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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberEP0551320 A1
Publication typeApplication
Application numberEP19910916983
PCT numberPCT/EP1991/001856
Publication dateJul 21, 1993
Filing dateSep 27, 1991
Priority dateOct 6, 1990
Also published asCA2093432A1, DE4031731A1, WO1992006118A1
Publication number1991916983, 91916983, 91916983.9, EP 0551320 A1, EP 0551320A1, EP-A1-0551320, EP0551320 A1, EP0551320A1, EP19910916983, EP91916983, PCT/1991/1856, PCT/EP/1991/001856, PCT/EP/1991/01856, PCT/EP/91/001856, PCT/EP/91/01856, PCT/EP1991/001856, PCT/EP1991/01856, PCT/EP1991001856, PCT/EP199101856, PCT/EP91/001856, PCT/EP91/01856, PCT/EP91001856, PCT/EP9101856
InventorsSiegfried Bialojan, Karl-Hermann Strube
ApplicantBASF Aktiengesellschaft
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: Espacenet, EP Register
Protein produced from hirudo medicinalis
EP 0551320 A1
Abstract  translated from French
L'invention concerne une nouvelle protéine extraite d'hirudo medicinalis qui prolonge le temps de coagulation du sang, qui est relativement stable à la chaleur et qui a un poids moléculaire compris entre 25 et 34 KDa, ainsi que ses mutéines, utiles pour traiter des maladies. The invention relates to a new protein derived from Hirudo medicinalis, which extends the blood coagulation time, which is relatively stable to heat and which has a molecular weight between 25 and 34 KDa, as well as muteins thereof, useful for treating diseases.
Claims  translated from German  (OCR text may contain errors)  (text from WO1992006118A1)
Patentanspruch claim
Protein aus Hirudo medicinalis, das die Gerinnungszeit des Blutes verlängert, relativ hitzestabil ist und ein Molekulargewicht von 25 bis 34 KDa besitzt, sowie dessen Muteine. Protein from Hirudo medicinalis, which prolongs the clotting time of the blood, is relatively heat stable and has a molecular weight of 25 to 34 kDa, and its muteins.
Description  translated from German  (OCR text may contain errors)  (text from WO1992006118A1)

Protein aus Hirudo medicinalis Protein from Hirudo medicinalis

Beschreibung description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein aus dem Blutegel Hirudo medicinalis, dessen Muteine sowie deren Her¬ stellung und Verwendung. The present invention relates to a novel protein from the leech Hirudo medicinalis, as well as their muteins whose Her¬ position and use.

Aus den Sekreten verschiedener Egel sind bereits eine Reihe medi- zinisch interessanter Faktoren beschrieben worden, die unter anderem bei der Koagulation des Blutes und der Fibrinolyse eine Rolle spielen. From the secretions of various flukes a series medically interesting factors have already been described, which play a role in areas such as blood coagulation and fibrinolysis. Zu diesen Faktoren gehören Fibrinolytika, die Fibrin oder Fibrinogen direkt abbauen, sowie Plas inogen- aktivatoren. These factors include fibrinolytic, degrade the fibrin or fibrinogen directly, and Plas activators inogen-. Zu den Fibrin bzw. Fibrinogen abbauenden Substanzen gehören das Hementin (aus He enteria ghilianii) und die De- stabilase (aus Hirudo medicinalis; IP Baskova et al. Folia Hä atol., Leipzig, 115, 1988, S. 166). The fibrin or fibrinogen depleting substances include hementin (of He enteria ghilianii) and the De- stabilase (Hirudo medicinalis from; IP Baskova et al Folia Huh atol, Leipzig, 115, 1988, p.166..). Ein Plasminogenaktivator wurde in Sekreten von Hementeria depressa beschrieben. A plasminogen activator described in secretions of Hementeria depressa.

Weiter sind auch Inhibitoren der Blutgerinnung, zB der Throm- bininhibitor Hirudin (aus Hirudo medicinalis), ein Faktor Xa-In- hibitor (aus Hirudo medicinalis), Trypsin- und Plasmin- bzw. Chymotrypsin- und Elastaseinhibitoren wie zB das Bdellin bzw. Egline (aus Hirudo medicinalis) beschrieben (Leech Biology and Behavior, Vol. II, Oxford, Science Publication/RT Sawyer, 1986). Next also inhibitors of clotting, such as the thrombin inhibitor hirudin (Hirudo medicinalis from), a factor Xa inhibitor Germany (Hirudo medicinalis from), trypsin and plasmin and chymotrypsin and elastase inhibitors such as the Bdellin or eglins described (Hirudo medicinalis out) (Leech Biology and Behavior, Vol. II, Oxford Science Publication / RT Sawyer, 1986).

