EP0765470A2 - Verfahren und vorrichtung zur gezielten entnahme von komponenten aus komplexen mischungen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur gezielten entnahme von komponenten aus komplexen mischungen

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Publication number
EP0765470A2
EP0765470A2 EP95923338A EP95923338A EP0765470A2 EP 0765470 A2 EP0765470 A2 EP 0765470A2 EP 95923338 A EP95923338 A EP 95923338A EP 95923338 A EP95923338 A EP 95923338A EP 0765470 A2 EP0765470 A2 EP 0765470A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
volume
removal
measurement
measuring
analysis
Prior art date
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Ceased
Application number
EP95923338A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Manfred Eigen
Rudolf Rigler
Karsten Henco
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec OAI AG
Original Assignee
Evotec Biosystems GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evotec Biosystems GmbH filed Critical Evotec Biosystems GmbH
Publication of EP0765470A2 publication Critical patent/EP0765470A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0241—Drop counters; Drop formers
    • B01L3/0268—Drop counters; Drop formers using pulse dispensing or spraying, eg. inkjet type, piezo actuated ejection of droplets from capillaries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C12M33/07—Dosage or metering devices therefore
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the present invention relates to a method for removing one or a few components of a system, an apparatus for carrying out the method and its applications.
  • the corresponding devices are known as line sorters. It can be based on certain parameters of light scattering or fluorescence such.
  • B. identify certain cell types of a blood count and count the cells of a defined specification. The cells can be stained with fluorescence-labeled antibodies and differentiated on the basis of their surface antigens or classified by their nucleic acid content using hybridization methods (in situ). After being separated into droplets, the cells are analyzed in the flow and can be selectively separated or fractionated by targeted electrostatic deflection of individual drops. Appropriate devices are commercially available and are of great importance for clinical diagnostics and research.
  • PCT / EP 93/03077 discloses how individual, linearly separated volume elements can be separated from a capillary flow.
  • the object on which the invention is based is to provide a method which makes it possible to take a small volume element of the solution or suspension from a larger volume element of a sample volume of a solution or suspension at defined spatial coordinates, this volume element containing a target substance.
  • a small volume element can be procedures are defined, as described in the Rigler et al. (PCT / EP 94/00117) are described.
  • extremely small measurement volumes are analyzed as part of a larger, surrounding sample volume, in that the presence of certain constituents is inferred by confocal illumination of a volume element, excitation by the light used for illumination and / or registration of specific fluorescence signals.
  • the illumination can alternatively also take place, for example, by the method of near-field spectroscopy, in which diaphragms with openings are used which are smaller than the wavelength of the radiated electromagnetic radiation.
  • the object is also to be achieved, based on the spectral properties of a sought-after, detected substance, of a specific molecule, a molecular complex or a cell, to selectively remove these.
  • the method according to the invention can be used in a particularly advantageous manner for the detection of previously unidentified unknown pathogens or immunogens.
  • (Unknown) pathogens or immunogens can be characterized and, if necessary, prepared.
  • a particularly advantageous procedure in the sense of the invention makes use of the fact that pathogens initially multiply after infection of a host organism without being prevented by a present immune defense. Only after a certain period has elapsed does the immune system establish a humoral immune response, e.g. B. by the synthesis of various immunoglobulins (primarily IgM, followed by IgG) and later a cellular immune response.
  • the fraction of immunoglobulins normally contains only a minor percentage of antibodies that are directed against the unknown pathogen.
  • the majority of the antibodies are directed against a large number of antigen structures which are not related to the specific pathogen / immunogen sought. Therefore, it is more difficult to characterize the pathogen through the immune complex using sera from a single patient.
  • the sought immune complex can, however, be isolated by including some expected characteristics:
  • the immune complex contains the major part of a pathogen, the mobility of which lies between that of a small RNA virus and that of a bacterium.
  • the pathogen has several antigenic binding sites that are occupied by more than one dye-labeled antibody.
  • the antibodies from two patients in the state of the hypothetically chronic phase can be prepared separately and labeled with different dyes or those which can be distinguished by cross-correlation.
  • the at least two patients are selected so that there is a high probability that both patients have been infected with the same pathogen. Since pathogens generally carry a large number of the antigenic determinant on the surface / virus envelope, it is likely that the immune complexes formed after the reaction with a mixture of different labeled antisera simultaneously have the different labeling dyes.
  • the experiment is carried out as shown in FIG. 5.
  • a single bacterium or virus with functional surface proteins could be detected in one method.
  • the decisive advantage lies in the interesting coupling of a phenotypic expression product, e.g. a natural or a recombinant surface protein on its genetic blueprint.
  • the method is to be seen in particular in connection with a preparative use according to the invention, by means of which cells or molecular complexes determined as desired can be separated from an environment.
  • the genome of microorganisms comprises approximately 10 7 nucleotides. Shotgun expression can be used to express subgenic fragments with an average length of 100 amino acids using the described method. Taking into account the reading frame variation (factor 3) and an assumed non-coding counter strand, 10 8 recombinant bacterial clones contain about 100 times each segment. 10 8 recombinant bacterial clones are contained in 1 ml of a suspension of 1 OD, which can be separated individually in about 24 hours using the method according to the invention, for example on their binding agents. have properties examined with IgE or IgE-bearing cells from an allergy patient. According to the invention, the correspondingly characterized bacteria are separated out, but at least highly enriched, biologically expanded or the corresponding genome segment is amplified and characterized by enzymatic amplification methods.
  • a corresponding bacterium is detected in the measuring volume element, it can be removed according to the invention directly from the mixture by sucking the volume element surrounding the bacterium / molecular complex through a capillary or by separating the molecular complex by electrophoresis, electroosmosis or dipole induction (FIGS. 1 and 2).
  • an electrically, optically or mechanically controlled suction device is used, the opening dimension of which is large compared to the measurement volume but small compared to the dimensioning of the sample volume, in order to solve the technical problem on which the invention is based.
  • the electrical, optical or mechanical pump system is controlled by an FCS-controlled pulse generator, so that a small proportion of the sample volume is separated from the total volume in such a way that back diffusion can be largely ruled out. This is done either by electrophoresis, induced dipole moments, electroosmosis, mechanically induced pressure jumps or by light pressure.
  • the method allows the removal of one or a few components of a system such as molecules, molecular complexes, vesicles, micelles, cells, optionally embedded in an associated volume element (removal volume) V (10 ⁇ 9 1 ⁇ V ⁇ 10 "18 1).
  • This volume element is Part of a larger volume of an environment that contains the small components to be removed (sample volume).
  • the removal is carried out by transferring the component or the components to another environment, the place and time of the removal. is determined by a signal of an analysis that correlates with the small component to be removed.
  • Methods which can be analyzed are the methods in which the molecular content of the smallest volume elements (10 "14 1) can be analyzed, as described by the international application Rigler et al.
  • the sample volume is connected to the recording device by a pore of a capillary or a pore of a membrane wall, the narrowest opening D of which is given by 100 ⁇ m D D 0,1 0.1 ⁇ m.
  • a capillary is used for this purpose, as described in Neher et al. , Methods in Enzymology, Vol. 207, 3-14.
  • This capillary is e.g. connected to a conveyor, such as a pump, which is capable of withdrawing the volume of solution surrounding the molecular complex.
  • a conveyor such as a pump
  • preference is given to using a mechanically, light pressure or electrically controlled suction system or a (piezo / solenoid) pump-controlled dispenser system.
  • withdrawals can be carried out in one or more steps in one and the same pick-up device, the individual withdrawal processes being able to take place independently of one another in the sense of a collection process.
  • the electrically controlled removal via a directed transport of the volume element by at least one electrical voltage or field pulse is preferred.
  • Other embodiments work mechanically by means of at least one pressure difference pulse and / or by means of at least one light pressure pulse in the direction of the pore opening using methods such as those described by Weber and Greulich, Int. Rev. Cytol. , 1992, 133, pp. 1 - 41, have been published.
  • the receiving device can be a capillary, the lumen of which is preferably larger than the diameter of the pore or Capillary tip, the opening of which is in direct contact with the sample volume.
  • Electro-osmosis can be carried out in consistently thin capillaries, as is customary in capillary electrophoresis. Otherwise, the flow resistance could be disadvantageously high in the case of mechanical volume transport.
  • the desired constituent in the measurement volume is deliberately made more electrically neutral via an electrical field pulse via the at least one, brief application of an electrical field, for the purpose of electrophoresis of electrically charged components and / or for the purpose of electroosmosis with coupled transport Molecules transferred to the receiving device.
  • one electrode can be brought into an electrically conductive contact with the solution on the side of the sample volume, the other electrode can be brought into an electrically conductive contact with the solution on the side of the receiving device, and the conductive contact between the two compartments can be established via the pore.
  • the desired transport is brought about by at least one short-term increase in the pressure in the volume outside the receiving compartment in comparison to the pressure within the receiving compartment and / or by a brief pressure reduction within the receiving compartment.
  • known dispensers microdrop
  • pump / suction devices solenoid pumps, stepper motor-controlled pumps
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the volume of the receiving device is increased or the sample volume is reduced in favor of the receiving device.
  • the transport into the receiving volume follows.
  • the size of the recorded volume is controlled via the number of drops dispensed or the step motor steps or via the length and intensity of the light pressure pulse.
  • the hardware / software-coupled on-line analysis system triggers the sampling time via the recorded, correlating signal.
  • the removal takes place at the moment when the particle or particles to be removed are with a high probability within the removal volume. This does not necessarily have to occur approximately at the same time as the positive analysis result obtained. If a molecule, molecular complex, virus or cell has been identified by FCS as a component to be removed, there is the possibility of direct removal or a later removal. It is based on the assumption that the respective component to be removed
  • electrophoretic migration is at a specific point in time at a specific point in time and since electrophoretic or mechanical preparation can be carried out according to FIGS. 1 and 2, or
  • this cell In the event that a cell of a desired cell type passes the cuvette, this cell is in one of these droplets after a defined time, which can be deflected from its trajectory after the separation by a coupled signal, for example by means of a pulse in the electrostatic field, and so on can be separated in a separate receiving device.
  • the disadvantage of the method lies in the fact that only an integral fluorescence signal in the sense of a pure intensity measurement can be obtained in the flowing flow.
  • the coupling according to the invention using the method of fluorescence correlation spectroscopy in small volume elements enables the fluorescence signals obtained to be differentiated according to their belonging to different molecular sizes and molecular mobilities.
