DE7232618U - Auflichtfluoreszenz-mikroskop - Google Patents

Description

Patentanwälte

ZELLENTIpJ u. LUYKEN

8000 München 22

Zweibrückenstr. 6

Tel. 22 45 85

Olyapue Optical Co·, Linited oot 721-7 Tokyo/JIPAB 4. September 1972

VBr

Aufliehtfluoreesens-Mikroskop

Die Erfindung besieht sieh Fluoressensmikroskope, insbesondere auf Auflichtfluoresxens-Hikroskope.

Die bekannten Auflichtfluoressene-Mikroskope sind, wie in Fig.1 geseigt, so ausgebildet, daß die Lichtstrahlen 1, die ▼on einer Lichtquelle ( nicht dargestellt ) können, die eine ; QuecksllberlaBpe oder dergleichen sein kenn, durch ein Einlad» filterte welches nur Lichtstrahlen einer gewünschten spesifisehen Wellenlänge durehlftSt ) hindurehtreten und diese gefilterten Lichtstrahlen werdendem an eines dichroitischen Spiegel 3 so reflektiert, daß sie durch ein Objektiv 5 «nf ein Objekt gelangen, welches fluoreszierend gemacht worden ist. Dieses Objekt 6 absorbiert die Lichtstrahlen mit der spezifischen Vellemlänge, welche auf das Objekt auftreffen und eaitiert Licht- oder Fluoressensstrahlu/^. Diese Flttoressenestrahlung wird durch das Objektiv 5 den,dichroitischen Spiegel 3 und

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einen Grensfilter 6 hindurchgelassen, um danm durch ein oder swei Olcalare betrachtet zu werden. Normalerweise wird das SU untersuchende Objekt suvor mit einer Fluoressensfarbe gefärbt. Ale eine solche Farbe, d.h. Farbstoff für die Fluoresseiis*Antik8rperteohnik wird beispielsweise F.I.T.C. (Fluoreszein Xsothiocyanat) häufig verwendet. Daher sollen *unäshst die Fälle besehrieben werden, in denen dieser Farbstoff sub Flrbea des Objektes verwendet wird. Dieses F.I.T.G. besitst eins maximale Absorption bei der Wellenlänge 490 m^ und emitiert eine maximale Fluoressensstrahlung mit einer Wellenlange von 520 no.« welche nahe dabei liegt· Deegemfiß ist es wunsehenswert, einen dicbrei tischen, Spiegel su verwenden

twie_jDiöglicl3J

der so viel lieht der Wellenlänge von 49Öm^reflektiert und der so viel Licht der Wellenlänge von 520 mj/ wie möglich durchlast, »ormalerweise wird ein Hehreciiiehtinterferensfilter verwendet« welches eine esuicimale Durchlässigkeit für die Wellen*, lange 520 sz/ibesitst und #i«· «oieK· spektrale Eigenschaft, dafi es diejenige Strahlung, die kleinere Wellenlängen besitst, elioiniert. 9a jedoch bei den bekannten Avifliehtfluoreasensllikroskopen alt einen optischen System, wie es in Fig· 1 dargestellt ist, der Lichtfluß auf den diehroitischen Spiegel 3 unter «ines Auftreffwinkel von 45° auftreifen gelassen wird, ergibt »ich in Terbindung mit den optisch·» Eigenschaften eines solchen Mehrschichtiger r«rensfiltexs, wie die Karre Jkrc\ in Fig. 2 seigt, daf? die maximale Durchlaseigkeit im Terhftltnis

sum Tertikaien Auftreff en langs&a abnimmt, so daß die Durchlässigkeit eisen stetigen Abf ell en den kärseren Wellenlängen hia besitzt. Hit anderen Worten können,vie auch die Kurve a in Fig. 2 aisigt, mehr als 50$ der Lichtstrahlen mit einer Wellenlänge von 490 bi((welche gleich der Wellenlänge ist,an der F.I.T.C. maximale Absorption besitst) durch den dichroitischen Spiegel hindurchtreten, ao daß die Hange des reflektierten Lichtes entsprechend kleiner ist. Hit anderen Worten tritt ein wesentlicher Yerlust an Licht auf, welches das fluoressierende Objekt beleuchtet. Auch wenn das Objekt einen großen Reflexionsfaktor besitzt, werden sehr als 50% des το« JTluorossierenden Objekt reflektierten Lichtes durch den dichroitisch« !Spiegel hindurchgelassen. Serartiges Licht, welches durch diesen Spiegel hindurchtritt, versursacht das Eitstehen von Völkern und dies bat den »achteil, daß das
seheinende Bild dunkel und verschwommen ist.

vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe sugrunde, ein Auflichtflttoressens-Ilikroskop ansugeben, welches ein helles wolkenfreies und klares Bild liefert.

