RU2545720C1 - ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК А4С2/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ - Google Patents
ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК А4С2/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2545720C1 RU2545720C1 RU2013153452/10A RU2013153452A RU2545720C1 RU 2545720 C1 RU2545720 C1 RU 2545720C1 RU 2013153452/10 A RU2013153452/10 A RU 2013153452/10A RU 2013153452 A RU2013153452 A RU 2013153452A RU 2545720 C1 RU2545720 C1 RU 2545720C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- subline
- virus
- swine fever
- african swine
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается перевиваемой гибридной сублинии клеток A4C2/9к SUS SCROFA. Представленная сублиния клеток A4C2/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС. В качестве ростовой среды используется среда Игла - MEM с 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/мл. Митотический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет 25-35. Сублиния клеток депонирована в Специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии под №87. Охарактеризованное изобретение позволяет выделить вирус африканской чумы свиней без предварительной адаптации в реакции гемадсорбции и обеспечивает его накопление в титре до 6,0-6,5 lg ГАЕ50/см3. 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии, и представляет собой сублинию внутривидовых гибридных клеток A4C2/9к для выделения, определения инфекционной активности и типовой принадлежности вируса африканской чумы свиней (АЧС).
Установлено, что лимфоцитоподобные клетки более чувствительны к вирусу АЧС, чем эпителиоподобные клетки. Кроме того, известны способы повышения титра вируса АЧС путем перевода культивирования клеток и вируса в питательную среду, содержащую сыворотку крови свиней [1].
Известна перевиваемая линия клеток A4C2, которая является гибридной линией клеток СПЭВ ТК- и представлена 2-мя типами клеток: эпителиоподобные, лимфоцитоподобные. Эпителиоподобные клетки обладают высокими адгезивными свойствами. Лимфоцитоподобные - низкоадгезивными свойствами и накапливаются, кроме мультислоя, в культуральной жидкости на 3-6 сутки культивирования в концентрации 50-100 тыс. кл/мл. Основная среда культивирования для постоянного поддержания культуры клеток 199 или Игла - МЕМ с 10-20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота или телят-доноров. Линия клеток чувствительна к вирусам классической чумы свиней, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, энцефаломиокардита свиней и др. [2].
В вирусологии известны перевиваемые линии клеток чувствительные к вирусу африканской чумы свиней, такие как ПСГК-60, ППК-666, CV-1, COS-1 [3]. Однако они имеют ряд недостатков: необходима предварительная адаптация вируса к перевиваемой линии клеток, вирус АЧС размножается в них без проявления гемадсорбции.
Целью нашего изобретения являлось получение высокочувствительной линии клеток к вирусу АЧС методом направленной селекции клеток, по принципу увеличения числа лимфоцитоподобных клеток и с последующей их адаптацией к росту в питательной среде с сывороткой крови свиньи.
Поставленная цель достигается тем, что перевиваемая линия клеток A4C2 чувствительна к вирусу АЧС, и вирус накапливается в ней в титре 2,5-3,0 lg ГАЕ50/см3.
Суть изобретения: получена сублиния внутривидовых гибридных клеток СПЭВ ТК- с лимфоцитоподобными клетками свиньи. Сублиния позволяет выделить вирус африканской чумы свиней без предварительной адаптации в реакции гемадсорбции и обеспечивает его накопление в титре до 6,0-6,5 lg ГАЕ50/см3.
Получение. Перевиваемую линию клеток A4C2 выращивали при температуре 37±0,5°C в течение 6-7 суток, поддерживая pH среды в пределах 7,2-7,6, с периодическим добавлением 7,5% NaHCO3. Учитывая способность клеток переходить в суспензию по мере зарастания монослоя, количество их в популяции увеличивали путем осаждения. Культуральную среду центрифугировали 15 минут при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендировали в 5-6 см3 питательной среды и подсчитывали клетки. Концентрацию клеток доводили до посадочной 80-100 тыс. клеток/мл и культивировали в питательной среде Игла - MEM с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Аналогично проводили 10 пассажей. В результате получена новая сублиния клеток, культуральные свойства которой оставались стабильными в течение следующих 20 пассажей (срок наблюдения).
Учитывая, что, как правило, вирус АЧС культивируют в поддерживающей среде, содержащей свиную сыворотку, осуществляли адаптацию культуры клеток к выращиванию в среде, постепенно увеличивая содержание сыворотки крови свиньи до полной замены фетальной сыворотки крупного рогатого скота на сыворотку крови свиньи с конечной концентрацией 10% в среде Игла - MEM.
В течение 15 последовательных пассажей культура сохранила свои основные цитоморфологические характеристики. Клетки при пересеве с коэффициентами 1:3, 1:5 формировали монослой на 2-3 сутки, который сохранялся без смены среды в течение 14 суток.
