DE69935914T2

DE69935914T2 - Osteoinduktion von allogenen kortikalen knochentransplantaten über biopolymere die mit periostalen knochenzellen besiedelt wurden

Info

Publication number: DE69935914T2
Application number: DE69935914T
Authority: DE
Inventors: Kai-Uwe Brookline LEWANDROWSKI; Shrikar Malden BONDRE; Debra J. Princeton TRANTOLO; Maurice V. Quincy CATTANEO; Joseph D. Brookline GRESSER; Donald L. Belmont WISE
Original assignee: DePuy Mitek LLC
Current assignee: DePuy Mitek LLC
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2019-08-13
Also published as: CA2339119C; CA2339119A1; EP1104267B1; WO2000009043A1; EP1104267A4; JP2002522157A; US6899107B2; EP1795214A3; WO2000009043A9; EP1104267A1; US6551355B1; ATE360447T1; EP1795214A2; US20030109934A1; DE69935914D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Handhabung großer Schäden des Skeletts stellt nach wie vor eine besondere Herausforderung für orthopädische Chirurgen dar, insbesondere dann, wenn das Problem bei jungen Patienten auftritt, bei denen künstlichen Vorrichtungen und Gelenkimplantate mit großer Wahrscheinlichkeit frühzeitig versagen. Sowohl für zementierte^111,145 als auch für nicht zementierte^60,75,139 Vorrichtungen wurde gezeigt, dass sie bei jungen Erwachsenen und Kindern zu signifikanten und potenziellen Komplikationen führen.
Zum Beispiel gibt es eine starke Zunahme des Einsatzes von Allotransplantaten aus großen gefrorenen kortikalen Knochen in Gliedmaßen-erhaltenden Verfahren. Diese werden zur Behandlung von Knochentumoren^{19,26,44,48,77,104,105,107,112,146,159}, zur Reparatur eines massiven Knochenverlusts aufgrund einer traumatischen Verletzung^69,99, zur Behandlung einer avaskulären Nekrose und, zunehmend, misslungener Gelenkarthroplastiken, bei denen häufig ein extensiver Knochenverlust aufgrund einer Osteolyse beobachtet wird^{47,56,76,109,125,130} eingesetzt. Zwar liegt die Gesamterfolgsrate für Allotransplantate aus massiven kortikalen Knochen, gemessen anhand der Wiederaufnahme der Arbeit und der Beschäftigung mit relativ normalen Aktivitäten ohne Krücken oder Schienen, bei annähernd 75 – 85 %, doch nur 50 % dieser Patienten zeigen einen vollkommen unkomplizierten postoperativen Verlauf. Ungefähr ein Viertel der gesamten Gruppe benötigt Nachoperationen, wie eine autologe Verpflanzung oder ein erneutes Einsetzen von Platten aufgrund von Ermüdungsbrüchen^4,5,32,103 oder eines verzögerten Zusammenwachsens^{5,43,70,71,103-105,127}. Bei einigen Patienten ist ein Herausschneiden des Transplantats wegen einer Infektion^98,149,150, eine Reimplantation, eine langfristige Schienung oder, in bestimmten Fällen, eine Amputation erforderlich. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass immer noch Probleme mit diesem Verfahren existieren und dass, wenn die Technik breiter eingesetzt werden soll, sie extensiver überprüft und erheblich verbessert werden muss. Deshalb erscheint die Entwicklung einer biologischen Alternative eminent erstrebenswert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine biologische Alternative bereit, die in Verbindung mit künstlichen Vorrichtungen und Gelenkimplantaten zum Zwecke der Verminderung von Immunreaktionen und zur Unterstützung der Inkorporation von transplantiertem Knochen und, insbesondere, Transplantaten aus kortikalem Knochen in den eigenen Knochen des Empfängers des Transplantats eingesetzt werden soll. Dieser Ansatz kann zu einer Verbesserung des klinischen Erfolgs von Knochentransplantationen und zur Verringerung der Häufigkeit auftretender Komplikationen führen.
Bei einem Aspekt zielt die Erfindung auf ein biokompatibles Verbundtransplantat für die Reparatur kortikaler Knochen ab, das ein starres biokompatibles Substrat mit einer Beschichtung aus einem offenzelligen Polymerschaum aus einem biologisch abbaubaren Polymer, die mit Periostzellen des Empfängers besät ist, umfasst. Vorzugsweise ist das Substrat ein Knochensegment des Spenders, z. B. ein Allotransplantat aus einem kortikalen Knochen. Bei anderen Ausführungsformen kann das Substratmaterial des Allotransplantats ein resorbierbarer vorgehärteter Knochenzement, ein molekular verstärktes, sich durchdringendes Netzwerk, ein geformtes, biologisch abbaubares Polymer oder ein anderes ähnliches Material sein.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines biokompatiblen Verbundtransplantats bei der Herstellung eines Implantats zur Förderung der Osteoinduktivität und der Inkorporation eines biokompatiblen Knochen-Verbundtransplantats in einen Schaden bei einem Patienten, wobei das genannte biokompatible Verbundtransplantat über die folgenden Schritte erhalten werden kann:

(a) Erzeugen eines biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat, Erzeugen, in vitro, vom genannten Patienten stammender, kultivierter Periostzellen,
(b) Beschichten des genannten biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat mit einem offenzelligen Polymerschaum aus einem biologisch abbaubaren Polymer, und
(c) Besäen der genannten Beschichtung auf dem genannten biokompatiblen Substratmaterial für das Transplantat mit den genannten kultivierten Periostzellen unter Bildung eines biokompatiblen Verbundtransplantats.

Die Erfindung betrifft auch ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen Verbundtransplantats, das die Schritte (a), (b) und (c) umfasst.
Vorzugsweise ist die Polymermatrix ein offenzelliger Polymerschaum, der aus einem biologisch abbaubaren Polymer hergestellt ist, wie Poly(lactid-co-glycolid), das auch als Poly(milchsäure-co-glycolsäure) (PLGA; H[-OCHR-CO-]OH, R = H, CH₃) bezeichnet wird, und vorzugsweise einem PLGA mit einem Lactid : Glycolid-Verhältnis von 50 : 50, das aber auch jedes beliebige Lactid : Glycolid-Verhältnis von 0 : 100 (d. h. Poly(glycolid)) bis 100 : 1 (d. h. Poly(lactid)) aufweisen kann. Die Lactideinheit kann D,L-Lactid oder L-Lactid sein. Zu anderen biologisch abbaubaren Polymeren, die für die Erfindung nützlich sein können, gehören Polydioxanon, Poly(caprolacton), Polyanhydrid, Poly(orthoester), Poly(ether-co-ester), Polyamid, Polylacton, Poly(propylenfumarat), H[-O-CH(CH₃)-CH₂-O-CO-CH=CH-CO-]_nOH) und Kombinationen von diesen.
Die Dicke der Beschichtung aus dem Biopolymerschaum reicht vorzugsweise von ungefähr 0,5 bis ungefähr 1,5 Millimeter, bevorzugter von ungefähr 1 bis ungefähr 2,5 Millimeter. Die Adhäsion der Polymerschaumbeschichtung für das Transplantat aus dem kortikalen Knochen wird durch die Erzeugung einer oberflächlichen Rauheit des Knochens durch ein Schleifen, eine Laserablation oder ein anderes annehmbares Verfahren gefördert.
Die in dieser Erfindung eingesetzten Periostzellen sind solche, die zuvor entweder vom Empfänger des Transplantats oder von allogenen oder xenogenen Spendern gewonnen wurden. Die Periostzellen werden in einer Matrix in Medien kultiviert, die Induktoren der Osteogenese umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die die Knochenbildung induzierende Faktoren, die Kalzifizierung fördernde Enzyme, den Phosphoreinbau fördernde Enzyme, Vitamine und Prostaglandine umfasst.
Die Erfindung umfasst auch ein Allotransplantat aus einem kortikalen Knochen für die Reparatur von Knochenschäden, das Zellen umfasst, die durch das Dissoziieren von Periostgewebe, das Aussäen der Periostzellen auf und in eine biokompatible Matrix, die für die Reparatur des Schadens geeignet ist und die einen biologisch abbaubaren, offenzelligen Polymerschaum umfasst, und das Kultivieren unter Kulturbedingungen, die in der Lage sind, die Periostzellen zur Bildung von neuem Knochen im Empfänger des Transplantats zu bringen und dadurch die Inkorporation des Transplantats in den eigenen Knochen des Empfängers zu fördern.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen in Verbindung mit den folgenden begleitenden Zeichnungen offensichtlich werden:
1 ist eine grafische Darstellung, die die Auswirkung des PLA-Gehalts auf die prozentuale Zellanheftung in der Beschichtung der Biopolymermatrix eines erfindungsgemäßen biokompatiblen Verbundtransplantats zeigt.