&ie_~s wird erfindunigegemäß dadurch erreicht, daß der dichroitische 8piegel als Koiokavspiegel ausgebildet ist und daß »wischen dieses und den Einlaßfilter ein erster kleiner ßeflektionaspiegel nahe der optischen Achse des Mikroskops angeordnet ist.

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Vorteilhaft ist dabei die Anordnung so getroffen, daß der Strom dee beleuchteten Lichtes auf den konkaven dichroitisehen Spiegel unter einen kleinetaSglichen Auf tr effwinkel auf trifft.

Der kleine Beflektionsspiegel wird vcrsugsweise an der Licht- | quellenseite dee konkaven dichroitieehen Spiegele möglichst nahe an der optiechen Achse des optischen Systems des Mikroskops angebracht. Weiterhin wird vorteilhaft eine Hilfalinee vexwv wendet, die den Beleuchtungslichtstrom in der Slhe des kleinen | Beflektionsapiegels fokussiert« Anstelle der Hilfelinse kann auch ein Konkavspiegel verwendet werden. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Grensfilter so angeordnet, daß es eine neigung war optischen Achse des Mikroskope beutst.

Bas su untersuchende Objekt wird vorteiBxaft mit einer Fluoreszenzfarbe gefärbt, die eic grünes Licht als Erregungsstrahluai verwendet, in Verbindung mit einem diehroitisehen Spiegel, der als Mehrschichtinit Pf«rensfilter ausgebildet 1st und diejenigen Liehtstrshlen. abschneidet, die auf der kurswelligen Sei» liegen und der eine Spektralcharakteristik besitst, daß die Wellen-, lange der Lichtstrahlen, die durchgelassen werden, bei einem Durchlaßfaktor von 5ö# 605 uu± 5 «κ oder 590 ■*(♦ 5 *M betragt. Es kann auch eine für blaues Licht als Xrregungs*t?ahlung vor-

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gesehene f luoreesensfarbe in Verbindung «it ein,·» al* Mehr- «ohichtiHU<f*r«ief liter ausgebildeten dichroitisch« Spiegel verwendet werden, der di· auf de* karewelligea Seit· liegeade Strahlung abschneidet uxtd eine Spektraleharakteriatik baaitst, bei der die WellenlMaf e ., die ait «inern Durchlaflf ektor von 50% dareagelaeaen wird, 305 m/ ♦ 5 »/,{beträgt.

Ferner kann auch, eine tür violett·· Licht al· £rregungaetrahlKO{

geeignete Fluoreaxenefarbe in Verbindung eit ein«· diehroitioehi Spiegel verwendet werden« der al· Mehraohichtinterferensfilter die auf der kurcwelligen Seite gelegene Liehtetrahlung ab» schneidet und der eine Spektraleharakteristik beaitst, bei der die Wellenlänge der mit einem Dnechlaßfaktor von 5OSi durchgelaaaenen Strahlung bei 4?3 »μ + 5 »/< liegt·

SchlieBlieh kann »ine ultraviolette· Licht als Krregungsetrahlung aufnehmende Flu^oreesensfarbe in Verbindung mit eines diehroitieohen Spiegel verwendet werden, der Hehraehiehtinterferenafilter die Lichtstrahlung abschneidet, die auf der kurswelligen Seite liegt und der eine solche Spektralcharakteri •tik besitzt, daB die Wellenlänge bei der Lichtstrahlung mit einem Durchlauf aktor von 50% durehgelaseen wird, 410 *β± 5m/^ beträgt.

Di· Erfindung wird mm anhand τοη Ausführuneatoeispielen unter Besugnahme auf dl· Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnung« ist

Fig» 1 dl« schematische Ansieht des optischen Bystees «Ines !»«kannten

Ilg· 2 «ill Blagranm, da« dl« spektral« Ihirchlaflf aktoren dl« choritischer Spiegel, vie si« Ib Aufliehtfluoree*ene-Mikroakopen Tenrenidet werden, zeigt

?lg· 5 echematieche Sarstelliingan des optiachen Syateae von und
VIg. 4 Auflichtflttoreeeene-Hikroelcopen nach der vorliegenden

Ecf indang und Fig. 5 Darstellungen verschiedener konkaver dichroltiacher

A,B u.

C Spiegel, wie si« Dsl der vorliegenden Erfindimg verwendet werden.