  • the method of fluorescence correlation spectroscopic detection technology of fluorescent particles such as molecules, vesicles, cells or molecular complexes is used in the mechanically induced, capillary flow with a targeted sorting device through a pore.
  • the actual separation process can take place after the passage of individual volume elements through the pore by after a defined spatial and temporal correlation, the positively registered measurement volumes with an associated volume element are transferred to separate recording devices.
  • the FCS measurement process can also take place before it emerges from the pore of a capillary tip, which is coupled to a microdispensing device and where, by means of various mechanical or field-induced deflections, small measurement volumes with an associated volume element of the environment as Droplets can be collected in different receptacles.
  • the temporal and / or location-specific correlation takes place between an analysis of a sub-volume of the sample volume (measurement volume) within the volume element
  • volume element V and a removal of a desired component by removal of the volume element V hardware / software supported. It is carried out, with at least one component that was identified positively in the volume element V being located in the recorded volume element V during the removal process.
  • the pore of the receiving device is mechanically brought up to the volume element and / or the volume element
  • V or components thereof with a predetermined temporal correlation are transported via a flow in the river or via electrostatic or magnetic field gradients or components thereof to the pore of the receiving compartment with a temporal correlation.
  • the analysis can also be carried out directly in front of the pore of the receiving compartment.
  • the sub-volume (measurement volume) is preferably smaller than the volume element V. This increases the probability that the positively identified component is removed before it has moved too far from its measurement volume.
  • the analysis process must meet certain requirements in order to be used in the process.
  • the signal correlating to the removal process is e.g. B. about a optical analysis system that can analyze specific molecular properties in small volume elements of ⁇ 10 "14 1. This is preferably done by analysis systems based on confocal laser correlation spectroscopy or fluorescence correlation analysis based on near field spectroscopy, whose signal is on line Coupled analysis and removal processes can be cascaded together in accordance with the invention, the recorded sample volumes with or without a dilution step being subsequently subjected to an analysis and again in an enriched form by a second and / or further removal unit after the removal Analysis can be taken.
  • Components can be removed which form a complex with at least one reaction partner which can be detected spectroscopically (indirectly) or which themselves have sufficient fluorescence properties (direct).
  • the method is of particular interest in combination with the procedure according to the invention for the removal of as yet unidentified (unknown) pathogens.
  • the aim is the multiplication of an isolated pathogen in vivo or the multiplication of the genetic material of the pathogen or parts thereof in vitro by amplification of the nucleic acid contained in the sense of a shot-gun method and characterization via sequencing.
  • unknown particles such as pathogens or immunogens
  • Sera can be obtained from at least one organism infected with the unidentified pathogen.
  • At least one serum (serum 1) is obtained from the acute infection phase by the previously unknown pathogen or immunogen and at least one further serum (serum 2) from the same or at least one other organism with the same or homologous infection from the chronic infection phase won.
  • the unknown pathogen or immunogen from serum 1 is caused to complex with indirectly or directly fluorescent dye-labeled antibodies from serum 2 and the complex formed is measured.
  • cross-correlation is important, as described in PCT / EP 94/00117, by means of which, for example, the simultaneous binding of different fluorescent ligands such as antibodies from different organisms can be measured.
  • Antibodies can be labeled directly via at least one reaction with couplable dyes or indirectly by reaction with dye-labeled antibody binding domains, in particular protein A derivatives or protein G derivatives.
  • the non-identified pathogenic components can turn out to be known microorganisms.
  • specific interactions or enzymatic activities with fluorescence-labeled target molecules to form surface-expressed or cytosolic-expressed structural elements of natural or genetically recombined proteins or peptides are detected.
  • the method according to the invention can cause the detection of molecules in a very low concentration. For example, fetal cells can be scanned in maternal blood. With the method according to the invention, very low concentrations ( ⁇ 10 "12 M) of fluorescent molecules can be determined. However, the method can become impractical if one has to wait too long with unchanged spatial coordinates to determine one or more measurement volumes until a wanted molecule the space element of the measuring volume happens. This problem also arises at higher concentrations (> 10 "12 M) if the diffusion times are very short, as is the case, for example, with cells and cell-bound molecules.
  • the method according to the invention can be modified so that the actual one Measuring method is preceded by a scanning process, in which the spatial coordinates are varied in temporally continuous measuring technique or in temporally discontinuous measuring technique until a signal of the desired quality is detected, which can occur, for example, when a correlated fluorescence occurs together two different emissions when using the cross-correlation method. If a signal is detected, the FCS measurement process is started. The duration of a scanning process can be less than one millisecond per measurement process. It can then be determined that the "scanned" measurement volume or the measuring volumes measured in parallel do not contain the component sought b When doing this, it should be noted that the average characteristic diffusion times are influenced in a calculable manner in their absolute size.
  • Scanning processes which are upstream of the actual measurement, become important when e.g. B. cell populations are to be analyzed, with only a fraction of the cells carrying molecules or molecular complexes that determine the removal properties. This is the case, for example, when analyzing evolutionarily produced mutant populations of recombinant cells, but also when analyzing maternal blood for the Presence of childhood, nucleated erythrocytes, which are to be analyzed for certain genetic makeup or chromosomal abnormalities.
  • the method is suitable for a method which is referred to below as functional gene extraction. What is meant is the production of genetic probes for the detection / detection / cloning of specific functions which are encoded on an entire genome or in a cDNA library. Examples of applications are functional genome analysis using phage or bacterial display systems, as well as corresponding applications in evolutionary biotechnology. Both examples are concerned with the detection and targeted selection of cells or phages with specific binding properties to specific ligands against a background of unreacted phages or bacteria.
  • volume elements increases significantly.
  • many volume elements can be screened in the ⁇ s to nanosecond range in single and multi-array operation.
  • the shift is only interrupted if e.g. Have differently colored signals correlated with each other. If this situation exists, material parameters of the components, e.g. the translation diffusion can be determined.
  • This time is statistically shorter by a time element to be calculated (approx. 50%), compared to the case in which a particle has to penetrate the volume element by itself or by forced diffusion. Once a particle has been detected, it can also be detected a second time by scanning the immediate surroundings.
  • the measurement volume can be composed of sub-measurement volumes illuminated in parallel, in that the simultaneous illumination of several measurement volumes by at least one radiation source for electromagnetic radiation At least one holographic grating is used to generate several volume elements.
  • the parallel illumination of several volume elements with confocal optics is described in DE 40 35 799.
  • Parallel illumination of measurement volumes, the relative distances of which lie in the sub- ⁇ m range, is not possible or is unsatisfactory using the devices described.
  • the illuminations to be provided in the method according to the invention with dimensions in the lower ⁇ m range and below are achieved by using holographic gratings.
  • Extensive arrays of small volume elements can be illuminated using holographic gratings.
  • the measurement volumes are measured confocally either by using a plurality of pinhole diaphragms in the object plane, by positioning multiarray detector elements in the object plane or by using optical fiber bundles with coupling the light into the object plane and transmission to photon detectors for fluorescence properties of the molecules contained therein.
  • volume elements are to be screened, the computational effort in favor of the computing capacity used and the computing time is to be minimized, the number of volume elements recorded per measurement and thus the total volume measured is to be maximized,
  • At least two measurement volumes are confocally imaged on the signal plane in the object plane together or combined in groups on at least one detector element of a photon-registering measurement system.
  • the sample volume is inventively according to the invention before the actual measurement and removal of at least one partly subjected to a scanning process, the time for acquiring a sought-after particle being shortened by continuous or discontinuous variation in time of the spatial coordinates of the measurement volume, relative to the spatial coordinates of the sample volume.
  • the time interval ⁇ t for the measurement of one or more volume elements with defined spatial coordinates before a sought-after molecule is detected via its fluorescence measurement signal is shorter than the average duration of stay of the sought-after molecule within a measurement volume.
  • the device for carrying out the method is characterized in that a pore of a porous receiving device is brought close to the optical measurement volume and the receiving device is connected to a mechanically, optically or electrically controllable removal device. It comprises the arrangement of a closed or open container for receiving a sample volume, coupled with a measuring device for illuminating and / or measuring a small volume element (measuring volume) by electromagnetic radiation and at least one connection to at least one second volume element in a receiving device, the is in direct contact with the sample volume through an opening via a liquid phase, the opening preferably being spatially immediately adjacent to the measuring volume.
  • the method according to the invention is used in particular for the preparative extraction of unknown pathogens, immunogens or organisms which functionally express parts of a genome, and for the analysis and preparative extraction of fetal cells containing nuclei from maternal blood.
  • Such problems are associated with methods for the evolutionary optimization of peptides and / or proteins through the use of mutagenesis methods and selection methods, as described, for example, in the international patent application PCT / EP 94/00117 are proposed.
  • About 10 9 bacteria can be screened in their binding properties to specific dye-labeled substances within 24 hours, for example for the presence of a bacterium which expresses a surface protein / peptide which has the ability to interact with the target molecule of a given concentration to step.
  • the corresponding bacterium can be cloned from such a reaction batch using conventional methods or directly isolated using the method according to the invention.
  • genomic and / or subgenomic segments from extensive collectives in their function, e.g. determine their functional binding behavior to target molecules.
  • allergens e.g. Aspergillus, milk protein, alpha-amylase
  • allergens e.g. Aspergillus, milk protein, alpha-amylase
  • the target molecules can be extracellular molecules (e.g. protease inhibitors), surface membrane receptors (e.g. insulin), soluble receptors as mediators (steroid hormone binding receptors) or cellular soluble structural proteins or enzymes.
  • extracellular molecules e.g. protease inhibitors
  • surface membrane receptors e.g. insulin
  • soluble receptors as mediators steroid hormone binding receptors
  • cellular soluble structural proteins or enzymes e.g. the extremely important task of finding, characterizing and, if necessary, preparing the pharmacologically important target molecule for a known active ingredient can thus be achieved:
  • the schematic drawing describes the principle of the device in which the contents of a small volume element from the compartment A in by a pore, which represents the open connection between the compartments A and B, a pressure or vacuum pulse or an electrical pulse a compartment B can be transferred.
  • Part of this volume element is the darkly symbolized measuring volume of ⁇ 10 "14 1 directly in front of the pore in which the FCS analysis takes place.
  • a cell or a macromolecular complex can also be achieved by means of a correspondingly directed light pressure using a laser pulse that is perpendicular to the Pore diameter takes place and can be guided into the receiving device of compartment B for the transport of a complex recognized as desired.
