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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung liegt im Wesentlichen in dem Gebiet der Detektion
von Analyten in einem Medium, und insbesondere betrifft die vorliegende
Erfindung einen Mikro-Kontaktdruck
von antikörperbindenden
Proteinen auf einem Substrat für
die Entwicklung von Wegwerfsensoren für einmalige Nutzung, um das
Vorhandensein des Analyten in einem Medium anzuzeigen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Es
stehen viele Systeme und Vorrichtungen für die Detektion einer breiten
Vielfalt von Analyten in verschiedenen Medien zur Verfügung. Die
meisten dieser Systeme und Vorrichtungen sind relativ teuer und
erfordern einen ausgebildeten Techniker, um den Test durchzuführen. Es
gibt viele Fälle,
wo es vorteilhaft wäre,
wenn man rasch und preiswert ermitteln könnte, ob ein Analyt vorhanden
ist. Was gebraucht wird, ist ein Biosensorsystem, das leicht und
preiswert herzustellen ist und zu einer zuverlässigen und empfindlichen Detektion
von Analyten einschließlich kleinerer
Analyten in der Lage ist. Zusätzlich
ist, was gebraucht wird, ein leichtes flexibles Verfahren zur Vorbereitung
der Biosensoren, was eine optimale Verarbeitung in größerem Maßstab ermöglicht.
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Sandstrom
et al., 24 Applied Optics 472, 1985 beschreiben die Verwendung eines
optischen Substrates aus Silizium mit einer Schicht aus Siliziummonoxid
und einer Schicht aus Silizium, die als dielektrische Filme ausgebildet
sind. Sie zeigen, dass eine Änderung
in der Filmdicke die Eigenschaften des optischen Substrates zur
Erzeugung unterschiedlicher Farben in Bezug auf die Dicke des Filmes ändert. Die
Dicke des Films steht in einer Beziehung zu der beobachteten Farbe
und ein auf der Oberseite eines optischen Substrates angeordneter Film
kann eine sichtbare Farbänderung
erzeugen. Die Autoren zeigen, dass ein mathematisches Modell dazu
genutzt werden kann, die Farbänderung
zu quantisieren, und dass "unter
Berechnung des Computermodells durchgeführte Berechnungen zeigen, nur
sehr wenig an optischen Verhalten unter Verwendung einer mehrlagigen
Struktur gewonnen werden kann, ... das aber eine Bioschicht auf
der Oberfläche die
Reflexion derartiger Strukturen sehr gering verändert, da die optischen Eigenschaften
hauptsächlich durch
die Grenzflächen
innerhalb der mehrlagigen Struktur bestimmt werden. Das empfindlichste
System zur Detektion von Bioschichten ist eine einlagige Beschichtung,
während
in den meisten anderen Anwendungen das Verhalten durch zusätzliche
dielektrische Schichten verbessert werden kann." Sandstrom et al. zeigen ferner, dass
aus Metalloxiden auf Metall ausgebildete Objektträger bestimmte
Nachteile haben, und dass das Vorliegen von Metallionen in vielen
biochemischen Anwendungen schädlich
sein kann. Sie zeigen, dass der ideale oberste dielektrische Film
ein Siliziumdioxidfilm von 2–3
nm Dicke ist, welcher spontan ausgebildet wird, wenn eine Siliziummonoxidschicht
in Atmosphäre
abgeschieden wird, und dass eine Siliziumdioxidschicht von 70–95 nm auf
einer Siliziummonoxidschicht von 40–60 nm auf einem Glas oder
Kunststoffsubstrat verwendet werden kann. Sie beschreiben auch die
Erzeugung eines Keils aus Siliziummonoxid durch selektives Ätzen des
Siliziummonoxids, Behandlung der Siliziumdioxidoberfläche mit
Dichiordimethylsilan und durch Aufbringung einer Bioschicht aus
Antigen und Antikörper.
Anhand dieser Keilkonstruktion waren sie in der Lage, die Filmdicke
mit einem Ellipsometer zu bestimmen und geben an, dass der "maximale Kontrast in
einem Bereich von etwa 65 nm gefunden wurde, wo sich die Interferenzfarbe
von Purpur nach Blau änderte". Sie geben an, dass
die Empfindlichkeit eines derartigen Systems hoch genug für die Detektion von
Proteinantigen mittels immobilisierter Antikörper ist. Sie schließen daraus, "die gegebenen Ausführungen
sind für
einen breiten Bereich von Anwendungen empfindlich genug." Die Materialien,
d. h., Glas, Silizium und Siliziumoxid sind chemisch inert und beeinflussen
nicht die untersuchte biochemische Reaktion. Unter Anwendung der
vorstehenden Berechnungen ist es möglich, Objektträger zu konstruieren,
welche für
unterschiedliche Anwendungen optimiert sind. Die Objektträger können hergestellt
und deren Qualität
mittels industrieller Verfahren gesichert werden, und zwei Ausführungen
sind derzeit kommerziell erhältlich.
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Das
an Kumar et al. erteilte
U.S.
Patent 5 512 131 beschreibt eine Vorrichtung, die ein Polymersubstrat
mit einer Metallbeschichtung beinhaltet. Eine antikörperbindende
Proteinschicht ist auf das beschichtete Substrat aufgestempelt.
Die Vorrichtung wird in einem Prozess zur Bestempelung oder als
ein Schalter verwendet. Ein Beugungsmuster wird erzeugt, wenn sich
ein Analyt an die Vorrichtung bindet. Eine Visualisierungsvorrichtung,
wie z. B. ein Spektrometer, wird dann verwendet, um das Vorliegen
des Beugungsmusters zu ermitteln.
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Die
von Kumar et al. beschriebene Vorrichtung weist jedoch mehrere Nachteile
auf. Ein Nachteil besteht darin, dass eine zusätzliche Visualisierungsvorrichtung
benötigt
wird, um irgendein Beugungsmuster zu betrachten. Durch das Erfordernis
eines Visualisierungsgerätes
ermöglicht
die Vorrichtung von Kumar et al. nicht die Untersuchung einer großen Menge
von Proben, da es nicht möglich
ist, das Vorliegen eines Analyten unter Einsatz des bloßen Auges
zu ermitteln.
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Das
U.S. Patent Nr. 5 482 830 für Bogart
et al. beschreibt eine Vorrichtung, die ein Substrat enthält, welches
eine optisch aktive Oberfläche
hat, die eine erste Farbe als Antwort auf darauf einfallendes Licht
anzeigt. Diese erste Farbe ist als eine Spektralverteilung des ausgehenden
Lichtes definiert. Das Substrat zeigt auch eine zweite Farbe, welche
sich von der ersten Farbe unterscheidet (indem sie eine Kombination
von Lichtwellenlängen
besitzt, welche sich von in der ersten Farbe vorhandenen Kombination
unterscheiden, oder indem sie eine unterschiedliche Spektralverteilung
besitzt, oder indem sie eine Intensität von einer oder mehrerer dieser
Wellenlängen
besitzt, die sich von denen in der ersten Farbe vorhandenen unterscheiden).
Die zweite Farbe zeigt sich als Reaktion auf dasselbe Licht, wenn
der Analyt auf der Oberfläche
vorhanden ist. Die Änderung
von einer Farbe zu einer anderen kann unter Verwendung eines Instrumentes
oder durch das Auge gemessen werden. Eine derart empfindliche Detektion
ist ein Fortschritt gegenüber
den von Sandstrom und Nygren vorstehend beschriebenen Vorrichtungen
und ermöglicht
die Nutzung der Vorrichtungen in einer kommerziell durchführbaren
und wettbewerbsfähigen Weise.
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Jedoch
weist das in dem Bogart et al. Patent beschriebene Verfahren verschiedene
Nachteile auf. Ein Nachteil sind die hohen Kosten der Vorrichtung. Ein
weiteres Problem mit der Vorrichtung ist die Schwierigkeit bei der
Steuerung der verschiedenen Schichten, die auf dem Wafer platziert
werden, sodass man einen zuverlässigen
Messwert erhält.
Was gebraucht wird, ist eine Biosensorvorrichtung, die leicht und
preiswert herzustellen ist, und eine zuverlässige und empfindliche Detektion
des Analyten ermöglicht.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine preiswerte und empfindliche Vorrichtung
und ein Verfahren zum Detektieren von in einem Medium vorhandenen
Analyten bereit. Die Vorrichtung besteht aus einer biosensorischen
Vorrichtung mit einem Substrat, bevorzugt einem metallisierten Polymerfilm,
auf welchen ein spezifisches vorbestimmtes Muster von antikörperbindenden
Proteinen, wie z. B. einem Protein A oder Protein G, aufgedruckt
ist. Eine anschließende
Aussetzung an den für
das gewünschte
Analyseergebnis spezifischen Antikörper führt zu einer gemusterten Abscheidung
dieses Antikörpers.
