EP1343586A1 - Procedes et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon - Google Patents

Procedes et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon

Info

Publication number
EP1343586A1
EP1343586A1 EP01998402A EP01998402A EP1343586A1 EP 1343586 A1 EP1343586 A1 EP 1343586A1 EP 01998402 A EP01998402 A EP 01998402A EP 01998402 A EP01998402 A EP 01998402A EP 1343586 A1 EP1343586 A1 EP 1343586A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
container
analyte
bottleneck
magnetic particles
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP01998402A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
EP1343586B1 (fr
Inventor
Pierre Puget
Patrick Pouteau
Frédéric Ginot
Patrice Caillat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Biom Rieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biom Rieux SA, Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Biom Rieux SA
Publication of EP1343586A1 publication Critical patent/EP1343586A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP1343586B1 publication Critical patent/EP1343586B1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/025—High gradient magnetic separators
    • B03C1/031—Component parts; Auxiliary operations
    • B03C1/033—Component parts; Auxiliary operations characterised by the magnetic circuit
    • B03C1/0332—Component parts; Auxiliary operations characterised by the magnetic circuit using permanent magnets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/28—Magnetic plugs and dipsticks
    • B03C1/288—Magnetic plugs and dipsticks disposed at the outer circumference of a recipient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0825—Test strips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502723—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by venting arrangements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/18—Magnetic separation whereby the particles are suspended in a liquid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Description