  • Figure 2 describes the principle of the device in which the contents of a small volume element from the compartment A in by a pore, which represents the open connection between the compartments A and B, a pressure or vacuum pulse or an electrical pulse a compartment B can be transferred.
  • Part of this volume element is the darkly symbolized measuring volume of ⁇ 10 "14 1 directly in front of
  • the figure shows the FCS selection according to the invention of individual microorganisms with targeted fractionation from a continuously or discontinuously moving sample volume.
  • the FCS measurement volume is located directly in front of the opening of a capillary pore and is identified by the hatched column in the focusing cone of the FCS laser illumination or near-field illumination.
  • computer-controlled measurement volumes can be transported as positively identified measurement volumes together with a surrounding volume from the sample device to the receiving device.
  • This works z. B. by connecting a microdrop dispenser device or e.g. in a simple version by coupling a stepper motor-controlled syringe (nl holder / step) or an electrical pulse.
  • a stepper motor-controlled syringe nl holder / step
  • the separating performance can be increased by connecting separating devices as described in FIG. 2 in series. This is important, for example, if a highly complex mixture (10 12 particles) of e.g. B. recombinant bacteria or phages in high concentration to separate individual particles as background-free as possible.
  • a highly complex mixture (10 12 particles) of e.g. B. recombinant bacteria or phages in high concentration to separate individual particles as background-free as possible.
  • FCS selection of individual microorganisms The figure describes a device with which bacteria can be separated from mixtures that express certain properties to be measured by FCS.
  • An initially uninduced bacterial mixture is fed to a capillary flow system.
  • IPTG is supplied as an expression-inducing reagent.
  • the expression product is supplied with an assay system with marker molecules, which can then be measured at a defined position in their interaction with any expression product.
  • the figure is also intended to indicate that a positively identified measurement volume can also be taken at a position that is spatially and temporally distant, provided that the space / time coordinates are in a known and defined relationship to one another.
  • the figure demonstrates the procedure according to the invention in the selection of unknown pathogens which can be detected by cross-correlation using FCS, the differently labeled antibodies which are directed against a specific pathogen preferably being able to come from different patients.

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Abstract

Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt eine gezielte Entnahme von einem oder wenigen molekulardispersen oder zellulären Bestandteilen eines Systems wie Moleküle, Molekülkomplexe, Vesikel, Micellen, Zellen, gegebenenfalls mit einem dazugehörigen Volumenelement V der Grösse 10<-9> 1 >/= V >/= 10<-18> 1 aus einem grösseren Probevolumen. Der gezielte Transfer des gesuchten Bestandteiles in eine andere Umgebung geschieht durch Festlegung von Ort und Zeit der Entnahme durch ein mit dem zu entnehmenden kleinen Bestandteil korrelierendem Signal. Das Verfahren ist besonders geeignet zur Entnahme selten vorkommender Bestandteile, die in einem vorgelagerten Schritt durch ein Scanverfahren in ihrer Existenz nachgewiesen werden können. Das Verfahren eignet sich auch zur Entnahme an sich nicht identifizierter Bestandteile.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur gezielten Entnahme von Komponenten aus komplexen Mischungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Entnahme von einem oder wenigen Bestandteilen eines Systems, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und dessen Anwendungen.
Die funktionale Charakterisierung einzelner Moleküle oder Molekülkomplexe, Viren oder einzelner Zellen wird mit Hilfe der in Rigler et al. (PCT/EP 94/00117) beschriebenen Ver¬ fahren möglich. Es lassen sich mit dem beschriebenen Ver¬ fahren Aussagen darüber erhalten, ob in einem komplexen Gemisch einer Lösung oder Suspension oder in einer zwei- dimensionalen Schicht einzelne Moleküle oder Molekülkomplexe in sehr kleinen Volumenelementen (< 10"121) enthalten sind, die bestimmte Wechselwirkungen mit definierten Zielmolekülen eingehen.
Für viele analytische und synthetische Fragestellungen ist es bereits von großem Vorteil zu wissen, daß sich ein ge¬ suchtes Molekül in einer analysierten Mischung befindet . Häufig stellt sich jedoch erfindungsgemäß zu lösende Aufgabe, das einmal als gewünscht erkannte Molekül gezielt aus dem Gemisch zu entfernen im Sinne einer präparativen An-
ORIGINAL UNTERLAGEN reicherung, um z.B. Klonierungsschritte zu umgehen oder vereinfachen zu können. Eine weitere Aufgabe besteht bei besonders verdünnten Lösungen einer Konzentration von 10"12 M in einem raschen Auffinden eines Volumenelementes als Teil des Probevolumens, in dem sich ein Vertreter der gesuchten Substanz befindet. Die gesuchte Substanz muß dabei keines¬ falls bekannt sein. Bei der Suche nach unbekannten Pathogenen oder Wirkstoffen sind eventuell nur Wechselwirkungen zu bekannten Substanzen bekannt, oder es können Wechselwirkungen zu eventuell anwesenden Nachweismolekülen postuliert werden.
Zur Entnahme ganzer Zellen sind Verfahren und Vorrichtungen beschrieben. Die entsprechenden Vorrichtungen sind als Zeil-Sorter bekannt. Es lassen sich aufgrund bestimmter Parameter der Lichtstreuung oder Fluoreszenz z. B. bestimmte Zeil-Typen eines Blutbildes identifizieren und die Zellen einer definierten Spezifikation auszählen. Die Zellen lassen sich mit Fluoreszenzmarkierten Antikörpern anfärben und auf¬ grund ihrer Oberflächen-Antigene differenzieren oder über Hybridisierungsverfahren (in situ) über ihren Nukleinsäure- gehalt klassifizieren. Nach einer Vereinzelung in Tröpfchen werden die Zellen im Durchfluß analysiert und können durch gezielte elektrostatische Ablenkung einzelner Tropfen selektiv ausgesondert bzw. fraktioniert werden. Entsprechende Geräte werden kommerziell angeboten und sind für klinische Diagnostik und Forschung von großer Bedeutung. PCT/EP 93/03077 offenbart, wie aus einem kapillaren Fluß einzelne, linear getrennte Volumenelemente separiert werden können.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das es ermöglicht, aus einem größeren Volumenelement eines Probenvolumens einer Lösung oder Suspension an definierten Raumkoordinaten, ein kleines Volumenelement der Lösung oder Suspension zu entnehmen, wobei dieses Volumenelement eine Zielsubstanz enthält. Ein solches kleines Volumenelement kann durch Einsatz von Analyse- verfahren definiert werden, wie sie in der Anmeldung Rigler et al . (PCT/EP 94/00117) beschrieben sind. Hierbei werden äußerst kleine Meßvolumina als Teil eines größeren, um¬ gebenden Probevolumens analysiert, indem durch konfokale Ausleuchtung eines Volumenelementes, Anregung durch das zur Ausleuchtung verwendenten Lichts und/oder Registrierung spezifischer Fluoreszenzsignale auf die Anwesenheit be¬ stimmter Inhaltsstoffe geschlossen wird. Die Ausleuchtung kann alternativ z.B. auch durch die Methode der Nahfeld¬ spektroskopie geschehen, wobei Blenden mit Öffnungen ver¬ wendet werden, die kleiner sind als die Wellenlänge der ein¬ gestrahlten elektromagnetischen Strahlung. Es soll die auch Aufgabe gelöst werden, aufgrund der spektralen Eigenschaften einer gesuchten, nachgewiesenen Substanz, ein bestimmtes Molekül, ein Molekülkomplex oder eine Zelle, diese gezielt zu entnehmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in besonders vorteil¬ hafter weise zum Nachweis bislang nicht identifizierter unbekannter Pathogene oder Immunogene eingesetzt werden, (unbekannter) Pathogene oder Immünogene können charakteri¬ siert und gegebenenfalls präparativ dargestellt werden. Eine besonders vorteilhafte Vorgehensweise im Sinne der Erfindung nutzt die Tatsache, daß Pathogene sich nach erfolgter Infek¬ tion eines Wirtsorganismus zunächst vermehren, ohne durch eine präsente Immunabwehr daran gehindert zu werden. Erst nach Ablauf einer bestimmten Periode etabliert die Immun¬ abwehr eine humorale Immunantwort z. B. durch die Synthese verschiedener Immunglobuline (vornehmlich IgM, gefolgt von IgG) und später eine zelluläre Immunantwort. Patienten mit Verdacht auf eine erfolgte Infektion oder auf Kontakt mit einem bisher unbekannten Pathogen oder Immunogen ohne Detek- tierbarkeit bekannter Antigen-Eigenschaften bezüglich einer Reaktion und Detektierbarkeit mit bekannten Antiseren/Anti- körpern, stellen das Ausgangsmaterial für die Pathogeniso- lierung dar. Zu einem späteren Zeitpunkt, in der Phase des chronischen ErkrankungsStadiums, wird davon ausgegangen, daß sich inzwischen Antikörper gegen das vermeintliche Pathogen, z.B. ein Virus, gebildet haben, der Virustiter dadurch allerdings inzwischen stark erniedrigt ist. Seren aus diesem Erkrankungsstadium dienen zur Präparation der Immunglobuline.
Die Fraktion der Immunglobuline enthält im Normalfall nur zu einem untergeordneten Prozentsatz Antikörper, die gegen das unbekannte Pathogen gerichtet sind. Die Mehrzahl der Antikörper richtet sich gegen eine Vielzahl von nicht mit dem gesuchten spezifischen Pathogen/Immunogen im Zusammenhang stehenden Antigenstrukturen. Deshalb ist es schwieriger, das Pathogen über den Immunkomplex durch Verwendung von Seren eines einzigen Patienten zu charakterisieren.
Der gesuchte Immunkomplex läßt sich jedoch durch Hinzuziehung einiger erwarteter Charakteristika isolieren:
Der Immunkomplex enthält den massenmäßig bestimmenden Hauptanteil eines Pathogens, dessen Beweglichkeit zwischen der eines kleinen RNA Virus und der eines Bakteriums liegt.
Das Pathogen hat mehrere antigene Bindestellen, die mit mehr als einem Farbstoff-markierten Antikörper besetzt sind.
