WO1991000354A1 - Acide nucleique codant pour l'enzyme de conversion de l'angiotensine (eca) testiculaire humaine, et ses applications, notamment pour le depistage in vitro de cette enzyme dans l'organisme - Google Patents

Acide nucleique codant pour l'enzyme de conversion de l'angiotensine (eca) testiculaire humaine, et ses applications, notamment pour le depistage in vitro de cette enzyme dans l'organisme Download PDF

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ace
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polypeptide
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Florent Soubrier
François ALHENC-GELAS
Christine Hubert
Pierre Corvol
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the invention relates to a nucleic acid encoding the angiotensin converting enzyme (ACE) in germ cells of human testes as well as vectors containing this nucleic acid and the use thereof for the production of this enzyme.
  • the invention also relates to the applications of this nucleic acid, in particular for the in vitro screening of this enzyme in the organism.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • ACE or peptidyl dipeptidase A (EC 3.4.15.1), or ininase II, plays an important role in the regulation of blood pressure, by hydrolyzing angiotensin I (inactive peptide released after cleavage of angiotensinogen by renin) into vasopressive angiotensin II playing a major role in the regulation of blood pressure (SKEGGS, LT, et al (1956) J. Exp. Med., 103, 295-299).
  • angiotensin I active peptide released after cleavage of angiotensinogen by renin
  • vasopressive angiotensin II playing a major role in the regulation of blood pressure
  • ACE activity by EDTA and metal chelators indicates that it is a metallopeptidase, more particularly a zinc peptidase, capable of hydrolyzing not only, angiotensin I, but also bradykinin (a vasodilator and natriuretic peptide which it transforms into an inactive heptapeptide), and many other peptides with biological activity (YANG, HYT et al (1970) " Biochim. Biophys. Acta, 214 , 374-376; ERDOS, EG, et al (1987) Lab. Invest., 56, 345-348).
  • ACE is a peptidase widely distributed in the body, which is found, for example, as a membrane enzyme on the surface of vascular endothelial cells, and renal epithelial cells, as well as an enzyme circulating in the plasma (ERDOS, et al (1987) mentioned above; CARD ELL, PRB et al, (1976) Science, 191, 1050-1051; RYAN, US et al (1976) Tissue Cell, 8, 125-145 ).
  • RNA encoding ACE messenger RNA (RNA) encoding ACE are probably too low in these organs to easily allow the cloning of a complementary DNA (cDNA) of this mRNA.
  • the cloning of the DNA encoding the ACE of human endothelial cells was carried out for the first time by the authors of the present application; the complete nucleotide sequence of the DNA encoding 4 used for the determination of the nucleic acid coding for human testicular ACE.
  • the composite sequence of the cDNA of the testicular ACE is 2477 nucleotides, is delimited by the nucleotides corresponding to positions 1 and 2477 of FIG. 1.
  • the nucleotide sequence, delimited by the nucleotides located in positions 29 and 2224 of the Figure 1, contains an open reading phase encoding a polypeptide of 732 amino acids.
  • This nucleotide sequence consists of a DNA sequence delimited by the nucleotides corresponding to positions 29 and 91 of FIG. 1 capable of coding for a signal peptide of 21 amino acids, and of a DNA sequence delimited by the nucleotides located at positions 92 and 2224 of FIG.
  • nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 228 and 2224 in FIG. 1 is identical to that delimited by the nucleotides located at positions 1944 to 3940 coding for the last 665 amino acids of human endothelial ACE and represented in FIG.
  • nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 29 and 229 coding for the first 67 amino acids of the testicular pre-enzyme (or precursor of the testicular enzyme), and more particularly the sequence delimited by the nucleotides located at positions 92 and 229 encoding for the first 46 amino acids of the enzyme for endothelial ACE, as well as the amino acid sequence of the latter are described in the article by SOUBRIER F. et al published in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, pp 9386-9390 (1988).
  • testicular ACE the structure of the ACE in human testes (or also referred to as the testicular ACE) is not known at present; and no DNA sequence encoding this testicular ACE has been described to date.
  • S.N. ROY et al asserted in 1988 in an article by Biochem. Biophys. Res. Common. 155: 678-684, having isolated clones but they do not give the sequence of the clones.
  • the present invention specifically relates to the cloning and sequencing of the nucleic acid coding for human testicular ACE; this work was carried out using two DNA libraries complementary to mRNA from human testes and nucleotide probes corresponding to endothelial ACE.
  • the techniques used for cloning and sequencing the nucleic acid according to the invention will be more particularly described in the detailed description of the invention.
  • FIG. 1 shows the nucleic acid as well as the polypeptide, deduced from the latter, corresponding to the human testicular ACE;
  • FIG. 2 represents the respective positions of the nucleic acids of the four clones mature testis, are particularly specific to testicular ACE;
  • polypeptide comprising a His-Glu-Met-Gly-His sequence corresponding to the amino acids located at positions 414 to 418 of Figure 1, could constitute part of the active site of the testicular ACE.
  • the present invention therefore relates to any nucleic acid characterized in that it comprises all or part of the nucleotide sequence of FIG. 1, this part itself comprising all or part of the nucleotide sequence delimited by the nucleotides located at positions 29 and 229 of FIG. 1, and in that it codes for a polypeptide capable of being recognized by polyclonal or monoclonal antibodies specifically recognizing any peptide derived from the peptide sequence delimited by the amino acids located in positions 1 to 67 of FIG.
  • angiotensin I and / or kinins capable of hydrolyzing angiotensin I and / or kinins, in particular bradykinin, or any nucleic acid which is distinguished from the preceding one in terms of its nucleotide sequence only by nucleotide substitutions which do not cause modifying the amino acid sequence of the above polypeptide under conditions which cause it to lose the above properties.
  • the invention relates more particularly to any nucleic acid comprising the DNA sequence delimited by the nucleotides located at positions 29 and 2224 of FIG. 1, and coding for the human testicular pre-ECA (or pro-enzyme) of 732 amino acids; the first 21 amino acids on the N-terminal side represent the signal peptide, and the remaining 711 amino acids represent nature's human testicular ACE.
  • the invention also relates to any nucleic acid comprising the DNA sequence delimited by the nucleotides located at positions 92 and 2224 in FIG. 1, and coding for mature human testicular ACE.
  • nucleic acids in accordance with the invention, mention will be made in particular of that comprising a DNA sequence extending between, on the one hand, a nucleotide situated between positions 1 to 92 and, on the other hand, a nucleotide situated between positions 229 to 2224 of Figure 1.
  • the subject of the invention is more particularly any nucleic acid comprising the part of the nucleotide sequence of FIG. 1 which is specific to testicular ACE, namely any nucleic acid containing the nucleotide sequence extending between, on the one hand, the nucleotide located at position 29, and, on the other hand, the nucleotide located at position 227 in Figure 1, or any nucleic acid containing a sequence derived therefrom.
  • the invention also relates to:
  • nucleic acid comprising a DNA sequence of approximately 15, and preferably 45, at 201 nucleotides, derived from the nucleic sequence extending between the nucleotide located at position 29 and the nucleotide located at position 227 of the figure 1,
  • any nucleic acid comprising a DNA sequence of approximately 15, and preferably 45, at 135 nucleotides, derived from the nucleic sequence extending between the nucleotide at position 92 and the nucleotide located at position 227 in the figure 1.
  • the invention also relates to the nucleic acids derived from those mentioned above, and whose nucleotide sequences are modified within the limits authorized by the degeneration of the genetic code, since the polypeptides encoded by these nucleic acids retain either an identical primary structure, or their immunological properties, and, where appropriate, enzymatic.
  • the subject of the invention is more particularly any nucleic acid having the characteristic of hybridizing specifically with the nucleic acid shown in FIG. 1, in particular under the conditions defined below:
  • Denhardt's solution is as follows: 1% ficoll, 1% polyvinylpyrrolidone, 1% BSA (bovine serum albumin), and that 1 x SSC is a 0.15 M solution of NaCl and 0.015 M sodium citrate, pH 7.
  • the invention also relates to any nu ⁇ keyic acid having the characteristic of hybridizing specifically with the nucleic acid of FIG. 1 under non-stringent conditions taking up the essential characteristics of the strin ⁇ gentes conditions defined above, except for what relates to the temperature which is 40 ⁇ C under non-stringent conditions, and the successive washings which, under non-stringent conditions, are carried out using
  • the subject of the invention is also any nucleic acid capable of hybridizing with the nucleic acids derived from that of FIG. 1 as defined above, or their complementary sequences, in particular under the hybridization conditions described above.
  • the invention also relates to nucleotide probes capable of hybridizing with all of the nucleic acid of FIG. 1, or with any fragment as defined above of this nucleic acid, as well as with RNA messenger encoding the testicular ACE and with the human gene responsible for the expression of the testicular ACE, in particular under the hybridization conditions defined above, or their complementary sequences.
  • stringent or non-stringent hybridization conditions constitute preferred conditions for hybridization, but are in no way limiting and can be modified without affecting the recognition and hybridization properties of the above-mentioned probes and nucleic acids.
  • the salt and temperature conditions, during hybridization and washing of the membranes, can be modified in the direction of greater or less stringency without the detection of hybridization being affected. For example, it is possible to add a variable percentage of formamide to lower the temperature during hybridization.
  • the invention also relates to the polypeptide of FIG. 1 corresponding to the human testicular ACE, as well as all the polypeptides, coded by the above-mentioned DNA fragments originating from the nucleic acid of FIG. 1, capable of being recognized by polyclonal or monoclonal antibodies specifically recognizing any peptide derived from the peptide sequence delimited by the amino acids located in positions 1 to 67 of FIG. 1, and more particularly that delimited by the amino acids located in positions 22 to 67 of FIG. 1, and, where appropriate, having an enzymatic activity of the type of that of testicular ACE
  • polypeptide characterized by the peptide sequence of approximately 5 to 67 amino acids, derived from the peptide sequence delimited by the amino acids located in positions 1 and 67 of FIG. 1,
  • polypeptide characterized by the peptide sequence of approximately 5 to 45 amino acids, derived from the peptide sequence delimited by the amino acids located in positions 22 and 67 of FIG. 1.
  • polypeptides can be modified as long as they retain the biochemical or immunological or pharmacological properties defined above.
  • polypeptides within the scope of the invention can be distinguished from the polypeptides defined above;
  • the N-terminal or C-terminal fragment does not play a significant role, if not essential for the manifestation of the immunological and / or enzymatic properties of said polypeptide.
  • the operation can optionally be repeated as long as there is a protease capable of recognizing another specific site close to an N-terminal or C-terminal end of the remaining polypeptide.
