DE69937439T3 - Verbesserter Entschützungsmethode für die Synthese von Oligomerverbindungen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zum Herstellen von oligomeren Verbindungen, die Phosphorothioat-Verknüpfungen aufweisen. Die Verfahren der Erfindung stellen Oligomere bereit, die verminderte Mengen an unerwünschten Nebenprodukten aufweisen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Antisense- und andere Oligonukleotid-Therapien haben über akademische Veröffentlichungen hinaus das Niveau eines zugelassenen Arzneistoffs erreicht, wie es sich durch die kürzliche FDA-Zulassung eines Antisense-Oligonukleotid-Therapeutikums für Cytomegalovirus-Infektionen des Auges gezeigt hat. Mehr und mehr Oligonukleotide werden klinisch für die Behandlung verschiedener Erkankungen verwendet, wie z. B. Entzündungen, Krebs, virale Erkrankungen und andere Erkrankungen. Es gibt einen dringenden Bedarf für verbesserte Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden in einer großen Menge und mit einer hohen Qualität.
  • Eine Festphasenchemie ist das gegenwärtige Verfahren der Wahl. Typische Synthons, die gegenwärtig verwendet werden, sind O-Cyanethyl-geschützte Nukleosid-Phosphoamiditmonomere. Am Ende der Synthese wird das Oligonukleotidprodukt typischerweise mit 30%igem wässrigen Ammoniumhydroxid behandelt, um die Cyanethylgruppen an dem Phosphorothioat-Grundgerüst sowie exocyclische Aminogruppen zu entschützen. Während dieses Schritts des Entschützens wird für jede vorhandene Cyanethylgruppe ein Molekül Acrylnitril erzeugt.
  • Es ist nunmehr bekannt, dass Acrylnitril ein Nager-Karzinogen ist und dass es bei pH 7 mit T, dC, dG, dA und dI reagieren kann, was zur Bildung verschiedener Addukte führt. Vgl. Solomon et al., Chem.-Biol. Interactions, 51, 167–190 (1984). Es besteht ein starker Bedarf dahingehend, diese Verunreinigungen bei der Synthese von Oligonukleotiden, insbesondere von Phosphorothioat-Oligonukleotiden, zu beseitigen.
  • Eritja et al. (Tetrahedron, 48, 4171–4182 (1992)) haben über die Verhinderung einer Acrylnitril-Adduktbildung von Nukleobaseresten während des Entschützens von β-Cyanethylgeschützten Oligomeren durch 40% Triethylamin in Pyridin für 3 Stunden, gefolgt von einer Behandlung mit 0,5 M DBU/Pyridin, berichtet. Wie es jedoch nachstehend ersichtlich ist, konnten deren Bedingungen die Adduktbildung nicht in einem geeigneten Ausmaß beseitigen.
  • DE 196 27 898 A1 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von Oligonukleotiden durch eine Festphasensynthese, bei der exocyclische Aminogruppen, die an Nukleobasen vorliegen, mit cyclischen Diacylgruppen geschützt werden. Die exocyclischen Aminogruppen können in der Gegenwart einer starken, nicht-nukleophilen Base entschützt werden.
  • US 5,589,586 beschreibt ein Verfahren zur Oligonukleotidsynthese, bei dem das erste Nukleosid mittels einer Silylether-Verknüpfung an einen Träger gebunden wird, was es ermöglicht, dass die Oligonukleotide einfacher und effektiver synthetisiert, entschützt und gereinigt werden können.
  • US 5,514,789 beschreibt ein Verfahren zum Spalten und Entschützen von neu synthetisierten Oligonukleotiden von einem festen Träger, welches das Inkubieren des festen Trägers in einer Umgebung umfasst, die ein gasförmiges Spaltungs/Entschützungsreagens, wie z. B. gasförmiges Ammoniak oder Ammoniumhydroxiddampf, umfasst.
  • Boal et al. (1996), Nucleic Acids Research, 24, 3115–317, beschreiben ein Verfahren zum Entschützen von Oligodesoxyribonukleotiden, bei dem gasförmige Amine unter Druck eingesetzt werden, um Bedingungen eines milden und raschen Entschützens zu erreichen.
  • WO 97/29780 beschreibt Zusammensetzungen, die Oligonukleotide umfassen, die an der 2'-Position eine Methoxyethoxy-Modifizierung aufweisen. Die modifizierten Oligonukleotide können mittels Routine-Festphasensynthesetechniken hergestellt werden.
  • Bei dem vorliegenden Bedarf für Oligonukleotide und Analoga davon für eine klinische Verwendung und der bekannten Toxizität von Addukten auf Acrylnitrilbasis besteht ein starker Bedarf für Verfahren zum Herstellen von Phosphat-verknüpften Oligomeren mit einer verringerten Menge solcher Addukte. Die vorliegende Erfindung ist darauf sowie auf andere, wichtige Ziele gerichtet.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von Phosphat-verknüpften Oligomeren bereit, wie in Anspruch 1 angegeben. Die Oligomere weisen signifikant verminderte Mengen eines exocyclischen Nukleobase-Addukts auf, das aus den Produkten der Entfernung von Phosphor-Schutzgruppen resultiert.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das aliphatische Amin Triethylamin.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst das entschützende Reagens, wie in Anspruch 1 angegeben, ein Halogenalkyllösungsmittel oder ein Cyanalkyllösungsmittel, das vorzugsweise Acetonitril oder Methylenchlorid ist.
  • Die Phosphor-Schutzgruppe ist -CH2-CH2-C≡N oder -CH2-(CH=CH)p-CH2-C≡N, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, wobei CH2-CH2-C≡N oder -CH2-CH=CH-CH2-C≡N bevorzugt ist und wobei CH2-CH2-C≡N besonders bevorzugt ist.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Spaltungsreagens weiter einen Fänger, der ein Mercaptan, ein Beta-Aminothiol, ein Phosphin, ein Phosphit, ein Dien, ein Harnstoff, ein Thioharnstoff, ein Amid, ein Imid, ein cyclisches Imid, ein Keton, ein Alkylmercaptan, ein Thiol, Ethylenglykol, ein substituiertes Ethylenglykol, 1-Butanthiol, S-(2-Amino-4-thiazolylmethyl)isothioharnstoffhydrochlorid, 2-Mercaptoethanol, 3,4-Dichlorbenzylamin, Benzylamin, Benzylamin in der Gegenwart von Schwefelkohlenstoff, Hydroxylamin, 2-Phenylindol, n-Butylamin, Diethylester von Acetaminomalonsäure, Ethylester von N-Acetyl-2-cyanglycin, 3-Phenyl-4-(o-fluorphenyl)-2-butanon, 3,4-Diphenyl-2-butanon, Desoxybenzoin, N-Methoxyphthalimid, p-Sulfobenzoldiazoniumchlorid oder p-Sulfamidobenzoldiazoniumchlorid ist.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Fänger ein Harz, das ein geeignetes Fängermolekül enthält, das daran gebunden ist. Beispiele für Fängerharze umfassen Polymere mit freien Thiolgruppen und Polymere mit freien Aminogruppen, wie z. B. ein Polymer-gebundenes Aminharz, wobei das Amin aus Benzylamin, Ethylendiamin, Diethylamintriamin, Tris(2-aminoethyl)amin, Methylamin, Methylguanidin, Polylysin, Oligolysin, AgroporeTM NH2HL, AgroporeTM NH2LL, 4-Methoxytritylharz und Thiol-2-chlortritylharz ausgewählt ist.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Spaltungsreagens eine wässrige methanolische Lösung eines Metallcarbonats der Gruppe I oder der Gruppe II, vorzugsweise wässriges methanolisches Kaliumcarbonat. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Spaltungsreagens ein wässriges Metallhydroxid. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Spaltungsreagens einen Phasentransferkatalysator, wobei es sich um ein quarternäres Ammoniumsalz, ein quarternäres Phosphoniumsalz, Kronenether, Kryptanden (d. h. Kronenether, die bicyclisch oder Cyclen höherer Ordnung sind), t-Bu4N+OH oder t-Bu4N+F handelt.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Spaltungsreagens NaNH2.