PROCEDES ET DISPOSITIFS DE TRANSPORT ET DE CONCENTRATION D'UN ANALYTE PRESENT DANS UN ECHANTILLON
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon, à un procédé , de concentration d'un analyte présent dans un échantillon, et à un dispositif pour la mise en œuvre de ces procédés.
Elle s'inscrit dans tous les domaines dans lesquels il existe un besoin de transporter Un analyte d'une première solution à une deuxième solution, ceci par exemple pour des raisons d'incompatibilité de la solution constituée par l'échantillon, ou d'éléments présents dans cette solution, avec un réactif ou un procédé chimique ciblant l' analyte.
Elle s'inscrit également dans tous les domaines dans lesquels il existe un besoin de concentrer un analyte pour pouvoir le mettre en évidence par exemple en le f isant réagir avec un réactif par ' exemple de transformation et/ou de mise en évidence de l' analyte.
Par exemple, de nombreux tests de diagnostic in vitro consistent à faire réagir chimiquement un analyte recherché" "avec un réactif adéquat. Le ou un des produits de la réaction est ensuite détecté directement ou indirectement .
On peut citer par exemple les tests immunologiques dans lesquels la réaction chimique est une reconnaissance anticorps/antigène, ou de façon plus générale une réaction protéine/ligand, et les tests par sondes d'acide (s) nucléique (s) dans lesquels on détecte une hybridation entre acides nucléiques.
Un test de diagnostic est d'autant meilleur qu'il présente à la fois une sensibilité et une spécificité élevées. Il est d'autant plus sensible qu'il permet de détecter une quantité faible d' analyte recherché. Il est d'autant plus spécifique qu'il n'est positif que pour l' analyte recherché et non pour des analytes semblables .. On entend par analyte tout ou partie de corpuscule ou molécule que l'on désire isoler, changer de milieu et/ou concentrer pour être utilisé et/ou mis en évidence tel qu'un microorganisme, une bactérie," un champignon, un virus, une cellule eucaryote ; un composé chimique ; une molécule telle qu'un peptide, une protéine, un enzyme, un polysaccharide, un lipide, une lipoprotéine, un lipopolysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un antigène, un anticorps, uri facteur de croissance, un haptène ; une cellule telle qu'une cellule tumorale etc.
Etat de la technique
De nombreux tests de diagnostic sont réalisés après des étapes d'extraction des analytes cibles des échantillons biologiques, de purification pour éliminer des produits parasites qui pénalisent les performances du test, de concentration des analytes cibles pour augmenter la quantité d' analyte par unité de volume de tampon, et de mise en solution des analytes cibles dans un tampon pour les rendre accessibles chimiquement.
En outre, pour augmenter la sensibilité et la spécificité d'un test permettant de mettre en évidence un analyte, il est parfois nécessaire de réduire le volume du tampon dans lequel se trouve les exemplaires de l' analyte recherché, tout en conservant l'intégralité de ce dernier. Les biologistes ont des moyens tout à fait classiques de concentration d'un analyte utilisant notamment des techniques de centrifugation, de filtration et/ou de sédimentation magnétique. Ces techniques . nécessitent des transferts de solutions et des manipulations de l' analyte qui conduisent à une réduction inévitable de la quantité d' analyte analysable .
Par exemple dans les procédés de centrifugation et de sédimentation magnétique, les étapes de centrifugation ou de sédimentation magnétique proprement dites peuvent devoir être répétées plusieurs fois, la limite du nombre de répétitions étant imposée par le volume minimal de solution qui peut être manipulé facilement et de façon fiable avec une pipette classique. Ce volume minimal est de l'ordre de la dizaine de micro-litre. En-deçà, on perd du liquide et donc de l' analyte en le transportant dans des "gros" contenants tels que des cônes de pipettes, des flacons, etc. En outre, il se pose des problêmes d' évaporation et d'adsorption sur les parois des contenants lors de ces manipulations.
Dans le cas d'une concentration faible d' analyte dans l'échantillon au départ, ceci peut provoquer la disparition totale de l' analyte ou une diminution de sa quantité telle qu'il peut devenir indétectable. Outre les inconvénients précités, ces manipulations sont • coûteuses en matériel et prennent beaucoup de temps .
Ceci reste un problème constant pour de nombreuses applications industrielles, par exemple la détection de microorganismes pathogènes dans un prélèvement biologique ou un échantillon industriel.
Il existe donc un réel besoin d'un procédé et d'un dispositif .permettant de faire passer un analyte d'une première solution à une deuxième solution et/ou de concentrer un analyte tout en conservant la quantité d' analyte présente au départ, ceci par exemple afin d'accroître la sensibilité et la spécificité des tests de diagnostic et de toute réaction chimique dirigée vers l' analyte, et de pallier les inconvénients précités .
La présente invention répond à ce besoin, et présente non seulement l'avantage de pallier aux inconvénients précités, mais aussi de nombreux autres avantages que l'homme du métier ne manquera pas de relever.
Exposé de l'invention
La présente invention fournit un procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, et on déplace au moyen d'un système magnétique
1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement , le deuxième contenant étant rempli par tout ou partie de la solution A et/ou par une autre solution.
Il est à noter qu'il est également possible que la préparation de l'échantillon dans laquelle 1 ' analyte est fixé sur les particules magnétiques peut être réalisée directement dans le premier contenant. Ceci est également valable pour les procédés de concentration exposés ci-dessous.
Par transport de 1 ' analyte au sens de la présente invention, on entend déplacement de l' analyte d'un contenant à un autre contenant, avec ou sans le milieu liquide dans lequel l' analyte est présent. L'utilité d'un tel transport obtenu grâce au procédé et au dispositif de la présente invention, ainsi que les applications et avantages qui en découlent apparaîtront clairement à l'homme du métier à la lecture de la présente description.
La présente invention fournit également" un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement , le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
Les analytes sont définis ci-dessus.
La préparation de la solution A à partir de l'échantillon comprend une étape dans laquelle 1' analyte est fixé de préférence de façon réversible sur des particules magnétiques. L'utilité de cette réversibilité est expliquée ci-dessous.
Les particules magnétiques ont une taille adéquate notamment avec l' nalyte à isoler, et avec le volume de solution A. Elles peuvent être de taille sub- micrométrique par exemple lorsque 1 ' analyte est une molécule .
La quantité de particules utilisée est fonction notamment de la nature et de la quantité d' analyte à fixer, elle est de préférence en nombre suffisant pour fixer la totalité de l' analyte. Les particules magnétiques utilisables dans le procédé de la présente invention peuvent être par exemple des produits tels que ceux de la marque de commerce Dynabeads de la société Dynal (Norvège) ou MACS de la société Miltenyi Biotec (Allemagne) , ou encore des produits de la société Immunicon Corp . (USA) .
D'une manière générale, les particules magnétiques utilisables sont classiquement utilisées en biologie moléculaire et cellulaire. Elles doivent être en particulier superparamagnétiques afin de rediffuser spontanément après annulation du champ magnétique. Des exemples de protocoles de fixation ou de capture de l' analyte sur les particules magnétiques peuvent être trouvés par exemple dans les références Bioscience Product Catalogue 2000, et Mil tenyi Biotec, Tri Magnétique de Cellules, Séparation de biomolécules 1999. Les principales particules disponibles sont les particules de Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec ou Estapor (marques déposées) . De telles particules peuvent être revêtues d'oligonucléotides de capture, par adsorption ou covalence. Les documents US-A-4, 672, 040 et US-A-5, 750 , 338 décrivent des procédés utilisables pour la présente invention. Un mode de réalisation particulièrement intéressant ' de "ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par l'un des demandeurs sous les références suivantes :
- PCT/FR 97/00912 sous priorité française du 24 mai 1996, et
- PCT/FR 99/00011 sous priorité française du 6 janvier 1998.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire.. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d' interagir avec au moins une molécule biologique, le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure _ de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et': 100°C et de préférence entre 20 et 60°c. Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques. Selon l'invention, l' analyte fixé réversiblement sur les particules magnétiques peut être libéré desdites particules dans le deuxième contenant. En effet, il peut être nécessaire de libérer 1 ' analyte pour qu'il puisse accéder plus facilement, ou être plus facilement accessible, à des réactifs chimiques et/ou aux moyens utilisés pour le mettre en évidence.
Selon l'invention, les particules magnétiques libérées de l' analyte peuvent être déplacées hors" du deuxième contenant au moyen d'un système magnétique. Ceci peut être utile par exemple pour éviter toute interaction préjudiciable des particules avec les analytes libérés et/ou avec des réactifs chimiques et/ou des moyens utilisés pour le mettre en évidence.
Selon l'invention, la libération de 1 ' analyte recherché, ou élution de l' analyte, peut être effectuée par exemple dans une solution tampon par exemple par chauffage ou un autre procédé adéquat . Les procédés de libération utilisables sont tous les procédés classiques de l'état de l'art. Les techniques chromatographiques offrent toute une panoplie de techniques de libération de protéines ou autre ligand utilisables dans le procédé de la présente invention, telles qu'un changement de pH ou un changement de force ionique, ou un changement de solvant, ou encore le passage en tampon contenant de l'EDTA ou toute autre substance chélatante des cations métalliques si 1' analyte est fixé à la particule par une technique de métal-chélate. Si l' analyte est un oligonucleotide, on peut par exemple chauffer à une température de 50 à 60°C pour un oligonucleotide de longueur de 15 à 25 bases pour dissocier tous les analytes des particules magnétiques .
