WO1990006952A1 - Chemically modified granulocyte colony stimulating factor - Google Patents

Description

明 細 化学修飾顆粒球コ Π ニ ー 刺激因子

[ 技術分野 ]

こ の発明 は 、 顆粉 球 コ ロ ニ ー 刺激因子 （ G — C S F ) の化学 修飾 に 関 し 、 こ の修飾 は G — C S F の化学的及 び /又 は生 理学 的性質を変え 得 る お のであ る 。

[ 背景技術 ]

ヒ 卜 G — C S F は 、 造血促進因子の一つ で あ り 、 ヒ 卜 膀胱癌 細胞系 5637 ( ATCC HT8-9) の培養液中 に 存在 し て い る こ と が示 さ れて い る （ ゥ エ ル 卜 等 ： Proc. Nat l . Acad . Sc i . U. S. A. 82 1526- 1530, ( 1985 ) ) 。 ま た こ の遺伝子を コ ー ド す る D N A 配列 が決定 さ れ （ 特表昭 63 - 500636 ) 、 遣伝子耝換え に よ る ヒ 卜 G 一 C S F の生産が 可 能 と な っ て いる 。

ヒ 卜 G — C S F は 、 通常の造血障害の治療や化学療法又 は放 射線療法 に よ る造血障害の 治療 ， 骨髄移植時或 は創傷治癒熱症 治療及び細菌性炎症治療 に 有効で あ る （'ゥ エ ル 卜 等 ； 前述 ） 。

一方、 一般 に 生 理活性蛋 白質 を投与 し た 時 に 、 生体内 に お け る ク リ ア ラ ン ス が速い ため に、 その薬効 が短時間 し か得 ら れな い こ と がある 。 ま た 、 蛋白質の疎水性が高い場合 に は 、 その安 定性に 問題が生 じ る場合があ る 。

この様な血中停滞時間 の延長や安定性の改善 、 或は抗原性 の 消失を 目 的 と し て 、 ポ リ エチ レ ング リ コ ー ルで生理活性蛋 白質 を修飾 する方法が知 ら れて いる 。 例 えば 、 特表昭 62 - 289522で は、 ポ リ エ チ レ ング リ コ ール等で修飾 し た T N F の免疫原性の 低下につ いて 開示さ れて い る 。 ま た 、 特表昭 62 - 503171で は 、 ポ リ エチ レ ング リ コ ール等で俊飾 し た I L — 2 , I F N — /3 の 水溶液中での凝集性の低下， 血 中半減期 の延長 ， 免疫原性の減 少が開示さ れて い る 。 こ の他にもプラズ ミ ノ ー ゲン活性化因子 ( 特表昭 63-60938 ) や I L — 2 , 1 F N - 7 , S O D ( 特表昭 63-10800 ) 並び に I A P ( 特表昭 63 - 126900) で 、 ポ リ エチ レ ング リ コ ール修飾に よ る血中半減期 の延長或い は抗原性 、 免疫 原性の消失が開示さ れている 。

しかし 、 いず れの場合も 、 ヒ 卜 G — C S F に ポ リ エ チ レング リ コ ールを俊飾させ た と きに 予想さ れる生物学的活性 ， 薬理動 • -態の改善効果 につ いて は開示さ れて いな い 。 - ヒ 卜 G— C S F を体内 に投与 し た 時、 生体内 に お ける血中停 滞時間 を延長 し 、 そ の結果 、 期待 し 得る薬効 の持続性を よ り 高 め る こ と が望 ま れて い る 。 更 に は 、 白 血 球減少時 に お る 白血 球の 回復を よ り 早め る よ う な ヒ 卜 G — C S F が望 ま れて い る 。

[ 発 明 の 開示 ]

ヒ 卜 G — C S F に お け る こ の様な 問題を解決す べ く 、 本発明 者等 は検討を重ね た結果 、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルを ヒ 卜 G —

C S F に 結合 さ せ る こ と に よ っ て 、 J" 記課題を解決で き る こ と' を見出 し 、 本発明 に 到達 し た 。

本発明 に お け る ヒ 卜 G — C S F は 、 遺伝子組換え に よ っ て 大 腸菌 ， 動物細胞等の宿主を形質転換 し て得た 形質転換体か ら 産 生せ し め単離精製 し て 得 ら れた も のであ ればいず れの も ので も 使用 す る こ と が で き る 。

し か し 、 そ れ ら の中で も純度良 く 均質大量 に 入手で き る 、 実 質的 に 次 の ア ミ ノ 酸配列 を有す る遺伝子耝換 え大腸菌 に よ り 産 生 さ れた ヒ 卜 G — C S F が特 に 好 ま し い も ので あ る 。

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u ( 18 H )

- -

Z6riO/68df/lDd 690/06 OAV 上記の ヒ 卜 G — C S F は 、 例 え ば特表 昭 6 3 - 5 0 0 6 3 6に 開示の 方法 に従 い得る こ と ができる 。 こ こで 「実質的 」 と は 、 ァ ミ ノ 酸配列が同一 で あ る場合の他 に 、 天然 ヒ 卜 G — C S F 蛋 白 と の 間 に 有害な機能的非類似性を生 じ さ せ な い よ う な Ί 以上 の ア ミ ノ 酸変化 （ 即 ち 欠失 . 付加 ， 挿入 ， 置換 ） を含み得 る こ と を 意 味す る 。

更 に 好 ま し く は 、 実質 的 に 前記の ア ミ ノ 酸配 列 を 有 す る ポ リ ペプ チ ド に お い て 、 少な く と も 1 つ 以上の リ ジ ン残基 、 或い は 少な く と も Ί つ 以上 の ァ スパラ ギ ン酸残基 か グル タ ミ ン酸残基 を持つ も の を使用 す る 。