2 ist eine grafische Darstellung, die die Dichte der Beschichtung aus dem Biopolymermatrixschaum als Funktion der Konzentration der für die Präparation verwendeten Lösung zeigt.
3A-3D sind rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen, die die Struktur der Beschichtung aus dem Biopolymermatrixschaum bei Vergrößerungen von 20x, 100x, 100x bzw. 500x zeigen; und
4A und 4B sind lichtmikroskopische Aufnahmen von Längsschnitten durch eine Rattentibia, in die ein erfindungsgemäßes Gerüst aus einem aktivierten Biopolymerschaum injiziert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Man weiß, dass die Inkorporation eines Knochentransplantats kooperative Wechselwirkungen zwischen der Empfängerstelle und dem Transplantat, die beide einzigartige und unbedingt erforderliche Beiträge bereitstellen^17,34,37,63, erfordert. Das Transplantat stellt eine Anzahl osteoinduktiver Wachstumsfaktoren, wie die TGF-β-artigen „Bone Morphogenetic Proteins" (BMP), und andere, nicht kollagenartige Proteine, die in der Matrix vorhanden sind ^{2,108,115,152,157,162,163,165}, sowie eine osteokonduktive Struktur, die die Bildung von neuem Knochen im Wirt unterstützt, bereit. Das Wirtsbett stellt eine entzündliche Reaktion bereit, die zu einem fibrovaskulären Stroms führt, das schließlich das Transplantat revaskularisiert und eine Quelle für die Rekrutierung und Transformation mesenchymaler Zellen in osteogene und chondrogene Zellen bereitstellt¹⁷.
Die Abfolge histologischer Ereignisse bei der Inkorporation massiver, nicht vaskularisierter segmentaler Knochenallotransplantate ist für Tiere ausführlich beschrieben worden^{13,14,16,18,151,153} Zunächst wird ein Hämatom gebildet, das der Ursprung für aus Blutplättchen stammende Wachstumsfaktoren, von anderen Wachstumsfaktoren und von Cytokinen ist. Üblicherweise wird durch das Implantationsverfahren und die Anwesenheit des Transplantats eine lokale entzündliche Reaktion stimuliert^13,14. Die Bildung des fibrovaskulären Stromas erfolgt innerhalb von Tagen. Das das Transplantat umgebende Bindegewebe übermittelt dem Transplantat vom Empfänger stammende Blutgefäße und osteogene Vorläufer³⁵. Die Einwanderung von Gefäßknospen in den kortikalen Knochen erfolgt gewöhnlich über bereits bestehende Hauers- oder Volkmann-Kanäle³⁵. Diese Kanäle werden durch die osteoklastische Aktivität erweitert, die die Neovaskularisationsreaktion begleitet. Eine osteoklastische Resorption des Knochenallotransplantats erfolgt üblicherweise ausgehend von der Oberfläche des Periosts und an der Verbindung mit dem Knochen des Wirts. Bei Allotransplantaten aus frischem gefrorenem kortikalem Knochen kann es sein, dass diese Resorption nur wenige Millimeter in das Transplantat voranschreitet^103,106. Nach der Initiation der Resorption des Transplantats mit nachfolgender Revaskularisation beginnt die Bildung von neuem Knochen. Diese beiden gleichzeitig ablaufenden Prozesse können zu einer adaptiven Remodellierungsantwort des Transplantats auf eine biomechanische Belastung führen^144,153. Vom klinischen Standpunkt betrachtet ist ein Transplantat erfolgreich inkorporiert worden, wenn sich die Grenzflächen von Wirt und Transplantat vereinigen und das Wirt-Transplantat-Knochenkonstrukt eine physiologische Belastung ohne einen Bruch oder Schmerzen toleriert.
Vom wissenschaftlichen Standpunkt betrachtet ist ein Knochenallotransplantat erfolgreich inkorporiert worden, wenn der ursprünglich transplantatierte Knochen vollständig durch neuen Knochen des Wirts ersetzt worden ist. Die Inkorporation von Knochenallotransplantaten kann deshalb als die gleichzeitige Revaskularisation und Substitution des Knochens eines nicht lebenden allogenen Transplantats durch den lebenden Knochen des autologen Wirts ohne einen wesentlichen Verlust an Stabilität definiert werden. Der resultierende Verbundkörper aus dem Transplantat und dem Knochen des Wirts kann physiologischen Belastungen standhalten und sich als Reaktion auf Veränderungen der Belastung oder auf Ermüdungsschäden selbst reparieren und remodellieren¹⁴³.
Experimentelle Daten legen nahe, dass die entzündliche Reaktion, die während der ersten Woche und bis zu drei Wochen beobachtet wird, höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer Wundheilung und einer unspezifischen Fremdkörperreaktion ist^13-16. Während sich bei autologen Knochentransplantaten diese Prozesse in Richtung einer Angiogenese und Osteogenese mit einer Revaskularisation und der Bildung von neuem Knochen auflösen, bleibt die entzündliche Antwort üblicherweise bei Knochenallotransplantaten bestehen, was zu einer kontinuierlichen Resorption führt.
Da Allotransplantate aus großen Knochensegmenten ein Depot von Antigenen darstellen, kann die voranschreitende Resorption eine langsame, aber stetige Freisetzung von Antigenen über einen langen Zeitraum bewirken^17,36,38,63. Das könnte eine persistierende Exposition gegen mehr Antigene begünstigen, die zu einer chronischen Immunreaktion führt.
Eine Störung der Initiation des Remodellierungszyklus aufgrund einer Beeinträchtigung osteoinduktiver Prozesse und der Revaskularisation aus dem umgebenden fibrovaskulären Stroms ist möglich.
Die Hauptkomplikationen für Allotransplantate aus einem massiven kortikalen Knochen (Brüche, kein Zusammenwachsen und Infektionen) waren Gegenstand vieler Übersichtsarbeiten oder kamen in ihnen vor. Diese Studien haben Hinweise darauf vorgelegt, dass man die Ursachen dieser Komplikationen immer noch kaum verstanden hat. Allerdings haben viele Forscher die Hypothese aufgestellt, dass wenigstens einige dieser Komplikationen immunologisch vermittelt sind^{33,38,39,49,53,64,117,118,143,161}. Es erscheint wahrscheinlich, dass Antigene auf den Knochenallotransplantaten eine spezifische Immunantwort stimulieren, die immunkompetente Zellen des Wirts aktiviert. In klinischen Studien wurde für diese Antwort beobachtet, dass sie sich schon einen Monat nach der Operation entwickelt^{33,41,116,147,154}. Diese Zellen sezernieren Cytokine, wie Interleukin 1 und die Tumornekrosefaktoren alpha und beta, die auch als potente Aktivatoren der osteoklastischen Zellentwicklungslinie bekannt sind und deshalb möglicherweise eine beschleunigte Knochenresorption stimulieren^{6,54,55,128,160,167,168}. Da die Knochenresorption erst erfolgen muss, ehe neuer Knochen gebildet werden kann, muss ein delikates Gleichgewicht zwischen den beiden gleichzeitig ablaufenden Prozessen aufrechterhalten werden, wenn das Transplantat revaskularisiert und durch den Knochen des Wirts ersetzt werden soll, ohne dass es zu einem erheblichen Verlust an Stabilität kommt. Es kann sein, dass es einen Zusammenhang zwischen dem Vorliegen einer chronischen Immunantwort und einer beschleunigten Resorption mit einem vorzeitigen mechanischen Versagen des Knochenallotransplantats gibt, aber es sind keine harten Daten verfügbar die zeigen, dass diese Ereignisse irgendeine Bedeutung für die Entwicklung klinischer Komplikationen haben. Jedoch sind Knochenallotransplantate eine ausgezeichnete Quelle für Antigene, und sie sind in der Lage, eine Immunantwort im Wirt zu stimulieren.