  • In bevorzugten Ausführungsformen weisen die entschützten Oligomere, die durch die Verfahren der Erfindung erzeugt worden sind, die prozentualen Anteile von Acrylnitriladdukt auf, die in den Ansprüchen 11 bis 13 angegeben sind.
  • In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das aliphatische Amin Triethylamin, das Lösungsmittel ist Acetonitril oder Methylenchlorid und die Phosphor-Schutzgruppe ist CH2-CH2-C≡N oder -CH2-CH=CH-CH2-C≡N und wobei das Spaltungsreagens vorzugsweise einen vorstehend definierten Fänger umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst das Spaltungsreagens ein Alkalimetallcarbonat, bei dem es sich vorzugsweise um Kaliumcarbonat handelt.
  • Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen von oligomeren Verbindungen, die Phosphorothioat-Verknüpfungen zwischen Nukleosiden aufweisen, sowie eine Zusammensetzung, die durch die Verfahren erzeugt worden ist, bereit.
  • Die Verfahren der Erfindung sind auf eine Festphase-Chemie anwendbar. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in iterativen Festphase-Oligonukleotid-Synthesevorschriften eingesetzt. Repräsentative Festphase-Techniken sind diejenigen, die typischerweise für die DNA- und RNA-Synthese unter Verwendung einer Standard-Phosphoramidit-Chemie eingesetzt werden (vgl. z. B. Protocols For Oligonucleotides And Analogs, S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Eine bevorzugte synthetische Festphase-Synthese nutzt Phosphoramidite als aktivierte Phosphatverbindungen. Bei dieser Technik wird ein 5'-geschütztes Phosphoramiditmonomer mit einer freien Hydroxylgruppe an der wachsenden Oligomerkette umgesetzt, um eine Phosphit-Zwischenverbindung zu erzeugen, die anschließend unter Verwendung von Standardverfahren zu dem PV-Zustand oxidiert wird. Diese Technik wird üblicherweise für die Synthese mehrerer Typen von Verknüpfungen, einschließlich Phosphodiester-, Phosphorothioat- und Phosphorodithioat-Verknüpfungen, verwendet.
  • Typischerweise ist der erste Schritt in einem solchen Verfahren das Binden eines ersten Monomers oder einer Untereinheit höherer Ordnung, das bzw. die eine geschützte 5'-Hydroxylgruppe enthält, üblicherweise mittels einer Verknüpfungseinheit, unter Verwendung von Standardverfahren und -prozeduren, die in dem Fachgebiet bekannt sind, an einen festen Träger. Vgl. z. B. Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, F. Eckstein, Hrsg., IRL Press, N. Y., 1991. Das Träger-gebundene Monomer oder das erste Synthon höherer Ordnung wird dann behandelt, um die 5'-Schutzgruppe zu entfernen. Das an den festen Träger gebundene Monomer wird dann mit einem aktivierten Phosphormonomer oder einem Synthon höherer Ordnung, bei dem es sich typischerweise um ein Nukleosid-Phosphoramidit handelt, das zweckmäßig an dem Phosphoratom und an jedweden empfindlichen exocyclischen Amino- oder Hydroxylgruppen geschützt ist, umgesetzt. Typischerweise wird das Kuppeln des Phosphoramidits an die Träger-gebundene Kette unter wasserfreien Bedingungen in der Gegenwart eines Aktivierungsmittels, wie z. B. 1H-Tetrazol, 5-(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol oder Diisopropylaminotetrazolid, erreicht.
  • Die resultierende Verknüpfung ist ein Phosphit oder Thiophosphit, das anschließend vor dem nächsten iterativen Zyklus oxidiert wird. Die Auswahl des Oxidations- oder Schwefelungsmittels wird bestimmen, ob die Verknüpfung zu einer Phosphodiester-, Thiophosphodiester- oder einer Dithiophosphodiesterverknüpfung oxidiert oder geschwefelt wird.
  • Am Ende der Synthesevorschrift wird die Träger-gebundene oligomere Kette typischerweise mit einer starken Base (z. B. 30%igem wässrigen Ammoniumhydroxid) behandelt, um das vervollständigte Oligonukleotid von dem festen Träger zu spalten und um gleichzeitig Phosphorschutzgruppen (bei denen es sich typischerweise um β-Cyanethyl-Schutzgruppen handelt) und exocyclische Nukleobase-Schutzgruppen zu entfernen. Ohne dass eine Bindung der vorliegenden Erfindung an irgendeine bestimmte Theorie vorgesehen ist, wird davon ausgegangen, dass der Verlust der Cyanethylphosphor-Schutzgrupe über einen β-Eliminierungsmechanismus stattfindet, der Acrylnitril als Produkt erzeugt. Es wird davon ausgegangen, dass das Acrylnitril in einer Michaeladdition mit exocyclischen Amin- und/oder Hydroxylresten der Nukleobase und insbesondere mit der N3-Position von Thymidinresten unter Bildung schädlicher Addukte reagiert. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung vermindern den Gehalt solcher Addukte, die während der Entfernung von Phosphor-Schutzgruppen, die zur Teilnahme an solchen Addukt-bildenden Additionsreaktionen fähig sind, gebildet werden, signifikant.
  • Folglich stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt Verfahren zum Entschützen eines Phosphat-verknüpften Oligomers bereit, wie in Anspruch 1 angegeben.
  • Folglich wird in einigen bevorzugten Verfahren der Erfindung ein Träger-gebundenes Oligomer mit einer Vielzahl von Phosphor-Schutzgruppen, wie in Anspruch 1 definiert, die Acrylnitril oder ein strukturell ähnliches Produkt, das ein Addukt mit Nukleobase-Aminogruppen bilden kann, erzeugen können, mit einem entschützenden Reagens in Kontakt gebracht, wie in Anspruch 1 definiert. Das Amin wird derart ausgewählt, dass es eine ausreichend starke Base ist, um die Entfernung des größten Teils der Phosphor-Schutzgruppen zu bewirken, jedoch nicht ausreichend stark ist, um eine Deprotonierung der N3-Position von Thymidin und somit eine Aktivierung dieser Position für eine Adduktbildung zu verursachen. Es wurde gefunden, dass geeignete Amine diejenigen umfassen, deren konjugierte Säuren einen pKa von 8 bis 11, mehr bevorzugt von 9 bis 11, noch mehr bevorzugt von 10 bis 11 aufweisen. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass das Amin ein aliphatisches Amin der Formel (R)3N, (R)2NH oder RNH2 ist, wobei R Alkyl ist. Ein besonders geeignetes Amin ist Triethylamin.
  • Der hier verwendete Begriff „Entschützen” oder „Entschützung” soll für die Entfernung des größten Teils der Phosphor-Schutzgruppen und mehr bevorzugt im Wesentlichen aller Phosphor-Schutzgruppen von den interessierenden Oligomeren stehen.
  • Das entschützende Reagens ist wie in Anspruch 1 angegeben. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel ein Halogenalkyllösungsmittel oder ein Cyanalkyllösungsmittel. Beispiele für besonders geeignete Lösungsmittel sind Acetonitril und Methylenchlorid.
  • Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung ist es stark bevorzugt, dass der größte Teil der Cyanethylgruppen entfernt wird, bevor das Oligomer unter den relativ starken Bedingungen des Spaltungsreagens (z. B. 30%igem wässrigen Ammoniumhydroxid) behandelt wird. Es wurde gezeigt, dass die Geschwindigkeit des Entschützens von β-Cyanoethylgruppen von Oligonukleotiden einen ausgeprägten Lösungsmitteleffekt aufweist. Beispielsweise beträgt die Halbwertszeit eines Dimers, das eine einzelne Cyanethylgruppe enthält, in einer 1:1 v/v-Lösung von Triethylamin in Acetonitril oder Methylenchlorid bei 25°C näherungsweise 10 min, wohingegen die Halbwertszeit der gleichen Verbindung in Triethylamin-Pyridin (1:1, v/v) etwa zehnmal länger ist. Eritja et al. (Tetrahedron, 48, 4171–4182 (1992)) empfehlen eine dreistündige Behandlung mit einer 40%igen Lösung von Triethylamin in Pyridin als ausreichend, um die Bildung eines Acrylnitriladdukts mit Thymidinresten in Oligonukleotiden, die anschließend mit DBU behandelt werden, zu verhindern. Es wurde jedoch gefunden, dass unter den Bedingungen, die von Eritja beschrieben worden sind, viele der Cyanethyl-Schutzgruppen intakt bleiben. Während eine Bindung an eine spezifische Theorie nicht vorgesehen ist, wird davon ausgegangen, dass eine anschließende Behandlung mit Ammoniumhydroxid (oder irgendeiner anderen starken Base, wie z. B. DBU) zur Bildung von nicht akzeptablen Konzentrationen von Resten mit Acrylnitriladdukten führen würde. Folglich umfasst in der vorliegenden Erfindung das Lösungsmittel, das in dem entschützenden Reagenz enthalten ist, kein Pyridin oder ähnliche heterocyclische Base-Lösungsmittel, welche die Zeit zur Entfernung von Oligomer-gebundenem β-Cyanethyl oder anderen elektronisch ähnlichen Schutzgruppen verlängern würden.
  • Gegenwärtig wird davon ausgegangen, dass die Nachweisgrenze eines Acrylnitriladdukts durch HPLC-Verfahren bei etwa 0,1% liegt. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass die vorliegenden Verfahren Oligomere bereitstellen, die einen niedrigen Wert von 0,001% eines solchen Addukts aufweisen. Folglich weisen die entschützten Oligomere, die durch die Verfahren der Erfindung erzeugt werden, in bevorzugten Ausführungsformen 0,1% bis 1% Acrylnitriladdukt auf, wobei 0,1 bis 0,75% Acrylnitriladdukt (noch) mehr bevorzugt ist und 0,1 bis 0,5% Acrylnitriladdukt noch mehr bevorzugt ist. In noch mehr bevorzugten Ausführungsformen sind die entschützten Oligomere frei von einem nachweisbaren Acrylnitriladdukt.
  • Der hier verwendete Begriff „Acrylnitriladdukt” bezieht sich auf Addukte an exocyclischen Nukleobaseaddukten, die aus dem Acrylnitril resultieren, das während der Entfernung von β-Cyanethylphosphor-Schutzgruppen gebildet worden ist, oder ähnliche Addukte, die durch Entfernen von Schutzgruppen gebildet worden sind, die bei der Entfernung elektronisch ähnliche Produkte bilden.
  • Der Ausdruck „elektronenziehende Gruppe” soll dessen in dem Fachgebiet anerkannte Bedeutung eines chemischen Rests haben, der Elektronendichte anzieht, und zwar ungeachtet davon, ob durch Resonanzeffekte oder induktive Effekte. Beispiele für elektronenziehende Gruppen sind Cyano-, Nitro-, Halogen-, in der ortho- oder para-Position mit einer oder mehreren Halogen-, Nitro- oder Cyanogruppe(n) substituierte Phenyl- und Trihalogenmethylgruppen. Der Fachmann kann einfach andere elektronenziehende Gruppen sowie andere Phosphor-Schutzgruppen identifizieren, die ein ähnliches Potenzial zur Bildung von Addukten mit exocyclischen Amino- oder Hydroxylfunktionen aufweisen.
  • Nach dem Kontakt mit dem entschützenden Reagens werden die Oligomere vor der Umsetzung mit einem Spaltungsreagens weiter gewaschen. Das Spaltungsreagens ist eine Lösung, die ein einzelnes Reagens oder eine Kombination von Reagenzien umfasst, das bzw. die die Spaltung des entschützten Oligomers von einem festen Träger bewirkt bzw. bewirken, und/oder, wenn das Oligomer in Lösung ist, die Spaltung von exocyclischen Schutzgruppen bewirkt bzw. bewirken, wie z. B. 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid.
  • In den Verfahren der Erfindung ist es vorteilhaft, die Entfernung im Wesentlichen aller Phosphor-Schutzgruppen von den Oligomeren zu bewirken und das Acrylnitril oder Acrylnitrilartige Produkte von den Oligomeren vor dem Aussetzen der Oligomere gegenüber den stärker basischen Bedingungen, die eine Spaltung von dem festen Träger oder eine Entfernung von exocyclischen und/oder Hydroxyl-Schutzgruppen bewirken, abzutrennen. Folglich wird ein Waschschritt zwischen dem Kontakt mit dem entschützenden Reagens und dem Spaltungsreagens eingesetzt. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird der Waschschritt unter Verwendung von einem oder mehreren geeigneten Lösungsmittel(n), wie z. B. Acetonitril oder Methylenchlorid, durchgeführt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird das Waschen mit einem Waschreagens durchgeführt, das ein oder mehrere Amin(e) enthält, wie es bzw. sie in dem entschützenden Reagens eingesetzt wird bzw. werden.
  • In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen kann in das Spaltungsreagens, das Waschreagens oder in Kombinationen davon ein Fänger einbezogen werden. Der Fänger ist ein Molekül, das mit dem Acrylnitril oder den Acrylnitril-artigen Produkten des Entschützens reagiert, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Nukleobaseaddukts vermindert wird. Der Fänger kann aus Mercaptanen, Beta-Aminothiolen, Phosphinen, Phosphiten, Dienen, Harnstoffen, Thioharnstoffen, Amiden, Imiden, cyclischen Imiden und Ketonen ausgewählt werden. Weitere nützliche Fänger umfassen Alkylmercaptane, Thiole, Ethylenglykol, substituierte Ethylenglykole, 1-Butanthiol, S-(2-Amino-4-thiazolylmethyl)isothioharnstoffhydrochlorid, 2-Mercaptoethanol, 3,4-Dichlorbenzylamin, Benzylamin, Benzylamin in der Gegenwart von Schwefelkohlenstoff, Hydroxylamin, 2-Phenylindol, n-Butylamin, Diethylester von Acetaminomalonsäure, Ethylester von N-Acetyl-2-cyanglycin, 3-Phenyl-4-(o-fluorphenyl)-2-butanon, 3,4-Diphenyl-2-butanon, Desoxybenzoin, N-Methoxyphthalimid, p-Sulfobenzoldiazoniumchlorid, p-Sulfamidobenzoldiazoniumchlorid. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Fänger ein Harz, das ein geeignetes Fängermolekül enthält, das daran gebunden ist. Beispiele für Fängerharze umfassen Polymere mit freien Thiolgruppen und Polymere mit freien Aminogruppen, wie z. B. ein Polymer-gebundenes Aminharz, wobei das Amin aus Benzylamin, Ethylendiamin, Diethylamintriamin, Tris(2-aminoethyl)amin, Methylamin, Methylguanidin, Polylysin, Oligolysin, AgroporeTM NH2HL, AgroporeTM NH2LL, 4-Methoxytritylharz und Thiol-2-chlortritylharz ausgewählt ist.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind zur Herstellung von oligomeren Verbindungen geeignet, die monomere Untereinheiten enthalten, die durch verschiedene Verknüpfungen verbunden sind, einschließlich Phosphit-, Phosphodiester-, Phosphorothioat- und/oder Phosphorodithioat-Verknüpfungen, vorausgesetzt, das Oligomer enthält Phosphorodithioat-Verknüpfungen.
