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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ausführen eines
schnellen Bestimmens eines Substrats mit hoher Messgenauigkeit in
einer Probe auf vereinfachte Weise.
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Stand der Technik
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Als
Verfahren zur quantitativen Analyse von Zuckern, wie etwa Saccharose
und Glucose wurden Polarimetrie, Kolorimetrie, Reduktiometrie und
Verfahren, die eine Vielzahl von Chromatographien verwenden, entwickelt.
Alle diese Verfahren haben jedoch eine schlechte Messgenauigkeit
aufgrund der schlechten Spezifität
für Zucker.
Unter diesen Verfahren ist Polarimetrie einfach zu handhaben, wird
aber durch die Temperatur während
des Vorgangs stark beeinflusst. Daher ist Polarimetrie kein geeignetes Verfahren,
mit dem Laien die Bestimmung von Zuckern zu Hause oder anderswo
auf vereinfachte Weise durchführen
können.
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Übrigens
wurden in jüngster
Zeit verschiedene Arten von Biosensoren entwickelt, die spezifische katalytische
Wirkungen von Enzymen verwenden.
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Im
Folgenden wird ein Verfahren zur Glucosebestimmung als ein Beispiel
des Verfahrens zur Substratbestimmung in einer Probenlösung beschrieben.
Ein allgemein bekanntes elektrochemisches Verfahren zur Glucosebestimmung
ist ein Verfahren, das Glucoseoxidase (EC1.1.3.4; nachfolgend zu
GOD abgekürzt)
und eine Sauerstoffelektrode oder eine Wasserstoffperoxidelektrode
(zum Beispiel "Biosensor" ed. by Shuichi Suzuki,
Kodansha) verwendet.
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GOD
oxidiert selektiv ein β-D-Glucosesubstrat
zu D-Glucono-δ-lacton unter
Verwendung von Sauerstoff als Elektronenmediator. Sauerstoff wird
in Gegenwart von Sauerstoff im Verlauf der Oxidationsreaktion durch
GOD zu Wasserstoffperoxid reduziert. Eine verringerte Menge wird
mit der Sauerstoffelektrode gemessen, oder, andernfalls, wird eine
erhöhte Menge
an Wasserstoffperoxid mit der Wasserstoffperoxidelektrode gemessen.
Die verringerte Menge an Sauerstoff oder die erhöhte Menge an Wasserstoffperoxid
ist proportional zum Glucosegehalt in der Probenlösung, so
dass Glucose basierend auf der verringerten Menge an Sauerstoff
oder der erhöhten Menge
an Wasserstoffperoxid bestimmt werden kann.
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Wie
aus dem Reaktionsprozess angenommen werden kann, hat dieses Verfahren
den Nachteil, dass das Messergebnis stark durch die Sauerstoffkonzentration
in der Probenlösung
beeinflusst wird. Des Weiteren ist die Messung in Abwesenheit von
Sauerstoff in der Probenlösung
unmöglich.
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Daher
wurde ein neuartiger Typ von Glucosesensor entwickelt, der nicht
Sauerstoff als Elektronenmediator verwendet, sondern eine organische Verbindung
oder einen Metallkomplex, einschließlich Kaliumferricyanid, Ferrocenderivaten,
Chinonderivaten usw. als Elektronenmediator verwendet. Dieser Sensortyp
oxidiert eine reduzierte Form eines Elektronenmediators, der aus
der Enzymreaktion auf der Elektrode resultiert, und bestimmt die
Glucosekonzentration, die in der Probenlösung enthalten ist, basierend
auf der Menge an Oxidationsstrom. Die Verwendung einer solchen organischen
Verbindung oder eines Metallkomplexes als dem Elektronenmediator
anstelle von Sauerstoff ermöglicht
die Bildung einer Reaktionsschicht, während sie genau eine bekannte
Menge an GOD trägt
und irgend einen Elektronenmediator in einem stabilisierten Zustand.
In diesem Fall, da die Reaktionsschicht in fast trockenem Zustand
in das Elektrodensystem integriert werden kann, hat ein Typ eines
Wegwerf-Glucosesensors, der auf dieser Technologie basiert, gegenwärtig viel
Aufmerksamkeit auf sich gezogen.
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Der
Typ eines Wegwerf-Glucosesensors erleichtert das Messen der Glucosekonzentrationen
mit einem Messgerät
durch die einfache Einführung
einer Probenlösung
in den abnehmbaren Sensor, der mit dem Messgerät verbunden ist. Die Anwendung einer
solchen Technik ist nicht nur auf die Glucosebestimmung beschränkt und
kann auf die Bestimmung anderer Substrate ausgeweitet werden, die
in der Probenlösung
enthalten sind.
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Das
Messen unter Verwendung des Sensors, wie zuvor beschrieben, kann
die Substratkonzentration, basierend auf einem fließenden Oxidationsstromwerts
bestimmen, der aus der Oxidation einer reduzierten Form eines Elektronenmediators
auf einer Arbeitselektrode resultiert. Wenn jedoch Blut, Fruchtsaft
oder etwas vergleichbares als Probe verwendet wird, wird jede leicht
oxidierbare Substanz, die in der Probenlösung enthalten ist, wie etwa
Ascorbinsäure,
Harnsäure
usw. gleichzeitig auf der Arbeitselektrode zusammen mit dem Elektronenmediator
in reduzierter Form oxidiert. Die Oxidationsreaktion einer solchen
leicht oxidierbaren Substanz kann manchmal das Messergebnis beeinflussen.