Deshalb sieht es so aus, dass Knochenallotransplantate generell vielen der gleichen Transplantationsprinzipien unterliegen wie alle anderen parenchymalen Organtransplantate. Jedoch sind Knochenallotransplantate mit verschiedenen gewebebezogen Eigenschaften assoziiert, die die Identifizierung einer Abstoßung schwieriger machen. Im Gegensatz zu parenchymalen Organen wie den Nieren, für die es leicht identifizierbare Funktionsmarker gibt, gibt es keine systemischen Marker, die es ermöglichen würden, die Abstoßung eines allogenen Knochentransplantats zu quantifizieren. Biopsien und Techniken wie eine bronchoalveoläre Lavage ermöglichen bei Lungentransplantaten eine sehr spezifische Diagnose einer Abstoßung. Allerdings sind Biopsien bei allogenen Knochentransplantaten sehr schwierig zu bewerten, da das Zellinfiltrat im Allgemeinen nicht einheitlich ist.
Außerdem ist es oft schwierig, Biopsieproben zu erhalten, oder das Transplantat ist unentbehrlich³⁰. Die Definition einer Abstoßung des Knochenallotransplantats wird deshalb gewöhnlich aus der Resorption des Knochentransplantats und einem vorzeitigen mechanischen Versagen aufgrund einer Ermüdung und einer fehlenden Inkorporation des Transplantats in den Knochen des Wirts abgeleitet.
Die Wirkung einer Abstimmung der Histokompatibilität auf die Inkorporation von Knochenallotransplantaten ist in kontrollierten Tierversuchen untersucht worden^{9,10,52,64,141,142,144}. Die humorale und die antikörperabhängige zeltvermittelte Zytotoxizität wurden von der Abstimmung der Gewebeantigene stärker beeinflusst als die zellvermittelte Immunität. Die Inkorporation von nicht vaskularisierten Allotransplantaten des Hundes wurde durch die Abstimmung der Gewebeantigene verstärkt. Das Ausmaß der Immunantwort wurde offenbar vom Ausmaß der Abstimmung der Gewebeantigene moduliert^141,142,144. Es wurde gefunden, dass das Volumen des fibrösen Bindegewebes in den intratrabekulären Räumen direkt proportional zur Antigenität des Transplantats war. Der prozentuale Anteil der Knochenoberfläche, der eine Remodellierung durchlief, war tendenziell umgekehrt proportional zur Immunogenität des Transplantats¹⁴⁴. Diese Daten aus einem experimentellen Tiermodell müssen mit Vorsicht interpretiert werden, und es kann sein, dass direkte Extrapolationen bezüglich des klinischen Ergebnisses unangebracht sind. Immer mehr Beobachtungen legen nahe, dass fehlende Übereinstimmungen des Major Histocompatibility Complex (MHC) eine schädigende Wirkung haben könnten, insbesondere auf das Schicksal massiver osteochondraler Allotransplantate.
Der Einfluss von Immunreaktionen auf diese großen Transplantate ist beim Menschen nicht klar. Für kleine frische, gefrorene^83,84 und gefriergetrocknete^41,135 Transplantate wurde gezeigt, dass sie zelluläre und humorale Immunantworten hervorrufen, aber diese beeinflussten die Inkorporation offenbar nicht. In Studien zu großen Transplantaten wurde für 85 % der Empfänger von Knochenallotransplantaten gefunden, dass sie eine Antikörperreaktion zeigten, wenn sie gegen verschiedne Zellen getestet wurden¹³¹, aber eine fast genau so große Zahl wurde in einer Kontrollgruppe gefunden, möglicherweise als Ergebnis des Erhalts von Transfusionen oder einer Schwangerschaft¹³¹. Zwei andere Studien konnten keine klare Korrelation zwischen dem Ausmaß der Histokompatibilität von Spender und Empfänger und klinischen Komplikationen zeigen^{88,94,116,147,148}. Deren Inzidenz steht deshalb wahrscheinlich eher mit einer Verzögerung der Inkorporation in Beziehung, die, wenigstens zum Teil, durch das Immunsystem vermittelt sein könnte.
Es muss jedoch angemerkt werden, dass diese Komplikationen multifaktoriellen Ursprungs sind, und dass die Auswirkung von Faktoren wie der Passform des Transplantats, der Anwendung von Vorrichtungen zur internen Fixierung, der Mechanik der Extremität, der Vaskularisation des Gewebebettes und des Einsatzes einer unterstützenden Bestrahlung oder Chemotherapie bei jeder Bewertung der Antwort der Transplantate auf die Immunreaktion des Wirts berücksichtigt werden muss. Die Untersuchungen haben bis jetzt keine zufriedenstellende Definition der Beziehung zwischen Immunreaktionen und dem Ergebnis von Knochenallotransplantationen beim Menschen liefern können, teilweise aufgrund einer fehlenden Berücksichtigung dieser Variablen.
In früheren Studien wurde versucht, die Inkorporation in den Wirt durch das Verändern der geometrischen Oberflächenkonfiguration des kortikalen Knochens zu verbessern^{3,45,46,122,133,137}. Der Mechanismus, über den derartige Veränderungen die Osteogenese und die Inkorporation förderten, schließt die folgenden Möglichkeiten ein : die größere Oberfläche des Knochentransplantats oder ein verbesserter Zugang zum Gefäßgewebe oder eine Kombination der beiden Faktoren. Frühere Studien haben aufgezeigt, dass die Geometrie eines Implantats das Ausmaß der Knochenbildung beeinflussen kann. Als solches wurde das osteokonduktive Potenzial von auf diese Weise behandelten Allotransplantaten aus einem kortikalen Knochen wenigstens teilweise auf dessen morphometrische Ähnlichkeit mit spongiösem Knochen, der hoch osteoinduktiv ist, zurückgeführt.
Die Entmineralisierung ist extensiv in dem Versuch untersucht worden, die Bildung von neuem Knochen in Knochenallotransplantaten zu fördern. Von diesem Ansatz weiß man, dass er zur Exposition von osteoinduktiven Faktoren der nicht aus Kollagen bestehenden Knochenmatrix¹⁶⁶, wie von TGF-β, Bone Morphogenetic Proteins (BMP)^{20,21,157,163-166} und von Sialoproteinen, einschließlich von Osteopontin²², Knochen-Gla-Protein²⁸, Osteocalcin^59,61,97,110 und anderen gegen die umgebenden weichen Gewebe führt. Diese Faktoren tragen zur Transformation mesenchymaler Zellen zu osteogenen und chondrogenen Zellen bei⁵⁰, die für die Induktion der Knochenresorption und die Bildung von neuem Knochen benötigt werden⁵¹. Außerdem nimmt man an, dass eine Entmineralisierung durch Säure zur Depletion zellulärer Komponenten im Inneren der Transplantate, die Transplantationsantigene exprimieren, führt¹⁵⁸. Da genügend Hinweise sowohl auf eine antikörpervermittelte als auch auf eine zeltvermittelte Zytotoxizität aus In-vivo- und In-vitro-Experimenten mit Knochenallotransplantaten vorliegen^{11,25,34,40,73,83,120,123,136}, die gezeigt haben, dass die primäre Antwort des Wirts auf das Knochenallotransplantat in erster Linie eine zellulär vermittelte Reaktion auf die MHC-codierten Zelloberflächenantigene ist, die von Zellen im Inneren des Allotransplantats getragen werden und von ansprechenden T-Lymphozyten im Wirt erkannt werden^{10,40,83,128,140}, kann die Wirkung einer Entmineralisierung auf die Inkorporation des Transplantats deshalb potenziell eine zweifache sein. Sie sollte die Osteoinduktion verbessern und die Abstoßung des Transplantats vermindern.
Gendler setzte vollständig entmineralisierte diaphysale allogene Stützen ein, die mittels eines mechanischen Bohrers perforiert worden waren⁴⁵. Demgegenüber verwendeten O'Donnell et al. entmineralisierten kortikalen Knochen des Schädeldachs¹²². Bernick et al. charakterisierten die induktiven zellulären Ereignisse in einem ähnlichen System³. Scanlon implantierte Stützallotransplantate aus einem entmineralisierten Oberschenkelknochen des Hundes in einem orthotopischen Modell¹³³. Die letzteren beiden Studien haben die Verwendung eines Erbium : Yttrium-Scandium-Gallium-Granat (Er: YSGG)-Lasers für das Durchbohren von Allotransplantaten aus kortikalem Knochen gezeigt, das die Porosität erhöhte und es ermöglichte, dass die Entmineralisierung in Bereiche fortschritt, die normalerweise für den Prozess der Entmineralisierung unzugänglich wären. Bei der Reimplantation könnten diese Transplantate deshalb osteogener als kortikale Transplantate ohne Löcher sein. Die Wirkung von Bohrlöchern und einer partiellen Entmineralisierung kann deshalb auf der Modifizierung von Allotransplantaten aus einem kortikalen Knochen zu einem poröseren Gerüst, das die Entwicklung fokaler Zentren einer Knochenresorption und die Bildung von neuem Knochen erleichtert, beruhen. Wenn das Nettoergebnis dieses Inkorporationsprozesses die Bildung von neuem Knochen begünstigt, wird das Transplantat schließlich vollständig durch den eigenen Knochen des Empfängers ersetzt werden.