  • Der hier verwendete Begriff „Oligomer” oder „oligomere Verbindung” wird verwendet, um Verbindungen zu bezeichnen, die eine Vielzahl von Nukleosidmonomeruntereinheiten enthalten, die durch Verknüpfungen, vorzugsweise Phosphor-enthaltende Verknüpfungen, wie z. B. Phosphit-, Phosphodiester-, Phosphorothioat- und/oder Phosphorodithioat-Verknüpfungen, zwischen Nukleosiden verbunden sind. Der Begriff „oligomere Verbindung” umfasst daher natürlich vorkommende Oligonukleotide, deren Analoga und synthetische Oligonukleotide.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Fänger ein Harz, das ein geeignetes Fängermolekül enthält, das daran gebunden ist. Beispiele für Fängerharze umfassen Polymere mit freien Thiolgruppen und Polymere mit freien Aminogruppen, wie z. B. ein Polymer-gebundenes Aminharz, wobei das Amin aus Benzylamin, Ethylendiamin, Diethylamintriamin, Tris(2-aminoethyl)amin, Methylamin, Methylguanidin, Polylysin, Oligolysin, AgroporeTM NH2HL, AgroporeTM NH2LL (von Aldrich Chem. Co., St. Louis, Mo. erhältlich), 4-Methoxytritylharz und Thiol-2-chlortritylharz ausgewählt ist.
  • Wenn er als Teil des Spaltungsreagenses verwendet wird, wird der Kontakt mit Fluoridionen vorzugsweise in einem Lösungsmittel wie z. B. Tetrahydrofuran, Acetonitril, Dimethoxyethan oder Wasser bewirkt. Die Fluoridionen werden vorzugsweise in der Form von einem oder mehreren Salz(en) bereitgestellt, das bzw. die aus Tetraalkylammoniumfluoriden (z. B. Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF)), Kaliumfluorid, Cäsiumfluorid oder Triethylammoniumhydrogenfluorid ausgewählt ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Herstellung von Phosphat-verknüpften Oligomeren mit verschiedenen Verknüpfungen zwischen Nukleosiden, einschließlich Phosphit-, Phosphodiester-, Phosphorothioat- und/oder Phosphorodithioat-Verknüpfungen und anderen in dem Fachgebiet bekannten Verknüpfungen, anwendbar, vorausgesetzt, das Oligomer enthält Phosphorodithioat-Verknüpfungen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen werden die Verfahren der Erfindung zur Herstellung von oligomeren Verbindungen, einschließlich Oligonukleotiden und deren Analoga, verwendet. Der hier verwendete Begriff „Oligonukleotid-Analogon” steht für Verbindungen, die sowohl natürlich vorkommende (d. h. „natürliche”) als auch nicht-natürlich vorkommende („synthetische”) Reste enthalten kann, wie z. B. nukleosidische Untereinheiten, die modifizierte Zucker- und/oder Nukleobaseabschnitte enthalten kann. Solche Oligonukleotid-Analoga sind typischerweise strukturell von natürlich vorkommenden oder synthetischen Wildtyp-Oligonukleotiden unterscheidbar, jedoch funktionell damit austauschbar. Folglich umfassen Oligonukleotid-Analoga alle solche Strukturen, die dahingehend effektiv wirken, die Struktur und/oder die Funktion eines gewünschten RNA- oder DNA-Strangs z. B. durch Hybridisieren an ein Ziel nachzuahmen. Der Ausdruck synthetisches Nukleosid bezieht sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auf ein modifiziertes Nukleosid. Repräsentative Modifizierungen umfassen eine Modifizierung eines heterocyclischen Baseabschnitts eines Nukleosids, so dass eine nicht-natürlich vorkommende Nukleobase, ein Zuckerabschnitt eines Nukleosids oder beides gleichzeitig erhalten wird.
  • Repräsentative Nukleobasen, die in den hier beschriebenen Verbindungen und Verfahren nützlich sind, umfassen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil und Thymin sowie andere nicht-natürlich vorkommende und natürliche Nukleobasen, wie z. B. Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 5-Halogenuracil und -cytosin, 6-Azouracil, -cytosin und -thymin, 5-Uracil (pseudo-Uracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen-, -Oxa-, -Amino-, -Thiol-, -Thioalkyl-, -Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl- und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin. Weitere natürlich und nicht-natürlich vorkommende Nukleobasen umfassen diejenigen, die im US-Patent Nr. 3,687,808 (Merigan et al.), im Kapitel 15 von Sanghvi in Antisense Research and Application, Hrsg. S. T. Crooke und B. Lebleu, CRC Press, 1993, in Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613–722 (vgl. insbesondere die Seiten 622 und 623), und in Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Hrsg. J. I. Kroschwitz, John Wiley & Sons, 1990, Seiten 858–859, P. D. Cook, Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585–607, beschrieben sind. Der Ausdruck „nukleosidische Base” soll ferner heterocyclische Verbindungen umfassen, die als entsprechende nukleosidische Basen, einschließlich bestimmte „universelle Basen”, die nicht nukleosidische Basen im klassischsten Sinn sind, sondern als nukleosidische Basen wirken, dienen können. Als eine universelle Base wird insbesondere 3-Nitropyrrol genannt.
  • Der hier verwendete Begriff „Alkyl” umfasst unter anderem geradkettige, verzweigte und alicyclische Kohlenwasserstoffgruppen. Alkylgruppen der vorliegenden Erfindung können nicht substituiert sein.
  • Der hier verwendete Begriff „Aralkyl” bezeichnet Alkylgruppen, die Arylgruppen aufweisen, wie z. B. Benzylgruppen. Der Begriff „Alkaryl” bezeichnet Arylgruppen, die Alkylgruppen aufweisen, wie z. B. Methylphenylgruppen. „Aryl”-Gruppen sind aromatische cyclische Verbindungen, die unter anderem Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl, Pyrenyl und Xylyl umfassen.
  • Der hier verwendete Begriff „Alkanoyl” weist dessen gebräuchliche Bedeutung als eine Gruppe der Formel -C(=O)-Alkyl auf. Eine bevorzugte Alkanoylgruppe ist die Acetoylgruppe.
  • Im Allgemeinen bezeichnet der Begriff „Hetero” ein von Kohlenstoff verschiedenes Atom, vorzugsweise, jedoch nicht ausschließlich, N, O oder S. Demgemäß bezeichnet der Begriff „Heterocycloalkyl” ein Alkylringsystem mit einem oder mehreren Heteroatom(en) (d. h. nicht-Kohlenstoffatomen). Bevorzugte Heterocycloalkylgruppen umfassen z. B. Morpholinogruppen. Der hier verwendete Begriff „Heterocycloalkenyl” bezeichnet ein Ringsystem mit einer oder mehreren Doppelbindung(en) und einem oder mehreren Heteroatom(en). Bevorzugte Heterocycloalkenylgruppen umfassen z. B. Pyrrolidinogruppen.
  • Oligomere sind mit einem festen Träger verknüpft. Feste Träger sind Substrate, die als Festphase in synthetischen Festphase-Verfahren dienen können, wie z. B. denjenigen, die in den US-Patenten Nr. 4,415,732 , 4,458,066 , 4,500,707 , 4,668,777 , 4,973,679 und 5,132,418 von Caruthers und den US-Patenten Nr. 4,725,677 und Re. 34,069 von Koster beschrieben sind. Verknüpfungseinheiten sind in dem Fachgebiet als kurze Moleküle bekannt, die zum Verbinden eines festen Trägers mit funktionellen Gruppen (z. B. Hydroxylgruppen) von anfänglichen Synthonmolekülen in Festphase-Synthesetechniken dienen. Geeignete Verknüpfungseinheiten sind z. B. in Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, F. Eckstein, Hrsg., IRL Press, N. Y., 1991, Kapitel 1, Seiten 1–23, beschrieben. Andere Verknüpfungseinheiten umfassen die „TAMRA”-Verknüpfungseinheit, die von Mullah et al., Tetrahedron Letters, 1997, 38, 5751–5754, beschrieben worden ist, und die „Q-Verknüpfungseinheit”, die von Pon et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25, 3629–3635, beschrieben worden ist.