本発明 に お い て 前記 ヒ 卜 G — C S F と ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル と は 、 ポ リ ペプチ ド の ア ミ ノ 酸残基を介 し て 互い に 共有結合 し て いる 。 該残基は遊離 ア ミ ノ 基或い は遊雞 カ ルポキ シル基等 を有す る任意の反応性 ア ミ ノ 酸で あ り 、 活性化 さ れた ポ リ ェ チ レ ンダ リ コ ールの反応性基が こ れ ら 遊離 ア ミ ノ 基或い は遊離 力 ルポキ シル基等 に 連結さ れる 。 遊離 ア ミ ノ 基を有 す る ア ミ ノ 酸 残基 と し て は リ ジ ン或い は NI 末端 ア ミ ノ 酸残基が 、 遊離 力 ルポ キ シル基を有す る ア ミ ノ 酸残基 と し て は ァ スパ ラ ギ ン酸 ， グル タ ミ ン酸或い は C 末端 ア ミ ノ 酸残基 が 、 そ れぞれ挙げ ら れる 。 使用 す る ポ リ エ チ レ ング リ コ ー ル の 分 子 fi は 特定 の も の に 限定される必要 はないが 、 通常約 5 00〜 20 , 000、 好ま し く は約 4， 000〜 1 0 , 000のもの が用 い ら れる 。 ポ リ エチ レ ング リ コ ールは 、 末端反応性基 （ ス ぺ ーサ 一 ） を 介 し て ヒ 卜 G — C S F 上に結合さ れる 。 スぺ ー サー を有す る ポ リ エチ レング リ コ ールを 、 活性型ポ リ エチ レ ング リ コ ール と称 する 。 スぺ ーサ一 は、 例 えば遊離ア ミ ノ 基 と ポ リ エチ レ ン グ リ コ ール と の結合を仲介する も の 、 或い は遊離 力 ルポキ シル基 と ポ リ エチ レ ンダ リ コ ール と の結合を仲介する も の等が挙げ ら れ る。 遊離ァ ミ ノ基 と結合す る活性型ポ リ エチ レ ング リ コ ール と し て 、 例 えば次式で表さ れる 、

0

CH. 0 ( C₂ Η_Λ 0 ) _n CO CH₂ CH₂ COON'

ポ リ エチ レング リ コ ールの コ ハ ク酸エス テルを N - ヒ ド ロ キ シ ス クシ二ルイ ミ ド に よ り 活性化 し た N - ヒ ド ロ キ シス ク シニル イ ミ-ドボ リ エチ レ ング リ コ ー ト が使わ れる 。 ま た 、 遊離 ア ミ ノ 基 と結合す るその他の活性型ポ リ エチ レ ング リ コ ールと し て は 次式 で表 さ れる 、

ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ルモ ノ メ チ ルエ ー テル と 塩化 シ ァ ヌ 一 ル 酸 よ り 合成さ れ る 2 , 4 -ビス （ 0 -メ 卜 キ シ ポ リ エチ レ ン グ リ コ ー ル ） -6-ク ロ ル - ^-卜 リ ァ ジ ン が挙 げ ら れる 。

ま た 、 遊離力 ルポキ シル基 と 結合す る活性型 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル と し て は 、 例え ば次式で表さ れる 、

H₂ CH_nCH₂CH₂0(C₂H₄0) _rCH₂CH_nCH₂ H₂ ポ リ 才 キ シ エ チ レ ン ジ ァ ミ ン が使わ れる 。

共有結合修飾反応は 、 生物学的 に 活性な材料を 活性型ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ール と反応せ し め る た め に 一般 に 使用 さ れる適当 な任意の方法 に よ り 実施 し得る 。 ヒ 卜 G — C S F 上 の反応性 ァ ミ ノ 酸が遊離 ア ミ ノ 基を有す る ア ミ ノ 酸残基で あ る場合 に は好 ま し く は p H 7.5〜 10.0に お い て 行わ れる 。 該反応 は 、 例 え ば リ ン酸塩， ホ ウ酸塩等の緩衝液中 PH 7.5〜 10.0, 温度 4〜 37°C で 1 〜 5 時間行う 。 ヒ 卜 G — G S F の遊離ア ミ ノ 基 に対 し 、 活性 型ポ リ エチ レ ング リ コ ールを 1 〜 200 倍モル量、 好 ま し く は 5 〜 50倍モル爆用 いる 。 一方、 ヒ 卜 G — C S F 上の反応性 ァ ミ ノ 酸が遊離力 ルポキシル基を有する ア ミ ノ酸残基であ る場合に は 好 ま し く は PH 3.5〜 5 · 5 に お い て 行われ 、 例えばポ リ オキ シェ チ レンジ ァ ミ ン を活性型ポ リ エ チ レ ング リ コ ール と し て使用す る反応で は、 PH 4.0〜 5.0 で 力 ルポジイ ミ ド存在下 、 温度 4〜 37Όで 1 〜 24時間行う 。 ヒ 卜 G — C S F の遊離 カ ルボ キシル基 に対 し 、 活性型ポ リ エチ レ ング リ コ ールを 1 〜 200 倍モル量用 い る 。

なお 、 ア ミ ノ酸残基の修飾率は 、 上記の活性型 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ールの使用量の範囲 に よ り 、 その使用量に応 じ 自 由 に変 動さ せる こ とができる 。

所望 に よ り 、 反応液は 、 透析 ， 塩析， 限外ろ過 ， イ オ ン交換 ク ロマ ト グラフ ィ ー ， ゲルろ過 ， 電気泳動など 、 通常の蛋 白質 の精製法で精製 し 、 目 的 と する ポ リ エチ レ ング リ コ ー ル修飾 ヒ • '·卜 G — C S F 、 即ち本発明の化学修飾蛋 白質を得る こ と ができ る。 特に イ オ ン交換 ク ロマ ト グラ フ ィ ー は 、 ポ リ エチ レ ンダ リ コ ー ル及び ヒ 卜 G — C S F の 除去 に 有効 で あ る 。