  • the loss by the recognized smaller polypeptide of the immunological and / or enzymatic properties of the longer fragment from which it was derived can lead to the hypothesis that the last separated fragment played a significant role in the manifestation of the enzymatic properties of the polypeptide of FIG. 1.
  • Another variant, simpler than the previous one, of detection of the regions of the testicular ACE essential to the manifestation of the enzymatic activities of the latter, may be based on enzymatic treatments of a nucleic acid coding for the testicular ACE.
  • This treatment is carried out before the incorporation of the nucleic acid thus obtained, and presumed to code for a polypeptide having immunological and / or enzymatic activities of the type of that of testicular ACE, in the expression vector used for setting implementation of a process for producing said polypeptide in the appropriate cell host (process which will be more particularly detailed in the following).
  • This enzymatic treatment can then consist either of pruning the ends of the initial nucleic acid (coding for example for the polypeptide of FIG.
  • an exonucleolytic enzyme such as Bal31
  • one or more enzymes of restriction chosen for their respective recognition sites if necessary arranged by site-directed point mutagenesis
  • ATG initiation codon
  • the peptide signal or any other sequence allowing secretion of the peptide and keeping the reading phase open.
  • the truncated nucleic acid obtained can then be tested, after incorporation into the chosen vector and transformation of the cell host with the recombinant vector obtained, for its capacity to express a corresponding truncated polypeptide, still having the above-mentioned immunological and / or enzymatic properties. or on the contrary no longer having them, hence the possibility, as in the previous variant, of identifying within the polypeptide of FIG. 1, the sequences playing an important, if not essential, role in the manifestation of the immunological and / or testicular ACE enzymes.
  • the subject of the invention is also any recombinant nucleic acid containing any DNA fragment of the above-mentioned type coding for human testicular pre-ACE, or mature human testicular ACE, or also for any polypeptide, capable of possessing an activity.
  • the introduction of said recombinant nucleic acid into the host cell is advantageously carried out using vectors, in particular of the plasmid type, which are capable of replicating in said host cell and allowing therein the expression of the sequence encoding the 'enzyme.
  • Said recombinant nucleic acid can also be introduced into the host cell using a viral vector (recombinant virus) capable of infecting said host cell, or using a retroviral vector capable of integrating into the genome of the host cell, and allowing expression of the polypeptide encoded by a nucleic acid according to the invention, the latter being under the control of a viral, or retroviral promoter, active in the host cell.
  • a viral vector recombinant virus
  • the invention therefore relates to a process for the production of human testicular ACE, or of the above-mentioned polypeptides derived from testicular ACE, which comprises the transformation of the host cells using the above-mentioned vectors, the culturing of the cells. hosts transformed in an appropriate medium and the recovery of said polypeptides either directly from the culture medium, when the latter are secreted therein (in particular in the case where the polypeptides considered are preceded by a signal sequence during their synthesis in the host cell ), or after lysis of the wall of the host cell in the case where the polypeptides are not secreted out of the latter.
  • the host cells used for implementing the above-mentioned method can be prokaryotic cells, in particular E. coli cells, or, more advantageously, eukaryotic cells, which make it possible, in particular, to obtain proteins in their glycosylated and mature form (yeast, CHO cells or other cells, or insect cells infected with baculovirus).
  • the invention also relates to a process for the preparation of the above-mentioned new polypeptides by synthesis which comprises either the step-by-step addition of the chosen peptide residues, with the addition or elimination of any protective groups of the amino and carboxyl functions, or addition of selected peptide residues to produce fragments, followed by condensation of said fragments into an appropriate amino acid sequence, with addition or removal of the protecting groups chosen.
  • the invention also relates to specific antibodies directed against the above polypeptides.
  • the invention relates to polyclonal or monoclonal antibodies directed against the above-mentioned peptide sequences.
  • a mode of obtaining polyclonal antibodies against a peptide derived from the sequence of the testicular ACE is briefly summarized below: - the peptide whose minimum size is approximately 5 to 15 amino acids, is coupled
  • the coupled peptide is then injected into the rabbit in an equal volume of Freund's adjuvant and into the plantar pad of the rabbits' hind legs. During the first injection, complete Freund's adjuvant is used. Then it's incomplete adjuvant,
  • the antibody titer is established by measuring the dilution for which the peptide which was used for the injections and which is radioactively labeled is bound to the antibody at 50 %).
  • the above-mentioned monoclonal antibodies can be produced by the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below.
  • one of the above polypeptides is inoculated into a chosen animal (for example a mouse of the Biozzi or Balb / C type), whose B lymphocytes are then capable of producing antibodies against this polypeptide.
  • the injection protocol includes, for example, three injections, the first of which is made with complete Freund's adjuvant. Animals can receive an IV injection of the polypeptide a few hours before the isolation of spleen cells. The spleen cells of the injected animal are then fused with the "immortal" cells of the myeloma line, according to the method described by DI PAULI (DI PAULI R, and WC, RASCHKE, (1978), in Current topics in Microbiology and Im unology, vol. 81 ,.
  • the antibody-producing hybridomas are then cloned and subcloned, at best using a cell sorter.
  • the hybridomas are then reinjected into the peritoneum of animals, in particular of Balb / C mice treated with pristane.
  • the ascites are then tested for the presence of antibodies and the immunoglobulins present in the ascites are purified on an affinity column, in particular on protein-A Sepharose.
  • Mono or polyclonal antibodies can also be produced against the entire ACE molecule.
  • polypeptides used for the manufacture of the above-mentioned polyclonal or monoclonal antibodies mention will be made more particularly of the specific polypeptides of the testicular ACE, namely those delimited by the amino acids located in positions l and 67, or 22 and 67 in the figure. 1, or those having at least 5 amino acids derived from the peptide sequence delimited by the amino acids located in positions 1 and 67 of FIG. 1.
  • the invention also relates to a method of screening, or assaying, in vitro of ACE or product having in vivo the properties of ACE, and more particularly of human testicular ACE, or of a product derived from 1 ' Testicular ACE such as the above-mentioned polypeptides, in a biological sample likely to contain them.
  • a screening method according to the invention can be performed either using the above-mentioned monoclonal antibodies, or using the nucleotide probes described above.
  • the invention relates more particularly to the use of polyclonal or monoclonal antibodies obtained from the polypeptide delimited by the amino acids located in positions 1 and 67, or that delimited by the amino acids located in positions 22 and 67, or also that derived from the peptide sequence delimited by the amino acids located in positions 1 and 67 of FIG. 1, and specifically recognizing these polypeptides, for the implementation of a screening method, or assay, in vitro, of ACE human testicular.
  • the invention also relates to the use of the nucleotide probes described above, in particular those which hybridize with the nucleic sequences coding for the specific polypeptides of human testicular ACE described above, for the implementation of the method of screening or dosage mentioned above.
  • the abovementioned biological sample is taken either from fluid tissues, such as blood, or from organs, the latter type of sample making it possible in particular to obtain fine sections of tissue on which the antibodies or the probes mentioned above are subsequently fixed.
  • the assay method according to the invention proceeding via the abovementioned antibodies notably comprises the following steps:
  • the antibodies used for the implementation of such a method are labeled in particular in an enzymatic or radioactive manner.
  • Such a method according to the invention can in particular be carried out according to the ELISA method (enzyme linked sorbent assay) which comprises the following steps: fixing of a predetermined quantity of antibodies on a solid support, in particular on the surface of a well d 'a microplate;
  • the above-mentioned antibodies are not labeled and the detection of the immunological complexes formed between the polypeptides and said antibodies is carried out using a labeled immunoglobulin recognizing said complexes.
  • the assay method according to the invention can also be carried out by an immunoenzymatic technique according to a mechanism of competition between the polypeptides likely to be contained in the biological sample, and predetermined quantities of these same polypeptides, vis-à-vis of the above-mentioned antibodies.
  • the polypeptides of the invention in a predetermined amount are advantageously labeled using an enzymatic marker.
  • the invention is in no way limited to the embodiments described above for the in vitro assay of the polypeptides of the invention, this assay can be carried out using any other appropriate immunological method.
  • the invention also relates to a method of screening, or assaying, in vitro of an ACE or product having in vivo the properties of ACE, and, more particularly, of human testicular ACE, this method proceeding by detection or assay of a nucleic acid corresponding according to the universal genetic code to all or part of this ECA, and being carried out from a biological sample capable of containing said nucleic acid.
  • This method is characterized in that it comprises:
  • the abovementioned biological sample is, prior to the implementation of the screening, treated so that the cells which it contains are lysed and, possibly, in that the material genomics contained in said cells is fragmented using restriction enzymes of the E188RI, BamHI type, etc., or that the RNAs are isolated therefrom, in particular according to the method described in THOMAS, PS (1983) Methods Enzymol., 100, 255-266.
  • the nucleotide probes of 1 • invention are labeled, in particular by the incorporation of one (or more) nucleotide either radioactive or coupled to a hapten allowing its detection by an antibody, the latter being conjugated to an enzyme whose activity is easily detectable (for example alkaline phosphatase).
  • an enzyme whose activity is easily detectable (for example alkaline phosphatase).
  • the DNA, or RNA, from the biological sample is placed on an appropriate support, in particular on a nitrocellulose or other filter, for example nylon membrane, on which the above-mentioned probes are then added.
  • histological sections are prepared from the abovementioned biological sample and the nucleotide probes 1 • invention are brought into direct contact with tissue sections for the detection of acids nucleic acids of the invention by in situ hybridization.
  • the invention also relates to the application of the ACE screening or assay method.
  • testicular mentioned above in in vitro diagnosis of specific pathologies of the testes (in particular at the level of the germ cells), in particular of testicular tumors (also called seminomas), the maturation of the male germ cells, hypofertilities and male sterility.
  • the above-mentioned method is advantageously carried out from sperm, or from germ cells or seminal plasma isolated from sperm, or from testicular biopsy.
  • the subject of the invention is also kits or kits for the implementation of the above-mentioned screening or assay methods in vitro.
  • kits include in particular:
  • kits used include, for example: a determined quantity of one of the above-mentioned nucleotide probes capable of giving rise to a hybridization reaction with one of the above-mentioned nucleic acids coding for testicular ACE or a polypeptide derived from the testicular ACE according to the invention;
  • the invention also relates to the use of the polypeptide of FIG. 1 or of any suitable peptide fragment derived from the latter, for the design of new inhibitors of human ACE, more powerful and / or specific for the latter than are current ACE inhibitors.
