WO1990009453A1 - Verfahren zur schnellen detektion von mikroorganismen in proben und vorrichtung zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur schnellen detektion von mikroorganismen in proben und vorrichtung zur durchführung des verfahrens Download PDF

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Dieter Naumann
Harald Labischinski
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Bruker Analytische Messtechnik Gmbh
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    • G01N21/35—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light
    • G01N21/3577—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light for analysing liquids, e.g. polluted water

Definitions

  • the invention relates to a method for the rapid detection of microorganisms in a large number of samples, e.g. Urine, blood, water, food, pharmaceutical raw materials and products such as Ointments, liquid preparations, etc., which are generally free of such microorganisms, either n or where certain, fixed limit values for the total number of bacteria or also for individual, defined representatives of microorganisms should not be exceeded, and also a device to carry out the procedure »
  • samples e.g. Urine, blood, water, food, pharmaceutical raw materials and products such as Ointments, liquid preparations, etc.
  • Such detection work is carried out in the clinical area (sepsis, urinary tract infections, Li quortestung) and out of clinic area (assessment of the sterility or burden of starting materials and end products, such as water, milk, food etc.) to a large extent, because the results of such tests are of great clinical importance but are also of great importance for quality control, durability assessment and other product and production medium tests, for example in industrial companies.
  • the current state of the art generally uses either methods which allow very small and very specific very small amounts of certain individual groups of microorganisms to be detected, and methods which are less rapid and which are comparatively significantly larger Quantities of microorganisms (about> 10 bacteria per ml test sample) can detect a large number of different microorganisms in a non-specific manner (for an overview see, for example, in: Bergan, T .: Methods in Mi crobiol og, Vols.
  • the first group includes, in particular, molecular biological detection methods with which the detection indirectly by detecting a reaction of the sample, e.g. with monoclonal antibodies or also by DNA / DNA hybridization etc. Techniques. Characteristic of these techniques is the need for (expensive) generation and preparation of highly specific reagents for each individual type of the microorganism to be detected. It is advantageous in these methods, however, that a detection of the microorganisms already includes, depending on the specificity of the reagents used, a more or less accurate identification of the detected microorganism type, provided that cross-reactions with other organism types are a common problem , be ignored.
  • Representatives of the second group of processes typically include, e.g. microcalorimetric, conductivity / impedance and optical measurements.
  • the sample to be examined for the presence of microorganisms for example bacteria
  • a suitable culture medium which promotes the growth of the organisms, and this is incubated under the best possible growth conditions.
  • the detection is then carried out, for example, by detecting the heat production of the culture by means of a microcalorimeter or the changes in the impedance of the culture fluid caused by the growth of the culture by means of suitable conductivity measuring systems.
  • this group of processes also includes simple optical measurements of the turbidity of the culture medium or the optical detection of microorganisms.
  • the advantage of this group of processes lies in the relatively universal application to a large number of organism groups and, with the exception of the last-mentioned process variant, in the comparatively simple operability and automatability.
  • the disadvantage is the lack of the possibility of parallel identification of the microorganisms, which, if necessary, has to be carried out separately using other methods, the relatively long time period between sample application and detection, which is due to cultivation, among other things, and the comparatively high detection limits (e.g. approx. 10 Cells / ml urine in the case of urological specimens which are particularly common in medical practice).
  • DE-Al-32 47 891 describes a method for identifying microorganisms based on the image analysis evaluation of infrared spectra in selected, small wave number ranges (cf. also Giesbrecht, P., Naumann, D., Labi schi nski, H., in: Habermehl: Methods and Automation in Microbiology and Immunology, pp. 198-206, Berlin, Springer Verlag (1985); Naumann, D., Fijala, V., Labi schi nski, H ., Giesbrecht, P., J. Mol. Struct. 174, 165-170 (1988)).
  • the sensitivity of these methods is not sufficient to be able to examine samples for the presence of microorganisms.
  • the object of the invention is to develop a method for the rapid detection of a very small number of microorganisms of the type mentioned at the beginning, and to make it possible to quickly and reliably detect a wide variety of microorganisms, even if the number of microorganisms in the sample to be examined is very small. According to the invention, this object is achieved by the measures specified in patent claim 1.
  • the invention achieves the advantages of the various process groups used to date, namely detection of low microbial counts of microorganisms, possibility of connection with identification processes, low expenditure of time, broad applicability to all types of organism, if possible, using a uniform, easy-to-automate process, combined in one process.
  • the method according to the invention can also be effectively used in the practice of microbiological laboratories in routine operation.
  • the spatially separated growth of microcolonies, starting from individual individuals of the microorganisms directly from the sample to be examined on the culture medium and the examination of a surface sample obtained from the culture medium after true-to-location transmission, does this according to the invention Processes are particularly suitable and valuable for examining samples which should be free of microorganisms or have only a very small number of bacteria.
  • the growth time according to the invention of at least 6 generation times of the organisms to be detected is based on the consideration that a localized concentration of the respective microorganism on a solid support for the sample, in particular on an agar plate, " enriches the microorganism up to one such degrees that the colonies formed are sufficiently large for detection with a microscope, in particular an IR microscope, and an ⁇ R spectroscope due to the low concentration of the microorganisms in the sample to be examined, possibly after a possible one Dilution, it is ensured that the individual microorganisms are applied as individuals in a large spatial separation to the surface of the solid support, so that the resulting colonies of the microorganisms do not adversely affect one another - Organisms in the microscopic range are carried out directly from the sample, without prior or subsequent isolation of the individual microorganisms being necessary.
  • the size of the colonies of the microorganisms should be such that the respective colony has an area which corresponds to a number of at least about 50 individuals, for example bacteria. Starting from a single cell, 64 cells are formed in 6 generation times, the area of which is already sufficient for infrared spectroscopy. In the case of particularly large cells, smaller cells 1, such as 2, may also be sufficient. For security reasons, however, the colony is generally used with a larger surface area, which is achieved in particular by at least 7-12 generation times. 10 generation times correspond to approximately 1000 cells.
  • the length of time within which colonial growth is achieved depends on the growth rate of the individual microorganisms. A generation time of 20-40 minutes is normally sufficient for samples taken from the clinical area and a generation time of approximately one hour for water samples. In order to be sure, the period of time is kept in practice at about 4 to 10 hours. The time required and suitable can also be determined by preliminary tests. It is thereby achieved that the routine application of the method can be carried out with the shortest possible time period in order to achieve the desired result as quickly as possible. Mixing of constituents of different colonies is avoided by the accurate transfer of surface layers of the microcolonies obtained to the optical support. This also makes the method according to the invention suitable for enumeration and identification of the microorganisms.
  • a high optical resolution and meaningfulness are achieved by using diaphragms of a suitable diameter.
  • a particularly suitable device for carrying out the method according to the invention is the subject of claim 10.
  • infrared microscopes which can be reproducibly measured down to below the nanogram range by the further development of the Fourier transform infrared spectroscopy.
  • detection is already possible with the preferred use of one or more, even very small, sections (for example only a few 100 wavenumbers) from the overall spectrum, so that carrier materials can also be used which only have IR in very small wavenumber ranges - are transparent or reflective.
  • stamp impression method for transferring samples from a culture medium usually used in bacteriology, in particular an agar culture plate, where in particular a circular stamp made of IR-transparent material of suitable thickness, for example, proved to be particularly advantageous for rapid detection
  • the culture plate is briefly pressed (for example for less than a second) and then lifted off again, parts of which are on the culture plate (after a brief incubation, for example a urine sample) ) located microcolonies of the possibly also different microorganisms, which are usually not yet perceptible to the naked eye, can be transferred to the stamping plate so that the impression samples on the stamping plate are directly on the sample table of the stamping plate without any further preparation effort FT-IR microscopes can be measured.
  • This procedure also has the advantage that, at the operator's request, the incubation of the original culture plates can be continued for later control purposes.