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Außerdem kann
bei der Messung unter Verwendung des Sensors, wie oben erwähnt, eine
Reaktion, die Wasserstoffperoxid unter Verwendung gelösten Sauerstoffs
als einem Elektronenmediator produziert, gleichzeitig mit der Reduktion
des getragenen Elektronenmediators auf der Reaktionsschicht ablaufen.
Des Weiteren reoxidiert das durch die Reaktion produzierte Wasserstoffperoxid
den Elektronenmediator in reduzierter Form. Dies kann möglicherweise
aufgrund des gelösten
Sauerstoffs einen negativen Fehler beim Messergebnis produzieren, wenn
die Substratkonzentration basierend auf dem Oxidationsstrom des
Elektronenmediators in reduzierter Form gemessen werden soll.
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Das
oben erwähnte
Verfahren legt häufig eine
Spannung zwischen der Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode
an, um die Flüssig-flüssig-Grenzfläche zu detektieren,
um nämlich
das Heranführen
der Probenlösung
auf der Basis einer elektrischen Änderung zwischen den beiden
Elektroden vor dem Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode
und der Gegenelektrode zu detektieren, um einen Ansprechstrom zu
erhalten. Zu diesem Zeitpunkt kommt es manchmal vor, dass die Messung
vor dem Heranführen
ausreichender Mengen der Probenlösung
zum Elektrodensystem beginnt, aufgrund der Veränderung im Widerstandswert
zwischen der oben erwähnten
Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, was manchmal das Messergebnis beeinflussen
kann. Die Induktion einer Veränderung bei
der Bedingung einer Schnittstelle der Arbeitselektrode kann das
Messergebnis ebenfalls beeinflussen.
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Des
Weiteren verwendet ein Messverfahren mit einem Zwei-Elektroden-System
eine Gegenelektrode als Referenzelektrode. Dies verursacht eine Veränderung
im Potential der Gegenelektrode als dem Standard in Verbindung mit
der Oxidations-Reduktions-Reaktion an der Arbeitselektrode, was
das Messergebnis ebenfalls beeinflusst.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, die Schwierigkeiten, wie oben
beschrieben, zu beseitigen und ein Verfahren zur Bestimmung bereitzustellen,
das eine genaue Messung der Substratkonzentration erleichtert, indem
Einflüsse
von leicht oxidierbaren Substanzen entfernt werden.
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Eine
andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Substratbestimmung mit geringeren Abweichungen beim Ansprechen
des Sensors bereitzustellen.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration
eines Substrats in einer Probenlösung
unter Verwendung eines Biosensors, umfassend eine elektrisch isolierende
Basisplatte, ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode, einer
Gegenelektrode und einer dritten Elektrode, die als Störsubstanzdetektionselektrode
verwendet wird, wobei jede an der oben erwähnten Basisplatte ausgebildet
ist, und eine Reaktionsschicht, die mindestens eine Oxidoreduktase
und einen Elektronenmediator enthält und auf dem Elektrodensystem
unter Aussparung der dritten Elektrode gebildet ist, wobei der Elektronenmediator
durch die generierenden Elektronen bei einer Reaktion zwischen dem
in der Probenlösung
enthaltenen Substrat und der Oxidoreduktase reduziert wird, um eine
reduzierte Menge des Elektronenmediators elektrochemisch zu messen,
wobei
das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden
Schritte umfasst:
- (a) einen Schritt zum Anlegen
einer Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode;
- (b) einen Schritt zum Heranführen
der Probenlösung
an die Reaktionsschicht;
- (c) einen Schritt zur Detektion einer elektrischen Änderung
zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode in Folge des
Heranführens
der Probenlösung
an die Reaktionsschicht;
- (d) einen Schritt zum Messen eines Stroms, der zwischen der
Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem oben erwähnten Detektionsschritt
(c) fließt;
- (e) einen Schritt zum Entfernen der Spannung zwischen der Gegenelektrode
und der dritten Elektrode nach dem oben erwähnten Messschritt (d);
- (f) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode
und der Gegenelektrode; und
- (g) einen Schritt zum nachfolgenden Messen eines Stroms, der
zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode fließt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Bestimmen der
Konzentration eines Substrats in einer Probenlösung unter Verwendung eines Biosensors
bereit, umfassend eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein Elektrodensystem
mit einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer dritten
Elektrode, die als Störsubstanzdetektionselektrode
verwendet wird, wobei jede an der oben erwähnten Basisplatte ausgebildet
ist, eine Reaktionsschicht, die mindestens eine Oxidoreduktase und
einen Elektronenmediator enthält
und auf dem Elektrodensystem unter Aussparung der dritten Elektrode ausgebildet
ist, und ein Abdeckelement, das einen Probenlösungszufuhrpfad bildet, um