  • a subject of the invention is also a method for detecting or assaying an ACE inhibitor, or for quantifying its inhibitory power, which comprises bringing the polypeptide of FIG. 1 into contact, or any peptide fragment derived from the latter and having an enzymatic activity of the type of that of ACE, with said inhibitor, and the determination, for these inhibitors, of the dissociation constant [Ki] and of the concentration necessary for a 50% inhibition [IC 50 ] of the enzyme.
  • the invention also relates to the use of the polypeptide of FIG. 1, or of any fragment of the latter, as described above, capable of hydrolyzing kinins, in particular bradykinin, in the treatment of inflammatory or infectious diseases , acute pancreatitis, and more generally of diseases where a release of kinins in the body could play a pathogenic role.
  • the invention relates more particularly to pharmaceutical compositions for the treatment of the diseases indicated above, characterized by the combination of all or part of the polypeptide of FIG. 1, capable of hydrolyzing kinins, in particular bradykinin, with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to the use of the nucleotide probes of the invention, capable of hybridizing with the gene responsible for the expression of human testicular ACE under the conditions described above, for the determination of the various allelic forms of the above-mentioned gene.
  • the subject of the invention is also any nucleotide sequence of approximately 15 to approximately 30 nucleotides derived from the nucleotide sequence of FIG. 1, or a sequence complementary to the latter, or also a sequence of approximately 15 to 30 nucleotides capable of s hybridize (under the conditions described above) with said sequence of approximately 15 to 30 nucleotides derived from FIG. 1, and the use of such sequences as primers allowing the gene amplification of all or part of the nucleotide sequence of FIG. 1, in particular according to the amplification method described in European patent application No. 86 / 302.298.4 of 03/27/1986.
  • oligonucleotide primers are particularly useful in the context of the synthesis of testicular ACE by means of genetic engineering as described above, the various steps of which mentioned above are preceded by a step of amplification of the gene coding for the Testicular ECA prior to the stage of transformation of the host cells.
  • the invention also relates to a method of in vitro detection of mRNA coding for testicular ACE, as described above, comprising a prior step of amplification of all or part of this mRNA (or amplification of the DNA copy of the RNA coding for the testicular ACE), if necessary, isolated from the other cellular constituents, using one or more, pair of primers as defined above.
  • the invention also relates to diagnostic kits as described above, and also containing at least a pair of primers mentioned above, these primers being capable of amplifying the number of copies of the nucleic acid to be detected in the presence of an appropriate polymerase and appropriate quantities of the 4 different deoxynucleotide triphosphate, dATP, dGTP, dCTP and dTTP.
  • the phage hybridizations were carried out according to the method of Benton WD and Davis RW Science (WASHINGTON) 1977, 196, 180-182. More precisely the hybridizations were carried out in a solution consisting of 6XSSC (IXSSC corresponds to 150 mM NaCl, 15 M sodium citrate), 0.1% NaDodSO 4 , 50 mM NaPO 4 buffer at pH 6.8, 0.1 mg / ml denatured DNA, salmon sperm at 65 "C.
  • 6XSSC corresponds to 150 mM NaCl, 15 M sodium citrate
  • NaDodSO 4 50 mM NaPO 4 buffer at pH 6.8
  • 0.1 mg / ml denatured DNA salmon sperm at 65 "C.
  • the sequence used as probe is contained in the bacteriophage ⁇ 19-22 and represents the last 3248 nucleotides of the complementary DNA sequence (position 691 to 4024), as described in the article by SOUBRIER F. et al, mentioned above. . It was chosen because it hybridizes with the ACE messenger RNA in the human testis.
  • the cloned DNA sequence of the endothelial ACE was used as a probe, by statistical labeling using DNA polymerase I from E. coli and oligonucleotide primers, according to the method described by FEINBERG AP et al ( 1983) Anal. Biochem., 132, 6-13.
  • the probe Using alpha [ 32 P], deoxycytidine triphosphate, of specific activity 3000cies / mmole, the probe has a specific activity of 2 to 8 x 10 ° cpm / ⁇ g of DNA.
  • the concentration of the radioactive probe in the hybridization solution of the filters is 10 6 cpm / ml.
  • the filters were then washed under high stringency conditions (final washing in 0.1 x SSC, 0.1% NaDodSO) at 68 "C for 30 minutes.
  • the screening of 2 x 10 6 clones from the library made it possible to isolate 17 positive clones. Among these, two positive clones were isolated.
  • the DNA fragments inserted into the recombinant phages were purified and inserted into the EcoRI site of the plasmid pBluescript (Sratagene). The sequence of insertions was obtained. either directly on the double stranded DNA of the plasmids, or by obtaining single stranded DNA by infecting the cultures using the phage helper K07. The determination of the nucleotide sequence of these clones was carried out by the Sanger method (SANGER, F. et al (1977), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467) using either the Klenow DNA polymerase, or modified T7 DNA polymerase (Sequenase, US Biochemical).
  • the clone ⁇ ht10 contains a sequence with a length of 2217 nucleotides and which extends from position 260 to 2477 of the sequence of the testicular cDNA shown in FIG. 1. This clone extends in the 3 'region of the RNA messenger to the polyadenylation sequence and includes a short poly (A) sequence.
  • the clone ⁇ htl6, with a length of 2263 nucleotides, corresponds to the region of the testicular cDNA located between position 50 and 2313 in FIG. 1.
  • An oligomer with a length of 22 nucleotides was synthesized and used to screen again the library in order to obtain clones corresponding to the most 5 ′ region of the messenger RNA.
  • the sequence of this oligomer is contained in the sequence of the clone ⁇ htl6 (position 59 to 80).
  • the oligomer was labeled with N 7 - [ 32 P-] adenosine triphosphate ATP (specific activity 5000cies / mmole) using T4 polynucleotide kinase.
  • the specific activity of the probe is 5 x 10 6 cp / pmole.
  • the filters were screened under the same conditions as specified above except for the following modification: the hybridization temperature was 60 ° C and the washing temperature of 65 ° C in a solution of 2 X SSC. This screening made it possible to isolate the clone ⁇ ht341, with a length of 2.2 kb, which extends in 5 ′ to nucleotide 31 of the testicular cDNA of the ACE.
  • RNA isolated from tissue. human testicular obtained during surgery.
  • the complementary DNA library was constructed according to the method of Gibler and Hoffman (Gene (1983), 25, 263-269), using two primers.
  • a specific primer for the ACE messenger RNA determined by the sequence of the clones previously obtained. It is an oligomer of 17 bases (ATH17), complementary to a sequence located in position 228-244 of Figure 1.
  • the second primer corresponds to the oligo- d (T) 12-18 seas (pharmacia ).
  • the complementary double-stranded DNAs were synthesized and then inserted into the phage ⁇ gt10 cut by the enzyme EcoRI according to the method of Koenig et al (Koenig, M et al, (1987) Cell, 50, 509-517).
  • the recombinant phages (1 ⁇ 10 6 recombinant phages) were screened using the TH16 oligomer, labeled as above.
  • the screening conditions of the library are identical to those described above with the same probe.
  • the ⁇ ht221 clone 244 base pairs in length, was sequenced. It contains the most 5 'part of the messenger RNA encoding the testicular ACE.
  • the sequence of testicular messenger RNA as it can be deduced from the composite nucleotide sequence of testicular cDNA obtained from the 4 clones, is 2477 nucleotides long.
  • testicular cDNA 3 'to position 228 of the testicular cDNA.
  • the two testicular and endothelial messenger RNAs diverge and the specific testicular sequence determined is 228 nucleotides. From the first ATG codon to the stop codon, there is an open phase coding for 732 amino acids.
  • the testicular enzyme being identical to that of the endothelial enzyme, in particular with regard to Km, Vmax, and Kcat on angiotensin I, the comparison of its structure with that of the endothelial enzyme provides interesting information concerning the structure activity relationships in the ACE molecule.
  • the endothelial enzyme is made up of two large domains, which are very homologous to each other. Each of these domains contain a short consensus amino acid sequence of the active site of zinc metallopeptidases such as thermolysin, collagenase or neutral endopeptidase.
  • testicular converting enzyme contains only the endothelial ACE carboxyterminal domain, which seems to indicate that this domain alone carries the structures responsible for enzymatic activity. Another hypothesis would be that the testicular enzyme acts in the form of a dimer, however the native testicular enzyme of rabbit tested in non-denaturing condition by density gradient centrifugation does indeed have a molecular weight lower than that of endothelial ACE.

Abstract

L'invention a pour objet le clonage et le séquençage de l'acide nucléique codant pour l'ECA testiculaire humaine, ainsi que la détermination de la séquence peptidique de cette ECA. Elle a plus particulièrement pour objet l'utilisation de sondes nucléotidiques susceptibles de s'hybrider avec tout ou partie de l'acide nucléique susmentionné, ou encore les anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant spécifiquement toute ou partie de la séquence peptidique susmentionnée, et l'utilisation de ces sondes ou de ces anticorps pour la mise en oeuvre respectivement d'une méthode de détection in vitro de l'ARN messager codant pour l'ECA testiculaire, ou directement de l'ECA testiculaire.

Description

ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR L'ENZYME DE CONVERSION DE L'ANGIOTENSINE (ECA) TESTICULAIRE HUMAINE, ET SES APPLICATIONS, NOTAMMENT POUR LE DEPISTAGE IH VITRO DE CETTE ENZYME DANS L'ORGANISME.
L'invention concerne un acide nucléique codant pour l'enzyme de conversion de 1•angiotensine (ECA) dans les cellules germinales de testicules humains ainsi que des vecteurs contenant cet acide nucléique et l'utilisation de ces derniers pour la production de cette enzyme. L'invention concerne également les applications de cet acide nucléique, notamment pour le dépistage in vitro de cette enzyme dans l'organisme.
L'ECA, ou peptidyl dipeptidase A (EC 3.4.15.1), ou encore ininase II, joue un rôle important dans la régulation de la pression artérielle, en hydrolysant l'angiotensine I (peptide inactif libéré après clivage de l'angiotensinogène par la rénine) en angiotensine II vasopressive jouant un rôle majeur dans la régulation de la pression artérielle (SKEGGS, L.T., et al (1956) J. Exp. Med., 103, 295-299).
L'inhibition de l'activité de l'ECA par l'EDTA et les chélateurs de métaux, indique qu'il s'agit d'une métallopeptidase, plus particulièrement d'une peptidase à zinc, capable d'hydrolyser, non seulement, l'angiotensine I, mais aussi la bradykinine (un peptide vasodilateur et natriurétique qu'elle transforme en un heptapeptide inactif) , et de nombreux autres peptides à activité biologique (YANG, H.Y.T. et al (1970) "Biochim. Biophys. Acta, 214, 374-376 ; ERDOS, E.G., et al (1987) Lab. Invest. , 56, 345-348).
