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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet der spektralen Kalibrierung von Fluoreszenz-basierten
automatisierten Instrumenten zur Bestimmung von Polynukleotidlängen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
spektrale Kalibrierung soll Referenz-Spektralprofile (Referenzspektren)
von bestimmten fluoreszierenden Farbstoffen, unter Verwendung des
optischen Messsystems eines automatisierten DNA Sequenzierers oder
einer ähnlichen Auftrennungsvorrichtung
für fluoreszierende
Polynukleotide, bei der bestimmte Farbstoffe verwendet werden, abschätzen. Die
bisherige Praxis der spektralen Kalibrierung ist auf die separate
Messung der spektralen Profile jedes einzelnen fluoreszierenden Farbstoffes
angewiesen. Dieser Ansatz zur spektralen Kalibrierung von Vorrichtungen
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide resultiert in einem reduzierten
Durchsatz, da er N Spuren bei gel-basierten Instrumenten benötigt und
N einzelne Läufe
bei Kapillar-basierten Instrumenten benötigt. Da weitere fluoreszierende
Farbstoffe routinemäßig entwickelt und
verwendet werden (es wird von einem ansteigendem N ausgegangen),
wird die spektrale Kalibrierung von Vorrichtungen zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide anspruchsvoller und, unter der bisherigen
Praxis, immer weniger effizient. Zusätzlich steigt der Umfang der
Computer Ressourcen, die der spektralen Kalibrierung gewidmet sind,
ebenfalls mit der Anzahl der Farbstoffe und der analysierten Auftrennungskanäle.
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Zusammenfassung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen, wie
sie in den Ansprüchen
definiert sind. Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen
zum Detektieren des elektrischen Stromflusse durch einen Trennungskanal
einer Vorrichtung zur Trennung von fluoreszierendem Polynukleotid.
Diese Verfahren und Zusammensetzungen setzen Überwachungsfarbstoffe ein. Überwachungsfarbstoffe
sind fluoreszierende Farbstoffe, die spektral verschieden sind von
dem Farbstoff auf dem Polynukleotid, das genetische Information
vermitteln soll, z. B., fluoreszierende Polynukleotid-Sequenzierungsreaktionsprodukte.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein Diagramm eines Beispiels eines Teils eines temporalen Profils,
welches markiert wurde, um Beispiele einiger der hier verwendeten Begriffe
zu geben.
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Definitionen
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Der
Begriff „Vorrichtung
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide", wie hier verwendet, bezeichnet eine
Vorrichtung zur Auftrennung von Polynukleotidmischungen (z. B. durch
Elektrophorese) und Detektion der aufgetrennten Polynukleotide anhand
der Fluoreszenzemission, die durch Anregung des fluoreszierenden
Farbstoffes erzeugt wird. Beispiele für Vorrichtungen zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide beinhalten automatisierte DNA Sequenzierer,
wie die PE Applied Biosystems 310 und 377 (Foster City, Kalifornien).
Beispiele für
Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide werden
auch, unter anderem, in den
U.S. Patenten
Nr. 4,971,677 ;
5,062,942 ;
5,213,673 ;
5,277,780 ;
5,307,148 ;
4,811,218 ; und
5,274,240 beschrieben. Der Begriff
Vorrichtung zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide beinhaltet
ebenfalls ähnliche
Instrumente zur Analyse der Länge
von Polynukleotidfragmenten, welche zu der für die Erlangung der DNA Basen
Sequenzinformation benötigte Auflösung von
einzelnen Basenpaaren nicht fähig sind.
Die Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
umfassen eine oder mehrere Auftrennungsregionen oder -kanäle, typischerweise der
Weg des elektrischen Stromflusses in elektrophoretischen Vorrichtungen
zur Auftrennung. Arten der Auftrennungskanäle beinhalten Kapillaren, Mikrokanäle, Röhren, Scheibengele
und ähnliche.
Die Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
sammeln während
ihres Betriebs verschiedene Typen von Daten. Diese Daten beinhalten
spektrale Daten und zeitliche Daten, die den fluoreszierenden Polynukleotiden,
welche von der Vorrichtung aufgetrennt wurden, zugeordnet sind.