Es wurde nun ein neuer Faktor aus Hirudo medicinalis isoliert. It is a new factor from Hirudo medicinalis was now isolated.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Protein aus Hirudo medi¬ cinalis, das die Gerinnungszeit des Blutes verlängert, relativ hitzestabil ist und ein Molekulargewicht von 25 bis 34 KDa be¬ sitzt, sowie dessen Muteine. The invention relates to a novel protein from Hirudo medi¬ cinalis that prolongs the clotting time of the blood, is relatively heat stable and has a molecular weight of 25 to 34 kDa be¬ sits, and its muteins.

Das neue Protein verlängert die intrinsiche Gerinnungszeit (APTT) und die extrinsische Gerinnungszeit (PT) des Blutes deutlich. The novel protein prolongs the intrinsic coagulation time (APTT) and extrinsic coagulation time (PT) of the blood significantly. Es unterscheidet sich in seinen blutgerinnungshemmenden Eigen¬ schaften von Hirudin und dem Faktor Xa-Inhibitor. It differs in its coagulation-retardant properties are of hirudin and the Factor Xa inhibitor. In Fraktionen, in denen die APTT verlängernde Aktivität vorhanden ist, können weder entsprechende Mengen Hirudin (durch ELISA) noch Faktor In fractions in which the APTT prolonging activity is present, can not appropriate amounts of hirudin (by ELISA) or factor

Xa-Inhibitor-Aktivität (durch Farbsubstrat) nachgewiesen werden. Xa inhibitor activity could be detected (by color substrate). Als Muteine des neuen Proteins sollen solche Proteine verstanden werden, die sich von dem neuen Protein durch Austausch, Deletion und/oder Addition von Aminosäuren oder Peptiden ableiten, ohne daß sich deren Eigenschaften stark vom neuen Protein unter- scheiden. As muteins of the new protein such proteins are to be understood, which are derived from the new protein by substitution, deletion and / or addition of amino acids or peptides without their properties differ greatly from the new protein company.

Das neue Protein läßt sich aus Blutegeln (Hirudo medicinalis) gewinnen. The new protein can be from leeches (Hirudo medicinalis) win. Hierzu werden die Egel in Wasser gegeben. To this end, the leeches are placed in water. Nach Stimulation mit Arginin geben die Blutegel den Faktor in die wäß- rige Lösung ab, aus der das neue Protein in bekannter Weise durch Ionenaustausch-, Affinitäts-, Chelat- und Gelpermeationschromato- graphie oder durch hydrophobe Chromatographie isoliert wird. After stimulation with arginine enter the leech factor in the aqueous solution from, from the chromatography, the new protein in a known manner by ion exchange, affinity, chelating and gel permeation or isolated by hydrophobic chromatography.

Man kann die Egel auch nach Argininstimulation punktieren und das neue Protein wie oben beschrieben aus dem Punktat isolieren. One can leech dot after arginine stimulation and isolate the novel protein as described above from the puncture.

Ebenso ist es möglich, das neue Protein aus dem Homogenat von Köpfen dekapitierter Egel in analoger Weise aufzureinigen. It is also possible to purify the novel protein of the homogenate of heads dekapitierter flukes in an analogous manner.

Um das Protein für therapeutische Zwecke in größeren Mengen ver¬ fügbar zu machen, kann man bekannte gentechnische Methoden (vgl. Maniatis, T. et al ; Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989) anwenden. To ver¬ the protein for therapeutic purposes in large quantities make them available, can be known recombinant methods (see Maniatis, T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989.) Apply. Hierzu wird das Protein zunächst in reiner Form hergestellt. For this purpose, the protein is first produced in pure form. Anschließend wird das Protein gespalten und die so erhaltenen Peptide über reversed phase HPLC (rHPLC) aufgetrennt. Subsequently, the protein is cleaved and separated the peptides obtained on reversed phase HPLC (RHPLC). Von einigen dieser Peptide wird die Aminosäuresequenz bestimmt. Some of these peptides, the amino acid sequence is determined. Mit Oligonukleotiden, die aus den ermittelten Sequenzen abgeleitet werden, wird dann in einer c-DNA-Bank durch sequenzspezifische Filterhybridisierung das für das neue Protein kodierende Gen identifiziert. With oligonucleotides derived from the determined sequences, the gene coding for the novel protein gene is then in a c-DNA library by sequence-specific hybridization filters identified. Die so erhaltene genetische Information kann man dann in verschiedenen Wirtzellen nach bekannten Methoden zur Expression bringen. The genetic information thus obtained can then be brought to expression in various host cells by known methods. Zu den Ex¬ pressionssystemen gehören einerseits Prokaryonten wie E. coli oder Bacillus subtilis, aber auch Eukaryonten wie Hefen und Säugerzellen (zB Cl27-Mausfibroblasten, Hamster-, Insekten¬ zellen) . To the pressionssystemen Ex¬ include on the one hand prokaryotes such as E. coli or Bacillus subtilis, but also eukaryotes such as yeast and mammalian cells (such as CL27 mouse fibroblasts, hamster, Insekten¬ cells).