L'ECA est une peptidase largement distribuée dans l'organisme, que l'on retrouve par exemple sous forme d'enzyme membranaire à la surface des cellules endothéliales vasculaires, et des cellules épithéliales rénales, ainsi que sous forme d'enzyme circulant dans le plasma (ERDOS, et al (1987) sus¬ mentionné ; CARD ELL, P.R.B. et al, (1976) Science, 191, 1050-1051 ; RYAN, U.S. et al (1976) Tissue Cell, 8 , 125-145) .
Des méthodes de purification de l'ECA endotheliale humaine ou animale ont déjà été décrites (notamment dans BULL H.G. et al, (1985)J. Biol. Chem., 260, 2963-2972 ; HOOPER, N.M. et al, (1987) Biochem. J. , 247, 85-93), et quelques séquences peptidiques de l'ECA endotheliale d'origine animale ont été publiées (BERNSTEIN, K.E. et al (1988), Kidney Int., 3_3, 652-655; HARRIS, R.B. et al (1985) J. Biol. Chem., 260, 2208-2211; IWATA, K. et al (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun, 107, 1097-1103 ; IWATA, K. et al (1983) Arch. Biochem. Biophys., 227, 188-201 ; ST CLAIR, D.K. et al (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun, 11 968-972 ; SOFFER, RL. et al (1987) Clin. Exp. Hyp. A9, 229-234).
Quelques essais de clonage de 1'ADN codant pour l'ECA animale ont été effectués à partir de deux organes riches en ECA, les reins et les poumons, mais aucun acide nucléique complet codant pour 1'ECA animale n'a cependant été décrit ; seuls quelques fragments d'un tel acide nucléique ont été décrits (DEHJCA-FLAHERTY, C. et al (1987) Int. J. Peptide Protein Res., 29, 678-684 ; BERNSTEIN K.E. et al, (1988), J. Biol. Chem., 263, 11021-11024). Les quantités d'ARN messager (ARN ) codant pour l'ECA sont probablement trop faibles dans ces organes pour permettre facilement le clonage d'un ADN complémentaire (ADNc) de cet ARNm.
Le clonage de l'ADN codant pour l'ECA des cellules endothéliales humaines a été réalisé pour la première fois par les auteurs de la présente demande ; la séquence nucléotidique complète de l'ADN codant 4 utilisés pour la détermination de l'acide nucléique codant pour l'ECA testiculaire humaine.
Une étude approfondie de 1'acide nucléique de l'invention, ainsi que du polypeptide déduit à partir de ce dernier et correspondant à l'ECA testiculaire humaine, conduit aux observations suivantes :
- la séquence composite de l'ADNc de l'ACE testiculaire est de 2477 nucleotides, est délimitée par les nucleotides correspondant aux positions 1 et 2477 de la figure 1. La séquence nucléotidique, délimitée par les nucleotides situés aux positions 29 et 2224 de la figure 1, contient une phase de lecture ouverte codant pour un polypeptide de 732 acides aminés. Cette séquence nucléotidique est constituée d'une séquence d'ADN délimitée par les nucleotides correspondant aux positions 29 et 91 de la figure 1 susceptible de coder pour un peptide signal de 21 acides aminés, et d'une séquence d'ADN délimitée par les nucleotides situés aux positions 92 et 2224 de la figure 1 susceptible de coder pour une protéine mature de 711 acides aminés ; la séquence nucléotidique délimitée par les nucleotides situés aux positions 228 et 2224 de la figure 1 est identique à celle délimitée par les nucleotides situés aux positions 1944 à 3940 codant pour les 665 derniers acides aminés de l'ECA endotheliale humaine et représentée sur la figure 2 de 1'article de SOUBRIER et al sus-mentionné ; la séquence nucléotidique délimitée par les nucleotides situés aux positions 29 et 229 codant pour les 67 premiers acides aminés de la pré-enzyme testiculaire (ou précurseur de l'enzyme testiculaire), et plus particulièrement la séquence délimitée par les nucleotides situés aux positions 92 et 229 codant pour pour les 46 premiers acides aminés de l'enzyme pour l'ECA endotheliale, ainsi que la séquence en acides aminés de cette dernière sont décrits dans l'article de SOUBRIER F. et al paru dans Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, pp 9386-9390 (1988).
Une activité enzymatique du type de celle de l'ECA a également été mise en évidence dans les testicules humains et animaux (J.J. LANZILLO et al, J. Biol. Chem., 260, pp 14938-14944 (1985)).
Toutefois, la structure de l'ECA des testicules humains (ou encore désignée par l'expression ECA testiculaire) n'est pas connue à l'heure actuelle; et aucune séquence de l'ADN codant pour cette ECA testiculaire n'a été décrite jusqu'à maintenant. S.N. ROY et al affirment en 1988 dans un article de Biochem. Biophys. Res. Commun. 155 : 678-684, avoir isolé des clones mais ils ne donnent pas la séquence des clones.
La présente invention a précisément pour objet le clonage et le séquençage de l'acide nucléique codant pour l'ECA testiculaire humaine ; ce travail a été réalisé à partir de deux banques d'ADN complémentaires d'ARNm provenant de testicules humains et de sondes nucléotidiques correspondant à l'ECA endotheliale. Les techniques utilisées pour le clonage et le séquençage de l'acide nucléique selon l'invention seront plus particulièrement décrites dans la description détaillée de l'invention.
Il sera fait référence dans ce qui suit, aux figures dans lesquelles :
- la figure 1 représente l'acide nucléique ainsi que le polypeptide, déduit de ce dernier, correspondant à l'ECA testiculaire humaine ; la figure 2 représente les positions respectives des acides nucléiques des quatre clones testiculaire mature, sont particulièrement spécifiques de l'ECA testiculaire ;
- le polypeptide comprenant une séquence His-Glu-Met- Gly-His correspondant aux acides aminés situés aux positions 414 à 418 de la figure 1, pourrait constituer une partie du site actif de l'ECA testiculaire.
La présente invention concerne donc tout acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la séquence nucléotidique de la figure 1, cette partie comprenant elle-même toute ou partie de la séquence nucléotidique délimitée par les nucleotides situés aux positions 29 et 229 de la figure 1, et en ce qu'il code pour un polypeptide suceptible d'être reconnu par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant spécifiquement tout peptide issu de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 à 67 de la figure 1, et, le cas échant, capable d'hydrolyser 1'angiotensine I et/ou les kinines, notamment la bradykinine, ou tout acide nucléique ne se distinguant du précédent au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucleotides n'entraînant pas la modification de la séquence en acides aminés du susdit polypeptide dans des conditions propres à lui faire perdre les susdites propriétés.
L'invention concerne plus particulièrement tout acide nucléique comprenant la séquence d'ADN délimitée par les nucleotides situés aux positions 29 et 2224 de la figure 1, et codant pour la pré-ECA testiculaire humaine (ou pro-enzyme) de 732 acides aminés ; les 21 premiers acides aminés du côté N-terminal représentent le peptide signal, et les 711 acides aminés restant représentent l'ECA testiculaire humaine nature.
L'invention concerne également tout acide nucléique comprenant la séquence d'ADN délimitée par les nucleotides situés aux positions 92 et 2224 de la figure 1, et codant pour l'ECA testiculaire humaine mature.
Parmi les acides nucléiques conformes à l'invention, on citera notamment celui comprenant une séquence d'ADN s'étendant entre, d'une part, un nucleotide situé entre les positions 1 à 92 et, d'autre part, un nucleotide situé entre les positions 229 à 2224 de la figure 1.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout acide nucléique comprenant la partie de la séquence nucléotidique de la figure 1 qui est spécifique de l'ECA testiculaire, à savoir tout acide nucléique contenant la séquence nucléotidique s'étendant entre, d'une part, le nucleotide situé à la position 29, et, d'autre part, le nucleotide situé à la position 227 de la figure 1, ou tout acide nucléique contenant une séquence issue de cette dernière.
A ce titre, l'invention concerne également :
- tout acide nucléique comprenant une séquence d'ADN d'environ 15, et de préférence 45, à 201 nucleotides, issue de la séquence nucléique s'étendant entre le nucleotide situé à la position 29 et le nucleotide situé à la position 227 de la figure 1,
- tout acide nucléique comprenant une séquence d'ADN d'environ 15, et de préférence 45, à 135 nucleotides, issue de la séquence nucléique s'étendant entre le nucleotide à la position 92 et le nucleotide situé à la position 227 de la figure 1. L'invention concerne aussi les acides nucléiques dérivés de ceux sus-mentionnés, et dont les séquences nucléotidiques sont modifiées dans les limites autorisées par la dégénérescence du code génétique, dès lors que les polypeptides codés par ces acides nucléiques conservent soit une structure primaire identique, soit leurs propriétés immunologiques,et, le cas échéant enzymatiques.
De telles modifications non limitatives conduisent par exemple à des acides nucléiques variants qui se distinguent des acides nucléiques ci-dessus :
- par addition et/ou
- suppression d'un ou de plusieurs nucleotides et/ou
- modification d'un ou de plusieurs nucleotides. L'invention a plus particulièrement pour objet tout acide nucléique présentant la caractéristique de s'hybrider spécifiquement avec l'acide nucléique représenté sur la figure 1, notamment dans les conditions définies ci-après :
- dénaturâtion de l'acide nucléique (lorsqu'il est sous forme d'ADN double brin) susceptible de s'hybrider avec celui de la figure l, avant sa fixation sur le support, défini ci-dessous, par traitement à l'aide d'une solution alcaline (0,5 M NaOH) , suivie d'un passage à pH neutre. traitement de préhybridation du support (filtre de nitrocellulose ou membrane de nylon) , sur lequel est fixé 1'acide nucléique susceptible de s'hybrider avec celui de la figure 1, à 50°C pendant 3 heures avec une solution ayant la composition suivante : 25 mM KPO^, pH 7,4 ; 5 x SSC ; 5 x Denhardt's ; 50 μg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué ; 0,1 % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS ou NaDod S04 ") , - remplacement de la solution de pré-hybridation au contact du support par une solution tampon ayant une composition identique à celle de pré-hybridation indiquée ci-dessus, (plus éventuellement 10 % de Dextran) , et comprenant 1*acide nucléique de la figure
1 en tant que sonde marquée, notamment de manière radioactive, et préalablement dénaturée par un trai¬ tement à 90βC pendant 3 minutes,
- incubation pendant 12 heures à 60"C,
- lavages successifs avec les solutions suivantes :
2 x SSC, pendant 30 minutes à 60"C à 2 reprises,
. 1 x SSC, 0,1 % SDS pendant 1 à 2 fois 15 minutes à 65*C.