Selon l'invention, le système magnétique est un système permettant de créer un champ magnétique fixe ou variable engendrant l'application d'une force sur les billes magnétiques, capable de les immobiliser ou de les déplacer. Il peut être constitué d'un ensemble d'aimants ou de bobines.
Il peut s'agir également d'une bobine intégrée, réalisée par exemple par des procédés de microtechnologie tel qu'un dépôt de matériaux et de résines photosensibles de masquage, une insolation de ces résines, des gravures de motifs à l'échelle du micron, par exemple. Des bobines de ce type sont par exemple fabriquées collectivement au moyen des technologies précitées pour réaliser des têtes de lecture/écriture de disques durs.
Selon l'invention, après avoir été transportées, les particules magnétiques peuvent être remises en suspension, par exemple dans le deuxième contenant, par annulation du. champ magnétique créé par le système magnétique.
Selon une variante de la présente invention, les inventeurs fournissent également un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur -des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, - on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement, on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques' desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, on transporte par déplacement d'un liquide 1' analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant .
Selon une variante du procédé de concentration de la présente invention, 1 ' analyte peut être libéré dans le deuxième contenant, et 1 ' analyte peut être déplacé soit sous transport du. liquide contenant les analytes, soit avec transport par déplacement d'un liquide du second contenant vers un troisième contenant. Selon l'invention, on peut déplacer les particules magnétiques libérées de l' analyte du deuxième contenant au premier contenant via le goulet d'étranglement, ou du goulet d'étranglement audit premier contenant, au moyen d'un système magnétique. Selon l'invention, comme décrit ci-dessus, l' analyte peut être libéré des particules magnétiques par modification des conditions physiques ou chimiques par exemple par chauffage ou par réaction avec au moins une substance présente dans l'autre solution. Selon l'invention, un agent d'immobilisation de l' analyte peut être fixé sur tout ou partie d'au moins une paroi du deuxième contenant ou de tout support solide présent dans ledit deuxième contenant. De tels supports peuvent par exemple être constitués par des billes de silice, des billes de verre pleines, creuses ou poreuses, des particules de quartz, des grains de sable, des grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath, de la laine de verre et/ou de roche, des billes d'argile, des particules de liège, des billes de polystyrène, de polyéthylène, de polypropylène, de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et d'épaisseur variables, de billes de latex, de billes revêtues de gélatine, et de grains de résine.
Selon l'invention, le goulet d'étranglement peut être sous la forme d'un capillaire. Cette forme peut être intéressante par exemple pour limiter la diffusion de l' analyte du deuxième contenant vers le premier contenant lorsque ledit analyte a été libéré des particules magnétiques.
La présente invention fournit également un procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon dans lequel : on procède à une concentration de l' analyte au moyen d'un procédé de concentration de la présente invention, - on met en évidence l' analyte dans le deuxième contenant ou dans tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant .
Le deuxième contenant ou chambre de réaction ou tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant peut contenir un ou des réactif (s) secs ou "en solution destiné (s) à réagir directement ou indirectement avec l' analyte. Par indirectement on entend que plusieurs réactions chimiques successives peuvent être réalisées sur 1' analyte ou un de ses dérivés obtenu. Des particules magnétiques sous forme de pastilles sont décrites dans l'état de la technique, par exemple dans le document EP-A-0 811 694. La fabrication des pastilles est également bien décrite dans l'état de la technique, par exemple dans les documents US-A-4 , 678 , 812 et US-A-5, 275 , 016. Cette fabrication évoquée ci-dessus peut être utilisée pour la synthèse des autres pastilles qui seront exposées par la suite, telles que :
- une pastille qui comporte des constituants structurels, comme des dNTP, des amorces ou des ions, permettant l'amplification ultérieure telle que décrite dans le brevet US-A-5, 098 , 893 ou l'article "Ambiant- temperature-stable molecular biology reagents" R. Ramanujam et al., Product Application Focus, vol. 14, n°3 (1993) , 470-473, par exemple, - une pastille contenant des constituants fonctionnels, tels que des enzymes qui, associés avec les constituants structurels précédemment cités, permettent la conduite d'une amplification. Des exemples de telles pastilles sont donnés dans le brevet US-A-4 891 319, les demandes de brevet WO-A-87/00196 et WO-A-95/33488 ou l'article "Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose : simplified molecular biology", de C. Colaço et al., Bio/Technology, vol. 10, September 1992, 1007-1011. On peut par exemple prévoir, selon la présente invention, des plots d'hybridation fixés sur une surface du deuxième contenant de manière à ce qu'ils soient accessibles à l' analyte lorsqu'il se trouve dans le deuxième contenant . Ceci peut être réalisé par exemple sous la forme d'une puce à ADN intégrée. Ainsi, selon la présente invention, lorsque l' analyte à mettre en évidence est un acide nucléique, il peut être mis en évidence par une technologie de puce à acide nucléique. Selon la présente invention, le deuxième contenant peut donc être un réservoir d'un microcomposant, par exemple d'une biopuce, par exemple d'une puce à ADN. Par biopuce, on entend tout support solide sur lequel sont fixés des ligands, et en particulier par une puce à ADN, on entend tout support solide sur lequel sont fixés des acides nucléiques. La méthode de fixation "des ligands peut être réalisée de différentes manières et notamment par adsorption ou covalence comme par exemple la synthèse in situ par les techniques de photolithographie ou par un système piézo-électrique, par dépôt capillaire de ligands préformés. A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces appliqués aux puces à ADN sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p. 40-44, 1998 ; F. Ginot, Human Mutation, 10, p. 1-10, 1997 ; J. Cheng et al., Molecular diagnosis, 1(3), p. 183-200, 1996 ; T. Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), p. 2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al., Nature
Biotechnology, 16, p. 541-546, 1998 ou dans les brevets
US 4,981,783 (Augenlicht) , US 5,700,637 (Southern), US
5,445,934 (Fodor) , US 5,744,305 (Fodor) , US 5,807,522
(Brown) . Selon l'invention, le deuxième contenant peut être aussi une chambre d'entrée vers un autre contenant d'un autre procédé. Ainsi, le deuxième contenant peut être relié directement ou indirectement à un autre contenant utilisé pour d'autres réactions chimiques ou étapes de procédé ciblant l' analyte ou un de ses dérivés telle qu'une purification, une amplification, un marquage, etc. Par exemple, l'autre contenant ou chambre peut être une chambre de PCR pour amplifier un gène, éventuellement avec ensuite une analyse dans un laboratoire sur puce ("micro-total analysis system" : MicroTas) . Néanmoins, toutes les techniques d'amplification peuvent être utilisées.' Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, ' il existe entre autres les techniques suivantes :
- PCR (Polymerase Chain Reaction) , telle que décrite dans les brevets US-A-4 683 195, US-A-4 683 202 et US-A-4 800 159,
- LCR (Ligase Chain Reaction) , exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184,
- RCR (Repair Chain Reaction) , décrite dans la demande de brevet O-A-90/01069,
- 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet O-A-90/06995 ,
- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) . avec la demande de brevet O-A-91/02818 , - SPSR (Single Primer Séquence Replication) avec le brevet "US-A-5 194 370, et
- TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5 399 491.
Selon l'invention, d'autres réactifs peuvent être utilisés, tels que des réactifs lyophilisés, par exemple pour faire un test homogène de détection de 1' analyte, par exemple par transfert de fluorescence. Selon l'invention, de manière non limitative, l' analyte est défini ci-dessus.
La présente invention fournit également un dispositif de transport d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant destiné à contenir un liquide et_ relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé 1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement. Selon l'invention, les volumes des premier et deuxième contenants sont de préférence adaptés aux volumes de solutions à manipuler. Ces volumes peuvent être inférieurs ou égaux à 10 ml.
La présente invention fournit également un dispositif de concentration d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant de volume α destiné à contenir un liquide relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, ledit deuxième contenant de volume β plus petit que le volume α du premier contenant, et un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé
1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement. Certains éléments de ces dispositifs ont déjà été décrits pour le procédé de la présente invention, et devrons être pris en considération avec la description ci-dessous . Selon la présente invention, ces contenants sont utilisables par exemple comme chambres de réaction. Les techniques précitées permettent également de réaliser des capillaires de section de quelques microns-carrés à quelques centaines de milliers de microns-carrés pour le transfert de solutions, ou d'un analyte fixé sur des microparticules, selon la présente invention, d'un premier contenant à un deuxième contenant, par exemple d'une chambre de réaction à une autre chambre" de réaction. Selon l'invention, le rapport des volumes α/β peut être par exemple de 10 à 1000.
Selon l'invention, le premier contenant peut par exemple avoir un volume d'environ 0,1 à 100 μl .
Selon l'invention, le deuxième contenant peut avoir un volume d'environ 0,01 à 1 μl .
L'invention permet donc une réduction de volume qui est de 100 à 1000 fois supérieure à ce qui pouvait être atteint par les pratiques de laboratoire ou de systèmes "macroscopiques" automatisés de l'art antérieur manipulant des liquides avec des pipettes et des flacons de quelques dizaines de microlitres. Elle permet de ce fait de concentrer un échantillon par le même facteur 100 à 1000.