本発 明 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 俊 飾 ヒ 卜 G -- C S F は 、 ( おそ ら く そ の体内で の ク リ ア ラ ン ス が延びる た め ） 薬理作用 の持続時間 が長 く な つ て いる 。 更 に は 、 白 血球減少時 に お け る 白 血球の 回復を よ り 早め る こ と が認め ら れて い る 。

本発 明 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル修飾 ヒ 卜 G — C S F は 、 未 修飾 ヒ 卜 G — C S F と 本質的 に 周様の生物学的活性 を有 し て い る た め 、 未修飾 ヒ 卜 G - C S F と 周様の 用 途 に 有効で あ る 。 即 ち 、 好中球を増加 さ せ る と い う 生物学的活性 に よ り 、 通常の造 血障害の治療 に 加 え て 、 化学療法又 は放射線療法 に よ る造血 障 害の 治療 ， 骨髄移植時或い は感染症治療に 有効で あ る 。

ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル修飾 ヒ 卜 G - C S F は 、 医薬上許容 可能な希釈剤 ， 等張化剤 ， P H 調整剤等 と 調合 す る こ と に よ り 患者 に投与可 能な製剤 と し て用 い る こ と がで き る 。

ポ リ エ チ レ ング リ コ ー ル修飾 ヒ 卜 G — C S F を有効成分 と す る製剤 の投与方法 は 、 治療 目 的 に 応 じ て変化 し 得る が 、 皮下， 筋肉内及び静脈へ の 注射 、 或い は経口 に よ っ て 実施さ れる 。 投 与量 は 、 そ の対象 と な る疾患及び患者の病状 に 合わせ て 決め る こ と がで き る が 、 注射の場合 は ヒ 卜 G — C S F 重量 と し て 通常 成人-一人当た り 0.1 /Kg〜 5 、 経口 の場合 に は同 じ く 0.1 ^〜 5 を投与す る こ と ができる 。

[ 図面の簡単な説明 ]

第 1 図 はポ リ エチ レ ング リ コ ール修飾 ヒ 卜 G - G S F の S D S — P A G E ゲルのスキ ャ ニングパ タ ー ンを示す 。 ヒ 卜 G — C S F の ァ ミ ノ 基 に対す る活性型ポ リ エチ レ ング リ コ ールの モル 比が 、 夫々 （a)0, (b)1, (c)5, ( d ) 10 , (e)50で得 ら れた生成物 を示す 。 未搽飾 ヒ 卜 G — C S F は 、 19K ( ※印 の ピー ク ） であ る 。

第 2 図 は ヒ 卜 G — C S F及びポ リ エチ レ ング リ コ ール修飾 ヒ 卜 G — G S F を投与後のマ ウスの好中球の変化を示す 。 尚 、 図 中の各点 は 6 匹のマ ウ ス につ いて得 ら れた平均値土 標準偏差 を 示す 。

第 3 図 はシ ク ロ ホス フ ア ミ ド投与マ ウ スの好中球減少 に対す る ヒ 卜 G — G S F及びポ リ エ チ レ ング リ コ ール修飾 ヒ 卜 G — C S F の効果を示す 。 尚 、 図中の各点 は 6 匹のマ ウス につ い て得 ら れた平均値士 標準偏差を示す 。

' 第 4 図 は 5— フ ル才 ロ ウラシル投与マ ウスの好 中球減少 に対 する ヒ 卜 G — C S F及びポ リ エチ レング リ コ ー ル修飾 ヒ 卜 G — C S F の効 果を示 す 。 尚 、 図 中 の 各点 は 6 匹のマ ウ ス に つ い て 得 ら れた 平均値 士 標準偏差を示す 。

第 5 図 は ヒ 卜 G — C S F ( β ) 及び P E G (10000) G - C S F ( 〇 〉 の血清 中 に お け る消失半減期 を示す 。 尚 、 図 中 の 各点 は 3 匹 の ラ ッ 卜 に つ い て得 ら れた 平均値 士 標準偏差 を示す 。

[ 発 明 を実施 す る た め最良 の形態 ]

以下の実施例 で本発明 を具体的 に 説明 す る が 、 本発 明 は こ れ ら に よ っ て 制 限さ れる あ ので は な い 。

実施例 1

P E G ( 4500 ) G — C S F の作成

修飾 に 用 い た ヒ 卜 G — C S F は 、 遺伝子組換 え技術 に よ っ て 発現 さ せ た も ので （ 特表 昭 63-500636 ) 、 次の ア ミ ノ 酸配 列 よ り な る ポ リ ペプチ ドで あ る 。

Met Thr Pro Leu G I y Pro A I a Ser Ser Leu

Pro Gin Ser P e Leu Leu Ly s Cys Leu G I υ Gin Va I Arg Lys lie G I n G I y Asp G I y A I a A i a Leu Gin G I u Lys Leu Cys A I a Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro G I u G I u Leu Va I Leu Leu Gly His Ser Leu G I y lie Pro Trp A I a Pro Leu Ser Ser Cys P ro Se r Gi n /Ua Leu G I n Leu A I a G I y Cy s Leu

Ser G I n Leu H i s Ser G l y Leu Phe Leu Ty r G i n

G I y Leu Leu G i n A I a Leu G I u G I y l i e Ser Pro

G I u Leu G I y Pro Thr Leu Asp Thr Leu G I n Leu

Asp Va I A I a ftsp Phe A I a Thr Thr l ie Trp G I n

G I n Het Q I u G I u Leu G I y Met A ί a Pro A I a Leu

G I n Pro Thr G i n G I y A I a Het Pro Al a Phe A I a '

