Procédé d' amplification du signal d'émission d'un composé luminescent.
L'invention a pour objet un procédé d'amplification du signal d'émission d'un composé luminescent.
Elle a éqalement pour objet un procédé de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu le contenant, mettant en oeuvre ce procédé d'amplification du signal d'émission d'un composé luminescent.
L'utilisation de dosages immunologiques pour l'analyse qualitative et quantitative de composés dans des fluides biologiques est à l'heure actuelle largement répandue.
Parmi les techniques existantes, les dosages par fluorimétrie ont pris une importance croissante.
En effet, ils présentent un certain nombre d'avantages parmi lesquels la sensibilité, la rapidité de la mesure, la stabilité et l'inocuité des réactifs marqués par des comoosés fluorescents et le coût relativement réduit.
Il est connu que les méthodes de détection utilisant la fluorescence sont intrinsèquement très sensibles et oourraient permettre des limites de détection inférieures à celles atteintes par des dosages immunologiques utilisant des réactifs radiomarqués, en particulier par l'utilisation de sources lumineuses modulables laser (I. Wieder, Immunofluorescence and related staininq techniques, 1978, Elsevier).
Cependant la sensibilité de la technique déDend de nombreux paramètres.
Il ressort de l'art antérieur que la molécule fluorescente choisie comme traceur doit posséder les propriétés suivantes :
- elle αoit posséder une fonction chimique permettant un couplage avec la molécule bioloqiαue sans la dénaturer ni modifier ses propriétés immunologiques ;
- le coefficient d'absorption molaire de la molécule fluorescente doit être le plus élevé possible ;
le rendement quantique de fluorescence doit être le plus élevé possible ;
- le déplacement de Stokes doit être le plus important possible ;
- la longueur d'onde d'émission doit être si possible supérieure à 500 nm ;
- elle doit être soluble dans l'eau ou les solutions tampon.
Ces conditions sont précisées par exemple dans l'article de E. S0INI et al, Clin. Chem. 25, 353 (1979) ou dans I. HEMMILLA, Clin. Chem. 31/3, 359 (1985).
Dans le domaine des dosages immunofluorescents et en particulier des dosages immunologiques homogènes, l'une des conditions nécessairesà l'obtention d'un dosage à haute sensibilité est l'utilisation d'un marqueur fluorescent possédant un rendement quantique élevé, stable à faible dilution dans le milieu de mesure.
Par "dosage immunologique homogène", on entend un dosaqe dans lequel le signal de la molécule traceur est modifié lors de la liaison entre le ligand et le récepteur ou entre 2 ligands et le récepteur (l'un ou l'autre étant la molécule que l'on cherche à doser), ce qui évite de devoir séparer les molécules marquées restant libres dans le milieu de mesure de celles qui sont liées, avant d'effectuer la mesure.
Dans le cas des dosages immunologiques homogènes par fluorescence utilisant le transfert d'énergie, la condition du rendement quantique élevé du donneur est d'autant plus importante qu'il détermine également l'efficacité de transfert et par conséquent la quantité de lumière émise par l'accepteur, que l'on mesure (Ullman et al. Clinical Lab. Techniques for the 1980 's, 1980, 13-43, A.R. Liss Ed.).
Ces critères de sélection du traceur luminescent s'appliquent de la même manière pour des dosages utilisant des molécules phosphorescentes.
La sensibilité de la mesure est également fcrtement affectée par le "bruit de fond" constitué par l'émission des autres molécules présentes dans l'échantillon à tester, susceptibles d'être excitées en même temps que le traceur luminescent et
d'émettre à la longueur d'onde de mesure.
Ce problème se pose de manière particulièrement aigϋe dans le cas de dosages en milieu sérique dans lequel de nombreuses molécules (protéines, etc..) sont susceptibles d'interférer dans la mesure.
Dans le cas des dosages immunofluorescents, les méthodes de mesure de fluorescence en temps résolu permettent de remédier partiellement à cet inconvénient. Le principe de ces méthodes est d' effectuer la mesure de la fluorescence émise par une molécule traceur ayant une durée de vie d'émission relativement longue, la mesure étant retardée dans le temps au-delà de la durée de vie d'émission des autres molécules présentes.
Il est dans ce cas nécessaire d'utiliser des molécules fluorescentes traceurs à durée de vie relativement longue telles que les chélates de terre rare.
Cette technique peut en particulier être utilisée dans le cas de dosages immunologiques homogènes par fluorescence utilisant un transfert d'énergie.
Le brevet US 4 822 733 décrit un procédé homogène de détection d'un analyte dans un échantillon, mettant en oeuvre un récepteur et un analyte marqués par des molécules fluorescentes ayant des durées de vie différentes. La mesure de la fluorescence résultant du transfert d'énergie est effectuée à un temps supérieur à la durée de vie d'émission de la molécule ayant la plus courte durée de vie.
Néanmoins, la mesure de fluorescence en temps résolu ne permet pas à elle seule de résoudre un des problèmes importants posés par les dosages immunofluorescents homogènes utilisant le transfert d'énergie qui est l'existence d'un signal résiduel du traceur portant la molécule fluorescente donneur lors de la mesure à la longueur d'onde de fluorescence de l'accepteur (Morrison, Anal Biochem 174 , 119, 1988). Ce phénomène est encore plus important lorsque l'on opère avec des forts excès de traceur comme dans le cas des techniques sandwich ou lorsque l'on opère par comoétitipn et que l'antigène marqué n'est pas pur.
Ce problème important qui limite la sensibilité a été évoqué par Ullman et al. (Clinical Lab. Techniques for the 1980' , 1980, 13-43, A.R. Liss Ed.) qui prppose l'utilisation d'un anticorps anti-traceur pour inhiber le traceur libre en solution.
Ce phénomène est encore aggravé lorsque la durée de vie du donneur est longue comparée è celle mesurée sur l'accepteur.
De manière inattendue, on a maintenant trouvé qu'en mettant en oeuvre, en tant que composé luminescent donneur des molécules ayant un rendement quantique global faible, et donc étant selon l'art antérieur inadéquates pour une utilisation dans un dosage, notamment un dosage immunologique par luminescence , il était possible en particulier de résoudre le problème du signal résiduel du traceur fluorescent sans nuire à l'efficacité du transfert, et par conséquent d'augmenter la sensibilité du dosage.