  • the transfer to the stamp serving as an optical carrier can also take place by pressing the movable stamp made of IR-transparent material of suitable thickness, for example,
  • an additional advantage is the fact that the microscope, in particular the light-optical mode of a preferably used IR microscope (possibly supported by methods of image evaluation with a television camera attached, for example, with or without further image processing) not only to control the interesting ones Areas of the stamp, but also for the preliminary assessment of the sample (for example according to the morphology of the microcolonies, color, shape of the microorganisms (cocci, rods etc.) can be used if desired.
  • the actual, reliable detection is then carried out by Recording the corresponding infrared spectra which, owing to the basic chemical composition (cell wall, membrane, protein, ribosomes, nucleic acids, etc.) common to all microorganisms, have a spectral characteristic which is in principle similar for all microorganisms in question, so that the methodology, as desired, without practically all microorganisms e restriction can be applied.
  • the basic chemical composition cell wall, membrane, protein, ribosomes, nucleic acids, etc.
  • the IR spectra of microorganisms can, if desired, also differentiate without additional equipment identification of the measured microorganisms by comparing the spectra with those of a suitable reference file down to the subspecies level can be carried out using a method previously described (Giesbrecht, P., Naumann, D., Labi schi nski, H., in: Habermehl: Methods and Automation in Microbiology and Immunology, pp.
  • the device according to the invention can, however, advantageously be designed such that all three main tasks, e.g. Detection, identification and, if necessary, even sensitivity tests can be carried out, so that an old goal of a uniform technology with a basically uniform operation for any microorganisms, which cannot be achieved with the previous state of the art, can now be achieved.
  • the sample to be examined such as urine, blood, liquor, water, aqueous extracts
  • the sample to be examined is extracted Foodstuffs, ointments, pharmaceuticals, etc., diluted in the manner customary in microbiology onto a solid culture medium plate in the manner known from microbiology, such that the microorganisms which may be present in the sample grow into colonies in isolated cases.
  • Culture plate on the transparent or reflective support in the desired wavenumber range for example by placing a sample support disk of, for example, about 2 mm thick and 3 cm in diameter made of, for example, ZnSe, polished steel, etc., and then lifting it again, so that the sample support a local impression of adhering microorganisms from the culture plate results.
  • the sample carrier is then transferred to the sample table of the microscope, in particular an IR microscope, in a manually or automatically controlled manner.
  • the sample plate can be inspected manually / visually in the optical mode of the microscope.
  • an initial estimate of the number of bacteria present in the sample can be made from the colony morphology (size , Color, surface quality, etc.) may already be a rough estimate of possibly different organism groups. If no microcolonies can be identified at this point in time, the process can already be ended with the result "negative" at this point.
  • the actual detection then takes place in the infrared spectroscopic mode of the microscope, in that of all or of a representative one
  • the number of microcolonies on the sample carrier are recorded in succession with the aid of the aperture systems integrated in each IR microscope, and the infrared spectra of the corresponding microcolonies are recorded. Only those detected optically previously Mi krokoloni e-prints, * whose Spek ⁇ centers with the typical microorganisms chemical Zusam ⁇ menage (especially proteins Liplde, nucleic acids, polysaccharides) are compatible, are finally accepted as detected.
  • the intended transfer steps ie a) application of the sample to the culture plate, b) transfer of the inoculated culture plate into an incubator, c) stamp impression for transferring the microcolonies from the culture carrier to the optical sample carrier, d) transfer if necessary of the sample carrier on the IR-M1 roskop-sample table and e) removal of the sample after the measurement has been carried out) easily mechanized and / or automated with the aid of conventional mechanical and / or electronic components.
  • An additional, complete automatic process handling can be achieved by adding an image processing system consisting of a camera flanged onto the IR microscope and an electronically - 1 2 -
  • controlled X-Y cross table as a microscope table, an electronically controlled switchover unit between optical and IR microscopic mode of the microscope, a control or computer unit (e.g. personal computer with corresponding interfaces or other computer systems) and one or more corresponding evaluation programs.
  • the computer and control unit, including evaluation programs, can expediently be integrated into the computer / control unit which is used from the outset to control the FT-IR device, including IR microscope.
  • a fully automatic process sequence then takes the following form: After the transfer of the sample carrier containing the microcolony impressions to the XY table of the IR microscope, an image of the carrier in the optical mode of the microscope can be recorded and digitized by the camera ( in at least 256 x 256 pixels, for example 64 gray levels) are passed on to the computer / control unit.
  • the XY positions of possible microcolony impressions can be determined there by evaluating the digital gray scale distribution of the image, for example using a peak search algorithm.
  • the control unit can retract a suitable aperture (diameter, for example, 30-80 ⁇ m), position it on the spatial coordinates of the first suspected microcolon imprint, and register the infrared spectrum at this point.
  • the control unit can then initiate the call of a further subroutine which checks all the spectra registered in this way for their compatibility with microorganism spectra. This can be achieved, for example, by means of a simple cross-correlation, if necessary with prior filtering of the spectrums with reference spectra of microorganisms, since a threshold value for each individual but also combined spectra range with a given filter method of the correlation coefficient between microorganism spectra exists, which, if undershot, identifies the suspected microcolony as inorganic or organic contamination of the sample carrier.
  • a reference number of 5-20 typical microorganism spectra e.g.
  • Staphyl kokke ⁇ streptococci, clostridia, pseudomonas, Entero bacteri aceen, Salmonella, Legionella, bacilli
  • the number of microorganisms present in the sample can then be calculated and output by the control / arithmetic unit based on the number of positions confirmed as microcolony impressions, possibly taking into account corresponding dilution factors, for example as the number of bacteria / ml sample.
  • subsequent identification of the detected microorganisms can also be made by comparison with a reference file v, which consists of reference spectra measured under the same conditions.
  • the required program parts are based on algorithms well known to the person skilled in the art and can be created by yourself or from a large number of generally available program systems (the IMAGIC program, for example, has been successfully used in this context, see M. van Heel, W. Keegstra, Ultramicroscopy 7, 113, 1981).
  • the new method for the detection of microorganisms in the manner described allows rapid qualitative and quantitative detection of microorganisms in principle of all types with the further advantage of additional identification with one and the same basic apparatus in a time of approximately 4-10 hours or less after dispensing samples without prior culture, this time duration is almost completely determined by the necessary incubation time - until M1 microcolons are obtained, since the further process steps only take minutes to less than an hour if the process is carried out appropriately.
  • This example in conjunction with FIG. 2, is intended to demonstrate the extraordinary sensitivity of the new method without describing the entire procedure.
  • 2 shows three spectra obtained in the following manner with an infrared microscope A 560, from Bruker, Düsseldorf, coupled to an IFS 48 FT-IR spectrometer from the same company:
  • microorganisms corresponds to less than 0.1 ng substance
  • Microorganisms are to be preferred if the most detailed possible, eg species identification, is to follow the detection with the same data set. It can be seen from this typical measurement example that the incubation time of the sample on the culture plate should be at least approximately 6 to 12 ' generation times in order to obtain a microcolony of approximately 200 from each microorganism isolated on the culture plate by correspondingly diluted application - To create 4000 organisms. Thus, for example, for enterobacteriaces (typical generation time on " usual media approx. 20 minutes) there is a lower limit for the incubation cell space of less than 4 hours, for staphylococci (generation time on usual media eg 30 minutes) of approx 5 hours etc.
  • enterobacteriaces typically generation time on " usual media approx. 20 minutes
  • staphylococci generation time on usual media eg 30 minutes
  • This example shows a typical process sequence when carrying out a manual experiment using the example of an aqueous sample which has been artificially mixed with 10 cells / ml of Staphylococcus aureus strain Pelzer. 100 ⁇ l of this sample were applied to a Pepto ⁇ agar plate (100 mm in diameter) and distributed using a Drigal sk1 spatula. After an 8-hour incubation period at 37 ° C in an incubator the microcolonies (not yet visible to the naked eye) were transferred to a 40 mm BaF 2 plate in the manner described in Example 1 (stamp impression).
  • Fig. 3 shows an enlarged image (250x) of a section of the sample holder.
  • three Mi krokol onie-PRINT spectra obtained in the range 1800 to 800 cm are in 'Fig. 4 dar ⁇ provided.