Insgesamt ermöglicht
dieses ein modulares Produktionsformat dergestalt, dass große Ballen
gemusterten Proteins zur Verwendung mit verschiedenen Analyten hergestellt
werden können.
Dann kann nach Bedarf das Endprodukt durch Aussetzung an den erforderlichen
Antikörper
hergestellt werden.
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Nach
der Anhaftung eines Zielanalyten, welche in der Lage ist Licht zu
streuen, an ausgewählten Bereichen
des Polymerfilms, auf welchem Protein und Antikörper als Muster aufgebracht
sind, tritt eine Beugung des transmittierten und/oder reflektierten Lichts
aufgrund der physikalischen Abmessungen und der definierten präzisen Platzierung
des Analyten auf. Ein Beugungsbild wird erzeugt, welches leicht
mit dem Auge oder optional mit einer Messvorrichtung zu sehen ist.
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Die
vorliegende Erfindung nutzt Verfahren des Kontaktdruckes antikörperbindender
Proteine als Muster. Diese Proteine binden sich an Antikörper, um diese
auf der Oberfläche
zu Mustern auszubilden, sowie die optimale Orientierung für die Rezeptorantikörper aufrechtzuerhalten.
Die Rezeptorantikörper sind
für einen
speziellen Analyten oder Klasse von Analyten abhängig von dem verwendeten Protein spezifisch.
Kontaktdruckverfahren, welche bei der Erzeugung der in dem vorliegenden
System verwendeten Erfassungsvorrichtungen nützlich werden, sind vollständig in
den
U.S. Patenten US 6 020 047 und
US 6 048 623 beschrieben.
Da sich jedoch diese Verfahren auf selbst-assemblierende Monoschichten
beziehen, müssen
die Verfahren, wie nachstehend diskutiert, leicht geändert werden,
um das antikörperbindende
Proteinmaterial zu drucken, da dieses Material nicht selbst-assemblierend
ist.
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In
Mustern angeordnete antikörperbindende Proteinschichten
mit gebundenen Antikörpern
bewirken eine strukturierte Platzierung oder Bindung von Analyten
darauf. Die dadurch hergestellten Biosensorvorrichtungen der vorliegenden
Erfindung können in
einer von zwei Arten abhängig
von der Größe des Analyten
verwendet werden. Für
Analyte, welche in der Lage sind, eine Beugung durch sich selbst
zu bewirken, wie z. B. Mikroorganismen, wird das System genutzt,
indem zuerst die Biosensorvorrichtung einem Medium ausgesetzt wird,
das den Analyten der Wahl enthält,
und dann nach einer geeigneten Inkubationsperiode ein Licht, wie
z. B. ein Laser durch den Film transmittiert oder dieses von dem
Film reflektiert wird. Wenn der Analyt in dem Medium vorhanden ist,
und an die Antikörper
auf der strukturierten antikörperbindenden
Proteinschicht gebunden ist, wird das Licht in einer solchen Weise
gebeugt, dass es ein sichtbares Bild erzeugt.
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Optional
kann das System für
sehr kleine Analyten, wie z. B. Proteine, "beugungsverbessernde Elemente" nutzen, welche sich
mit dem Zielanalyt und dem Biosensor verbinden können und in der Lage sind,
eine substantielle Änderung
in der Höhe und/oder
dem Brechungsindex zu bewirken, um dadurch den Beugungswirkungsgrad
des Biosensors zu steigern und die Detektion kleinerer Analyte zu
ermöglichen.
Im Einsatz haftet der Zielanalyt entweder an dem beugungsverbessernden
Element an, welches dann an dem Biosensor anhaftet oder direkt an ausgewählten Bereichen
des Polymerfilms, auf welche das Protein und der Antikörper aufgedruckt
sind. Dann tritt die Beugung des transmittierten und/oder reflektierten
Lichtes über
die physikalischen Abmessungen und durch die definierte präzise Platzierung des
Analyten auf. Es wird ein Beugungsbild erzeugt, weiches leicht mit
dem Auge oder optional mit einer Messvorrichtung zu sehen ist.
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Eine
weitere Option für
die Verwendung dieses Sensors beinhaltet die Detektion von Analyten, welche
Antikörper
sind. Die Messvorrichtung könnte nur
die strukturierten Antikörperbindungsproteine enthalten
und würde
dann dem Medium plus den beugungsverbessernden Partikeln ausgesetzt
werden, welche einen für
den zu detektierenden Antikörper
spezifischen Antikörper
aufweisen. Die Auswahl des Antikörpers
auf dem Partikel wird bevorzugt so ausgeführt, sodass er sich nicht unspezifisch
an das strukturierte Antikörperbindungsprotein
bindet, sondern sich stattdessen nur bindet, wenn der Analytantikörper ebenfalls
gebunden wird. Auf diese Weise würden
die beugungsver bessernde Elemente eine erhebliche Änderung
in der Höhe
und/oder in dem Brechungsindex bewirken, wenn der Analytantikörper vorhanden
ist, und dadurch die Ausbildung eines Beugungsbildes bewirken. Es
ist vorstellbar, dass dasselbe Format auch mit anderen Immunassay-Formaten
wie z. B. Lateral Flow Assays oder Mikrotitrierplatten verwendet
werden könnte.
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Mit
anderen Worten, das Antikörperbindungsprotein
und die Antikörperschichten
mit den daran gebundenen Analyten können optische Beugungsmuster
erzeugen, um das Vorhandensein des Analyten anzuzeigen. Das Licht
kann sich in dem sichtbaren Spektrum befinden und entweder von dem
Film reflektiert oder durch ihn transmittiert werden, und der Analyt
kann jede beliebige Verbindung oder ein Partikel sein, die mit der
Antikörperbindungsproteinschicht
reagieren. Das Licht kann weißes
Licht oder monochromatische elektromagnetische Strahlung in dem
sichtbaren Bereich sein. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen
flexiblen Träger
für eine
antikörperbindende
Proteinschicht auf Gold oder einem anderen geeigneten Metall oder
einer Metalllegierung bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen preiswerten Wegwerfbiosensor
bereit, welcher in Massenproduktion hergestellt werden kann. Sie
beinhaltet die Verwendung von Oberflächen, die mit einem Muster
aus Antikörperbindungsprotein
versehen sind. Typischerweise binden diese Proteine einen Antikörper durch
dessen konstanten Bereich (Fc) so, dass
die Antigen-Bindungsbereiche (Fab) des Antikörpers für eine optimale
Bindungsaktivität
frei sein. Die Erzeugung der als Muster ausgebildeten Proteinoberflächen ermöglicht eine
maximale Flexibilität
in der Sensorproduktion. Der letzte Schritt in der Produktion, die
Erfassung des gewünschten
Antikörpers in
den als Muster ausgebildeten Bereichen kann nach Bedarf für den gewünschten
Analyten erfolgen (d. h., zu dem Zeitpunkt der Herstellung).
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Die
Biosensoren der vorliegenden Erfindung können als ein Einzeltest zum
Detektieren eines Analyten hergestellt werden, oder sie können als
eine Mehrfachtestvorrichtung formatiert werden. Die Biosensoren
der vorliegenden Erfindung können
zur Detektion einer Kontamination in Kleidungsstücken, wie z. B. Windeln, und
zur Detektion einer Kontamination durch Mikroorganismen verwendet
werden.
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Die
vorliegende Erfindung kann auch auf Kontaktlinsen, Brillengläsern, Fensterscheiben,
pharmazeutischen Gefäßen, Lösungsmittelbehältern, Wasserflaschen,
Haftverbänden
und dergleichen eingesetzt, um eine Kontamination zu detektieren.
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Diese
und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden
nach Betrachtung der nachstehenden detaillierten Beschreibung der
offenbarten Ausführungsformen
ersichtlich.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1 stellt
einen Biosensor dar, welcher eine simultane Messung mehrerer unterschiedlicher Analyten
in einem Medium ausführen
kann.
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2 ist
eine schematische Darstellung eines Kontaktdruckvorgangs von antikörperbindenden Proteinschichten,
gefolgt von einer in einem Muster ausgeführten Abscheidung eines Antikörpers.
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Detaillierte Beschreibung
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Die
vorliegende Erfindung stellt verbesserte Biosensorenvorrichtungen
bereit, und Verfahren zur Anwendung derartiger Biosensorenvorrichtungen zum
Detektieren und Quantifizieren des Vorhandenseins oder der Menge
eines interessierenden Analyten in einem Medium. Die Analyten, welche durch
die vorliegende Erfindung detektiert werden können, aber nicht darauf beschränkt sind,
sind Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien, Hefen, Pilze und Viren.