En effet des techniques de photolithogravure de substrats solides, par exemple de silicium, de silice, ou de verre, ou de moulage de grande précision de matières plastiques, permettent la réalisation de contenants de dimensions submillimétriques, voire de l'ordre de quelques microns dans au moins une direction, qui peuvent donc avoir des volumes réduits à des fractions de micro-litre. Selon l'invention, le premier contenant et/ou le deuxième contenant peuvent/peut avoir une forme qui converge vers ledit goulet d'étranglement. Le goulet d'étranglement peut être par exemple sous la forme d'un capillaire tel que décrit dans le paragraphe précédent . Selon l'invention, le goulet d'étranglement peut par exemple avoir une' section comprise entre 1 μm2 à 1 mm2, préférentiellement 100 μ 2 à 0,1 mm2.
Selon l'invention, le deuxième contenant' et/ou le goulet d'étranglement peut/peuvent être muni (s) de canaux d'entrée/sortie de fluides. Ces canaux ont bien entendu une section adaptée en fonction des volumes de solution qu'ils sont destinés à contenir. Ainsi, par exemple pour une mise en évidence de l' analyte, lorsqu'il s'agit d'un acide nucléique, dans le deuxième contenant par une hybridation sur des sondes de capture portées par un support solide, ces canaux peuvent être utilisés pour faire les lavages nécessaires avant 1 ' étape de lecture .
Selon l'invention, les dispositifs précités peuvent comprendre un évent sous forme de capillaire présent au niveau du deuxième contenant et reliant directement celui-ci à l'extérieur. Lors des opérations de remplissage et/ou de transfert de fluide dans le deuxième contenant, cet évent sert à évacuer le fluide initialement présent dans le contenant que ce soit de l'air ou du liquide. La présence d'air dans le deuxième contenant n'est qu'une éventualité. Il peut y avoir des évents à d'autres endroits, par exemple au niveau du goulet d'étranglement, du premier contenant etc. Ces évents de mise à l'air libre peuvent être commandés par exemple par des vannes à billes. L'invention permet donc grâce à l'utilisation de techniques de micro-technologies de s'intégrer dans les dispositifs appelés aujourd'hui labopuce, ou "lab-on-a- chip" ou bien encore "micro-Total-Analysis-System" (MicroTAS) dans la terminologie anglo-saxonne. Dans l'exemple "lab-on-a-chip" le dispositif de la présente invention peut être combiné à d'autres fonctions pour former un système plus complet et plus précis d'analyse biologique.
Par exemple, le dispositif de la présente invention peut être le premier élément d'un ensemble comprenant :
1. un module de concentration/réduction de volume,
2. un module d'amplification, 3. un module de séparation, par exemple par électrophorèse, 4. un module de détection.
Un exemple de dispositif intégré comprenant les éléments 2, 3 et 4 ci-dessus est décrit dans la référence M.A. Burns et al . , An Integrated Nanoli ter DNA Analysis Device, Science, vol 282, 16 oct 98.
Dans certaines réalisations de la présente invention, les concepts de chambre de réaction et de canaux de transfert peuvent donc se confondre puisque ces labopuces permettent la réalisation de procédés en continu pour lesquels les réactions se font dans des capillaires, par exemple dans certaines techniques d' électrophorèse capillaire et de PCR.
L'invention peut par exemple être utile quand 1' analyte recherché est initialement présent dans un échantillon de grand volume mais en quantité limitée.
L'invention proposée permet, par exemple par la mise en œuvre des micro-technologies précitées, de concentrer une solution de molécules que l'on veut détecter, ou de déplacer un analyte d'une première solution vers une deuxième solution dans un volume inférieur au microlitre, complètement inaccessible par les procédés classiques de laboratoire.
La présente invention peut être mise en œuvre "par exemple dans un système de diagnostic in vitro automatisé, ou un système de détection de contaminants biologiques dans des domaines tels que l' agroalimentaire et/ou le contrôle microbiologique industriel .
L'invention peut être appliquée par exemple pour la détection ultrasensible sans amplification de pathogènes dans un échantillon biologique. Les acides nucléiques des pathogènes potentiellement présents dans un échantillon peuvent être extraits par des techniques habituelles. Ils peuvent ensuite être purifiés et concentrés, toujours par des techniques standards, jusqu'à un volume de tampon de quelques dizaines de microlitres.
L'utilisation du dispositif de la présente invention ou - micro-composant permet dans ce cas de concentrer le matériel biologique dans le volume de la chambre de réaction qui correspond au deuxième composant. Là, des étapes ultérieures d'hybridation sur support plan et de détection permettent de détecter la présence ou non d'acides nucléiques de séquence donnée, caractéristique de l'infection de l'échantillon.
L'utilisation de l'invention permet donc d'augmenter très fortement la sensibilité d'un test, à performances égales du système de détection.
La présente invention peut par exemple être appliquée pour améliorer les immuno-essais . En effet, pour les immuno-essais dans lesquels se pose un problême de sensibilité, l'utilisation de l'invention, comme précédemment décrite, en concentrant le matériel biologique dans un volume très faible, permet d'augmenter fortement leur sensibilité.
Pour les immuno-essais où la quantité de matériel biologique à détecter est suffisante, l'utilisation de l'invention permet de concentrer le prélèvement, et donc de diminuer la durée de la réaction immunologique .
D'autres caractéristiques et avantages apparaîtrons encore dans les exemples ci-dessous, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
La . figure 1 est une représentation schématique en perspective et éclatée avec une coupe partielle d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention,
La figure 2 est une représentation schématique en perspective et éclatée d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention, La figure 3 est une représentation schématique en perspective et éclatée avec une coupe partielle d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention, - La figure 4 est une représentation schématique d'un premier aimant utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention, et
La figure 5 est une représentation schématique d'un deuxième aimant utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Sur ces figures, les références identiques indiquent des éléments identiques.
Exemples
Exemple 1 : exemple de préparation de la solution A
L'échantillon biologique est traité par des moyens classiques de biologie moléculaire pour obtenir une solution contenant les molécules d'ARN cible à détecter ; cette solution a un volume de 200 microlitres et la solution tampon est la suivante : Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,05%, ADN de saumon 0 , 14 mg/ml .
On ajoute à cette solution 2 μl d'une solution d'oligonucléotides de capture ; cette solution d'oligonucléotides de capture est constituée de : Tris 10 mM, EDTA ImM, pH 8, oligonucleotide de capture 101:L/μl ; l 'oligonucleotide de capture est un oligonucleotide, biotynilé en 5', d'une séquence par exemple de 32 bases, complémentaire d'une sous-séquence de l'ADN cible. Incubation pendant 2h à 35°C.
Introduction de 1 μl de particules Immunicon Corporation, streptavidine ferrofluide, non diluées. Incubation 30 minutes à 35°C. Dans ces conditions, plus de 95% des molécules cibles se trouvent immobilisées sur les particules magnétiques .
Exemple 2 : dispositif selon un premier mode de réalisation de la présente invention
Le dispositif ou composant décrit dans cet exemple est un micro-composant qui permet de réduire d'un facteur 100 à 1000 le volume de tampon dans lequel se trouve un analyte recherché, tout en conservant la quantité d' analyte présente dans l'échantillon initial.
L'architecture générale du composant 1 est représentée à la figure 1. Il est constitué d'une chambre d'introduction 3, éventuellement prolongée par un dispositif d'introduction constitué des pièces 13 et 15, reliée à une chambre de réaction 7 par l'intermédiaire d'un goulet d'étranglement 5, ici représenté sous la forme d'un capillaire. Les formes particulières des deux chambres sont données à titre d'exemple. Les chambres et le capillaire peuvent être de forme ou de taille différente suivant l'application ou la technologie de fabrication du composant. La figure 1 suggère un mode de fabrication selon lequel le composant est fabriqué en gravant les chambres et le goulet d'étranglement dans un matériau plan, puis en assemblant par collage ou tout autre mode de fixation le couvercle 11. C'est un mode de fabrication possible, mais l'invention n'est pas dépendante de ce mode de fabrication. Toute autre technologie, en particulier :
• permettant de creuser un matériau directement pour réaliser des cavités de la forme des chambres et du goulet d'étranglement,
• ou qui consisterait à creuser les chambres 3 et 7 ainsi que le goulet d'étranglement dans la plaque supérieure, dans l'exemple dans le couvercle 11, au lieu de les creuser dans la plaque inférieure, pourrait être utilisée pour fabriquer le dispositif.
On peut citer par exemple les techniques à l'image de la "LIGA" utilisant la lithographie, la galvanoplastie et le moulage.
Un évent 9 permet l'évacuation des fluides air ou liquide lorsqu'on remplit ou transfère des liquides dans les chambres .
L'échantillon et les différents réactifs ou tampons peuvent être introduits dans les dispositifs de différentes manières. Nous en donnons deux ici à titre d'exemples.
Ce premier mode de réalisation, illustré sur la figure 1, est réalisé en pratiquant un orifice dans le couvercle 11 du dispositif et en équipant cet orifice d'une cuvette conique 15. Une pièce cylindrique 13 sert à maintenir la cuvette conique en position et à assurer l'étanchéité entre la cuvette conique et le dispositif. En appliquant par exemple une pipette, un embout de diluteur ou de seringue, sur la cuvette conique, on peut "pousser" le tampon ou un réactif à l'intérieur du dispositif en exerçant une pression sur le liquide. L'air ou tout autre fluide liquide ou gazeux initialement présent dans le dispositif sera évacué du dispositif par 1 ' évent 9. Cet évent débouche ici dans la chambre de réaction, mais il pourra être placé suivant les cas à d'autres endroits du dispositif. On pourra même éventuellement disposer de plusieurs évents.