Il est à rappeler que la composition de la solution de Denhardt est la suivante : 1 % ficoll, 1 % polyvinylpyrrolidone, 1 % BSA (albumine de sérum de boeuf) , et que 1 x SSC est une solution 0,15 M de NaCl et 0,015 M de citrate de sodium, pH 7.
L'invention concerne également tout acide nu¬ cléique présentant la caractéristique de s'hybrider spécifiquement avec l'acide nucléique de la figure 1 dans des conditions non stringentes reprenant les caractéristiques essentielles des conditions strin¬ gentes définies ci-dessus, sauf pour ce qui concerne la température qui est de 40βC dans les conditions non stringentes, et les lavages successifs qui, dans les conditions non stringentes, sont réalisés à 1 'aide de
2 x SSC avec ou sans SDS à 45βC pendant 15 minutes à 2 reprises.
L'invention a également pour objet tout acide nucléique susceptible de s'hybrider avec les acides nucléiques issus de celui de la figure 1 tels que définis ci-dessus, ou leurs séquences complémentaires, notamment dans les conditions d'hybridation décrites ci-dessus.
L'invention vise également les sondes nucléo¬ tidiques susceptibles de s'hybrider avec la totalité de l'acide nucléique de la figure 1, ou avec tout fragment tel que défini ci-dessus de cet acide nucléique, ainsi qu'avec l'ARN messager codant pour l'ECA testiculaire et avec le gène humain responsable de l'expression de l'ECA testiculaire, notamment dans les conditions d'hybridation définies ci-dessus, ou leurs séquences complémentaires.
Il va de soi que les conditions d'hybridation stringentes ou non stringentes, définies ci-dessus constituent des conditions préférées pour l'hybridation, mais ne sont nullement limitatives et peuvent être modifiées sans affecter pour autant les propriétés de reconnaissance et d'hybridation des sondes et des acides nucléiques sus-mentionnés.
Les conditions salines et de température, au cours de 1•hybridation et du lavage des membranes, peuvent être modifiées dans le sens d'une plus grande ou d'une plus faible stringence sans que la détection de l'hybridation en soit affectée. Par exemple, il est possible d'ajouter un pourcentage variable de formamide pour abaisser la température au cours de 1'hybridation.
L'invention concerne également le polypeptide de la figure 1 correspondant à l'ECA testiculaire humaine, ainsi que tous les polypeptides, codés par les fragments d'ADN sus-mentionnés issus de l'acide nucléique de la figure 1, susceptibles d'être reconnus par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant spécifiquement tout peptide issu de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 à 67 de la figure 1, et plus particulièrement celle délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 à 67 de la figure 1, et, le cas échéant, de posséder une activité enzymatique du type de celle de l'ECA testiculaire
Parmi les polypeptides sus-mentionnés, on distinguera notamment :
- le polypeptide s'étendant entre les acides aminés correspondant aux positions 1 et 732 de la figure 1 ;
- le polypeptide s'étendant entre les acides aminés correspondant aux positions 22 et 732 ;
- le polypeptide dont la séquence peptidique est délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 67 de la figure 1,
- le polypeptide dont la séquence peptidique est délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 et 67 de la figure 1,
- le polypeptide caractérisé par la séquence peptidique d'environ 5 à 67 acides aminés, issue de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 67 de la figure 1,
- le polypeptide caractérisé par la séquence peptidique d'environ 5 à 45 acides aminés, issue de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 et 67 de la figure 1.
Les polypeptides précédents peuvent être modifiés dès lors qu'ils conservent les propriétés biochimiques ou immunologiques ou pharmacologiques définies précédemment.
Par exemple, et de façon non limitative, des polypeptides dans le cadre de l'invention peuvent se distinguer des polypeptides définis ci-dessus ;
- par addition et/ou
- suppression d'un ou plusieurs acides aminés et/ou - modification d'un ou de plusieurs acides aminés, sous réserve que les propriétés biochimiques ou immunologiques ou pharmacologiques comme indiqué ci-dessus soient conservées.
On conçoit que l'homme de métier dispose de la possibilité d'identifier, voire de sélectionner ceux des polypeptides de séquences plus courtes qui entrent dans le champ de l'invention. A titre de l'un des moyens généraux lui permettant de procéder à cette identification, on mentionnera, par exemple, le traitement du polypeptide de la figure 1 avec une protéase clivant le polypeptide sus-mentionné dans un site peptidique choisi, soit dans une région N- terminale, soit dans une région C-terminale, suivi de la séparation du fragment N-terminal ou du fragment C-terminal du restant dudit polypeptide, ce "restant" étant alors testé pour ses propriétés de reconnaissance par un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre un peptide issu de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 à 67 de la figure 1, et, le cas échéant, pour son activité enzymatique vis-à-vis de l'angiotensine et/ou de la bradykinine. En cas de réponse positive, l'on aura alors établi que le fragment N-terminal ou C-terminal, ne jouait pas un rôle significatif, sinon essentiel pour la manifestation des propriétés immunologiques et/ou enzymatiques dudit polypeptide. L'opération peut éventuellement être répétée pour autant que l'on dispose d'une protéase susceptible de reconnaître un autre site spécifique proche d'une extrémité N- terminale ou C-terminale du polypeptide restant. La perte par le polypeptide plus petit reconnu des propriétés immunologiques et/ou enzymatiques du fragment plus long dont il était issu peut conduire à l'hypothèse que le dernier fragment séparé jouait un rôle significatif dans la manifestation des propriétés enzymatiques du polypeptide de la figure 1.
Une autre variante, plus simple que la précédente, de détection des régions de l'ECA testiculaire essentielles à la manifestation des activités enzymatiques de cette dernière, peut être basée sur des traitements enzymatiques d'un acide nucléique codant pour l'ECA testiculaire. Ce traitement est réalisé avant l'incorporation de l'acide nucléique ainsi obtenu, et présumé coder pour un polypeptide possédant des activités immunologiques et/ou enzymatiques du type de celle de l'ECA testiculaire, dans le vecteur d'expression utilisé pour la mise en oeuvre d'un procédé de production dudit polypeptide dans l'hôte cellulaire approprié (procédé qui sera plus particulièrement détaillé dans ce qui suit) . Ce traitement enzymatique peut alors consister soit en un émondage des extrémités de l'acide nucléique initial (codant par exemple pour le polypeptide de la figure 1 en entier) , par exemple par une enzyme exonucléolytique, telle que Bal31, soit par une ou plusieurs enzymes de restriction choisie pour leurs sites de reconnaissance respectifs (le cas échéant aménagés par mutagenèse ponctuelle dirigée) dans la séquence de l'acide nucléique initial, soit par l'addition d'un fragment d'ADN synthétique de jonction entre le site de coupure de l'enzyme de restriction et le début de la région à exprimer. On peut ainsi supprimer à partir de 1*extrémité 3' de l'ARN messager, des séquences de longueurs croissantes, remplacées par un codon stop de traduction. La même démarche peut s'appliquer à l'extrémité 5' mais nécessite de maintenir un codon d'initiation (ATG) , le signal peptide ou tout autre séquence permettant la sécrétion du peptide et de maintenir la phase ouverte de lecture.
L'acide nucléique tronqué obtenu peut alors être testé, après incorporation dans le vecteur choisi et transformation de l'hôte cellulaire avec le vecteur recombinant obtenu, pour sa capacité à exprimer un polypeptide tronqué correspondant, possédant encore les susdites propriétés immunologiques et/ou enzymatiques ou au contraire ne les possédant plus, d'où la possibilité, comme dans la variante précédente, d'identifier au sein du polypeptide de la figure 1, les séquences jouant un rôle important, sinon essentiel dans la manifestation des propriétés immunologiques et/ou enzymatiques de l'ECA testiculaire.
L'invention a également pour objet tout acide nucléique recombinant contenant tout fragment d'ADN du type sus-indiqué codant pour la pré-ECA testiculaire humaine, ou l'ECA testiculaire humaine mature, ou encore pour tout polypeptide, susceptible de posséder une activité immunologique et/ou enzymatique du type de celle de l'ECA testiculaire, associé avec un promoteur et/ou un terminateur de transcription reconnu par les polymérases de la cellule hôte dans laquelle ledit acide nucléique recombinant est susceptible d'être introduit.
L'introduction dudit acide nucléique recombinant dans la cellule hôte, est avantageusement réalisée à l'aide de vecteurs, notamment du type plasmide, qui sont aptes à se répliquer dans ladite cellule hôte et à y permettre l'expression de la séquence codant pour l'enzyme.
Ledit acide nucléique recombinant peut également être introduit dans la cellule hôte à l'aide d'un vecteur viral (virus recombinant) capable d'infecter ladite cellule hôte, ou à l'aide d'un vecteur rétroviral capable de s'intégrer dans le génome de la cellule hôte, et d'y permettre l'expression du polypeptide codé par un acide nucléique selon l'invention, ce dernier étant sous le contrôle d'un promoteur viral, ou rétroviral, actif dans la cellule hôte.
A titre d'exemples de vecteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera le virus de la leucémie murine de type Moloney (ou M-MuLV) susceptible d'infecter les cellules NIH 3T3, ou le baculovirus utilisé pour infecter les cellules d•insectes.
L'invention concerne donc un procédé de production de l'ECA testiculaire humaine, ou des polypeptides sus-mentionnés issus de l'ECA testiculaire, qui comprend la transformation des cellules hôtes au moyen des vecteurs sus-indiqués, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu approprié et la récupération desdits polypeptides soit directement à partir du milieu de culture, lorsque ces derniers y sont sécrétés (notamment dans le cas où les polypeptides considérés sont précédés d'une séquence signal lors de leur synthèse dans la cellule hôte) , soit après lyse de la paroi de la cellule hôte dans le cas où les polypeptides ne seraient pas sécrétés hors de cette dernière.
Les cellules hôtes utilisées pour la mise en oeuvre du procédé sus-mentionné peuvent être des cellules procaryotes, notamment des cellules de E. coli, ou, d'une manière plus avantageuse, des cellules eucaryotes, qui permettent, notamment, d'obtenir des protéines sous leur forme glycosylée et mature (levures, cellules CHO ou autres cellules, ou cellules d'insectes infectées par le baculovirus).
L'invention vise également un procédé de préparation des nouveaux polypeptides sus-mentionnés par synthèse qui comprend soit l'addition étape par étape des résidus peptidiques choisis, avec l'addition ou l'élimination de groupes protecteurs quelconques des fonctions amino et carboxyle, ou addition de résidus peptidiques choisis afin de produire des fragments, suivie d'une condensation desdits fragments en une séquence en acides aminés appropriée, avec addition ou élimination des groupes protecteurs choisis.