  • the visual comparison of the three spectra already shows the excellent reproducibility of the method by - recording different microcolonies of the same microorganism.
  • the D-value of approx. 8 determines the surprisingly good level of reproduction of the method and, in the event of subsequent desired differentiation or identification of the detected microorganisms, provides the pressure value for differentiating between different microorganisms.
  • 17 microcolony prints were detected on the carrier plate via their infrared spectrum. From this value, taking into account the amount of sample used (100 ⁇ l) and the area ratio of the agar plate to the sample carrier area (6.26: 1), an excellent depletion of tea KKeeiimmzzaahll vvoonn 11..0066xx1100 in excellent agreement with the value used.
  • game 3 the amount of sample used (100 ⁇ l) and the area ratio of the agar plate to the sample carrier area (6.26: 1)
  • Staphylococcus aureus, Staphylococcus xyl ⁇ sus and Klebsiell pneu oniae were applied to a peptone-agar plate as in Example 2, after an incubation time of 8 hours and with the same stamp technique applied to the same sample carrier as described in Example 2.
  • 3 shows a 250x enlarged section of the sample carrier. Because of the location-specific and therefore area-precise transmission of the microcolonies, the observation in the optical mode of the microscope already gives indications for the involvement of several organisms, even for an experimentally trained bacteriologist, since the different microcolony sizes, as shown in Fig 4 shows three different microorganisms.
  • the single bacterial morphology (eg cocci or rods) can also be used.
  • ( d ) e.g. stamp imprint on ZnSe, BaF 2 _ Scll eiben, ' polymer film, aluminum plate, polished steel plate etc.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Detektion und Enumeration von Mikroorganismen und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Die spektroskopische Detektion erfolgt nach kurzer Inkubation der zu untersuchenden Probe über die Detektion des mit dem bloßen Auge noch nicht feststellbaren Wachstums von Mikrokolonien auf einer festen Nährbodenplatte nach direkter Übertragung dieser Mikrokolonien auf einen Probenträger mittels spezieller Abdrucktechniken; die Detektion selbst erfolgt durch die Registrierung der Spektren aller, bzw. einer repräsentativen Zahl von Abdrücken mittels eines IR-Mikroskops. Dadurch können nicht nur Aussagen über die Zahl der Mikroorganismen in der Probe getroffen werden, sondern auch der hohe Informationsgehalt der Spektren für anspruchsvolle mikrobiologische Differenzierungsarbeiten bis hin zur Speziesidentifizierung genutzt werden.

Description

Beschreibung
Verfahren zur schnellen Detektion von Mikroorganismen in Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Detektio von Mikroorganismen in einer Vielzahl von Proben, w e z.B. Urin, Blut, Wasser, Lebensmitteln, pharmazeutischen Rohstof fen und Produkten, wie z.B. Salben, Flüssigpräparaten etc., die in der Regel frei von solchen Mi kroorgani sinen ,sei n sol¬ len oder bei denen bestimmte, festgelegte Grenzwerte an Ge¬ samtkeimzahl oder auch an einzelnen, definierten Vertretern von Mikroorganismen nicht überschritten werden sollen, sowi eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens»
Derartige Detekti onsarbeiten werden im klinischen Bereich (Sepsis, Harnwegsinfektionen, Li quortestung) und außerkl ini sehen Bereich (Beurteilung der Keimfreiheit bzw. B&lastung von Ausgangsmaterialien und Endprodukten, wie z.B. Wasser, Milch, Lebensmittel etc.) in großem Umfang vorgenommen, da die Ergebnisse derartiger Tests von großer klinischer Bedeu¬ tung aber auch von großer Bedeutung für Qualitätskontrolle, Haltbarkeitsbeurteilung und andere Produkt- und Produktions¬ mitteltests z.B. in industriellen Betrieben sind. Dabei ist wegen der häufigen Möglichkeit des expontiellen Wachstums der zu detekti erenden Mikroorganismen und der im klinischen Bereich oft notwendigen sehr frühzeitigen Erkennung von, z.B. Infektionen zur Einleitung therapeutischer Maßnahmen, z.B. im Falle lebensbedrohender Sepsis bzw. im außerklini¬ schen Bereich, z.B. im Falle der Produktion von Pharmaka zur Verhinderung der Unbrauchbarkeit ganzer Chargen, z.B. bei Verwendung verunreinigter Ausgangsmaterialien mit möglicher¬ weise erheblichen ökonomischen Folgen, eine Detektion auch ggeerriinnggeerr KKeeiimmzzaahhlleenn ((zz..BB.. << T10 pro ml bzw. g Probe) in mög- liehst kurzer Zeit gefordert.
Bei der Durchführung von Detektionsprüfungen bedient man sich in der Regel beim derzeitigen Stand der Wissenschaft entweder Verfahren, die sehr schnell und hochspezifisch sehr kleine Mengen bestimmter, einzelner Gruppen von Mikroorga¬ nismen zu detektieren gestatten, und solcher, die weniger schnell und mit vergleichsweise deutlich größeren Mengen an Mikroorganismen (etwa>10 Bakterien pro ml Uπtersuchungs- probe) eine große Vielzahl von verschiedenen Mi roorganis¬ men unspezifisch nachweisen können (für eine Übersicht vgl. z.B. in: Bergan, T.: Methods in Mi crobiol og , Vols. 14-16, London, Orlando, San Diego, San Francisco, New York, Toron¬ to, Montreal, Sydney, Tokyo, Sao Paulo: Academic Press (1984); Kipps, T.J., Herzenberg, L.A., in: Habermehl, K.-O.: Rapid Methods and Automation in Microbiology and Im unology, Berlin, New York, Tokyo: Springer Verlag (1985); Toorova, T.P., Antonov, A.S., in: Colwell, R.R. und Grigorova, R.: Methods in Microbiology, Vol. 19, London, Orlando, San Diego, New York, Austin, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto: Academic Press (1987); Thronsberry, C, in: Habermehl, K.-O.: Rapid Methods and Automation in Microbiology and Im- munology, Berlin, New York, Tokyo: Springer Verlag (1985); Carlberg, D.M., in: Lorian, V.: Antibiotics in Laboratory Medicine, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney: Williams
Wilkiπs (1986)). Zu der ersten Gruppe gehören insbesondere molekularbiologische Nachweismethoden, mit denen die Detek¬ tion indirekt durch Nachweis einer Reaktion der Probe, z.B. mit monoklonalen Antikörpern oder aber auch durch DNA/DNA- Hybridisierung u.a. Techniken erfolgt. Charakter stisch für diese Techniken ist die Notwendigkeit der (kostspieligen) Erzeugung und Bere tstellung von hochspezifischen Reagenzie für jeden einzelnen Typ der zu detektierenden Mikroorga¬ nismen. Vorteilhaft bei diesen Verfahren ist jedoch, daß eine Detektion der Mikroorganismen gleichzeitig bereits eine, je nach Spezifität der verwendeten Reagenzien, mehr oder weniger genaue Identifizierung des detektierten Mi- kroorgaπi smustyps mit beeiπhaltet, sofern Kreuzreaktionen mit anderen Organismustypen, die ein häufiges Problem dar¬ stellen, vernachlässigt werden. Ihr Einsatz, der ohnehin bisher kaum routinemäßig erfolgt, ist daher absehbar auf einzelne, besonders wichtige (z.B. lebensbedrohende Keime i Falle einer Infektion) Organismengruppen beschränkt. Zu den Vertretern der zweiten Verfahrensgruppe gehören typischer¬ weise, z.B. mikrokalorimetrische, Leitfähi gkeits/Impedanz- und optische Messungen.