En effet, on a observé qu'en utilisant des composés accepteurs à des concentrations comparables à celles indiquées dans la littérature pour une utilisation avec un composé donneur à rendement quantique élevé, il était possible d'obtenir, avec un composé donneur ayant un rendement quantique global faible, une efficacité de transfert élevée et on a constaté que l'intensité du signal mesuré sur l'accepteur était supérieure à celle du signal mesuré sur le composé donneur seul. Cette constatation permet d'effectuer une mesure précise et sensible avec un composé donneur ayant un rendement quantique global faible, ceci étant surprenant compte tenu de l'analyse de l'art antérieur.
Il s'agit donc d'une méthode d'amplification du signal d'émission d'un composé luminescent donneur. De manière avantageuse, cette amplification sera d'autant plus significative que le rendement quantique global du composé luminescent donneur sera faible.
Une des hypothèses permettant d'expliquer le mécanisme de ce phénomène est de relier l'efficacité de transfert importante observée en utilisant un composé luminescent donneur ayant un rendement quantique global faible, au seul rendement de désactivation radiative du niveau émissif du donneur et non à
son rendement quantique global comme enseigné dans l'art antérieur.
Dans le cas des cryptâtes et des chélates de terre rare utilisés comme traceurs fluorescents, on peut représenter les mécanismes photophysiques entre l'absorption et l'émission de la lumière à l'intérieur des terres rares de la manière suivante , comme indiqué par exemple dans N. Sabbatini et al., dans Supramolecular Biochemistry, 1987, p. 187-206, Reidel Dordrecht, Ed V Balzani
L'énerqie d'excitation sert à peupler le niveau S1 qui par transition inter-système peuple le triplet. Le triplet transfère son énergie sur le niveau émissif de la terre rare qui se désactive radiativement ou non. Le rendement global de fluorescence est le produit des rendements de ces différentes étapes :
La dernière étape est la désactivation du niveau émissif de la terre rare. Elle recouvre des désactivations de différentes natures qui s'effectuent à différentes vitesses.
Le rendement de désactivation radiative du niveau émissif de la terre rare s'exprime par la formule
dans laquelle
kR est la vitesse de désactivation radiative et kNR est la somme des vitesses de désactivation non radiatives. La somme de ces 2 vitesses de désactivation s'exprime par kD.
Dans le cas d'un transfert d'énergie entre un donneur et un accepteur, l'efficacité de transfert s'exprime par :
De manière générale, il est considéré dans l'art antérieur que la vitesse de transfert kτ dépend du rendement quantique global ɸ T. Ceci est, par exemple, indiqué dans D. Thomas et al. PNAS, 1978, 75, 5746 - 5750, par la relation dans laquelle
- r est la distance entre le donneur et l'accepteur,
- Ro est la distance donneur-accepteur à laquelle l'efficacité de transfert est de 50 %,
et Ro est fonction de Qo, qui représente le rendement quantique global.
Dans le cas des molécules traceurs phosphorescentes, les mécanismes de désactivation sont analogues mais la désactivation radiative a lieu à partir du niveau triplet.
Les composés luminescents accepteurs que l'on peut utiliser pour obtenir l'amplification des signaux d'émission des composés luminescents donneurs sont choisis en fonction de ces derniers et plus précisément en fonction de leur rendement de désactivation radiative de leur niveau émissif.
En effet, on a trouvé que l'amplification du signal d'émission du composé donneur a lieu lorsque la relation
dans laquelle :
- E est l'efficacité de transfert,
- ɸA est le rendement quantique du ccmposé accepteur,
- ɸ3 est le rendement de désactivation radiative du niveau émissif,
est remplie.
On peut exprimer ces variables par les formules suivantes:
dans lesquelles :
- E, kT, kR et kD pnt les significations données plus haut,
- J représente l'intégrale de reccuvrement des spectres,
R représente la distance dcnneur-acceoteur dans l'essai considéré, et k = n-4 × 5,87 × 1023 , n étant l'indice de réfraction du milieu, lorsque R est exprimé en Å et J en cm3 M-1.
E peut donc être exprimé par la relation
la relation E ɸA>ɸ3 peut être exprimée par
régit donc le choix du composé accepteur en fonction du composé donneur car les valeurs ɸA, ɸ3 et J sont caractéristiques du couple accepteur/donneur.
L'intégrale de recouvrement des spectres J est calculée comme indiqué dans Conrad et al, Biochemistry, 1968, 7, 777-787.
Le rendement de désactivation radiative du niveau émissif OL est calculé de manière connue dans la littérature, comme décrit par exemple dansN.Sabbatini et al, dans Supramolecular Biochemistry, 1987, p.187-206, Reidel Dordrecht, Ed. V. Balzani.
L'invention a donc pour objet un procédé d'amplification du signal d'émission d'un composé luminescent utilisé comme composé donneur dans un dosage par luminescence, dans lequel on met en oeuvre également un composé luminescent accepteur, caractérisé en ce que le ccmposé luminescent donneur possède un rendement quantique global faible et en ce que le rendement quantique de désactivation radiative du niveau émissif du donneur est inférieur au rendement quantique de l'accepteur.
En tant que composé luminescent donneur mis en oeuvre dans un dosage par luminescence, on utilisera avantageusement des composés à longue durée de vie tels que des chélates ou des cryptâtes de terre rare fluorescents ou encore des molécules phosphorescentes.
Dans un aspect préféré, l'invention a pour objet un procédé d'amplification du signal d'émission d'un cryptate ou d'un
chelate de terre rare utilisé comme composé luminescent donneur dans un dosage par luminescence, dans lequel on met en oeuvre également un composé luminescent accepteur, caractérisé en ce que le cryptate ou le chelate de terre rare possède un rendement quantique global faible et eh ce que le rendement quantique de désactivation radiative du niveau émissif de la terre rare est inférieur au rendement quantique de l'accepteur.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé homogène de détection et/ ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir, par mise en évidence du produit de la réaction entre l'analyte et au moins un récepteur correspondant, consistant :
1) à ajouter audit milieu un premier réactif constitué d'au moins un récepteur dudit analyte,
2) à ajouter un second réactif choisi parmi l'analyte ou au moins l'un de ses récepteurs, l'un des deux réactifs étant couplé avec un composé luminescent donneur constitué par un cryptate ou un chelate de terre rare et l'autre réactif étant couplé avec un composé luminescent accepteur, l'ordre d'ajout des réactifs pouvant être inversé, et, après excitation du mélange par une source de lumière à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
3) à mesurer le signal d'émission du composé luminescent accepteur,
dans lequel le cryptate ou le chelate de terre rare utilisé comme composé donneur possède un rendement quantique global faible et un rendement de désactivation du niveau émissif de la terre rare inférieur au rendement quantique de l'accepteur.