Untersuchungen der Erfinder haben gezeigt, dass die Osteogenese in orthotopisch transplantierten Transplantaten aus kortikalem Knochen durch den Prozess einer partiellen Entmineralisierung und eine Laserablation gefördert werden konnte^87,92,93. Im Hinblick darauf, dass eine minimale partielle Entmineralisierung und eine Laserablation die Erhaltung der strukturellen Integrität ermöglichen könnten, während die osteoinduktiven Eigenschaften so verändert werden, dass das Einwachsen von neuem Knochen gefördert wird, repräsentiert dieses experimentelle Modell einen Fortschritt bezüglich des Verständnisses, wie die Osteogenese in Transplantaten aus kortikalem Knochen verbessert werden könnte. Eine groß angelegte tierexperimentelle Studie an Schafen bestätigte die verbesserte Inkorporation nach einer kontrollierten partiellen Entmineralisierung und dem Anbringen von Bohrlöchern mittels eines Lasers zur Verbesserung der Inkorporation großer Knochenallotransplantate.
Es traten jedoch Probleme wie eine beschleunigte Resorption des Transplantats mit einem Knochenverlust auf^89-91. Diese Beobachtungen beruhten wahrscheinlich auf spenderspezifischen Immunreaktionen, da es bei nicht abgestimmten Paaren aus Spender und Empfänger zu einem erheblichen Knochenverlust kam. Die Ergebnisse der Studie an den Schafen zeigten, dass die Entwicklung spenderspezifischer Alloantikörper durch den Entmineralisierungsprozess minimiert, aber nicht eliminiert wird, wie es mittels eines Crossmatching von Spender-T-Zellen mit Empfängerserum, das zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation gewonnen wurde, ermittelt wurde⁸⁹. Unterschiede bezüglich des Gewebetyps von Spender- und Empfängertieren wurden mittels eindimensionaler isoelektrischer Fokussierung von Klasse-I-Molekülen untersucht^78,79,129. Fehlende Übereinstimmungen wurden durch die parallele Gelanalyse von Proben von Spender und Empfängern und den Vergleich spezifischer Banden ermittelt. Fehlende Übereinstimmungen wurden mit dem Vorliegen einer Allostimulation in Beziehung gebracht. Von den Spender-Empfänger-Paaren mit fehlender Übereinstimmung der Transplantationsantigene waren alle Empfänger, die eine Immunantwort stimulierten, die Knochenallotransplantate, die eine exzessive Knochenresorption durchlaufen hatten. In laserperforierten und teilweise entmineralisierten Knochenallotransplantaten waren spenderspezifische Alloantikörper, wenn sie nach der Transplantation vorhanden waren, nach der vollständigen Inkorporation der Transplantate nicht mehr nachweisbar. Das legte nahe, dass Antigene des Transplantats effektiver präsentiert und prozessiert wurden, wenn die Allotransplantate eine beschleunigte Resorption durchliefen.
Die obige Beobachtung ist mit klinischen Daten zu einer früheren historischen klinischen Kontrollgruppe konsistent, deren Patienten Allotransplantate aus frischem gefrorenem Knochen erhielten. Sie unterstützt auch die Hypothese, dass Immunantworten auf Allotransplantationen von kortikalem Knochen nicht zu einem sofortigen Versagen des Transplantats führen, sondern stattdessen möglicherweise einer chronischen Abstoßung mit kontinuierlicher Knochenresorption den Weg bereiten.
Da die in der zuvor beschriebenen großen Studie an Schafen eingesetzten Transplantate einem großen Skelettschaden vergleichbar waren, wie er in der Klinik häufig bei der Resektion eines Knochentumors auftritt, stellten die Erfinder die Hypothese auf, dass der Schutz großer Allotransplantate aus kortikalem Knochen vor dem Immunsystem des Wirts durch das Aufbringen einer Oberflächenbeschichtung, die der Empfänger des Transplantats als „eigen" erkennet, das Überleben des Transplantats verbessert und deshalb zu einem besseren klinischen Ergebnis führt.
Diese Hypothese wird weiter durch eine frühere, von den Erfindern durchgeführte immunologische Studie untermauert, in der das Vorhandensein zytotoxischer Antikörper bei sechzehn Patienten nachgewiesen wurde, die achtzehn Allotransplantate aus großen gefrorenen Knochen erhalten hatten¹⁴⁸. Spenderspezifischen Antigene wurden durch das Testen von Empfängerseren gegen Spender-T-Zellen in einem Crossmatch-Test und durch das Testen der Reaktivität von Serum gegen eine Reihe von Zellen mit 38 verschiedenen Klasse-I-Determinanten identifiziert. Fehlende Übereinstimmungen bezüglich der HLA-Klasse-1 wurden durch eine Gewebetypisierung der Spender und Empfänger untersucht. Die Ergebnisse legten nahe, dass Allotransplantate aus großen gefrorenen Knochen bei ihrem Wirt häufig eine humorale Immunreaktion mit einer Antikörper-abhängigen Zytotoxizität hervorrufen.
Alle Patienten mit einem positiven Crossmatch entwickelten spenderspezifische zytotoxische Alloantikörper gegen allgemeine und persönliche Domänen des durch den HLA-A-, den HLA-B- und den HLA-C-Locus codierten MHC-Moleküls der Klasse I. Die zellvermittelte Immunität wurde über den Einsatz eines zellfreien ELISA zur Bestimmung der Serumspiegel des löslichen Teils des Interleukin-2-rezeptors (IL2R) untersucht. Dieser Test wurde gleichzeitig mit den Crossmatches durchgeführt, wobei Seren, die zuvor von den Empfängern erhalten worden waren, eingesetzt wurden. Zwar zeigte die Hälfte der Patienten mit einer Immunreaktion klinische Komplikationen, aber es konnte keine direkte Korrelation zwischen der antikörperabhängigen und der zellvermittelten Zytotoxizität und dem klinischen Ergebnis gefunden werden. Die kumulativen Hinweise sowohl aus der experimentellen Studie an Schafen⁸⁹ als auch der historischen klinischen Studie^88,148 legten nahe, dass die Immunreaktion von Empfängern auf ihre Knochenallotransplantate ihre klinischen Ergebnisse beeinflussen können.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem und erzielt einen Schutz des Transplantats durch das Beschichten der Oberfläche des Transplantatsubstrats mit den eigenen Periostzellen des Empfängers (autologe Zellen). Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren, durch das Immunreaktionen gegen das Material des Transplantatsubstrats, z. B. kortikale Knochen einer Leiche, minimiert werden können und gleichzeitig das osteoinduktive Potenzial des Transplantats verbessert werden kann. Es werden auch andere Substratmaterialien, wie ein resorbierbarer vorgehärteter Knochenzement, ein molekular verstärktes, sich durchdringendes Netzwerk und ein geformtes, biologisch abbaubares Polymer in Betracht gezogen. Weiterhin stellt die Erfindung neue Typen von Knochentransplantaten bereit, die besser und schneller mit dem Wirtsknochen verheilen, wodurch langfristige Komplikationen wie Brüche, fehlende Verbindungen, Infektionen und Abstoßungen eliminiert werden. Die erfindungsgemäßen zusammengesetzten biokompatiblen Knochentransplantate sind so modifiziert, dass sie eine osteoinduktive Oberfläche aufweisen, die der Körper des Empfängers des Transplantats als sein eigenes Gewebe erkennt und deshalb nicht abstößt. Die osteoinduktive Oberflächenmodifikation umfasst eine Beschichtung aus einem porösen Biopolymer, das mit Periostzellen besät wurde, die zuvor aus dem Empfänger des Transplantats gewonnen wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige und einzigartige Oberflächencharakteristika bei einem neuen Typ von Knochentransplantat bereit, der die Entwicklung einer Immuntoleranz im Empfänger gegenüber dem Transplantat unterstützt. Die Entwicklung einer Immuntoleranz gegenüber dem Transplantat führt zu einer beschleunigten Inkorporation und besseren klinischen Ergebnissen. Als solche stellt die Verwendung von Periostzellen des Empfängers des Knochentransplantats einen neuen Ansatz dar.