Das neue Protein und dessen Muteine eignen sich zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe thrombotischer Zustände. The new protein and its muteins useful in the treatment of diseases, especially for the treatment and prophylaxis of thrombotic conditions. Be i sp i el Be i sp i el

a) Gewinnung von Egelextrakt a) obtaining Egelextrakt

Extrakte aus Hirudo medicinalis wurden nach folgenden Ver¬ fahren erhalten: Extracts of Hirudo medicinalis were obtained by following drive Ver¬:

1. Egel wurden 75 min mit einer 10 mM Arginin-Lösung behandelt. 1. leeches were treated min 75 with a 10 mM arginine solution. In dieser Zeit nahm die Lösung durch die Sekretionstätigkeit der Egel eine gelbliche Farbe an. During this time, the solution adopted by the secretory activity of the leech on a yellowish color.

Nach Austausch der Flüssigkeit gegen Wasser sezernierten die Egel weiter. After exchange of the liquid to water leeches secreted on.

2. Egel, die gemäß 1. mit Arginin behandelt worden waren, wurden punktiert und der Mageninhalt gewonnen. 2. leeches that had been treated in accordance with the first arginine were punctured and won the gastric contents.

b) Reinigung des neuen Proteins. b) cleaning of the new protein.

Die gemäß a) erhaltenen Flüssigkeiten wurden einzeln oder zusammen 10 min auf 90°C erhitzt und anschließend sofort auf Eis abgekühlt. The liquids obtained in a) were separately or together for 10 minutes heated to 90 ° C and then immediately cooled on ice. Nach der Zentrifugation (20 min, 10.000 rpm, Sorvall® SA 600-Rotor) wurde der überstand zunächst 1:2 bis 1:5 mit PBS verdünnt. After centrifugation (20 min, 10,000 rpm, Sorvall® SA 600 rotor) the supernatant was first 1: 2 to 1: 5 with PBS. Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt. The pH was adjusted to 7.4. Danach wurde die Lösung auf eine mit PBS äquilibrierte Thereafter, the solution to an equilibrated with PBS was

Q-Sepharose®-Säule (10 ml, Pharmacia, Schweden) aufgetragen. Q-Sepharose® column (10 ml, Pharmacia, Sweden). Nach dem Wegwaschen nicht-gebundenen Materials wurde die Säule mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer A (PBS + 1 M NaCl) eluiert. After washing away unbound material, the column with a linear gradient of 0 to 100% buffer A (PBS + 1 M NaCl) was eluted. Aliquots der Fraktionen wurden auf APTT-Verlängerung getestet. Aliquots of fractions were assayed for APTT prolongation. Der neue Faktor eluierte unter diesen Bedingungen zwischen 0,3 M und 0,5 M NaCl. The new factor eluted under these conditions is between 0.3 M and 0.5 M NaCl.

Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, 1:2 mit 20 mM Phosphatpuffer, 250 mM NaCl pH 7,0 verdünnt und auf eine Cu-Chelat-Säule (1 ml) aufgetragen. Activity containing fractions were pooled, 1: 2 with 20 mM phosphate buffer, 250 mM NaCl pH 7.0 and applied to a copper chelate column (1 ml). Nach dem Spülen mit 10 bis 15 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer (20 mM NaPhosphat, 250 mM NaCl pH 7,0) erfolgte die Elution durch Anlegen eines linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer B (20 mM Bernsteinsäure, 1 M NaCl pH 4,0). After rinsing with 10 to 15 column volumes of equilibration (20 mM NaPhosphate, 250 mM NaCl pH 7.0), elution was carried out by applying a linear gradient of 0 to 100% buffer B (20 mM succinic acid, 1 M NaCl pH 4.0) , Die Säule wurde anschließend entweder mit 20 mM Phosphat, 2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7 oder mit 20 mM Bernsteinsäure 2 M NaCl, 100 M Histidin pH 4 nacheluiert. The column was then nacheluiert with either 20 mM phosphate, 2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7 or 20 mM succinic acid 2 M NaCl, 100 M histidine pH 4th Aliquots einzelner Fraktionen wurden auf APTT-Verlängerung getestet, Aktivität enthaltende Fraktionen vereinigt und über Centricon® 10 (A icon, Best. Nr. 4206) aufkonzentriert, auf PBS umgepuffert und auf einer FPLC-Gelfilrationssäule (Superose® 12, Pharmacia) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min weiter aufgereinigt. Aliquots of individual fractions were assayed for APTT prolongation, activity-containing fractions were combined and concentrated over Centricon 10 (A icon, Cat. No. 4206), rebuffered in PBS and on a FPLC Gelfilrationssäule (Superose® 12, Pharmacia) at a flow rate of 0.5 ml / min purified further.