Dans la présente description on définit par : - "analyte" toute substance ou groupe de substances analogues à détecter et/ou déterminer ;
- "récepteur" toute substance capable de se fixer spécifiquement sur un site dudit analyte ;
- "composé luminescent" toute substance qui, excitée à une longueur d'onde donnée, est capable d'émettre de la lumière.
Dans un aspect préféré, le procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir selon l'invention est une méthode par excès consistant;
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par au moins un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent donneur constitué par un cryptate ou un chelate de terre rare,
2) à ajouter un second réactif constitué par un ou plusieurs autres récepteurs dudit analyte, ledit second réactif étant couplé avec un composé luminescent accepteur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur
5) à mesurer le signal émis par le composé luminescent accepteur.
Dans un aspect préféré, on utilisera dans la méthode par excès ci-dessus un seul récepteur de l'analyte qui est couplé soit avec le composé luminescent donneur, soit avec le composé luminescent accepteur.
Dans un autre aspect, ce procédé est une méthode par compétition consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent donneur constitué par un cryptate ou un chelate de terre rare,
2) à ajouter un second réactif constitué de l'analyte couplé avec un composé luminescent accepteur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
5) à mesurer le signal émis par le composé luminescent accepteur .
Le procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte selon l'invention peut également s'appliquer à une méthode par compétition consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par un récepteur dudit analyte, ledit récepteur étant couplé avec un composé luminescent accepteur,
2) à ajouter, un second réactif constitué de l'analyte couplé avec un composé luminescent donneur constitué par un cryptate ou un chelate de terre rare,
3) à faire incuber ledit milieu soit après l'addition de chaque réactif, soit après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
5) à mesurer le signal émis par le composé luminescent accepteur .
Dans un aspect avantageux, le premier réactif et le second réactif utilisés dans les procédés de détection et/ou de détermination d'un analyte indiqués ci-dessus sont ajoutés simultanément au milieu contenant l'analyte recherché.
En tant que composé luminescent donneur, on utilisera avantageusement des chélates ou des cryptâtes de terbium, europium, dysprosium, samarium ou neodymium. On utilisera de préférence un chelate ou un cryptate de terbium ou d' europium.
Dans un aspect avantageux, les cryptâtes de terre rare pouvant être mis en oeuvre dans les procédés selon l'invention sont décrits dans la demande EP 180 492. Ces composés sont constitués d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule générale
dans laquelle Z est un atome ayant trois ou quatre valences, tel que l'azote, le carbone ou le phosohpre, R est rien ou représente l'hydrogène, le grpupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarooné, les radicaux bivalents Ⓐ , Ⓑ et Ⓒ sont indéoenoamment l ' un de l ' autre αes chaînes hydrocarbonées qui
contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux Ⓐ , Ⓑ ou Ⓒ comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé.
Des motifs moléculaires particulièrement préférés aux fins de l'invention sont la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, les bipyridines, les biquinoléines, notamment les bi-isoquinoléines, par exemple la 2,2'-bipyridine, l'azobenzène, l'azopyridine, la pyridine ou la 2,2'-bi-isoquinoléine.
A titre d'exemples de radicaux Ⓐ , Ⓑ et Ⓒ comportant un motif donneur d'énergie, on peut citer notamment les chaînes ci-après :
X1 et X2 pouvant être identiques ou différents désignent l'oxygène, l'azote ou le soufre :
X étant l'oxygène ou l'hydrogène.
Des composés décrits dans la demande EP 0 180 492 utilisés de préférence dans le procédé de l'invention sont le cryptate de terbium Tb trisbipyridine et le cryptate d' europium Eu trisbipyridine.
D'autres cryptâtes de terre rare utilisables dans le procédé de l 'invention sont décrits dans la demande EP 321 353. Ils sont constitués d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique répondant à l'une des formules I ou II ci-après :
cans lesouels le cycle de formule - est L'un des cycles suivants
- Y est un groupe ou un bras d'espacement qui est constitué par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1 a C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et/ou étant éventuellement interromous par un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre ou le phosphore, parmi les groupes cycloalkylène en C5-C8 ou parmi les groupes arylène en C6 à C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle, aryle ou sulfonate.
Z est un groupe fonctionnel susceptible de se lier de façon covalente avec une substance biologique ;
- R est un groupe methyle ou représente le groupe -Y-Z ;
- R' est l'hydrogène ou un groupe -COOR" dans lequel R" est un groupe alkyle en C1 à C10et représente de préférence le groupe methyle, éthyle ou tertiobutyle ou bien R' est un groupe -CO-NH-Y-Z.
A titre d'exemples de groupes fonctionnels appropriés, on peut citer notamment les groupes amino, thio, cyano, isocyano, isothiocyano, thiocyano, carboxyle, hydroxyle, maléimido, succinimido, mercapto, phénol, imidazole, aldéhyde, époxyde, halogénure, thionyle, sulfonyle, nitrobenzoyle, carbonyle, triazo, anhydride, halogénoacétate, hydrazino, acridine etc.
Les groupes particulièrement préférés sont les groupes amino, thio et carboxy qui doivent être activés avant le couplage covalent avec la substance biologique ainsi que les groupes maléimido, succinimido et isothiocyanate, lesquels peuvent se lier directement avec la substance biologique.
Des ccmposés décrits dans la demande EP 321 353 avantageusement utilisés dans les procédés de l'invention sont le cryptate d' europium Eu trisbipyridine diamine et le cryptate de terbium Tb trisbipyridine diamine.
Les cryptâtes de terre rare décrits ci-dessus présentent de plus l'avantage d'avoir une longue durée de vie de l'ordre de plusieurs dizaines de μs , ce qui permet d'une part d'utiliser la technique de la mesure en temps résolu et ainsi de neutraliser les émissions parasites et, d'autre part, d'utiliser pour la mesure un matériel classique.
On peut également utiliser comme comppsés luminescents donneurs des composés phosphorescents tels que l'éosine ou l'érythrosine.