Ser A I a Phe Gi n A rg Arg A I a G I y 6 I y Va I Leu

Va I A I a Ser H i s Leu G i n Ser Phe Leu G I u Va I

Ser Ty r Arg Va I Leu Arg H i s Leu A I a G I n Pro ポ リ エチ レ ング リ コ ール は、 平均分子量が約 4, 500 のポ リ エ チ レ ング リ コ ールの コ ノ、 ク酸エステ ルを N - ヒ ド ロ キ シ ス ク シ 二ルイ ミ ド に よ り 活性化 し た N - ヒ ド ロ キシス ク シニルイ ミ ド ポ リ エチ レ ング リ コ ー 卜 （ 活性型 P F G ) ( 日 本油脂製 ） を使 用 し た 。

ヒ ト G — C S F を 、 0.25Mホ ウ酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ PH 8.0) 中で -、 活性型 P E G と 4 Όで 時間反応させた 。 活性型 P E G 量は 、 ヒ 卜 G— G S F 中の遊離ア ミ ノ 基に対 し て 1〜 50倍躉を 用 い た 。 生成物 は 、 予め 10mM N H ₄ H C 0 3 で平衡化さ せ た Sephadex G25で緩衝液交換 を し た 後 、 DEAEイ オ ン 交換 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー を用 い て 、 種々 の形の ポ リ エ チ レ ン ダ リ コ ー ル修飾 ヒ 卜 G — C S F ( P E G 修飾 ヒ 卜 G — C S F ) を試薬及び必要 に 応 じ 未反応 ヒ 卜 G — C S F か ら 分離 し た 。 以降 、 こ の反応で 得 ら れ た P E G 修飾 ヒ 卜 G — C S F を 、 P E G ( 4500 ) G - C S F と い う 。

実施例 2

P E G ( 4500 ) G — C S F の特徴付け

実施例 1 で作成 し た P E G ( 4500 ) G — C S F の特徴付 け を 未修飾ア ミ ノ 基数及び S D S — P A G E に よ る分子躉の推定 に よ っ て 行な っ た 。

未修飾 ァ ミ ノ 基数の測定 は 、 Habeeb等の方法 （Anaに B iochem. 14, pp 328-336, ( 1966 ) ) に従 っ て 、 % NaHC0₃ 中で 0.1 % T N B S と反応さ せ 、 335 nm の吸光度を測定 す る こ と に よ っ て 行な っ た 。

ま た一方 、 反応物 の分子量の特徴付け は 、 S D S — P A G E ( 16%ゲル， G B B 染色 〉 上で行な っ た 。 反応物 を 、 Laeml iの 方法 （ Nature, 227, pp680, ( 1970 ) )に 準 じ て S D S — P A G E を行い 、 C B B 染色を行な っ た 。 染色の後 に 、 各ゲルの各 レ ー ンの スキ ャ ニングを行な っ た 。 測定 に は島津 ク ロ マ 卜 ス キ ヤ ナ （ C S -930 ) を用 いた 。

ヒ 卜 G — C S F の ァ ミ ノ 基に 対す る活性型 P E Gの比率が増 加する につれて 、 修飾の程度が増加 し た 。 活性型 P E G /ア ミ ノ基 （ モ ル比 ） が 1 の試料で は 、 未惨飾 ヒ 卜 G — C S F のバ ン ド （ 19K ) の他 に 、 約 26K の見かけの分子量を有する Ί 本のパ ン ドが認め ら れた 。 ま た 、 活性型 P F G Zァ ミ ノ 基が 5 及びそれ 以上の試料で は、 上記のパン ドの他 に更に大き な分子量を有す るパ ン ドが認め ら れた 。 スキ ャ ニ ングの結果よ り 、 各試料 につ いて各パ ン ドの含有率を求め た （ 表 1 ) 。 こ の結果 と未修飾ァ ミ ノ 基平均個数 （ 表 1 ) と を考え合わせる と 、 26Kのバ ン ドを 示すも の は ヒ 卜 G — C S F に 1 分子の活性型 P E Gが結合 し た ものであ り 、 34Kのパ ン ドを示すも の は ヒ 卜 G — C S F に 2分 子の活性型 P E Gが結合 し た も の である と推定さ れた 。

表 Ί Ρ Ε G ( 500 ) G — C S F の特徴付け

分子量分布 ） 被 修 飾 未修飾 NH₂

PEG/NH₂ 19Κ 26Κ 34Κ NH₂ 基 (%) 平均個数

1 86 12 5 4.8

2 68 31 1 15 4.3

3 56 42 2 15 4.3

4 36 48 16 20 4.0

5 31 49 20 27 3.7

6 25 50 25 27 3.7

7 20 50 28 27 3.7

ま た 、 イ オ ン交換 ク π マ 卜 グ ラ フ ィ 一 か ら 溶出 さ れた 画 分 の S D S — P A G E のパタ ー ン に よ り 、 よ り 修飾 さ れ た 分子種ほ ど早 く 溶出 し 、 最後 に 溶出 さ れた 画分が未修飾 ヒ 卜 G — C S F で あ る こ と がわ か っ た 。

更 に 活性型 P E G /ア ミ ノ 基を増加 さ せ た場合も含 め た 、 S D S — P A G E のス キ ャ ニ ング図 を 、 図 1 に 示 し た 。 実施例 3

P E G G — C S F の作成

修飾に用 い た ヒ 卜 G— C S F は 、 実施例 1 に示 し たも の と周 じである 。 ポ リ エチ レ ング リ コ ールは 、 ポ リ エチ レ ング リ コ ー ルモ ノ メ チルエ ーテルと塩化シ ァ ヌ ール酸よ り 合成さ れた下式 に示す平均分子量約 10, 000の 活性 型 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル ( 活性型 P E G 2 ) ( 生化学工業製 ） を使用 し た 。

