RU2395577C1

RU2395577C1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L.- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga) (ВАРИАНТЫ), МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПРОДУЦИРУЕМОЕ ШТАММОМ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ФОРМАТА "СЭНДВИЧ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКА VP40 ВИРУСА ЭБОЛА, СУБТИП ЗАИР (ШТАММ Mainga)

Info

Publication number: RU2395577C1
Application number: RU2008150265/13A
Authority: RU
Inventors: Елена Ивановна Казачинская (RU); Елена Ивановна Казачинская; Алла Владимировна Иванова (RU); Алла Владимировна Иванова; Алла Васильевна Качко (RU); Алла Васильевна Качко; Екатерина Леонидовна Субботина (RU); Екатерина Леонидовна Субботина; Александр Алексеевич Чепурнов (RU); Александр Алексеевич Чепурнов; Иван Алексеевич Разумов (RU); Иван Алексеевич Разумов; Валерий Борисович Локтев (RU); Валерий Борисович Локтев
Priority date: 2008-12-18
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2010-07-27

Abstract

В изобретении созданы штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 4А2, депонированный в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор», являющийся продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), и штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1C1, депонированный в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор», являющийся продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). Изобретение также направлено на получение моноклональных антител 4А2, продуцируемых гибридомой 4А2 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепь) и используемых в качестве захватывающих антиген в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), и моноклональных антител 1C1, продуцируемых гибридомой 1C1 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), используемых в качестве индикаторных меченных биотином в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). Антитела по изобретению используют совместно в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). Изобретение позволяет получать специфические, не конкурирующие между собой за антигенные эпитопы моноклональные антитела, которые при их совместном использовании в иммуноферментной системе формата "сэндвич" обеспечивают высокую достоверность результатов по выявлению матриксного белка VP40 вируса Эбола. 5 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской вирусологии и иммунологии, может быть использовано для проведения иммунодиагностики геморрагической лихорадки Эбола (ГЛЭ).

Вирус Эбола (ВЭ) относится к семейству филовирусов, вызывает тяжелую геморрагическую лихорадку человека с высоким уровнем летальности во время неожиданно возникающих вспышек [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Природный резервуар и переносчики не известны, эффективные средства специфической профилактики для людей отсутствуют. Филовирусы распространяются от человека к человеку через прямой контакт с биологическими жидкостями. Аэрозольный путь передачи также возможен, как показали исследования на экспериментально зараженных животных [7, 8] и высокая смертность среди медицинских работников во время вспышки в Уганде в 2000-2001 гг. [9]. Распространение ВЭ среди человеческой популяции возможно через ввоз обезьян из стран Африки и развитие туризма в данном регионе [10]. Вакцина против ВЭ находится пока на стадии разработки. Полная защита инфицированных морских свинок [11] и обезьян [12] была показана при их иммунизации бивакциной в виде аденовирусоподобных частиц, содержащих белки гликопротеин (GP) и матриксный белок (VP40) нескольких штаммов вирусов Эбола и Марбург. Белок VP40 филовирусов является одним из трех мажорных компонентов, составляя 37,7% (белок VP35 - 24,5% и нуклеопротеин (NP) - 17% соответственно) от массы вириона [13]. ВЭ появляется в культуральной жидкости при заражении культуры клеток Vero и Л-68 на 3-4 сутки, в крови инфицированных морских свинок на 4-7 сутки, в крови обезьян Papio Hamadryas на 7 сутки от заражения (в день появления температуры) и может быть обнаружен методом иммуноферментного анализа (ИФА) [14, 15]. У пациентов, страдающих от ГЛЭ, вирус присутствует в тканях и крови в высоких титрах 10(6)-10(8) вирусных частиц в миллилитре и может быть обнаружен на третий день после начала симптомов [16]. В настоящее время в России нет коммерчески доступных ИФА тест-систем по экспрессному выявлению антигена вируса Эбола для контроля за импортированными животными для зоопарков и исследовательских целей и туристами, прибывшими из стран Африки с симптомами, подобными при ГЛЭ. Препараты очищенных моноклональных антител (МКА) могут служить основой такой системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике [17], которая в России также пока не разработана.