Bei diesen Methoden wird in der Regel die auf Anwesenheit von Mikroorganismen, z.B. Bakterien, zu untersuchende Probe in ein geeignetes, das Wachstum der Organismen förderndes Kulturmedium gegeben und dieses bei möglichst optimalen Wachstumsbedingungen inkubiert. Die Detektion erfolgt dann zum Beispiel durch Nachweis der Wärmeproduktion der Kultur mittels eines Mi krokal orimeters oder der durch das Wachstum der Kultur verursachten Veränderungen der Impedanz der Kul¬ turflüss gke t mittels geeigneter Leitf higkeitsmeßsysteme. Im weiteren Sinn gehören zu dieser Verfahrensgruppe auch einfache optische Messungen der Trübung des Kulturmediums oder der lichtoptische Nachweis von Mikroorganismen. Der Vorteil dieser Verfahrensgruppe liegt in der relativ univer¬ sellen Anwendung auf sehr viele Organismusgruppen und, mit Ausnahme der letztgenannten Verfahrensvariante, in der ver¬ gleichsweise einfachen Bedieπbarkeit und Automatisierbar- keit. Nachteilig ist dagegen die fehlende Möglichkeit einer parallelen Identifizierung der Mikroorganismen, die, falls erforderlich, separat mit anderen Verfahren durchgeführt werden muß, sowie der u.a. durch Kultivierung bedingte rela¬ tiv lange Zeitraum zwischen Probenaufgabe und Detektion und die vergleichsweise hohen Nachweisgrenzen (z.B. ca. 10 Zel¬ len/ml Urin im Falle der in der medizinischen Praxis beson¬ ders häufigen urologischeπ Proben).
In der DE-Al-32 47 891 ist ein Verfahren zur Identifizierung von Mi roorganismen auf der Basis der bildanalytischen Aus¬ wertung von Infrarotspektren in ausgewählten, kleinen Wel¬ lenzahl bereichen beschrieben (vgl. auch Giesbrecht, P., Naumann, D., Labi schi nski , H., in: Habermehl: Methods and Automation in Microbiology and Immunology, S. 198-206, Ber¬ lin, Springer Verlag (1985); Naumann, D., Fijala, V., Labi schi nski , H., Giesbrecht, P., J. Mol. Struct. 174, 165-170 (1988)). Trotz leistungsf higer Infrarot-Spektrosko¬ pe und Infrarot-Mikroskope reicht die Empfindlichkeit dieser Verfahren nicht aus, um Proben auf das Vorhandensein von Mikroorganismen untersuchen zu können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur schnellen Detektion einer sehr kleinen Anzahl von Mikro¬ organismen der eingangs erwähnten Art zu entwickeln, und die Möglichkeit zu schaffen, die unterschiedlichsten Mikro¬ organismen schnell und sicher nachzuweisen, auch wenn die Anzahl von Mikroorganismen in der zu untersuchenden Probe sehr gering ist. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Patentan- spruch 1 angegebenen Maßnahmen gelöst. Durch die Erfindung werden die Vorteile der verschiedenen bisher eingesetzten Verfahrensgruppen, nämlich Nachweis geringer Keimzahlen von Mikroorganismen, Verbindungsmöglichkei mit Identifizie¬ rungsverfahren, geringer Zeitaufwand, breite Anwendbarkeit auf möglichst alle Organismustypen nach einem einheitlichen, leicht zu automatisierenden Verfahren, bei einem Verfahren kombiniert erreicht. Gleichzeitig ist das erfindungsgemäße Verfahren auch in der Praxis der mikrobiologischen Laborato¬ rien im Routinebetrieb effektiv einsetzbar. Das räumlich getrennte Wachstum von Mi krokol oni en, ausgehend von einzel- neπ Individien der Mi roorganismen direkt aus de≠ zu unter¬ suchenden Probe auf dem Kulturträger und die Untersuchung einer aus dem Kulturträger gewonnenen Oberfl chen-Probe nach ortsgetreuer Übertragung, macht das erfindungsgemäße Verfah¬ ren gerade zur Untersuchung von Proben, die an sich frei von Mikroorganismen sein sollten oder nur eine sehr geringe Keimzahl aufweisen, geeignet und wertvoll.
Die erfindungsgemäß vorgesehene Wachstumszeit von zumindest 6 Generationszeiten der zu detektierenden Organismen beruht auf der Überlegung, daß eine ortsgebundene Konzehtri eruπg des jeweiligen Mikroorganismus auf einem festen- Träger für die Probe, insbesondere auf einer Agarpl atte," eine Anreiche¬ rung des Mikroorganismus bis zu einem solchen Grade dar¬ stellt, daß die gebildeten Kolonien für die Detektion mit einem Mikroskop, insbesondere IR-Mi kroskop, und einem ΪR- Spektroskop ausreichend groß sind. Durch die geringe Konzen tration der Mikroorganismen in der zu untersuchenden Probe, ggf. nach einer etwaigen Verdünnung, wird sichergestellt, daß die einzelnen Mikroorganismen als Individien in einer s großen räumlichen Trennung auf die Oberfläche des festen Trägers aufgebracht werden, daß die daraus entstehenden Ko¬ lonien der Mikroorganismen sich gegenseitig nicht beein¬ trächtigen. Auf diese Weise wird eine Reinzucht der Mikro- Organismen im mikroskopischen Bereich unmittelbar aus der Probe durchgeführt, ohne daß eine vorherige oder nachfolgen¬ de Isolation der einzelnen Mikroorganismen erforderlich ist. Die Größe der Kolonien der Mikroorganismen soll so sein, daß die jeweilige Kolonie eine Flächenausdehnung besitzt, die einer Anzahl von mindestens ca. 50 Individien, z.B. Bakte¬ rien, entspricht. Ausgehend von einer Einzelzelle werden in 6 Generationszeiten 2 gleich 64 Zellen gebildet, deren Flä¬ chenausdehnung für die Infrarot-Spektroskopie bereits aus¬ reicht. Bei besonders großen Zellen können auch geringere Zel 1 anzahlen, wie 2 ausreichend sein. Aus Sicherheitsgrün¬ den wird jedoch in der Regel mit einer größeren Flächenaus¬ dehnung der Kolonie gearbeitet, die insbesondere durch min¬ destens 7 - 12 Generationszeiten erreicht wird. 10 Genera¬ tionszeiten entsprechen etwa 1000 Zellen.