In einer bevorzugten Vorgehensweise lassen sich (Figur 5) die Antikörper aus zwei Patienten im Zustand der hypothetisch chronischen Phase getrennt präparieren und mit unterschied¬ lichen oder über Kreuzkorrelation unterscheidbaren Farb¬ stoffen markieren. Es werden dabei die mindestens zwei Patienten danach ausgewählt, daß eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, daß beide Patienten sich mit demselben Pathogen infiziert haben. Da Pathogene in der Regel eine große Anzahl der antigenen Determinante auf der Oberfläche/Virushülle tragen, ist es wahrscheinlich, daß die gebildeten Immunkom¬ plexe nach der Reaktion mit einem Gemisch der unterschiedlich markierten Antiseren gleichzeitig die verschiedenen, markierenden Farbstoffe aufweisen.
Experimentell wird vorgegangen, wie es in Figur 5 dargestellt ist.
Detektion einzelner Bakterien über die Bindungsspezifitäten von oberflachen-exprimierenden Bakterien
Für eine große Anzahl wichtiger Anwendungen der modernen bio¬ technologischen Forschung wäre es äußerst vorteilhaft und effizient, könnte in einem Verfahren anstelle der Detektion eines funktionalen Biomoleküls in einem gegebenen Probe¬ volumen die Detektion eines einzelnen Bakteriums oder eines Virus mit funktionalen Oberflächenproteinen erfolgen. Der entscheidende Vorteil liegt in der interessanten Kopplung eines phänotypisehen Expressionsproduktes, z.B. eines natür¬ lichen oder eines rekombinanten Oberflächenproteins an dessen genetischen Bauplan. Das Verfahren ist insbesondere im Zusammenhang mit einem erfindungsgemäßen präparativen Einsatz zu sehen, durch den als gewünscht bestimmte Zellen oder Molekülkomplexe aus einer Umgebung ausgesondert werden können.
Bestimmung und präparative Gewinnung der immunogenen Epitope von Mikroorganismen
Das Genom von Mikroorganismen umfaßt ca. 107 Nukleotide. Durch Shotgun-Expression lassen sich mit dem beschriebenen Verfahren subgenische Fragmente einer durchschnittlichen Länge von 100 Aminosäuren exprimieren. Unter Berück¬ sichtigung der Leserahmenvariation (Faktor 3) und eines angenommenen nicht kodierenden Gegenstranges enthalten 108 rekombinante Bakterienklone jedes Segment ca. lOOfach. 108 rekombinante Bakterienklone sind in 1 ml einer Suspension von 1 OD enthalten, die sich in ca. 24 Stunden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einzeln z.B. auf ihre Binde- eigenschaften mit IgE oder IgE tragenden Zellen aus einem Allergie-Patienten untersuchen lassen. Erfindungsgemäß werden die entsprechend charakterisierten Bakterien ausgesondert, zumindest jedoch stark angereichert, biologisch expandiert oder das entsprechende Genomsegment durch enzymatische Amplifikationsverfahren amplifiziert und charakterisiert.
Falls ein entsprechendes Bakterium im Meßvolumenelement detektiert wird, kann es erfindungsgemäß unmittelbar aus dem Gemisch entfernt werden, indem das Bakterium/Molekülkomplex umgebende Volumenelement durch eine Kapillare abgesogen wird oder der Molekülkomplex durch Elektrophorese, Elektroosmose oder Dipolinduktion abgetrennt wird (Figuren 1 und 2) .
Ein der Erfinding zugrundeliegender Erfindungsgedanke ist, daß eine elektrisch, optisch oder mechanisch gesteuerte Absaugvorrichtung eingesetzt wird, deren Öffnungsdimension groß ist gegenüber dem Meßvolumen, aber klein gegenüber der Dimensionierung des Probevolumens, um das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem zu lösen. Erfindungsgemäß wird das elektrische, optische oder mechanische Pumpsystem durch einen FCS-gesteuerten Impulsgeber gesteuert, so daß ein kleiner Anteil des Probevolumens so von dem Gesamtvolumen abgetrennt wird, daß eine Rückdiffusion weitgehend ausge¬ schlossen werden kann. Dies geschieht entweder durch Elektrophorese, induzierte Dipolmomente, Elektroosmose, mechanisch induzierte Drucksprünge oder durch Lichtdruck.
Das Verfahren erlaubt die Entnahme von einem oder wenigen Bestandteilen eines Systems wie Moleküle, Molekülkomplexe, Vesikel, Micellen, Zellen, gegebenenfalls eingebettet in einem dazugehörigen Volumenelement (Entnahmevolumen) V (10~91 ≥ V ≥ 10"18 1) . Dieses Volumenelement ist Teil eines größeren Volumens einer Umgebung, die die zu entnehmenden kleinen Bestandteile enthält (Probevolumen) . Die Entnahme erfolgt durch Transfer des Bestandteiles oder der Bestand¬ teile in eine andere Umgebung, wobei Ort und Zeit der Ent- nähme durch ein mit dem zu entnehmenden kleinen Bestandteil korrelierendes Signal einer Analyse festgelegt wird. Als Analyseverfahren kommen solche Verfahren in Frage, bei denen der molekulare Inhalt kleinster Volumenelemente (10 "14 1) analysiert werden können, wie dies durch das in der inter¬ nationalen Anmeldung Rigler et al. PCT/EP 94/00117 beschrie¬ ben ist. Das Probevolumen ist mit AufnähmeVorrichtung durch eine Pore einer Kapillare oder einer Pore einer Membran¬ wandung verbunden, deren engste Öffnung D durch 100 μm ≤ D ≤ 0,1 μm gegeben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird hierzu eine Kapillare eingesetzt, wie sie bei Neher et al . , Methods in Enzymology, Vol. 207, 3 - 14 beschrieben ist. Diese Kapillare ist z.B. mit einer Fördereinrichtung, wie eine Pumpe verbunden, die in der Lage ist, das den Molekülkomplex umgebende Lösungsvolumen abzuziehen. Erfindungsgemäß bevor¬ zugt ist der Einsatz eines mechanisch, lichtdruck- oder elektrisch gesteuerten Absaugsystems oder eines (Piezo/- Solenoid-) -pumpen gesteuerten Dispensersystems.
Es lassen sich mehrere Entnahmen in ein oder mehreren Schritten in ein und dieselbe Aufnahmevorrichtung durch¬ führen, wobei die einzelnen Entnahmevorgänge jeweils unab¬ hängig voneinander im Sinne eines Sammelvorganges erfolgen können.
In vielen Fällen ist die elektrisch gesteuerte Entnahme über einen gerichteten Transport des Volumenelementes durch mindestens einen elektrischen Spannungs-oder Feldimpuls bevorzugt. Andere Ausführungsformen arbeiten mechanisch durch mindestens einen Druckdifferenzpuls und/oder durch mindestens einen Lichtdruckpuls, in Richtung auf die Porenöffnung mit Verfahren, wie sie z.B. von Weber und Greulich, Int. Rev. Cytol. , 1992, 133, pp. 1 - 41, publiziert wurden. Die Auf¬ nahmeVorrichtung kann eine Kapillare sein, deren Lumen vorzugsweise größer ist als der Durchmesser der Pore oder Kapillarenspitze, deren Öffnung mit dem Probevolumen in direktem Kontakt steht. In durchgängig dünnen Kapillaren kann Elektroosmose durchgeführt werden, wie es in der Kapillar¬ elektrophorese üblich ist, bei mechanischem Volumentransport könnte ansonsten der Strömungswiderstand unvorteilhaft groß werden.
Im Falle einer elektrisch vermittelten Entnahme wird vorzugs¬ weise der gewünschte Bestandteil im Meßvolumen gezielt über einen elektrischen Feldimpuls über das mindestens einmalige, kurzzeitige Anlegen eines elektrischen Feldes, zum Zweck einer Elektrophorese elektrisch geladener Bestandteile und/oder zum Zweck einer Elektroosmose mit gekoppeltem Transport elektrisch neutraler Moleküle, in die Aufnahme- Vorrichtung transferiert. Eine Elektrode kann dazu mit der Lösung auf Seiten des Probevolumens elektrisch leitend in Kontakt gebracht, die andere Elektrode auf Seiten der Auf¬ nahmeVorrichtung elektrisch leitend mit der Lösung in Kontakt gebracht und der leitende Kontakt zwischen beiden Kom- partimenten über die Pore hergestellt werden. Bei der Ent¬ nahme über einen gezielten Druckpuls wird durch mindestens einmalige kurzzeitige Erhöhung des Druckes im Volumen außer¬ halb des Aufnahmekompartimentes im Vergleich zum Druck innerhalb des Aufnahmekompartimentes der gewünschte Transport bewirkt und/oder durch eine kurzzeitige Druckminderung innerhalb des Aufnahmekompartimentes. Hierbei haben sich an sich bekannte Dispenser (Microdrop) oder Pump/Saugvorrichtun¬ gen bewährt (Solenoid-Pumpen, Schrittmotor-gesteuerte Pumpen) . Damit können kleine Volumenelemente von ≤ 1 nl aus einem größeren Volumen einer Lösung oder Suspension durch Transfer des kleinen Volumenelementes durch eine Pore eines Durchmessers ≤ 100 μm in ein Aufnahmekompartiment trans¬ feriert werden, wobei der Zeitpunkt und die Raumkoordinate des Entnahmevorgang über ein korreliertes Analysesystem wie durch die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) ge¬ steuert wird. Insbesondere durch einen Unterdruckpuls über ein piezoge- steuertes Dispensiermodul, dessen Füllvolumen sich innerhalb des Aufnahmekompartimentes befindet und/oder durch einen Druckpuls und/oder Unterdruckpuls wird bewirkt, daß das Volumen der Aufnahmevorrichtung vergrößert wird oder das Probevolumen zugunsten der Aufnahmevorrichtung verkleinert wird. Erfindungsgemäß folgt der Transport in das Aufnahme- volumen. Die Größe des aufgenommenen Volumens wird über die Anzahl der dispensierten Tropfen oder der Schrittmotor¬ schritte oder über die Länge und Intensität des Lichtdruck¬ pulses gesteuert.