Die Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf eine mit PBS äquilibrierte Mono Sepharose® (Pharmacia, Schweden) aufgetragen. The fractions containing activity were pooled and applied to a column equilibrated with PBS mono Sepharose® (Pharmacia, Sweden). Von der Mono Q-Säule erfolgte die Elution entweder mit einem pH-Gradienten (0 bis 100 % B, Puffer B = 20 M Bernsteinsäure 1 M NaCl pH 4) oder mit einem Salzgradienten (0 bis 100 % Puffer A). From the Mono Q column was eluted either with a pH gradient (0 to 100% B, Buffer B = 20 M succinic acid 1 M NaCl pH 4) or with a salt gradient (0 to 100% buffer A).

S-Sepharose®-Chromatographie S-Sepharose chromatography

Zur weiteren Reinigung des neuen Faktors wurde eine Chromatographie an S-Sepharose® (LKB, Pharmacia) durchgeführt. For further purification of the new factor chromatography on S-Sepharose (LKB, Pharmacia) was carried out. Dazu werden die Wertfraktionen der Q-Sepharose bzw. Cu-Chelat-Chromatographie zunächst mit Hilfe einer Konzentrierungskammer (Amicon, YM 10 Membran) bei pH 4 bzw. 7 auf onzentriert und durch wiederholtes Auffüllen und Konzentrieren entsalzt. For this, the value of Q-Sepharose fractions or Cu-chelating chromatography, first with the aid of a concentrate chamber (Amicon, YM 10 membrane) at pH 4 and 7 to onzentriert and desalted by repeated filling and concentrating.

Nach dem letzten Schritt wurden die Konzentrate auf 20 mM Bernsteinsäure pH 2,5 (Endkonzentration) verdünnt und auf eine mit 20 mM Bernsteinsäure pH 2,5 äquilibrierte S-Sepha- rose-Säule® aufgetragen. After the last step, the concentrates were 20 mM succinic acid pH 2.5 (final concentration) and applied to a 20 mM succinic acid pH 2.5 equilibrated S-sepharose-Säule®. Durch Elution mit 30 mM Bernstein¬ säure pH 4,5 wurde evtl. vorhandenes Hirudin abgetrennt. possibly existing hirudin was separated by elution with 30 mM succinic acid pH 4.5. Die Elution des neuen Faktor? The elution of the new factor? erfolgte durch Anlegen eines Puffergradienten nach PE pH 7,5. was performed by applying a buffer gradient by PE pH 7.5. In den Wertfraktionen der S-Sepharose wurde ein pH-Wert von 5,5 - 7 gemessen. In the value of fractions of S-Sepharose, a pH of 5.5 was - 7 measured. Die Aktivität (Thrombin-Inhibition) enthaltenden Fraktionen wurden weiterhin in einem Hirudin-Elisa (s. Beispiel 6a) getestet. The fractions containing activity (thrombin inhibition) (Example 6 s.) Were tested further in a hirudin-Elisa. Fraktionen, die die APTT verlängern und im Hirudin-Elisa negativ waren, wurden vereinigt, aufkonzen¬ triert, zur Trockne eingedampft, in Ammoniumacetat pH 6 aufgenommen und durch rHPLC an einer C-4 Phase (rp 304® Bio-Rad) weiter aufgereinigt. Fractions prolong the APTT and the hirudin Elisa were negative were combined, aufkonzen¬ tered, evaporated to dryness, taken up in ammonium acetate pH 6 and RHPLC on a C-4 phase (rp 304® Bio-Rad) purified further. Reversed Phase HPLC (rHPLC) Reverse phase HPLC (RHPLC)

Die Thrombin-Inhibition aufweisenden Fraktionen der S-Sepharose®-Chromatographie wurden über reversed phase HPLC an einer Bio-RAD rp304®-Säule mit einem 20 M Ammonium- acetat, pH 6, 20 M Ammoniumacetat, 50 % Acetonitri 1-System weiter aufgereinigt. The thrombin inhibition fractions comprising the S-Sepharose chromatography were acetate over reversed phase HPLC on a Bio-Rad rp304® column with a 20 M ammonium, pH 6, 20 M ammonium acetate, 50% Acetonitri 1 system further purified , Dazu wurden die Wertfraktionen auf ein Volumen von 200 bis 500 μl konzentriert und durch Anlegen eines Acetonitrilgradienten von der rHPLC eluiert. For this, the fractions were concentrated to a volume of 200 to 500 .mu.l and eluted by applying a gradient of acetonitrile from RHPLC. Der neue Faktor elusiert bei einer Acetonitri Ikonzentration von 7,5 % +_ 3 %. The new factor elusiert at a Acetonitri Ikonzentration of 7.5% + _ 3%. Die Aktivität des neuen Thrombininbibitors bleibt erhalten und kann durch Tricin-SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese oder APTT-Bestimmung nachgewiesen werden. The activity of the new Thrombininbibitors remains and can be detected by Tricine-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or APTT determination.

c) Charakterisierung des neuen Proteins c) Characterization of the new protein

1. Temperaturstabilität 1. Temperature stability

Ein Aliquot des neuen Faktors wurde 10 min auf 95°C erhitzt und danach sofort auf Eis abgekühlt. An aliquot of the new factor was heated 10 min at 95 ° C and then immediately cooled on ice. Die Aktivität wurde durch Messung der Hemmung der APTT bestimmt. The activity was determined by measuring the inhibition of the APTT. Durch die Hitzebehandlung nahm die Aktivität um etwa 10 % ab. Through the heat treatment, the activity decreased by about 10%.