Морфологическая характеристика. Сублиния представлена лимфоцитоподобными клетками с плотными ядрами и узким ободком цитоплазмы, обладающие низкоадгезивными свойствами, и накапливаются в культуральной жидкости на 5 сутки культивирования в концентрации 500-550 тыс. кл/см3, а также эпителиоподобными клетками полигональной формой, плотно примыкают друг к другу, обладают высокими адгезивными свойствами. Культура представлена в монослое эпителиоподобными клетками до 30-40% и лимфоцитоподобными клетками 60-70% (таблица 1).
Модальное число хромосом 40 имеют 46% клеток популяции. Разброс числа хромосом составляет 38-45.
Таблица 1 | |||
Сравнительная характеристика перевиваемой линий клеток A4C2 и сублинии клеток A4C2/9к | |||
№ п/п | Характеристика | A4C2 | Сублиния A4C2/9к |
1 | процент лимфоцитоподобных клеток | 30-40% | 60-70% |
2 | посевная концентрация, тыс. клеток/мл | 80-100 | 80-100 |
3 | среда для культивирования | Игла - MEM | Игла - MEM |
4 | сыворотка крови | фетальная КРС | свиньи |
5 | накопление вируса АЧС, lg ГАЕ50/см3 | 3,0±0,12 | 6,5±0,14 |
Культуральные свойства. В качестве ростовой среды используется среда Игла - MEM с 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/см3. Для снятия клеток используют 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:9. Коэффициент пересева (1:3)-(1:5). Сбор клеток в суспензии осуществляют методом осаждения. Митотический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет 25-35.
Криоконсервацию культуры осуществляют в криозащитной среде, состоящей из 60% среды Игла, 30% сыворотки свиньи и 10% глицерина. Режим замораживания: эквилибрация при 4°C в течение 1 часа, далее снижение температуры до минус 70°C. Затем помещают в жидкий азот при минус 196°C. Количество жизнеспособных клеток после размораживания составляет 80-95%.
Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы, микроплазмы не обнаружены.
Пример 1. Культивирование сублинии клеток A4C2/9к
Культуру выращивают на питательной среде Игла - MEM, содержащей 10% сыворотки крови свиньи. Посевная концентрация 80-100 тыс. клеток/см3. Для снятия клеток используют 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:9. Коэффициент пересева 1:3-1:5. Сбор клеток в суспензии осуществляют методом осаждения. Монослой формируется на 2 сутки культивирования.
Пример 2. Выделение эпизоотического вируса
Культуру клеток выращивают на чашках Карреля, инфицируют вирусом АЧС с адсорбцией вируса в течение 60 минут и заменой ростовой питательной среды на поддерживающую с 2% сыворотки крови свиньи. Через 24 часа вносят по 0,1 см3 0,5% взвеси эритроцитов свиней. Инфицированные культуры клеток инкубируют при температуре 37±0,5°C в течение 5-7 суток. На поверхности инфицированных клеток отмечают специфическую гемадсорбцию, которая характеризуется многослойным прикреплением к ним эритроцитов свиней.
Сублиния клеток A4C2/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС по сравнению с другими перевиваемыми линиями CV-1, Vero, РК-15, кроме того, вирус АЧС размножается в нем с проявлением гемадсорбции.
Пример 3. Определение типовой принадлежности вируса АЧС
Культуру выращивают в 24 - луночных культуральных планшетах, инфицируют вирусом АЧС с множественностью заражения 0,1 ТЦД50/кл с адсорбцией вируса в течение 60 минут, затем вносят поддерживающую среду Игла - MEM с 2% сыворотки крови свиньи и по 0,1 см3 специфической сыворотки и 0,1 см3 0,5% взвеси эритроцитов свиней. Культуры клеток инкубируют при 37°C в течение 5-7 суток. Учет реакции проводят аналогично реакции задержки гемадсорбции в культуре клеток КМС.
Культура клеток костного мозга свиней является переживающей клеточной системой, и чувствительность клеток зависит от партии клеток. Сублиния клеток A4C2/9к является стабильной перевиваемой клеточной линией, которая обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС. Применение A4C2/9к для выявления, определения инфекционной активности и типовой принадлежности вируса АЧС позволяет оптимизировать условия и стандартизировать методы исследований.
Список использованных источников
1. Калантаенко Ю.Ф. Выращивание вируса африканской чумы свиней в культуре перевиваемых клеток: дис. … канд. вет. наук. 16.00.03 / Калантаенко Юрий Федорович. - Покров, 1982. - 57 с.