eine Probenlösung
von einem Probenlösungszufuhreinlass
in die oben erwähnte
Reaktionsschicht auf der oben erwähnten Basisplatte einzuleiten,
wobei die dritte Elektrode stromauf des Probenlösungszufuhrpfads ausgehend
von der Reaktionsschicht angeordnet ist, wobei der Elektronenmediator
durch die erzeugten Elektronen bei einer Reaktion zwischen dem in
der Probenlösung
enthaltenen Substrat und der Oxidoreduktase reduziert wird, um eine
reduzierte Menge des Elektronenmediators elektrochemisch zu messen,
wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a)
einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Gegenelektrode
und der dritten Elektrode;
- (b) einen Schritt zum Heranführen
der Probenlösung
an die Reaktionsschicht;
- (c) einen Schritt zur Detektion einer elektrischen Änderung
zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode in Folge des
Heranführens
der Probenlösung
an die Reaktionsschicht;
- (d) einen Schritt zum Messen eines Stroms, der zwischen der
Gegenelektrode und der dritten Elektrode nach dem oben erwähnten Detektionsschritt
(c) fließt;
- (e) einen Schritt zum Entfernen der Spannung zwischen der Gegenelektrode
und der dritten Elektrode nach dem oben erwähnten Messschritt (d);
- (f) einen Schritt zum Anlegen einer Spannung zwischen der Arbeitselektrode
und der Gegenelektrode; und
- (g) einen Schritt zum nachfolgenden Messen eines Stroms, der
zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode fließt.
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Für das Verfahren
zur Bestimmung gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung einer dritten Elektrode als Referenzelektrode
bevorzugt. Es wird nämlich
ebenfalls eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode und der dritten
Elektrode während
des oben erwähnten
Schritts (f) angelegt.
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Wenn
ein Biosensor verwendet wird, bei dem das Abdeckelement in die oben
erwähnte
Basisplatte integriert ist, ist es ebenfalls bevorzugt, eine Lecithin-tragende
Schicht auf einer freiliegenden Wandfläche des Abdeckelements für den Probenlösungszufuhrpfad
bereitzustellen.
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Es
ist bevorzugt, dass die oben erwähnte Reaktionsschicht
des Weiteren ein hydrophiles Polymer enthält.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Draufsicht, die einen Glucosesensor gemäß einem Beispiel der vorliegenden
Erfindung darstellt, bei der die Reaktionsschicht ausgespart wurde.
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2 ist
eine perspektivische Explosionsansicht, die einen Glucosesensor
gemäß einem
anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung darstellt, bei der die
Reaktionsschicht ausgespart wurde.
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Beste Art, die Erfindung auszuführen
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Es
wird eine Struktur des Biosensors beschrieben, der in dem Verfahren
zur Bestimmung gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird.
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Zuerst
wird ein erster Biosensortyp mittels 1 beschrieben.
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Bei
diesem Sensor werden eine Gegenelektrode 6, eine Arbeitselektrode 7 und
eine dritte Elektrode 8 auf einer isolierenden Basisplatte 1 ausgebildet,
die aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist, zusammen mit den
jeweiligen Zuführungen 2, 3 und 4,
die mit diesen elektrisch verbunden sind. Eine Kohlenstoffschicht 9,
die ausgebildet wird, um die Erzeugung einer Reaktionsschicht zu
erleich tern, wirkt nicht als Elektrode. Eine runde Reaktionsschicht (nicht
gezeigt), die eine Oxidoreductase und einen Elektronenmediator enthält, wird
an der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7 und
der Kohlenstoffschicht 9 unter Aussparung der dritten Elektrode 8 ausgebildet.
In der Figur steht die Ziffer 5 für eine isolierende Schicht.
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Dann
wird ein zweiter Biosensortyp mittels 2 beschrieben.
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Dieser
Sensor ist eine Kombination der Basisplatte 1 in 1 mit
einem Abdeckelement, umfassend eine Abdeckung 10 und einen
Abstandshalter 11. Sie sind miteinander in einer Lagebeziehung verbunden,
wie durch die Strichpunktlinie in 2 gezeigt,
um einen Sensor auszubilden.
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Ein
Schlitz 12 zur Ausbildung des Probenlösungszufuhrpfads ist auf dem
Abstandshalter 11 ausgebildet, und eine Lüftungsöffnung 13 ist
auf der Abdeckung 10 ausgebildet. Das Laminieren der Abdeckung 11 auf
die Basisplatte 1 über
den Abstandshalter 11, um sie miteinander zu verbinden,
führt zur
Bildung eines Hohlraums, der als Probenlösungszufuhrpfad am Schlitz 12 auf
dem Abstandshalter 11 durch die Basisplatte 1,
den Abstandshalter 11 und die Abdeckung 10 dient.
Eine Endkante dieses Hohlraums kommuniziert mit der Lüftungsöffnung 13.