L'invention se rapporte également à des anticorps spécifiques dirigés contre les polypeptides ci-dessus. En particulier, l'invention vise des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre les séquences peptidiques sus-mentionnées.
Un mode d'obtention d'anticorps polyclonaux contre un peptide dérivé de la séquence de l'ECA testiculaire est brièvement résumé ci-après : - le peptide dont la taille minimum est d'environ 5 à 15 acides aminés, est couplé
* soit à la sérum albumine bovine ou à la KLH (hemocyanine de Keyhole Limpets (Megathura crenulata) si le peptide contient une cystéine, qui peut être ajoutée de façon artificielle à la séquence naturelle. Cette cystéine sera auparavant activée par le SPDP ≈ Ester N-Hydroxysuccinimide de l'acide (pyridyldithio-2)-3 propionique,
* soit à la KLH ou à la LPH (hemocyanine de 1'hemolymphe de Limulus polyhemas) par l'intermédiaire de la benzoquinone;
* soit à la LPH par le glutaraldéhyde,
* soit à la LPH par le carbodiimide. - le peptide couplé est ensuite injecté au lapin dans un volume égal d'adjuvant de Freund et dans le coussinet plantaire des pattes postérieures des lapins. Lors de la première injection, c'est de l'adjuvant de Freund complet qui est utilisé. Ensuite c'est de l'adjuvant incomplet,
- une injection de rappel est pratiquée toutes les 3 à 4 semaines,
- entre chaque injection, un prélèvement de sang est effectuée pour mesurer le titre des anticorps (le titre des anticorps est établi en mesurant la dilution pour laquelle le peptide qui a servi aux injections et qui est marqué radioactivement est lié à l'anticorps à 50%) .
Les anticorps monoclonaux sus-mentionnés peuvent être produits par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.
Dans un premier temps, on inocule un des polypeptides ci-dessus à un animal choisi (par exemple souris de type Biozzi ou Balb/C) , dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ce polypeptide. Le protocole d'injection comprend par exemple trois injections dont la première faite avec de l'adjuvant de Freund complet. Les animaux peuvent recevoir une injection I.V. du polypeptide quelques heures avant l'isolement des cellules de la rate. Les cellules spléniques de l'animal injecté sont ensuite fusionnées avec les cellules "immortelles" de la lignée myélomateuse, selon la méthode décrite par DI PAULI (DI PAULI R, and W.C., RASCHKE, (1978), in Current topics in Microbiology and Im unology, vol. 81,. F. MELCHERS, M. POTTE, and N.L. WARNER, editors, Springer-Verlag, Berlin, 37-39), à l'aide du polyéthylène glycol. Les cellules ayant fusionnées (hybridomes) sont ensuite remises en culture et sélectionnées dans un milieu hypoxanthine- aminoptérine-thymidine. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on réalise alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment.
Les hybridomes produisant des anticorps sont ensuite clones et sous-clonés, au mieux grâce à un trieur de cellules. Les hybridomes sont ensuite réinjectés dans le péritoine d'animaux, notamment de souris Balb/C traitées par le pristane. Les ascites sont ensuites testées pour la présence d'anticorps et les immunoglobulines présentes dans les ascites sont purifiées sur colonne d'affinité, notamment sur protéine-A Sépharose.
Des anticorps mono ou polyclonaux peuvent également être produits contre la molécule entière d'ECA.
Parmi les polypeptides utilisés pour la fabrication des anticorps polyclonaux ou monoclonaux sus-mentionnés, on mentionnera plus particulièrement les polypeptides spécifiques de l'ECA testiculaire à savoir ceux délimités par les acides aminés situés aux positions l et 67, ou 22 et 67 de la figure 1, ou encore ceux possédant au moins 5 acides aminés issus de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 67 de la figure 1.
L'invention concerne également une méthode de dépistage, ou de dosage, in vitro d'ECA ou produit ayant in vivo les propriétés de l'ECA, et plus particulièrement de l'ECA testiculaire humaine, ou d'un produit dérivé de 1'ECA testiculaire tel que les polypeptides sus-mentionnés, dans un prélèvement biologique susceptible de les contenir. Une telle méthode de dépistage selon l'invention, peut être réalisée soit à 1'aide des anticorps monoclonaux sus¬ mentionnés, soit à l'aide des sondes nucléotidiques décrites ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à partir du polypeptide délimité par les acides aminés situés aux positions 1 et 67, ou celui délimité par les acides aminés situés aux positions 22 et 67, ou encore celui issu de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 67 de la figure 1, et reconnaissant spécifiquement ces polypeptides, pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage, ou de dosage, in vitro, de l'ECA testiculaire humaine.
L'invention concerne également l'utilisation des sondes nucléotidiques décrites ci-dessus, notamment celles s'hybridant avec les séquences nucléiques codant pour les polypeptides spécifiques de l'ECA testiculaire humaine décrits ci-dessus, pour la mise en oeuvre de la méthode de dépistage ou de dosage sus-mentionnée.
Le prélèvement biologique sus- entionné est effectué soit dans des tissus fluides, tels que le sang, soit dans des organes, ce dernier type de prélèvement permettant notamment d'obtenir des coupes fines de tissus sur lesquelles les anticorps ou les sondes sus-mentionnés sont ultérieurement fixés.
La méthode de dosage selon l'invention, procédant par l'intermédiaire des anticorps sus-mentionnés comprend notamment les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un anticorps reconnaissant spécifiquement l'ECA testiculaire ou un polypeptide dérivé de l'ECA testiculaire selon l'invention, avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre l'ECA testiculaire ou produit qui en est dérivé et l'anticorps sus¬ mentionné;
- la détection à l'aide de tout moyen approprié du susdit complexe immunologique.
Avantageusement, les anticorps utilisés pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont marqués notamment de manière enzymatique ou radio-active.
Une telle méthode selon l'invention peut notamment être réalisée suivant la méthode ELISA (enzyme linked sorbent assay) qui comprend les étapes suivantes : fixation d'une quantité prédéterminée d'anticorps sur un support solide, notamment à la surface d'un puits d'une microplaque ;
- addition du prélèvement biologique (sous forme liquide) sur ledit support ;
- incubation pendant une temps suffisant pour permettre la réaction immunologique entre lesdits anticorps et l'ECA testiculaire ou produit qui en est dérivé sus-mentionné ; élimination des parties non fixées du prélèvement biologique et lavage du support solide (en particulier des puits de la microplaque) ;
- addition d'une immunoglobuline marquée par une enzyme susceptible d'activer un substrat spécifique de cette enzyme,
- addition du substrat spécifique de l'activité enzymatique libérée lors de la réaction immunologique précédente ;
- détection, à l'aide de tout moyen approprié, de la dégradation du substrat par 1'enzyme ; et
- corrélation de la quantité d'enzymes libérées à la concentration d'ECA humaine initialement présente dans le prélèvement biologique. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de dosage de l'invention, les anticorps sus-mentionnés ne sont pas marqués et la détection des complexes immunologiques formés entre les polypeptides et lesdits anticorps est réalisée à l'aide d'une immunoglobuline marquée reconnaissant lesdits complexes.
La méthode de dosage selon l'invention peut également être réalisée par une technique immuno- enzymatique suivant un mécanisme de compétition entre les polypeptides susceptibles d'être contenus dans le prélèvement biologique, et des quantités prédéterminées de ces mêmes polypeptides, vis-à-vis des anticorps sus-mentionnés. Dans ce dernier cas, les polypeptides de l'invention en quantité prédéterminée sont avantageusement marqués à l'aide d'un marqueur enzymatique.
L'invention ne se limite nullement aux modes de réalisation décrits ci-dessus pour le dosage in vitro des polypeptides de l'invention, ce dosage pouvant être réalisé à l'aide de toute autre méthode immunologique appropriée.
L'invention concerne également une méthode de dépistage, ou de dosage, in vitro d'une ECA ou produit ayant in vivo les propriétés de l'ECA, et, plus particulièrement, de l'ECA testiculaire humaine, cette méthode procédant par détection ou dosage d'un acide nucléique correspondant selon le code génétique universel à toute ou partie de cette ECA, et étant réalisée à partir d'un prélèvement biologique susceptible de contenir ledit acide nucléique. Cette méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique décrite ci-dessus avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre l'acide nucléique à détecter et ladite sonde ;
- la détection à l'aide de tout moyen approprié du susdit complexe d'hybridation.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le prélèvement biologique sus-mentionné est, préalablement à la mise en oeuvre du dépistage, traité de manière à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et, éventuellement, en ce que le matériel génomique contenu dans lesdites cellules soit fragmenté à 1'aide d*enzymes de restriction du type EçoRI, BamHI etc..., ou que les ARN en soient isolés, notamment selon la méthode décrite dans THOMAS, P.S. (1983) Methods Enzymol., 100, 255-266.
Avantageusement, les sondes nucléotidiques de 1•invention sont marquées, notamment par 1'incorpo¬ ration d'un (ou plusieurs) nucleotide soit radio-actif soit couplé à un haptène permettant sa détection par un anticorps, ce dernier étant conjugué à une enzyme dont l'activité est facilement détectable (par exemple la phosphatase alcaline) . Les ADN, ou ARN, issus du prélèvement biologique sont placés sur un support approprié, notamment sur un filtre de nitrocellulose ou autre, par exemple membrane de nylon, sur lequel sont ensuite additionnées les sondes sus-mentionnées.
Selon un autre mode avantageux de réalisation du procédé sus-mentionné de l'invention, des coupes histologiques sont réalisées à partir du susdit prélèvement biologique et les sondes nucléotidiques de 1•invention sont mises en contact direct avec des coupes histologiques pour la détection des acides nucléiques de l'invention par hybridation in situ.
L'invention concerne également l'application de la méthode de dépistage ou de dosage de l'ECA testiculaire sus-mentionnée aux diagnostic in vitro de pathologies spécifiques des testicules (en particulier au niveau des cellules germinales) , notamment de tumeurs de testicules (encore appelés séminomes) , de la maturation des cellules germinales mâles, des hypofertilités et stérilités masculines.
Dans le cadre de diagnostic de l'hypofertilité et de la stérilité masculine, la méthode sus-mentionnée est avantageusement réalisée à partir du sperme, ou de cellules germinales ou du plasma séminal isolés à partir du sperme, ou à partir de biopsie testiculaire. ; L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre des méthodes de dépistage, ou de dosage, in vitro sus¬ mentionnés.