  • Feste Träger gemäß der Erfindung umfassen diejenigen, die in dem Fachgebiet dafür allgemein bekannt sind, dass sie zur Verwendung in Festphase-Verfahren geeignet sind, einschließlich z. B. Glas mit kontrollierter Porengröße (CPG), Oxalylglas mit kontrollierter Porengröße (vgl. z. B. Alul et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527), Tentagel-Träger – ein Aminopolyethylenglykol-derivatisierter Träger (vgl. z. B. Wright et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373) und Poros – ein Copolymer aus Polystyrol/Divinylbenzol.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können Hydroxylgruppen mit einer Hydroxyl-Schutzgruppe geschützt werden. In den Verfahren der Erfindung können viele verschiedene Hydroxyl-Schutzgruppen verwendet werden. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe unter basischen Bedingungen stabil, kann jedoch unter sauren Bedingungen entfernt werden. Im Allgemeinen machen Schutzgruppen chemische Funktionalitäten gegen spezifische Reaktionsbedingungen inert und können an solche Funktionalitäten in einem Molekül ohne wesentliche Schädigung des Rests des Moleküls gebunden und von diesen entfernt werden. Repräsentative Hydroxyl-Schutzgruppen sind von Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223–2311, und auch von Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Kapitel 2, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1991, beschrieben worden. Bevorzugte Schutzgruppen, die für R2, R3 und R3a verwendet werden, umfassen Dimethoxytrityl (DMT), Monomethoxytrityl, 9-Phenylxanthen-9-yl (Pixyl) und 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl (Mox). Die Hydroxyl-Schutzgruppe kann von oligomeren Verbindungen der Erfindung durch bekannte Techniken zur Bildung des freien Hydroxyls entfernt werden. Beispielsweise können Dimethoxytrityl-Schutzgruppen durch protische Säuren, wie z. B. Ameisensäure, Dichloressigsäure, Tri-chloressigsaure, p-Toluolsulfonsäure, oder mit Lewissäuren, wie z. B. Zinkbromid, entfernt werden. Vgl. z. B. Greene und Wuts, vorstehend.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Aminogruppen an Alkyl- oder andere Gruppen, wie z. B. 2'-Alkoxygruppen, gebunden. Solche Aminogruppen liegen üblicherweise auch in natürlich vorkommenden und nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen vor. Es ist allgemein bevorzugt, dass diese Aminogruppen in geschützter Form während der Synthese oligomerer Verbindungen der Erfindung vorliegen. Repräsentative Aminoschutzgruppen, die für diese Zwecke geeignet sind, werden in Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Kapitel 7, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, 1991, beschrieben. Im Allgemeinen zeigt der hier verwendete Begriff „geschützt”, wenn er im Zusammenhang mit einem molekularen Rest, wie z. B. einer „Nukleobase” verwendet wird, dass der molekulare Rest eine oder mehrere Funktionalität(en) enthält, die durch Schutzgruppen geschützt ist bzw. sind.
  • Schwefelungsmittel, die während der Oxidation zur Bildung von Phosphorothioat- und Phosphorodithioatverknüpfungen verwendet werden, umfassen Beaucage-Reagens (vgl. z. B. R. P. Iyer et al., J. Chem. Soc., 1990, 112, 1253–1254, und R. P. Iyer et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 4693–4699); 3-Methyl-1,2,4-thiazolin-5-on (MEDITH; Zong et al., Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2095); Tetraethylthiuramdisulfid (vgl. z. B. H. Vu, B. L. Hirschbein, Tetrahedron Lett., 1991, 32, 3005–3008), Dibenzoyltetrasulfid (vgl. z. B. M. V. Rao et al., Tetrahedron Lett., 1992, 33, 4839–4842); Di(phenylacetyl)disulfid (vgl. z. B. P. C. J. Kamer, Tetrahedron Lett., 1989, 30, 6757–6760); Bis(O,O-diisopropoxyphosphinothioyl)disulfide (vgl. Stec et al., Tetrahedron Lett., 1993, 34, 5317–5320); 3-Ethoxy-1,2,4-dithiazolin-5-on (vgl. Nucleic Acids Research, 1996, 24, 1602–1607, und Nucleic Acids Research, 1996, 24, 3643–3644); Bis(p-chlorbenzolsulfonyl)disulfid (vgl. Nucleic Acids Research, 1995, 23, 4029–4033); Schwefel, Schwefel in einer Kombination mit Liganden, wie z. B. Triaryl-, Trialkyl-, Triaralkyl- oder Trialkarylphosphinen.
  • Geeignete Oxidationsmittel, die zur Bildung der Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Verknüpfungen verwendet werden, umfassen Iod/Tetrahydrofuran/Wasser/Pyridin oder Wasserstoffperoxid/Wasser oder tert-Butylhydroperoxid oder jedwede Persäure, wie z. B. m-Chlorperbenzoesäure. In dem Fall einer Schwefelung wird die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen unter Ausschluss von Luft, insbesondere Sauerstoff, durchgeführt, wohingegen in dem Fall einer Oxidation die Reaktion unter wässrigen Bedingungen durchgeführt werden kann.
  • Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung, die an ein bestimmtes Ziel hybridisierbar sind, umfassen vorzugsweise etwa 5 bis etwa 100 Monomeruntereinheiten. Es ist mehr bevorzugt, dass solche Verbindungen etwa 5 bis etwa 50 Monomeruntereinheiten, mehr bevorzugt 10 bis etwa 30 Monomeruntereinheiten umfassen, wobei 15 bis 25 Monomeruntereinheiten besonders bevorzugt sind. Bei der Verwendung als „Bausteine” beim Aufbau größerer oligomerer Verbindungen sind kleinere oligomere Verbindungen bevorzugt. Bibliotheken von dimeren Verbindungen, trimeren Verbindungen oder Verbindungen höherer Ordnung können mit den Verfahren der Erfindung hergestellt werden. Die Verwendung kleiner Sequenzen, die mittels Festphasenchemie in einer automatisierten Synthese größerer Oligonukleotide synthetisiert werden, erhöhen die Kupplungseffizienz und die Reinheit der schließlich erhaltenen Oligonukleotide. Vgl. z. B. K. Miura et al., Chem. Pharm. Bull., 1987, 35, 833–836, G. Kumar und M. S. Poonian, J. Org. Chem., 1984, 49, 4905–4912, W. Bannwarth, Helvetica Chimica Acta, 1985, 68, 1907–1913, A. Wolter et al., nucleosides and nucleotides, 1986, 5, 65–77.
  • Die vorliegende Erfindung kann für die Herstellung von Oligomeren eingesetzt werden, die viele verschiedene 2'-Substituentengruppen aufweisen können. Der hier verwendete Begriff „2'-Substituentengruppe” umfasst Gruppen, die an die 2'-Position des Zuckerrests mit oder ohne Sauerstoffatom gebunden sind. 2'-Zuckermodifizierungen, die mit der vorliegenden Erfindung gebildet werden können, umfassen Fluor, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, geschütztes O-Alkylamino, O-Alkylaminoalkyl, O-Alkylimidazol und Polyether der Formel (O-Alkyl)m, wobei m 1 bis etwa 10 ist. Von diesen Polyethern sind lineare und cyclische Polyethylenglykole (PEG's) und (PEG)-enthaltende Gruppen, wie z. B Kronenether und diejenigen bevorzugt, die von Ouchi et al., Drug Design and Discovery 1992, 9, 93, Ravasio et al., J. Org. Chem. 1991, 56, 4329, und Delgardo et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249, beschrieben worden sind. Weitere Zuckermodifizierungen sind in P. D. Cook, Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585–607, beschrieben. Eine Fluor-, O-Alkyl-, O-Alkylamino-, O-Alkylimidazol-, O-Alkylaminoalkyl- und Alkylamino-Substitution ist in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 08/398,901, angemeldet am 6. März 1995, mit dem Titel „Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions” beschrieben.
  • Repräsentative 2'-O-Zuckersubstituenten der Formel XII sind in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/130,973, angemeldet am 7. August 1998, mit dem Titel „Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides” beschrieben.