Typischerweise werden solche Daten von einem Detektor (z. B. einer
CCD Anordnung, einer Photovervielfacherröhre und ähnlichem) detektiert, der dazu
ausgelegt ist, quantitative spektrale Daten über eine vorherbestimmte Region
oder Regionen der Auftrennungskanäle zu sammeln. Die von der
Vorrichtung gesammelten spektralen Daten beinhalten die Intensität der Fluoreszenz
bei einer Vielzahl von Wellenlängen.
Die unterschiedlichen abgetasteten Wellenlängen werden als Bins oder Kanäle bezeichnet.
Die Vorrichtung sammelt weiterhin zeitliche Daten, die mit den spektralen
Daten korreliert werden. Die zeitlichen Daten werden zu zahlreichen
verschiedenen Zeitpunkten gesammelt. Zum Beispiel wird ein an einer
festen Position befindlicher Detektor die Zu- und Abnahmen der Fluoreszenzintensität als eine Funktion
der Zeit messen, wenn eine markierte Polynukleotidspitze am Detektor
vorbeizieht. Diese zeitlichen Daten können als „Einzelbild-" oder „Abtastnummer" ausgedrückt werden,
um die unterschiedlichen zeitlichen Abtastpunkte auszudrücken. Der
Begriff „Polynukleotid", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf natürlich
vorkommende Polynukleotide, wie DNA und RNA und auf synthetische
Analoge von natürlich
vorkommender DNA, z. B. Phosphorothioate, Phosphoramidate, Peptid-Nukleinsäuren (PNAs)
und ähnliche.
Der Begriff „Polynukleotid" enthält keine
Limitierung der Länge
und sollte so verstanden werden, dass er in vitro synthetisierte
Oligonukleotide mit einschließt.
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Spezifische Ausführungsformen der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen, wie
sie in den Ansprüchen
definiert sind. Fluoreszierende Farbstoffe haben charakteristische
Emissionsspektren für
eine gegebene Anregungswellenlänge.
Wenn mehrere unterschiedliche Farbstoffe in einer aufzutrennenden
Mischung vorhanden sind, müssen
die individuellen Beiträge der
verschiedenen Farbstoffe an der ausgelesenen spektralen Detektion
von einander getrennt werden. Solch eine Trennung kann mittels Verwendung
einer Matrix, die die spektralen Emissionsdaten der verschiedenen
Farbstoffe enthält,
die für
die Analyse verwendet werden, erreicht werden, siehe Yin et al., Electrophoresis
17: 1143–1150
(1996) und
WO 97/46963 .
WO 93/14224 bezieht sich
auf eine Größenkalibrierungsmischung,
die verwendet wird, um eine Einzelbasenpaarauflösung der Polynukleotidfragmente
in der Elektrophorese zu erreichen.
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Die
Verwendung von vier spektral verschiedenen Farbstoffen, von denen
jeder im Wesentlichen derselbe wie der Farbstoff ist, der in Sequenzierungen
vom Typ des Kettenabbruchs mit vier Farben verwendet wird, ist von
besonderem Interesse für
die Verwendung in Sequenzierungen vom Typ des Kettenabbruchs mit
vier Farben (die entweder fluoreszenzmarkierte Kettenabbruchsnukleotide,
oder fluoreszenzmarkierte Primer verwenden). Der multiple Farbkalibrierungsstandard
kann ein oder mehrere fluoreszierende Molekül(e) zusätzlich zu den Farbstoffen im
Standard umfassen, welche mit den Farbstoffen korrespondieren, die
in Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, die für die Verwendung
mit dem bestimmten Standard entwickelt wurden. Diese zusätzlichen
Farbstoffe können „Signal
Farbstoffe" sein,
wie später
in dieser Anmeldung beschrieben. Diese zusätzlichen Farbstoffe, die vorzugsweise
an Polynukleotide angeheftet sind, können zur Überwachung des elektrischen
Stromflusses durch den Auftrennungskanal oder die Auftrennungskanäle einer Vorrichtung
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide verwendet werden.