2. Lösungsmittelstabilität 2. solvent stability

Ein Aliquot der Aktivität enthaltenden Proben wurde bei Raumtemperatur mit 50 % Acetonitril in 20 M Ammoniumacetat pH 6,0 versetzt und 30 min inkubiert. An aliquot of the sample containing activity was treated at room temperature with 50% acetonitrile in 20 M ammonium acetate pH 6.0 and incubated for 30 min. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Einfluß der Proben auf die APTT analysiert. After removing the solvent, the leverage of the samples was analyzed for APTT. Es zeigte sich, daß der neue Faktor in seiner Aktivität durch Acetonitril nicht beeinflußt wird. It was found that the new factor is not influenced in its activity by acetonitrile.

3. Proteinnatur 3. Protein Nature

Ein Aliquot des neuen Faktors wurde mit 10 μg Trypsin 16 h bei 37°C inkubiert. An aliquot of the new factor was incubated with 10 ug trypsin for 16 h at 37 ° C. Die Reaktion wurde durch 5 min Kochen und sofortiges Abkühlen mit Eis gestoppt und danach der Einfluß der Probe auf die Hemmung der APTT bestimmt. The reaction was stopped by 5 min cooking and immediate cooling with ice and then determines the influence of the sample to the inhibition of the APTT. Ebenso wurde mit einer Kontrollprobe verfahren, die nicht mit Trypsin aber sonst gleich behandelt worden war. It has also been dealt with a control sample which had not been but otherwise treated identically with trypsin. Die Ergeb¬ nisse zeigen, daß nach Inkubation mit Trypsin die Aktivität des Faktors verschwindet, was seine Proteinnatur beweist. The Ergeb¬ Nisse show that after incubation with trypsin, the activity of factor will disappear, its protein nature proves. 4. Molekulargewicht 4. Molecular Weight

a) Das Molekulargewicht des neuen Proteins wurde mit Hilfe von Membranen definierter Porengröße eingegrenzt. a) The molecular weight of the new protein was narrowed defined with the aid of membranes pore size. Dazu wurden Fraktionen, die das neue Protein enthielten, mit Puffer (PBS pH 7,2 bzw. 20 mM Bernsteinsäure pH 4) verdünnt, in einen Centricon® Mikrokonzentrator (10 bzw. 30 kDa Ausschlu߬ grenze) gegeben und 60 min bei 5000 xg zentrifugiert. For this, the fractions containing the new protein, diluted with buffer (PBS pH 7.2 or 20 mM succinic acid pH 4), in a Centricon® microconcentrator (10 and 30 kDa Ausschlu߬ limit), and 60 min at 5000 xg centrifuged. Die Durchläufe der Membranen wurden in einem Speed Vac Konzen- trator zur Trockne eingeengt, in PBS resuspendiert und eben¬ so wie die Retentate der Membranen in der APTT vermessen. The passes of the membranes were in a Speed Vac concentrator evaporated to dryness, resuspended in PBS and eben¬ as are the residues of the membranes in the APTT measured.

Bei beiden pH-Werten ließ sich das neue Protein durch Centricon® 10, nicht aber durch Centricon® 30 konzentrieren. At both pH values, the new protein made by Centricon 10, but do not focus by Centricon 30th Das bedeutet, daß das neue Protein ein Molekulargewicht zwischen 10 und 30 kDA besitzen muß. This means that the novel protein should have a molecular weight of 10-30 kDa.

b) Das Molekulargewicht wurde weiter auf einer kalibrierten Gelfiltrationssäule (Superose® 12) bestimmt. b) The molecular weight was further determined on a calibrated gel filtration column (Superose® 12). Als Laufmittel diente dabei PBS bei einem Fluß von 0,3 ml/min. PBS served here at a flow rate of 0.3 ml / min as the mobile phase. Es wurden There were

Fraktionen von 150 μl fraktioniert und auf APTT-Verlängerung getestet. fractionated fractions of 150 ul and assayed for APTT prolongation. Das Aktivitätsmaximum wurde unter diesen Bedin¬ gungen in einem Bereich von 25 kDa bis 34 kDa bestimmt. The peak of activity was under these conditions Bedin¬ determined to 34 kDa in a range of 25 kDa.

c) Bestimmung des Molekulargewichtes durch Tricin-SDS-Poly- acrylamid Gel Elektrophorese c) determination of molecular weight by tricine SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