Im Gegensatz zu früheren
Vorrichtungen ermöglichen
diejenigen der vorliegenden Erfindung die Detektion von extrem kleinen
Mengen eines Analyten in einem Medium in einem raschen Test, welcher
nur wenige Minuten dauert. Zusätzlich
werden keine signalisierenden oder zugeordnete elektronische Komponenten
in den Biosensorvorrichtungen der vorliegenden Erfindung benötigt.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet einen Mikro-Kontaktdruckvorgang
von antikörperbindenden
Proteinen auf einem Polymerfilm, welcher auch eine Metallbeschichtung
haben kann. Dieses ermöglicht
ein leichtes, modulares Produktionsverfahren dahingehend, dass die
anschließende
Aussetzung an einen Antikörper,
dessen als Muster aus gebildete Bindung bewirkt. Zusätzlich können diese
Proteine die Aktivität
des immobilisierten Antikörpers
verbessern. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Entwicklung von
Wegwerfbiosensoren mit einmaliger Nutzung auf der Basis von Lichtbeugung,
um das Vorhandensein des Analyten anzuzeigen. Nach der Anhaftung
eines Zielanalyten an ausgewählten
Bereichen des Kunststofffilms, welche das Protein enthalten, erfolgt
die Beugung des transmittierten und/oder reflektierten Lichtes über die
physikalischen Abmessungen und die definierte präzise Platzierung des Analyten.
Beispielsweise sind Hefe, Pilze oder Bakterien groß genug,
um als Beugungselemente für sichtbares
Licht zu wirken, wenn sie in organisierten Mustern auf einer Oberfläche platziert
sind. Zusätzlich
kann die vorliegende Erfindung beugungsverbessernde Elemente enthalten,
welche den Beugungswirkungsgrad des Biosensors verbessern, und es
dadurch ermöglichen,
eine beliebige Anzahl unterschiedlicher Analyten zu detektieren.
Zusätzlich
zur Erzeugung eines einfachen Beugungsbildes können Muster von Analyten so
sein, dass sie die Entwicklung eines holographischen Messbildes
und/oder eine Änderung
in der sichtbaren Farbe bewirken. Somit zeigt das Erscheinen eines
Hologramms oder eine Änderung
in einem existierenden Hologramm eine positive Antwort an. Das durch
die Beugung des transmittierten Lichtes erzeugte Muster kann jede Form
einschließlich,
jedoch nicht darauf beschränkt, die
Transformation eines Musters von einem Muster in ein anderes Muster
nach der Bindung des Analyten an das rezeptive Material beinhalten.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen
ist das Beugungsmuster in weniger als einer Stunde nach dem Kontakt des
Analyten mit der Biosensorvorrichtung der vorliegenden Erfindung
unterscheidbar.
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Das
Beugungsgitter, welches die Beugung von Licht nach der Wechselwirkung
mit dem Analyten erzeugt, hat bevorzugt eine minimale Periodizität der Wellenlänge und
einen sich von dem des umgebenden Mediums unterscheidenden Brechungsindex. Sehr
kleine Analyten, wie z. B. Viren oder Moleküle können indirekt detektiert werden,
indem ein größeres Partikel
genutzt wird, das für
den kleinen Analyten spezifisch ist. Eine Ausführungsform, in welcher der
kleine Analyt detektiert werden kann, beinhaltet die Beschichtung
eines Latextröpfchens
mit einem Proteinmaterial, das sich spezifisch an den interessierenden
Analyten bindet. Partikel, die in der vorliegenden Erfindung genutzt
werden umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Glas, Zellulose, synthetische
Polymere oder Kunststoffe, Latex, Polystyrol, Polykarbonat, Proteine,
Bakterien- oder Pilzzellen und dergleichen. Die Partikel haben bevorzugt eine
kugelige Form, wobei aber die strukturelle und räumliche Konfiguration der Partikel
für die
vorliegende Erfindung nicht kritisch ist. Beispielsweise könnten die
Partikel Scheibchen, Ellipsiode, Würfel und dergleichen sein.
Eine wünschenswerte
Partikelgröße reicht
von einem Durchmesser von angenähert 0,2 μm bis 50,0 μm, bevorzugt
zwischen angenähert 0,4 μm bis 1 μm. Die Zusammensetzung
des Partikels ist für
die vorliegende Erfindung nicht kritisch.
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Der
Antikörper,
welcher auf der Oberfläche immobilisiert
bzw. als Muster ausgebildet wird, bindet sich spezifisch ein Epitop
auf den Analyten, das sich von dem in der Bindung an das beugungsverbessernde
Element verwendeten Epitop unterscheidet. Somit wird zur Detektion
eines Mediums mit einem kleinen Analyten, wie z. B. Virenpartikeln,
das Medium zuerst den beugungsverbessernden Elementpartikeln, wie
z. B. Latexpartikeln ausgesetzt, an welchen sich die Virenpartikel
binden. Dann werden die beugungsverbessernden Elementpartikel optional gewaschen
und dem Polymerfilm mit den die virusspezifischen Antikörper enthaltenden
antikörperbindenden
Proteinschichten ausgesetzt. Die Antikörper binden dann die Virenpartikel
an das Elementpartikel, um dadurch die Elementpartikel in demselben
Muster wie z. B. die Antikörper
auf dem Film zu immobilisieren. Da die gebundenen Elementpartikel
eine Beugung des sichtbaren Lichtes bewirken, wird ein Beugungsmuster
erzeugt, das das Vorhandensein des Viruspartikels in der Flüssigkeit
anzeigt. Zusätzlich kann
der Polymerfilm eine Metallbeschichtung darauf enthalten. Die antikörperbindende
Proteinschicht würde
dann auf der metallisierten Oberfläche des Films angeordnet werden.
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Alternativ
kann der Analyt detektiert werden, indem zuerst das Substrat dem
den Analyten enthaltenden Medium ausgesetzt wird und dann der Analyt veranlasst
wird, sich an das antikörperbindende
Proteinschichtmaterial zu binden, das den analytspezifischen Antikörper enthält. Anschließend wird
eine die beugungsverbessernden Elementpartikel enthaltende Lösung mit
dem Substrat mit dem daran gebundenen Analyten in Kontakt gebracht.
Die Partikel binden sich dann an den Analyten. Da die gebundenen
Elementpartikel eine Beugung des sichtbaren Lichtes bewirken, wird
ein Beugungsmuster erzeugt, das das Vorliegen des Analyten in der
Flüssigkeit
anzeigt.
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Schließlich können in
einer bevorzugten Ausführungsform
der Biosensor, die beugungsverbessernden Elementpartikel und das
den Analyten enthaltende Medium gleichzeitig gemischt werden. Dieses
führt zu
einer Kombination der vorstehend diskutierten Bin dungsprozeduren.
Einige von den Analyten werden sich zuerst mit einem beugungsverbessernden
Elementpartikel vor einer Bindung mit dem Substrat verbinden. Andere
Analyten werden sich zuerst mit dem Substrat verbinden und dann
mit einem Elementpartikel verbinden. Wenn eine Punktlichtquelle
durch den Sensor hindurch gestrahlt wird, wird ein Beugungsmuster
erzeugt, das das Vorhandensein des Analyten in der Flüssigkeit
anzeigt.
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Die
Analyten, von denen angenommen wird, dass sie unter Anwendung der
Erfindung detektiert werden, umfassen, sind jedoch nicht darauf
beschränkt,
Bakterien; Hefen; Pilze; Viren; Rheumafaktoren; Antikörper, einschließlich, jedoch
nicht darauf beschränkt,
IgG-, IgM-, IgA- und IgE-Antikörper;
karzinoembryonales Antigen, Antigen der Streptokokkengruppe A, virale
Antigene, Autoimmunkrankheiten zugeordnete Antigene, Allergene,
Tumorantigene, Antigen der Streptokokkengruppe B, HIV-I- oder HIV-II-Antigen;
Wirtsantworten (Antikörper)
auf diese und andere Viren; für
RSV oder Wirtsantworten (Antikörper)
auf den Virus spezifische Antigene; ein Antigen; Enzym; Hormon;
Polysaccharide; Protein; Lipid; Kohlenhydrat; Droge oder Nukleinsäure; Salmonella Spezies;
Candida Spezies, einschließlich,
jedoch nicht darauf beschränkt,
Candida albicans und Candida tropicalis, Salmonella Spezies; Neisseria-Meningitis-Gruppen
A, B, C, Y und W-Untergruppe 135, Streptococcus Pneumoniae, E.-coli
KI, Haemophilus influenza Typ B, von einem Mikroorganismus abgeleitetes
ein Antigen, ein Halbantigen (Hapten), eine Missbrauchsdroge, eine
therapeutisches Medikament, einem Milieumittel; und für Hepatitis
spezifische Antigene.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
Nährstoffe
für eine
spezifische Klasse von Mikroorganismen in die antikörperbindende
Proteinschicht mit eingebaut werden. Auf diese Weise können sehr
niedrige Konzentrationen von Mikroorganismen detektiert werden,
indem sie zuerst mit dem Biosensor der vorliegenden Erfindung mit
den darin eingebauten Nährstoffen
in Kontakt gebracht werden und dann der Biosensor unter für das Wachstum
der gebundenen Mikroorganismen geeigneten Bedingungen inkubiert
wird. Das Wachstum der Mikroorganismen wird zugelassen, bis genügend Organismen
vorhanden sind, um ein Beugungsmuster auszubilden. Natürlich können sich
in einigen Fällen
die Mikroorganismen ausreichend vervielfachen, um ein Beugungsmuster
ohne das Vorhandensein eines Nährstoffes
auf der strukturierten Monoschicht zu erzeugen.