Zu den Vorteilen der erfindungsgemäßen Materialien und Verfahren gegenüber bisherigen Techniken der Knochentransplantation gehört die minimale Gewebeschädigung des Transplantats, da keine weitere Verarbeitung mehr erforderlich ist. Die Verwendung der eigenen Periostzellen des Empfängers führt zur schnellen Bildung einer Manschette aus Periostknochen um das Knochentransplantat herum. Diese Manschette aus Periostknochen schützt nicht nur das Transplantat vor dem Immunsystem des Empfängers, sondern es fördert auch seine Inkorporation über eine erhöhte Osteogenese und eine beschleunigte direkte Knochenbildung.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Vorteile der vorliegenden Erfindung und zur Unterstützung eines normal qualifizierten Fachmanns bei ihrer Herstellung und Anwendung gebracht. Diese Beispiele sollen den Umfang der Offenbarung ansonsten auf keinerlei Weise einschränken.
BEISPIEL I
Herstellung eines Transplantatsubstratmaterials
Das Transplantatsubstratmaterial kann jedes beliebige starre, biokompatible Substrat sein, das in einer geeigneten Form hergestellt oder zu dieser geformt werden kann. Bei einer Ausführungsform ist das Transplantatsubstrat ein Stück Knochen von einem Spender, z. B. einer Leiche, das von weichem Gewebe und dem Periost befreit wurde und aus dem das Mark mit Saline unter Druck entfernt wurde.
Ein weiteres mögliches Transplantatsubstratmaterial ist ein resorbierbarer vorgehärteter Knochenzement. Ein derartiger Knochenzement umfasst ein hydrolysierbares Biopolymer, das ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen enthält, wie Poly(propylenfumarat) (PPF), was es dem Biopolymer ermöglicht, sich mit einem geeigneten Vernetzungsreagens zu vernetzen, ein Vernetzungsmittel, das ein Vinylmonomer wie N-Vinyl-2-pyrrolidon umfasst, einen Initiator wie Benzoylperoxid zur Auslösung der Vernetzung, einen anorganischen Füllstoff mit begrenzter Löslichkeit, der dazu dienen kann, die Stabilität des gehärteten Zements zu erhöhen, und der auch die Heilung fördern kann, wie Hydroxyapatit (auch bekannt als Hydroxylapatit), ein Calciummineral, das stark der anorganischen Komponente des Knochens ähnelt und von dem auch bekannt ist, dass es osteokonduktiv ist, ein relativ lösliches biokompatibles Material, vorzugsweise ein Calciumsalz einer organischen Säure, wie z. B., ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Calciumacetat, Calciumpropionat oder Calciumgluconat oder eine beliebige Kombination von diesen, die in Gegenwart von Gewebeflüssigkeiten durch ein Auflösen und die Diffusion aus der Implantationsstelle hinaus eine Porosität erzeugen, gegebenenfalls Beschleuniger und Inhibitoren, die zur Steuerung der Aushärtungsgeschwindigkeit zugegeben werden, und gegebenenfalls andere Komponenten, einschließlich von Verstärkungshilfen wie Fasern, zur weiteren Stabilisierung der Vorrichtung.
Nach dem Kompoundieren entsprechend der obigen Formulierung kann der Knochenzement ex vivo in Formen, deren Form dem Knochenstück, das ersetzt werden soll, angenähert ist, zu einer knochenähnlichen Härte gehärtet werden. Alternativ kann der Knochenzement nach dem Aushärten maschinell in die gewünschte Form gebracht werden.
Außerdem kann ein molekular verstärktes, sich durchdringendes Netzwerk als Substratmaterial für das Allotransplantat nützlich sein. Bei dieser Ausführungsform ist das Substrat ein resorbierbares Verbundmaterial, das zwei resorbierbare, hydrolysierbare Biopolymere umfasst, von denen eines eine ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung enthält, die es ihm ermöglicht, in Gegenwart des anderen unter Bildung eines molekular verstärkten, sich durchdringenden Netzwerks vernetzt zu werden. Dieses Material umfasst ein hydrolysierbares Biopolymer, das eine ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung enthält, wie Poly(propylenfumarat) (PPF), die es dem Biopolymer ermöglicht, von einem geeigneten Vernetzungsmittel vernetzt zu werden, ein hydrolysierbares Biopolymer wie Poly(lactid-co-glycolid), vorzugsweise mit einem Lactid : Glycolid-Verhältnis von 70 : 30 bis 90:10, ein Vernetzungsmittel, das ein Vinylmonomer wie N-Vinyl-2-pyrrolidon (VP) sein kann, einen Initiator wie Benzoylperoxid und gegebenenfalls Beschleuniger wie N,N-Dimethyl-p-toluidin und Inhibitoren wie Hydrochinon.
Die Polymere können zunächst in einer Mischung eines niedrig siedenden Lösemittels, wie Aceton, und des Vernetzungsmittels VP gelöst werden, und danach kann das Lösemittel durch ein kontrolliertes Abdampfen entfernt werden, wobei das hochsiedende VP in der Polymermischung zurückbleibt. Dieses Kunststoffmaterial wird druckgeformt, und die Form wird zur Bewirkung der Aushärtung erhitzt. Nach dem Aushärten kann es in seiner fertigen Form vorliegen, oder es kann noch eine maschinelle Bearbeitung erfordern. Alternativ können die beiden Polymere in dem Vernetzungsmittel direkt, ohne die Verwendung eines niedrig siedenden Lösemittels, gelöst werden.
Das Substratmaterial für das Allotransplantat kann auch passenderweise ein geformtes, biologisch abbaubares Polymer sein, wie Poly(lactid-co-glycolid) X : Y (PLGA), wobei X : Y das Molverhältnis der Lactid- zu den Glycolideinheiten, die das PLGA ausmachen, ist. Die Lactideinheit der Knochenersatzes aus PLGA kann D,L-Lactid oder L-Lactid sein, und das X : Y-Verhältnis kann von 0 : 100, d. h. Poly(glycolid), bis 100: 1, d. h. Poly(D,L-lactid) oder Poly(L-lactid), variieren. Das PLGA kann dann vor dem Beschichten zur gewünschten Form geformt und, wenn es erforderlich ist, maschinell in die endgültige Form gebracht werden.
BEISPIEL II
Beschichten des Allotransplantatsubstrats mit einem Polymerschaum
Die Oberfläche des gehärteten Materials oder des Transplantatsubstrats kann zur Sicherstellung einer besseren Befestigung des Schaums aufgeraut werden. Das Aufrauen kann mechanisch erreicht werden, wie durch ein Schleifen oder Sandstrahlen. Alternativ können Löcher mit einem Durchmesser von unter 1 mm und Abständen von ungefähr 5 mm sowohl axial als auch radial durch den Knochen oder bis zu einer gewissen Tiefe in den Knochen gebohrt werden. Das Substrat kann auch zur Veränderung der Oberflächentopografie Laserpulsen ausgesetzt werden. Ein Er: YAG-Laser kann auch für das Bohren von Löchern entweder teilweise oder vollständig durch das Substrat zur Sicherstellung einer besseren Befestigung des Schaums eingesetzt werden.
Der zusätzliche Einsatz eines Laserbohrens und einer partiellen Entmineralisierung, in Kombination mit durch ein Gewebeengineering erzeugten Oberflächenmodifikationen, sollte die Inkorporation aus zwei Gründen weiter verbessern. Die das Knochenallotransplantat umgebende entmineralisierte Knochenmatrix sollte eine hoch osteoinduktive Matrix für das Einwachsen von Periostzellen aus dem Schaum in das Allotransplantat bereitstellen. Zweitens kann es Wachstumsfaktoren aus der entmineralisierten Knochenmatrix freisetzen, die die Ausbreitung von Periostzellen aus dem Schaum in das Transplantat stimulieren. Somit ist die Weiterverarbeitung von Allotransplantaten aus einem kortikalen Knochen über den Einsatz einer durch ein Gewebeengineering erzeugten Oberflächenmodifikationen mit früheren Versuchen zur Verbesserung ihrer Inkorporation in Wirtsknochen konsistent.