ヒ 卜 G — C S F を 、 0.25Mホ ウ酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ PH10.0) 中で 、 活性型 P E G 2 ど室温で 1 時間反応させた 。 活性型 P E G 2 量 は、 ヒ 卜 G— C S F 中の遊離ア ミ ノ 基に対 し て 5 倍量を 用 い た 。 生成物 は、 予め 1 OmM N H ₄ H C 03 で平衡化させた Sephadex G25で緩衝液交換を し た後、 D E A E イ オ ン交換ク ロ 'マ 卜 グラ フ ィ ー を用 いて 、 P E G俊飾 ヒ 卜 G— C S F を試薬及 び未反応 ヒ 卜 G— C S F か ら分離 し た 。 実施例 2 と周様に S D S — P A G E 上 に て 分子量の 推定 を行 っ た と こ ろ 、 平均分子邋 は 45K で あ り 、 そ の分布 は 30 K ( 10% ) , 40 K ( 70% ) 及び 66 K ( 20% ) で あ っ た 。 こ の反応で得 ら れた P E G 修飾 ヒ 卜 G — C S F を 、 以降 、 P E G ( 10000 ) G — C S F と い う 。

更に 、 ヒ 卜 G — C S F を 0.25M ホ ウ酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ PH 10.0 ) 中で 、 活性型 P E G 2 と 室温で 2 時間 反応さ せ た 。 活性 型 P E G 2 量 は ヒ 卜 G — C S F 中 の遊離 ア ミ ノ 基 に 対 し て 10倍¹ 量 を 用 い た 。 生成物 は予 め 10 mM N H 4 H C 03 で平衡化 さ せ た Sephadex G25で緩衝液交換 を し た後 、 D E A E イ オ ン交換 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー を用 い て P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F を分離 し た 。 実施例 2 と 周様 に S D S — P A G E 上 に て分子量の 推定 を 行 な っ た と こ ろ 、 分子量 は 30K で あ り 、 こ れ は 、 ヒ 卜 G — C S. F に 1 分子の 活性型 P E G が結合 し た も ので あ る と 推定 さ れた 。

ま た 、 同様 に ヒ 卜 G — C S F 中 の遊離 ア ミ ノ 基 に 対 し て 50倍 量の P E G 2 を用 い て反応さ せ 、 P E G 修飾 ヒ 卜 G — C S F を 分離 し た 。 同様 に し て 分子量の推定 を行 っ た と こ ろ 、 平均分子 量 は 51 K で あ り 、 そ の分布は 40K ( 58% ) 、 66K ( 42% ) で あ つ た 。 実施例 4

P E G ( 4000 ) G — G S F の作成

ヒ 卜 G — C S F 中の遊離力 ルポキシル基へポ リ エチ レ ング リ コ ールを共有結合させ た P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F を作成 し た 。 ポ リ エチ レング リ コ ールは、 平均分子量が約 4， 000の ポ リ オキ シエ チ レンジ ァ ミ ン （ 活性型 P E G ; 化学式 は前述 ） （ 日 本油 脂製 ） を使用 し た 。 ¹ ヒ 卜 G — 〇 S F と活性型 P E Gを 、 PH 4.5に お いて 0.05Mの 1 - ェチル -3 - ( 3 -ジ メ チルァ ミ ノ プ □ ピル ） カ ルポ ジイ ミ ドの 存在下で 、 室温で一晚反応させた 。 なお 、 活性型 P E G量 は 、 ヒ 卜 G — G & F 中 の遊離力ルポキシル基 ^対 し て 60倍量を用 い た 。 1 Μ酢酸ナ ト リ ウ ム （ΡΗ 4.75 ) を加 える こ と に よ り 、 反応 を停止 し 、 更に チロ シ ンの再生をする た め に 、 0.5Μ ヒ ド ロ キ シァ ミ ン中で 25¾ , 5 時間反応させた 。 生成物 は 、 予め lOmM齚 酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ PH 5.5) で平衡化さ せた T S K G 3000 S Wカ ラ ムを用 い てゲルろ過ク ロ ク 卜 グラ フ ィ ー を行い 、 P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F を試薬及び未反応 ヒ 卜 G — C S F か ら 分 離 した 。 実施例 2 と同様 に S D S — P A G E 上に て分子量の推 定を行な っ た と こ ろ 、 分子量 とその分布 は 27 K ( 70% ) , 35K ( 20% ) 及び 42K ( 10% ) であ っ た 。 こ の反応で得 ら れ た P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F を 、 以降 、 P E G ( 4000 ) G — C S F と い う 。

実施例 5

P E G (4500) G — C S F の in vivo で の薬理効果 実施例 Ί で 作成 し た P E G ( 4500 ) G — C S F に つ い て 、 マ ウ ス に お け る 薬理効 果を 調 べ た 。 マ ウ ス （ I C R ( $ ) ； 実験 I で は 4 週令 を 、 実験 I で は 8 週令を用 い た 。 ) に 試料を 1 p r 01 e i n / あ る い は 100^ protei n/ Kgの用 缰で静脈内 に 投与後 、 前者 は 24 時間後 ， 後者 は 32時間後 にマ ウ ス の 眼窩静脈叢よ り 採血 し 、 自 動血球計数装置 （ E-2000, 東亜医用 電子 ） に て 白 血球数を 測定 し た 。 ま た 、 同 時 に 血液塗末標本を ラ イ 卜 染色 し 、 自 動血球分 類装置 （ MICR0X, 立石電機 ） に て 白 血球分画を測定 し 、 好中球 数を求め た 。 そ の結果を 、 表 2 に 示す 。

P E G ( 4500 ) G — G S F と し て は 、 （1) 活性型 P E G Zァ ミ ノ 基が 5 で反応させた 時の生 成物 （ 図 1 ， C) , (2) D E A E イ オ ン交換 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー を用 い て分画 し た 26K 画分 ， お よ び （3) D E A E イ オ ン交換 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー を 用 い て 分画 し た 高分子画分 （ 26K ： 14% , 34 K ： 55% , > 34K ： 28% を含 む ） を用い た 。