2. Патент РФ 2082758, C12N 5/06. Штамм внутривидовых гибридных клеток Suis Domestica, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней / Дьяконов Л.П., Майджи Е.В., Герасимов В.Н., Гальнбек Т.В.; Дудар Л.Н.; Солдатова Н.В.; Федорова Е.Е.; Егорова А.И.; ГНУ ВИЭВ. - №94026140/13; заявл. 14.07.1994; опубл. 27.06.1997.
3. Apoptosis induced in an early step of African swine virus entry into Vero cell does not require virus replication / A.L. Carrascosa, M.J. Bustos, M.L. Nogal [et al.] // J. Virol. - 2002. - Vol.294. - P.372-382.
Claims (1)
- Перевиваемая гибридная сублиния клеток A4C2/9к SUS SCROFA, используемая для вирусологических исследований вируса африканской чумы свиней, депонирована в Специализированной коллекции клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии под №87.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013153452/10A RU2545720C1 (ru) | 2013-12-03 | 2013-12-03 | ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК А4С2/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013153452/10A RU2545720C1 (ru) | 2013-12-03 | 2013-12-03 | ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК А4С2/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2545720C1 true RU2545720C1 (ru) | 2015-04-10 |
Family
ID=53295555
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013153452/10A RU2545720C1 (ru) | 2013-12-03 | 2013-12-03 | ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК А4С2/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2545720C1 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2082758C1 (ru) * | 1994-07-14 | 1997-06-27 | Дьяконов Лев Петрович | Штамм внутривидовых гибридных клеток suis domesfice, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней |
US20100158947A1 (en) * | 2007-07-27 | 2010-06-24 | Ghent University | Permissive cells and uses thereof |
RU2506310C1 (ru) * | 2012-07-23 | 2014-02-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ПОРОСЕНКА Sus scrofa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ |
-
2013
- 2013-12-03 RU RU2013153452/10A patent/RU2545720C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2082758C1 (ru) * | 1994-07-14 | 1997-06-27 | Дьяконов Лев Петрович | Штамм внутривидовых гибридных клеток suis domesfice, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней |
US20100158947A1 (en) * | 2007-07-27 | 2010-06-24 | Ghent University | Permissive cells and uses thereof |
RU2506310C1 (ru) * | 2012-07-23 | 2014-02-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии | ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ПОРОСЕНКА Sus scrofa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN100562567C (zh) | 用于生产目的物质的禽细胞系 | |
CN1692156B (zh) | 在无血清条件下培养原代细胞和扩增病毒的方法 | |
CN103396990A (zh) | 一种制备间充质干细胞的方法 | |
CN103667176A (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
CN101402943A (zh) | 一种体外诱导和培养多潜能干细胞的方法 | |
CN113144185A (zh) | 一种传染性造血器官坏死病疫苗及其病毒在胖头鱥上皮细胞上扩增的方法 | |
Mashkour et al. | Discovery of an Australian Chelonia mydas papillomavirus via green turtle primary cell culture and qPCR | |
Chaudhary et al. | Establishment and characterization of an epithelial cell line from thymus of Catla catla (Hamilton, 1822) | |
CN106119191A (zh) | 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及临床化制备方法 | |
Zimmer et al. | Mycoplasma-like organisms: occurrence with the larvae and adults of a marine bryozoan | |
RU2545720C1 (ru) | ПЕРЕВИВАЕМАЯ ГИБРИДНАЯ СУБЛИНИЯ КЛЕТОК А4С2/9к SUS SCROFA, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ | |
RU2335537C2 (ru) | ЛИНИЯ КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ КОЗЫ ДОМАШНЕЙ Capra hircus L. ЯДК-04 ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ | |
CN104140951B (zh) | 一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法 | |
CN110305844A (zh) | 一种鲫鱼脊髓组织细胞系及其应用 | |
KR101358973B1 (ko) | 트리할로오스를 이용한 정원줄기세포의 동결보존 방법 | |
RU2488631C1 (ru) | ЛИНИЯ КЛЕТОК ПОЧКИ ТЕЛЕНКА Bos taurus RBT (Rene Bos Taurus) ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ | |
CN109402068A (zh) | 一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法 | |
Wang et al. | A grafting technique for efficiently transplanting transgenic regenerated plants of cotton | |
CN104805053A (zh) | 珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用 | |
CN110283793B (zh) | 一种分离和培养猪伪狂犬病病毒的方法 | |
US20150376569A1 (en) | Production of avian embryo cells | |
EP3411064A1 (en) | Methods of producing viruses | |
RU2082758C1 (ru) | Штамм внутривидовых гибридных клеток suis domesfice, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней | |
RU2506310C1 (ru) | ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ПОРОСЕНКА Sus scrofa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ | |
RU2306334C2 (ru) | МЕЖВИДОВАЯ ЛИНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (Ovis aries) С ЛИМФОЦИТАМИ КРОЛИКА (ПО-TK-×ЛК) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161204 |