Während
die Detektion des elektrischen Stromflusses durch eine Vorrichtungen
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide ohne die Verwendung
von zusätzlichen
Farbstoffen für
Vorrichtungen, die einen einzelnen Auftrennungskanal verwenden,
z. B. ein Scheibengel, relativ einfach ist, ist die Detektion des
Stromflusses durch ein Multikanalsystem, z. B. ein multiples Kapillarsystem,
ohne die Verwendung zusätzlicher
Farbstoffe schwierig. Die Bewegung dieser zusätzlichen Farbstoffe, welche
ebenfalls zu der zu analysierenden Probe gegeben werden sollten,
durch die Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide hindurch
kann detektiert werden, um den Fluss von elektrischem Strom durch
einen Auftrennungskanal, z. B. einer individuellen Kapillare, zu überprüfen.
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Eine
große
Vielzahl an fluoreszierenden Farbstoffen kann verwendet werden,
um die Polynukleotide in multiplen Farbkalibrierungsstandards zu markieren.
Fluoreszierende Farbstoffe sind dem Fachmann wohlbekannt. Beispiele
von fluoreszierenden Farbstoffen schließen Fluorescein, 6-Carboxyfluorescein,
2',4',5',7',-Tetrachloro-4,7-dichlorofluorescein,
2',7'-Dimethoxy-4',5'-6-Carboxirhodamin (JOE),
N',N',N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA)
und 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) ein. Fluoreszierende Farbstoffe sind
in, unter anderem,
U.S. Patent
4,855,225 ; Menchen et al,
U.S.
Patent 5,188,934 ; Bergot et al, Internationale Anmeldung PCT/US90/05565;
Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probe and Research Chemicals,
6. Ausgabe (1996) und ähnlichen
Referenzen beschrieben. Beispiele für solche Farbstoffe schließen Verfahren zum
Anbringen von fluoreszierenden Farbstoffen an Polynukleotide ein
und sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt. Beispiele für solche
Verfahren zur Anbringung können
in, unter anderem,
U.S. Patent Nr.
4,789,737 ;
4,876,335 ;
4,820,812 und
4,667,025 gefunden werden.
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Detektieren
des elektrischen Stromflusses durch einen Trennungskanal einer Trennungsvorrichtung
für fluoreszierendes
Polynukleotid. Solche Verfahren und Zusammensetzungen sind besonders
mit einer Trennungsvorrichtung für
fluoreszierendes Polynukleotid nützlich,
die multiple Trennungskanäle
einsetzt, z. B., ein Multikapillar- oder multiples Mikrokanalsystem,
da Unterbrechungen des Stromflusses in individuellen Trennungskanälen schwierig
zu detektieren sein kann, wenn ein wesentlicher Prozentsatz der
Kanäle
korrekten Stromfluss besitzt. Die Beobachtungsverfahren für den elektrischen
Fluss involvieren die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen,
die von den hauptsächlich
interessierenden fluoreszierende markierten Polynukleotiden spektral
verschieden sind. Diese spektral verschiedenen fluoreszierenden
Farbstoffe werden hier als Überwachungsfarbstoffe
bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
der Überwachungsfarbstoff
so ausgewählt,
das eine signifikante Emission produziert, wenn er durch die gleiche
Anregungsquelle oder – quellen
angeregt wird, die verwendet wird, um die anderen fluoreszierenden
Farbstoffe in der interessierenden Zusammensetzung anzuregen.
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Zum
Beispiel kann eine Polynukleotid-Sequenzierungsreaktionsproduktmischung
(Kettenterminationssequenzierung) enthalten: (1) vier spektral verschiedene
fluoreszierende Farbstoffe, wobei jeder der vier Farbstoffe mit
einer anderen Polynukleotidbase korreliert ist (z. B.) fluoreszierend markierte
Dideoxy-Sequenzierung) und (2) einen Überwachungsfarbstoff, die der
spektral von den vier anderen Farbstoffen verschieden ist. Bewegung
des Überwachungsfarbstoffs
in einem Trennungskanal kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass
sich Stromfluss und daher korrekte Trennung des Sequenzierungsreaktionsprodukte
ereignet. Überwachungsfarbstoffe
können
in Verbindung mit Sequenzreaktionsmischungen verwendet werden, die
entweder mehr oder weniger als vier Farbstoffe einsetzen.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung sind Verfahren und Zusammensetzungen
zum Detektieren des elektrischen Stromflusses durch einen Trennungskanal
einer Trennungsvorrichtung für
fluoreszierendes Polynukleotid. Solche Verfahren und Zusammensetzungen
sind besonders mit einer Trennungsvorrichtung für fluoreszierendes Polynukleotid nützlich,
die multiple Trennungskanäle
einsetzt, z. B., ein Multikapillar- oder multiples Mikrokanalsystem wegen
der Möglichkeit
des Versagens eines der Trennungskanäle. Die Überwachungsverfahren für den elektrischen
Fluss involvieren die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen,
die von den hauptsächlich
interessierenden fluoreszierende markierten Polynukleotiden spektral
verschieden sind. Diese spektral verschiedenen fluoreszierenden
Farbstoffe werden hier als Überwachungsfarbstoffe
bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
der Überwachungsfarbstoff
so ausgewählt,
dass er eine signifikante Emission produziert, wenn er durch die
gleiche Anregungsquelle oder -quellen angeregt wird, die verwendet
wird, um die anderen fluoreszierenden Farbstoffe in der interessierenden
Zusammensetzung anzuregen.