  • Zucker, die O-Substitutionen am Ribosylring aufweisen, sind ebenfalls für die vorliegende Erfindung geeignet. Repräsentative Substitutionen für den Ring-O umfassen S, CH2, CHF und CF2, vgl. z. B. Secrist et al., Abstract 21, Program & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, Park City, Utah, 16. bis 20. September 1992.
  • Repräsentative cyclische 2'-O-Zuckersubstituenten der Formel XIII sind in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/123,108, angemeldet am 27. Juli 1998, mit dem Titel „RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized” beschrieben.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden die Verbindungen der Erfindung zum Modulieren von RNA oder DNA verwendet, die ein Protein kodieren, dessen Bildung oder Aktivität moduliert werden soll. Der Zielabschnitt der einzusetzenden Zusammensetzung wird folglich so ausgewählt, dass er zu dem vorausgewählten Abschnitt von DNA oder RNA, der an diesen Abschnitt hybridisierbar sein soll, komplementär ist.
  • Die oligomeren Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung können in der Diagnostik, der Therapie und als Forschungsreagenzien und -kits verwendet werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Einbeziehen eines geeigneten pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels oder Trägers verwendet werden. Sie können ferner zur Behandlung von Organismen mit einer Krankheit verwendet werden, die durch die unerwünschte Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist. Der Organismus sollte mit einem Oligonukleotid in Kontakt gebracht werden, das eine Sequenz aufweist, die mit einem Strang einer Nukleinsäure, die das unerwünschte Protein kodiert, spezifisch hybridisieren kann. Behandlungen dieses Typs können mit verschiedenen Organismen von einzelligen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen bis zu mehrzelligen eukaryotischen Organismen durchgeführt werden. Jedweder Organismus, der eine DNA-RNA-Transkription oder RNA-Protein-Translation als grundlegenden Teil von dessen Vererbung, metabolischer oder zellulärer Kontrolle nutzt, ist bezüglich einer therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung gemäß der Erfindung empfindlich. So unterschiedliche Organismen wie z. B. Bakterien, Hefen, Protozoen, Algen, alle Pflanzen und alle höheren tierischen Formen, einschließlich warmblütige Tiere, können behandelt werden. Ferner kann jede Zelle von mehrzelligen Eukaryoten behandelt werden, da sie sowohl eine DNA-RNA-Transkription als auch eine RNA-Protein-Translation als integrierte Teile ihrer zellulären Aktivität umfasst. Ferner umfassen viele der Organelle (z. B. Mitochondrien und Chloroplasten) von eukaryotischen Zellen ebenfalls Transkriptions- und Translationsmechanismen. Folglich können auch einzelne Zellen, zelluläre Populationen oder Organelle in die Definition von Organismen einbezogen werden, die mit therapeutischen oder diagnostischen Oligonukleotiden behandelt werden können.
  • Die folgenden Beispiele sollen veranschaulichend und nicht beschränkend sein. Sämtliche Beispiele liegen nicht unbedingt im Umfang der Ansprüche.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Vergleichsbeispiel: Vorliegende Erfindung gegen das Verfahren des Standes der Technik von Erjita et al.
  • Die Behandlung von Cyanethyl-geschützten Oligonukleotid-Phosphorothioaten mit Ammoniumhydroxid führt zur Erzeugung von einem Äquivalent Acrylnitril (AN) pro Phosphorothioat-verknüpfung. In der Gegenwart von Ammoniumhydroxid reagiert ein kleiner Prozentsatz von Thymidinresten mit dem freigesetzten AN unter Bildung von N3-Cyanethylthymidin (CN-T)-Resten.
  • Nonadecathymidinyloctadecaphosphorothioat (T-19 P=S) wurde unter drei Sätzen von Bedingungen synthetisiert und entschützt:
    • (a) Ammoniumhydroxid, 60°C, 16 Stunden,
    • (b) Triethylamin-Pyridin (2:3, v/v), 25°C, 3 Stunden, dann Ammoniumhydroxid, 60°C, 16 Stunden,
    • (c) Triethylamin-Acetonitril (1:1, v/v), 25°C, 12 Stunden, dann Ammoniumhydroxid, 60°C, 16 Stunden.
  • Bei dem zweiten Satz von Bedingungen handelt es sich um diejenigen, die von Erijta empfohlen werden. Die rohen Oligonukleotide, die durch Verdampfen der Ammoniumhydroxidlysate erhalten werden, wurden detrityliert und mittels Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie (LC-MS) untersucht, um die Menge des vorliegenden CN-T zu quantifizieren. Es wurde gezeigt, dass die Konzentrationen von CN-T in T-19 P=S-Proben, die den Bedingungen a), b) und c) unterworfen worden sind, etwa 15%, 2% bzw. weniger als 0,1 betrugen.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Bedingungen, die von Erijta vorgeschlagen worden sind, zur Bildung von Oligonukleotiden führen, die immer noch hohe Konzentrationen an CN-T-Resten enthalten, wohingegen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die CN-T-Bildung auf eine Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze des Tests drücken.
  • Beispiel 2
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 1 Minute durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit einer Lösung von Triethylamin in Acetonitril (1:1, v/v) für 12 Stunden gewaschen, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 3
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 160 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit einer Lösung von Triethylamin in Acetonitril (1:1, v/v) für 12 Stunden gewaschen, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 4
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot 1 Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 1 Minute durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in einen Behälter überführt, mit einer Lösung von Triethylamin in Acetonitril (1:1, v/v) für 12 Stunden gerührt, filtriert, dann mit 30%igem wässrigen Ammoniumhydroxid behandelt, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 5
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 160 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in einen Behälter überführt, mit einer Lösung von Triethylamin in Acetonitril (1:1, v/v) für 12 Stunden gerührt, filtriert, dann mit 30%igem wässrigen Ammoniumhydroxid behandelt, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 6
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 1 Minute durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid zusammen mit Thymidin eingebracht, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 7
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 160 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid zusammen mit Thymidin eingebracht, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 8
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 1 Minute durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid zusammen mit Uridin eingebracht, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 9
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 160 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid zusammen mit Uridin eingebracht, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 10
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 1 Minute durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid zusammen mit Imidazol eingebracht, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 11
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 160 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,45 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger in 30%iges wässriges Ammoniumhydroxid zusammen mit Imidazol eingebracht, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 12
  • GMP-Herstellung eines vollständig modifizierten 5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3'-Phosphorothioat 20-mer (ISIS 2302) auf OligoProcess
  • ISIS 2302 (5'-d(GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA)-3') wurde unter den Bedingungen einer guten Laborpraxis (GMP) auf einem Pharmacia OligoProcess-Synthesegerät in einem 150 mmol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia hergestellt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit einer Lösung von Triethylamin in Acetonitril (1:1, v/v) für 30 Minuten gewaschen und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, filtriert, mit Acetonitril-Lösungsmittel gewaschen und dann mit 30%igem wässrigen Ammoniumhydroxid behandelt, abgespalten, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt. Das Oligonukleotid wurde mittels Massenspektrometrie analysiert, um die Beseitigung des Acrylnitriladdukts zu bestätigen.
  • Beispiel 13
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Thymidinnukleosid (20 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 14
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot 1 Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Uridinnukleosid (20 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 15
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Inosinnukleosid (20 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 16
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Thymin (25 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 17
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Uracil (25 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 18
  • Synthese eines vollständig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Imidazol (50 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiel 19
  • Synthese eines vollstä+ndig modifizierten 5'-d(TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T)-3'-Phosphorothioat 20-mer
  • Die Synthese der vorstehenden Sequenz wurde auf einem Pharmacia OligoPilot I Synthesegerät in einem 30 Mikromol-Maßstab unter Verwendung der Cyanethylphosphoramidite, die von Pharmacia erhalten worden sind, und von HL 30 Primärträger von Pharmacia durchgeführt. Die Detritylierung wurde unter Verwendung von 3% Dichloressigsäure in Toluol (Volumen/Volumen) durchgeführt. Die Aktivierung von Phosphoramiditen wurde mit einer 0,4 M-Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril durchgeführt. Die Schwefelung wurde unter Verwendung einer 0,2 M-Lösung von Phenylacetyldisulfid in Acetonitril:3-Picolin (1:1 v/v) für 2 Minuten durchgeführt. Am Ende der Synthese wurde der Träger mit Benzylmercaptan (50 Äquivalente) inkubiert, entschützt und in der üblichen Weise gereinigt.