In dem In flg. 3 dargestellten AuafOhrungsbeiepiel durchläuft die von einer Lichtquelle kon&ande Lichtstrahlung 1 einen Siagangsfilter 2, wird von einen sweiten Beflektionsspiegel 9 reflektiert und von der Hilfelinse 10 in die HShe des ersten kleinen Beflektio&sspiegels 8 reflektiert. Sie vom de« ersten kleinen Beflektionsspiegel 8 reflektierte Strahlung wird weiter m den konkaven dichrcfci sehen Spiegel 3& aufgenoaaen und reflektiert und als vergrößertes Bild cum Punkt 4 der Austritts-

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pupill· des Objektive oder sam rückwärtigen Brennpunkt der Objektivlinse fokuft&trt, wodurch eine perfekte Zonlerbeleuchtung mit der Objektivlinse erreicht wird. Zu diesem Zweck ist der

3a
konkave dichroitische Spiegel mit einer leichten Veigtmg relativ sur optisches Achse des Mikroskops angeordnet. \Die aus dieser Anordnung resultierende; Beugung der optischen Achse kann durch Anordnung des Grensfilters 7 ait einer Beigung relativ sur optischen Achse korrlegiert werden. Es sei darauf hingewiesen, daß bei dieses Auaführungsbeispiel der erste kleine Beflektionsspiege 8 an der Liehtquellenseite des konkaven diehroitisehen Spiegels 3a einen wirksamen Durchmesser hat, der kleiner sein kanu als der des diehroitisehen Spiegels 3a. Saher kann der erste kleine Beilektionaspiegel 8 in der Baehbarsehaf t der optischen Achse des optischen Systems des Hikroskops angeordnet werden, Dadurch kann der Auftreffwinkel des Beleuchtungslichtstrams auf den

3a
konkaven diehroitisehen Spiegel außerordentlich klein gehalten werden· Bei einem tatsächlichen Aueführungebeispiel war es möglich, den BeleuchtungsliehtstroB auf den konkaven diehroitischen

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Spiegel unter einem Auftreffwinkel von ungefähr 6 auf treffen

su lassen· Selbstverständlich kann auch der sweite Eeflektionsspiegel 9 ein Konkavspiegel sein, wie in einem weiteren Ausführungsbeispiel später beschrieben wird. Ee sei jedoch erwähnt, daß, wenn kein «weiter Reflexionsspiegel 9 verwendet wird, die Lichtquelle schräg angeordnet werden muß. Daher wird es

aus verschiedenen Gründen, wie der Lebensdauer der Lichtquelle« bevorzugt, daß ein solcher zweiter Reflexionsspiegel 9 verwendet wird. Auch bei diesem Ausführungsbeispiel ist schon aus der Zeichnung ersichtlich, daß der erste kleine Reflexionsspiegel 9 als Spiegelfläche auf der planen Seite einer plankonvexen Linse ausgebildet ist und so angeordnet ist, daß deren konvexe Seite nach oben gerichtet ist. Selbstverständlich kann eine genau gleiche Traktion, wie bei dieser Anordnung, beider folgenden Anordnung erreicht werden, bei der eine Spiegelfläche an der konkaven Seite einer plankonkaven Linse angeordnet ist, wobei die konkave Flache nach oben gerichtet ist· Erwähnt sei, daß es »war möglich ist, den ersten kleinen Reflexionsspiegel 8 in Form eines Planspiegels auszubilden, daß aber die Auslildung als plankonvexe Linse, wie sie in Fig. 3 geseigt ist, aus de» folgenden Grunde vorteilhaft ist. Dadurch, daß der konkave dichroitisch« Spiegel 3a eine leichte Krümaung hat, tragt ein Teil seiner Konvergens dasu bei, daß Idcttstrahlen, die von den ersten kleinen Reflexionsspiegel 8 ausgehen,

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den schädlichen Effekt, auf das Bild^erdurch die ffeigung dieses dichroitischen Spiegele 3a relativ eur optischen Achse des Mikroskops bedingt ist.

Die Kurve b in Fig. 2 neigt die Spektraldurchlässigkeit in dem Fall, in dea die Lichtstrahlen auf den dichroitischen Spiegel unter eines Auftreffwinkel von 6° auftreffen· Wie man aus dieser Kxuve b entnehmen kann, 1st die Spektrale Durchlässigkeit in