Die Zeitdauer, innerhalb derer das Kolonienwachstum erreicht wird, hängt von der Wachstumsgeschwindigkeit der einzelnen Mikroorganismen ab. Normalerweise ist eine Generationszeit von 20 - 40 Minuten für Proben, die aus dem klinischen Be¬ reich entnommen werden, und eine Generationszeit von ca. einer Stunde, für Wasserproben ausreichend. Um sicher zu gehen, wird die Zeitdauer in der Praxis bei ca. 4 - 10 Stun¬ den gehalten. Die jeweils erforderliche und geeignete Zeit¬ dauer kann auch durch Vorversuche ermittelt werden. Dadurch wird erreicht, daß bei der routinemäßigen Anwendung des Ver¬ fahrens mit der kürzestmögl ichen Zeitdauer gearbeitet werden kann, um das gewünschte Ergebnis möglichst schnell zu errei¬ chen. Durch die ortsgetreue Übertragung von Oberflächen¬ schichten der erhaltenen Mikrokolonien auf den optischen Träger, wird eine Vermischung von Bestandteilen verschiede¬ ner Kolonien vermieden. Dies macht das erfindungsgemäße Ver¬ fahren auch zur Enumeration und Identifikation der Mikro¬ organismen geeignet. Durch die Verwendung von Blenden geeig¬ neten Durchmessers wird eine hohe optische Auflösung und Aussagekraft erreicht. Eine besonders geeignete Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist Gegenstand der Anspruchs 10. Vorteilhafte Weiterentwicklungen und Merkmale des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung enge&en sich aus den Unteransprüchen in Verbindung mit der nachfolgenden Be¬ schreibung. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Kombination- miteinander verwirklicht sein. •
Von besonderem Vorteil ist die bevorzugte Verwendung von Infrarot-Mikroskopen, die durch die meßtechnische Weiterent¬ wicklung der Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie Pro¬ benmengen bis unter den Nanogra mm-Bereich hinab reprodu¬ zierbar vermessen lassen. Durch die neu entwickelten Techni¬ ken der Probenübertragung von Mikrokolonien άer Mikroorga¬ nismen ohne vorherige Reinkultur, iπsbesondere~direkt auf infrarotdurchlässige oder reflektierende Trägermaterialien, die unmittelbar im optischen und infrarotspektroskopisehen Mode des IR-Mikroskops vermessen werden können, wird eine besonders schnelle und sichere Detektion ermöglicht. Über¬ raschenderweise gelingt die Detektion bereits bei der bevor¬ zugten Verwendung eines oder mehrerer auch sehr kleiner Aus¬ schnitte (z.B. nur wenige 100 Wellenzahlen) aus dem Gesamt¬ spektrum, so daß auch Trägermaterialien verwendet werden können, die nur in sehr kleinen Wellenzahlbereichren IR- transparent oder gut reflektierend sind. Als besonders vor¬ teilhaft für die schnelle Detektion erwies sich die Verwen¬ dung eines Stempel abdruckverfahrens zur Probenübertragung von einem in der Bakteriologie üblicherweise verwendeten Kulturträger, insbesondere einer Agarkulturplatte, woiei insbesondere ein z.B. kreisrunder Stempel aus IR-transparen tem Material geeigneter Dicke, auf zweckmäßige Weise mit Hilfe einer Führung, ggf. auch direkt mit der Han*d", an die Kulturplatte kurz (z.B. für weniger als eine Sekunde) ange¬ drückt und wieder abgehoben wird, wobei Teile der auf der Kulturplatte (nach kurzem Bebrüten z.B. einer Urinprobe) sich befindlichen, mit bloßem Auge in der Regel noch nicht wahrnehmbaren Mi krokolonien der ggf. auch verschiedenen Mikroorganismen ortsgetreu auf die Stempelpl atte übertragen werden können, so daß die Abdruck-Proben auf der Stempel¬ platte ohne weiteren Präparationsaufwand direkt auf dem Pro¬ bentisch des FT-IR-Mi kroskops vermessen werden können. Diese Vorgehensweise bietet darüber hinaus den Vorteil, daß auf Wunsch des Operators die Bebrütung der originalen Kultur¬ platten für spätere Kontrollzwecke fortgeführt werden kann. Die Übertragung auf den als optischen Träger dienenden Stem¬ pel kann auch durch Andrücken des bewegbaren Kulturträgers gegen die Stempeloberfl äche erfolgen.
Als zusätzlicher Vorteil erweist sich die Tatsache, daß das Mikroskop, insbesondere der lichtoptische Modus eines bevor¬ zugt verwendeten IR-Mi kroskops (ggf. unterstützt durch Methoden der Bildauswertung bei zum Beispiel aufgesetzter Fernsehkamera mit oder ohne weitere Bildverarbeitung) nicht nur zur Ansteuerung der interessanten Bereiche des Stempels, sondern auch zur Vorbeurteilung der Probe (z.B. nach Morpho¬ logie der Mi krokolonien , Farbe, Gestalt der Mikroorganis¬ men (Kokken, Stäbchen etc.), falls gewünscht, mitbenutzt werden kann. Die eigentliche, sichere Detektion erfolgt dann durch Aufnahme der entsprechenden Infrarot-Spektren, die aufgrund der allen Mikroorganismen gemeinsamen grundlegenden chemischen Zusammensetzung (Zellwand, Membran, Protein, Ri- bosomen, Nukleinsäuren, etc.) eine für alle in Frage kommen¬ den Mikroorganismen prinzipiell ähnliche spektrale Charak¬ teristik aufweisen, so daß die Methodik, wie gewünscht, auf praktisch alle Mikroorganismen ohne Beschränkung angewendet werden kann. Dabei erweist es sich als besonderer Vorteil der Methode, daß die IR-Spektren von Mikroorganismen, unge¬ achtet ihrer prinzipiellen Ähnlichkeit als Folge der spezi¬ fischen chemischen Zusammensetzung der Zellen einzelner Mikroorganismentypen, falls gewünscht, ohne weiteren appara¬ tiven Aufwand auch eine Differenzierung und Identifizierung der vermessenen Mikroorganismen durch Vergleich der Spek¬ tren mit denen einer geeigneten Referenzdatei bis hin zur Subspezies-Ebene durchführen läßt unter Verwendung einer früher beschriebenen Arbeitsweise (Giesbrecht, P., Naumann, D., Labi schi nski , H., in: Habermehl : Methods and Automation in Microbiology and Immunology, S. 198-206, Berlin: Springe Verlag (1985); Naumann, D., Fijala, V., Labi schinski , H., Giesbrecht, P., J. Mol. Struct. V74, 165-170 (1988)), auf die hier verwiesen wird.
Gemäß der Erfindung ist es, wie bereits erwähnt, möglich, zusätzlich zur Detektion auch eine Identifizierung von Mikroorganismen vorzunehmen. Die erfindungsgemäße Vorrich¬ tung kann jedoch mit Vorteil so ausgestaltet sein, daß alle drei Hauptaufgaben, z.B. Detektion, Identifizierung und ggf sogar Empfindlichkeitsprüfungen, vorgenommen werden können, so daß ein altes, mit dem bisherigen Stand der Technik aber nicht realisierbares Ziel einer einheitlichen Technik mit prinzipiell einheitlichem Arbeitsgang für beliebige Mikro¬ organismen nunmehr verwirklicht werden kann. In diesem Zu¬ sammenhang erweist es sich als sehr vorteilhaft, en gesam¬ ten Verfahrensablauf von der Probenaufbereitung über die Probenvermessung bis zur Ausgabe des Ergebnisses vollständi zu automatisieren, falls gewünscht sogar unter Einbeziehung einer nachfolgenden Weiterverarbeitung des Ergebnisses, etw im Sinne einer Identifizierung oder Empfindlichkeitsprüfung da das Verfahren für alle in Frage kommenden Mikroorganis¬ men im Prinzip einheitlich durchgeführt werden kann und die Technik der Spektrenregistrierung durch die FT-IR-mi krosko- pische Technik von vornherein ein digitales und damit leich auf elektronischem Wege zu verarbeitendes Meßergebnis lie¬ fert.
Bei der Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende Pro¬ be, wie z.B. Urin, Blut, Liquor, Wasser, wäßrige Auszüge au Lebensmitteln, Salben, Arzneimitteln etc., in der in der Mi¬ krobiologie üblichen Weise auf eine feste Nährbodenplatte in der aus der Mikrobiologie bekannten Art so verdünnt plat¬ tiert, daß die ggf. in der Probe vorhandenen Mikroorganis¬ men zu Kolonien vereinzelt wachsen. Nach einer kurzen Kulti¬ vierungszeit von etwa 4-10 Stunden (in Abhängigkeit von der Probenart und der Generationszeit der zu detektierenden Mikroorganismen), in der sich auf der Platte mit dem Auge noch nicht detekti erbare M1 krokol onien aus zum Beispiel ca.