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Ein
Teil der vorliegenden Erfindung ist das zum Strukturieren von Rezeptoren,
wie z. B. Antikörpern,
auf einem Polymerfilm oder metallisiertem Polymerfilm eingesetzte
Verfahren. Das Verfahren beinhaltet das Mikro-Kontaktdrucken von
Proteinen, die Antikörper
binden. Diese Proteine können,
sind jedoch nicht darauf beschränkt,
Protein A, Protein G, Protein L, sowie deren Rekombinantenformen
enthalten. Kommerzielle Versionen wie z. B. Zymed's (San Francisco,
CA) KAPPALOCKTM sind ebenfalls geeignet.
Somit ist das Proteinmaterial als das Basismaterial definiert, um
ein spezifisches Bindungspaar zu erzeugen, wobei der andere Teil
einen für
den interessierenden Analyten spezifischen Antikörper aufweist.
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Das
Rezeptormaterial, das mit dem als Muster ausgebildeten Protein verbunden
wird, ist durch seine Fähigkeit
gekennzeichnet, spezifisch den oder die interessierenden Analyten
zu binden. Unabhängig
von dem gewählten
interessierenden Analyten ist das Proteinmaterial dafür ausgelegt,
sich spezifisch mit dem interessierenden Analyten zu verbinden.
In den bevorzugten Ausführungsformen
ist die Biosensorvorrichtung dafür
konfiguriert und angeordnet, ein durch das Auge detektierbares Muster
als Antwort auf die Transmission von polychromatischem Licht zu
erzeugen, wenn der interessierende Analyt zwischen dem Antikörper und
einem beugungsverbessernden Element eingeschlossen ist. In einer
weiteren Ausführungsform,
in welcher der Analyt groß genug
ist, um Licht zu beugen, muss ein beugungsverbessernde Elemente
nicht erforderlich sein.
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In
vielen Fällen
kann ein "Blocker" erforderlich sein,
um eine nicht spezifische Bindung zu verhindern. Der Begriff "Blocker", so wie er hierin
verwendet wird, bedeutet ein Reagens, das an der Sensoroberfläche anhaftet,
sodass es "blockiert" oder eine nichtspezifische
Bindung von Nicht-Analytenmaterialien an der Oberfläche (entweder
in den strukturierten oder unstrukturierten Bereichen verhindert. Der
Blockierungsschritt kann als eine Nachbehandlung an einer Oberfläche ausgeführt werden,
welche bereits kontaktgedruckt ist ("Post-Block") und ist die Standardtechnik zur Auffüllung in
nicht-kontaktbedruckten
Bereich mit einem anderen Thiol. Die Erfinder haben jedoch entdeckt,
dass eine "Pre-Block"-Technik gegenüber der
Post-Block-Technik zu bevorzugen ist. In der Pre-Block-Technik wird die
Oberfläche
des Substrates mit einem nicht-Thiol enthaltenden Blocker vorbehandelt
und dann kontaktbedruckt. Ohne an eine spezifische Theorie gebunden
sein zu wollen, wird theoretisch angenommen, dass das kontaktbe druckte
Material (üblicherweise
schwefelhaltiges) den physisorbierten Blocker verschiebt, und dadurch
dem antikörperbindenden Proteinmaterial
ermöglicht,
sich direkt an die Oberfläche
des Substrates zu binden. Eine anschließende Post-Blockierung kann
falls gewünscht
ebenfalls durchgeführt
werden. Die Blocker können,
sind jedoch nicht darauf beschränkt, β-Casein,
Albumine wie z. B. Rinderserumalbumin, Pluronic oder andere Oberflächenbenetzer,
Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, oder Schwefelderivate der vorstehenden
Verbindungen enthalten und jedes andere Blockermaterial, das dem
Fachgebiet auf dem Gebiet bekannt ist.
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Die
den interessierenden Analyten enthaltende Matrix kann ein Festkörper, ein
Gas oder eine Körperflüssigkeit,
wie z. B. Zwischengewebsfluid, Schleim, Speichel, Urin, Fäkalmaterial,
Gewebe, Mark, Hirn/Rückenmarks-Fluid,
Serum, Plasma, Vollblut, Synovialsputurn, gepufferte Lösungen,
extrahierte Lösungen,
Sperma, Vaginalsekrete, perikardiale, gastrische, peritoneale, pleurale,
Halsabstriche oder andere Ausspülungen
und dergleichen sein. Der interessierende Analyt kann ein Antigen,
ein Antikörper,
ein Enzym, ein Toxin, ein Umgebungsagens, eine Zytoplasmenkomponente,
Haar- oder Flagellenkomponente, Protein, Polysacharid, Medikament oder
jedes andere Material sein, das durch einen Antikörper erkannt
werden kann. Beispielsweise kann Rezeptormaterial für Bakterien
spezifisch eine Oberflächenmembranenkomponente,
Protein oder Lipid oder Polysacharid oder Nukleinsäure oder
ein Enzym binden. Der Analyt, welcher Bakterien anzeigt, kann ein
Sacharid, ein Polysacharid, ein Enzym, eine Nukleinsäure, eine
Membrankomponente, ein Gangliosid oder ein durch den Wirt in Reaktion
auf die Bakterien erzeugter Antikörper sein. Das Vorhandensein des
Analyten kann eine infektiöse
Krankheit (bakteriell- oder virusbedingt), Krebs, eine Allergie
oder eine andere medizinische Fehlfunktion oder Zustand anzeigen.
Das Vorhandensein des Analyten kann eine Anzeige von Wasser- oder
Nahrungskontamination oder anderer schädlicher Materialien sein. Der
Analyt kann einen Medikamentenabusus anzeigen oder die Werte therapeutischer
Mittel überwachen.
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In
einigen Fällen
kann der Analyt nicht bloß das
Rezeptormaterial binden, sondern kann auch das Auftreten einer detektierbaren
Modifikation des Rezeptormaterials bewirken. Diese Wechselwirkung könnte eine
Zunahme in der Menge an der Testoberfläche oder eine Abnahme in der
Menge des Rezeptormaterials auf der Testoberfläche bewirken. Ein Beispiel
für das
letztere ist die Wechselwirkung eines abbauenden Enzyms oder Materials
mit einem spezifischen immobilisierten Substrat. In diesem Falle
würde man
ein Beugungsmuster vor der Wechselwirkung mit dem interessierenden
Analyten sehen, während
das Beugungsmuster verschwindet, wenn der Analyt vorhanden ist.
Der spezifische Mechanismus, mittels welchem eine Bindung, Hybridisation
oder Wechselwirkung des Analyten mit dem Rezeptormaterial auftritt
ist für
die Erfindung nicht wichtig, sondern kann die in dem abschließenden Messprotokoll verwendeten
Reaktionsbedingungen beeinflussen.
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Im
Allgemeinen kann das antikörperbindende
Protein passiv an der Substratschicht befestigt werden. Falls erforderlich,
können
funktionale Gruppen mit dem antikörperbindenden Protein konjugiert werden,
um deren kovalente Befestigung auf der Testoberfläche zu ermöglichen.
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Ein
breiter Bereich von Techniken kann angewendet werden, um das Proteinmaterial
auf das Substrat aufzubringen. Testoberflächen können mit antikörperbindendem
Protein beschichtet werden, indem eine Lösung in diskreten Bereichen
oder Mustern aufgebracht durch Sprüh-, Tintenstrahl- oder andere
Aufdruckverfahren, oder durch Kontaktdrucken aufgebracht wird. Die
gewählte
Technik sollte die Menge des erforderlichen Proteinmaterials für die Beschichtung
einer großen
Anzahl von Testoberflächen
minimieren und die Stabilität/Funktionalität des Proteinmaterials
während
der Aufbringung aufrechterhalten. Die Technik muss das Proteinmaterial
auf dem Substrat auch in einer sehr gleichmäßigen und reproduzierbaren
Weise aufbringen oder befestigen.