Die Gelelektrophorese wurde entsprechend der Vorschrift (Schägger, H. and von Jagow, G.; Analytical Biochemistry, 166, 368-379 (1987) bei 20 A und 1400 V, 30 W, mit einem Stromversorger der Firma LKB und einer Laufkammer des "mighty s all System" durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel zunächst für 30 min in einer 2,5 %igen Lösung aus Triton X100 inkubiert und dann auf eine Thrombin und Fibrinogen haltige Agarose-Platte 2 mal The gel electrophoresis was performed according to the instructions (Schägger, H. and von Jagow, G .; Analytical Biochemistry, 166, 368-379 (1987) at 20 A and 1400 V, 30 W, with a power company LKB and an overflow chamber of the " mighty s "performed all system. on completion of electrophoresis, the gel was first blocked for 30 min in a 2.5% solution of Triton X100 and then incubated on a thrombin and fibrinogen-containing agarose plate 2 times

20 Minuten aufgelegt. placed 20 minutes. Die Thrombinkonzentration in der Agarose war dabei so eingestellt, daß binnen 2 bis 4 Stunden eine Polymerisation des Fibrinogens unter der Wirkung des Thrombins stattfand. The concentration of thrombin in the agarose was adjusted such that within 2 to 4 hours took place polymerization of fibrinogen by the action of thrombin. Die Anwesenheit des neuen Thrombin- inhibitors wurde durch unpolymerisierte Stellen in der The presence of the new thrombin inhibitor was by unpolymerized points in the

Agarose angezeigt. Agarose displayed. Durch Färben des Molekulargewichtsmarkers (Eichproteine: Intaktes Myoglobin 17,2 kDA, Bromcyanpeptid Myoglobin I + Uli 14,6 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin I 8,2 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin II 6,4 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin III 2,6 kDa, Myoglobin 1-14) wurde das Molekular¬ gewicht des neuen Thrombininhibitors mit 14, 6 +_ 3 kDa bestimmt. By coloring the molecular weight marker (calibration proteins: Intact myoglobin 17.2 kDa Bromcyanpeptid myoglobin I + Uli 14.6 kDa, Bromcyanpeptid myoglobin I 8.2 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin II 6.4 kDa, Bromcyanpeptid myoglobin III 2.6 kDa, myoglobin 1 -14) was the Molekular¬ weight of the new thrombin inhibitor with 14, 6 + _ 3 kDa determined.

5. Angriffspunkt des neuen Proteins in der Koagulationskaskade 5. point of the novel protein in the coagulation cascade

Der neue Faktor wurde in verschiedenen Assaysystemen ge- testet um festzustellen, wie und welche Faktoren in der Koagulations as ( ade er inhibiert. The new factor was checked in various assay systems testing to determine how and which factors in the coagulation as (he ade inhibited.

a) APTT ( *** aktivierte partielle Thromboplastinzeit) zum Nach¬ weis einer antikoagulatorischen Aktivität in der intrinsi- sehen Gerinnungskaskade. a) APTT (activated partial thromboplastin time ***) for Nach¬ facing an anticoagulant activity in the intrinsic coagulation cascade see.

Zu testende Proben wurden in 50 μl humanem Plasma (zB Preciclot®, Boehringer/Ma, Nr. 654 370) verdünnt. Samples to be tested were dissolved in 50 ul human plasma (eg Preciclot®, Boehringer / Ma, no. 654370) diluted. Dazu wurden 50 μl PTT a -Reagenz (Boehringer/Ma, Nr. 886 050) pipettiert und 5 min bei 37°C inkubiert. Given 50 ul PTT a reagent (Boehringer / Ma, no. 886 050) were pipetted and incubated for 5 min at 37 ° C. Durch Zugabe von 50 μl 25 mM CaCl wurde die Gerinnungskaskade gestartet. By addition of 50 .mu.l 25 mM CaCl the coagulation cascade has started. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plasma¬ gerinnseln. the time was measured until the clots occur Plasma¬.

Die Proben zeigten eine signifikante Verlängerung der Plasmagerinnungszeit (intrinsisch) . The samples showed a significant prolongation of plasma clotting time (intrinsic).

b) PT (= Prothrombinzeit, Quick-Test) zum Nachweis einer antikoagulatorischen Wirkung auf die extrinsische Gerinnungskaskade. b) PT (prothrombin time = time, quick test) for the detection of an anticoagulant effect on the extrinsic coagulation cascade.