Frühere Studien haben versucht, die Inkorporation in den Wirt über das Verändern der geometrischen Oberflächenkonfiguration des kortikalen Knochens zu verbessern^{3,45,46,122,133,137}. Der Mechanismus, über den das Vorhandensein von Laserlöchern die Osteogenese und die Inkorporation in teilweise entmineralisierte Transplantate förderte, beinhaltet die folgenden Möglichkeiten : die größere Oberfläche des teilweise entmineralisierten Knochens oder die erhöhte Zugänglichkeit für Gefäßgewebe oder eine Kombination der beiden Faktoren. Frühere Studien haben aufgezeigt, dass die Geometrie eines Implantats das Ausmaß der Knochenbildung beeinflussen kann. Als solches wurde das osteokonduktive Potenzial von derart behandelten Allotransplantaten aus einem kortikalen Knochen, wenigstens teilweise, ihrer morphometrischen Ähnlichkeit mit spongiösem Knochen zugeschrieben. Außerdem würde die Entmineralisierung allein eine geometrische Oberflächenkonfiguration ergeben, die im Vergleich mit spongiösem Knochen weniger günstig für das für das Einwachsen von Knochen ist, da kortikaler Knochen weniger porös ist und ein vergleichsweise niedriges Verhältnis von Oberfläche zu Volumen hat. Die Auswirkungen von Bohrlöchern und einer partiellen Entmineralisierung könnten deshalb auf der Modifizierung von Allotransplantaten aus einem kortikalen Knochen zu einem poröseren Gerüst beruhen, das die Entwicklung fokaler Zentren einer Knochenresorption und die Bildung von neuem Knochen erleichtert.
Wenn es gewünscht ist, kann das Transplantat vor oder nach dem Aufrauen durch eine Inkubation in verdünnter Salzsäure bei Raumtemperatur partiell entmineralisiert werden. Diese Behandlung bewirkt eine Entmineralisierung bis zu einer Tiefe, die proportional zur Behandlungsdauer ist. Nach der Behandlung werden die Knochen zur Entfernung der Säure mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen. PBS unter Druck wird zur Entfernung des Marks eingesetzt. Der Ansatz der Verwendung einer Salzsäureentmineralisierung zur Oberflächenmodifizierung wurde gewählt, da bekannt ist, dass er zur Exposition osteoinduktiver Faktoren der nicht aus Kollagen bestehenden Knochenmatrix führt¹⁶⁶, wie von TGFβ, Bone Morphogenetic Proteins (BMP)^{21,22,157,163-165} und von Sialoproteinen einschließlich von Osteopontin²², Knochen-Gla-Protein²⁸, Osteocalcin^59,61,97,110 und anderer gegen die umgebenden weichen Gewebe führt. Diese Faktoren tragen zur Transformation mesenchymaler Zellen in osteogene und chondrogene Zeilen bei²², die für die Induktion der Knochenresorption und die Bildung von neuem Knochen benötigt werden51. Für die Entkalzifizierung der Oberfläche von Allotransplantaten aus einem kortikalen Knochen ist gezeigt worden, dass sie deren Inkorporation verbessert, aber Probleme, wie eine Knochenresorption, die schneller als die Bildung von neuem Knochen war, und Immunreaktionen, blieben bestehen.
Aus In-vivo- und In-vitro-Experimenten mit Knochenallotransplantaten liegen genügend Hinweise auf sowohl eine antikörpervermittelte als auch eine zellvermittelte Zytotoxizität vor^{10,25,33,34,73,83,120,123,136}. Diese Studien haben gezeigt, dass die primäre Antwort des Wirts auf das Knochenallotransplantat vorwiegend eine zellvermittelte Antwort auf die MHC-codierten Zelloberflächenantigene ist, die von Zellen im Inneren des Allotransplantats getragen und von reagierenden T-Lymphozyten des Wirts erkannt werden. Der Einsatz einer Entmineralisierung bei der Verarbeitung von Knochenallotransplantaten kann zweierlei Wirkungen haben. Er sollte die Inkorporation durch die Verstärkung ihres osteoinduktiven Potenzials verbessern. Außerdem sollte er die Immunogenität des Transplantats vermindern, da für Spülungen des Transplantats mit Lösungen wie Salzsäure, Triton X oder anderen entfettenden Lösungen gezeigt wurde, dass sie den Gehalt des Transplantats an zellulären Antigenen vermindern.
Der Polymerschaum wird durch das Lösen des getrockneten biokompatiblen Polymermaterials, z. B. PLGA, vorzugsweise Poly(D,L-lactid-co-glycolid) 50 : 50, in einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise Eisessig, hergestellt. Wie in der 1 gezeigt ist, beeinflusste ein hoher Milchsäuregehalt die Aussaat der Zellen negativ. Im Einzelnen heftete sich im Vergleich zu einem Gerüst aus 0 % PLA/100 % PGA bei Verwendung eines Gerüsts aus 75 % PLA und 25 % PGA weniger als die Hälfte der Zellen an. Das legt nahe, dass das Minimieren des Milchsäuregehalts den Prozess der Zellaussaat optimieren und das osteogene Potenzial der Konstrukte maximieren würde. Auf der Basis dieser kumulativen Daten erscheint es vernünftig, die Schaummanschette aus PLGA 50 : 50 herzustellen. Diese Formulierung wäre aus der Perspektive der Polymertechnik geeignet, da sie, neben ihrer hohen Effektivität bezüglich der Zellaussaat, sich etwas langsamer zersetzen wird, eine erwünschte Eigenschaft, da die vom Schaum bereitgestellte große Oberfläche eine schnellere hydrolytische Zersetzung fördert.
Die Konzentration der Lösung bestimmt sowohl die Dichte als auch die Porengrößeverteilung der fertigen Schaumbeschichtung, wie in der Tabelle 1 gezeigt ist. Das Verändern der Porengröße hat einen starken Einfluss auf die Oberfläche, die für die Aktivität der Periostzellen zur Verfügung steht. Die Porosität, die Porengröße und die Porenstruktur sind wichtige, mit der Nährstoffversorgung transplantierter und regenerierter Zellen assoziierte Faktoren. Poren mit kleinem Durchmesser sind vorzuziehen, damit hohe Verhältnisse von Oberfläche zu Volumen erhalten werden, solange die Porengröße größer als der Durchmesser einer Zelle in der Suspension ist. Für den Fall der Knochenregeneration gibt es eine für das maximale Einwachsen von Gewebe optimale Porengröße, die bei ungefähr 200 bis ungefähr 400 μm liegt (BOYAN et al., 1996). Die Kenntnis sowohl des Transports von Wachstumsfaktoren als auch des Transports von Zellen in die Schaummatrix ist für die Optimierung der Geometrie der Schaummanschette erforderlich. Für das Besäen der Oberfläche eines idealen porösen Mediums wird erwartet, dass die Zellzahl logarithmisch mit der Tiefe abnimmt, was nahe legt, dass die Masse der Periostzellen möglicherweise auf die ersten wenigen hundert Mikrometer der Tiefe der Schaummanschette beschränkt ist (CATTANEO et al., 1997).
Das gewählte Transplantatsubstrat wird dann gleichmäßig mit der Polymerlösung beschichtet. Das kann entweder durch das Eintauchen des Substrats in die Lösung oder durch das Aufmalen der Lösung auf das Substrat erreicht werden. Es können auch andere Verfahren, wie ein Aufsprühen der Lösung auf das Substrat, eingesetzt werden. Der Vorteil des Tauchbeschichtens besteht darin, dass die Lösung durch ein schnelles Anlegen und Absetzen eines Vakuums in die Poren oder Hohlräume, die durch das Aufrauen oder Bohren gebildet wurden, gesaugt werden kann.
Sobald das Substrat vollständig beschichtet ist, wird es aus der Lösung genommen und in einen gekühlten Lyophilisierungskolben gegeben, der in einen Gefrierschrank gegeben wird, bis die Schicht aus der Polymerlösung gefroren ist. Der beschichtete Knochen wird dann zur Entfernung des Lösemittels, z. B. Eisessig, lyophilisiert, wobei das PLGA in Form einer Schicht aus einem offenzelligen Schaum auf dem Substrat zurückbleibt.

Die Dicke der PLGA-Beschichtung kann bei 0,5 bis 2,5 mm liegen, in Abhängigkeit von der Konzentration der Lösung und der Dicke der Flüssigkeitsschicht, die nach der Entnahme aus der Polymerlösung am Substrat haftet. Eine bevorzugte Dicke ist ungefähr 1,0 bis 2,0 mm. Tabelle 1 : Dichte des PLGA-Schaums in Abhängigkeit von der PLGA-Konzentration in einer Eisessiglösung

Konzentration der Lösung, mg/ml	Dichte des Schaums, mg/cm³	Konzentration der Lösung, mg/ml	Dichte des Schaums, mg/cm³
30,0	46,3±4,9	50,0	70,5±1,7
32,8	47,2	66,7	86,7±1,1
40,0	61,0	74,7	98,0
42,9	66,3	130,0	158,0
45,0	67,3±2,3

Die Struktur der Polymerbeschichtung ist die eines offenzelligen Schaums mit einer faltblatt- oder plättchenartigen Struktur. Diese Struktur ist in den rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der 3A-3D gezeigt, die bei einer Vergrößerung von 20x, 100x, 100x bzw. 500x aufgenommen wurden.