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Der
nächste
Schritt würde
aus der Aussetzung der mit Muster versehenen Oberfläche an den für die gewünschten
Analyten spezifischen Antikörper
sein. Dieses könnte
durch vollständiges
Eintauchen in eine Lösung
für eine
vorbestimmte Zeitdauer, Aufsprühen
oder Aufschleudern einer Beschichtung erfolgen. Zusätzlich könnte eine
kontrollierte Platzierung verschiedener Antikörper zu einem Mehrfach-Analytensystem
führen.
Ein weiterer Vorteil dieses Prozesses ist das modulare Format für die Produktion.
Mit anderen Worten, ein System mit als Muster aufgebrachten antikörperbindendem
Protein kann optimiert werden, und dann die Detektion einer breiten
Vielfalt von Analyten abhängig
von der Antikörperbindung
ermöglichen.
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Das
Medium, in welchem sich der Analyt befinden kann, kann ein Festkörper sein,
gelartig sein, eine Flüssigkeit
oder Gas sein. Für
die Zwecke der Detektion eines Analyten in einem Körperfluid,
wird das Fluid aus Urin, Serum, Plasma, Spinaifluid, Sputum, Vollblut,
Speichel, urogenitalen Sekreten, Fäkalextrakten, perikardialen,
gastrischen, peritonealen, pleuralen Ausspülungen, Vaginalsekreten, oder
einem Halsabstrich ausgewählt;
und das Verfahren beinhaltet optional die Verwendung eines Spektrophotometers,
um das Auftreten eines Brechungsmusters zu detekieren. wie z. B.
Zwischengewebsfluid, Schleim, Speichel, Urin, Fäkalmaterial, Gewebe, Mark,
Hirn/Rückenmarks-Fluid,
Serum, Plasma, Vollblut, Synovialsputum, gepufferte Lösungen,
extrahierte Lösungen,
Sperma, Vaginalsekrete, perikardiale, gastrische, peritoneale, pleurale,
Halsabstriche oder andere Ausspülungen
und dergleichen sein. Der interessierende Analyt kann ein Antigen,
ein Antikörper,
ein Enzym, ein Toxin, ein Umgebungsagens, eine Zytoplasmenkomponente,
Haar- oder Flagellenkomponente, Protein, Polysacharid, Medikament oder
jedes andere Material sein, das durch einen Antikörper erkannt
werden kann. Als das am häufigsten mit
der Biosensorvorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendete Gas
wird Luft angenommen.
-
Die
Biosensorvorrichtung der vorliegenden Erfindung nutzt Verfahren
des Kontaktaufdrucks in Mustern angeordneter antikörperbindender
Proteine auf Substraten, erwünschtermaßen metallisierten Polymerfilmen,
die anschließende
Aussetzung an Antikörper,
um einen in Mustern angeordneten Antikörper zu erhalten, die dadurch
erzeugten Zusammensetzungen, und die Anwendung dieser Zusammensetzungen.
In Mustern angeordnete antikörperbindende
Proteinschichten ermöglichen
die kontrollierte Platzierung von Antikörpern, welche einen Analyten
binden können,
darauf. Der Begriff "in
Mustern angeordnete antikörperbindende
Proteinschichten", sowie
er hierin verwendet wird, bedeutet das antikörperbindende Protein plus den
erwünschten
Antikörperschichten
in beliebigen Mustern auf dem Substrat einschließlich einem zusammenhängenden
Muster.
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Wenn
der Film mit den in Mustern angeordneten antikörperbindenden Proteinschichten
einem Analyten ausgesetzt wird, der mit dem Antikörper reagieren
kann, erzeugt der Film optische Beugungsmuster, welche sich abhängig von
der Reaktion des Antikörpers
mit dem interessierenden Analyten unterscheiden. Die Flüssigkeit
kann ein Fluid mit hoher Oberflächenspannung,
wie z. B. Wasser, sein. Das Licht kann sich in dem sichtba ren Spektrum
befinden und kann entweder von dem Film reflektiert oder durch diesen
transmittiert werden und der Analyt kann jede beliebige Verbindung
sein, die mit der strukturierten antikörperbindenden Proteinschicht
reagiert.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
beinhaltet das Verfahren das in Kontakt bringen des Substrates mit
einer möglicherweise
den Analyten enthaltenden Testprobe unter Bedingungen, in welchen
das Substrat eine Änderung
in dem Brechungsindex bewirkt. Wenn Licht durch den Film mit der
darauf befindlichen in Muster angeordneten antikörperbindenden Proteinschicht
transmittiert wird, wird ein sichtbares Beugungsmuster erzeugt und
kann visualisiert werden, indem das Licht auf eine Oberfläche geleitet wird
oder direkt durch das Substrat hindurch betrachtet wird.
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In
einer Ausführungsform
ist die vorliegende Erfindung in Form eines Eintauchstreifens (Dipstick) vorstellbar,
in welcher der mittels Mikrokontakt bedruckte Film auf dem Ende
des Eintauchstreifens befestigt ist. Im Einsatz wird der Eintauchstreifen
in die Flüssigkeit
eingetaucht, in welcher der vermutete Analyt vorhanden sein kann
und einige Minuten darin belassen. Der Eintauchstreifen wird dann
entfernt, und dann entweder Licht durch den Film projiziert oder
der Film mit einer Lichtquelle hinter dem Film betrachtet. Wenn
ein Muster beobachtet wird, ist dann der Analyt in der Flüssigkeit
vorhanden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein mehrfacher Analyttest auf demselben
Träger
aufgebaut. Gemäß Darstellung
in 1 ist ein Streifen 10 mit mehreren mittels Mikrokontakt
aufgedruckter Filme 20, 25, 30 und 35 versehen,
wobei auf jeden Film ein Muster 40 aufgedruckt ist. Jeder
von den mittels Mikrokontakt bedruckten metallisierten Filmen 15, 20, 25 und 30 kann einen
unterschiedlichen Antikörper
aufweisen, der für unterschiedliche
Analyte spezifisch ist. Man kann sehen, dass die vorliegende Erfindung
in einer Anordnung mit einer Vielzahl von mittels Mikrokontakt bedruckten
metallisierten Filmen formatiert werden kann, und damit dem Benutzer
der Biosensorvorrichtung der vorliegenden Erfindung ermöglichen
kann, das Vorhandensein mehrerer Analyte in einem Medium unter Anwendung
eines einzigen Tests zu detektieren.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann der Biosensor an einem rückseitig
klebenden Aufkleber oder Etikett befestigt werden, welche dann auf einer
harten Oberfläche oder
einer Behälterwand
platziert werden können. Der
Biosensor kann auf der Innenoberfläche eines Behälters, wie
z. B. einer Lebensmittelpackung oder einem Glasgefäß, platziert
werden. Der Biosensor kann dann betrachtet werden, um das Vorhandensein
des Analyten zu ermitteln.
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Typischerweise
wird ein Goldfilm von 5–2000 nm
Dicke auf einem mit Titan vorbereiteten Polyethylenterephthalatfilm,
Si/SiO2-Waver oder Glasfläche unterstützt. Das
Titan dient als Haftungsvermittler zwischen Gold und dem Träger. Das
antikörperbindende
Protein haftet an der Goldoberfläche
während der
Kontaktbedruckung.
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2 skizziert
die für
die Mikrokontaktbedruckung angewendete Prozedur. Ein elastomerischer
Stempel wird zum Übertragen
von antikörperbindender
Protein-"Tinte" auf eine Oberfläche mittels Kontakt
verwendet; wenn der Stempel mit einem Mustern versehen ist, bildet
sich eine in Mustern angeordnete antikörperbindende Proteinschicht.
Der Stempel wird hergestellt, indem Polydimethylsiloxan (PDMS) auf
einem Master mit dem gewünschten Muster
gegossen wird. Master werden unter Anwendung standardmäßiger photolithographischer
Techniken hergestellt, oder aus existierenden Materialien mit Oberflächenmerkmalen
im Mikromaßstab
aufgebaut.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
einer typischen experimentellen Prozedur wird ein photolithographisch
hergestellter Master in einer Glas- oder Kunststoff-Petrischale
platziert, und ein Gemisch aus SYLGARD®Silikonelastomer
184 und einem Härtungsmittel
für das
Silikonelastomer 184 (Dow Corning Corporation) in 10:1 Verhältnis (w:w)
darüber gegossen.