Известны мышиные гибридомы, продуцирующие МКА к белкам вируса Эбола: к рекомбинантному NP - 12 линий [18], к гликопротеину - 2 линии [19], к гликопротеину - одна линия [23]. В работе [20] описаны 9 линий, продуцирующих МКА к матриксному белку VP40 инактивированного тритоном - 100 ВЭ субтип Заир (штамм Mainga), и одна лабораторная ИФА тест-система формата "сэндвич" на основе двух МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы матриксного белка VP40. Эта система успешно выявляет вирион-ассоциированный VP40 из вируссодержащей культуральной среды и инактивированный додецилсульфатом натрия вирус, добавленный в сыворотку крови человека, а также рекомбинатный белок VP40, полученный при инфицировании клеток рекомбинатным вирусом вакцины MVA-T7, содержащим плазмиды, кодирующие ген VP40 ВЭ (субтип Заир).

Техническим результатом является получение таких штаммов гибридных клеток Mus musculus L., которые продуцировали бы специфические МКА, не конкурирующие между собой за антигенные эпитопы, что позволяло бы использовать их в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления белка VP40 ВЭ совместно в качестве "захватывающих" антиген и "индикаторных", меченных биотином, что обеспечит повышение достоверности ИФА при лабораторных исследованиях ВЭ и при конструировании тест-систем для выявления антигена.

Указанный технический результат достигается путем создания Штамма гибридных клеток животного Mus musculus 1. 4А2, депонированного в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор", являющегося продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), и используемых в качестве захватывающих антиген в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).

Указанный технический результат достигается также созданием Штамма гибридных клеток животного Mus musculus l. 1C1, депонированного в Коллекции клеточных культур ГНЦ BБ "Вектор", являющегося продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), и используемых в качестве индикаторных меченных биотином в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вирусаЭбола, субтип Заир (штамм Mainga).

Указанный технический результат достигается также получением моноклональных антител 4А2, продуцируемых штаммом гибридных клеток животного Mus musculus l. 4A2 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющих тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепь), и моноклональных антител 1C1, продуцируемых штаммом гибридных клеток животного Mus musculus 1. 1C1 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), используемых совместно в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).

Также возможно индивидуальное использование МКА в иммунофлуоресцентном и иммуноферментном методах для выявления ВЭ в инфицированных клетках и тканях.

Штаммы получены путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным 5% β-меркаптоэтанолом и 1% додецилсульфатом натрия препаратом ВЭ, субтип Заир (штамм Mainga) [21]. Заявляемые штаммы гибридных клеток получены в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора Российской Федерации и депонированы в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор". Авторское название гибридомных клеточных линий - 4А2 и 1C1.

Родословная штаммов. Штаммы гибридных клеток получены путем слияния клеток мышиной p3-X63/Ag8.653 (NS/1) миеломы с клетками селезенок мышей BALB/c, иммунизированных очищенным, концентрированным, инактивированным препаратом ВЭ. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля фирмы "Sigma" с молекулярным весом 1300-1600 кД по методу [22].

Клетки после слияния выращивали в селективной среде ГАТ в 96-луночных культуральных планшетах. В качестве фидерных клеток использовали перитонеальные макрофаги беспородных мышей. Гибридомы, стабильно продуцирующие специфические МКА, клонировали 3 раза. Выход позитивных клонов в последнем клонировании составил 100%.

Число пассажей к моменту депонирования: 7-10 пассажей.