Proben wurden in 100 μl humanem Plasma (zB Preciclot®, Boehringer/Ma, Nr. 654 370) verdünnt. Samples were diluted in 100 ul human plasma (eg Preciclot®, Boehringer / Ma, no. 654 370). Dazu wurden 100 μl Thromboplastin (1:1 mit NaCl 0, 9 % verdünnt) pipettiert. For this purpose, 100 .mu.l of thromboplastin were (diluted 1: 1 with NaCl 0, 9%) were pipetted. Mit 50 μl 25 mM CaCl 2 wurde die Gerinnungskaskade gestartet. With 50 ul of 25 mM CaCl 2, the coagulation cascade has started. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plasma¬ gerinnseln. the time was measured until the clots occur Plasma¬. Die Proben zeigten eine signifikante Ver¬ längerung der Plasmagerinnungszeit (extrinsisch) . The samples showed a significant extension of the Ver¬ plasma clotting time (extrinsic). c) FXa-Inhibitionstest zur Differenzierung von FXa-lnhibitor c) FXa inhibition assay for differentiating factor Xa inhibitor

Proben (verdünnt in PBS) wurden mit Faktor Xa (FXa) und einem spezifischen chromogenen Substrat für FXa 60 min bei Raumtemperatur inkubiert: Samples (diluted in PBS) were incubated with factor Xa (FXa) and a specific chromogenic substrate for FXa 60 min at room temperature:

25 μl Probe 25 ul of sample

50 μl FXa (Boehringer/Ma, Nr. 602 388, 0,025 U/ml) 100 μl S-2222-Farbsubstrat (Kabi-Vitrum, 16,9 ml H 2 0/vial) Nach 5 min wurde die optische Dichte bei 405 nm erstmals gemessen. 50 .mu.l factor Xa (Boehringer / Ma, no. 602,388, 0,025 U / ml) 100 ul S-2222-color substrate (Kabi Vitrum-, 16.9 ml of H 2 0 / vial) After 5 minutes, the optical density at 405 nm first measured. Nach 60 min wurde die Reaktion mit 50 μl Eisessig gestoppt und die optische Dichte bei 405 nm erneut gemessen. After 60 min the reaction was stopped with 50 .mu.l of glacial acetic acid and the optical density at 405 nm is measured again.

Als Kontrollen dienen Ansätze ohne FXa sowie Proben ohne Inhibitor. The controls used approaches without FXa and samples without inhibitor. Für die Auswertung wurde ein Δ OD405 40' nach folgender Formel errechnet: For the evaluation, a Δ was OD405 40 'is calculated using the following formula:

Δ OD = CθD 60m in-OD5 min ] +FXa - [OD 6 0min- OD 5minJ'-FXa Δ OD = CθD 60m-OD5 min] + FXa - [OD OD 6 0min- 5minJ'-FXa

(Differenz der Extinktionsänderung mit und ohne FXa). (Difference in absorbance with and without FXa).

Aus entsprechenden Ansätzen mit und ohne Inhibitor ergibt sich der Grad der Inhibition von FXa (in %) durch From corresponding batches with and without inhibitor, the degree of inhibition of FXa (in%) is given by

Δ 0D +Inhibitor Δ 0D + inhibitor

% Inhibition = x 100 % Inhibition = x 100

Δ 0D -lnhibitor Δ 0D -lnhibitor

d) Thrombin-Zeit d) thrombin time

Eine Probe des neuen Proteins wurde in 100 μl Plasma ver¬ dünnt. A sample of the new protein was diluted in 100 ul ver¬ plasma. Durch Zugabe von 50 μl Thrombin-Reagenz (Boehringer/Ma, Nr. 126 594) wurde die Gerinnung gestartet. By adding 50 ul thrombin reagent (Boehringer / Ma, no. 126 594) was started coagulation. Die Zeit bis zum Auftreten von Plasmagerinnseln wurde turbi- do etrisch bestimmt. The time to occurrence of plasma clots was determined turbine-do etrisch.

Die Auswertung erfolgte anhand einer Eichkurve mit bekannten Thrombin-Inhibitoren (zB Hirudin). Evaluation was carried out using a calibration curve with known thrombin inhibitors (eg hirudin). Die erhaltenen Ergeb- nisse zeigen, daß das neue Protein ein Thrombin-Inhibitor ist. The obtained results show that the new protein is a thrombin inhibitor. 6. Versuche zur Abgrenzung des neuen Proteins gegen Hirudin 6. Attempts to define the new protein to hirudin

a) Fraktionen des neuen Proteins, die eine APTT-Verlängerung entsprechend 2500 ATU zeigten, wurden in einen Hirudin-ELISA eingeschleust: a) fractions of the new protein, the corresponding 2500 ATU showed APTT prolongation were introduced in a hirudin-ELISA:

Material: Material:

Microtiterplatten (Flow 77-173-05) - Streptavidin-Peroxidase-Ko plex (Boehringer/Ma 1089153) Tetramethylbenzidin (Serva 35926) Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TBM-Lösung (42 mM TBM in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-acetat pH 4,9) langsam mischen; Microtiter plates (Flow 77-173-05) - streptavidin-peroxidase complex Ko (Boehringer / Ma 1089153) tetramethylbenzidine (Serva 35926) peroxidase substrate: 0.1ml TBM solution (42 mM in DMSO TBM) and 10 ml of substrate buffer (0, 1 M Na acetate pH 4.9) slowly mix; dann Zusatz von 14,7 μl 3 % H2O2 then adding 14.7 .mu.l 3% H2O2