3 10 Organismen gebildet haben, erfolgt der Transfer von der
Kulturplatte auf den im gewünschten Wellenzahl bereich durch¬ lässigen oder reflektierenden Träger, z.B. durch Auflegen einer Probenträgerscheibe von z.B. ca. 2 mm Dicke und 3 cm Durchmesser aus z.B. ZnSe, poliertem Stahl etc. und an¬ schließendes Wiederanheben, so daß sich auf dem Probenträger ein ortsentsprechender Abdruck von anhaftenden Mikroorga¬ nismen von der Kulturplatte ergibt. Der Probenträger wird anschließend manuell oder auch automatisch gesteuert auf den Probentisch des Mikroskops, insbesondere IR-Mikroskops, überführt. An dieser Stelle des Verfahrens sind je nach Wunsch des Experimentators und gegebener Detail ausstattung des Mikroskops mehrere Varianten möglich. Im einfachsten Falle kann die Probenplatte im optischen Mode des Mikro¬ skops manuell /visuell inspiziert werden. Aus der Zahl der optisch erkennbaren Mi krokol onien kann (unter Berücksichti¬ gung eventueller Verdünnungsfaktoren je nach Probenverdün¬ nung in der in der Mikrobiologie üblichen Weise) bereits eine erste Abschätzung über die in der Probe vorhandene Keimzahl erfolgen, aus der Kolonie-Morphologie (Größe, Far¬ be, Oberflächenbeschaffenheit etc.) eventuell auch bereits eine grobe Abschätzung über eventuell unterschiedliche Orga nismusgruppen. Sind zu diesem Zeitpunkt keine Mikrokolonien erkennbar, kann das Verfahren an dieser Stelle bereits mit dem Ergebnis "negativ" beendet werden. Die eigentliche De¬ tektion erfolgt dann 1m Infrarotspektroskopischen Mode des Mikroskops, in dem von allen, bzw. von einer repräsentative Zahl der auf dem Probenträger befindlichen Mi krokolonien nacheinander unter Zuhilfenahme der in jedem IR-Mikroskop integrierten Blendensysteme die Infrarot-Spektren der ent¬ sprechenden Mi krokol onien registriert werden. Nur solche optisch vorher erfaßten Mi krokoloni e-Abdrücke,* deren Spek¬ tren mit der für Mikroorganismen typischen chemischen Zusam¬ mensetzung (vor allem Proteine, Liplde, Nukleinsäuren, Poly- saccharide) kompatibel sind, werden als endgültig detektiert akzeptiert. Auf diese Weise wird verhindert, daß im opti¬ schen Mode erkannte Abdruck-Stellen, die z.B. von anorgani¬ schen Verschmutzungen (Staub etc.) oder auch z.B. von Über¬ tragungen von Medien- oder Agarkomponenten stammen, fehler¬ haft zum Ergebnis beitragen. Die erhaltenen Spektren können, falls gewünscht, im Sinn einer Verfahrensvariante, sofort anschließend oder auch zu einem späteren Zeitpunkt durch Abgleich mit einer Spektrenreferenzdatei in defo oder den gewünschten, auch sehr kleinen Spektralbereich (en ) , nach de veröffentlichten Verfahrensgrundsätzen (s.o.) auch hinsicht lich einer Identifizierung der Mikroorganismen herangezogen werden. Um, falls gewünscht, eine größere Unabhängigkeit de Verfahrens von menschlichen Eingriffen in den Verfahrens¬ gang, wie oben prinzipiell beschrieben, zu erreichen, sind eine Reihe weiterer Verfahrensmodifikationen möglich. So können z.B. die vorgesehenen Transferschritte (also a) Auf tragung der Probe auf die Kulturplatte, b) Übertragung der beimpften Kulturplatte in einen Inkubator, c) Stempelab¬ druck zur Übertragung der Mikrokoloni en vom Kulturträger au den optischen Probenträger, d) ggf. Überführung des Proben trägers auf den IR-M1 roskop-Probenti seh und e) Abtranspor der Probe nach erfolgter Messung) leicht mechanisiert und/oder automatisiert unter Zuhilfenahme üblicher mechani¬ scher und/oder elektronischer Komponenten vorgenommen wer¬ den. Eine darüber hinausgehende, vollständige automatische Verfahrensabwicklung kann erreicht werden durch Hinzufügen eines Bildverarbeitungssystems, bestehend aus einer auf dem IR-Mikroskop angeflanschten Kamera, einem elektronisch ge- - 1 2 -
steuerten X-Y-Kreuztiseh als Mikroskoptisch, einer elektro¬ nisch gesteuerten Umschalteinheit zwischen optischen und IR-mi kroskopischem Mode des Mikroskops, einer Steuer- bzw. Rechnereinheit (z.B. Personalcomputer mit entsprechenden Interfaces oder auch andere Rechnersysteme) und einem oder mehreren entsprechenden Auswerteprogrammen. Zweckmäßigerwei se kann die Rechner- und Steuereinheit einschließlich Aus¬ werteprogrammen in die der Steuerung des FT-IR-Geräts ein¬ schließlich IR-Mi kroskops dienenden, von vornherein vorhan¬ denen Rechner-/Steuereinheit integriert werden.
Ein vollautomatischer Verfahrensablauf gestaltet sich dann in folgender Weise: Nach dem Transfer des die Mikrokolo- nien-Abdrücke enthaltenden Probenträgers auf den X-Y-Tisch des IR-Mikroskops kann eine Abbildung des Trägers im opti¬ schen Mode des Mikroskops von der Kamera aufgenommen und digitalisiert (in zumindest 256 x 256 Pixel, z.B. 64 Grau¬ stufen) an die Rechner-/Steuereinheit weitergegeben werden. Dort können mittels eines Teilprogramms die X-Y-Positionen möglicher Mi krokolonien-Abdrücke durch Auswertung der digi¬ talen Graustufenverteilung des Bildes, z.B. mit einem Peak- such-Algori thmus, ermittelt werden. Darauffolgend kann von der Steuereinheit eine geeignete Blende (Durchmesser z.B. 30-80 μm) eingefahren, eine Positionierung auf die Ortskoo dinaten des ersten vermuteten Mi krokolonlen-Abdrucks vorge nommen und das Infrarot-Spektrum an dieser Stelle regi¬ striert werden. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, bis alle vorher ermittelten X-Y-Positionen abgearbeitet sind. Die Steuereinheit kann anschließend den Aufruf eines weite ren Teilprogramms veranlassen, das sämtliche so registrier ten Spektren auf ihre Kompatabi11tat mit Mikroorganismen- Spektren hin überprüft. Dies kann z.B. über eine einfache Kreuzkorrelation ggf. mit vorhergehender Filterung der Spe tren mit Referenzspektren von Mikroorganismen erreicht wer den, da für jeden einzelnen aber auch kombinierten Spektra bereich bei vorgegebener Filtermethode ein Threshold-Wert des Korrel ationskoeffizienten zwischen Mikroorganismus-Sp tren existiert, dessen Unterschreitung die vermutete Mikr kolonie als anorganische oder organische Verunreinigung d Probenträgers identifiziert. Dabei reicht eine Referenzda von 5-20 typischen Mi roorganismen-Spektren (z.B. Staphyl kokkeπ, Streptokokken, Clostridien, Pseudomonaden, Entero bacteri aceen , Salmonellen, Legionellen, Bazillen) zur sic ren Diskriminierung zwischen Mikroorganismen und Verunrei gung aus. Selbstverständlich können für spezielle Anwendu gen auch Peaktabellen oder z.B. eine Auswertung mittels b kannter Methoden der multivariaten Statistik herangezogen werden. Die Zahl der in der Probe vorhandenen Mikroorga¬ nismen kann anschließend von der Steuer-/Recheneinheit au der Anzahl der als Mi rokolonien-Abdrücke bestätigten Pos tionen, ggf. unter Berücksichtigung entsprechender Verdün nungsfaktoren z.B. als Keimzahl/ml Probe berechnet und au gegeben werden. Mit Hilfe der Steuer- und Recheneinheit k natürlich, falls gewünscht, bei entsprechender Programmie rung auch eine nachfolgende Identifizierung der detektier Mikroorganismen durch Vergleich mit einer Referenzdatei v genommen werden, die aus unter gleichen Bedingungen gemes nen Referenzspektren besteht. Die benötigten Programmteil bauen auf dem Fachmann wohlbekannten Algorithmen auf und können selbst erstellt oder aus einer Vielzahl von allgem erhältlichen Programmsystemen (erfolgreich verwendet in d sem Zusammenhang wurde z.B. das Programm IMAGIC, siehe M. van Heel , W. Keegstra, Ultramicroscopy 7, 113, 1981) über nom en werden.
Insgesamt erlaubt das neue Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in der geschilderten Weise einen raschen qualitativen und quantitativen Nachweis von Mikroorganis¬ men prinzipiell aller Art mit dem weiteren Vorteil der zu sätzlichen Identifizierung mit ein und derselben Grundapp ratur in einer Zeit von ca. 4-10 Stunden oder weniger nac Probenabgabe ohne vorherige Reinkultur, wobei diese Zeit- dauer fast vollständig durch die notwendige Inkubationszeit - bis zum Erhalt von M1krokolon1en bestimmt wird, da die wei¬ teren Verfahrensschritte lediglich Minuten bis weniger als eine Stunde bei geeigneter VerfahrensdurchfUhrung in An¬ spruch nehmen.