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Bei
diesem Biosensor liegt die Arbeitselektrode 7 an einer
Position näher
an einem Probenlösungszufuhreinlass 12a (der
einer offenen Kante des Schlitzes 12 entspricht) als die
halbmondförmige
Gegenelektrode 6, und die dritte Elektrode 8 liegt
an einer Position, die noch näher
an dem Probenlösungszufuhreinlass 12a ist,
als die Arbeitselektrode 7. Jede dieser Elektroden 6, 7 und 8 ist
hinsichtlich des oben erwähnten
Hohlraums freiliegend.
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Beim
Messen der Substratkonzentration unter Verwendung des oben erwähnten Biosensors, wird
ein Endabschnitt des Sensors, an dem die Zuführungen 2, 3 und 4 bereitgestellt
sind, zuerst auf ein Messgerät
gesetzt, gefolgt vom Anlegen eines vorbestimmten Potentials auf
die dritte Elektrode 8, bezogen auf die Gegenelektrode 6.
Wenn das Potential angelegt wird, wird eine Probenlösung, die
zum Beispiel Ascorbinsäure
als Störsubstanz
enthält,
auf die Reaktionsschicht getropft, um die Reaktionsschicht in der
Probenlösung
aufzulösen.
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Beim
Heranführen
der Probenlösung
beginnt ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem
zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert,
welches seinerseits einen Messtimer startet. Zu diesem Zeitpunkt
wird das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 angelegt, und es wird ein Stromwert
zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 gemessen,
wenn eine bestimmte Zeit nach der Detektion des Heranführens der
Probenlösung
vergangen ist. Da auf der Reaktionsschicht die dritte Elektrode 8 ausgespart
ist, dauert es eine kurze Zeit, bis der Elektronenmediator in reduzierter
Form, der aus der Enzymreaktion resultiert, die Nähe der dritten
Elektrode 8 erreicht. Daher muss der oben erwähnte Stromwert
von der Oxidationsreaktion der Ascorbinsäure abgeleitet sein, die als
Störsubstanz
enthalten ist.
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Dann
wird die Spannung zwischen der Gegenelektrode 6 und der
dritten Elektrode 8 entfernt.
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Nachfolgend
wird ein Potential zum Oxidieren des oben erwähnten Elektronenmediators in
reduzierter Form auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf
die Gegenelektrode 6, angelegt, um einen Stromwert zwischen
der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 zu
messen. Dieser Strom ist von den Oxidationsreaktionen des Elektronenmediators
in reduzierter Form und der bereits vorhandenen Störsubstanz
Ascorbinsäure
abgeleitet. Anders ausgedrückt erzeugt
die Ascorbinsäure
einen positiven Fehler im Messergebnis. Der oben erwähnte Stromwert
zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 spiegelt
im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration wieder, so
dass die Korrektur des Messergebnisses auf der Basis dieses Stromwerts
jeden Einfluss der Ascorbinsäure
entfernt, wodurch eine genaue Substratkonzentration bestimmt werden kann.
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Der
zweite Sensortyp detektiert das Heranführen der Probenlösung zwischen
der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8,
so dass der gesamte freiliegende Bereich der Arbeitselektrode 7 mit Sicherheit
mit der Probenlösung
gefüllt
ist. Folglich kann das Heranführen
der Probenlösung
zuverlässiger
bestimmt werden.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung mittels der Beispiele spezifischer
beschrieben.
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Beispiel 1
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Es
wird ein Verfahren zur Glucosebestimmung beschrieben. Die in 1 gezeigte
Basisplatte wurde als Basisplatte eines Glucosesensors verwendet.
Der Glucosesensor wurde wie folgt erzeugt.
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Eine
Silberpaste wurde auf die isolierende Basisplatte 1, die
aus Polyethylenterephthalat hergestellt wurde, unter Verwendung
von Siebdruck gedruckt, um die jeweiligen Zuführungen 2, 3 und 4 auszubilden.
Dann wurde des Weiteren eine leitende Kohlenstoffpaste, die einen
Harzträger
enthält,
auf die Basisplatte 1 gedruckt, um die Gegenelektrode 6, die
Arbeitselektrode 7, die dritte Elektrode 8 und
die Kohlenstoffschicht 9 auszubilden. Die Gegenelektrode 6,
die Arbeitselektrode 7 und die dritte Elektrode 8 sind
elektrisch mit den Zuführungen 2, 3 bzw. 4 verbunden.
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Dann
wurde eine isolierende Paste auf die Basisplatte 1 gedruckt,
um die isolierende Schicht 5 auszubilden. Die isolierende
Schicht 5 bedeckt jeweils einen Rand der Gegenelektrode 6,
der Arbeitselektrode 7, der dritten Elektrode 8 und
der Kohlenstoffschicht 9, wodurch jeweils der freiliegende
Bereich der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7, der
dritten Elektrode 8 und der Kohlenstoffschicht 9 konstant
gehalten wird. Die isolierende Schicht 5 bedeckt die Zuführungen 2, 3 und 4 teilweise.