Der Ansatz der Verwendung eines bioresorbierbaren Schaums mit einer Struktur aus offenen Fenstern als Träger durch ein Gewebeengineering hergestellter Oberflächenmodifikationen leitet sich von der Tatsache ab, dass Knochen ein beträchtliches Potenzial zur Regeneration hat. Tatsächlich wird er von einigen als das prototypische Modell für eine Geweberegeneration angesehen (LAURENCIN 1996, REDDI 1998). Die Entwicklung von Verbundstrukturen aus extrazellulärer Matrix und Stammzellen, die auf regulatorische Signale ansprechen, steht im Zentrum der künstlichen Erzeugung von Skelettgeweben und ist das Hauptziel dieses Vorhabens. Tatsächlich basieren führende Strategien zur künstlichen Erzeugung und Regenerierung von Skelettgeweben zum großen Teil auf Beobachtungen einer lokalen Knocheninduktion nach der Implantation von entmineralisierter Knochenmatrix an subkutane Stellen. Diese Modelle haben die Untersuchung der sequenziellen Morphogenese der Extremitäten möglich gemacht und die Isolierung von Knochenmorphogenen, wie der „Bone Morphogenetic Proteins" (BMPs), aus der entmineralisierten Matrix ausgewachsener Knochen ermöglicht. BMPs initiieren und fördern die Chondrogenese und Osteogenese und halten sie aufrecht. Deshalb erscheint es vernünftig, unseren biologisch abbaubaren Schaum als ein Gerüst zu betrachten, der als Träger für Zellen und Gewebe fungiert, wobei auf die Superstrukturierung des Materials beim Design oberflächemodifizierter und durch ein Gewebeengineering hergestellter Allotransplantate aus einem kortikalen Knochen besonderer Wert gelegt wird. Deshalb wird eine biologisch abbaubare Superstruktur, die optimale Bedingungen bezüglich der räumlichen Verhältnisse und der Nährstoffversorgung für die Erhaltung von Zellen bereitstellt, über die Anordnung von Strukturelementen (z. B. Poren oder Fasern) zur Variierung des Systems der Zell-Zell-Kontakte (WINTERMANTEL 1996) künstlich hergestellt. Zum Beispiel werden dreidimensionale Matrices aus Zellen und Polymer für ein Gewebeengineering benötigt, die es Osteoblastenzellen ermöglichen, ihre phänotypischen Eigenschaften zu bewahren und eine mineralisierte Matrix zu bilden, wenn sie auf die Polymeroberfläche ausgesät werden (PUELACHER 1996, RIVARD 1996).
BEISPIEL III
Modellsystem der Kultur von Periostzellen
Der Ansatz der Verwendung von Periostzellen des Empfängers leitet sich von der Beobachtung ab, dass diese Zellen leicht aus Periostgewebe kultiviert werden können (KOSHIHARA et al., 1989, NAKAHARA et al., 1990). Außerdem wachsen sie extrem gut in synthetischen polymeren sowie in natürlichen, kollagenhaltigen Matrices, und sie werden deshalb als ein extrem osteoinduktives Material angesehen (UCHIDA et al., 1988). Parallel zu Versuchen, Hautfibroblasten für die In-vitro-Vermehrung autologer Gelenkknorpelzellen heranzuziehen (BRITTBERG 1994) erscheint es logisch, Periostzellen des zukünftigen Empfängers eines Knochenallotransplantats zu nehmen und sie in vitro zum Zwecke eines Gewebeengineering zu vermehren. Breitbart et al. (1998) haben bereits die Durchführbarkeit einer Verwendung von Periostzellen für die Reparatur von Schädelknochendefekten durch ein Gewebeengineering gezeigt. In Analogie dazu sollte ein neuer Typ eines durch ein Gewebeengineering unter Verwendung von Periostzellen des zukünftigen Empfängers hergestelltes Knochenallotransplantat eine verbesserte Inkorporation und signifikant niedrigere Sensibilisierungsraten zeigen. Sowohl die antikörpervermittelte Immunität als auch die zeltvermittelte Zytotoxizität sollten einfach über die Bildung einer dichten Manschette aus autologem Periostknochen, die das Knochentransplantat umgibt, vermindert werden.
Die Durchführbarkeit eines derartigen Gewebeengineering-Ansatzes hängt von der Fähigkeit ab, eine Population von Zellen zu gewinnen, die osteoblastenartige Funktionen aufweisen oder entwickeln. Für den Zweck dieser Studie wurde als Quelle für die Zellen das Periost langer Knochen gewählt, und zwar wegen 1) der relativ leichten chirurgischen Verfügbarkeit und 2) der bekannten osteogenen Eigenschaften seiner Zellen. Das Periost selbst ist dafür bekannt, dass es eine kritische Rolle bei der Heilung von Brüchen und der Kallusbildung spielt (UTVAG 1996, ARO 1990), die vermutlich zellvermittelt ist. Die vom Periost stammenden Zellen sind zur Bildung von Knochen an subkutanen Orten in der Lage, und zwar entweder allein (NAKAHARA 1991) oder wenn sie auf Substrate aus keramischem Calciumphosphat (NAKAHARA 1992) oder polymerem PGA (KIM 1995) ausgesät werden. Weiterhin wurde die Heilung von Schäden kritischer Größe des Schädels (VACANTI 1995) und des Oberschenkels (PUELACHER 1996, BREITBART 1998) mit Hilfe von Periostzellen, die auf PGH-Gerüste gesät wurden, gezeigt. Für Zellen aus dem Periost ist bekannt, dass sie sowohl ein osteogenes (NAKAHARA 1991) als auch ein chondrogenes (RUBAK 1982) Potenzial haben, und der Prozess der Knochenbildung aus Periostzellen beinhaltet einen Übergang durch eine knorpelartige Phase (KIM, 1995). Studien, die die Verwendung von Chondrozyten auf Polymergerüsten zur Ausfüllung von Knochenschäden untersuchten, haben die Bildung von stabilem Knorpel, der keinen Knochen erzeugt, gezeigt (KIM 1994). Periostzellen, die in das gleiche Material an der gleichen Stelle gegeben werden, reparieren den Schaden letztlich mit Knochen (VACANTI 1994).
Im Hinblick auf diese Befunde erscheint das Beschichten kryopräservierter Knochen mit PLGA-Schaum, gefolgt von einem Besäen mit Periostzellen, als optimaler Prozess. Dieser Prozess nützt die anfängliche Stabilität und Geometrie des Allotransplantats aus, wobei er gleichzeitig die Resorption des transplantierten Knochens beschleunigt und die Immunreaktion gegen fremdes Gewebe minimiert.
Es wurden intakte Tibiae männlicher Sprague-Dawley-Inzuchtratten gewonnen und zur Entwicklung eines Modellsystems einer Periostzellkultur eingesetzt. Unter sterilen Bedingungen wurde das Periost exzidiert und in Stücke von 2 mm × 2 mm geschnitten. Einzelne Stücke wurden zur Ermöglichung einer Anheftung an Kunststoff 10-20 Minuten in 6-Well-Kulturschalen gegeben und zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) mit Antibiotika gewaschen. Alternativ können Perioststücke zur Induktion einer Anheftung des Gewebes an das Polymer direkt auf die Oberseite des PLGA-Gerüsts gegeben werden, und die Gewebe/Polymer-Konstrukte können dann in 6-Well-Kulturschalen gegeben und zweimal mit Antibiotika, z. B. 10000 U/mL Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin, gewaschen werden. Anschließend wurden Periostproben, in Kulturschalen oder auf Gewebe/Polymer-Konstrukten, mit 3 ml Medium 199 mit 10 % FKS, 20 mg/ml Ascorbat und Antibiotika bedeckt. Die Wanderung von Zellen aus den Periostproben wird täglich registriert, und alle 3 Tage wird frisches Medium zugegeben. Die Wanderung von Zellen aus den Periostproben wird gestoppt, wenn eine Konfluenz von 60-80 % erreicht worden ist. Die Zellen werden mit 0,05 % Trypsin und 0,53 mM Na₂EDTA von den Platten abgelöst und entweder in einer Dichte von 2 500 Zellen/cm² erneut ausgesät oder auf Polymergerüste gesät. Das ermöglicht die Erzeugung von genügend Material für das Besäen der Schaumbeschichtung von Knochentransplantatsubstraten.