Маркерные признаки и методы их оценки. Штаммы секретируют мышиные моноклональные иммуноглобулины субкласса IgGl (имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), специфически взаимодействующие с белком VP40 ВЭ. Анализ мышиных иммуноглобулинов проводят методом ИФА, используя в качестве антигена очищенный инактивированный ВЭ, субтип Заир (штамм Mainga) или рекомбинатный белок VP40 (полученный, как описано [26], в результате биосинтеза в клетках Е.coli на основе плазмидной конструкции, включающей полный ген VP40 ВЭ) и антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Культуральные свойства. Среда для культивирования DMEM/F12 с глутамином, пиридоксином, Hepes (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора). Содержание фетальной сыворотки, оптимизированной для гибридом (HyClone, USA) в ростовой среде - 10%. В среду также добавляют 80-160 мкг/мл сульфата гентамицина. Штаммы являются монослойно-суспензионными культурами, в которых до 20% клеток находится в суспензии, не прикрепляясь к поверхности посуды для культивирования. Клетки с поверхности культуральной посуды удаляются раствором трипсина/версена = 1/1 (объем/объем). Посевная доза 200 тысяч кл/мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Индекс пролиферации - не менее 5.

Культивирование гибридом в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma). Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день. Гибридома прививается в 100% случаев. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости, содержащей МКА.

Характеристика полезного продукта. Типирование гибридомных иммуноглобулинов проведено методом твердофазного ИФА с использованием моноспецифических мышиных антител («Sigma», США). МКА относятся к субклассу IgGl. Они специфически взаимодействуют с нативным белком VP40 ВЭ (40 кДа) и рекомбинатным VP40 (40 кДа) в реакции иммуноблота. В ИФА титр МКА в асците составляет 1:6561000. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании. Из одного миллилитра асцитической жидкости можно получить 3-5 мг очищенных МКА.

Криоконсервирование. Среда для замораживания - среда ДМЕМ(М) - 50%, фетальная сыворотка - 40%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота и через 18-24 часа пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80% (по результатам окрашивания 0,25% трипановым синим). Каждая ампула содержит не менее 10 млн/мл клеток.

Изобретение поясняется графическим материалом, представленным на фиг.1-3.

На фиг.1 представлена электрофореграмма очищенных МКА, где:

1, 2 - препараты очищенных МКА 4А2 и 1С1 (по 1 мкл), стрелками обозначены цепи иммуноглобулинов:

т - тяжелая цепь (55 кДа); л - легкая цепь (25 кДа);

3 - белковые маркеры молекулярного веса (10 мкл) (Bio-Rad);

4 - значения молекулярного веса белковых маркеров.

На фиг.2а представлена электрофореграмма нативных белков вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40, где:

1 - значения молекулярного веса белковых маркеров;

2 - белковые маркеры молекулярного веса (10 мкл)(Bio-Rad);

3 - очищенный рекомбинатный белок VP40 (10 мкл);

4 - препарат вируса Эбола (20 мкл), стрелками обозначены вирусные белки;

5 - обозначения вирусных белков.

На фиг.2в представлен иммуноблот нативного и рембинантного белков VP40 вируса Эбола с МКА, где:

1 - препарат вируса Эбола, обработан МКА 4А2 в разведении 1:10000;

2 - препарат вируса Эбола, обработан МКА 1С1 в разведении 1:10000;

3 - рекомбинатный белок VP40, обработан МКА 4А2 в разведении 1:10000;

4 - рекомбинатный белок VP40, обработан МКА 1С1 в разведении 1:10000;

5 - препарат вируса Марбург, обработан МКА 4А2 в разведении 1:10000 (отрицательный контроль);

6 - препарат вируса Марбург, обработан МКА 1С1 в разведении 1:10000 (отрицательный контроль);

7 - лизат E.coli., обработан МКА 4А2 в разведении 1:10000 (отрицательный контроль);

8 - лизат E.coli., обработан МКА 1С1 в разведении 1:10000 (отрицательный контроль).

На фиг.3 представлен график титрования антигена вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 4А2 и 1С1*, где исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1:400 соответствует концентрации 2500 нг/мл;

1С1* - индикаторные МКА, меченные биотином;

в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 вируса Марбург [24];

концентрация МКА для "захвата" антигенов - 10 мкг/мл;

концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1 мкг/мл.

Методика получения заявляемых штаммов.

Штаммы гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1 получают следующим образом. Самок мышей BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") массой 15-20 г иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице.