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Zum
Beispiel kann eine Polynukleotid-Sequenzierungsreaktionsproduktmischung
(Kettenterminationssequenzierung) enthalten: (1) vier spektral verschiedene
fluoreszierende Farbstoffe, wobei jeder der vier Farbstoffe mit
einer anderen Polynukleotidbase korreliert ist (z. B.) flureszierend
markierte Dideoxy-Sequenzierung) und (2) einen Überwachungsfarbstoff, der spektral
von den vier anderen Farbstoffen verschieden ist. Bewegung des Überwachungsfarbstoffs
in einem Trennungskanal kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass
sich Stromfluss und daher korrekte Trennung der Sequenzierungsreaktionsprodukte ereignet. Überwachungsfarbstoffe
können
in Verbindung mit Sequenzreaktionsmischungen verwendet werden, die
entweder mehr oder weniger als vier Farbstoffe einsetzen, z. B. eine
auf einer Farbe oder zwei Farben basierende Sequenzierung.
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Überwachungsfarbstoffe
können
auch in Verbindung mit anderen Formen der Analyse fluoreszierender
Polynukleotidfragmente zusätzlich
zur Polynukleotidsequenzierung verwendet werden. Solche andere Formen
der Analyse schließen
Nukleinsäureamplifikationsprodukte,
Ligationsprodukte und ähnliche
ein.
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Die Überwachungsfarbstoffe
können
als solche oder mit anderen konjugiert verwendet werden, die die
Migrationsrate der Überwachungsfarbstoffe während der
Elektrophorese modifizieren können,
d. h. ein Mobilitätsmodifizierer.
Beispiele solcher die Migration modifizierende Moleküle schließen Polynukleotide,
Polynukleotidanaloge, Peptide, Polypeptid, und die Mobilität modifizierenden
Moleküle,
die in
U.S. Patent Nr. 5,514,543 beschrieben
sind und ähnliche,
ein. Vorzugsweise werden dieses die Mobilität modifizierenden Moleküle so ausgewählt, dass
sie keine spektralen Eigenschaften besitzen, die mit der Fluoreszenzdetektion
der interessierenden Farbstoffe interferieren. Eingehende Beschreibungen,
wie man Fluoreszenzfarbstoffe mit zahlreichen Verbindungen konjugieren
kann, können
in, neben anderen Orten, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic
Press, San Diego, CA (1996) gefunden werden. Falls nicht durch den
Kontext der Verwendung angezeigt, schließt der Begriff „Überwachungsfarbstoff" Überwachungsfarbstoff-Konjugate
ein.
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Ausführungsformen
der Erfindung schließen Zusammensetzungen
ein, die fluoreszierend markierte Polynukleotide und einen oder
mehrere Überwachungsfarbstoffe
einschließen,
wobei die Überwachungsfarbstoffe
von den anderen Fluoreszenzfarbstoffen der Mischung verschieden
sind. Die Überwachungsfarbstoffe
können
zu der Zusammensetzung entweder vor, nach, oder während der
Bildung der fluoreszierend markierten Polynukleotide zur Analyse
zugegeben werden. Zum Beispiel kann ein Überwachungsfarbstoff zu einer
Polynukleotidsequenzierungsreaktion entweder vor oder nach Beendigung der
Reaktion zugegeben werden. In einigen Ausführungsformen der Erfindung
umfassen die Zusammensetzungen multiple verschiedene Überwachungsfarbstoffe.