Les composés luminescents accepteurs utilisés dans les procédés de l'invention sont choisis en fonction des composés donneurs comme indiqué plus haut.
Lorsque le composé luminescent donneur est un cryptate d' europium fluorescent, on utilisera avantageusement un composé fluorescent accepteur choisi parmi l'allophycocyanine, l'allophycocyanine B, la C phycocyanine ou la R phycocyanine.
Dans le cas de l'utilisation d'un cryptate de terbium comme comoosé donneur, on utilisera avantageusement un comoosé fluorescent accepteur choisi parmi les rhodamines, la thionine, la R ohycocyanine, la phvcoerythrocyanine, la C phycoerythrine, la B
phycoerythrine ou la R phycoerythrine.
On peut également utiliser comme composé luminescent donneur un composé phosphorescent tel que l'éosine ou l'erythrosine. Dans ce cas on utilisera avantageusement un composé fluorescent accepteur choisi parmi les chlorophylles telles que celles citées dans les demandes EP 71991 et EP 314406, ou les porphyrines telles que citées dans la demande EP 71 991 ou encore les phtalocyanines telles que celles de la demande PCT/WO 88 04777.
Dans le cas d'un dosage en milieu liquide utilisant des composés donneurs phosphorescents, la lecture sera effectuée soit sur un support solide, soit en ajoutant au milieu de mesure des molécules capteurs d'oxygène, ces techniques étant connues de l'homme du métier.
Les chlorophylles et les phtalocyanines peuvent également être utilisées comme composés accepteurs fluorescents en utilisant comme composé donneur un cryptate ou un chelate d'europium.
Comme source de lumière permettant l'excitation du composé luminescent donneur, on utilisera avantageusement une source de lumière modulable telle que celles décrites dans
Lakowicz, Principles of fluorescent spectroscopy, Plénum Press,
New-York, 1983, p. 96-100.
Le procédé d'amplification de l'invention trouve en particulier une application importante dans les dosages immunologiques par fluorescence, aussi bien dans les méthodes de dosage dites par compétition que par excès, en phase homogène ou hétérogène, décrits dans l'art antérieur (Landon, Ann. Clin.
Biochem, 1981, 18, 253 et E. SOINI et al, Clin. Chem. 1979, 25,
353).
En particulier, le procédé d'amplification de l'invention peut être avantageusement utilisé dans les dosages immunologiques en milieu sérique nécessitant une haute sensibilité, celle-ci étant habituellement affectée par un important bruit de fond.
En effet, le procédé d'amplification de l'invention permet d'utiliser des traceurs ayant un rendement quantique global faible et dont le signal résiduel est donc également plus faible.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif.
EXEMPLE 1 :
Deux séries d'essais d'amplification dynamique ont été réalisées en utilisant en tant que composé donneur un cryptate d' Europium Eu trisbipyridine (Eu TBP) préparé comme décrit dans la demande EP 180492 (exemple 5) et comme composé accepteur l'allophycocyanine(Interchim, France) et d'autre part en utilisant comme composé donneur un cryptate de terbium Tb trisbipyridine (Tb TBP) préparé de manière analogue à Eu trisbipyridine et comme composé accepteur la rhodamine B (Fluka, Suisse) ou la B phycoerythrine (Sigma, USA).
Le composé donneur est utilisé à une concentration de 10-8 M/1 dans différents tampons :
- tampon phosphate 0,1 M pH 7,4
- tampon Tris 0,1 M pH 8
- tampon Tris HC1 0,1 M pH 7,1
ces tampons contenant également de la sérum albumine humaine à 1 g/1, en présence de différentes concentrations de composé accepteur. La fluorescence peut être mesurée en temps résolu au moyen d'un fluorimètre ARCUS (LKB, Suède) en utilisant un filtre interférentiel adapté à l'émission du composé accepteur.
Pour effectuer la mesure de la fluorescence en tempS résolu dans le présent essai, on a utilisé un fluorimètre à laser prototype, qui est décrit ci-après :
Un laser puisé à azote (LASER SCIENCE INC., modèle
LS1-337ND) est utilisé comme source d'excitation (longueur d'onde à 337,1 nm). La durée des pulsations est spécifiée à 3 nanosecondes et est répétée sous une fréquence de 10 Hertz. Le faisceau passe à travers un filtre (CORNING) afin d'éliminer tcute lumière parasite à l'excitation autre que 337 nm.
Après être rentré dans la chambre de mesure, le faisceau est réfléchi par un filtre dichroique, placé à 45 degrés, qui a la propriété de réfléchir les ultraviolets et de pouvoir transmettre la lumière visible.
Le faisceau réfléchi par le filtre dichroîque est focalisé sur le puits à mesurer d'une microplaque par une lentille en silice fondue. L'émission de fluorescence est collectée selon un angle solide de 20 degrés, collimatée par la même lentille, et passe directement à travers le filtre dichroique (fluorescence en lumière visible).
Un filtre interférentiel, de caractéristiques définies selon la longueur d'onde de fluorescence à détecter, permet de se débarrasser des lumières pouvant parasiter le signal, dont l'intensité est ensuite mesurée par un photomultiplicateur (HAMAMATSU R2949).
Le compteur de photons utilisé est un SR-400 (STANFORD RESEARCH SYSTEMS), dont les opérations et la synchronisation avec le laser sont contrôlées par un ordinateur de type IBM PC-AT via une sortie RS 232 . Les pulsations provenant du photomultiplicateur sont enregistrées pendant une fenêtre de temps (tg) et après un délai (td) déterminés à condition qu'elles soient supérieures à un niveau discriminant sélectionné par le compteur de photons afin d'optimiser le rapport signal/bruit du photomultiplicateur.
Une table X-Y, pilotée par l'IBM PC-AT, permet les différents positionnements de la microplaque de mesure par des moteurs pas à pas, incluant les manoeuvres de chargement, de positionnement sous le faisceau excitant, de lecture automatique en séquentiel des 96 puits, et de sortie. A 200 μl d'une solution de Eu TBP ou Tb TBP à 2 10-8 M dans le tampon de travail on ajoute soit 200 μl de tampon de travail soit 200 μl des solutions suivantes : Alloohycocyanine à 1,24 10-5 M dans du tampon de travail
Rhodamine B à 2 10-5 M, 1,6 10-5 M, 1,2 10-5 M dans du tampon Tris. HCl 0,1 M pH 7,1
B phycoerythrine à 1,54 10-6 M et 9,6 10-7 M dans du tampon Tris
HCl 0,1 M pH 7,1.