A titre d'exemple, de tels kits comprennent notamment:
- une quantité déterminée d'un des anticorps polyclonaux ou monoclonaux sus-mentionnés susceptible de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec l'ECA testiculaire ou avec un des polypeptides dérivés de l'ECA testiculaire selon l'invention ; et/ou une quantité déterminée d'ECA testiculaire ou un polypeptide susceptible de donner lieu à une réaction immunologique avec les anticorps sus-mentionnés ;
- avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre l'ECA ou les polypeptides de 1•invention et les anticorps sus¬ mentionnés ;
- avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques produits lors de la réaction immunologique sus-mentionnée.
Dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro utilisant des sondes nucléotidiques, les kits utilisés comprennent par exemple : une quantité déterminée d'une des sondes nucléotidiques sus-mentionnées susceptible de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un des acides nucléiques sus-mentionnés codant pour l'ECA testiculaire ou un polypeptide dérivé de l'ECA testiculaire selon l'invention ;
- avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation produits lors de la réaction d'hybridation sus-mentionnée.
L'invention concerne également l'utilisation du polypeptide de la figure 1 ou de tout fragment peptidique approprié issu de ce dernier, pour la conception de nouveaux inhibiteurs de l'ECA humaine, plus puissants et/ou spécifiques de cette dernière que ne le sont les actuels inhibiteurs de l'ECA.
L'invention a également pour objet une méthode de détection ou de dosage, d'un inhibiteur de l'ECA, ou de quantification de son pouvoir inhibiteur, qui comprend la mise en contact du polypeptide de la figure 1, ou de tout fragment peptidique issu de ce dernier et possédant une activité enzymatique du type de celle de l'ECA, avec ledit inhibiteur, et la détermination, pour ces inhibiteurs de la constante de dissociation [Ki] et de la concentration nécessaire à un inhibition de 50% [IC50]de l'enzyme.
L'invention concerne également l'utilisation du polypeptide de la figure 1, ou de tout fragment de ce dernier, tel que décrit ci-dessus, capable d'hydrolyser les kinines, notamment la bradykinine, dans le traitement des maladies inflammatoires, ou infectieuses, de la pancréatite aiguë, et plus généralement de maladies où une libération de kinines dans l'organisme pourrait jouer un rôle pathogène. A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement des compositions pharmaceutiques pour le traitement des maladies indiquées ci-dessus, caractérisée par l'association de tout ou partie du polypeptide de la figure 1, capable d'hydrolyser les kinines, notamment la bradykinine, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des sondes nucléotidiques de l'invention, capables de s'hybrider avec le gène responsable de l'expression de l'ECA testiculaire humaine dans les conditions décrites ci-dessus, pour la détermination des différentes formes alléliques du gène sus-mentionné.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique d'environ 15 à environ 30 nucleotides issue de la séquence nucléotidique de la figure 1, ou une séquence complémentaire de cette dernière, ou encore une séquence d'environ 15 à 30 nucleotides susceptible de s'hybrider (dans les conditions décrites ci-dessus) avec ladite séquence d'environ 15 à 30 nucleotides issue de la figure 1, et l'utilisation de telles séquences en tant qu'amorces permettant l'amplification génique de toute ou partie de la séquence nucléotidique de la figure 1, notamment selon la méthode d'amplification décrite dans la demande de brevet européen n" 86/302.298.4 du 27/03/1986.
Ces amorces oligonucléotidiques sont particulièrement utiles dans le cadre de la synthèse de l'ECA testiculaire par voie du génie génétique telle que décrite ci-dessus, dont les différentes étapes sus-mentionnées sont précédées par une étape d'amplification du gène codant pour l'ECA testiculaire préalablement à l'étape de transformation des cellules hôtes.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'ARNm codant pour l'ECA testiculaire, telle que décrite ci-dessus, comprenant une étape préalable d'amplification de toute ou partie de cet ARNm (ou l'amplification de la copie d'ADN de l'ARN codant pour l'ECA testiculaire), le cas échéant, isolé des autres constituants cellulaires, à l'aide d'un ou de plusieurs, couple d'amorces telles que définies ci-dessus.
A ce titre, l'invention a également pour objet des kits de diagnostic tels que décrits ci-dessus, et contenant également au moins un couple d'amorces sus¬ mentionnées, ces amorces étant susceptibles d'amplifier le nombre de copies de l'acide nucléique à détecter en présence d'une polymérase appropriée et des quantités appropriées des 4 désoxynucléotides triphosphate différents, dATP, dGTP, dCTP et dTTP.
Des caractéristiques supplémentaires de 1'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit du clonage de 1'acide nucléique codant pour l'ECA testiculaire humaine, ainsi que des sondes utilisées pour ce clonage, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.
I - SEQUENÇAGE DE L'ADN COMPLEMENTAIRE DE L'ECA TESTICULAIRE HUMAINE
Une banque d'ADNc de testicules humains amorcée avec de l'oligo(dT), construite dans le phage λgtll (clontech laboratories Inc.) a été criblée en utilisant la sonde décrite ci-dessous.
Les hybridations avec les phages ont été effectuées selon la méthode de Benton WD et Davis RW Science (WASHINGTON) 1977, 196, 180-182. Plus précisément les hybridations ont été effectuées dans une solution constituée de 6XSSC (IXSSC correspond à NaCl 150 mM, citrate de sodium 15 M) , 0,1 % de NaDodS04, tampon NaP04 50 mM à pH 6,8, 0,1 mg/ml d'ADN dénaturé, de sperme de saumon à 65"C.
La séquence utilisée comme sonde est contenue dans le bactériophage Λ19-22 et représente les 3248 derniers nucleotides de la séquence d'ADN complémentaire (position 691 à 4024) , telle que décrite dans l'article de SOUBRIER F. et al, sus¬ mentionné. Elle a été choisie car elle hybride avec l'ARN messager de l'ECA dans le testicule humain. La séquence clonée de l'ADN de l'ECA endotheliale a été utilisée comme sonde, par marquage statistique à l'aide de la DNA polymérase I de E.coli et d'amorces oligonucléotidiques, selon la méthode décrite par FEINBERG AP et al (1983) Anal. Biochem., 132, 6-13. En utilisant l'alpha [32P] , deoxycytidine triphosphate, d'activité spécifique 3000cies/mmole, la sonde a une activité spécifique de 2 à 8 x 10° cpm/μg d'ADN. La concentration de la sonde radioactive dans la solution d'hybridation des filtres est de 106 cpm/ml. Les filtres ont ensuite été lavés en condition de forte stringence (lavage final en 0,1 x SSC, 0,1 % NaDodS0) à 68"C pendant 30 minutes. Le criblage de 2 x 106 clones de la banque a permis d'isoler 17 clones positifs. Parmi ceux-ci , deux clones positifs ont été isolés. Les fragments d'ADN insérés dans les phages recombinants ont été purifiés et insérés dans le site EcoRI du plasmide pBluescript (Sratagene) . La séquence des insertions a été obtenue soit directement sur l'ADN double brin des plas ides, soit en obtenant de l'ADN simple brin en infectant les cultures à l'aide du phage helper K07. La détermination de la séquence nucléotidique de ces clones a été effectuée par la méthode de Sanger (SANGER, F. et al (1977), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467) en utilisant soit l'ADN polymérase de klenow, soit l'ADN polymérase de T7 modifiée (Sequenase, US Biochemical) . Quelques régions ont été séquencées en utilisant à la place de la déoxyguanosine tri-phosphate (dGTP) , le déoxyinosine tri-phosphate (dITP) ou le deaza-déoxyguanosine tri¬ phosphate (7-deaza dGTP) . L'électrophorèse des fragments marqués par le [S35] dATP a été pratiquée sur gel d'urée-polyacrylamide. Les séquences ont été déterminées en synthétisant des oligomères de proche en proche toutes les 350 paires de base environ qui ont servi d'amorces échelonnées le long de la séquence.
Le clone λhtlO contient une séquence d'une longueur de 2217 nucleotides et qui s'étend de la position 260 à 2477 de la séquence du cDNA testiculaire portée sur la figure 1. Ce clone s'étend dans la région 3' de l'ARN messager jusqu'à la séquence de polyadénylation et comprend une courte séquence poly(A) . Le clone λhtl6, d'une longueur de 2263 nucleotides, correspond à la région du cDNA testiculaire située entre la position 50 et 2313 de la figure 1. Un oligomer d'une longueur de 22 nucleotides, a été synthétisé et utilisé pour cribler à nouveau la banque afin d'obtenir des clones correspondant à la région la plus 5' de l'ARN messager. La séquence de cet oligomer est contenue dans la séquence du clone λhtl6 (position 59 à 80) . L'oligomer a été marqué auN 7-[32P-] adénosine triphosphate ATP (activité spécifique 5000cies/mmole) à l'aide de la T4 polynucléotide kinase. L'activité spécifique de la sonde est de 5 x 106 cp /pmole. Les filtres ont été criblés dans les mêmes conditions que précisées au dessus à part les modification suivantes : la température d'hybridation était de 60'C et la température de lavage de 65*C dans une solution 2 X SSC. Ce criblage a permis d'isoler le clone λht341, d'une longueur de 2,2 kb, qui s'étend en 5' jusqu'au nucleotide 31 du cDNA testiculaire de l'ACE.
De manière à obtenir l'ADN complémentaire correspondant à l'extrémité 5' de l'ARN messager codant pour l'ECA testiculaire, une autre banque de donnée d'ADNc a été construite en utilisant 5 μg d'ARN isolé à partir de tissu testiculaire humain obtenu lors d'une intervention chirurgicale. La banque d'ADN complémentaire a été construite selon la méthode de Gùbler et Hoffman (Gène (1983), 25, 263-269), en utilisant deux amorces. D'une part une amorce spécifique de l'ARN messager de l'ECA, déterminé par la séquence des clones précédemment obtenus. Il s'agit d'un oligomer de 17 bases (ATH17) , complémentaire d'une séquence localisée en position 228-244 de la figure 1. La seconde amorce correspond à l'oligo- d(T)12-18 mers (pharmacia) . Les ADN complémentaires double-brin ont été synthétisés puis insérés dans le phage λgtlO coupé par l'enzyme EcoRI selon la méthode de Koenig et al (Koenig, M et al, (1987) Cell, 50, 509-517) .