Das Hardware-/Software-gekoppelte on line-arbeitende Analyse¬ system triggert über das aufgenommene, korrelierende Signal den Entnahmezeitpunkt. Die Entnahme erfolgt in dem Moment, wenn sich der oder die zu entnehmende Partikel mit hoher Wahrscheinlichkeit innerhalb des Entnahmevolumens befindet. Dies muß nicht unbedingt annähernd zeitgleich mit dem er¬ haltenen positiven Analyseergebnis erfolgen. Wenn ein Mole¬ kül, Molekülkomplex, Virus oder Zelle durch FCS als zu entnehmender Bestandteil identifiziert wurde, besteht die Möglichkeit der direkten Entnahme oder einer späteren Ent¬ nahme. Dabei wird die Annahme zugrundegelegt, daß der jeweilige zu entnehmende Bestandteil
entweder kurz nach der erfolgten Messung durch er¬ zwungenen Transport wie beschrieben oder elektro- phoretische Wanderung sich zu einem definierten Zeit¬ punkt an einem bestimmten Ort aufhält und da gemäß Figuren 1 und 2 elektrophoretisch oder mechanisch präparativ abgetrennt werden kann, oder
ohne erzwungene Translation sich noch in der Nähe des Detektionsvolumens aufhält, aus dem der Bestandteil elektrophoretisch, optisch durch Lichtdruck oder mechanisch abgetrennt werden kann. Handelsübliche Zellsortierer sind mit einem System zur Ver¬ einzelung von Zellen nach vorheriger Analyse ausgestattet, das sich erfindungsgemäß mit dem analytischen Verfahren der Fluoreszenzkorrelations-Spektroskopie koppeln läßt. Üblicher¬ weise werden Zellen in einem Flüssigkeit ummantelten, kapil¬ laren Fluß durch eine Küvette geleitet, die mit einer konven¬ tionellen Fluoreszenzmeßvorrichtung und/oder einer Licht- streumeßvorrichtung gekoppelt ist. Im definierten räumlichen und zeitlichen Abstand nach der Meßvorrichtung wird am Ende der Kapillare durch eine angelegte kontinuierliche Schallfre¬ quenz für eine normierte und kontinuierliche Zerteilung des dünnen Flüssigkeitsstrahles in einzelne austretende Tröpfchen gesorgt. Im Falle, daß eine Zelle eines gewünschten Zelltyps die Küvette passiert, befindet sich diese Zelle nach einer definierten Zeit in einem dieser Tröpfchen, das nach der Vereinzelung durch ein gekoppeltes Signal z.B. mittels eines Puls im elektrostatischen Feld gezielt aus seiner Flugbahn abgelenkt werden kann und so in einer separaten Aufnahmevor¬ richtung abgetrennt werden kann. Der Nachteil der Methode liegt darin begründet, daß im strömenden Fluß nur ein in¬ tegrales Fluoreszenzsignal im Sinne einer reinen Intensitäts- messung erhalten werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht die erfindungsgemäße Kopplung mit der Methode der Fluores¬ zenzkorrelations-Spektroskopie in kleinen Volumenelementen, eine Differenzierung der erhaltenen Fluoreszenzsignale nach Zugehörigkeit zu unterschiedlichen Molekülgrößen und Molekül- beweglichkeiten. Dies ist erforderlich, um z.B. Rezeptor¬ gebundene Liganden von anwesenden freien Liganden zu unter¬ scheiden. Erfindungsgemäß wird die Methode der fluoreszenz- korrelations-spektroskopischen Nachweistechnik von fluores¬ zierenden Partikeln wie Molekülen, Vesikeln, Zellen oder Molekülkomplexen im mechanisch induzierten, kapillaren Fluß mit einer gezielten Sortiervorrichtung durch eine Pore eingesetzt.
Der eigentliche Trennvorgang kann hierbei nach dem Durchtritt einzelner Volumenelemente durch die Pore stattfinden, indem nach definierter räumlicher und zeitlicher Korrelation die positiv registrierten Meßvolumina mit einem zugehörigen Volumenelement in getrennte Aufnahmevorrichtungen überführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der FCS- Meßvorgang auch vor dem Austritt aus der Pore einer Kapil¬ larenspitze erfolgen, die mit einer Mikrodispensiervorrich- tung gekoppelt ist und wobei durch verschiedene mechanische oder Feld-induzierte Ablenkungen kleine Meßvolumina mit einem zugehörigen Volumenelement der Umgebung als Tröpfchen in verschiedenen Aufnahmevorrichtungen aufgefangen werden.
Insbesondere erfolgt die zeitliche und/oder ortsspezifische Korrelation zwischen einer Analyse eines Subvolumens des Probevolumens (Meßvolumen) innerhalb des Volumenelementes
V und einer Entnahme eines gewünschten Bestandteiles durch Entnahme des Volumenelementes V Hardware-/Software-gestützt. Sie wird vorgenommen, wobei sich mindestens ein Bestandteil, das im Volumenelement V positiv identifiziert wurde, beim Entnahmevorgang im aufgenommenen Volumenelement V befindet. Dabei wird die Pore der Aufnahmevorrichtung mechanisch an das Volumenelement herangeführt und/oder das Volumenelement
V oder Bestandteile davon mit vorbestimmter zeitlicher Korrelation über einen Transport im Fluß oder über elektro¬ statische oder magnetische Feldgradienten oder Bestandteile davon an die Pore des Aufnahmekompartimentes mit zeitlicher Korrelation transportiert. Die Analyse kann auch unmittelbar vor der Pore des Aufnahmekompartimentes erfolgen. Vorzugs¬ weise ist das Subvolumen (Meßvolumen) kleiner als das Volumenelement V. Damit wird die Wahrscheinlichkeit erhöht, daß der positiv identifizierte Bestandteil entnommen wird, bevor er sich zu weit aus seinem Meßvolumen entfernt hat.
Das Analyseverfahren muß bestimmte Anforderungen erfüllen, um im Verfahren eingesetzt werden zu können. Das zum Ent¬ nahmevorgang korrelierende Signal wird z. B. über ein optisches Analysesystem ermittelt, das spezifische Molekül- eigenschaften in kleinen Volumenelementen von < 10"14 1 analysieren kann. Dies geschieht vorzugsweise durch Analysen¬ systeme auf der Basis der konfokalen Laser-Korrelations¬ spektroskopie oder Fluoreszenzkorrelationsanalytik auf der Basis der Nahfeldspektroskopie, dessen Signal on line und Software-gesteuert zeitlich einen gezielten Entnahmevorgang steuert. Gekoppelte Analyse- und Entnahmevorgänge lassen sich erfindungsgemäß kaskadenförmig aneinanderreihen, wobei die aufgenommenen Probenvolumina mit oder ohne Verdünnungsschritt nachfolgend wiederum einer Analyse ausgesetzt werden und wiederum in angereicherter Form durch eine zweite und/oder weitere Entnahmeeinheit nach erfolgter Analyse entnommen werden.
Es lassen sich solche Bestandteile entnehmen, die mit mindestens einem Reaktionspartner einen Komplex bilden, der spektroskopisch erfaßt werden kann (indirekt) oder selbst hinreichende Fluoreszenzeigenschaften (direkt) aufweisen.
Von besonderem Interesse ist das Verfahren in Kombination mit der erfindungsgemäßen Vorgehensweise zur Entnahme noch nicht identifizierter (unbekannter) Pathogene. Ziel ist die Vermehrung eines isolierten Pathogens in vivo oder die Vermehrung des genetischen Materials des Pathogens oder Teilen davon in vitro durch Amplifikation der enthaltenen Nukleinsäure im Sinne eines Shot-Gun Verfahrens und Charakterisierung über Sequenzierung.
Bedeutsam ist auch die gezielte Entnahme von Bestandteilen, die bislang bezüglich ihrer molekularen Natur nicht bekannt sind, wie Moleküle, Zellen, Vesikel, Molekülkomplexe, die sich funktioneil z. B. über eine enzymatische Wirkung oder eine Komplexbildung identifizieren lassen.
Wie in Figur 5 skizziert werden erfindungsgemäß unbekannte Partikel, wie Pathogene oder Immunogene, entnommen, indem Seren von mindestens einem Organismus gewonnen werden, der mit dem nicht identifizierten'Pathogen infiziert ist. Dabei wird mindestens ein Serum (Serum 1) aus der Phase einer akuten Infektion durch das bislang unbekannte Pathogen oder Immunogen gewonnen und mindestens ein weiteres Serum (Serum 2) aus demselben oder mindestens einem weiteren Organismus mit gleicher oder homologer Infektion aus der Phase der chronischen Infektion gewonnen. Das unbekannte Pathogen oder Immunogen aus Serum 1 wird mit mittelbar oder unmittelbar Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Antikörpern aus Serum 2 zur Komplexbildung gebracht und der gebildete Komplex gemessen. Von Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die Kreuzkorre¬ lation, wie in PCT/EP 94/00117 beschrieben, über die z.B. die gleichzeitige Bindung verschieden fluoreszierender Liganden wie Antikörper aus unterschiedlichen Organismen gemessen werden kann. Die Markierung von Antikörpern kann unmittelbar über mindestens eine Reaktion mit kopplungs- fähigen Farbstoffen oder mittelbar durch Reaktion mit Farb¬ stoff-markierten, Antikörper-Bindedomänen, insbesondere Protein A-Derivaten oder Protein G-Derivaten erfolgen. Die nicht idenfizierten pathogenen Bestandteile können sich als an sich bekannte Mikroorganismen herausstellen. Als Merkmal werden spezifische Wechselwirkungen oder enzymatische Aktivi¬ täten mit Fluoreszenz-markierten Zielmolekülen zu ober- flächen-exprimierten oder cytosolisch-exprimierten Struktur¬ elementen natürlicher oder genetisch rekombinierter Proteine oder Peptide detektiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann die Erfassung von Mole¬ külen in sehr niedriger Konzentration bewirken. Zum Beispiel kann das Scanning von foetalen Zellen im mütterlichen Blut durchgeführt werden. Mit der erfindungsgemäßen Methode lassen sich sehr niedrige Konzentrationen (< 10"12M) fluoreszieren¬ der Moleküle bestimmen. Das Verfahren kann jedoch unprak¬ tikabel werden, wenn zu lange bei unveränderten Raum¬ koordinaten zur Festlegung eines oder mehrerer Meßvolumen gewartet werden muß, bis ein gesuchtes Molekül das Raum- element des Meßvolumens passiert. Dieses Problem stellt sich auch bei höheren Konzentrationen ein (> 10"12 M) , wenn die Diffusionszeiten sehr klein sind, wie dies z.B. bei Zellen und zellgebundenen Molekülen der Fall ist. In solchen Fällen kann das erfindungsgemäße Verfahren so modifiziert werden, daß dem eigentlichen Meßverfahren ein Scanning-Prozeß vorges¬ chaltet ist, bei dem solange die Raumkoordinaten in zeitlich kontinuierlicher Meßtechnik oder zeitlich diskontinuierlicher Meßtechnik variiert werden, bis ein Signal der gewünschten Qualität erfaßt wird. Dies kann z. B. das gemeinsame Auf¬ treten einer korrelierten Fluoreszenz mit zwei verschiedenen Emissionen bei Verwendung der Kreuzkorrelationsmethode sein. Ist ein Signal erfaßt, wird der FCS-Meßvorgang gestartet. Die Dauer eines Scanning-Vorgangs kann weniger als eine Millisekunde pro Meßvorgang betragen. Schon dann ist fest¬ stellbar, daß das "gescannte" Meßvolumen oder die parallel vermessenen Meßvolumina den gesuchten Bestandteil nicht beinhalten. Bei dieser Vorgehensweise ist zu beachten, daß die durchschnittlichen charakteristischen Diffusionszeiten in ihrer absoluten Größe auf berechenbare Weise beeinflußt werden. Dies geschieht zum Beispiel so, daß fixierte Moleküle (z.B. auf fixierten Bakterienzellen) direkt und ausschlie߬ lich die zeitliche Variation der relativen Veränderung der Raumkoordinaten des Meßvolumens im Vergleich zu den Ko¬ ordinaten des Probevolumens wiedergeben, oder bei beweglichen kleinen Molekülen und sprunghafter Veränderung der Raumko¬ ordinaten ca. die Hälfte der durchschnittlichen Aufenthalts¬ dauer, da die Moleküle sich bei Beginn des Meßvorgangs bereits innerhalb des Meßvolumens befinden.