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Dann
wurde eine wässrige
Lösung
aus Carboxymethylcellulose (nachfolgend zu CMC abgekürzt) auf
die Gegenelektrode 6, die Arbeitselektrode 7 und
die Kohlenstoffschicht 9 unter Aussparung der dritten Elektrode 8 getropft
und getrocknet, um eine CMC-Schicht auszubilden. Das Auftropfen
einer wässrigen
Lösung,
die GOD als Enzym und Kaliumferricyanid als Elektronenmediator enthält, auf
die CMC-Schicht, löst
einmal die CMC-Schicht, die aus einem hydrophilen Polymer besteht,
das durch den nachfolgenden Trocknungsvorgang zu einer Reaktionsschicht
ausgebildet wird, wobei CMC mit dem Enzym und dem anderen Bestandteil
gemischt wird. Die Abwesenheit von Rühren usw. führt jedoch zu einem unvollständigen Vermischen
der beiden, wodurch die Fläche
des Elektrodensystems nur mit CMC bedeckt wird. Anders ausgedrückt, weil
kein Kontakt des Enzyms und des Elektronenmediators mit der Fläche des
Elektrodensystems erfolgt, kann die Adsorption von Protein auf die
Fläche
des Elektrodensystems verhindert werden.
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Um
die Glucosekonzentrationen unter Verwendung dieses Sensors zu messen,
wurde ein Endabschnitt des Sensors, an dem die Zuführungen 2, 3 und 4 bereitgestellt
sind, zuerst auf ein Messgerät gesetzt
und ein Potential von 500 mV wurde auf die dritte Elektrode 8,
bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das
Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die
Ascorbinsäure
als Störsubstanz
enthielt, als Probenlösung
mit 30 μl
auf die Reaktionsschicht getropft. Die Reaktionsschicht auf dem
Elektrodensystem löste sich
in der aufgetropften Probenlösung
auf.
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Beim
Heranführen
der Probenlösung
begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem
zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert.
Dieses startete einen Messtimer. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin
zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt,
und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der
Probenlösung
wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten
Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Oxidationsreaktion
der Ascorbinsäure,
die als Störsubstanz
enthalten war, abgeleitet, und hatte eine proportionale Beziehung
zu deren Konzentration. Nach dem Messen des Stroms zwischen der
Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde
die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
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Wie
oben erwähnt
wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher
dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen,
die aus der Enzymreaktion resultieren, in der Nähe der dritten Elektrode 8.
Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines
Intervalls bis zur Ankunft der Ferrocyanidionen spiegelt nämlich im
Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
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Des
Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500
mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die Gegenelektrode 6,
angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der Arbeitselektrode 7 gemessen.
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Die
Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert
schließlich
Glucose zu Gluconolacton und reduziert die Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen.
Die Konzentration an Ferrocyanidionen ist proportional zur Glucosekonzentration. Ein
Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 wird
nach 30 Sekunden Detektion der Probenlösung von den Oxidationsreaktionen
der Ferrocyanidionen und der bereits vorhandenen Ascorbinsäure abgeleitet.
Dies bedeutet, dass Ascorbinsäure
einen positiven Fehler im Messergebnis erzeugt. Wie jedoch zuvor
beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem
Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure entfernen, wodurch die
Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
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Beispiel 2
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Die
Elektroden 6, 7, 8 und die Kohlenstoffschicht 9 wurden
auf der Basisplatte 1 auf die gleiche Weise wie in Beispiel
1 ausgebildet. Dann wurde eine wässrige
CMC-Lösung
auf die Gegenelektrode 6, die Arbeitselektrode 7 und
die Kohlenstoffschicht 9 getropft, wobei die dritte Elektrode 8 ausgespart
wurde, und getrocknet, um die CMC-Schicht auszubilden, auf die des
Weiteren eine wässrige
Lösung,
die GOD als Enzym und Kaliumferricyanid als Elektronenmediator enthält, aufgetropft
und getrocknet wurde, um die Reaktionsschicht auszubilden.
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Dann
wurde, um des Weiteren das Heranführen der Probenlösung zur
Reaktionsschicht zu vereinfachen, eine organische Lösemittel-Lecithinlösung, wie
zum Beispiel eine Toluenlösung,
vom Probenlösungszufuhreinlass
zur Reaktionsschicht verteilt und getrocknet, um eine Lecithinschicht
auf der Reaktionsschicht auszubilden. Dann wurden die Abdeckung 10 und
der Abstandshalter 11 mit der Basisplatte 1 in
einer Lagebeziehung verbunden, wie durch die Strichpunktlinie in 2 gezeigt,
um einen Glucosesensor auszubilden.
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Der
Sensor wurde auf ein Messgerät
gesetzt und es wurde ein Potential von 500 mV auf die dritte Elektrode 8,
bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das
Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die
Ascorbinsäure
als Störsubstanz
enthielt, als Probenlösung
mit 3 μl
durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die
Probenlösung
erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte,
und löste
die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
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Beim
Heranführen
der Probenlösung
begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem
zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert.
Dieses startete einen Messtimer. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential weiterhin
zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt,
und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der
Probenlösung
wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten
Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Oxidationsreaktion
der Ascorbinsäure,
die als Störsubstanz
enthalten war, abgeleitet, und hatte eine proportionale Beziehung
zu deren Konzentration. Nach dem Messen des Stroms zwischen der
Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde
die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
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Wie
oben erwähnt
wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher
dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen,
die aus der Enzymreaktion resultieren, in der Nähe der dritten Elektrode 8.
Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines
Intervalls bis zur Ankunft der Ferrocyanidionen spiegelt nämlich im
Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
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Des
Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500
mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die Gegenelektrode 6,
angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der Arbeitselektrode 7 gemessen.
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Die
Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert
schließlich
Glucose zu Gluconolacton und reduziert die Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen.
Die Konzentration an Ferrocyanidionen ist proportional zur Glucosekonzentration. Ein
Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 wird
nach 30 Sekunden Detektion der Probenlösung von den Oxidationsreaktionen
der Ferrocyanidionen und der bereits vorhandenen Ascorbinsäure abgeleitet.
Dies bedeutet, dass Ascorbinsäure
einen positiven Fehler im Messergebnis erzeugt. Wie jedoch zuvor
beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem
Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure entfernen, wodurch die
Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
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Im
vorliegenden Beispiel wird aufgrund der Detektion des Heranführens der
Probenlösung
zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8,
der gesamte freiliegende Abschnitt der Arbeitselektrode 7 mit
Sicherheit mit der Probenlösung
gefüllt.
Dies ermöglicht
eine noch zuverlässigere
Bestimmung des Heranführens
der Probenlösung.
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Beispiel 3
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Ein
Glucosesensor wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 erzeugt.
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Der
Sensor wurde auf ein Messgerät
gesetzt und es wurde ein Potential von 500 mV auf die dritte Elektrode 8,
bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das
Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die
Ascorbinsäure
als Störsubstanz
enthielt, als Probenlösung
mit 3 μl
durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die
Probenlösung
erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte,
und löste
die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
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Beim
Heranführen
der Probenlösung
begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem
zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert,
welches dann einen Messtimer startete. Zu diesem Zeitpunkt wird
das Potential weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der
dritten Elektrode 8 angelegt, und nach Ablauf einer bestimmten
Zeit nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde
ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten
Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Oxidationsreaktion
der Ascorbinsäure,
die als Störsubstanz
enthalten war, abgeleitet, und hatte eine proportionale Beziehung
zu deren Konzentration. Nach dem Messen des Stroms zwischen der
Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde
die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
-
Wie
oben erwähnt
wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher
dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen,
die aus der Enzymreaktion resultieren, in der Nähe der dritten Elektrode 8.
Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 während eines
Intervalls bis zur Ankunft der Ferrocyanidionen spiegelt nämlich im
Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
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Des
Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500
mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die dritte Elektrode 8,
angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der Arbeitselektrode 7 gemessen.
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Die
Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert
schließlich
Glucose zu Gluconolacton und reduziert die Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen.
Die Konzentration an Ferrocyanidionen ist proportional zur Glucosekonzentration. Ein
Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der Arbeitselektrode 7 wird
nach 30 Sekunden Detektion der Probenlösung von den Oxidationsreaktionen
der Ferrocyanidionen und der bereits vorhandenen Ascorbinsäure abgeleitet.
Dies bedeutet, dass Ascorbinsäure
einen positiven Fehler im Messergebnis erzeugt. Wie jedoch zuvor
beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Ascorbinsäurekonzentration.
Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend auf diesem
Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure entfernen, wodurch die
Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
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Die
zusätzliche
Messung eines Potentials der dritten Elektrode 8 während des
Anlegens des Potentials auf die Arbeitselektrode 7, bezogen
auf eine Silber/Silberchloridelektrode bewies fast keine Potentialänderung
der dritten Elektrode 8, obwohl eine Oxidationsreaktion
an der Arbeitselektrode 7 stattfand. Abweichungen beim
Ansprechen des Sensors wurden im Vergleich zu herkömmlichen
Verfahren, die Flüssigflüssig-Grenzflächen basierend
auf einer Änderung
des Widerstands zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode
detektieren, ebenfalls verringert.
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Beispiel 4
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Auf
die gleiche Weise wie in Beispiel 2 wurde die Reaktionsschicht auf
der Gegenelektrode 6, der Arbeitselektrode 7 und
der Kohlenstoffschicht 9 ausgebildet, wobei die dritte
Elektrode 8 ausgespart wurde.
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Dann
wurde eine organische Lösemittel-Lecithinlösung, wie
zum Beispiel eine Toluenlösung,
auf einer Rille, die auf dem Abdeckelement zum Ausbilden des Probenlösungszufuhrpfads
ausgebildet wurde, verteilt und getrocknet, um dadurch die Lecithinschicht
auszubilden, mit dem Ziel, das Heranführen der Probenlösung zur
Reaktionsschicht noch weiter zu vereinfachen. Dann wurden die Abdeckung 10 und
der Abstandshalter 11 mit der Basisplatte 1 in
einer Lagebeziehung verbunden, wie durch die Strichpunktlinie in 2 gezeigt,
was einen Glucosesensor ergab.