Eine Grobübersi cht über den gesamten Verfahrensablauf von bevorzugten Ausführungsformen zeigt Fig. 1 in schemati- scher Darstellung.
Beispiel 1
Dieses Beispiel 1 soll im Zusammenhang mit Fig. 2 die außerordentliche Sensitivität des neuen Verfahrens belegen, ohne den gesamten Verfahreπsabl auf zu beschreiben. Fig. 2 zeigt drei mit einem Infrarot-Mikroskop A 560, Fa. Bruker, Karlsruhe, gekoppelt an ein IFS 48 FT-IR-Spektro- meter derselben Firma auf folgende Weise erhaltene Spektren:
3 100 ul einer 10 Keime/ml enthaltende Kultur von Klebsiella pneu iniae, ATCC 13882 in Peptonwasser wurde auf eine Pep- ton-Agarpl atte ausplattiert und für 8 Stunden bei 37 °C in¬ kubiert (ca. 24 Generationszeiten). Der Abdruck der Bakte¬ rien erfolgte durch vorsichtiges Auflegen und Wiederabheben eines polierten BaF« Probeträgers von 40 mm Durchmesser und 3 mm Dicke. Der dabei übertragene, in der Regel (insbeson¬ dere bei kürzeren Inkubationszeiten) aus 1-3 Bakterien¬ schichten bestehende Bakterienfilm trocknet innerhalb weni¬ ger Sekunden bei Raumbedingungen ohne Anwendung von Vakuum oder Trocknungsmitteln an. Die Inspektion des Probenträgers im optischen Mode des IR-Mikroskops (Objektiv 15x, Casse- graniaπ, Okular 20x) ergab einen ausgedehnten, dünnen, l-31agigen Bakterienfilm über praktisch die gesamte Proben¬ trägerfläche. Durch die Wahl geeigneter Kreisblenden wurde erreicht, daß jeweils ca. 10 (Spektrenzug 1 in Fig. 2, Blende 80 μm Durchmesser), ca. 10 (Spektrenzug 2, Blende 40 μm Durchmesser) bzw. ca. 10 (Spektrenzug 3, Blende 20 μ Durchmesser) Mikroorganismen zum Spektrum beitragen. Sämtli che Spektren wurden in Transmission vermessen, 512 Scans wurden bei einer spektralen Auflösung von 8 cm akkumu¬ liert. Inspektion der Fig. 2 zeigt eindeutig, daß be- reits bei ca. 10 Mikroorganismen (entspricht weniger als 0,1 ng Substanz) klar als Mikroorganismen-Spektren zu detek tierende Spektrensignale, hier 1m Bereich von ca. 4000 - 90 Wellenzahlen dargestellt, zu erhalten sind. Aufgrund des relativ hohen Rauschaπtei 1 s (vgl. Spektrenzug 3 n Fig. 2) ist jedoch das Arbeiten mit zumindest ca. 10
Mikroorganismen dann vorzuziehen, wenn eine möglichst tief¬ gehende, z.B. Spezies-Identifizierung sich an die Detektion mit dem gleichen Datensatz anschließen soll. Aus diesem ty¬ pischen Meßbeispiel ist abzulesen, daß die Inkubationszeit der Probe auf der Kulturplatte zumindest ca. 6 bis 12'Gene- rationszeiten betragen sollte, um aus jedem auf der Kultur¬ platte durch entsprechend verdünntes Auftragen vereinzelten Mikroorganismus eine Mikrokoloπie von ca. 200 - 4000 Orga¬ nismen entstehen zu lassen. Somit ergibt sich z.B. für En- terobacteriaceen (typische Generationszeit auf" üblichen Me¬ dien ca. 20 Minuten) eine untere Grenze für den Inkubations zeltraum von weniger als 4 Stunden, für Staphylokokken (Ge¬ nerationszeit auf üblichen Medien z.B. 30 Minuten) von ca. 5 Stunden etc..
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt einen typischen Verfahrensablauf bei manueller Versuchsdurchführung am Beispiel einer wäßrigen Probe, die künstlich mit 10 Zellen/ml von Staphylococcus aureus Stamm Pelzer versetzt wurde. 100 μl dieser Probe wur den auf eine Peptoπ-Agarpl atte (100 mm Durchmesser) aufge¬ tragen und mit Hilfe eines Drigal sk1-Spatels verteilt. Nach 8-stündiger Inkubationszeit bei 37 °C 1n einem Brutschrank wurden die (mit bloßem Auge noch nicht erkennbaren) Mikroko- lonien in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise (Stempelab¬ druck) auf eine 40 mm BaF2 Platte ortsgetreu übertragen.
Fig. 3 zeigt eine vergrößerte Aufnahme (250x) eines Ausschnitts des Probenträgers. Die von den in < Fig. 3 gezeigten drei Mi krokol onie-AbdrUcken erhaltenen Spektren im Bereich zwischen 1800 und 800 cm sind in ' Fig. 4 dar¬ gestellt. Schon der visuelle Vergleich der drei Spektren zeigt die ausgezeichnete Reproduzierbarkeit der Methode bei - Erfassung unterschiedlicher Mi krokoloni en des gleichen Mikroorganismus. Zur quantitativen Bestätigung wurde durch Kreuskorrel ati on der sogenannte Differenzzierungsindex D (D= (1- oC ) • 1000,σc= Pearson-scher Korrelationskoeffizient) bestimmt. Er ergab sich bei den hier gezeigten ebenso wie bei weiteren Spezies analog durchgeführten Messungen zu D«5» 8 unter Einbeziehung von Messungen von unabhängig präparier¬ ten Proben, die zu unterschiedlichen Zeiten auf Agarplatten unterschiedlicher Chargen desselben Nährmediums angefertigt wurden. Somit bestimmt der D-Wert von ca. 8 (entsprechend einem Korrel atioπskoeffizient von 0.9921) das überraschend gute Reproduktionsniveau des Verfahrens und liefert für den Fall einer gewünschten anschließenden Differenzierung bzw. Identifizierung der detektierten Mikroorganismen den Thres- hold-Wert zur Unterscheidung verschiedener Mikroorganismen. Im beschriebenen Beispiel wurden auf der Trägerplatte 17 Mi krokolonien-Abdrücke über ihr Infrarot-Spektrum detek- tiert. Aus diesem Wert errechnet sich unter Berücksichtigung der eingesetzten Probenmenge (100 μl ) und des Flächenver¬ hältnisses von Agarplatte zu Probenträgerfläche (6.26 : 1) eeiinnee ddeetteekkttiieerrttee KKeeiimmzzaahhll vvoonn 11..0066xx1100 in exzellenter Über- einstimmung mit dem eingesetzten Wert. Bei spi el 3
Dieses Beispiel illustriert die Vorgehensweise einer sich a die Detektion anschließenden Identlfi zierung der. gefundenen
Mi kroorgani s en:
3 100 μl einer Wasserprobe mit je 10 Keimen pro ml von
Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylόsus und Klebsiell pneu oniae wurden wie in Beispiel 2 auf eine Pepton-Ägar- platte aufgebracht, nach einer Inkubationszeit von 8 Stunde und mit der identischen Stempeltechni k auf den- gleichen Pro benträger, wie in Beispiel 2 beschrieben, aufgebracht. Fig. 3 zeigt einen 250x vergrößerten Ausschnitt des Pro¬ benträgers. Wegen der orts- und damit auch fl chengenauen Übertragung der Mi krokolonien ergibt bereits die Betrachtun im optischen Mode des Mikroskops auch für einen bakteriolo¬ gisch nur wenig geschulten Experimentator Hinweise auf die Beteiligung mehrerer Organismen, denn die unterschiedlichen Mi krokol oni engrδßen , wie aus Fig. 4 ersichtlich, weise bereits auf drei verschiedene Mi roorganismen hin. Bei höhe rer Vergrößerung kann auch die Einzel bakterienmorphol ogie (z.B. Kokken oder Stäbchen) mit herangezogen werden. Dies stellt jedoch für den Experimentator nur ei mögliches zu¬ sätzliches Hilfsmittel dar, denn im Verfahrensablauf erfolg die Detektion durch Registrierung der entsprechenden Infra¬ rot-Spektren. Die für die in Fig. 5 mit 1, 2 und 3 be¬ zeichneten Mi krokol onien-Abdrücke erhaltenen Spektren im Infrarotmodus der FT-IR-Mi kroskops zeigt ' Fig.*- 6. Alle Spektren zeigen über den charakteristischen Pr benverl auf die Präsenz von Mikroorganismen an. Der Vergleich der in Fig. 6 dargestellten Spektrenzüge mit denejιäeiner Re¬ ferenzdatei aus 100 Spektren von Bakterien aus 4$ .ve fehl e- denen Spezies ergab auf der Basis der niedrigsten TD-Werte, berechnet aus den 1. Ableitungen der Spektren im Wellenzahl bereich von 1500-900 cm" , eine für alle Mi krokoIonie-Ab- drücke speziesgenaue Identifizierung. Beispiele und Bemerkungen zu Fig. 1
(a) z.B. Urin, Liquor, Blut, Lebensmittel, Wasser, etc., ggf. nach entsprechender Aufbereitung und Verdünnung
(b) z.B. Agarplatte mit Blutzusatz, Pepton o.a., ggf. Selektiv¬ oder Elektivmedium
(c) z.B. 20-40 Grad Celsius, pH 4-9, für z.B. 4-10 Std. bzw. etwa 8-20 Generationszeiten der Mikroorganismen
(d) z.B. Stempelabdruck auf ZnSe, BaF2_Sclleiben, 'Polymerfilm, Aluplättchen, polierte Stahlplättchen etc.