Для слияния используют соотношение 3/1 селезеночных клеток мышей и клеток мышиной миеломы NS/1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,4 мл 45% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1300-1600. Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. После 3 мин паузы слой ПЭГ медленно разбавляют 5 мл раствора версена, после чего осадок ресуспендируют. Затем клетки снова осаждают (10 мин при 1000 об/мин) и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в пять 96-луночных микроплат (Costar) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавлены 10% фетальной сыворотки коров (Gipco), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина. Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки микроплат (ВНИИМедПолимер) в качестве антигена сорбируют 100-200 нг очищенного ВЭ. Места неспецифического связывания насыщают 0,5% раствором казеина (ICN). Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 45 мин при 37°С. После инкубации лунки промывают 3-5 раз физиологическим раствором, содержащим 0,05% твин-20 (Sigma). Далее в планшеты вносят по 100 мкл антивидового конъюгата (иммуноглобулины кролика против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена) и выдерживают 45 мин при 37°С. Планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию. Результаты анализа определяют на спектрофотометре "Multiscan" (Финляндия). Полученные гибридные штаммы дважды клонируют методом предельных разведений, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Приведенные ниже примеры подробно раскрывают полезные свойства объектов изобретения.

Пример 1. Культивирование гибридных клеток штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1, продуцирующих МКА к белку VP40 ВЭ в организме животных, мышей BALB/c.

Мышам BALB/c (виварий ГНЦВБ "Вектор") весом 20-22 г не менее чем за 10 дней до прививки гибридомных клеток вводят внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл пристана. Культивируемые клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильном растворе Эрла или Хенкса. Через 2-4 недели животным прививают внутрибрюшинно 10 млн гибридных клеток в объеме 1 мл клеточной суспензии. Через 7-10 дней животных усыпляют и из брюшной полости извлекают 3-5 мл асцитической жидкости. Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и в надосадочной жидкости определяют титр МКА с помощью ИФА, как описано выше.

Пример 2. Выделение очищенных моноклональных антител, продуцируемых гибридными культивируемыми клетками штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1. Один объем асцитической жидкости, содержащей МКА, разводят 4 объемами 0,6 М ацетатного буфера (0,04 М лимонной кислоты, 0,2 М натрия ацетата), рН 4,0, и доводят рН до 4,5 с помощью 0,1 N раствора едкого натра. К разведенному образцу добавляют по каплям с постоянным перемешиванием каприловую кислоту из расчета 25 мкл на 1 мл раствора и инкубируют ночь при +4°С. Затем центрифугируют 30 мин при 8000 g и осадок удаляют, а надосадок смешивают с 10-кратным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и устанавливают рН 7,4 раствором 1,0 N едкого натра. Равный объем насыщенного раствора сульфата аммония добавляют к этому раствору, встряхивают и выдерживают ночь при +4°С или 30 мин при +20-25°С. Центрифугируют 15 мин при 5000 g. Надосадок сливают, а осадок растворяют в ФСБ, рН 7,4. Остатки сульфата аммония удаляют путем диализа против 50-100 объемов ФСБ, рН 7,4. Электрофорез очищенных препаратов МКА проводили по методу, описанному в работе [25], в прерывистой буферной системе с использованием 12-15% полиакриламидного геля с 0,1% додецилсульфата натрия в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель содержал 0,0625М трис-HCl (рН 8,8), 0,1% SDS, 10(15)% акриламид, 1% N,N-метиленбисакриламид. Препараты МКА (по 1 мкл) наносили на дорожку в объеме 30 мкл буфера, содержащем 0,0625М трис-HCl (рН 6,8), 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий. Перед нанесением буфер, содержащий МКА, прогревали 3 мин при 95°С. Электрофорез вели в режиме 10 В/см. Окраску геля проводили при помощи Кумасси G-250-Очищенные препараты в виде электрофореграммы представлены на фиг.1.

Пример 3. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1 с ВЭ или рекомбинатным белком VP40.