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wesentlichen die gleiche wie hei vertikalem Auftreffen. Insbesondere ergibt sich eine extrem kleine Durchlässigkeit hei der Wellenlänge 490 du, während eine extrem große Durchlässigkeit hei 520 m (/beobachtet wird· Saher werden bei Anwendung der vorliegenden Erfindung bei einem AufllGhtf luoreasens-lfakroskop die Lichtstrahlen so geführt, daS sie auf den dichroitischen Spiegel mit einem Einfallswinkel von ungefShr 6° auftreffen, so daß ein helles, wolkenfreies und klares Bild beobachtet werden kann durch das Okular 13 oit der Austrittepupille 14. Bas Okular 13 ist geneigt but optischen Achse 17 des Auflichtfluoressens-Hikroskops angeordnet und daher ist im Gehäuseteil 16 mit dem geneigten Tubus für das Okular ein Prisma 15 angeordnet. Ah den Subusabschaitt 12 für Idchtprojektion des Hikroskopgehäuses sehließt sieh nach unten der Objektivteil mit dem auf einem Revolver 11 angeordneten Objektiv 5 an·

Ia Fig. 4 ist ein imderes Aueführungebeispiel der Erfindung dargestellt. Wie sieh aus dieser Fig. ergibt, sind sowohl die Liehttuelle als auch das MnlaÄfilter 2 in besug auf die optische Achse des Mikroskope gegenüber dem ersten kleinen Beflektionsspiegel 8 and dem zweiten leflektionsspiegel 9 angeordnet. Auch der sweite H»flektionsspiegel 9 ist in der Form eines konkaven Spiegels ausgebildet, um in gleicher Weise wie die bei dem ersten Ausfuhrungsbeispiel von Fig. 3 verwendete Hilfslinse 10 su wirken* Selbstverständlich kamt die vorliegende Erfindung

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sowohl in dem Fall verwirklicht werden, wenn bei dem ersten Ausführungsbeispiel keine Hilf slinse 10 verwendet wird., als auch in dem Fall, wann in »weiten Aueführungabeispiel der «weite Reflexionsspiegel als Planspiegel ausgebildet ist. Die in dan Zeichnungen dargestellte Ausführung wird jedoch bevorsugt, weil sie einen besseren Effekt liefert.

Weiterhin ist su beachten, daß bei eines Fluoressensfarbatoff, wie F»X.7»C·, dar hlauea Licht als Erragangsstrahlung verwendet (andere Farbstoffe ähnlicher Hatur, wie F.I.T.C. enthalten Quinacrin Rustard, Fluorssensnatrium usw.),wie die Kurve b in Fig. 2 aeigt, die Tarwandung eines diehroitischen Spiegels optimal ist, der al* Hehrschichtinterferensfilter ausgebildet ist, welches diejenigen Lichtstrahlen abschneidet, die an dar kurswelligen Seite liegen uad der eine Spektralcharakteristik hat, bei dar die Wellenlänge dar durehgelassenen Lichtstrahlung mit dam DurchlaÖfaktor 50Jt bei 505 */Λ U«gt. Für ein mit f etr»- athylrhodawinnrtschung, Tetraathylrhodaminisothiocynat usw., d.h. mit Fluoressansf arben, die grünes Licht als Srregungastrahlung verwenden, gefärbtes Objekt ist die Verwendung eine» dichroltischen Spiegele optimal, dar aus einem Hehrschiehtintarferenzfilter besteht, welches dia janige Wellenstrahl ung abachneidet, die an dar kurswelligen Saite liegt und der eine Spektralcharakteristik basitst, bei dar die Wellenlänge der mit einem Durchl&Bfaktor von 50Jt durehgelassanen Strahlung

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605 ma oder 590 au beträgt. Für «in Objekt, das mit Serotonin oder einem anderen fluoreszierenden farbstoff, der violettes Licht als Srregungsstrahlung verwendet, gefärbt ist, ist die Verwendung eines diebxoitischen Spiegele optimal, der aus einem Mehfcschiohtinterferenzfliter besteht, welches die auf der kurs·» welligen Seite liegende Strahlung wegschneidet und eine Spektralcharakteristik besitzt, bei der die Wellenlänge der mit eine» Burchlaßfaktor von 5O3& durchgelassenen Strahlung 473 m IA betragt· Schließlich ist für ein mit Catecholaain oder der gleichen fluoreszierenden Farbstoff ,der ultraviolettes Lieht als Srregungsstrahlung verwendet, die Verwendung eines dieLroitischen Spiegels optimal, der aus »ine» Hehrschichtinterferensf ixt er besteht, welches die an der kurswelligen Seite liegende Strahlung abschneidet und eine Spelctralcharakterietik besitzt, bei welcher die mit eine» Durchlaßfaktor von 505* durchgelassene Strahlung bei 410 mz/i liegt.