P E G ( 4500 ) G - C S F (1), (2), (3) で は 、 未瘙飾 ヒ 卜 G — G S F に比べ 、 好中球数が増加 し て い た 。 全般的傾向 と し て 、 比較的傪飾率の髙ぃ試料 （ υ , (3 ) に お いて 、 その効果は よ り 顕 著であ っ た 。

通常 、 ヒ 卜 G — C S F を 10^ protei /igの用畺でマ ウ ス に 投与 し た場合、 好中球数 は増加 し 、 約 6〜 12時間後 に最大 と な り 、 その後は徐々 に減少 し 、 ほぼ 30時間で正常 レベル に戻る 。 本実験でのこ の用量での採血時間 （ 24時間 ） は、 好中球数がも との レベルに戻る直前の時間であ る 。 prote i / の用量 の採血時間 （ 32時間 ） の決定も周様の原理に基づい て行なわれ た 。 従 っ て 、 こ れ ら の 時間で P E G ( 4500 ) G - C S F (1 ), (2) , (3) を投与 したマウス において 、 未修飾 ヒ 卜 G — C S F を 投与 し たマ ウ ス と比べて 好中球が多い こ と は 、 本試料 の好 中球 増加作用 が持続 し て いる可 能性を示唆する 。

な お 、 P E G と未修飾 ヒ 卜 G — G S F を結合させず に混合 し た だけで は 、 未修飾 ヒ 卜. G — C S F のみの場合 と変わ ら なかつ • '-た （ デー タ 省略 ） 。 表 2 PEG 修飾 ヒ 卜 G-CSF の i n vivo 薬理効 果

a.10 (？ κ ½ ぐ 実験 I >

べ ヒ ク ル 5.6土 1.0 1.0 コ ン 卜 ロ ー ル G-CSF 9.6土 1.4 1.7

PEG( 4500 )G-CSF(1 ) 20.8± 2.6 3.7 PEG(4500)G-CSF(2) 17.5± 3.0 3.1

< 実験 H >

べ ヒ ク ル 6 12.3± 1 1.0 コ ン 卜 ロ ー ル G-CSF 27.1 ± 4.6 2.2

PEG(4500)G-CSF(3) 6 54.0 ± 7.2 4.4 b. 100«g

< 実験 I >

べ ヒ ク ル 6.6± 0 1.0 コ ン 卜 ロ ー ル G-CSF 6 18.5± 2.3 2.8 PEG(4'500 )G-CSF(1 ) 6 42.9士 4.3 6.5

PEG(4500)G-CSF(2) 6 22.6 ± 1.9 3.4 実施例 6

P E G (4000 ) G - C S F の ^ vivo での薬理効果 実施例 4 で作成 し た P E G ( 4000 ) G — C S F につ いて 、 マ ウ ス に おける薬理効果を調べた 。 マ ウ ス （ I C R ( ） ； 7 週 令 ） に試料を 10^ protei n/teの用量で静脈内 に投与 し 、 24時間 後にマウスの 眼窩静脈叢よ り 採血 し 、 実施例 5 と周様に好中球 数を求め た 。 その結果を 、 表 3 に示す 。 力 ルポキ シル基 に ポ リ エチ レ ング リ コ ールを結合させた P E G ( 4000 ) G — C S F の 場合 に おいて も 、 未修飾 ヒ 卜 G — C S F に比べ 、 好中球が増加 して い た 。

3 P E G (4000) G C S F の i n vivo

薬理効果 好 中 球 数 べ ヒ クルに 群 匹数

(X10 ) 対す る比

べ ヒ ク ル 6 10.9 ± 1 · 0 1.0 コ ン 卜ロ ール 6 16.4± 1 · 4 1.5 ヒ 卜 G-CSF

PEG(4000)G-CSF 23.3± 2.5 2.1 実施例 7

P E G 修飾 ヒ 卜 G — C S F の好 中球増加作用

実施例 Ί 及び実施例 3 で作成 し た P E G ( 4500 ) G — C S F 及 び P E G ( 10000 ) G — C S F に つ い て 、 マ ウ ス に お け る 好 中球 増加作用 を経時的 に 調 べ た _D マ ウ ス （ I C R ( $ ) ： 7 週令 ） に 試料を 10 g protei n, の用 ffiで静脈内 に 投与後 、 6 , 24, 32 , 48及び 72時 間後 にマ ウ ス の 眼窩静脈叢 よ り 採血 し 、 実施例 5 と 周様 に 好中球数を求め た 。 但 し 、 自 動血球計数装置 は 、 C C 180-A ( 東亜医用電子 ） を用 い た 。 ま た 、 P E G 修飾 G — C S F と し て は 、 P E G ( 4500 ) G - C S F ( 活性型 P E G ノ ア ミ ノ 基を 50で反応さ せ 、 D E A E イ オ ン交換ク ロ マ 卜 グラ フ ィ 一 を用 い て 分画 し た 高分子画分 ； 平均分子量 60 K ； 分 子量分布 38K (20¾) , 58K ( 54% ) , 80K ( 27% ) ： 実施例 1 参照 ） 及 び P E G ( 10000) G — C S F を用 い た 。

図 2 に 示 し た よ う に 、 未修飾 ヒ 卜 G — C S F で は 、 投与 24 時間後 に は好 中球が通常 レ ベ ル ま で戻 る の に 対 し て 、 P E G ( 4500 ) G — C S F で は 32時間後 ， P E G ( 10000 ) G — C S F で は 48時間後 ま で 、 好中球の有意な増加 が認め ら れた 。

な お 、 実施例 3 で作成 し た （a) 分子量 30K の P E G G - C S F 、 及び （b) 平均分子量 51 K ： 分子量分布 ： 40K ( 58