In solchen Ausführungsformen
der Erfindung, sind die Überwachungsfarbstoffe
vorzugsweise Konjugate mit verschiedenen elektrophoretischen Mobilitäten. In
anderen Ausführungsformen der
Zusammensetzungen, gibt es einen Einzelsignalfluoreszenzfarbstoff,
aber die Farbstoffmoleküle
sind mit zwei oder mehr verschiedenen Spezies von Mobilitätsmodifizierern
konjugiert, so dass sie multiple Gelegenheiten schaffen, den Überwachungsfarbstoff während der
elektrophoretischen Trennung zu detektieren.
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Die
Erfindung schließt
auch Verfahren zum Detektieren des elektrischen Stromflusses durch
einen Trennungskanal einer Trennungsvorrichtung für fluoreszierendes
Polynukleotid ein, bei dem eine fluoreszierend markierte Polynukleotidzusammensetzung
in einen Kanal einer Trennungsvorrichtung für fluoreszierendes Polynukleotid
eingeführt
wird. Die fluoreszierend markierte Polynukleotidzusammensetzung
umfasst ein Polynukleotid, das mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff
markiert ist und einen Überwachungsfarbstoff,
die spektral von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff verschieden ist.
In den meisten Ausführungsformen
der Erfindung ist das fluoreszierend markierte Polynukleotid eine
komplexe Mischung aus verschieden langen Polynukleotiden. Beispielhaft
für solche
fluoreszierend markierten Polynukleotidmischungen sind die Produkte
der DNA-Sequenzierungsreaktionen, die entweder fluoreszierend markierte
Primer oder fluoreszierend markierte Terminatoren, PCR-Amplifikationsprodukte, die
unter Verwendung von fluoreszierend markierten Primern, fluoreszierend
markierten Minisequenzierungsreaktionen, Produkten, fluoreszierend
markierten Oligonukleotid-Ligationsreaktionsprodukten,
und ähnlichen
gebildet wurden, verwenden. Solche Reaktionen produzieren genetische
Information, die in der Trennungsvorrichtung für fluoreszierendes Polynukleotid
analysiert werden können.
Der Überwachungsfarbstoff
ist von den Fluoreszenzfarbstoffen spektral verschieden, die verwendet
werden, um die Polynukleotide zu markieren, die die genetische Information
enthalten. Zum Beispiel schließt
die Erfindung eine Zusammensetzung ein, die eine komplexe Mischung
von verschiedenen fluoreszierend markierten Polynukleotiden umfasst,
die durch Vierfarben-Kettenabbruchsequenzierung und Signalfarbstoff
erhalten wurde, der spektral von den vier fluoreszierenden Farbstoffen
auf den verschiedenen Sequenzierungsreaktionsprodukten verschieden
ist.
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Nachdem
die fluoreszierend markierte Polynukleotidzusammensetzung in den
Trennungskanal einer Trennungsvorrichtung für fluoreszierendes Polynukleotid
eingeführt
wurde, wird die Vorrichtung aktiviert und dem Polynukleotid (und
den Signalfarbstoffen, wenn sie nicht mit einem Polynukleotid verbunden
sind) ermöglicht,
sie über
den Trennungskanal aufzutrennen. Die Bewegung des Überwachungsfarbstoffes
durch den Trennungskanal kann dann durch die Vorrichtung detektiert
werden. Ein Fehlen der Bewegung des Überwachungsfarbstoffes (oder
der Farbstoffe) oder Permutationen der Bewegung der Überwachungsfarbstoffe
durch die Trennungskanäle
kann verwendet werden, um Probleme mit dem elektrischen Stromfluss
durch den Trennungskanal zu detektieren. Die Bewegung der Überwachungsfarbstoffe
in verschiedenen Kanälen
einer Mulitkanal-Trennungsvorrichtung für fluoreszierendes Polynukleotid
kann mit einer anderen verglichen werden, um so die Detektion der
Probleme mit dem Stromfluss zu ermöglichen.
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Ausführungsformen
der Erfindung schließen auch
Computercode zur Verwendung von Überwachungsfarbstoffen
ein, um den Stromfluss in den Verfahren zu überwachen, Computerspeichermedien, die
solchen Code verkörpern,
und programmierbare elektronische Computer ein, die mit solchem
Code programmiert wurden.