  • Beispiele 20 bis 27
  • Oligonukleotidsynthese
  • Oligodesoxynukleotide wurden auf einem ABI 380B DNA-Synthesegerät unter Verwendung einer 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)nukleosid-3'-O-(carboxymethyloxy)acetat-derivatisierten CPG 1-Phosphoramidit-Chemie (in dem nachstehenden Schema 1 gezeigt) und entweder einem käuflichen Oxidationsmittel oder 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (0,05 M in MeCN) als Schwefelübertragungsreagens aufgebaut.
  • Schema 1 Feste Träger
    Figure DE000069937439T3_0001
    Schema 2 Entschützen und Freisetzen des Oligonukleotids 5 von dem festen Träger Schema 2
    Figure DE000069937439T3_0002
  • Desoxynukleosid-CE-Phosphoramidite, die in einer Standardweise geschützt worden sind (Abz, Cbz, Gib) wurden zur Synthese von Oligonukleotiden verwendet, die in den Beispielen 21, 23 bis 27 dargestellt sind. Diejenigen, die zur Herstellung von Oligonukleotiden verwendet worden sind, die in den Beispielen 20 und 22 dargestellt sind, wurden entweder mit Phenoxyacetyl (PAC)- oder 4-(t-Butyl)phenoxyacetyl(tBPA)-Gruppen geschützt.
  • Beispiel 20
  • Zweistufiges Entschützen von Oligonukleotiden mit sekundären Aminen in einem organischen Lösungsmittel gefolgt von methanolischem K2CO3
  • Das Entschützungsverfahren ist im Schema 2 beispielhaft für Dodecathymidylat 5 dargestellt. Nach der vollständigen Oligonukleotidsynthese wurde an festem Träger gebundenes 2 entweder mit 2M Diethylamin oder 1M Piperidin in MeCN, Dioxan, THF oder DMF (3 ml) für 2 Stunden bis 12 Stunden decyanethyliert. Die Säule wurde mit Dioxan (10 ml) gewaschen, so dass 3 erhalten wurde. Andere Amine, wie z. B. Morpholin, Pyrrolidin oder Dimethylamin können ebenfalls in diesem Schritt verwendet werden.
  • Das Oligonukleotid 4 wurde von dem festen Träger 3 durch Behandeln mit 0,01 bis 0,05 M K2CO3 in MeOH (2'5 ml und 2'20 ml für 1- bzw. 15 mmol-Synthesen) freigesetzt. Jeder Teil wurde für 45 min vor und zurück durch die Säule geschickt und durch Laufenlassen durch eine kurze Säule mit Dowex 50 W'8 (PyH+, etwa 1 ml) neutralisiert. Die vereinigten Eluate wurden zur Trockne eingedampft, zusammen mit MeCN (10 ml) eingedampft und in Wasser gelöst. Das Ziel-Oligonukleotid 4 wurde durch RP-HPLC auf einer Delta Pak 15 mm C18 300 Å-Säule (3,9 × 300 mm und 7,8 × 300 mm für 1- bzw. 15 mmol-Synthesen) unter Verwendung von 0,1 M NH4OAc als Puffer A, 80% wässrigem MeCN als Puffer B und einem linearen Gradienten von 0 bis 60% B in 40 min bei einer Flussrate von 1,5 bzw. 5 ml min–1 isoliert. Gesammelte Fraktionen wurden eingedampft und mit 80% wässriger AcOH für 30 min bei Raumtemperatur detrityliert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, das Produkt wurde in Wasser wieder gelöst und durch Injizieren auf die gleiche Säule, dann Waschen mit Wasser (10 min) und Eluieren eines Oligonukleotids 5 als Ammoniumsalz mit 50% wässrigem MeCN (20 min) entsalzt. Die Homogenität von 5 wurde mittels RP-HPLC und Kapillarelektrophorese charakterisiert. ESMS: 3764,2 (gefunden), 3765,1 (berechnet).
  • Die Effizienz des Entschützungsverfahrens wurde bei der Herstellung der Oligonukleotid-Phosphorothioate 6 und 7 (Isis 1939) und des Phosphodiester-Oligonukleotids 8 in einem Maßstab von 1 bis 15 mmol verifiziert.
    • 6: C5A2T11-Thioat. ESMS: 5628,3 (gefunden), 5629,6 (berechnet).
    • 7: C5AC2ACT2C4TCTC-Thioat. ESMS: 6438,6 (gefunden), 6440,2 (berechnet).
    • 8: C5A2T11. ESMS: 5355,8 (gefunden), 5356,4 (berechnet).
  • Beispiel 21
  • Zweistufiges Entschützen des Oligonukleotids TGCATC5AG2C2AC2AT (9) mit sekundären Aminen in einem organischen Lösungsmittel gefolgt von einer Ammonolyse
  • Ein an einem festem Träger gebundenes Oligonukleotid wurde entweder mit 2M Diethylamin oder 1M Piperidin, Morpholin oder Diethylamin in MeCN, Dioxan, THF oder DMF decyanethyliert, wie es im Beispiel 20 beschrieben worden ist. Andere Amine, wie z. B. Morpholin, Pyrrolidin oder Dimethylamin können ebenfalls in diesem Schritt verwendet werden.
  • Der feste Träger wurde mit konzentriertem wässrigen Ammoniak für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, die Lösung wurde gesammelt und 8 Stunden bei 55°C gehalten. Bei der Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Wasser wieder gelöst und gereinigt, wie es im Beispiel 20 beschrieben worden ist.
    • 9: ESMS: 5980,9 (gefunden), 5982,8 (berechnet).
    • 10: TGCATC5AG2C2AC2AT-Thioat. ESMS: 6287,8 (gefunden), 6288,0 (berechnet).
  • Beispiel 22
  • Entschützen von synthetischen Oligonukleotiden mit wässrigen Aminen
  • Das Entschützungsverfahren wird beispielhaft für das Oligonukleotid 10 angegeben. Ein an einen festen Träger gebundenes Material (20 μmol) wurde mit 1 M wässrigem Piperidin für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Andere Amine, wie z. B. Morpholin, Pyrrolidin, Diethylamin, Dimethylamin, Ethylamin oder Methylamin, können ebenfalls in diesem Schritt verwendet werden. Der feste Träger wurde mit einem anderen Teil des Entschützungsreagenses gewaschen und vereinigte Lösungen wurden unter vermindertem Druck eingedampft. Rohes 5'-DMTr-geschütztes Oligonukleotid wurde in Wasser (5 ml) gelöst und mittels halb-präparativer HPLC auf einer DeltaPak C18-Säule (Waters, 15 mm, 300 Å, 25'100 mm) unter Verwendung von 0,1 M NH4OAc als Puffer A, 80% wässrigem MeCN als Puffer B und einem linearen Gradienten von 0 bis 40% B in 50 min bei einer Flussrate von 15 ml min–1 gereinigt. Gesammelte Fraktionen wurden eingedampft, der Rückstand wurde mit 80% wässriger AcOH für 30 min behandelt und zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Material wurde in 50% wässrigem DMSO gelöst und auf die gleiche Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 0,05 M wässrigem NaOAc (15 min) und Wasser (15 min) bei einer Flussrate von 15 ml min–1 gewaschen. Eine Elution mit 60% wässrigem MeCN und Eindampfen zur Trockne ergaben 23,0 mg (20%) entsalztes Oligonukleotid 10 (Na+-Salz), ESMS: 6286,4 (gefunden), 6288,0 (berechnet).