Un second mode de réalisation pour 1 ' introduction de liquide dans le dispositif est représenté à la figure 2. Dans ce mode de réalisation l(a), les liquides sont introduits par un capillaire 17, lui-même connecté à l'extérieur du dispositif par une interface, non représentée sur la figure. Le couvercle 19 ne comprend pas d'orifice.
Exemple 3 : concentration avec transport sur particules magnétiques
Le procédé décrit dans cet exemple permet de réduire d'un facteur 100 à 1000 le volume de tampon dans lequel se trouve un analyte recherché, tout en conservant la quantité d' analyte présente dans l'échantillon initial. Il met en oeuvre le dispositif représenté dans 1 ' exemple précédent .
Le composant est préalablement rempli de tampon sans analyte recherché et sans particule magnétique. Ce tampon peut être introduit en versant la quantité nécessaire dans la cuvette conique 15 représentée sur la figure 1, et en appliquant une pression pneumatique dans cette cuvette conique. Une fois le composant rempli, le tampon en excès présent dans la cuvette conique 15 est retiré, par exemple à l'aide d'une pipette.
L'échantillon composé d'une certaine quantité de tampon, par exemple de l'ordre de 30 μl, dans lequel les analytes recherchés ont été préalablement fixés sur des particules magnétiques est déposé dans la cuvette conique 15.
Les particules magnétiques sont ensuite attirées vers le fond de la chambre d'introduction 3 (figure 1) à l'aide d'un aimant, par exemple l'aimant 30 de la forme indiquée à la figure 4 positionné sous le dispositif, à l'aplomb de la cuvette conique. Les particules , magnétiques sont alors rassemblées en un culot de petite taille.
A l'aide d'un autre aimant, par exemple l'aimant 40 de la forme indiquée à la figure 5, disposé de telle sorte que le dispositif se trouve dans son entrefer "42 , le culot est attiré et transporté de sa position initiale dans la première chambre d'introduction 3, à travers le capillaire 5, dans la chambre de réaction 7.
L' analyte est ensuite libéré des particules magnétiques par chauffage (élution) à l'intérieur de la chambre de réaction 7. Pendant cette opération, les particules magnétiques sont éventuellement remises en suspension dans la chambre de réaction 7 en retirant 1 ' aimant .
Les particules magnétiques sont de nouveau rassemblées en un culot dans la chambre de réaction 7 en utilisant à nouveau un aimant, par exemple de la forme présentée sur la figure 4. Elles sont ensuite transportées à nouveau à travers le capillaire 5, mais en sens inverse que précédemment, de la chambre de réaction 7 vers la chambre d'introduction 3, en utilisant un aimant, par exemple de la forme présentée à la figure 5. Le résultat final de cette suite d'opérations est le transport de la totalité des analytes de la cuvette conique 15 vers la chambre de réaction 7, de volume beaucoup plus faible.
Exemple 4 : concentration avec transport fluidique
Le procédé décrit dans cet exemple est une variante du précédent .
Comme précédemment, le composant est préalablement rempli par du tampon sans particule magnétique. L'échantillon composé d'une certaine quantité de tampon, par exemple de l'ordre de 30 μl , dans lequel les analytes recherchés ont été préalablement fixés"sur des particules magnétiques est déposé dans la cuvette conique 15. Les particules magnétiques sont attirées vers le fond de la chambre d'introduction 3 (figure 1) à l'aide d'un aimant, par exemple de la forme indiquée à la figure 4. Les particules magnétiques sont alors rassemblées en un culot de petite taille. A l'aide d'un autre aimant, par exemple de la forme indiquée à la figure 5, disposé de telle sorte que le dispositif se trouve dans son entrefer, le culot est attiré et transporté de sa position initiale dans le capillaire 5 (et non plus dans la chambre de réaction 7) .
L' analyte est libéré des particules magnétiques par chauffage (élution) à l'intérieur du capillaire 5. Pendant cette opération, les particules magnétiques sont éventuellement remises en suspension dans le capillaire en retirant l'aimant.
Les particules magnétiques sont à nouveau rassemblées en un culot dans le capillaire en utilisant à nouveau un aimant, par exemple de la forme présentée à la figure . A ce moment, les analytes sont libres en solution à l'intérieur du capillaire. En poussant du tampon à 1 ' intérieur du dispositif par une surpression au niveau de la cuvette conique 15, on provoque un déplacement de liquide dans le capillaire vers la chambre de réaction 7. Les analytes en solution sont ainsi entraînés par le déplacement du liquide dans la chambre de. réaction 7. Les particules magnétiques, elles, restent en position dans le capillaire, maintenues en position sous forme de culot par l'aimant fixe.
Le résultat final de cette suite d'opérations "est comme précédemment le transport de la totalité des analytes de la cuvette conique 15 vers la chambre de réaction 7, de volume beaucoup plus faible.
Selon une variante de ce procédé, les particules magnétiques sont sous la forme d'entités sèches déjà présentes dans la chambre d'introduction 3. De telles entités sont bien décrites dans les brevets US-A-5,750, 338 et 4,672,040. L'introduction de l'échantillon, dans ladite chambre 3, solubilise les particules magnétiques qui se fixent alors à 1 ' analyte présent dès le. départ dans ledit échantillon.
Exemple 5 : utilisation de l'invention pour mettre en évidence 1 ' analyte dans un test de détection homogène
Dans cet exemple, 1 ' analyte est mis en évidence en utilisant la technique des "Molecular Beacons", telle qu'elle est décrit dans Tyagi, S. and Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 14:30-308, 1996. Brièvement, cette technique consiste à mettre les molécules cibles avec des sondes nucléiques, les "Molecular Beacons", qui ont la structure suivante : la séquence sonde, complémentaire de la cible, est prolongée de part et d'autre par deux bras de quelques nucléotides de long, complémentaires l'un de l'autre. Un fluorophore, par exemple le groupe EDANS, est fixé à l'un des bras, alors qu'un inhibiteur de fluorescence, par exemple, le groupe DABCYL est fixé à 1 ' autre bras . En l'absence de cible, les deux bras de la sonde s'hybrident l'un sur l'autre et la fluorescence de EDANS est éteinte par le DABCYL. Quand la sonde s 'hybride sur la cible, les deux groupes se' trouvent éloignés l'un de l'autre, et la fluorescence de EDANS est libérée. Ainsi, la présence et même la concentration de l' analyte, est révélée par le signal de fluorescence et l'intensité de ce signal. La mise en oeuvre de cette technique dans un dispositif conforme à 1 ' invention est par exemple la suivante : 1. Préparation de la solution A à analyser, l' analyte étant un acide nucléique,
2. Remplissage du deuxième contenant 7 du dispositif, ainsi que du goulet d'étranglement 5 et du fond 3 du premier contenant par une solution de révélation, contenant les sondes nucléiques précédemment définies nécessaires à la détection de l' analyte.
3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 3 prolongé par le cône 15, 4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond du premier contenant 3 , puis transport magnétique des particules magnétiques dans le deuxième contenant 7, par exemple selon 1-es modalités décrites dans 1 ' exemple 3 ,
5. Chauffage à 60°C de l'ensemble du dispositif, attente de 1 à 2 minutes à cette température.
L' analyte est alors libéré des particules,
6. Transport magnétique des particules magnétiques du deuxième contenant 7 vers le premier contenant, 7. Mise à la température adéquate pour l'hybridation de la sonde nucléique beacon, par exemple 25°C,
8. Lecture de la fluorescence dans le' deuxième contenant 7 par exemple en plaçant le dispositif sous un microscope à épi-fluorescence équipé d'un photomultiplicateur .
L ' avantage de cette procédure par rapport à 1 ' état de l'art est de concentrer dans un rapport alpha/béta 1' analyte, par exemple de 100 fois, et donc de diminuer relativement la fluorescence résiduelle des sondes
"Molecular Beacons", et ainsi augmenter d'autant le rapport signal sur bruit intrinsèque à cette technique de mise en évidence d'un analyte. La sensibilité du test est donc augmentée d'autant.
Exemple 6 : utilisation de l'invention pour mettre en évidence 1 ' analyte à l'aide d'une puce à ADN
Dans cet exemple, 1 ' analyte est mis en évidence par hybridation sur une puce à ADN ; la puce à ADN a l'avantage, par rapport à la technique de marquage présentée à l'exemple 5, de pouvoir faire beaucoup d'hybridations en parallèle, donc d'offrir au biologiste une puissance analytique bien plus grande.
Dans cet exemple, le fond du deuxième contenant 7 est une puce à ADN, constituée par exemple d'une vingtaine de plots d'hybridation. La puce est fabriquée par dépôt d'ADN selon les moyens standards de l'état de l'art des puces à ADN.
La mise en oeuvre de cette technique dans un dispositif .conforme à 1 ' invention peut être par exemple la suivante :
1. Préparation de la solution A à analyser, l' analyte étant un acide nucléique, marqué par un groupement fluorescent, par exemple dé" la fluorescéine, par des moyens classiques de l'état de l'art,
2. Remplissage du deuxième contenant 7 du dispositif, ainsi que du goulet d'étranglement 5 et du fond 3 du premier contenant par le tampon d'hybridation, par exemple : Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100
0,05%, ADN de saumon 0,14 g/ml,
3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 15,
4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond 3 du premier contenant, puis transport magnétique des particules magnétiques dans le deuxième contenant 7, par exemple selon les modalités décrites dans 1 ' exemple 3 , 5. Chauffage à 60°C de l'ensemble du dispositif. L' analyte est alors libéré des particules, 6. Transport magnétique des particules magnétiques du deuxième contenant 7 vers le premier contenant 3 ,
7. Hybridation dans les conditions de température et de durée adéquates pour la puce à ADN considérée. Par exemple, hybridation pendant 30 minutes à 40°C,
8. Lavage par passage dans le deuxième contenant 7,. au moyen de l'entrée et de la sortie de fluide par les ouvertures 21, 22 représenté sur la figure 3, d'une solution de lavage, par exemple Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,5%-,
9. Lecture de la fluorescence présente sur la puce à ADN, par exemple en mettant le dispositif sous un microscope à épi-fluorescence équipé d'une caméra CCD, et en utilisant un grossissement adéquat. Comme dans l'exemple précédent, la concentration de l' analyte avant son hybridation sur la puce à ADN permet une réaction plus rapide de 1 ' analyte sur la puce à ADN. Cette accélération de la cinétique par rapport à l'état de l'art permet, soit de diminuer le temps d'hybridation, soit d'augmenter la sensibilité de détection du système, puisque cette sensibilité est en général limitée par la cinétique d'hybridation de 1' analyte sur la puce à ADN.