% ) 、 66K ( 42% ) の P E G (10000) G — G S F に つ い て もマ ウ ス に おける好中球増加作用 を調 べ た 。 マ ウ ス （ I C R ( ） 8 週令 ） に試料を 10j«g protei nZ の用量で静脈内 に投与 し 、 24時間後にマウスの眼窩静脈叢よ り 採血 し 、 実施例 5 と周様に 好中球数を求め た 。 その結果を表 4 に示す 。 表 4 P E G G — G S F の in vivo 薬理効果 群 匹数 好中球数 べ ヒ ク ルに

(X10² / μ& 対する比 べ ヒ ク ル 7.4土 0.6 1.0

G - C S F 16.4土 3. 1 2.2

PEG(10000) G-CSF (a) 5 68.9± 10.5 9.3 PEG(10000) G-CSF (b) 5 95.8土 6.4 12.9

P E G ( 10000 ) G - C S F (a), (b) でも 、 未修飾 G — C S F に比べ 、 好中球数が増加 し て いた 。 P E G ( 4500 ) G - C S F の場合と同様に俊飾率の高い試料に おいて その効果は よ り 大き か っ た 。 実施例 8

P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F の シ ク ロ ホ ス フ ア ミ ド投与マ ウ ス の 好 中球減少 に 対す る効果

実施例 7 で使用 し た も の と 同 じ P E G ( 4500 ) G — C S F 及 び P E G (10000) G — C S F につ い て 、 シ ク ロ ホ ス フ ア ミ ド ( C Y ) に よ る好中球減少 に 対す る効果を調 べ た 。 マ ウ ス （ I C R ( $ ) 7 週令 ） に C Y l^ / を腹腔内 投与 （ day 0 と ' す る ） し 、 好 中球減少マ ウ ス を作成 し た 。 試料 10 rotei n/ ノ 日 を C Y投与翌 日 （ day 1 〉 か ら day 4 ま で 1 日 Ί 回 ， 4 日 間尾静脈内投与 し 、 最終投与後 、 6 , 24及び 48時間後の各点 で実施例 5 と同様 に採血 し 好中球数を 求め た 。 図 3 に 示 し た よ う に 、 P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F に お い て も 、 未修飾 ヒ 卜 G — C S F と 同様或い はそ れ以 上 に C Y 投与 に よ る 好中球減少か ら の 回復を 早め る効果が認め ら れた 。 特 に 、 P E G ( 10000 ) G — 〇 S F で は 、 更 に好中球の顕著な 増加 が認め ら れた 。 実施例 9

実施例 7 で使用 し た も の と 周 じ P E G ( 10000 ) G _ C S F に つ い て 、 雌性 B D F <! マ ウ ス （ 7 週令、 日 本 S L C株式会社 ） を用 い て 5 — F U に よ る好中球滅少 に対する効果を調 べ た 。 マ ウ ス に 5 — F U 200fflg / Kgを静脈内投与 し （day 0と す る ） 、 好 中球減少マウス を作成 し た 。 試料 proteinZ ZiSf Z日 を 5 — F U 投与翌 日 （ day 1 )か ら day 11ま で 1 ¾ 回合計 11回 （ P E G ) 、 day 1 , 3, 5_r 7, 9, 11の 2 日 に Ί 回合計 6 回 （ P E G 2 ) および day 1 , 4, 7, 10の 3 曰 に Ί 回合計 4 回 （ P E G 3 ) の スケ ジ ュ ールで皮下投与を行な っ た 。 対照 と し て未修飾 G — C S F ^Q proteinZ /^Z日 を day 1 か ら day 11ま で Ί 日 Ί 回合計 11 回皮下投与 し た 。 好中球数は実施例 5 同様の方法で day 7, 8, 9, 10 , 11 , 12 , 14 ,お よび 17で採血 し求めた 。

第 4 図 に示 し た よ う に 5 — F U の みの投与で は好中球の正常 レベルへの回復 に約 14日 間かかるの に 対 して未修飾 G — C S F を投与 し た群で は "日 間 、 P E G 1 , 2 , 3 投与群で は 9 日 間 であ っ た 。 こ の よ う に P E G修飾 G — G S F は未俊飾 G— G S F と比べ て好中球の回復を早 く し 、 さ ら に P E G修飾 G — C S F の投与回数を未修飾 G — C S F の投与回数よ り 減ら し て も好 中球減少か ら の 回復効果は P E G俊飾 G — C S F の ほ う が上ま お っ て いた-。 - 2 1 - 実施例 10

P E G修飾 ヒ 卜 G— C S Fの急性毒性試験

実施例 7 で使用 し た も の と 同 じ P E G ( 4500 ) G — C S F 及 び P E G ( 10000 ) G — C S F に つ い て 、 急性毒性試験 を行 な つ た 。

雌雄 の S ic : I Rマ ウ ス （ 5週令 ） 各 6匹を 1 群 と し 、 投与 液 は 12 ノ と し た 。 比較の た め 、 べ ヒ ク ル投与群を お い た 。¹ 観察 に つ い て は 、 投与 日 は投与後 6時間 ま で可能な 限 り 頻回 ， そ の後原則 と し て 14日 間 は毎 日 Ί 回行い 、 一般状態 の観察 と 生 死の確認を行な っ た 。 体重の測定 は 、 投与 曰 ， 第 5 , 8 , 12及 び 15曰 目 に 行な っ た 。 生存例 は 、 観察期 間終了後エ ー テル麻粋 下 に放血致死さ せ 剖検 し た 。

結果 は 、 表 4 に 示 し た と お り 、 観察期 間 中 に 死亡例 は な く 、 L D _5Q値 は P E G (4500 ) G — C S F 及び P E G (10000) G - C S F いず れも雌雄 と も 3, 000 ^ / ^以上であ っ た 。 一般状態 、 体重及び剖検所見でも 、 P E G ( 4500 ) G — G S F 及び P E G ( 10000 ) G — C S F 投与 に 関連 し た重篤な変化 は認 め ら れず 、 未修飾 ヒ 卜 G — C S F と 周様に そ の毒性 は極め て 弱 い と 考え ら れた 。 5 マ ウ ス の 死 亡 率 死 亡 数