  • Beispiel 23
  • Entschützen von synthetischen Oligonukleotiden mit wässrigen sekundären Aminen
  • Nach dem Abschluss der Oligonukleotidsynthese wurde ein an einen festen Träger gebundenes Material (20 mmol) mit einem wässrigen Amin behandelt, wie es im Beispiel 22 beschrieben worden ist. Nach dem Eindampfen der Lösung des entschützenden Reagenses wurde der Rückstand 8 Stunden bei 55°C mit Ammoniumhydroxid behandelt und das Lösungsmittel wurde verdampft. Das Produkt, 6, wurde isoliert und charakterisiert, wie es im Beispiel 22 beschrieben worden ist.
  • Beispiel 24
  • Entschützen von synthetischen Oligonukleotiden mit Ammoniak in der Gegenwart von Aminoalkylharzen als Acrylnitrilfänger. Verfahren A
  • Nach dem Abschluss der Oligonukleotidsynthese wird ein an einen festen Träger gebundenes Material (20 mmol) mit einem Aminoalkylharz [z. B. Aminoalkyl-CPG oder Polymer-gebundenem Tris(2-aminoethyl)amin] gemischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit konzentriertem wässrigen Ammoniak behandelt. Die Festphase wird abfiltriert und das Entschützen wird durch Halten der Lösung bei 55°C für 8 Stunden vervollständigt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und das Produkt wird isoliert und charakterisiert, wie es im Beispiel 22 beschrieben worden ist.
  • Beispiel 25
  • Entschützen von synthetischen Oligonukleotiden mit Ammoniak in der Gegenwart von Aminoalkylharzen als Acrylnitrilfänger. Verfahren B
  • Ein an einen festen Träger gebundenes Material (20 mmol) wird 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem Fluss von konzentriertem wässrigen Ammoniak behandelt. Nach dem Verlassen des Reaktionsbehälters wird die Lösung durch eine zweite Säule geleitet, die ein Aminoalkylharz wie im Beispiel 24 enthält, und gesammelt. Gegebenenfalls kann die gesammelte Lösung durch erneutes Leiten durch beide Säulen rezykliert werden. Wenn das Freisetzen von Oligonukleotid von dem CPG vollständig ist, wird die Oligonukleotidlösung gesammelt und wie im Beispiel 24 behandelt.
  • Beispiel 26
  • Entschützen von synthetischen Oligonukleotiden mit Ammoniak in der Gegenwart von Mercaptanen als Acrylnitrilfänger
  • Ein an einen festen Träger gebundenes Oligonukleotid wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur mit konzentriertem wässrigen Ammoniak und Thiokresol (0,1 M) behandelt, die Lösung wurde gesammelt und 8 Stunden bei 55°C gehalten. Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in Wasser wieder gelöst und zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die wässrige Schicht wurde gesammelt und das Produkt, 5, wurde isoliert und charakterisiert, wie es im Beispiel 20 beschrieben worden ist. Andere Thiole, wie z. B. Thiophenol, Mercaptoethanol, 1,3-Ethandithiol oder Ethanthiol, können ebenfalls als Acrylnitrilfänger verwendet werden.
  • Beispiel 27
  • Entschützen von synthetischen Oligonukleotiden mit Ammoniak in der Gegenwart von mercaptoalkylierten Harzen als Acrylnitrilfänger
  • Ein an einen festen Träger gebundenes Oligonukleotid wird wie im Beispiel 25 behandelt, jedoch enthält die zweite Säule ein mercaptoalkyliertes Harz (z. B. bereits beschriebene mercaptoalkylierte Harze (H. Salo, A. Guzaev, H. Lönnberg, Bioconjugate Chem., 1998, 9, 365–371) oder NovaSyn® TG-Thiolharz). Das Produkt wird isoliert und charakterisiert, wie es im Beispiel 20 beschrieben worden ist.

Claims (13)

  1. Verfahren zum Entschützen eines Phosphat-verknüpften Oligomers, wobei das Oligomer eine Vielzahl von geschützten Phosphorverknüpfungen der Formel:
    Figure DE000069937439T3_0003
    aufweist, worin X jeweils O oder S ist, das Oligomer jedoch Phosphorthioatbindungen aufweist, Rt eine Phosphor-Schutzgruppe der Formel: -CH2-CH2-C≡N oder -CH2-(CH=CH)p-CH2-C≡N ist, worin p eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, umfassend: (a) das Bereitstellen einer Probe, enthaltend eine Vielzahl der Phosphat-verknüpften Oligomere gebunden an einen festen Träger, (b) das Inkontaktbringen der Oligomere mit einem entschützenden Reagens für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Gruppen Rt von den Oligomeren unter Bildung einer Vielzahl von entschützten Oligomeren zu entfernen, wobei das entschützende Reagens mindestens ein aliphatisches Amin umfasst, wobei die konjugierte Säure des Amins einen pKa von 8 bis 11 aufweist, wobei das entschützende Reagens weiter ein oder mehrere Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyllösungsmitteln, Halogenalkyllösungsmitteln, und Cyanalkyllösungsmitteln umfasst, und (c) das Umsetzen der entschützten Oligomere mit einem Spaltungsreagens zur Abspaltung der entschützten Oligomere vom festen Träger, wobei, nach dem Kontakt mit dem entschützenden Reagens, die Oligomere vor der Reaktion mit dem Spaltungsreagens gewaschen werden, und wobei Alkyl mit Ausnahme von Halogen im Fall von Halogenalkyl und Cyan im Fall von Cyanalkyl nicht substituiert ist.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das entschützende Mittel ein Halogenalkyllösungsmittel oder ein Cyanalkyllösungsmittel umfasst.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Phosphor-Schutzgruppe -CH2-CH2-C≡N ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens weiter einen Fänger umfasst, wobei es sich bei dem Fänger um ein Mercaptan, ein beta-Aminothiol, ein Phosphin, ein Phosphit, ein Dien, einen Harnstoff, einen Thioharnstoff, ein Amid, ein Imid, ein cyclisches Imid, ein Keton, ein Polymer mit freien Thiolgruppen oder ein Polymer mit freien Aminogruppen handelt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Fänger ein Alkylmercaptan, Thiol-4-methoxytritylharz, Thiol-2-chlortritylharz, Ethylenglykol, substituiertes Ethylenglykol, 1-Butanthiol, S-(2-Amino-4-thiazolylmethyl)isothioharnstoffhydrochlorid, 2-Mercaptoethanol, 3,4-Dichlorbenzylamin, Benzylamin, Benzylamin in der Gegenwart von Schwefelkohlenstoff, Hydroxylamin, 2-Phenylindol, n-Butylamin, Diethylester von Acetaminomalonsäure, Ethylester von N-Acetyl-2-cyanglycin, 3-Phenyl-4-(o-fluorphenyl)-2-butanon, 3,4-Diphenyl-2-butanon, Desoxybenzoin, N-Methoxyphthalimid, p-Sulfobenzoldiazoniumchlorid, p-Sulfamidobenzoldiazoniumchlorid oder ein Polymer-gebundenes Aminharz ist, wobei das Amin aus Benzylamin, Ethylendiamin, Diethylamintriamin, Tris(2-aminoethyl)amin, Methylamin, Methylguanidin, Polylysin, Oligolysin, Agropore®NH2HL, und Agropore®NH2LL ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens eine wässrige methanolische Lösung eines Metallcarbonats der Gruppe I oder Gruppe II umfasst.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Spaltungsreagens wässriges methanolisches CaCO3 ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens ein wässriges Metallhydroxid umfasst.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens einen Phasentransferkatalysator umfasst, wobei der Phasentransferkatalysator ein quartäres Ammoniumsalz, quartäres Phosphoniumsalz, Kronenether, t-Bu4N+OH oder t-Bu4N+F ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Spaltungsreagens NaNH2 umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die entschützten Oligomere von 0,1% bis 1% Acrylnitriladdukt aufweisen.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die entschützten Oligomere von 0,1% bis 0,75% Acrylnitriladdukt aufweisen.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die entschützten Oligomere von 0,1% bis 0,5% Acrylnitriladdukt aufweisen.
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