(e) z.B. manuelle, visuelle oder automatische Abrasterung des Probenträgers, Registrierung und ggf. elektronische Spei¬ cherung von Abdruckpositionskoordinaten, ggf. unter Heran¬ ziehen von Bildverarbeitungstechniken, die Auskunft über Zahl, Position und Größe der Kolonieabdrücke liefern
(f) z.B. seriell, manuell oder automatisch gesteuertes Anfahren der im vorigen Schritt ermittelten Abdruckkoordinaten, Einschwenken einer geeigneten Blende im Bereich von ca.
10 - 200 um und Aufnahme der Spektren im Wellenzahlbereich von z.B. 5000 - 500 im mittleren Infrarot
(g) z.B. optische Spektrenbeurteilung durch Experimentator, Berechnung von Korrelationskoeffizienten zu Referenzspekt¬ ren, multivariate Analyse der Spektren etc.
(h) ggf. Identifizierung durch Vergleich mit Referenzdaten
(i) ggf. unter Berücksichtigung von Probenverdünnung etc., Zusatzergebnisse wie Identifizierung, Kolonienform etc.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur schnellen Detektion von Mikroorganis¬ men, wie z.B. Bakterien und Pilzen, in Proben, da¬ durch gekennzeichnet, daß eine auf Mikroorganismen zu untersuchende Probe a) auf einen in der Mikrobiologie verwendeten im we¬ sentlichen festen Kulturträger in einer Verdün¬ nung aufgetragen wird, die das* Wachstum vorhande¬ ner Mikroorganismen in örtlich getrennten Kolo¬ nien ermöglicht, b) ein kurzzeitiges Wachstum von zumindest 6 Genera¬ tionszeiten der zu detektierenden Organismen zu örtlich getrennten Mikrokol onien unter den in der Mikrobiologie üblichen Bedingungen veranlaßt wird,
Erεat biatt c) Mikrokolonien aufweisende Oberflächenbereiche des Kulturträgers auf einen im gewünschten Spektral¬ bereich entweder zumindest teildurchlässigen oder reflektierenden optischen Träger ortsgetreu über¬ tragen werden, d) einzelne Kolonien der übertragenen Mikroorganis¬ men in einem Mikroskop lokalisiert werden und e) von den übertragenen Mikroorganismen-Kolonien einzeln mittels eines Infrarotmikroskops im Transmission- oder Reflektions odus unter Verwen¬ dung von Blenden im Durchmesserbereich von etwa 10 - 200 μm sequentell IR-Spektren aufgenommen und ausgewertet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ausschluß von ggf. auf den Träger übertrage¬ nen Bestandteilen, die nicht Mikroorganismen reprä¬ sentieren, insbesondere von organischen und/oder an¬ organischen Verunreinigungen, Nährmedieπbestandteilen und/oder Staub, durch einen Vergleich der erhaltenen Spektren mit Spektren von Referenzmikroorganismen durchgeführt wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lokalisierung der Mikroorganismen-Kolonien in einer optischen oder IR- spektroskopi sehen Betriebsart des Infrarotmikroskops durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die ortsgetreue Übertra¬ gung der Mikroorganismen vom Kulturträger in direkter Weise auf einen Stempel vorgenommen wird, dessen Stempelfläche aus einem, im gewünschten Wellenbereich durchlässigen oder reflektierenden Material besteht.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenprobe durch einfachen Abdruck vom Kulturträger auf einen Stempel übertragen wird und der Stempel dann als op¬ tischer Probenträger und insbesondere als Küvettenbe- staπdteil in das IR-Gerät bzw. -Mikroskop zur Vermes¬ sung der Spektren überführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Infrarotspektren in einem oder auch mehreren, ggf. sehr kleinen Wellen- zahli ntervallen von z.B. weniger als 300 cm , oder auch nur einzelne, selektive, für bestimmte Mikroor¬ ganismen charakteristische Absorptionsbanden oder ggf. Bandenkonturen im NIR-, MIR- und/oder FIR-Be- reich des Infrarotspektrums gemessen werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung der Spek¬ tren zur Bakteriendetektion mittels mathematischer Techniken der Datenreduktion durch Methoden der ul- tivariaten Statistik, Berechnung von Korrelatioπsko- effizienten und ähnlichen Vergleichsmaßnahmen zu Referenzspektren etc. mit oder ohne Zuhilfenahme mathematischer Techniken, wie z.B. Spektrengl ttung, Spektrenfilterung o.a., durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß neben der reinen Detek¬ tion von Mikroorganismen zusätzlich eine Identifika¬ tion derselben durch Vergleich mit Spektrenreferenz- dateien vorgenommen wird. "*
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Enumeration der Mikroorganismen die Anzahl der pro Flächeneinheit gefundenen Mikroorganismen-Kolonien bestimmt und auf die Probe zurückgerechnet wird, wobei die Zählung verschiedenartiger Kolonien vorzugsweise getrennt er¬ folgt.
10. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Kopplung und/oder Integration a) einer Beimpfungseinheit zur Aufgabe der Proben auf Kulturträger, b) einer Inkubatoreinheit zum Bebrüten der Kulturen, c) einer Übertragungseinheit zum Übertragen von ge¬ bildeten Mikrokolonien auf einen optischen Trä¬ ger, d) einer Einheit zum Lokalisieren von Mikroorganis¬ men-Kolonien mittels eines Mikroskops, e) eines IR-Geräts und f) einer Einheit zur kontrollierten Steuerung der einzelnen Funktionen der Apparatur.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskop ein IR-Mikroskop, insbesondere ein FT-IR-Mikroskop ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, gekennzeichnet weiterhin durch eine Überführungseinheit zur Übertra¬ gung des optischen Trägers auf den Objekttisch eines Mikroskops, insbesondere IR-Mi kroskops, eine mechani¬ sche Einheit zum Abrasterπ der übertragenen Probe un¬ ter Nutzung des optischen Modus eines IR-Mi kroskops und/oder einer Detektionseinheit zur Erfassung von Mi krokol onien-Abdrücken auf dem optischen Träger im optischen und infrarotspektroskopi sehen Modus eines IR-Mi kroskops.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, da¬ durch gekennzeichnet, daß die Steuereinheit der Appa¬ ratur parallel oder alternativ zur Detektion auch zur Steuerung einer Identifizierung eingerichtet ist.
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