Les phages recombinants (1 x 106 phages recombinants) ont été criblés à l'aide de l'oligomer TH16, marqué comme précédemment. Les conditions de criblage de la banque sont identiques à celles décrites plus haut avec la même sonde. Parmi les clones positifs obtenus, le clone λht221, d'une longueur de 244 paires de base a été séquence. Il contient la partie la plus 5' de l'ARN messager codant pour l'ECA testiculaire. La séquence de l'ARN messager testiculaire, telle qu'elle peut être déduite de la séquence nucléotidique composite du cDNA testiculaire obtenue à partir des 4 clones, est longue de 2477 nucleotides. Elle présente une séquence nucléotidique identique à celle de l'ARN messager endothelial, en 3' de la position 228 du cDNA testiculaire. En 5' de cette position les deux ARN messagers testiculaires et endothéliaux divergent et la séquence spécifique testiculaire déterminée est de 228 nucleotides. Depuis le premier codon ATG jusqu'au codon stop, il existe une phase ouverte codant pour 732 acides aminés. L'analyse de la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique montre qu'il existe après la méthionine de départ de la traduction, un peptide qui présente les caractéristiques d'un signal peptide et en utilisant le programme décrit par VON HEIJNE (Nucleic Acids Research, (1986), 14, 4683-4690) pour la prédiction des sites de coupure d'un signal peptide, le site de coupure du signal peptide se situerait entre l'acide aminé en position 21 et celui en position 22. A la suite de cette séquence signal, la séquence peptidique spécifique de l'ECA testiculaire est très riche en serine et en thréonine, sites potentiels de glycosylation, et ce type de séquence est évocateur de O-glycosylation groupée.
Les caractéristiques enzymatiques de l'enzyme testiculaire étant identiques à celle de l'enzyme endotheliale, notamment en ce qui concerne le Km, la Vmax, et Kcat sur 1'angiotensine I, la comparaison de sa structure avec celle de l'enzyme endotheliale apporte des informations intéressantes concernant les relations structure activité dans la molécule d'ECA. En effet, l'enzyme endotheliale est constituée de deux grands domaines, très homologues entre eux. Chacun de ces domaines contient une courte séquence d'acides aminés consensus du site actif des métallopeptidases à zinc tels que la thermolysine, la collagénase ou 1•endopeptidase neutre. L'enzyme de conversion testiculaire ne contient que le domaine carboxyterminal de l'ECA, endotheliale, ce qui semble indiquer que ce domaine à lui seul porte les structures responsables de l'activité enzymatique. Une autre hypothèse serait que l'enzyme testiculaire agit sous forme d'un dimère, cependant l'enzyme testiculaire native de lapin testée en condition non dénaturante par centrifugation en gradient de densité a bien un poids moléculaire inférieur à celui de l'ECA endotheliale.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléique de la figure 1, ou une partie de cette séquence, cette partie comprenant elle-même toute ou partie de la séquence nucléique délimitée par les nucleotides situés aux positions 29 et 229 de la figure 1, et en ce qu'il code pour un polypeptide, ce polypeptide étant : susceptible d'être reconnu par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant spécifiquement tout peptide issu de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 à 67 de la figure 1,
- et, le cas échant, capable d'hydrolyser 1•angiotensine I et/ou les kinines, notamment la bradykinine, ou tout acide nucléique ne se distinguant du précédent au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucleotides n'entraînant pas la modification de la séquence en acides aminés du susdit polypeptide dans des conditions propres à lui faire perdre les susdites propriétés.
2. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il est susceptible de s'hybrider avec l'acide nucléique représenté sur la figure 1, dans les conditions d'hybridation stringentes suivantes : dénaturation de l'acide nucléique (ADN) susceptible de s'hybrider avec celui de la figure 1, par traitement à l'aide d'une solution alcaline (0,5 M NaOH) , suivie d'un passage à pH neutre,
- traitement de préhybridation du support (filtre de nitrocellulose ou membrane de nylon) , sur lequel est fixé 1'acide nucléique représenté sur la figure 1, à 50*C pendant 3 heures avec une solution ayant la composition suivante : 25 mM KP04, pH 7,4 ; 5 x SSC ; 5 x Denhardt's ; 50 μg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué ; 0,1 % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS ou NaDod S04 ") ,
- remplacement de la solution de pré-hybridation au contact du support par une solution tampon ayant une composition identique à celle de pré-hybridation indiquée ci-dessus, (plus éventuellement 10 % de Dextran) , et comprenant 1'acide nucléique de la figure 1 en tant que sonde marquée, notamment de manière radioactive, et préalablement dénaturée par un trai¬ tement à 90βC pendant 3 minutes,
- incubation pendant 12 heures à 60*C,
- lavages successifs avec les solutions suivantes :
2 x SSC, pendant 30 minutes à 60*0 à 2 reprises,
. 1 x SSC, 0,1 % SDS pendant 1 à 2 fois 15 minutes à 65*C.
3. Acide nucléique caractérisé en ce que qu'il est susceptible de s'hybrider avec l'acide nucléique de la figure 1 dans des conditions non stringentes reprenant les caractéristiques essentielles des conditions stringentes définies dans la revendication 2, sauf pour ce qui concerne la température qui est de 40βC dans les conditions non stringentes, et les lavages successifs qui, dans les conditions non stringentes, sont réalisés à 1 'aide de 2 x SSC avec ou sans SDS à 45βC pendant 15 minutes à 2 reprises.
4. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN délimitée par les nucleotides situés aux positions 92 et 2224 de la figure 1, codant pour l'ECA testiculaire humaine mature.
5. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN codant pour l'ECA testiculaire humaine mature est précédée par une séquence d'ADN délimitée par les nucleotides situés aux positions 29 et 91 de la figure 1, cette dernière codant pour un peptide signal de 21 acides aminés.
6. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN s'étendant entre, d'une part, le nucleotide situé entre les positions 1 à 92 et, d'autre part, le nucleotide situé entre les positions 229 à 2224 de la figure 1.
7. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN d'environ 15 à 201 nucleotides, issue de la séquence nucléique s'étendant entre le nucleotide situé à la position 29 et le nucleotide situé à la position 229 de la figure 1.
8. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'ADN d'environ 15 à 135 nucleotides, issue de la séquence nucléique s'étendant entre le nucleotide situé à la position 92 et le nucleotide situé à la position 229 de la figure 1.
9. Polypeptide codé par l'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 à 732 de la figure 1, et en ce qu'il est suceptible d'être reconnu par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissant spécifiquement tout peptide issu de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 à 67 de la figure 1, et, le cas échant, capable d'hydrolyser l'angiotensine I et/ou les kinines, notamment la bradykinine.
10. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 et 732 de la figure 1.
11. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 67 de la figure 1
12. Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé par la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 et 67 de la figure 1.
13. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé par la séquence peptidique d'environ 5 à 67 acides aminés, issue de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 1 et 67 de la figure 1,
14. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé par la séquence peptidique d'environ 5 à 45 acides aminés, issue de la séquence peptidique délimitée par les acides aminés situés aux positions 22 et 67 de la figure 1.
15. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 associée avec un promoteur sous le contrôle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être d'effectuée et, le cas échéant, une séquence d'ADN codant pour des signaux de terminaison de la transcription.
16.. Vecteur recombinant, notamment plasmide recombinant, ou virus recombinant, capable de transformer, ou d'infecter, une cellule hôte appropriée, notamment une cellule eucaryote, ledit vecteur contenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 sous le contrôle d'éléments de régulation permettant l'expression de ce fragment d'ADN dans la cellule hôte, notamment d'un promoteur reconnu par les polymerases de ladite cellule hôte.
17. Procédé de production de 1•ECA testiculaire humaine, mature ou non, ou d'un polypeptide issu de l'ECA testiculaire humaine selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, ce procédé comprenant la transformation de cellules hôtes au moyen du vecteur selon la revendication 16, la mise en culture des cellules hôtes transformées dans un milieu de culture approprié et la récupération de 1'enzyme à partir de ces cellules ou du milieu de culture.
18. Anticorps polyclonal ou monoclonal, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 9 à 15.
19. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constitulée par une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider avec toute ou partie de l'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans les conditions définies dans la revendication 2 ou la revendication 3, ou toute sonde nucléotidique ne se distinguant de la précédente au niveau de sa séquence nucléotidique que par des substitutions de nucleotides n'entraînant pas la modification des propriétés d'hybridation de ladite sonde avec l'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
20. Amorce nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une succcession d'environ 15 à 30 nucleotides issue d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 8, ou d'une séquence complémentaire de cette dernière, ou en ce qu'elle est constituée d'une succession d'environ 15 à 30 nucleotides susceptible de s'hybrider avec l'une de ces séquences.
21. Méthode de dépistage, ou de dosage, in vitro d'une ECA ou produit ayant in vivo les propriétés de l'ECA, et, plus particulièrement, de l'ECA testiculaire humaine, dans un prélèvement biologique susceptible de la contenir, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un anticorps selon la revendication 18, avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe immunologique formé entre l'ECA ou produit qui en est dérivé et l'anticorps sus-mentionné ;
- la détection du susdit complexe immunologique.
22. Méthode de dépistage, ou de dosage, in vitro d'une ECA ou produit ayant in vivo les propriétés de l'ECA, et, plus particulièrement, de l'ECA testiculaire humaine dans un prélèvement biologique susceptible de la contenir, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- le cas échéant, l'amplification du nombre de copies de l'acide nucléique à détecter à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 20,
- la mise en contact d'une sonde nucléotidique selon la revendication 19, avec le susdit prélèvement biologique dans des conditions permettant la production éventuelle d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et l'acide nucléique à détecter,
- la détection du susdit complexe d'hybridation.
23. Méthode de dépistage in vitro selon la revendication 21 ou 22, appliquée au diagnostic in vitro de la maturation des cellules germinales mâles humaines, des hypofertilités, et des stérilités masculines, ou encore des tumeurs testiculaires (ou séminomes) .
24. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro selon les revendications 21 et 23 comprenant :
- une quantité déterminée d'un anticorps selon la revendication 18 susceptible de donner lieu à une réaction immunologique avec un polypeptide à détecter selon l'une quelconque des revendications 9 à 15 ;
- avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre le po¬ lypeptide et l' anticorps sus-mentionnés ;
- avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés entre le polypeptide et l' anticorps lors de la susdite réaction immunologique.
25. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro selon les revendications 22 et 23 comprenant :
- le cas échéant, au moins un couple d'amorces selon la revendication 20, une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon la revendication 19, susceptible de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ; avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre l' acide nucléique et la sonde sus-mentionnée ; avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre l'acide nucléique et la sonde lors de la susdite réaction d'hybridation.
26. Compositions pour le traitement de maladies inflammatoires ou infectieuses, notamment de la pancréatite aigue, et des maladies où les kinines jouent une rôle pathogène, caractérisées par l'association d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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