ИФА проводили на полистироловых планшетах; антиген в рабочем разведении (очищенный и инактивированный ВЭ или рекомбинатный белок VP40) сорбировали в ФСБ, рН 7,4 в объеме 100 мкл/лунка на планшеты. Места неспецифического связывания насыщали при 37°С 45 минут 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0.145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0,1% Tween-20 (Serva), pH-7,4) и затем инкубировали с очищенными МКА 45 минут при 37°С. Специфическое связывание МКА с антигеном выявляли антивидовыми меченными пероксидазой антителами против IgG мыши. Далее добавляли хромоген, 0,1% O-фенилендиамин, в нитратно-фосфатном буфере (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М Na₂HPO₃, pH 5,0) с 0,03% перекиси водорода). Останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку 1 N HCl и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Multiscan" с использованием светофильтра с максимумом пропускания 492 нм. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали гомологичные нормальную (неиммунную) и гипериммунную сыворотки соответственно.

Пример 4. Выявление в иммуноблоте взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1 с белком VP40 ВЭ (субтип Заир) и рекомбинатным белком VP40.

Вирусные белки и рекомбинатный белок VP40 после 12% ПААГ-электрофореза были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере ТСБ-Твин (0,145 М хлористого натрия, 20 mM Трис-HCl, 5 mM PMSF (Sigma), 0.1% Tween-20 (Serva), pH-7,4) при 37°С 2 часа. Затем отдельные полоски мембраны инкубировали с очищенными МКА 4 часа при 20-22°С. Специфическое связывание антител, взаимодействующих с вирусными белками, выявляли с помощью конъюгата антивидовых антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена. В качестве отрицательного контроля использовали полоски мембраны с перенесенными после электрофореза инактивированным вирусом Марбург [24] и лизатом Е.coli., также обработанными МКА. Результаты представлены на фиг 2а и 2в.

Пример 5. Приготовление конъюгатов МКА с биотином.

Для биотинилирования моноклональных иммуноглобулинов использовали следующую методику: готовили свежий раствор NSB (N-hydroxysuccinimidobiotin), для этого растворяли 2 мг биотина в 0,5 мл ДМСО и доводили объем до 2 мл. Затем готовили раствор очищенных МКА (в 0,1М NaHCO₃ pH 9,0) в концентрации 1 мг/мл. Раствор NSB капельно добавляли к раствору иммуноглобулинов в объемном соотношении 1/1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем доводили объем раствора до 1 мл 0,05М фосфатным буфером (PBS) с рН 7,0, содержащем 0,15М натрия хлорида и 0,1% азида натрия. Диализовали против фосфатного буфера. Процесс включения биотина в иммуноглобулины контролировали титрованием меченых МКА на антигене, иммобилизованном на пластик, с конъюгатом пероксидазы со стрептовидином.

Пример 6. Конкурентный ИФА формата "сэндвич" для выявления нативного белка VP40 ВЭ, субтип Заир (штамм Mainga), и рекомбинатного белка VP40.

В лунках высокосорбционных полистироловых планшетов (“Testiks” или "Nunc") сорбировали очищенные МКА 4А2 в 0,5 М карбонатном буфере (рН 9,0) в объеме 100 мкл в рабочей концентрации (10 мкг/мл) при 22°С в течение 12 ч. Места для неспецифического связывания антител на планшетах насыщали 0,5% раствором казеина и выдерживали при 37°С в течение 30 минут. Титрование антигена (инактивированный вирус или рекомбинантный белок) проводили с разведения 1:400 двухкратным шагом в течение ночи при 4°С или при 37°С в течение часа. Затем в лунки планшетов вносили конъюгат МКА 1С1 с биотином в рабочем разведении (1 мкг/мл), выдерживали при 37°С в течение часа и после 3-х кратной отмывки лунок вносили в них конъюгат стрептавидина с пероксидазой. Специфическое связывание антител, меченных биотином, с конъюгатом выявляли жидкой субстратной системой ТМБ (3,3', 5,5' - Tetramethylbenzidine, Sigma) no 100 мкл на лунку. Выдерживали планшеты 30 мин в темноте, останавливали реакцию добавлением 100 мкл на лунку IN соляной кислоты и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре "Uniscan" при длине волны 450 нм. Положительным считали результат измерения ОП в лунке, превышающий в 2 раза таковой для лунки с отрицательным контролем. Для отрицательного контроля связывания антител с антигеном использовали пару МКА, выявляющих белок VP40 вируса Марбург. График титрования антигенов представлен на фиг.3.