Das Elastomer lässt
man sich für
angenähert
30 Minuten bei Raumtemperatur und verringertem Druck zur Entgasung
setzen, und wird dann für wenigstens
4 Stunden bei 60°C
gehärtet
und vorsichtig von dem Master abgezogen. Der Auftrag von "Tinte" auf den elastomerischen
Stempel wird erreicht, indem der Stempel in eine 0,1 bis 10 μM wässrige Lösung aus
Disulfid-abgeleiteten antikörperbindenden Protein
ausgesetzt wird, indem der Stempel mit der Stempelfläche nach
unten für
zehn Sekunden bis zehn Minuten in der Lösung platziert wird. Den Stempel
lässt man
unter Umgebungsbedingungen trocknen, oder typischerweise, indem
er einem Strom aus Luft oder Stickstoffgas ausgesetzt wird. Anschließend auf
die Tintenaufbringung wird der Stempel auf eine Goldoberfläche aufgebracht.
Ein leichter Druck wird angewendet, um einen vollständigen Kontakt zwischen
dem Stempel und der Oberfläche
sicherzustellen. Nach einer Sekunde bis fünf Minuten wird dann der Stempel
vorsichtig von der Oberfläche
abgelöst.
Anschließend
an die Entfernung des Stempels wird die Oberfläche gespült und getrocknet. Alternativ
kann eine weitere Derivatisierung nicht gestempelter Bereiche erreicht
werden, indem entweder ein zweiter Stempel verwendet wird, oder
indem die gesamte Oberfläche
einem anderen Agens ausgesetzt wird. Anschließend kann eine Aussetzung an ein
proteinblockierendes Agens, wie z. B. BSA oder β-Casein oder irgendein anderes
im Fachgebiet allgemein bekanntes Mittel ebenfalls ausgeführt werden.
Nachdem das Muster positioniert ist, würde die strukturierte Oberfläche einen
für den
gewünschten Analyten
spezifischen Antikörper
entweder durch Eintauchen in eine Lösung oder durch Sprüh- oder Aufschleuderbeschichtung
der Lösung
auf die strukturierte Oberfläche
ausgesetzt werden.
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Die
elastomerische Eigenschaft des Stempels ist für den Erfolg des Prozesses
wichtig. Polydimethyisiloxan (PDMS) ist im ausgehärteten Zustand ausreichend
elastomerisch, um einen guten formschlüssigen Kontakt des Stempels
und der Oberfläche
selbst für
Oberflächen
mit signifikanten Reliefs zu ermöglichen;
dieser Kontakt ist für
eine effiziente Kontaktübertragung
des Proteins auf den Goldfilm wichtig. Die elastomerischen Eigenschaften
des PDMS sind auch wichtig, wenn der Stempel von dem Master entfernt
wird: Wenn der Stempel starr (wie der Master) wäre, wäre es schwierig, den Stempel
von dem Master nach der Aushärtung
ohne Beschädigung
von einem der zwei Substrate zu trennen. PDMS ist auch ausreichend
starr, um seine Form selbst für
Merkmale mit Sub-Mikrometerabmessungen beizubehalten. Die Oberfläche des
PDMS hat eine niedrige freie Grenzflächenenergie (y = 22,1 Dynes/cm)
und der Stempel haftet nicht an dem Goldfilm an. Der Stempel ist
dahingehend haltbar, dass der Stempel bis zu 100 Mal über eine
Zeitdauer von mehreren Monaten ohne signifikante Verschlechterung
in seinem Verhalten verwendet werden kann. Die polymerische Natur
des PDMS spielt auch eine kritische Rolle bei der Tintenaufbringungsprozedur, indem
sie dem Stempel die Absorption der Proteintinte durch Anschwellen
ermöglicht.
-
Eine
detailliertere Beschreibung der Verfahren und der Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung folgt. Alle hierin zitierten Veröffentlichungen
sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit beinhaltet.
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Jeder
Kunststofffilm ist für
die vorliegende Erfindung geeignet. Bevorzugt kann auf dem Kunststofffilm
auch eine Metallbeschichtung abgeschieden sein. Diese umfassen,
sind jedoch nicht darauf beschränkt,
Polymere wie z. B. Polyethylenterephthalat, (Mylar®),
Acrylnitrilbutadienstyrol, Acrylnitrilmethylacrylat-Copolymer, Zellophan,
zellulosehaltige Polymere, wie Ethylzellulose, Zelluloseacetat,
Zelluloseacetatbutyrat, Zellulosepropionat, Zellulosetriacetat,
Zellulosetriacetat, Polyethylen, Polyethylenvinylacetat-Copolymere, Ionomere
(Ethylen-Polymere), Polyethylen-Nylon-Copolymere, Polypropylen, Methylpenten-Polymere,
Polyvinylfluorid und aromatischen Polysulfone. Bevorzugt hat der
Kunsstofffilm eine optische Transparenz, die größer als 80% ist, Weitere geeignete
thermoplastische Kunststoffe und Lieferanten kann man beispielsweise
in Bezugswerken wie z. B. Modern Plastics Encyclopedia (McGraw-Rill,
Publishing Co., New York, 1923–1996)
finden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung weist der Polymerfilm eine Metallbeschichtung darauf
auf und hat eine optische Transparenz zwischen angenähert 5%
und 95%. Eine erwünschtere
optische Transparenz für
den in der vorliegenden Erfindung verwendeten thermoplastischen
Film liegt zwischen angenähert
20% und 80%. In einer gewünschten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hat der Polymerfilm wenigstens angenähert 80%
optische Transparenz, und die Dicke der Metallbeschichtung ist so,
dass sie eine optische Transparenz größer als etwa 20% aufrechterhält, so dass
Beugungsmuster entweder durch reflektiertes oder transmittiertes
Licht erzeugt werden können.
Dieses entspricht einer Dicke der Metallbeschichtung von etwa 10
nm. Jedoch kann in weiteren Ausführungsformen
der Erfindung die Golddicke zwischen etwa 1 nm und 1000 nm betragen.
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Das
bevorzugte Metall für
die Abscheidung auf dem Film ist Gold. Jedoch können Silber, Aluminium, Chrom,
Kupfer, Eisen, Zirkon, Platin und Nickel ebenso sowie Oxide dieser
Metalle verwendet werden.
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Im
Prinzip könnte
jede Oberfläche
mit Rauhigkeiten geeigneter Größe als Master
verwendet werden. Der Prozess der Mikrokontakt-Bedruckung beginnt
mit einer geeigneten Reliefstruktur, aus welcher ein elastomerischer
Stempel gegossen wird. Diese "Master"-Schablone kann photolithographisch oder
mittels anderer Prozeduren, wie z. B. kommer ziell erhältlicher
Beugungsgitter hergestellt werden. In einer Ausführungsform kann der Stempel
aus Polydimethylsiloxan hergestellt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung eine optische Testvorrichtung mit einer optisch
aktiven rezeptiven Oberfläche,
die dafür
konfiguriert und angeordnet ist, einen gleichzeitigen Test von mehreren
Proben auf der Oberfläche
für einen
interessierenden Analyten zu ermöglichen,
und eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung (z.
B. eine Pipettierungsvorrichtung) bereit, die dafür konfiguriert
und angeordnet ist, Proben- und Reagenzlösungen auf der Oberfläche zu verteilen.
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Anschließend wird
ein Hinweis auf die Methodik gegeben, mittels welcher die für den Aufbau optischer
Testoberflächen
dieser Erfindung nützlichen
optimalen Materialien und Verfahren gefunden werden können. Im
Wesentlichen beinhaltet die vorliegende Erfindung neue optisch aktive
Testoberflächen
für die
direkte Detektion eines Analyten. Diese Testoberflächen haben
einen analytspezifischen Antikörper,
der mit der Testoberfläche
unter Verwendung einer Befestigungsschicht – nämlich den antikörperbindenden
Proteinen verbunden ist. Somit stellt die vorliegende Erfindung
eine Detektionsvorrichtung bereit, welche die Auswahl eines optimalen Substrates,
dessen Bedruckung mit Mustern mit antikörperbindendem Protein und dann
dessen Aussetzung an den Antikörper
für den
gewünschten
Analyten umfasst. Das Detektionsverfahren beinhaltet das in Kontakt
bringen dieser Vorrichtung mit einem Probefluid, das den interessierenden
Analyten enthält, und
dann die Untersuchung der Änderung
in der Brechung von transmittiertem oder reflektiertem Licht, indem
beobachtet wird, ob ein Beugungsmuster ausgebildet ist.