Scanning-Prozesse, die der eigentlichen Messung vorgeschaltet sind, erlangen dann Bedeutung, wenn z. B. Zellpopulationen analysiert werden sollen, wobei nur ein Bruchteil der Zellen Moleküle oder Molekülkomplexe die die Entnahme bestimmenden Eigenschaften tragen. Dies ist z.B. bei der Analyse evolutiv hergestellter Mutantenpopulationen rekombinanter Zellen der Fall, aber auch bei der Analyse mütterlichen Blutes auf die Anwesenheit kindlicher, kernhaltiger Erythrozyten, die auf bestimmte Erbanlagen oder Chromosomenanomalien analysiert werden sollen.
Das Verfahren eignet sich für eine Methode, die im folgenden als funktionale Genextraktion bezeichnet wird. Gemeint ist die Herstellung genetischer Sonden zur Auffindung/Detektion/- Klonierung spezifischer Funktionen, die auf einem Gesamtgenom oder in einer cDNA-Bank kodiert sind. Anwendungsbeispiele sind die funktionale Genomanalyse durch Verwendung von Phagen- oder Bakterien-Displaysystemen, sowie entsprechende Anwendungen in der evolutiven Biotechnologie. In beiden Beispielen geht es um die Detektion und gezielte Selektion von Zellen oder Phagen mit spezifischen Bindungseigenschaften zu bestimmten Liganden vor einem Hintergrund nicht-reagieren¬ der Phagen oder Bakterien.
Die Anzahl durchgemusterter Volumenelemente steigt somit erheblich. In Kombination mit der Kreuzkorrelation lassen sich somit im μs- bis Nanosekundenbereich im Einzel und Multiarraybetrieb viele Volumenelemente durchmustern. Die Verschiebung wird nur unterbrochen, wenn sich im erfaßten Volumenelement z.B. verschiedenfarbige miteinander korre- lierte Signale nachweisen lassen. Liegt diese Situation vor, können stoffliche Parameter der Bestandteile, z.B. die Trans¬ lationsdiffusion, bestimmt werden. Diese Zeit ist um ein zu errechnendes Zeitelement (ca. 50%) statistisch kürzer, verglichen mit dem Fall, daß ein Teilchen in das Volumen¬ element von sich aus oder durch erzwungene Diffusion ein¬ dringen muß. Ist ein Teilchen einmal erfaßt, kann es auch durch Scanning der unmittelbaren Umgebung ein zweites Mal erfaßt werden.
Erfindungsgemäß kann das Meßvolumen sich aus parallel ausge¬ leuchteten Untermeßvolumina zusammensetzen, indem die gleich¬ zeitige Ausleuchtung mehrerer Meßvolumina durch mindestens eine Strahlenquelle für elektromagnetische Strahlung durch Verwendung mindestens eines holographischen Gitters zur Erzeugung mehrerer Volumenelemente erfolgt.
Die parallele Ausleuchtung mehrerer Volumenelemente mit konfokaler Optik ist in DE 40 35 799 beschrieben. Parallele Ausleuchtung von Meßvolumina, deren relative Abstände im sub-μm-Bereich liegen, gelingt durch die beschriebenen Vorrichtungen nicht oder nur unbefriedigend. Die -.im er¬ findungsgemäßen Verfahren bereitzustellenden Ausleuchtungen mit einer Dimensionierung im unteren μm-Bereich und darunter gelingen durch Verwendung holographischer Gitter.
Umfangreiche Arrays kleiner Volumenelemente können durch Einsatz holographischer Gitter ausgeleuchtet werden. Die Meßvolumina werden erfindungsgemäß konfokal entweder über die Verwendung mehrerer Lochblenden in Objektebene, durch Positionierung von Multiarraydetektor-elementen in Objekt- ebene oder durch Einsatz von Lichtfaserbündeln mit Ein- kopplung des Lichtes in Objektebene und Übertragung auf Photonen-Detektoren auf Fluoreszenzeigenschaften darin enthaltener Moleküle vermessen.
Bei der hochparallelisierten Ausleuchtung von kleinen Volumenelementen stellt sich das Problem der Registrierung der emittierten Fluoreszenzsignale aus den einzelnen Volumen¬ elementen. In der Patentanmeldung PCT/EP 94/00117 ist be¬ schrieben, daß es möglich ist, parallel kleine Raumelemente auszuleuchten und die jeweiligen Fluoreszenzsignale in¬ dividuell durch die Verwendung konfokaler Lochblendensysteme in Objektebene auf Multiarraydetektoren abzubilden oder die Signale an der Position und anstelle der Lochblenden in Lichtleiter einzukoppeln und auf Detektorelemente zu leiten oder die Multiarraydetektoren anstelle und in der Position der der Lochblenden selbst zu positionieren. Es wird auch die Möglichkeit beschrieben, ein größeres Volumenelement auszuleuchten und mit den oben beschriebenen konfokalen, parallelen Abbildungen kleiner Untervolumenelemente zu kom¬ binieren.
Bei hoher Parallelisierung werden jedoch die Anforderungen an die Anzahl der Detektorarrays sowie an den mit der parallelen Verarbeitung auflaufenden Daten verbundenen Rechenaufwand erheblich. Erfindungsgemäß werden diese Probleme dadurch gelöst, daß in einer weiteren Form der Kopplung kleiner, parallel ausgeleuchteter Raumelemente mit einer Registriervorrichtung die Signale über mehrere Raum¬ elemente hinweg integriert erfaßt werden. Diese Vorgehens¬ weise ist insbesondere bei solchen Anwendungen von Nutzen, bei denen
eine Vielzahl von Volumenelementen durchgemustert werden sollen, der Rechenaufwand zugunsten der eingesetzten Rechen¬ kapazität und der Rechendauer minimiert werden soll, die Anzahl der pro Messung erfaßten Volumenelemente und somit das vermessene Gesamtvolumen maximiert werden soll,
Signale von Molekülen, Molekülkomplexen oder Zellen in hoher Verdünnung analysiert werden sollen, die Präzision der ortsaufgelösten Erfassung von unter¬ geordneter Bedeutung ist, die Anzahl der ausgesandten Lichtquanten während der Diffusion durch ein einzelnes Raumelement für eine Korrelation ausreichend ist.
Erfindungsgemäß werden mindestens zwei Meßvolumina bei der Signalregistrierung in Objektebene gemeinsam oder in Gruppen zusammengefaßt auf mindestens ein Detektorelement eines photonenregistrierenden Meßsystems konfokal abgebildet.
Zur Erfassung fluoreszierender Moleküle in sehr niedriger Konzentration wird das Probevolumen erfindungsgemäß vor der eigentlichen Messung und Entnahme mindestens eines Bestand- teiles einem Scanning-Prozeß unterworfen, wobei durch kon¬ tinuierliche oder diskontinuierliche zeitliche Variation der Raumkoordinaten des Meßvolumens, relativ zu den Raum¬ koordinaten des Probevolumens, die Zeit zur Erfassung eines gesuchten Teilchens verkürzt wird. Das Zeitintervall δt für die Messung eines oder mehrerer Volumenelemente mit de¬ finierten Raumkoordinaten vor einer Erfassung eines gesuchten Moleküls über sein Fluoreszenz-Meßsignals ist dabei-,kürzer als die durchschnittliche Aufenthaltsdauer des gesuchten Moleküls innerhalb eines Meßvolumens.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Pore einer porösen Aufnahmevor- richtung dicht an das optische Meßvolumen herangeführt wird und die Aufnahmevorrichtung mit einer mechanisch, optisch oder elektrisch steuerbaren Entnahmevorrichtung verbunden ist. Sie umfaßt die Anordnung eines geschlossenen oder offenen Behältnisses zur Aufnahme eines Probevolumens, gekoppelt mit einer Meßvorrichtung zur Ausleuchtung und/oder Messung eines kleinen Volumenelementes (Meßvolumen) durch elektromagnetische Strahlung und mindestens einer Verbindung zu mindestens einem zweiten Volumenelement in einer Aufnahme- Vorrichtung, das mit dem Probevolumen durch eine Öffnung in direktem Kontakt über eine flüssige Phase steht, wobei die Öffnung dem Meßvolumen vorzugsweise räumlich unmittelbar benachbart ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet besondere Verwendung zur präparativen Gewinnung unbekannter Pathogene, Immunogene oder Organismen, die Teile eines Genoms funktional expri- mieren, sowie zur Analyse und präparativen Gewinnung kern¬ haltiger foetaler Zellen aus mütterlichem Blut.
