-Fusion herzustellen.
  3. Verfahren zum Erzeugen einer DNA-Protein-Fusion, wobei das Verfahren umfasst: (a) Ligieren eines Nukleinsäure-Primers an ein RNA-Molekül, wobei der Primer an einen Peptidakzeptor gebunden ist und eine Haarnadelstruktur aufweist; (b) Translatieren der RNA, um ein Proteinprodukt herzustellen, wobei das Proteinprodukt kovalent an den Nukleinsäure-Primer gebunden ist; und (c) reverses Transkribieren der RNA ausgehend von dem Nukleinsäure-Primer, um eine DNA-Protein-Fusion herzustellen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verfahren zusätzlich das Behandeln des Produkts aus Schritt (c) der Ansprüche 1 oder 3 oder aus Schritt (d) des Anspruchs 2 zum Entfernen besagter RNA umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei besagtes Behandeln das In-Kontakt-Bringen des Produkts aus Schritt (c) der Ansprüche 1 oder 3 oder aus Schritt (d) des Anspruchs 2 mit RNase H unter Bedingungen umfasst, die ausreichend sind, um RNA zu verdauen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Nukleinsäure-Primer ein DNA-Primer ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Translationsschritt in vitro ausgeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Nukleinsäure-Primer eine Haarnadelstruktur aufweist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Primer zusätzlich ein Photovemetzungsmittel umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Photovernetzungsmittel Psoralen ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Primer mit einem Oligonukleotid vernetzt ist, das an einen Peptidakzeptor gebunden ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Primer an das RNA-Molekül hybridisiert ist und wobei der Vernetzungsschritt durch Photovernetzen ausgeführt wird.
  13. Verfahren für die Selektion eines gewünschten Proteins oder seiner kodierenden DNA, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Population an DNA-Protein-Fusionen, die jeweils eine DNA, die kovalent an ein Kandidatenprotein gebunden ist, umfassen, wobei das Protein durch die kovalent gebundene DNA kodiert wird; und b) Auswählen einer gewünschten DNA-Protein-Fusion, wodurch das gewünschte Protein oder die gewünschte DNA ausgewählt wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Protein relativ zu einem Referenzprotein eine geänderte Funktion aufweist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Molekül oder die DNA-Protein-Fusion zusätzlich eine Ribonukleinsäure umfasst, die kovalent an die DNA gebunden ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Protein durch die Ribonukleinsäure kodiert wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Protein wenigstens 10 Aminosäuren, vorzugsweise 30 Aminosäuren, oder mehr bevorzugt 100 Aminosäuren umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die DNA über einen Peptidakzeptor kovalent an das Protein gebunden ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Population an Kandidaten-DNA-Protein-Fusionen wenigstens 105 unterschiedliche DNA-Moleküle, vorzugsweise wenigstens 1014 unterschiedliche DNA-Moleküle umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Selektionsschritt das Binden des gewünschten Proteins an einen immobilisierten Bindungspartner umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Verfahren zusätzlich das Wiederholen der Schritte (a) und (b) umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die DNA doppelsträngig ist.
  24. Verfahren zum Erzeugen einer DNA-Protein-Fusion, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer RNA, die kovalent an einen Peptidakzeptor gebunden ist; (b) Vernetzen eines Nukleinsäure-Primers mit dem Molekül aus Schritt (a); (c) Translatieren des RNA-Moleküls, um ein Protein herzustellen, wobei das Protein kovalent an den Peptidakzeptor gebunden ist; und (d) reverses Transkribieren der RNA durch Verlängern des Primers, um eine DNA-Protein-Fusion herzustellen.
  25. Verfahren nach Anspruch 2 oder 24, wobei das Protein der DNA-Protein-Fusion über einen Linker, der eine DNA umfasst, kovalent an die RNA gebunden ist, und wobei der Nukleinsäureprimer kovalent an den Linker gebunden ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Verfahren zusätzlich das Behandeln des Produkts aus Schritt (d) zum Entfernen der RNA umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Behandeln das In-Kontakt-Bringen des Produkts aus Schritt (d) mit RNase H unter Bedingungen umfasst, die ausreichend sind, um die RNA zu verdauen.
  28. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Nukleinsäure-Primer ein DNA-Primer ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Translationsschritt in vitro ausgeführt wird.
  30. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.
  31. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Nukleinsäure-Primer zusätzlich ein Photovernetzungsmittel umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Photovernetzungsmittel Psoralen ist.
  33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Nukleinsäure-Primer mit einem Oligonukleotid vernetzt ist, das an einen Peptidakzeptor gebunden ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Nukleinsäure-Primer an das RNA-Molekül hybridisiert ist und wobei der Vernetzungsschritt durch Photovernetzung ausgeführt wird.
  35. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Linker zusätzlich ein Polymer umfasst.
  36. Molekül, umfassend eine DNA, die über einen Peptidakzeptor kovalent an ein Protein gebunden ist, wobei das Protein durch besagte, kovalent gebundene DNA kodiert wird.
  37. Molekül nach Anspruch 36, wobei das Protein wenigstens 10 Aminosäuren umfasst.
  38. Molekül umfassend eine DNA, die kovalent an ein Protein gebunden ist, wobei das Protein wenigstens 10 Aminosäuren umfasst, wobei das Protein durch die kovalent gebundene DNA kodiert wird.
  39. Molekül nach Anspruch 36 oder 38, wobei das Protein vollständig durch die kovalent gebundene DNA kodiert wird.
  40. Molekül nach Anspruch 36 oder 38, wobei das Protein wenigstens 30 Aminosäuren oder vorzugsweise wenigstens 100 Aminosäuren umfasst.
  41. Molekül nach Anspruch 36 oder 38, wobei das Molekül zusätzlich eine Ribonukleinsäure umfasst, die kovalent an die DNA gebunden ist.
  42. Molekül nach Anspruch 41, wobei das Protein durch die Ribonukleinsäure kodiert wird.
  43. Molekül nach Anspruch 36 oder 38, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.
  44. Molekül nach Anspruch 36 oder 38, wobei die DNA doppelsträngig ist.
  45. Population aus wenigstens 105 DNA-Protein-Fusionen, wobei jede Fusion eine DNA umfasst, die kovalent an ein Protein gebunden ist, wobei das Protein durch die kovalent gebundene DNA kodiert wird.
  46. Population nach Anspruch 45, wobei die Population wenigstens 1014 Fusionen umfasst.
  47. Population nach Anspruch 45, wobei das Protein vollständig durch die kovalent gebundene DNA kodiert wird.
  48. Population nach Anspruch 45, wobei das Molekül oder die DNA-Protein-Fusion zusätzlich eine Ribonukleinsäure umfasst, die kovalent an die DNA gebunden ist.
  49. Population nach Anspruch 48, wobei das Protein durch die Ribonukleinsäure kodiert wird.
  50. Population nach Anspruch 45, wobei das Protein wenigstens 10 Aminosäuren, vorzugsweise 30 Aminosäuren oder mehr bevorzugt 100 Aminosäuren umfasst.
  51. Population nach Anspruch 45, wobei die DNA über einen Peptidakzeptor kovalent an das Protein gebunden ist.
  52. Population nach Anspruch 51, wobei der Peptidakzeptor Puromycin ist.
  53. Population nach Anspruch 45, wobei die DNA doppelsträngig ist.
  54. Fester Träger umfassend ein Array aus immobilisierten Molekülen, die jeweils eine DNA umfassen, die kovalent an ein Protein gebunden ist, wobei das Protein durch die DNA kodiert wird.
  55. Fester Träger nach Anspruch 54, wobei der feste Träger ein Mikrochip ist.
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