Afin de déterminer l ' amplification , la fluorescence a été mesurée dans un premier temps pour le composé donneur seul par mesure de la surface du pic émis à 620 nm, avec un filtre interférentiel de 80 % de transmission et de 20 nm de largeur à mi-hauteur pour Eu TBP et à 545 nm avec un filtre de 80 % de transmission et de 20 nm de largeur à mi-hauteur pour Tb TBP.
Dans un second temps, la fluorescence du mélange est déterminée après excitation à 307 nm et mesurée de la même manière mais à 670 nm pour le composé donneur en présence du composé accepteur (allophycocyanine) et à 580 nm (rhodamine, B phycoerythrine).
La lecture est effectuée à des délais de 0,1 et 0,05 ms. On mesure également la durée de vie des signaux émis.
Les résultats montrent que dans tous les cas on obtient une amplification du signal émis par le composé accepteur par rapport à celui du composé donneur seul. Cette amplification varie de 1,8 à 5,9.
EXEMPLE 2 :
Un essai d'amplification dynamique a été réalisé de la même manière que décrit dans l'exemple 1 en utilisant le cryptate d'europium Eu trisbipyridine (préparé selon l'exemple 5 de la demande EP 180 492) en tant que composé donneur à une concentration de 10-8 M/1 et l'allophycocyanine (Cyanotech, USA) en tant que composé accepteur à une concentration de 6,2.10-6 M, dans de l'eau ou du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4.
Dans un premier temps, on a déterminé le rendement de désactivation de la terre rare ( ɸ 3 Eu) dans les 2 tampons utilisés selon la formule
dans laquelle
- ζ est la durée de vie du cryptate d1 europium Eu trisbipyridine mesurée dans les conditions de l'essai,
- ζ77 est la durée de vie de ce cryptate dans l'eau lourde à 77° K (azote liquide).
Par ailleurs, on détermine le rendement quantique global (ɸ total) selon une méthode classique comme décrit par exemple dans Lakowicz, Principles of fluorescent spectroscopy, Plénum Press, New-York, 1983.
On a effectué ensuite la mesure de la fluorescence en temps résolu à l'aide du fluorimètre à laser-prototype décrit dans l'exemple 1 en mettant en présence le cryptate Eu trisbipyridine et l'allophycocyanine comme indiqué dans l'Exemple 1. L'efficacité de transfert a été calculée selon la référence D. Thomas et l P N A S 1978, 75, 5746-5750 par la formule
dans laquelle Z est la durée de vie du donneur en
présence de l'accepteur et % est la durée de vie du donneur seul.
Les résultats sont rapportés dans le tableau I ci-après:
Ces résultats montrent qu'en utilisant un composé donneur ayant un rendement quantique total faible, il est néanmoins possible d'obtenir une efficacité de transfert élevée, ce qui entraîne une amplification du signal du composé donneur.
EXEMPLE 3 :
Un essai d'amplification dynamique a été réalisé dans les conditions de l'exemple 1 en utilisant comme composé donneur le cryptate de terbium Tb trisbipyridine préparé comme décrit dans la demande EP 180 492 et comme composés accepteurs la B phycoerythrine (Sigma, USA ) ou la rhodamine B ( Fluka, Suisse ) afin de déterminer la concentration en accepteur permettant d'obtenir une efficacité de transfert de 50 %.
Le chelate de terbium Tb (DPA)3 décrit dans D. Thomas et al., P.N.A.S., 1978, 75, 5746-5750, qui possède un rendement quantique de 100 %, a été utilisé comme référence.
Les résultats montrent que les concentrations en accepteurs (B phyccerythrine ou rhodamine B) permettant d'obtenir une efficacité de transfert de 50 %, en utilisant comme donneur le cryptate de terbium Tb trisbipyridine dont le rendement quantique est voisin de 2 % sont du même ordre ( 6.10 M) que celles mesurées en utilisant le chelate de terbium Tb (DPA)3 dont le
rendement quantique est voisin de 100 %.
Ceci entraîne une amplification du signal du donneur
Tb trisbipyridine.
EXEMPLE 4 : Dosage de la prolactine:
Un immuno essai homogène montrant l'application du principe de l'amplification au dosage de la prolactine a été réalisé en utilisant comme composé donneur le cryptate d'europium
Eu trisbipyridine diamine préparé comme décrit dans la demande EP
321 353 (exemples 3 et 4) et comme composé accepteur l'allophycocyanine (Cyanotech, USA) couplés respectivement aux anticorps monoclonaux anti-prolactine E1 et 3D3 (CIS bio international,France) reconnaissant 2 épitopes distincts de la prolactine.
Les abréviations utilisées ci-après sont les suivantes : APC = allophycocyanine
DTT = dithiothreitol
EuTBP = cryptate d' europium Eu trisbipyridine diamine
HSA = sérum albumine humaine
IgG = immunoglobuline G
SPDP = N-succinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionate
Sulfo-SMCC = sulfosuccinimidyl 4(N-maléimidométhyl)cyclohexane
1-carboxylate.
1) PREPARATION -DES -IgG -3D3-APC
a) Activation de l 'APC -par-Ie-soIfo-SMCC
L'APC (3 mg) commercialement fournie sous forme précipitée dans une solution à 60 % de sulfate d'ammonium, est centrifugée. Après élimination du surnageant, le culot est repris par 250 μl de tampon phosphate 100 mM, pH 7,0, puis filtré à 0,8 lA/ m afin d'éliminer les éventuelles particules en suspension.
Le filtrat est purifié par chromatographie d'exclusion sur colonne G25 suoerfine (Pharmacia, Suède) dans le même tampon.
La concentration d'APC éluée dans le volume d'exclusion est déterminée à 650 nm, en considérant un ε650nm de 731000M-1 Cm-1.