BEISPIEL IV
Transplantationsuntersuchungen an Tieren
Adulte männliche Sprague-Dawley-Ratten werden als Tiermodell für den Empfänger eingesetzt. Die Knochentransplantate bestehen aus 8 mm langen Diaphyseabschnitten, die aus dem mittleren Teil der Tibiae von Wistar-Ratten, die als Spender dienten, exzidiert werden. Die Transplantate werden von den anhaftenden weichen Geweben, einschließlich des Periosts, befreit. Das Mark wird durch wiederholte Waschungen mit Saline entfernt. Die Transplantate werden bis zu ihrer Verwendung bei –80 °C gelagert. Wie oben beschrieben werden die Transplantate mit dem Polymer beschichtet und dann mit Periostzellen besät. Unter Einsatz eines von den Erfindern etablierten Modells^92,93 werden die Transplantate orthotopisch implantiert, indem ein acht mm langer diaphysaler Abschnitt aus der Tibia entfernt und eines der experimentellen Transplantate implantiert wird. Das Periost des Wirtbettes wird entfernt, und das Knochenmark wird aus den Enden des Wirtsknochens ausgewaschen. Die Fixierung wird mit einem K-Draht von 0,062 Zoll mit Gewinde als intramedullärem Stab erreicht. Die Tiere werden vier oder sechzehn Wochen nach der Operation getötet und für die mechanische Testung oder die histologische Analyse der Transplantate eingesetzt. Die Transplantate werden mittels hochauflösender Radiografie, Zwei-Spektren-Röntgenabsorptiometrie (DXA), Histologie und Histomorphometrie untersucht.
Zur Demonstration der Eignung des bioresorbierbaren Schaums auf PLGA-Basis für das Einwachsenlassen von Knochen vor seinem Einsatz für das Besäen mit Periostzellen wurde eine initiale Studie zur In-vivo-Biokompatibilität an Ratten mittels des Tibia-Schaden-Modells von Gerhart et al. durchgeführt. Der Schaum auf PLGA-Basis (PLGA 85 : 15) wurde mittels einer 18G-Nadel in einen Tibia-Schaden (ein Bohrloch von 1 mm Durchmesser) injiziert, der in männlichen Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Breeding Laborstories) von ungefähr 200 Gramm erzeugt worden war. Die Gruppe, der der Schaum injiziert wurde, wurde mit der scheinoperierten Gruppe mit einem Bohrloch, aber ohne Implantat, verglichen. Gruppen von 8 Tieren wurden 1, 3, 5 und 7 Woche(n) nach der Operation getötet. Somit wurden insgesamt 64 Ratten in 8 Gruppen operiert. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Schnitte aller Proben wurden zur Bestimmung der Biokompatibilität im Frühstadium mikroskopisch untersucht. Die histologische Untersuchung dieser Schnitte zeigte die Bildung von neuem Geflechtknochen bei den Tieren, denen der Schaum auf PLGA-Basis injiziert worden war, und zwar bereits eine Woche nach der Operation (siehe mikroskopische Aufnahmen, 4a und 4b). Die 4a zeigt, dass das Bohrloch in einer Rattentibia, dem ein Schaum auf der Basis von PLGA 85 : 15 injiziert worden war, vollständig mit neugebildetem Geflechtknochen ausgefüllt war. Die 4B zeigt zwischen den Bälkchen des neugebildeten Geflechtknochens Reste des Schaums auf PLGA-Basis, der aktiv resorbiert wird.
Diese Ergebnisse zeigten, dass der bioresorbierbare Schaum auf PLGA-Basis in der Lage ist, als ein Gerüst für das Einwachsen von Knochen zu dienen, und dass er für das Besäen mit Periostzellen geeignet ist. Der Knochen, der im Schaumgerüst wuchs, stammte höchstwahrscheinlich vom Periost in unmittelbarer Nachbarschaft zum Bohrloch ab und wuchs durch appositionelles Wachstum „per continuum" in das Loch.
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Claims

Biokompatibles Verbundtransplantat für die Reparatur kortikaler Knochen, wobei das genannte Transplantat ein starres biokompatibles Substrat mit einer Beschichtung aus einem offenzelligen Polymerschaum, der aus einem biologisch abbaubaren Polymer besteht, umfasst, wobei die genannte Beschichtung mit Periostzellen des Empfängers, für den das Transplantat vorgesehen ist, besät ist.
Verwendung eines biokompatiblen Verbundtransplantats bei der Herstellung eines Implantats zur Förderung der Osteoinduktivität und der Inkorporation eines biokompatiblen Verbundtransplantats für einen Knochen in einen Schaden bei einem Patienten, wobei das genannte biokompatible Verbundtransplantat über die folgenden Schritte erhalten werden kann: Erzeugen eines biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat, Erzeugen, in vitro, vom genannten Patienten stammender, kultivierter Periostzellen, Beschichten des genannten biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat mit einem offenzelligen Polymerschaum, der aus einem biologisch abbaubaren Polymer besteht, und Besäen der genannten Beschichtung auf dem genannten biokompatiblen Substratmaterial für das Transplantat mit den genannten kultivierten Periostzellen.
Ex-vivo-Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen Verbundtransplantats, das zur Förderung der Osteoinduktivität und der Inkorporation eines biokompatiblen Verbundtransplantats in einen Schaden bei einem Patienten geeignet ist, wobei das genannte Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Erzeugen eines biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat, Erzeugen, in vitro, vom genannten Patienten stammender, kultivierter Periostzellen, Beschichten des genannten biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat mit einem offenzelligen Polymerschaum, der aus einem biologisch abbaubaren Polymer besteht, und Besäen der genannten Beschichtung auf dem genannten biokompatiblen Substratmaterial für das Transplantat mit den genannten kultivierten Periostzellen.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Verfahren nach Anspruch 3, wobei das genannte biokompatible Substrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem gespendeten Stück Knochen, einem resorbierbaren vorgehärteten Knochenzement, einem molekular verstärkten sich durchdringenden Netzwerk und einem geformten biologisch abbaubaren Polymer besteht.
Verbundtransplantat nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2 oder Verfahren nach Anspruch 3, wobei das genannte biologisch abbaubare Polymer ein Poly(lactid-co-glycolid) mit einem Lactid:Glycolid-Verhältnis von 0:100 bis 100:0 ist.
Verbundtransplantat, Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 5, wobei das genannte Poly(lactid-co-glycolid) ein Lactid:Glycolid-Verhältnis von 50:50 aufweist.
Verbundtransplantat nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2 oder Verfahren nach Anspruch 3, wobei das genannte biologisch abbaubare Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polydioxanon, Poly(caprolacton), Polyanhydrid, Poly(orthoester), Poly(ether-co-ester), Polyamid, Polylacton und Poly(propylenfumarat), H[-O-CH(CH₃)-CH₂-O-CO-CH=CH-CO-]_nOH, besteht.
Verbundtransplantat nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2 oder Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Dicke der Beschichtung aus dem Polymerschaum vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 2,5 Millimeter liegt.
Verbundtransplantat, Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Dicke der Beschichtung aus dem Polymerschaum im Bereich von 1,0 bis 2,0 Millimeter liegt.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des Erzeugens eines biokompatiblen Substratmaterials für das Transplantat ferner das Erzeugen einer Rauheit auf der Oberfläche des genannten Substratmaterials umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Periostzellen in einer Matrix in Medien kultiviert werden, die Induktoren einer Osteogenese aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Faktoren, die die Knochenbildung induzieren, Enzymen, die die Kalzifizierung fördern, Enzymen, die die Phosphoreinlagerung fördern, Vitaminen und Prostaglandinen besteht.
Allotransplantat für kortikale Knochen zur Reparatur von Knochenschäden, das Zellen umfasst, die erhalten werden können durch das Dissoziieren von Periostgewebe, das Aussäen von Periostzellen auf und in eine biokompatible Matrix, die für die Reparatur des Schadens geeignet ist und einen biologisch abbaubaren offenzelligen Polymerschaum umfasst, und das Kultivieren unter Kulturbedingungen, die in der Lage sind, die Periostzellen zur Bildung von neuem Knochen im Empfänger des Transplantats anzuregen, wodurch die Inkorporation des Transplantats in den eigenen Knochen des Empfängers gefördert wird.
Verbundmaterial nach Anspruch 1 oder Allotransplantat für kortikale Knochen nach Anspruch 12 für den Einsatz in der Medizin.