Derartige Probleme stehen im Zusammenhang mit Verfahren zur evolutiven Optimierung von Peptiden und/oder Proteinen durch Einsatz von Mutagenese-Verfahren und Selektions-Verfahren, wie sie beispielsweise in der internationalen Patetnanmeldung PCT/EP 94/00117 vorgeschlagen werden. Es lassen sich ca. 109 Bakterien in ihren Bindungseigenschaften zu spezifischen Farbstoff-markierten Substanzen innerhalb von 24 Stunden durchmustern z.B. auf die Anwesenheit eines Bakteriums, das ein Oberflächenprotein/Peptid exprimiert, das die Fähigkeit besitzt, mit dem Zielmolekül von vorgegebener Konzentration in Wechselwirkung zu treten. Das entsprechende Bakterium ist aus einem solchen Reaktionsansatz mit herkömmlichen Methoden klonierbar bzw. mit dem erfindungsgemäßen Verfahren direkt isolierbar.
Ein weiteres bedeutendes Anwendungsfeld ergibt sich aus dem sogenannten Genomprojekt zur funktionalen Kartierung von Gen¬ segmenten aus genomischen Banken, cDNA Banken oder Banken subgenischer St ukturelernente (Shape Space) . Auf diese Weise lassen sich genomische und/oder subgenomische Segmente aus umfangreichen Kollektiven in ihrer Funktion, z.B. ihrem funktionalen Bindeverhalten zu Zielmolekülen bestimmen.
Die Verwendung der beschriebenen Methodik der funktionalen Zuordnung genetisch kodierter Peptidsegmente kann insbe¬ sondere in der allergologischen Forschung große Bedeutung erlangen. Die Zuordnung von immundominanten Epitopen auf Allergenen (z.B. Aspergillus, Milchprotein, alpha-Amylase) ist von außerordentlich großer Bedeutung und bislang ein schwer zu lösendes Problem. Typische Probleme der Praxis sind:
Bestimmung der IgE-bindenden Moleküle aus einem zumeist Undefinierten Substanzgemisch. Bedeutsam ist beispiels¬ weise die Beantwortung der Frage, welche Bestandteile des Sojalecithins immunogen sind, die Reinsubstanz allein, die Reinsubstanz in ihrer Wechselwirkung mit Verunreinigungen des Präparates oder die Wechselwirkung mit Strukturen des Empfängerorganismus. Erfindungsgemäß lassen sich die unterschiedlichen immunogenen Sub- stanzen in der Mischung mit markiertem IgE aus Patienten differenzieren.
Durch Expression subgenischer Gensegmente lassen sich mit dem oben genannten Verfahren die immun¬ dominanten Epitope eingrenzen, charakterisieren und präparativ darstellen. Mit diesen Ergebnissen lassen sich
mit den in DE 41 12 440 C2 beschriebenen Methoden evolutiv analoge, funktionale Moleküle erzeugen, denen die entsprechenden Immundominanten Regionen fehlen, z.B. eine abgeschwächt immunogene alpha- Amylase oder Waschmittel-Proteasen, die spezifischen Epitope nach Standardmethoden einfach gentechnisch darstellen und als reine Nachweis¬ reagenzien einsetzen oder zur Desensibilisierung ver¬ wenden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich bestimmte Aufgaben lösen, die bislang nicht oder nur durch unver¬ hältnismäßig großen Aufwand lösbar gewesen sind.
Screening von pharmakologisch aktiven Substanzen über die Bindung bekannter Fluoreszenz-markierter Liganden an an sich unbekannte Rezeptoren, die sich auf Zellen oder natürlichen oder künstlichen Vesikel-Strukturen befinden können.
Es gibt natürliche und chemisch synthetisierte Wirkstoffe mit pharmakologischer Wirksamkeit, deren Zielmoleküle nicht bekannt sind. Die Zielmoleküle können dabei extrazelluläre Moleküle sein (z.B. Protease-Hemmer) , Oberflächen-Membran-- Rezeptoren (z.B. Insulin) , lösliche Rezeptoren als Mediatoren (steroidhormonbindende Rezeptoren) oder zelluläre lösliche Strukturproteine oder Enzyme. Erfindungsgemäß läßt sich somit die äußerst wichtige Aufgabe lösen, zu einem bekannten Wirkstoff das pharmakologisch wichtige Zielmolekül zu finden, zu charakterisieren und gegebenenfalls zu präparieren:
Orphan-Rezeptor-Suche
Aufklärung pharmakologischer Wirkmechanismen Suche nach analogen Wirkstoffen
Suche und Differenzierung unterschiedlicher Rezeptor¬ moleküle, vorzugsweise in differenzierbaren bio¬ logischen Targets (unterschiedliche Zelldifferen¬ zierung, Tumor/non-Tumor) , krankheitsassoziiert - nicht krankheitsassoziiert etc.
Legende der Figuren
Figur 1
(Molekülsammler)
Die schematische Zeichnung beschreibt das Prinzip der Vor¬ richtung, bei der durch eine Pore, die die offene Verbindung zwischen den Kompartimenten A und B darstellt, durch einen Druck- oder Unterdruckpuls oder einen elektrischen Puls die Inhaltsstoffe aus einem kleinen Volumenelement aus dem Kompartiment A in ein Kompartiment B überführt werden kann. Ein Teil dieses Volumenelementes ist das dunkel symbolisierte Meßvolumen von < 10"14 1 unmittelbar vor der Pore, in dem die FCS-Analyse stattfindet. Eine Zelle oder ein makromolekularer Komplex läßt sich auch durch einen entsprechend gerichteten Lichtdruck mittels eines Laserpulses erreichen, der senkrecht zum Porendurchmesser erfolgt und zum Transport eines als gewünscht erkannten Komplexes in die Aufnahmevorrichtung des Kompartiment B geführt werden kann. Figur 2
(FCS-Selektion einzelner Mikroorganismen mit gezielter Fraktionierung)
Die Figur zeigt die erfindungsgemäße FCS-Selektion einzelner Mikroorganismen mit gezielter Fraktionierung aus einem kontinuierlich oder diskontinuierlich bewegten Probevolumen. Das FCS-Meßvolumen befindet sich unmittelbar vor der Öffnung einer kapillaren Pore und ist durch die schraffierte Säule im Fokussierungskegel der FCS-Laserausleuchtung oder Nahfeld- ausleuchtung gekennzeichnet. Jeweils in kosekutiven Schritten lassen sich rechnergesteuert als positiv identifizierte Meßvolumina gemeinsam mit einem umgebenden Volumen aus der Probevorrichtung in die Aufnahmevorrichtung trasportieren. Dies gelingt z. B. durch Anschluß einer Microdrop-Dispenser- Vorrichtung oder z.B. in einfacher Ausführung durch An- kopplung einer schrittmotorgesteuerten Spritze (nl-Aufnahme/ Schritt) oder einen elektrischen Puls. So können während einer Messung mehrere Volumenelemente in der Aufnahmevor¬ richtung akkumuliert werden.
Figur 3
(Kaskadenanreicherung)
Durch serielles Aneinanderschalten von Trennvorrichtungen, wie sie in Figur 2 beschrieben sind, läßt sich die Trenn¬ leistung steigern. Dies ist beispielsweise bedeutungsvoll, wenn aus einem hochkomplexen Gemisch (1012 Partikel) von z. B. rekombinaten Bakterien oder Phagen in hoher Konzentration einzelne Partikel möglichst hintergrundsfrei ausgesondert werden sollen.
Figur 4
(FCS-Selektion einzelner Mikroorganismen) Die Abbildung beschreibt eine Vorrichtung, mit der Bakterien aus Gemischen ausgesondert werden können, die bestimmte, durch FCS zu messende Eigenschaften exprimieren. Es wird einem kapillaren Fließsystem ein zunächst nicht induziertes Bakteriengemisch zugeführt. In einer Mischkammer wird bei¬ spielsweise IPTG als ein expressionsinduzierendes Reagenz zugeführt. Nach hinreichend langer Flußzeit wird dem Ex¬ pressionsprodukt ein Assay-System mit Markermolekülen zu¬ geführt, die sich anschließend an einer definierten Position in ihrer Wechselwirkung mit einem etwaigen Expressionsprodukt messen lassen. Die Abbildung soll darüber hinaus andeuten, daß ein positiv identifiziertes Meßvolumen auch an einer räumlich und zeitlich entfernten Position abgenommen werden kann, sofern die Raum/Zeit-Koordinaten in einem bekannten und definierten Verhältnis zueinander stehen.
Figur 5
(Nachweis und Präparation neuer Pathogene)
Die Abbildung demonstriert die erfindungsgemäße Vorgehens- weise bei der Selektion von unbekannten Pathogenen, die sich durch Kreuzkorrelation mittels FCS detektieren lassen, wobei die unterschiedlich markierten Antikörper, die gegen ein bestimmtes Pathogen gerichtet sind, vorzugsweise aus unter¬ schiedlichen Patienten stammen können.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Entnahme von einem oder wenigen Bestand¬ teilen eines Sytems wie Moleküle, Molekülkomplexe, Vesikel, Micellen, Zellen, gegebenenfalls mit einem dazugehörigen Volumenelement (Entnahmevolumen)-. V, 10" 9 ≥ V ≥ 10~18 1, aus einem größeren Volumen einer die zu entnehmenden kleinen Bestandteile enthaltenen Um¬ gebung (Probevolumen) durch Transfer des Bestandteiles oder der Bestandteile in eine andere Umgebung, wobei Ort und Zeit der Entnahme durch ein mit dem zu entneh¬ menden kleinen Bestandteil korrelierendes Signal fest¬ gelegt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch (gekennzeichnet, daß das Probevolumen mit der anderen Umgebung in Form einer Aufnahmevorrichtung durch eine Pore einer Kapillare oder Membranwandung verbunden ist, deren engste Öffnung D durch 100 μm ≤ D ≤ 0,1 μm gegeben ist.
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und/oder, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß mindestens eine Entnahme in ein oder mehreren Schritten in ein und dieselbe Aufnahme- Vorrichtung erfolgt, wobei die einzelnen Entnahmevor¬ gänge jeweils unabhängig voneinander nach Art eines SammelVorganges erfolgen.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Entnahme über einen gerichteten Transport des Volumenelementes durch min¬ destens einen elektrischen Spannungs-oder Feldimpuls erfolgt und/oder mechanisch durch mindestens einen Druckdifferenzpuls und/oder durch mindestens einen Lichtdruckpuls.