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Die
vorliegende Erfindung weist einen breiten Bereich von Anwendungen
auf und kann in einer Vielzahl spezifischer Bindungspaar-Assay-Methoden verwendet
werden. Beispielsweise können
die Vorrichtungen dieser Erfindung im Immun-Assay-Verfahren entweder
zur Antigen- oder Antikorperdetektion eingesetzt werden. Diese Vorrichtungen
können
für den
Einsatz in direkten, indirekten oder Wettbewerbs-Detektionsverfahren
angepasst werden.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hat die antikörperbindende Proteinschicht die
nachstehende allgemeine Formel: X-P-Ab
-
X
ist optional als eine Mittel, um eine Chemisorption an Metall oder
Metalloxid zu ermöglichen. Beispielsweise
kann X asymmetrisches oder symmetrisches Disulfid (-R'SSY', -RSSY), Sulfid (-R'SY', -RSY), Diselenid
(-R'Se-SeY'), Selenid (-R'SeY', -RSeY), Thiol (-SH), Nitril (-CN),
Isonitril, Nitro (-NO2), Selenol (-SeH),
trivalente Phosphorverbindungen, Isothiocyanat, Xanthat, Thiocarbamat,
Phosphin, Thiosäure
oder Dithiosäure,
Karboxylsäuren,
Hydroxylsäuren
und hydroxamische Säuren
sein.
-
P
repräsentiert
die antikörperbindenden
Proteine, welche mit X abgeleitet werden können. Ab repräsentiert
den für
den gewünschten
Analyten spezifischen Antikörper.
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Der
Stempel kann in Luft oder unter einem Fluid, wie z. B. Wasser, aufgebracht
werden, um eine überflüssige Diffusion
des Proteinmaterials zu verhindern. Für Druckprozesse in größerem Maßstab oder kontinuierliche,
ist es am meisten erwünscht,
in Luft zu drucken, da kürzere
Kontaktzeiten für
diese Prozesse erwünscht
sind.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Muster auf dem metallisierter thermoplastischen
Polymer mit der antikörperbindenden
Proteinschicht ausgebildet. In einer werteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Relief des Musters mit der antikörperbindenden Proteinschicht
ausgebildet. Nach dem Stempelungsvorgang können die metallisierten Bereiche
auf dem Kunststoff optional passiviert oder blockiert werden, wie
z. B. mit einem Reagenz wie z. B. β-Casein. Bevorzugt erfolgt dieses
vor der Aussetzung an den Antikörper.
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Diese
Erfindung wird ferner durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht,
welche in keiner Weise als Einschränkungen ihres Schutzumfangs
anzeigend betrachtet werden sollten. Im Gegenteil dürfte es
klar erkennbar sein, dass auf verschiedene weitere Ausführungsformen,
Modifikationen und deren Aquivalente zurückgegriffen werden kann, welche
sich nach dem Lesen der Beschreibung hierin, selbst für den Fachmann
auf diesem Gebiet ohne Abweichung von dem Erfindungsgedanken der vorliegenden
Erfindung aufdrängen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
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Antikörper-konjugierte
Polystyrolpartikel wurden mittels Carbodiimid-Kopplung mit Ethyldimethylamindicarbodiimid
(EDAC), Flasche Nr. 3 des Polysciences-Kit, Katalog No. 19539) hergestellt.
Für dieses
Beispiel wurden 0,1225 mL einer 10% Suspension blau carboxylierter
Partikel mit 0,5 μm Durchmesser
(Gangs Laborstories; Fishers, Indiana; Cat No. D0005070CB) mit einer
wässrigen
Lösung des
EDAC für
1 bis 4 Stunden aktiviert, gespült,
und dann 300 Mikrogramm eines monoclonalen Antikörper zu einem luteniisierenden
Hormon, Alpha Subeinheit ausgesetzt, (Fitzgerald Industries, Cat.
No. 10-L10, Clone
No. M94136). Die Partikel wurden nochmals gespült, mit Rinderserumalbumin
blockiert und bei 2,5% Konzentration in einer phosphatgepufferten
Salzlösung
gelagert.
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Eine
10 mM wässrige
Lagerungslösung
aus Sulfo-LC-SPDP (Pierce Chemical Co.; Rockford, IL) wurde hergestellt,
indem 1,3 mg Sulfo-LC-SPDP in 2,07 mL deionisiertem Wasser gelöst wurden.
Die Konjugationsreaktion wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS),
die 20 mM Natriumphosphatpuffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, und 0,02%
Natriumazid bei pH 7,5 enthielt, ausgeführt. Ein Milligramm eines lyophilisierten
Proteins A oder Proteins G wurde in 450 Mikroliter PBS gelöst, und
50 Mikroliter der Sulfo-LC-SPDP-Lagerungslösung wurden
der Antikörperlösung zugesetzt.
Das Gemisch ließ man
bei Raumtemperatur für
60 Minuten reagieren. Die Probe wurde auf eine 5-mL Entsalzungs-Polyacrylamidsäule aufgebracht,
die zuvor mit 5 Bettvolumina (25 mL) von PBS ins Gleichgewicht gebracht
wurde. Fraktionen wurden unter Verwendung von PBS als Elutionspuffer
eluiert, und das Protein in den Fraktionen wurde unter Verwendung
eines COOMASSIE® Plus
Protein Assay (Pierce Chemical Co.) überwacht. Typischerweise wurden
50 μL des
COOMASSIE® Reagenz
mit 50 μL
jeder Fraktion in einer Mikrotiterplatte gemischt. Das COOMASSIE® Reagenz
reagierte mit dem Protein unter Erzeugung einer blauen Farbe, deren
Intensität
von der Menge in der Fraktion vorhandenen Proteins abhängig war.
Die Fraktionen, welche die intensivste blaue Farbe erzeugten, waren diejenigen,
die den Großteil
des eluierten Proteins enthielten. Diese Fraktionen wurden als die
Disulfidform des zum Schluss abgeleiteten Produktes zusammengepoolt.
Dieses erfolgte typischerweise in der für den Kontaktdruck verwendeten
Form.
-
Optional
kann die auf der Disulfidform des thiolierten Binders vorhandene
Disulfid-Pyridylgruppe
auf eine Thiolgruppe in einer Reduzierungsreaktion reduziert werden.
Anstelle einer Entsalzung auf einer mit PBS ins Gleichgewicht gebrachten
Säule wurde
das abgeleitete Protein auf einer mit einem Acetatpuffer (100 mM
Natriumacetatpuffer, 100 mM NaCl, pH 4,5) ins Gleichgewicht gebrachten
Säule entsalzt.
Der sauere pH dieses Acetatpuffers wirkt als Schutz aller auf dem
nativen Protein aus der ungewünschten
Reduzierung vorhandenen Disulfidbindungen. In der Reduktionsreaktion
werden 12 mg Dithiotreitol (DTT) in 500 mL Acetatpuffer gelöst und 1
mL des SPDP-abgeleiteten Proteins zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde für
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und auf einer mit 5 Bettvolumina
(25 mL) eines Acetatpuffers ins Gleichgewicht gebrachten 5 mL Entsalzungssäule entsalzt.
Der Proteinanteil der eluierten Fraktionen wurde wiederum mittels
des COOMASSIE® Protein
Assay, wie vorstehend beschrieben, überwacht, und die die größten Mengen
an Protein enthaltenden Fraktionen wurden für einen anschließenden Kontaktdruckvorgang
zusammengepoolt.
-
Sowohl
die Disulfid- als auch reduzierten Formen der thiolierten Binder
wurden in einer wässrigen
Lösung
bei 4°C
bis zur Benutzung bei dem Kontaktdruck gelagert.
-
Ein
Gold/MYLAR®-Film
wurde mit einer 5 mg/ML β-Caseinlösung für 10 Minuten
vorbehandelt (oder blockiert), dann sorgfältig gespült und unter einem Luftstrom
getrocknet. Ein PDMS-Stempel mit 10 μm Kreisen wurde mit dem thiolierten
antikörperbindenden
Protein beschichtet, indem der Stempel mit der Stempelfläche nach
unten in einer 0,5 mg/mL thiolierten Lösung von Protein A (oder Protein
G) platziert und für
10 Minuten getränkt
wurde. Ein starker Luftstrom wurde zum sorgfältigen Trocknen der Oberfläche des
Stempels verwendet. Der beschichtete Stempel wurde mit der Gold/MYLAR® für 5 Minuten
in Kontakt gebracht und dann entfernt. Der sich ergebende bedruckte
Gold/MYIAR®-Film
wurde in destilliertem Wasser gespült und getrocknet.
-
Der
Sensor wurde dann einer Antikörperlösung (z.
B. einer 2 μg/mL
PBS-Lösung
eines monoclonalen Antikörpers
zu einem luteniisierenden Hormon-Beta ausgesetzt, (Katalog No. 10-L15,
Clone No. M94187 Fitzgerald industries, für 30 Minuten ausgesetzt, gefolgt
von einer Spülung
und Lufttrocknung.