Вышеприведенные свойства штаммов гибридных клеток Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1 (авторское название клеточных линий 4А2 и 1С1) позволяют заключить, что впервые на основе мышиной миеломы получены гибридомы Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1 - продуценты МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы белка VP40 ВЭ. Штаммы гибридных клеток обеспечивают получение мышиных моноклональных иммуноглобулинов класса IgGl в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитической жидкости. Очищенные МКА специфично реагировали в ИФА с ВЭ и рекомбинатным белком VP40 (титр МКА составлял не менее 1:6561000); выявляли в иммуноблоте вирус-ассоциированный белок VP40 и рекомбинатный белок VP40, полученный в результате биосинтеза в клетках Е.coli на основе плазмидной конструкции, включающей полный ген VP40 ВЭ. Совместное использование МКА в ИФА в формате "сэндвич" позволяет выявлять нативный и рекомбинатный белки с чувствительностью менее 1нг/мл. Использование данных препаратов МКА и рекомбинатного белка VP40 в качестве положительного контроля на антиген позволит эффективно выявлять случаи ГЛЭ на территории России в формате ИФА "сэндвич".

Вышеуказанные свойства штаммов Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" - 4А2 и Mus musculus L. ГНЦ ВБ "Вектор" 1С1 (авторское название клеточных линий 4А2 и 1С1) отличают их от всех описанных ранее гибридом, продуцирующих МКА к белкам вируса Эбола.

Источники информации

1. Bowen ET, Lloyd G, Harris WJ, Platt GS, Baskerville A.Vella ЕЕ. / Viral haemorrhagic fever in southern Sudan and northern Zaire. // Preliminary stadies on the aetiological agent. Lancet 1977. 1:571-573.

2. World Health organization reports 1995, 2007. / Ebola haemorrhagic fever in Zaire.

3. World Health organization reports 1996, 1997, 2001, 2002. / Ebola haemorrhagic fever in Gabon.

4. World Health organization reports 2000, 2001, 2007. / Ebola haemorrhagic fever in Uganda.

5. World Health organization reports 2002, 2003, 2005. / Ebola haemorrhagic fever in Congo

6. World Health organization report 2004. / Ebola haemorrhagic fever in Sudan.

7. Пьянков О.В., Сергеев А.Н., Пьянкова О.Г., Перебоева Л.А. / Патологические изменения в организме приматов, аэрозольно инфицированных вирусом Эбола. // Изучение и профилактика особоопасных вирусных инфекций. Межведомственная конференция 7-8 апреля 1993 г., Кольцово, тезисы докладов.

8. Johnson E, Jaax N, White J, Jahrling P. / Lethal experimental infection of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. // Int J Exp Pathol 1995 / 76(4):227-36.

9. World Health organization report 3 January 2001. / Ebola haemorrhagic fever in Uganda.

10. Science News. ScienceDaily Aug.31, 2005. / Poaching, logging, and outbreaks of Ebola threaten central african gorillas and chimpanzees.

11. Swenson D, Warfield KL, Negley DL, Schmaljohn A, Bavari S. / Virus-like particles exhibit potential as pan-filovirus vaccine for both Ebola and Marburg viral infections. // Vaccine 23. 2005, pp.3033-3042.

12. Swenson D, Wang D, Luo M, Warfield KL, Woraratanadharm J, Holman DH, Dong JY, Pratt WD. / Complete protection of nonhuman primates against multistrain Ebola and Marburg virus infections. // Clin Vaccine Immunol. 2008. 15(3):460-7.

13. Elliott LH, Kiley MP, McCormick JB. / Descriptive analysis of Ebola virus protein. // Virology 1985. 147. PP.169-176.

14. Мерзликин Н.В., Чепурнов А.А., Истомина Н.Н., Офицеров В.И., Воробьева М.С. / Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола. // Журнал "Вопросы вирусологии" №1, 1995. С.31-35.