L'activation de l'APC est réalisée en ajoutant une solution de sulfo-SMCC préparée extemporanement à raison de 6,9 mM
dans un tampon phosphate 100 mM pH 7,0 et en laissant la réaction se produire pendant une heure, à température ambiante, sous agitation douce (rapport molaire de 15 à 75 sulfo-SMCC par APC). L'APC-maléimide est alors purifiée sur colonne G25 superfine en tampon phosphate 100 mM, EDTA 5 mM, pH 6,5 et conservée à 4°C avant couplage sur IgG 3D3.
b) Activation-des-IgG-3D3-par-Ie-SPDP
Simultanément, 5 mg d'IgG 3D3 à raison de 10 mg/ml dans un tampon phosphate 100 mM, pH 7,0 sont activés par l'ajout d'une solution de SPDP (Pierce, USA) à raison de 6,4 mM dans du dioxane dans un rapport molaire de 7,5 SPDP par IgG 3D3.
Après 35 min d 'activation à température ambiante, l'IgG pyridine-2 thione est purifiée sur colonne G25 superfine dans un tampon phosphate 100 mM, EDTA 5mM, pH 6,5.
Les protéines sont concentrées et les groupes 2-pyridyl disulfides sont réduits par une solution de DTT (Sigma, USA) ayant une concentration finale de 19 mM pendant 15 min à température ambiante. Le DTT et la pyridine-2-thipne sont éliminés par purification sur colonne G25 superfine en tampon phosphate 100 mM, EDTA 5mM, pH 6,5. La concentration en IgG-SH est déterminée à 280 nm avec unε280nm de 210000 M-1cm-1.
c) Conjugaison des-IgG-3D3 -SH-avec-APC-maIéimide
La fixation des groupements thiols sur les maléimides est réalisée en ajoutant 2,51 mg d'APC activées par mg d'IgG 3D3-SH. Après 18 heures d'incubation à 4°C et à l'obscurité sous agitation douce, les fonctions thiols restées libres sont bloquées par l'addition d'une solution à 100 mM de N-méthyl maléimide (Sigma, USA) ayant une concentration finale de 20 mM pendant une heure à température ambiante.
Le milieu réacticnnel est purifiée par gel filtration sur colonne TSK G3000SW semi-préparative (Beckmann, USA ) en tampon phosphate 100 mM pH 7,0.
Les concentrations en APC et en IgG 3D3 du conjugué purifié, élue dans le premier pic, sont déterminées par les absorptions à 280 nm et à 650 nm, selon le calcul suivant :
avec A'280nm étant la contribution à cette longueur d'onde de l'APC-rnaléimide, déterminée plus haut (paragraphe 1 - a)).
De l'albumine sérique humaine (HSA) est rajoutée à concurrence de 1 g/1 au conjugué qui est ensuite réparti en aliquotes puis congelé à -20°C.
2) PREPARATION-BES-CONJUGUES-IgG-El--Eu-TBP
La préparation de IgG El-SH est réalisée selon le protocole décrit plus haut pour les IgG 3D3 mais en faisant varier le rapport molaire de 4 à 16 SPDP par IgG El.
A 5 mg (5 10-6moles) de Eu TBP est ajoutée une solution à 25 mM de sulfo-SMCC, en tampon phosphate 20 mM, diméthylformamide 10 % (v/v)pH 7,0 dans une proportion de 2,5 moles d'activateur par mole de EuTBP.
Après 45 min d'activation à température ambiante, le milieu réactionnel est filtré à 0,8 Am afin d'éliminer le précipité éventuellement formé. Les produits réactionnels indésirables (sulfo-SMCC, N-hydroxysuccinimide, acide (N-maléimidométhyl) carboxylique) sont éliminés par chromatographie échangeuse d'ions sur colonne Mono Q (Pharmacia, Suède) en tampon phosphate 20 mM diméthylformamide 10 % (v/v), pH 7,0 sous choc de NaCl. La concentration en Eu TBP maléimide est déterminée à 307 nm avec un ε307nm de 25000 M-1cm-1 ainsi que le rapp0rt A 307nm/A 280nm
De façon similaire à celle décrite plus haut on fait réagir les fonctions maléimides avec les fonctions thiols fixés sur l'anticorps, dans des proportions molaires variant de 10 à 30 Eu
TBP maléimide par IgG El-SH.
Après 18 heures d'incubation à 4°C et blocage des groupements thiols (éventuellement restés libres) par N-méthylmaléimide, le Eu TBP non couplé est éliminé par dialyse en tamDon phosphate 100 mM pH 7,0 à 4°C jusqu'à épuisement (plus αe fluorescence dans les bains de dialyse) .
Les caractéristiques du conjugué sont déterminées par ses aosorptions à 307 nm et à 280 nm en utilisant les valeurs
suivantes en tenant compte de l'absorption propre du cryptate déterminée par le rapport A307nm/A280nm.
Eu-TBP-maIéimide :
ε307nm = 25000 M-1cm-1
A307nm/A280nm déterminée expérimentalement.
IgG-El-SH- ε280nm = 210000
ε307nm = 0 M-1cm-1
3) APPLICATION-AU DOSAGE -DE -LA-PROLACTINE
On ajoute successivement dans des microplaques en polystyrène de 96 puits (Dynatech, USA) de 350μl :
- 100 μl de solution standard de prolactine de concentration connue
- 100,01 de conjugué IgG El-Eu TBP (donneur) à 0,50g/ml
- 100 μl. de conjugué IgG 3D3-APC (accepteur) à 3 μg/ml Les deux conjugués sont dilués dans du tampon phosphate 50 mM, HSA 1 g/l, pH 7,4.
Après incubation pendant une heure à température ambiante, on effectue la lecture à l'aide du fluorimètre à laser (prototype) décrit dans l'exemple 1 équipé d'un filtre à 650 nm de 20 nm de largeur, avec un délai de 50 μs et pendant 100 μs .
Les résultats obtenus, exprimés en coups par seconde (cps), sont rapportés dans le tableau II ci-après :
Ces résultats montrent que le signal mesuré résultant du transfert donneur-accepteur varie proportionnellement à la concentration en prolactine dans le milieu.
Les comppsés donneurs à faible rendement quantique selon
l'invention sont donc particulièrement adaptés à ce type de dosage immunologique.
EXEMPLE-5-: -Dosage-de -la-prolactine:
Un autre essai a été réalisé de manière analogue a celle décrite ci-dessus dans l'exemple 4, paragraphe 3), en utilisant un composé accepteur différent : la C phycocyanine (Cyanotech.USA) .
On ajoute successivement dans des microplaques en polystyrène de 96 puits (Dynatech, USA ) de 350μl :
- 100 μl de solution standard de prolactine de concentration connue
- 100 μl de conjugué IgG El-Eu TBP (donneur) à 0,1 ou 0,5 μg/ml
- 100 μl de conjugué IgG 3D3-Phycocyanine à 3 μg/ml. Les deux conjugués sont dilués dans du tampon phosphate 50 mM, HSA 1 g/l, PH 7,4.