Exemple 7 : utilisation de l'invention comme point d'entrée d'un μTAS
Dans cet exemple, l ' invention sert de point d ' entrée à un μTAS plus complexe qu ' un dispositif composé seulement de deux contenants séparés par un goulet d'étranglement. Nous prenons comme exemple de μTAS celui présenté par l'équipe de A. Northrup, qui consiste en une chambre d'amplification, suivie d'une électrophorèse capillaire des produits amplifiés et d'une détection (voir Anal. Che . 1996, 68, 4081-4086) .
Dans cet exemple, le deuxième contenant est en fait une chambre d'amplification par PCR, par exemple fabriquée par les moyens des microtechnologies. Ceci signifie que le deuxième contenant est muni d'un moyen de chauffage, d'un moyen de refroidissement, et d'un capteur de température, ce qui permet d'appliquer à l'échantillon liquide contenu dans le ' deuxième contenant 7 des cycles thermiques. L ' entrée-sortie 21, 22 de fluide coupant ce deuxième contenant est le canal d'injection par électrophorèse de l'échantillon amplifié dans le capillaire de séparation. Le capillaire de séparation n'est pas montré sur nos figures (voir figure 1 de l'article sus-cité), ni les microréservoirs permettant l'application des champs électriques nécessaires à l'injection puis à la séparation par électrophorèse.
Le deuxième contenant contient en outre des culots secs contenant tous les produits nécessaires à l'amplification par PCR ; ces produits sont "glassifiés" par des techniques bien connues, et les culots glassifiés, en forme de bille, contenant les divers produits nécessaires à l'amplification, sont déposés dans le deuxième contenant avant mise en place du couvercle. La fabrication de ces culots est bien décrite dans l'état de la technique, par exemple US-A-4,678,812 et US-A-5 , 275 , 016. Le capillaire de séparation contient en outre un gel de séparation, par exemple de l'hydroxy éthyl cellulose, qui lui-même contient un marqueur • fluorescent de l'ADN, par exemple le thiazole orange. Ainsi, les fragments d'ADN seront marqués par le thiazole orange au cours de leur migration électrophorétique dans le capillaire de séparation.
L'utilisation d'un tel dispositif est par exemple la suivante : 1. Préparation de la solution A à analyser, l' analyte étant un acide nucléique,
2. Remplissage de l'ensemble du dispositif, notamment des capillaires, par la solution d' électrophorèse ; les culots de réactifs présents dans le deuxième contenant commencent à s'hydrater,
3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 15,
4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond du premier contenant
3, puis transport magnétique dans le deuxième contenant 7, selon les modalités de l'exemple 3 ci-dessus,
5. Chauffage à 60°C du deuxième contenant 7. Attente de 10 à 30 minutes selon le culot de réactif à dissoudre. En effet, ce chauffage a principalement pour but d'accélérer la remise en solution des culots de réactifs présents dans le contenant, 6. Cyclage thermique pour effectuer l'opération d'amplification des cibles (il existe des particules magnétiques qui ne gênent pas l'amplification, il n'est donc pas nécessaire de les retirer de la chambre d'amplification), 7. Injection par électrophorèse de l'échantillon amplifié dans le capillaire de sortie, 8. Electrophorèse capillaire dans le capillaire de séparation, par exemple, selon les modalités décrites dans l'article suscité, 9. Détection des fragments amplifiés par exemple par un microscope à épi-fluorescence équipé d'un photomultiplicateur, le champ du microscope étant situé en fin du capillaire de séparation. Dans cet exemple, le couplage de l'invention à un système intégré d'amplification et d' électrophorèse capillaire permet :
• de concentrer l'échantillon avant amplification, par exemple de 100 fois, donc de diminuer le nombre de cycles d'amplification nécessaires (moins 8 cycles environ) , ce qui limite les risques intrinsèques à l'amplification (biais d'amplification selon les séquences, risque de contamination croisée, ...),
• de diminuer le volume de l'échantillon pour l'amplification, donc de diminuer les quantités de réactifs nécessaires à l'amplification d'où un gain de coût sur les réactifs,
• d'augmenter le nombre d'échantillons qu'il est possible de traiter en parallèle dans un même dispositif grâce à la diminution des dimensions de la chambre d'amplification.
Par ailleurs, la rapidité avec laquelle s'effectue l'ensemble de la chaîne, de l'ordre de quelques minutes pour le transport magnétique, de 10 à 15 minutes pour l'amplification et de 1 à 2 minutes pour 1 ' électrophorèse capillaire, permet d'obtenir des résultats d'excellente qualité, sans qu'il soit nécessaire d'isoler les compartiments par des vannes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de transport d'un analyte présent dans une solution A dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique l' analyte fixé sur des particules magnétiques d'un premier contenant à un deuxième contenant via un goulet d'étranglement, le deuxième contenant étant rempli par ladite solution A et/ou par une autre solution.
2. Procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, une solution A dans laquelle 1 ' analyte est fixé sur des particules magnétiques,
, on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
3. Procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la .solution A dans un premier contenant relié via à un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
4. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
5. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on . introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules dans le deuxième contenant .
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique les particules magnétiques libérées de l' analyte hors du deuxième contenant .
8. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement, on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et on transporte par déplacement de liquide 1' analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
9. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de 1 ' échantillon une solution A. dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, - on déplace au moyen d'un système magnétique 1 ' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement, on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et on transporte par déplacement de liquide 1' analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique les particules magnétiques libérées de l' analyte du deuxième contenant au premier contenant via le goulet d'étranglement, ou du goulet d'étranglement audit premier contenant.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans lequel l' analyte est libéré des particules magnétiques par modification des conditions physiques ou chimiques par exemple par chauffage ou par réaction avec au moins une substance présente dans l'autre solution.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel un agent d'immobilisation de l' analyte est fixé sur tout ou partie d'au moins une paroi du deuxième contenant ou de tout support solide présent dans ledit deuxième contenant .
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le goulet d'étranglement est sous la forme d'un capillaire.
14. Procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon dans lequel : on procède à une concentration de 1 ' analyte au moyen d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, et on met en évidence l' analyte dans le deuxième contenant ou dans tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant .
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel l' analyte est choisi parmi un microorganisme tel qu'une bactérie, un champignon, un virus, un composé chimique, une molécule telle qu'un peptide, une protéine, un enzyme, un polysaccharide, un lipide, une lipoprotéine, un lipopolysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un antigène, un anticorps, un facteur de croissance, une cellule tumorale.
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, dans lequel l' analyte étant un acide nucléique, il est mis en évidence par une technologie de puce à acide nucléique, préfèrentiellement à ADN.
17. Dispositif de transport d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant (3) destiné a contenir un liquide et relié via un goulet d'étranglement (5) à un deuxième contenant (7) , et un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé 1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement.
18. Dispositif de concentration d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant (3) de volume α destiné à contenir un liquide relié via un goulet d'étranglement (5) à un deuxième contenant (7), ledit deuxième contenant de volume β plus petit que le volume α du premier contenant, et un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé 1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, dans lequel le premier contenant et/ou le deuxième contenant ont une forme qui converge vers le goulet d'étranglement.
20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, comprenant un évent sous forme de capillaire présent au niveau du deuxième contenant.
21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, dans lequel le système magnétique est constitué d'au moins un aimant externe et/ou une bobine et/ou une bobine intégrée réalisée par un procédé de micro-technologie.
22. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, dans lequel le deuxième contenant et/ou le goulet d'étranglement est/sont muni (s) de canaux d'entrée-sortie de fluides.
23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, dans lequel le goulet d'étranglement, a une section comprise entre 1 μm2 à 1 mm2, préférentiellement entre 100 μm2 et 0,1 mm2.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, dans lequel le rapport des volumes α/β est de 10 à 1000.
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, dans lequel le premier contenant a un volume d'environ 0,1 à 100 μl .
26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 25, dans lequel le deuxième contenant a un volume d'environ 0,01 à 1 μl .
EP01998402A 2000-11-29 2001-11-27 Procedes de concentration d'un analyte present dans un echantillon Expired - Lifetime EP1343586B1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0015417A FR2817343B1 (fr) 2000-11-29 2000-11-29 Procede et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon
FR0015417 2000-11-29
PCT/FR2001/003743 WO2002043865A1 (fr) 2000-11-29 2001-11-27 Procedes et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EP1343586A1 true EP1343586A1 (fr) 2003-09-17
EP1343586B1 EP1343586B1 (fr) 2005-04-20