In Fig. 5 «nd 4 sind ksskave dichroitische Spiegel dargestellt„ die eine Anordnung eines dlehroitiachen Spiegels darstellen, der an der Vex^indungsfläche zwischen einer plankonkaven Linse and einer plankonvexem Linse angeordnet ist. In anderer Ausführung kann der dichroitisch« Siegel van der konkaven Fläche einer plankonkaven Linse, dex*« konkave Flache nach unten gerichtet ist, gebildet werden, wie der Spiegel 5b in Fig. 54 »«igt. Ferner kenn der konkave dichroitiache Spiegel auf der konvexen

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Flfiohe einer plankonvexen Linse angeordnet werden, deren plane fläche naeh unten gerichtet 1st, wie der Spiegel Jc in VIg. 5B. Schllefilieh kann der konkave dioAroitiscne Spiegel auf der konkaven Seite einer koakav-konkrexen Idnae angeordnet werden« deren konkave Seite nach unten gerichtet ist, vie der Spiegel 3d in Fig· 50 seigt* Die Anordneng der Lichtquelle, de· Sinlafif iltera 2, des konkaven diehroitieehen Spiegele 3a, de· ersten kleinen Bef lektlonsspiegels 8, dee sveiten Ref lektionsspiegels 9* de« Grensfilter· 6 usv. kann geändert «erden, ohne den Bahnen der Erfindung asu Überschreiten·

Claims (1)

1. RATENTANWALT Dipl.-Phy&i RICHARD LUYKEN

   11.12.1981 L/Ro

   Schutzansprüche

   1. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop mit einem Einlaßfilter, einem dichroitischen Spiegel, einem Objektiv, einem fluoreszierenden Objekt, einem Grenzfilter und einem Okular, dadurch gekennzeichnet, daß der dichroitische Spiegel (3a) als Konkavspiegel ausgebildet ist und daß zwischen diesem und dem Einlaßfilter (2) ein erster kleiner Reflektionsspiegel (8) nahe der optischen Achse des Mikroskops angeordnet ist.

   2. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß der konkave dichroitische Spiegel (3a) als Vergrößerungsspiegel für das Bild der Lichtquelle nahe der Austrittspupille oder des hinteren Brennpunktes (4) des Objektivs (5) dient.

   3. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß der erste kleine Reflektorspiegel (8) als Spiegelfläche auf der planen Seite einer plankonvexen Linse, deren konvexe Fläche nach oben gerichtet ist, ausgebildet ist.

   4. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß der erste kleine Reflektorspiegel (8) als Spiegelfläche auf der

   konkaven Seite iiner plankonkaven Linse ausgebildet ist, deren konkave Fläche nach oben gerichtet ist.

   5. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter Reflektorspiegel (9) zwischen dem Einlaßfilter (2) und dem ersten kleinen Reflektorspiegel (8) vorgesehen ist.

   6. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 5> d a durch gekennzeichnet, daß der zweite Reflektorspiegel (9a) als ein Konkavspiegel ausgebildet ist.

   7. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach ,nspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß eine Hilfelinse (10) als konvergierendes Element zwischen dem Einlaßfilter (2) und dem ersten kleinen Reflektorspiegel (8) vorgesehen ist.

   8. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Grenzfilter (7) relativ zur optischen Achse (17) des Mikroskops geneigt ist.

   9· Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Betrachtung eines mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Objekts mit grünem Licht als Erregungsstrahlung der konkave chroitische Spiegel (3a) als ein Mehrschichtinterferenzfilter mit einem Durchlaßfaktor von 50 % bei 605 mu +_ 5mu oder 59Omu +_ 5 "iu und dem Durchlaßfaktor 0 für kurzwellige Strahlung ausgebildet ist.

   -βίο. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Betrachtung eines mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Objekts mit blauem Licht als Erregungsstrahlung der konkave chroitische Spiegel (3a) als ein Mehrschichtinterferenzfilter mit einem Durchlaßfaktor von 50 % bei 505 mu +_ 5 % niM und dem Durchlaßfaktor 0 für kurzwellige Strahlung ausgebildet ist.

   11. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Betrachtung eines mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Objekts mit violettem Licht als Erregungsstrahlung der konkave choitische Spiegel (3a) als ein Mehrschichtinterferenzfilter mit einem Durchlaßfaktor von 50 % bei 473 mu +_ 5 mu und dem Durchlaßfaktor 0 für kurzwellige Strahlung ausgebildet ist.

   12. Auflichtfluoreszenz-Mikroskop nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Betrachtung eines mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Objekts mit ultraviolettem Licht als Erregungsstrahlung der konkave chroitische Spiegel (3a) als ein Mehrschichtinterferenzfilter mit einem Durchlaßfaktor von SO % bei 41 ο mu jf 5 mu und dem Durchlaßfaktor 0 für kurzwellige Strahlung ausgebildet ist.