Vorgehen: procedure:

Microtiterplatten beschichten mit 0,2 ml/well Hirudin Coat microtiter plates with 0.2 ml / well hirudin

(1 μg/ml, in 0,1 M NaHC0 3 , pH 8,3) - Absättigen mit 1% BSA/PBS; (1 ug / ml, in 0.1 M NaHC0 3, pH 8.3) - saturate with 1% BSA / PBS; 0,3 ml/well 0.3 ml / well

3 x Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS Washing 3x with 0.05% Tween 20 / PBS

12 Standardverdünnungen von Hirudin, angefangen mit 12 standard dilutions of hirudin, starting with

500 ng/ l 0, 1 % BSA/PBS in 2er Schritten, davon je 500 ng / l 0, 1% BSA / PBS in 2-steps, one each

0,1 ml/well; 0.1 ml / well; dann Zusatz von 0,1 ml/well poly-anti-Hirudin (1 μg/ml 0,1 % BSA/PBS) und then addition of 0.1 ml / well poly-anti-hirudin (1 ug / ml 0.1% BSA / PBS) and

Inkubation über Nacht/4°C Overnight incubation / 4 ° C

Waschen wie oben Wash as above

0,2 ml/well biotinylierter anti-Kaninchen-IgG-Anti- körper (1:5000) 2 h bei Raumtemperatur - Waschen wie oben 0.2 ml / well biotinylated anti-rabbit IgG antibody (1: 5000) for 2 h at room temperature - wash as above

0,2 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (1:10000); 0.2 ml / well streptavidin-peroxidase complex (1: 10000);

30 min bei Raumtemperatur 30 min at room temperature

Waschen wie oben Wash as above

0,1 ml/well Peroxidasesubstrat - Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 MH 2 0.1 ml / well peroxidase substrate - reaction stop with 0.1 ml / well 2 MH 2

Messung der Absorption bei 450 nm Measuring the absorbance at 450 nm

Auswertung: Evaluation:

Die erhaltenen OD-Werte wurden gegen den Logarithmus der The obtained OD values were plotted against the logarithm of

Standardverdünnungen aufgetragen und ergaben im Bereich von ca. 60 bis 2 ng/ml eine lineare Abhängigkeit. applied standard dilutions and were in the range of about 60 to 2 ng / ml, a linear dependence. Proben mit unbekannter Hirudinkonzentration setzte man parallel zur Eichprobe in unterschiedlichen Verdünnungen im Test ein. Samples of unknown concentration of hirudin is placed parallel to the calibration sample in different dilutions in a test. In den gemessenen Proben konnte eine Hirudinmenge nachgewiesen werden, die einer Aktivität von maximal 5 ATU/ml entspricht. In the measured samples, a hirudin could be detected, corresponding to an activity of maximum 5 ATU / ml.

b) Thrombin-Zeit (= TZ) b) thrombin time (= TC)

Bei der Analyse des neuen Proteins ergab die Messung der TZ eine Antithrombin-Aktivität von 200 ATU/ml. In the analysis of the new protein, the measurement of TC resulted in a antithrombin activity 200 ATU / ml. Dieser Wert lag um den Faktor > 40 über dem nach ELISA für Hirudin er¬ mittelten Wert. This value was a factor of> 40 on the by ELISA for hirudin er¬ mediated value. Das beweist, daß das neue Protein nicht Hirudin ist. This shows that the novel protein is not hirudin.

c) Aufkonzentrierung c) Concentration

Es wurde versucht, Hirudin mit Hilfe von Centricon® Membranen bei p und 7 zu konzentrieren. An attempt was made to concentrate hirudin using Centricon membranes at p and 7 was. Hirudin wurde durch die Centricon® 10-Memb nicht zurückgehalten. Hirudin was not retained by the Centricon-10 Memb. Das neue Protein wird unter diesen Bedingunge von der Membran zurückgehalten (vgl. 4a). The new protein is under these Bedingunge retained by the membrane (see FIG. 4a).

Non-Patent Citations
Reference
1 *See references of WO9206118A1
Classifications
International ClassificationC07K14/815, A61K38/00, C07K14/435, A61P7/02
Cooperative ClassificationA61K38/00, C07K14/815
European ClassificationC07K14/815
Legal Events
DateCodeEventDescription
Jul 21, 199317PRequest for examination filed
Effective date: 19930108
Jul 21, 1993AKDesignated contracting states:
Kind code of ref document: A1
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Oct 13, 199318WWithdrawn
Withdrawal date: 19930819
Oct 20, 1993R18WWithdrawal (correction)
Effective date: 19930819