La mesure est effectuée après une heure d'incubation à température ambiante à l'aide du fluorimètre à laser décrit dans l'exemple 1 équipé d'un filtre à 647 nm de 20 nm de largeur
Les résultats sont donnés dans le tableau III ci-après et exprimés en coups par seconde (cps) :
Ces résultats montrent à nouveau la variation du signal mesuré résultant du transfert donneur-accepteur, proportionnellement à la quantité de prolactine présente dans le milieu.
EXEMPLE-6-: -Dosage-de-l'antigène-19:9.
L'antigène 19.9 est un carbohydrate représentatif du carcinome du colon.
Le site de l'anticorps anti-19.9 étant un épitope répétitif, on marque le même anticorps soit avec le donneur, soit avec l'accepteur.
On utilise pour cet immuno-essai homogène des conjugués anticorps - Eu TBP et anticorps -APC préparés de manière analogue à celle décrite dans l'exemple 4.
L'antigène 19.9 et l'anticorps anti-19.9 sont fournis par Centochor, USA.
Les deux conjugués sont dilués dans un tampon phosphate 100 mM, Na F 150 mM, HSA 1 g/l, pH 6.
On réalise une gamme standard d'antigène 19.9 par dilution d'une solution concentrée d'antigène dans du sérum de veau nouveau-né.
On ajoute successivement dans des microplaques en polystyrène de 96 puits (Dynatech, USA) :
- 50 μl de solution standard d'antigène 19.9
- 50 μl de tampon de dilution
- 100μl de conjugué anticorps-Eu TBP à 0,5μg/ml
- 100μl de conjugué anticorps-APC à 5μg/ml.
Après incubation pendant 3 h30 à température ambiante, on effectue la lecture à l'aide du fluorimètre à laser décrit dans l'exemple 1 équipé d'un filtre à 650 nm de 20 nm de largeur, avec un délai de 50μs pendant 400 μs .
Les résultats sont rapportés dans le tableau IV ci-après et exprimés en unités arbitraires (UA).
Ces résultats montrent que le signal mesuré varie proportionnellement à la quantité d'antigène 19.9 dans le milieu. EXEMPLE -7- : Dosage -de -l'antigène-carcinoembryonnaire-(ACE):
Dans cet immuno-essai homogène, on utilise deux anticorps monoclonaux G12 et G15 (CIS bio international, France) couplés respectivement avec du cryptate d' europium Eu TBP et de l'allophycocyanine.
Les deux conjugués G12-Eu TBP et G15-APC sont dilués dans un tampon phosphate 100 mM, HSA 1 g/l, NaF 150 mM.
On ajoute successivement dans des microplaques en polystyrène (Dynatech, USA) :
- 100 μl de solution standard
- 100 μl de conjugué G12-cryptate à O.S^g/ml - 100 μl de conjugué G15-APC à Sju.q/ml .
Après incubation pendant 3 h à 37°C on effectue la lecture à l'aide d'un fluorimètre à laser décrit dans l'exemple 1 équipé d'un filtre à 650 nm de 20 nm de largeur, avec un délai de 50yus, pendant 400 LS .
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau V ci-après et exprimés en unités arbitraires (UA) :
Les résultats montrent une variation du signal émis proportionnelle à la concentration en ACE. De plus, l'amplification du signal permet de détecter l'ACE avec une sensibilité de l'ordre du ng/ml.
EXEMPLE -8-:
Dosage-de-la-digoxine
La digoxine est un glucoside cardiotonique utilisé comme principe actif de médicaments traitant l'insuffisance cardiaque. A/ Préparation-d'un-traceur-allophycocyaπiπe-digoxine-par- -couplage au periodate:
a) activation-de-la-digoxine-par-le-periodate
268 μl d'une solution de NaIO4 (Fluka, Suisse) préparée extemporanement sont ajoutés à une suspension de digoxine (ref 37100 Fluka, Suisse) de 5,35 mg dans 268 μl d'éthanol absolu.
Le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante sous agitation, puis la réaction est bloquée par ajout de 100 μl de glycérol 0,1 M.
La concentration finale en digoxine activée calculée sur la masse initiale et le volume final est de 1,2 × 10-2M.
b) couplage-de-la-digoxine-activée-aveclallophycocyanine-(APC)
A 2 ml de solution APC purifiée (Cyanσtech, USA) en tampon borate pH 9,0 sont ajoutés 95μl de la solution de digoxine activée au periodate.
Le mélange est incubé pendant 1h30 à température ambiante sous agitation douce. La réaction est bloquée par ajout de 100 μl. d'une solution de borohydrure de sodium préparée extemporanement à
raison de 5 mg de NaBH. dans 1,32 ml de tampon borate pH 9,0.
c) purification-du-traceur-APC-digoxine
2 ml du mélange réactionnel sont injectés sur une colonne HR 10/10 G25 (Pharmacia, Suède) équilibrée en tampon phosphate 100 mM, pH 7, et élues dans le volume exclu. Les réactifs en excès sont élues par 8 ml de tampon.
On récupère environ 4 ml de solution de produit couplé APC-digoxine à 1,22 mg/ml en APC (mesurée par l'absorbance à 650 nm).
La concentration en digoxine est évaluée par un dosage
RIA ou DELFIA (Pharmacia, Suède).
Le rapport molaire final calculé digoxine/allophycocyanine est d'environ 0,8.
B/ Bosage-homogène-compétitif-de-la-digoxine-en-sérum-homain:
On prépare un conjugué anticorps-cryptate d' europium Eu
TBP diamine de manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-digoxine (ref. G 31604 M, Interchim, France). Ce conjugué anticorps-cryptate est utilisé à la concentration de 0,5μg/ml en tampon phosphate 100 mM, NaF 150 mM, HSA 1 g/1, pH 7.
Le traceur APC-digoxine est utilisé à une concentration de 0,2 μg/ml dans le même tampon.
On prépare une gamme de standards digoxine par dilution en sérum humain d'une solution de digoxine (Fluka, Suisse) à 1 mg/ml dans un mélange éthanol/eau 50/50.