Family

ID=8857009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP01998402A Expired - Lifetime EP1343586B1 (fr) 2000-11-29 2001-11-27 Procedes de concentration d'un analyte present dans un echantillon

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7569398B2 (fr)
EP (1) EP1343586B1 (fr)
AT (1) ATE293494T1 (fr)
AU (1) AU2002222057A1 (fr)
DE (1) DE60110256T2 (fr)
FR (1) FR2817343B1 (fr)
WO (1) WO2002043865A1 (fr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078224B1 (en) * 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
WO2005008209A2 (fr) * 2003-07-16 2005-01-27 Toyo Boseki Dispositif permettant de separer un compose biologique et procede de separation d'un compose biologique au moyen de ce dispositif
DE10354351B3 (de) * 2003-11-20 2005-06-16 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zur verbesserten Reinigung einer an paramagnetische Mikropartikel gebundenen Substanz
FR2863626B1 (fr) * 2003-12-15 2006-08-04 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif de division d'un echantillon biologique par effet magnetique
DE102004005193B4 (de) * 2004-02-02 2006-08-24 Medion Diagnostics Gmbh Vorrichtung zur Separation einzelner Partikel von Partikel-Agglutinationen
JP2006053090A (ja) * 2004-08-13 2006-02-23 Alps Electric Co Ltd 検査用プレートと、前記検査用プレートを用いた検査方法
WO2006047840A1 (fr) * 2004-11-05 2006-05-11 Interuniversitair Microelektronica Centrum (Imec) Procede de transport de particules magnetiques et dispositifs correspondant
US7502625B2 (en) * 2005-01-20 2009-03-10 Skyworks Solutions, Inc. Integrated multi-band transceiver for use in mobile communication device
EP1907585A4 (fr) * 2005-07-01 2010-04-07 Promega Corp Réseau de particules flottantes destinées à purifier des biomolécules et utilisations de ces particules ou de ce réseau de particules flottantes pour purifier des biomolécules
DE102005039175A1 (de) * 2005-08-18 2007-02-22 Qiagen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Abtrennen von magnetischen Partikeln aus einer Flüssigkeit
US8030034B2 (en) * 2005-12-09 2011-10-04 Promega Corporation Nucleic acid purification with a binding matrix
CN101375166B (zh) 2006-01-25 2013-07-10 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于分析流体的装置
US20100311186A1 (en) * 2006-07-28 2010-12-09 Biosite Incorporated Devices and methods for performing receptor binding assays using magnetic particles
EP1939629A3 (fr) * 2006-08-11 2011-03-09 Samsung Electronics Co., Ltd. Force centrifuge basée selon un dispositif de contrôle de position magnétique et système micro fluide sous forme de disque
CA2691451C (fr) * 2007-06-21 2015-03-24 Sara H. Fan Instruments et receptacles pour effectuer des procedes
WO2009029561A2 (fr) * 2007-08-24 2009-03-05 Advanced Liquid Logic, Inc. Manipulations de perles sur un actionneur à gouttelettes
US20100300978A1 (en) * 2007-09-19 2010-12-02 Agency For Science, Technology And Research Device, system and method for washing and isolating magnetic particles in a continous fluid flow
EP2072133A1 (fr) * 2007-12-20 2009-06-24 Koninklijke Philips Electronics N.V. Dispositif à plusieurs compartiments doté de particules magnétiques
US8470148B2 (en) * 2008-01-17 2013-06-25 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for sample application
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
US8222397B2 (en) * 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
CN102947703A (zh) 2010-06-17 2013-02-27 皇家飞利浦电子股份有限公司 多表位测定
JP6382699B2 (ja) * 2014-11-28 2018-08-29 株式会社東芝 マイクロ分析チップ
CN105424922B (zh) * 2015-12-09 2018-01-19 北京乐普医疗科技有限责任公司 基于磁珠包被抗体的微流控芯片及捕获心肌标志物的方法
DK3501658T3 (da) * 2019-03-19 2021-07-26 Ace Medical Tech Co Ltd Indretning til sortering af biopartikler ved anvendelse af en kraft genereret fra lysinduceret dielektroforese og fremgangsmåde til betjening deraf