5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß die AufnähmeVorrichtung eine Kapillare ist, deren Lumen größer ist als der Durchmesser der Pore oder Kapillarenspitze, deren Öffnung mit dem Probevolumen in direktem Kontakt steht.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 5 dadurch gekennzeichnet, daß die Entnahme gezielt über einen elektrischen Feldimpuls über das mindestens einmalige, kurzzeitige Anlegen eines elektrischen Feldes zum Zweck einer Elektrophorese elektrisch ge¬ ladener Bestandteile und/oder zum Zweck einer Elektroosmose mit gekoppeltem Transport elektrisch neutraler Moleküle erfolgt, indem eine Elektrode mit der Lösung auf Seiten des Probevolumens elektrisch leitend in Kontakt steht und die andere Elektrode auf Seiten der Aufnahmevorrichtung elektrisch leitend in Kontakt steht mit der Lösung und der leitende Kontakt zwischen beiden Kompartimenten über die Pore herge¬ stellt wird.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Entnahme gezielt über einen mechanischen Druckimpuls durch mindestens ein¬ malige kurzzeitige Erhöhung des Druckes im Volumen außerhalb des Aufnahmekompartimentes im Vergleich zum Druck innerhalb des Aufnahmekompartimentes entsteht und/oder durch eine kurzzeitige Druckminderung inner¬ halb des Aufnahmekompartimentes.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, daß der Unterdruckpuls durch ein piezo-gesteuertes Dispensiermodul entsteht, dessen Füllvolumen sich innerhalb des Aufnahmekompartimentes befindet und/oder daß der Druckpuls und/oder Unterdruckpuls dadurch erfolgt, daß durch vorzugsweise Schrittmotor gesteuerte Hubänderung einer gekoppelten Kolbenspritzenvorrichtung das Volumen der Aufnahmevorrichtung vergrößert wird oder das Probevolumen zugunsten der Aufnahmevorrichtung verkleinert wird.
9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des aufgenommenen Volumens über die Anzahl der dispensierten Tropfen oder der Schritte des Schrittmotors gesteuert wird..
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daß das korrelierende Signal den Entnahmezeitpunkt triggert, der in dem Moment erfolgt, wenn sich das oder die zu entnehmende Partikel mit hoher Wahrscheinlichkeit innerhalb des Entnahme- volumens befindet.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 - 10 dadurch gekennzeichnet, daß die zeitliche und/oder ortsspezifische Korrelation zwischen einer Analyse eines Subvolumens des Probevolumens (Meßvolumen) inner¬ halb des Volumenelementes V und einer Entnahme eines gewünschten Bestandteiles durch Entnahme des Volumen¬ elementes V Rechner/Software-gestützt vorgenommen wird, wobei sich mindestens ein Bestandteil, das im Volumen¬ element V analysiert wurde, beim Entnahmevorgang im aufgenommenen Volumenelement V befindet, wobei die Pore der Aufnahmevorichtung mechanisch an das Volumenelement herangeführt wird und/oder das Volumenelement V oder Bestandteile davon mit vorbestimmter zeitlicher Korre¬ lation über einen Transport im Fluß oder über elektro¬ statische oder magnetische Feldgradienten oder Bestand¬ teile davon an die Pore des Aufnahmekompartimentes zeitlich korreliert transportiert wird und/oder die Analyse geometrisch unmittelbar vor der Pore des Auf¬ nahmekompartimentes erfolgt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Subvolumen (Meßvolumen) kleiner als das Volumenelement V ist.
13. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, daß das korrelierende Signal über ein optisches Analysesystem ermittelt wird, das spezifische Moleküleigenschaften in kleinen Vplumen- elementen von < 10"14 1 analysieren kann, insbesondere Analysensysteme auf der Basis der konfokalen Laser- Korrelationsspektroskopie oder auf der Basis der Nahfeldspektroskopie, dessen Signal on line und Soft¬ ware gesteuert zeitlich einen gezielten Entnahmevorgang steuert.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 13, dadurch gekennzeichnet, daß die gekoppelten Analyse- und Entnahmevorgänge kaskadenförmig aneinandergereiht werden, wobei die aufgenommenen Probenvolumina mit oder ohne Verdünnungsschritt nachfolgend wiederum einer Analyse ausgesetzt werden und wiederum in ange¬ reicherter Form durch eine zweite und/oder weitere Entnahmeeinheit nach erfolgter Analyse entnommen werden können.
15. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß Bestandteile entnommen werden, die mit mindestens einem Reagens einen Komplex bilden, der spektroskopisch erfaßt werden kann.
16. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 15, dadurch gekennzeichnet, daß Bestandteile entnommen werden, die bislang nicht bezüglich ihrer molekularen Natur bekannt sind, Moleküle, Zellen, Vesikel, Molekül¬ komplexe, die sich über eine Wechselwirkung mit be¬ kannten Strukturen oder Wirkungen wie enzymatische Wirkung oder eine Komplexbildung identifizieren lassen.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die unbekannten Partikel Pathogene oder Immunogene sind, die gezielt entnommen werden, indem Seren von mindestens einem Organismus gewonnen werden, wobei mindestens ein Serum (Serum 1) , aus der Phase einer akuten Infektion durch ein auch bislang nicht identi¬ fiziertes (unbekanntes) Pathogen oder Immunogen ge¬ wonnen wird und mindestens ein Serum (Serum 2) aus demselben oder mindestens einem weiteren Organismus mit gleicher oder homologer Infektion aus der Phase der chronischen Infektion gewonnen wird, wobei das auch unbekannte Pathogen oder Immunogen aus Serum 1 mit mittelbar oder unmittelbar fluoreszenz-markierten Anti¬ körpern aus Serum 2 zur meßbaren Komplexbildung ge¬ bracht wird.
18. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 - 17 dadurch gekennzeichnet, daß über Kreuzkorrelation die gleichzeitige Bindung von Liganden mit unterschied¬ lichen Fluoreszenzsignalen, z. B. markierte Antikörper aus unterschiedlichen Organismen, bestimmt wird.
19. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 - 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung der Anti¬ körper unmittelbar über mindestens eine Reaktion mit kopplungsfähigen Farbstoffen oder mittelbar durch Reaktion mit Farbstoff-markierten, Antikörper-Binde¬ domänen, insbesondere Protein A-Derivaten oder Protein G-Derivaten erfolgt.
20. Verfahren gemäß mindestens einen der Ansprüche 1 - 19 dadurch gekennzeichnet, daß die auch unbekannten Partikel an sich bekannte Mikroorganismen, oder Vesikel sind, wobei als Merkmal spezifische Wechselwirkungen oder enzymatische Aktivitäten mit fluoreszenz-markier¬ ten Zielmolekülen zu oberflächen-exprimierten oder cytosolisch-exprimierten Strukturelementen natürlicher oder genetisch rekombinierter Proteine oder Peptide detektiert werden.
21. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Meßvolumen sich aus parallel ausgeleuchteten Untermeßvolumina zusammen¬ setzt, wobei die gleichzeitige Ausleuchtung mehrerer Meßvolumina durch mindestens eine Strahlenquelle für elektromagnetische Strahlung durch Verwendung mindestens eines holographischen Gitters erfolgt.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Registrierung von Fluoreszenzsignalen aus mindestens einem Meßvolumen durch konfokale Abbildung durch Verwendung einer Mehrzahl konfokaler Lochblenden in Objektebene oder Einkopplung der Signale in Licht¬ leiter in der Objektebene oder durch Multiarray¬ detektoren in Objektebene erfolgt.
23. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 - 22, dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung paralleli- sierter Messungen an mindestens zwei Meßvolumina bei der Signalregistrierung in Objektebene mindestens zwei Meßvolumina gemeinsam oder in Gruppen zusammengefaßt auf mindestens ein Detektorelement eines Photonenre¬ gistrierenden Meßsystems konfokal abgebildet werden.
24. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 23, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erfassung fluores¬ zierender Moleküle in sehr niedriger Konzentration das Probevolumen vor der eigentlichen Messung und Entnahme mindestens eines Bestandteiles einem Scanning-Prozeß unterworfen wird, wobei die Zeit zur Erfassung eines gesuchten Teilchens verkürzt wird, indem die Raumkoor¬ dinaten des Meßvolumens relativ zu den Raumkoordinaten des Probevolumens zeitlich diskontinuierlich oder kontinuierlich variert werden. /35492 PCI7EP95/02344
- 30 -
25. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Zeitintervall δt für die Messung eines oder mehrerer Volumenelemente mit definierten Raumkoordinaten vor einer Erfassung eines gesuchten Moleküls über sein Fluoreszenz-Meßsignal kürzer ist als die durchschnittliche Aufenthaltsdauer des gesuchten Moleküls innerhalb eines Meßvolumens.
26. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 - 25, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Pore einer Aufnahmevorrichtung dicht an das Meßvolumen herangeführt wird, die Aufnahmevor- richtung mit einer mechanisch, optisch oder elektrisch steuerbaren Entnahmevorichtung verbunden ist.
27. Vorrichtung gemäß Anspruch 26, bestehend aus einer An¬ ordnung eines geschlossenen oder offenen Behältnisses zur Aufnahme eines Probevolumens, gekoppelt mit einer Meßvorrichtung zur Ausleuchtung und/oder Messung eines kleinen Volumenelementes (Meßvolumen) durch elektro¬ magnetische Strahlung und mindestens einer Verbindung zu mindestens einem zweiten Volumenelement, das mit dem Probevolumen durch eine Öffnung in direktem Kontakt über eine flüssige Phase steht, wobei die Öffnung dem Meßvolumen vorzugsweise räumlich unmittelbar benachbart ist.
28. Verwendung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 27, zur präparativen Gewinnung nicht identifizierter Pathogene, Immunogene oder Organismen, die Teile eines Genoms funktional exprimieren.
29. Verwendung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 25 zur Herstellung genetischer Sonden zur Auffindung/Detektion/Klonierung funktionalen Elemente eines Gesamtgenoms und/oder davon abgeleiteter Diagnostika und/oder Therapeutika.
30. Verwendung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 25, zur Analyse und präparativen Ge¬ winnung kernhaltiger foetaler Zellen aus mütterlichem Blut.
31. Verwendung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 25, zur Detektion und präparativen Ge¬ winnung mindestens eines spezifischen Gens eines. Mikro¬ organismus, dessen mindestens ein Genprodukt auf der inneren oder äußeren Zellmembran oder Virushülle prä¬ sentiert ist.
32. Verwendung des Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 - 25, zur Funktionsbestimmung von Gen¬ produkten definierter Gensegmente.
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