15. Мерзликин Н.В. / Иммуноферментные тест-системы для изучения лихорадки Эбола. // Автореферат диссертации канд.биол.наук. Кольцове 1995.

16. Rowe AK, Bertolli J, Khan AS at all and Ksiazek TG. / Clinical, virologic and immunologic follow up of convalescent Ebola haemorrhagic fever patients and their household contacts, Kikwit Democratic Republic of the Congo. // J Infect Dis, 1999. 179 (1), p.28-35.

17. Towner JS, Rollin PE, Bausch DG, Sanchez A, Crary SM, Vincent M, Lee WF, Spiropoulou CF, Ksiazek TG, Lukwiya M, Kaducu F, Downing R, Nichol ST. / Rapid diagnosis of Ebola fever by reverse transcription-PCR in an outbreak setting and assessment of patient viral load as a predictor of outcome. // J Virol 2004. 78(8):4330-41.

18. Niikura M, Ikegami T, Saijo M, Kurane I, Miranda M, Morikawa S. / Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein. // Journal of Clinical Microbiology 2001. 39(9):3267-71.

19. Luch A, Grunov R, Otterbein C, Moller P, Feldmann H, Becker S. / Production of monoclonal antibolies and development of an antigen capture ELISA directed against envelope glycoprotein GP of Ebola virus. // Med Microbiol Immunol 2004. 193:181-187.

20. Luch A, Grunov R, Moller P, Feldmann H, Becker S. / Development, characterization and use of monoclonal VP40-antibodies for the detection of Ebola virus. // Journal of Virological Methods 111, pp.21-28. 2003.

21. Чепурнов А.А., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И., Чепурнова Т.С., Волчков В.Е., Истомина Н.И., Кузьмин В.А., Воробьева М.С. / Получение очищенного вируса Эбола. // Журнал "Вопросы вирусологии" №6, 1994. С.254-257.

22. Gefler ML, Margulies DH, Schaff MD. / A simple method for polyethylene glycol promoted hybridization of mouse myeloma cells. // Somat Cell Genet 1977. V3, pp.231-236.

23. Ручко С.В., Лебедев В.Н., Пащенко Ю.И., Борисевич Г.В., Хамитов Р.А., Семенова И.С., Миронов А.Н. / Штамм гибридных клеток Э4/N-6G5 животных MUS MUSCULUS L., продуцирующих моноклональные антитела к вирусу Эбола. / Патент РФ №2186106, опубликован 27.07.2002.

24. И.А.Разумов, Е.Ф.Беланов, А.А.Букреев, Е.И.Казачинская. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеризация. / Вопросы вирусологии N6. 1998, с.274-279.

25. Остерман А.А. / Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. // Москва, 1981. С.37-64.

26. А.В.Сорокин, Е.И.Казачинская, А.В.Качко, А.В.Иванова, А.А.Букреев, И.А.Разумов. / Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург. / Вопросы вирусологии N5. 1999, с.206-213.

Claims

1. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 4A2, депонированный в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор", являющийся продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), и используемых в качестве захватывающих антиген в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).

2. Моноклональное антитело 4A2, продуцируемое штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 4A2 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), используемые в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).

3. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1C1, депонированный в Коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор", являющийся продуцентом моноклональных антител, специфичных к матриксному белку VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), и используемых в качестве индикаторных меченных биотином в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).

4. Моноклональное антитело 1C1, продуцируемое штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 1C1 (субкласс иммуноглобулинов IgG1, имеющие тяжелую 55 кДа и легкую 25 кДа цепи), используемые в иммуноферментной системе формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga).

5. Набор для иммуноферментной тест-системы формата "сэндвич" для выявления матриксного белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga), включающий моноклональные антитела 4А2, продуцируемые штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 4А2 и сорбированные на полистироловых планшетах, конъюгаты биотина с моноклональными антителами 1С1, продуцируемые штаммом гибридных клеток животного Mus musculus L. 1C1, конъюгат стрептавидина с пероксидазой и тетраметилбензидин, количественное содержание которых в наборе достаточно для проведения иммуноферментной реакции.