La courbe standard estréalisée à l'aide de prises de 250μlcontenant
- 50 μl de tampon phosphate
- 50 μl de standard
-100 μl de traceur APC-digoxine
-100 μl de conjugué anticorps-cryptate.
Les échantillons à doser sont composés de la même façon en remplaçant les 50 μl de standard par 50 μl de sérum individuel à doser.
Le dpsage est réalisé dans des microolaques αe 96 puits
(Dynatech, USA).
Après 30 min d'incubation à température ambiante, on effectue la lecture sur un fluorimètre à laser tel que décrit dans l'exemple 1, équipé d'un filtre à 665 nm, de 20 nm de largeur à mi-hauteur, dans une fenêtre de temps de 100μs , après un délai de 50 μs .
Les résultats sont exprimés en pourcentage du rapport
B/B dans lequel B représente la valeur obtenue pour chaque standard et Bo celle du standard 0.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau VI ci-apres :
Ces résultats montrent que les valeurs obtenues varient proportionnellement à la concentration en digoxine.
EXEMPLE 3 :
Dosage-de-la-thyroxine.
A/ Préparation-d'un-traceur-allcohycocyanine-thyroxine-(APC-T4) a ) Activation -de -la -thyroxine-par -le -S-AMSA
A 500 μl d 'une solution à 20 mg/ml de T4 (Calbiochem ,
France) dans du méthanol sont ajoutés 500 μl d'une solution de S-AMSA (Sigma, USA) à 8,7 mg/ml (50mM) dans du méthanol et le mélange est incubé 15 mn à température ambiante, avant ajeût de 500 μl d'une solution d'hydroxylamine à 6,95 mg/ml (100 mM) dans du méthanol. Après 15 min d'incubation à température ambiante,
975μl du mélange réactionnel sont prélevés et additionnés de 525 μl d'eau bidistillée filtrée sur filtre MILLIPORE HA 0,45 μm . Cette solution est passée par fractions de 250/μlsur une colonne HPLC Pep.RPC HR 5/5 (Pharmacia, Suède) et éluée par un mélange méthanol/eau 65/35. Les trois premiers pics élues sont récupérés, et les fractions successives sont jointes et évaporées sous vide dans un évaporateur rotatif. On récupère environ 3 mg de T4 activée (T4-SH) .
b) Activatian de l'allophycocyanine par le SMCC
10 mg d'APC sont purifiés, puis concentrés sur cône
AMICON CENTRICON 30 jusqu'à une concentration de 10,6 mg/ml sous 700 μl.
A cette solution sont ajoutés 160 μl d'une solution de sulfo-SMCC (Pierce, USA) à 10 mg/ml dans un tampon phosphate 100 mM, pH 7. Le mélange réactionnel est incubé 1 h à température ambiante sous agitation, puis l'APC activée est purifiée par chromatographie d'exclusion sur colonne G 25 HR 10/10 (Pharmacia, Suède) en tampon phosphate pH 7.
c) Couplage de la thyroxine activée avec l'allophycocyanine activée
Le contenu du ballon de T4-SH est repris par 200μl de méthanol 50 MSL de cette solution sont ajoutés à 2 ml de solution d'APC activée en tampon phosphate 100 mM, pH 7. Le mélange réactionnel est incubé 18 h à 4°C sous agitation, puis les sites maléimides en excès sont bloqués par 5 μl d'une solution de mercaotoéthanol (Sigma, USA) au 1/10 dans le tampon phosphate. d) Purification du traceur APC-T,
Le mélange réactionnel est concentré jusqu'à un volume de
1 ml sur dispositif d'ultrafiltration AMICON CENTRICON 30, puis 50 μl d'une solution de N-AANS à 1 mg/ml dans le tampon phosphate sont ajoutés (concentration finale en N-AANS environ 50.μg/ml). Le traceur est finalement purifié sur cclonne de chromatographie d'exclusion PHARMACIA G 25 HR 10/10 (tampon d'élution phosphate 100 mM pH 7). On pbtient 2,5 ml environ de traceur à la concentration
(calculée par DO à 650 nm, ε = 731 000) de 0,8 mg/ml.
L'évaluation du nombre de molécules de T4 couplées par
molécule d'APC est réalisée par dosage RIA du traceur et comparaison à une courbe standard en T4 (trousse T4-KPR, ORIS Industrie, France). Le calcul donne un rapport sur le traceur purifié de 1,4 T4/APC.
La purification du traceur APC-T4 s'effectue en présence de N-AANS synthétisé à partir de N-ANS (KODAK, USA) par une modification du protocole décrit par HINDS et al. (CLIN. CHEM. 32, 16-21, 1986). B/ Bosage -homogène-compétitif-de-la-thyroxine-en-sérum-humain
On prépare un conjugué anticorps-cryptate d' europium Eu TBP diamine de manière analogue à celle décrite dans l'exemple 1, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-T4 R41 (CIS bio international, France). Ce conjugué est utilisé à la concentration de 2 μg/ml en tampon phosphate 100 mM, NaF 120 mM, HSA 0,2 %, pH 7.
On prépare une gamme de standards T4 par dilution dans un sérum humain normal traité par échange d'ions et dépourvu de T4. La courbe standard est réalisée à l'aide de prises de 250 μlcontenant
- 50 μl. de solution de N-AANS
- 50 μl de sérum humain dépourvu de T4 ou 50 μl de l'un des standards T4
- 100 μl de traceur APC-T4
- 100 μl de conjugué anticorps-cryptate.
Les échantillons à doser sont composés de la même manière, en remplaçant les 50 μl de standard par 50 μl de sérum individuel à doser.
Le dosage est réalisé dans des microplaques de 96 puits (Dynatech, USA).
Après incubation pendant 30 mn à température ambiante , on effectue la lecture sur un fluorimètre à laser tel que décrit dans l'exemple 1 équipé d'un filtre à 665 nm, de 20 nm de largeur à mi-hauteur, en utilisant une lampe Flash 1000 Hz comme source d'excitation pendant 1 s, dans une fenêtre de temps de 100 μs , après un délai de 50μs.
Les valeurs obtenues pour chaque standard (B) sont divisées par la valeur du standard 0 (Bo) et exprimées en pourcentage (B/Bo %) . La concentration des échantillons à doser estcalculée par comparaison avec la courbe standard.
Les résultats sont rapportés dans le tableau VIIci-après:
Les résultats montrent que les valeurs obtenues varient proportionnellement à la concentration en T4.