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Die
Positionierung der Lecithinschicht von der Reaktionsschicht über die
dritte Elektrode 8 kann manchmal die Abweichungen der Ansprechmerkmale
des Sensors aufgrund einer Änderung
der Fläche der
dritten Elektrode durch die Lecithinschicht erhöhen. Die Positionierung der
Lecithinschicht auf die Abdeckelementseite, wie oben gezeigt, führte zu
einer Verringerung solcher Abweichungen, und die Ansprechmerkmale
wurden verbessert.
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Beispiel 5
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Ein
Glucosesensor wurde auf gänzlich
gleiche Weise erzeugt wie in Beispiel 2, abgesehen von der Aussparung
der CMC-Schicht
von der Reaktionsschicht.
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Und
das Ergebnis der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführten Messung
zeigte ein Abhängigkeit
von den Ascorbinsäure-
und Glucosekonzentrationen, trotz der erhöhten Abweichungen beim Ansprechen
des Sensors, verglichen mit dem Fall, bei dem die CMC-Schicht enthalten
war.
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Beispiel 6
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Ein
Glucosesensor wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 erzeugt.
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Der
Sensor wurde auf ein Messgerät
gesetzt und es wurde ein Potential von –1.300 mV auf die dritte Elektrode 8,
bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das
Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine luftgesättigte wässrige Glucoselösung mit
3 μl als
Probenlösung
durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die
Probenlösung erreichte
den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad
passierte, und löste
die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
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Beim
Heranführen
der Probenlösung
begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem
zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert,
welches einen Messtimer startete. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential
weiterhin zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt,
und nach Ablauf einer bestimmten Zeit nach der Detektion des Heranführens der
Probenlösung
wurde ein Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten
Elektrode 8 gemessen. Der Strom wurde aus der Reduktionsreaktion des
gelösten
Sauerstoffs abgeleitet.
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Wenn
eine Glucoselösung,
die mit Argon entgast wurde, zugeführt wurde, verringerte sich
der Reduktionsstrom drastisch. Nach dem Messen des Stroms zwischen
der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 wurde
die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
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Wie
oben erwähnt
wurde die Reaktionsschicht nicht auf der dritten Elektrode 8 angeordnet. Daher
dauert es eine kurze Zeit bis zur Ankunft von Ferrocyanidionen in
der Reaktionsschicht in der Nähe
der dritten Elektrode 8. Der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 während eines Intervalls bis
zur Ankunft der Ferricyanidionen spiegelt nämlich im Wesentlichen nur die
Konzentration an gelöstem
Sauerstoff.
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Des
Weiteren wurden 25 Sekunden nach der Detektion der Probenlösung 500
mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die dritte Elektrode 8,
angelegt, und nach 5 Sekunden wurde ein Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der Arbeitselektrode 7 gemessen.
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Die
Reaktion von Ferricyanidionen, Glucose und GOD in der Lösung oxidiert
schließlich
Glucose zu Gluconolacton und die Reduktion von Ferricyanidionen
zu Ferrocyanidionen findet mit dieser Oxidationsreaktion statt.
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Wenn
andererseits gleichzeitig eine Reaktion als Konkurrenzreaktion abläuft, bei
der gelöster Sauerstoff
zu Wasserstoffperoxid reduziert wird, wenn die Glucose zu Gluconolacton
reduziert wird, aufgrund der Wirkung des gelösten Sauerstoff in der Probenlösung als
Elektronenmediator. Das durch diese Reaktion generierte Wasserstoffperoxid
reoxidiert Ferrocyanidionen zu Ferricyanidionen. Wenn daher die
Glucosekonzentration basierend auf einem Oxidationsstrom des Ferrocyanidions
gemessen werden soll, kann solch ein gelöster Sauerstoff einen negativen
Fehler im Messergebnis erzeugen.
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Wie
jedoch zuvor erwähnt,
spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen nur die Konzentration
an gelöstem
Sauerstoff. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend
auf diesem Ergebnis, alle Effekte des gelösten Sauerstoffs entfernen,
wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration ermöglicht wird.
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Beispiel 7
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Ein
Glucosesensor wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 erzeugt.
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Der
Sensor wurde auf ein Messgerät
gesetzt und es wurde ein Potential von 500 mV auf die dritte Elektrode 8,
bezogen auf die Gegenelektrode 6, angelegt. Während das
Potential weiterhin angelegt wurde, wurde eine wässrige Glucoselösung, die
Ascorbinsäure
als Störsubstanz
enthielt, als Probenlösung
mit 3 μl
durch den Probenlösungszufuhreinlass 12a zugeführt. Die
Probenlösung
erreichte den Lufteinlass 13, indem es den Probenlösungszufuhrpfad passierte,
und löste
die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem auf.
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Beim
Heranführen
der Probenlösung
begann ein Flüssigkeitszufuhrdetektionssystem
zu arbeiten, das auf einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 des Elektrodensystems basiert,
welches einen Messtimer startete. Zu diesem Zeitpunkt wird das Potential
weiter zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten Elektrode 8 angelegt.
Zwei Sekunden nach der Detektion des Heranführens der Probenlösung wurde das
Potential, das an die dritte Elektrode 8 angelegt werden
soll, auf –1.300
mV geändert.