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5498392A (en) * 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
WO1994026414A1 (fr) * 1993-05-17 1994-11-24 Syntex (U.S.A.) Inc. Recipient de reaction pour essai par liaison specifique et procede d'utilisation
US5603760A (en) * 1995-09-18 1997-02-18 W. R. Grace & Co.-Conn. Cement admixture capable of inhibiting drying shrinkage and method of using same
US5863502A (en) * 1996-01-24 1999-01-26 Sarnoff Corporation Parallel reaction cassette and associated devices
US6074827A (en) * 1996-07-30 2000-06-13 Aclara Biosciences, Inc. Microfluidic method for nucleic acid purification and processing
DE69709377T2 (de) * 1996-09-04 2002-08-14 Scandinavian Micro Biodevices Mikrofliesssystem für die teilchenanalyse und trennung
FR2758884B1 (fr) * 1997-01-30 1999-04-02 Bio Merieux Procede pour isoler, notamment detecter ou quantifier un analyte dans un milieu
ATE556149T1 (de) * 1999-02-23 2012-05-15 Caliper Life Sciences Inc Manipulation von mikropartikeln in mikrofluidischen systemen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0243865A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE60110256T2 (de) 2006-03-09
ATE293494T1 (de) 2005-05-15
FR2817343A1 (fr) 2002-05-31
EP1343586B1 (fr) 2005-04-20
DE60110256D1 (de) 2005-05-25
US7569398B2 (en) 2009-08-04
AU2002222057A1 (en) 2002-06-11
WO2002043865A1 (fr) 2002-06-06
US20040023273A1 (en) 2004-02-05
FR2817343B1 (fr) 2003-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1343586B1 (fr) Procedes de concentration d'un analyte present dans un echantillon
US7347976B2 (en) Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix
US9250169B2 (en) Selective capture and release of analytes
US20050221281A1 (en) Self-contained microfluidic biochip and apparatus
US20100233824A1 (en) Microfluidic methods and systems for use in detecting analytes
CN103998940B (zh) 芯片装置、操作芯片的制作方法及操作对象成分的方法
CA2487933A1 (fr) Nouveaux ensembles ordonnes d'echantillons a haute densite et technique d'analyse d'analysat
CN102770769B (zh) 旋转柱系统和方法
US20180037960A1 (en) Quantitative detection of pathogens in centrifugal microfluidic disks
JPH11304666A (ja) 試料ハンドリングツールおよびその使用方法
WO2019178033A1 (fr) Découverte de protéines à débit très élevé
Xiang et al. Advances in improvement strategies of digital nucleic acid amplification for pathogen detection
US9903001B1 (en) Quantitative detection of pathogens in centrifugal microfluidic disks
US20190329244A1 (en) Sieve-through vertical flow system for particle-based bioassays
US20100248242A1 (en) Process for concentrating nucleic acid molecules
JP2007263706A (ja) バイオアッセイ用マイクロチップ
WO2020241689A1 (fr) Procédé d'introduction de liquide dans des puits
WO2023195542A1 (fr) Procédé et kit de détection de multiples types de fragments d'acide nucléique cibles
US20040170757A1 (en) Method for depositing a spot product of a product of interest, and use for isolating and/or determining an analyte
JP4935424B2 (ja) 免疫分析チップ
JP2011072210A (ja) センサーチップ及びその使用方法
FR2826454A1 (fr) Cartes d'analyse
US20110158861A1 (en) Volatility-type isolation and purification device
Guo et al. Application of Compact Disc-Type Microfluidic Platform to Biochemical and Biomedical Analysis Review
WO2009128009A1 (fr) Biocapteur à écoulement continu

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20030423

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO SI

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

RTI1 Title (correction)

Free format text: METHODS FOR CONCENTRATING AN ANALYTE PRESENT IN A SAMPLE

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: POUTEAU, PATRICK

Inventor name: GINOT, FREDERIC

Inventor name: PUGET, PIERRE

Inventor name: CAILLAT, PATRICE

RTI1 Title (correction)

Free format text: METHODS FOR CONCENTRATING AN ANALYTE PRESENT IN A SAMPLE

GRAS Grant fee paid

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE

Owner name: BIOMERIEUX SA

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: B1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT;WARNING: LAPSES OF ITALIAN PATENTS WITH EFFECTIVE DATE BEFORE 2007 MAY HAVE OCCURRED AT ANY TIME BEFORE 2007. THE CORRECT EFFECTIVE DATE MAY BE DIFFERENT FROM THE ONE RECORDED.

Effective date: 20050420

Ref country code: IE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050420

Ref country code: NL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050420

Ref country code: AT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050420

Ref country code: FI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050420

Ref country code: TR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050420

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: FG4D

Free format text: NOT ENGLISH

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: EP

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FG4D

Free format text: LANGUAGE OF EP DOCUMENT: FRENCH

REF Corresponds to:

Ref document number: 60110256

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20050525

Kind code of ref document: P

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050720

Ref country code: SE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050720

Ref country code: GR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050720

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: ES

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050731

GBT Gb: translation of ep patent filed (gb section 77(6)(a)/1977)

Effective date: 20050804

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: PT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20050920

NLV1 Nl: lapsed or annulled due to failure to fulfill the requirements of art. 29p and 29m of the patents act
PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CY

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20051127

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LU

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20051130

Ref country code: CH

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20051130

Ref country code: LI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20051130

Ref country code: BE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20051130

Ref country code: MC

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20051130

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FD4D

PLBE No opposition filed within time limit

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

26N No opposition filed

Effective date: 20060123

REG Reference to a national code

Ref country code: CH

Ref legal event code: PL

BERE Be: lapsed

Owner name: BIOMERIEUX SA

Effective date: 20051130

Owner name: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE

Effective date: 20051130

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Payment date: 20131112

Year of fee payment: 13

Ref country code: DE

Payment date: 20131106

Year of fee payment: 13

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Payment date: 20131202

Year of fee payment: 13

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R119

Ref document number: 60110256

Country of ref document: DE

GBPC Gb: european patent ceased through non-payment of renewal fee

Effective date: 20141127

REG Reference to a national code

Ref country code: FR

Ref legal event code: ST

Effective date: 20150731

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20150602

Ref country code: GB

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20141127

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: FR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20141201