投与晨 死亡率 * ^{L D}50

性 別 化 台 物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 " 12 13 14 15 (曰》 べ ヒ クル 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6 雄 PEG4500-G-CSF 3,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6 >3,000

r

PEG10000-G-CSF 3,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6 >3,000 O べ ヒ クル 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6 雌 PEG4500- G-CSF 3,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6 >3,00

PEG10000-G-CSF 3,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6 >3,000

* 死亡数 処理検体数

実施例 11

P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F の消失半減期 の測定

以下に 述べ る各々 の採血 時間 あ た り 3 匹 の出生 後 7 週令 の S D 系雄性ラ ッ 卜 に 、 ヒ 卜 G — C S F 又 は実施例 3 で得 られた P E G ( 10000 ) G - C S F 100/«g protein/ /½rを 、 そ れぞれ尾静 脈 よ り 注入 し た 。 ヒ 卜 G _ C S F お よ び P E G ( 10000 ) G - C S F を投与 し て か ら 、 10分 、 2 、 4 、 8 、 24、 48時 間経過後 、 各個体毎 に 腹大動脈 よ り 、 約 15 の容量を もつ ポ リ プ ロ ピ レ ン チ ュ ー ブ中 に約 6か ら 相 当 を採血 し 、 4°C に お い て 18000 xg、 5 分間遠心す る こ と に よ っ て 血清画分を採取 し 、 こ の 血清 試料 中 に お け る活性を保持 し た ヒ 卜 G — C S F 蛋 白 量 を マ ウ ス 骨髄細胞を用 い た ³Ή — thymid i ne 取込みを指標 と し た バ イ オ . ア ツ セ ィ （ Ra l ph ら 、 B lood 68, PP633-639 (1988) ) に よ っ て 測定 し た 。 血清中 ヒ 卜 G — C S F 蛋 白 濃度の経時 的 な変化 を第 5 図 に 示 し た 。 さ ら に 、 そ の測定値 よ り ヒ 卜 G — C S F お よ び P E G ( 10000 ) G — C S F の消失半減期 を箅出 し た と こ ろ 、 そ れぞれ、 1 · 79時間 お よ び 7.05時間で あ っ た 。 ま た 、 ヒ 卜 G — C S F お よ び P E G ( 10000 ) G - C S F の血清中 濃度 - 時間 曲線 下面積 （ A U C ) を算出 し た と こ ろ 、 そ れぞれ 、 2000 ng蛋 白 ♦ 時間 Z お よ び 16195 ng蛋白 ♦ 時間 Ζ であ っ た 。

以上の こ とか ら 明 ら かな よ う に 、 本発明 の P E G修飾 ヒ 卜 G — C S F は、 ヒ 卜 G - C S F に 比べ体内 か ら の消失が抑制 さ れ て いる こ とがわかる 。

[ 産業上の利用 可能性 ]

本発明 が提供す る ポ リ エチ レング リ コ ール修飾 ヒ 卜 G— C S F は、 未修飾 ヒ 卜 G — C S F と 比較 し て 、 薬効 （ 好中球の増加 作用 ） がよ り 長 く 持続する こ と に よ り 、 生体内投与 の際 に 、 よ り 少量での よ り少ない 回数の投与が可能 と な り 、 ヒ 卜 G — C S F を用 いる治療に一層貢献 し得る こ と が期待さ れる 。

Claims

請 求 の 範 囲

(1) 実質的 に 以下の ア ミ ノ 酸配列 を有 し 、 外来性 D N A 配列 の 宿主細胞 に よ る発現産物 で あ る こ と を特徴 と す る ポ リ ペプ チ ド に ポ リ エ チ レ ング リ コ ー ルを '結台 し て な る化学修飾蛋 白 質 。

(Het) n

Th r Pro Leu G I y Pro A I a Se r Se r Leu Pro G I n

Ser Phe Leu Leu Lys Cy s Leu 6 I u G I n Va I A rg

Ly s lie G I n G I y Asp G I y A I a A I a Leu Gin G I u

Lys Leu Cy s A I a T r Tyr Lys Leu Cy s His Pro Q I u G I u Leu Va I Leu Leu G I y His Ser Leu G I y lie ro T rp A I a Pro Leu Ser Ser Cy s Pro Ser Gin A I a Leu G I n Leu A I a G I y Cy s Leu Ser G I n

Leu His Ser G I y Leu Phe Leu Tyr Gin 61 y Leu し eu Gin A I a Leu G I u G I y l ie Ser Pro G I u Leu

G I y Pro T r Leu Asp Thr Leu 61 n Leu Asp Va I

A I a Asp Phe A I a Thr T r lie Trp 61 n Gin Met

G I u G I u Leu G I y Met A I a Pro A I a Leu G I n Pro

Thr G I n G I y A I a Met Pro A I a Phe A I a Ser A I a Phe Gi n Arg Arg A I a G I y G I y Va I Leu Va I A I a

Sep H i s Leu G I n Se r Phe Leu G i u Va I Ser Ty r Arg Va I Leu Arg H i s Leu A I a Gi n Pro

(n = 0又は 1 )

0 ポ リ エチ レ ング リ コ ールが 、 ボ リ ペプチ ドの ア ミ ノ 酸の ァ ミ ノ 基を介 し て結合サ る請求の範囲第 1 項に記載の化学修飾蛋 白質。

(3) ボ リ エチ レング リ コ ールが 、 ポ リ ペプチ ドの ア ミ ノ 酸の 力 ルポキシル基を介 し て結合する請求の範囲第 1 項に記載の化学 惨飾蛋白質。