Der Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und der dritten
Elektrode 8 wurde zu zwei Zeitpunkten unmittelbar vor und 3
Sekunden nach der Potentialänderung
auf –1.300 mV
gemessen. Der Strom unmittelbar vor der Potentialänderung
hängt im
Wesentlichen von der Ascorbinsäurekonzentration
ab. Andererseits hängt
der Strom 3 Sekunden nach der Potentialänderung auf –1.300 mV
im Wesentlichen von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Probenlösung ab.
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Nach
dem Messen des Stroms zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 nach 2 und 5 Sekunden des Heranführens der
Probenlösung
wurde die Spannung zwischen den beiden Elektroden entfernt.
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Fünfundzwanzig
Sekunden nach der Detektion der Probenlösung wurden des Weiteren 500
mV auf die Arbeitselektrode 7, bezogen auf die dritte Elektrode 8,
angelegt, und nach 5 Sekunden wurde der Strom zwischen der Gegenelektrode 6 und
der Arbeitselektrode 7 gemessen.
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Wie
oben beschrieben, spiegelt der Stromwert zwischen der Gegenelektrode 6 und
der dritten Elektrode 8 im Wesentlichen die Konzentrationen
an Ascorbinsäure
gelöstem
Sauerstoff. Daher können die
Konzentrationen dieser beiden Substanzen basierend auf diesem Stromwert
bestimmt werden. Daher kann die Korrektur des Messergebnisses, basierend
auf diesem Ergebnis, alle Effekte der Ascorbinsäure und des gelösten Sauerstoffs
entfernen, wodurch die Bestimmung der genauen Glucosekonzentration
ermöglicht
wird.
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Wenngleich
in den vorgenannten Beispielen das Potential, das auf die dritte
Elektrode 8 anzulegen ist, um das Heranführen der
Probenlösung
abzutasten, um Ascorbinsäure
oder gelösten
Sauerstoff zu detektieren, 500 mV oder –1.300 mV betrug, ist die vorliegende
Erfindung nicht auf diese Potentialwerte beschränkt. Überdies ist, wenngleich ein Potential
von 500 mV auf die Arbeitselektrode 7 angelegt wurde, um
einen Ansprechstrom zu erhalten, die vorliegende Erfindung nicht
auf diesen Potentialwert beschränkt,
und es kann jedes Potential verwendet werden, wenn es den Elektronenmediator
in reduzierter Form oxidieren kann, der aus einer Reaktionsserie
resultiert. Der Zeitpunkt zum Messen des Stromwerts ist ebenfalls
nicht auf jene beschränkt, die
in den vorgenannten Beispielen verwendet wurden.
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Wenngleich
in den vorgenannten Beispielen Carboxymethylcellulose als hydrophiles
Polymer verwendet wurde, kann eine Vielzahl von hydrophilen Polymeren
verwendet werden, um die hydrophile Polymerschicht auszubilden.
Beispielhafte hydrophile Polymere beinhalten Hydroxyethylcellulose,
Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose,
Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol,
Polyaminosäure,
wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine und deren Derivate,
Polyacrylsäure
und deren Salze, Polymethacrylsäure
und deren Salze, Stärke
und deren Derivate, und Maleinsäureanhydrid-
oder Maleatpolymer. Darunter sind Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose
und Hydroxypropylcellulose bevorzugt.
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Die
Oxidoreductase die in der Reaktionsschicht enthalten sein muss,
wird abhängig
von dem Substrat ausgewählt,
das in der Probenlösung
enthalten ist. Beispielhafte Oxidoreductasen beinhalten Fructosedehydrogenase,
Glucoseoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Cholesteroloxidase,
Xenthinoxidase und Aminosäureoxidase.
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Als
Elektronenmediator können
Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Methylenblau
und Ferrocenderivat beispielhaft genannt werden. Diese Elektronenmediatoren
können
allein oder in einer Kombination aus zwei oder mehreren verwendet
werden.
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Die
oben beispielhaft erwähnten
Enzyme und Elektronenmediatoren können in der Probenlösung aufgelöst werden,
oder es kann verhindert werden, dass sie sich in der Probenlösung auflösen, indem
die Reaktionsschicht auf die Basisplatte fixiert wird, und so weiter.
Wenn das Enzym und der Elektronenmediator fixiert werden sollen,
enthält
die Reaktionsschicht bevorzugt das hydrophile Polymer.
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In
den oben genannten Beispielen wurden spezifische Elektrodensysteme
gezeigt, aber die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf die
Form der Elektrode und die Lage der Elektroden und Zuführungen
nicht auf diese Elektrodensysteme beschränkt.
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Wenngleich
in den oben genannten Beispielen Kohlenstoff als Material für die dritte
Elektrode verwendet wurde, ist die vorliegende Erfindung nicht auf
eine Kohlenstoffelektrode beschränkt,
und es können
auch Elektroden verwendet werden, die aus anderem leitenden Material
hergestellt sind, oder eine Silber/Silverchloridelektrode.
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Wie
oben diskutiert ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Substratbestimmung mit hoher Zuverlässigkeit.