-
Die
Sensorprobe wurde einer 2 μg/mL
wässrigen
Lösung
(mit 1% Rinderserumalbumin) eines Ziegen-Anti-Maus HRP (als Meerrettichperoxidase bezeichnet)
ausgesetzt, indem ein Tröpfchen
der Lösung
auf die Oberseite der Sensoroberfläche für 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur
aufgebracht wurde. Die Probe wurde mit 0,02% Twen 20 Lösung und
dann destilliertem Wasser gespült.
Eine anschließenden
Aussetzung an eine TMB-Membran-Enhancer-Lösung (z. B. ein 10:1 v/v Gemisch von
Kirkegaard and Perry Laborstories Reagentien Cat No. 50-46-18 und
Cat. No. 50-77-01) erfolgte, indem die TMB-Lösung auf der Sensorprobe für 10 Minuten
platziert wurde. Dieses bewirkte die Entwicklung eines blauen Ausfällung auf
den Kreisen oder Merkmalen, sowie eines Beugungsbildes bei Bestrahlung
mit einer Punktlichtquelle.
-
Optional
wird die Analytlösung
(z. B. luteniisierendes Hormon in diesem Beispiel) mit Mikropartikeln
(typischerweise 50 bis 70 Mikroliter der Analytlösung mit 10 bis 20 Mikroliter
einer 1,5 bis 2,5% Antikörper-konjugierten
Partikelsuspension) gemischt und auf der Oberseite des Sensors aufgebracht
(typischerweise wird eine Sensorprobe von 1 cm2 verwendet).
Nach 5 bis 10 Minuten wird eine Nitrozellulosescheibe (5 bis 8 μm Porengröße, Sigma
No. N3771 oder N4146) mit einem kleinen aus der Mitte ausgestanzten
Loch auf der Oberseite des Sensor platziert. Dieses dient dazu, überschüssiges Fluid und
ungebundene Mikropartikel abzusaugen. Zu diesem Zeitpunkt wird eine
Punktlichtquelle durch die Sensorprobe (unter Verwendung des kleinen
Loches in der Nitrozellulose) transmittiert. Wenn der Analyt vorhanden
war, war ein Beugungsbild auf der anderen Seite des Lichtstrahls
zu sehen.
-
Beispiel 2
-
Antikörper-konjugierte
Polystyrolpartikel wurden mittels Carbodiimid-Kopplung mit Ethyldimethylamindicarbodiimid
(EDAC), Flasche Nr. 3 des Polysciences-Kit, Katalog No. 19539) hergestellt.
Für dieses
Beispiel wurden 0,1225 ml einer 10% Suspension blau carboxylierter
Partikel mit 0,5 μm
Durchmesser (Gangs Laboratories; Fishers, Indiana; Cat No. D0005070CB)
mit einer wässrigen
Lösung
des EDAC für
1 bis 4 Stunden aktiviert, gespült,
und dann 300 Mikrogramm eines polyclonalen Antikörper zu IgE (wie z. B. Huhn
Anti-IgE ausgesetzt, um mit dem als Muster aufgebrachten Protein
A nicht zu reagieren. Die Partikel wurden nochmals gespült, mit
Rinderserumalbumin blockiert und bei 2,5% Konzentration in einer
phosphatgepufferten Salzlösung
gelagert.
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Eine
10 mM wässrige
Lagerungslösung
aus Sulfo-LC-SPDP (Pierce Chemical Co.; Rockford, IL) wurde hergestellt,
indem 1,3 mg Sulfo-LC-SPDP in 2,07 mL deionisiertem Wasser gelöst wurden.
Die Konjugationsreaktion wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS),
die 20 mM Natriumphosphatpuffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, und 0,02%
Natriumazid bei pH 7,5 enthielt, ausgeführt. Ein Milligramm eines lyophilisierten
Proteins A wurde in 450 Mikroliter PBS gelöst, und 50 Mikroliter der Sulfo-LC-SPDP-Lagerungslösung wurden
der Antikörperlösung zugesetzt.
Das Gemisch ließ man
bei Raumtemperatur für
60 Minuten reagieren. Die Probe wurde auf eine 5-mL Entsalzungs-Polyacrylamidsäule aufgebracht,
die zuvor mit 5 Bettvolumina (25 mL) von PBS ins Gleichgewicht gebracht
wurde. Fraktionen wurden unter Verwendung von PBS als Elutionspuffer
eluiert, und das Protein in den Fraktionen wurde unter Verwendung
eines COOMASSIE® Plus
Protein Assay (Pierce Chemical Co.) überwacht. Typischerweise wurden
50 μL des
COOMASSIE® Reagenz
mit 50 μL
jeder Fraktion in einer Mikrotiterplatte gemischt. Das COOMASSIE® Reagenz
reagierte mit dem Protein unter Erzeugung einer blauen Farbe, deren
Intensität
von der Menge in der Fraktion vorhandenen Proteins abhängig war.
Die Fraktionen, welche die intensivste blaue Farbe erzeugten, waren diejenigen,
die den Großteil
des eluierten Proteins enthielten. Diese Fraktionen wurden als die
Disulfidform des zum Schluss abgeleiteten Produktes zusammengepoolt.
Dieses erfolgte typischerweise in der für den Kontaktdruck verwendeten
Form.
-
Optional
kann die auf der Disulfidform des thiolierten Binders vorhandene
Disulfid-Pyridylgruppe
auf eine Thiolgruppe in einer Reduzierungsreaktion reduziert werden.
Anstelle einer Entsalzung auf einer mit PBS ins Gleichgewicht gebrachten
Säule wurde
das abgeleitete Protein auf einer mit einem Acetatpuffer (100 mM
Natriumacetatpuffer, 100 mM NaCl, pH 4,5) ins Gleichgewicht gebrachten
Säule entsalzt.
Der sauere pH dieses Acetatpuffers wirkt als Schutz aller auf dem
nativen Protein aus der ungewünschten
Reduzierung vorhandenen Disulfidbindungen. In der Reduktionsreaktion
werden 12 mg Dithiotreitol (DTT) in 500 mL Acetatpuffer gelöst und 1
mL des SPDP-abgeleiteten Proteins zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde für
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und auf einer mit 5 Bettvolumina
(25 mL) eines Acetatpuffers ins Gleichgewicht gebrachten 5 mL Entsalzungssäule entsalzt.
Der Proteinanteil der eluierten Fraktionen wurde wiederum mittels
des COOMASSIE® Protein
Assay, wie vorstehend beschrieben, überwacht, und die die größten Mengen
an Protein enthaltenden Fraktionen wurden für einen anschließenden Kontaktdruckvorgang
zusammengepoolt.
-
Sowohl
die Disulfid- als auch reduzierten Formen der thiolierten Binder
wurden in einer wässrigen
Lösung
bei 4°C
bis zur Benutzung bei dem Kontaktdruck gelagert.
-
Ein
Gold/MYLAR®-Film
wurde mit einer 5 mg/ML β-Caseinlösung für 10 Minuten
vorbehandelt (oder blockiert), dann sorgfältig gespült und unter einem Luftstrom
getrocknet. Ein PDMS-Stempel mit 10 μm Kreisen wurde mit dem thiolierten
antikörperbindenden
Protein beschichtet, indem der Stempel mit der Stempelfläche nach
unten in einer 0,5 mg/mL thiolierten Lösung von Protein A platziert
und für
10 Minuten getränkt
wurde. Ein starker Luftstrom wurde zum sorgfältigen Trocknen der Oberfläche des
Stempels verwendet. Der beschichtete Stempel wurde mit der Gold/MYLAR® für 5 Minuten
in Kontakt gebracht und dann entfernt. Der sich ergebende bedruckte Gold/MYIAR®-Film
wurde in destilliertem Wasser gespült und getrocknet.
-
Die
Analytlösung
(typischerweise 50 bis 70 Mikroliter Auf 2 μg/mL PBS-Lösung von IgE (Katalog No. 30-Al05,
Fitzgerald industries International, Inc.; Concord; MA) wird auf
der Oberseite des Sensors aufgebracht (typischerweise 1 cm2) für
0–20 Minuten aufgebracht),
gefolgt von 10–20
Mikroliter 1,5–2,5% antikörperkonjugierter
Partikelsuspension für
zusätzliche
5–20 Minuten.
Eine Nitrozellulosescheibe (5 bis 8 μm Porengröße, Sigma No. N3771 oder N4146)
mit einem kleinen aus der Mitte ausgestanzten Loch wird dann auf
der Oberseite des Sensor platziert. Dieses dient dazu, überschüssiges Fluid
und ungebundene Mikropartikel abzusaugen. Zu diesem Zeitpunkt wird eine
Punktlichtquelle durch die Sensorprobe (unter Verwendung des kleinen
Loches in der Nitrozellulose) transmittiert. Wenn der Analyt vorhanden
war, war wie veranschaulicht ein Beugungsbild auf der anderen Seite
des Lichtstrahls zu sehen.