WO1993016194A1 - Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsäuren - Google Patents

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WO1993016194A1
WO1993016194A1 PCT/EP1993/000254 EP9300254W WO9316194A1 WO 1993016194 A1 WO1993016194 A1 WO 1993016194A1 EP 9300254 W EP9300254 W EP 9300254W WO 9316194 A1 WO9316194 A1 WO 9316194A1
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Karsten Henco
Manfred Eigen
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Diagen Institut Für Molekular-Biologische Diagnostik Gmbh
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • a device is to be created which allows the amplified nucleic acids detected with the method according to the invention to be recognized reliably and easily, the device also being intended to permit evaluation to be largely automated.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is based on the fact that the amplified nucleic acids contain at least one co-amplified nucleic acid standard, the sequence of which is homologous to a sequence to be determined, preferably identical, with the exception, however, of at least one point mutation, which is particularly in a sequence region of lowest stability. However, care must be taken to ensure that this point mutation is outside the primer binding sites when enzymatic amplifications are performed.
  • the nucleic acid standard can also be a natural component of the nucleic acid to be analyzed. According to the invention, it is also possible to observe a successful amplification of a particular nucleic acid without adding a marked standard fragment to the reaction mixture after the amplification has taken place.
  • a different melting point of the two sequences can be influenced, for example, by strongly varying the length of the sequence or by choosing a poly-A / T sequence.
  • the question of whether an amplification reaction has taken place can then be decided by using the method according to the invention, for example in a temperature gradient with the simultaneous presence of ethidium bromide, which also enables quantitative detection.
  • the evaluation of the function of the change in the spectroscopic behavior of the substance which interacts with the nucleic acid then allows the conclusion to be drawn about the presence or number or homology of a sought nucleic acid to the corresponding standard.
  • the data is preferably evaluated online by a data processing system.
  • Films known per se are particularly suitable for the process according to the invention because they can be thermostated efficiently, inexpensive to manufacture and easy to dispose of in an environmentally friendly manner.
  • the use of optically clear foils for the visible light range permits on-line registration of fluorescence signals from commercially available fluorescence dyes.
  • the foils can be filled with the generally required reagents (enzymes, primers, buffers, stabilizers, etc.) and preserved in the lyophilized state for long periods. Trehalose or saccharose are preferably used as stabilizers.
  • the serially arranged reaction vessels can be hermetically sealed after adding the samples to be analyzed. This can be done by fusing a cover film with the reaction compartment-carrying film. It is also possible to use films which are coated with a thermoplastic polymer and which can be welded below the melting temperature of the actual carrier films. In the lid area of the carrier film, above the reaction compartments, reagents can be fixed or compartmentalized which should not take part in the reaction from the beginning. This is in the case according to the invention, for. B.
  • a high specificity of the method according to the invention is achieved if a probe is used which is covalently linked to one or more dye molecules (FIG. 4). This is preferably achieved by using a primer for the production of the probe which carries at least one dye molecule internally or at the end.
  • a maximum fluorescence intensity of the double-strand intercalated fluorescent dye is obtained only when the probe is in the state of base pairing of the homoduplex or heteroduplex.
  • the fluorescence intensity of the parallel reaction batches can be recorded simultaneously using a camera.
  • the individual evaluation of the channels results in a fluorescence curve, as is typically shown in FIG. 9.
  • the relative magnitude of the changes in fluorescence can be converted directly into number of copies via a computer connected online.

Abstract

Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von mindestens einer in vitro-amplifizierten Nukleinsäure in einem verschlossenen Reaktionsraum, wobei während oder nach der Amplifizierung der Nukleinsäure mindestens eine Substanz (Sonde) vorhanden ist, die mit der nachzuweisenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, wobei spektroskopisch meßbare Parameter der Substanz (Sonde) eine Änderung erfahren und dabei ein meßbares Signal erzeugt wird, die zu messende Probe der Einwirkung eines Gradienten ausgesetzt wird, der Nukleinsäuren mindestens teilweise denaturieren kann, unter Erfassung des sich durch die Einwirkung des Gradienten ändernden meßbaren Parameters und die gesamte Amplifikationsreaktion einschließlich der qualitativen und quantitativen Bestimmung in einem verschlossenen Reaktionsraum (Meßkompartiment) ohne zwischenzeitliche Öffnung durchführbar ist. Die Methode basiert auf einem Vergleich der Kopienzahl und der Sequenz einer zu analysierenden DNA oder RNA und einem internen Standard mit Hilfe eines zeitlichen Temperaturgradienten. Der Nachweis wird mit optischen Verfahren in homogenen oder heterogenen Phasen geführt und erfordert keine elektrophoretischen Trenntechniken. Der amplifizierte Reaktionsansatz kann auch während und nach der Analyse verschlossen bleiben. Damit wird z.B. eine Entsorgung unter vollständiger Vermeidung der Kontaminationsgefahr durch amplifizierte Reaktionsansätze möglich.

Description

"Verfahren zur Bestimmung von in vitro a plifizierten Nukleinsäuren"
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von mindestens einer in vitro amplifizier¬ ten Nukleinsäure in einem Reaktionsraum, eine Vor¬ richtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens geeignet ist, sowie Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die moderne Analytik greift zunehmend auf molekularbio¬ logische Grundprinzipien zurück. Mit der Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist in jüngster Zeit ein sehr nützliches Werkzeug für die Analytik mittels molekular¬ biologischer Grundlagen gefunden worden, die sich auf allen Gebieten der Analytik, in denen Nukleinsäuren eine direkte oder indirekte Rolle spielen, angewendet werden kann.
Die PCR-Analytik (R.K. Saiki et al. (1988) Science 239, 487 - 491) und andere enzymatische Amplifikationstechniken (J.C. Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. 87, 1874 - 1878) sind prinzipiell in der Lage, niedrige Titer von DNA- oder RNA-Kopien in einer wäßrigen Lösung nach¬ zuweisen. Letztlich ist eine einzige Kopie ausreichend für eine enzymatische Amplifikation. Allerdings haben sich eine Reihe praktischer Schwierigkeiten bei der routinemäßigen qualitativen Anwendung herausgestellt sowie bei dem Bestreben, PCR mit einer quantitativen Kopienzahl-Bestimmung zu verbinden. Die Schwierigkeiten der A plifikationsanalytik stehen im Zusammenhang mit:
- Unerwünschter Amplifikation durch Fehlpri ing,
- ungleichmäßiger Verbrauch der Primer,
- Heteroduplex-Bildung,
- schwankende Zykluseffizienzen,
- diverse Amplifikationsartefakte,
- Quantifizierungsproblematik,
- Kontaminationsgefahr,
- "falsch positve" Resultate,
- "falsch negative" Resultate,
- Testkosten,
- Serienreife,
- Aufwand in der Handhabung, verglichen mit immuno¬ logischen ELISA-Verfahren für die Proteinanalytik.
Die WO 91/02815 beschreibt einen sicheren qualitativen und quantitativen Nachweis spezifischer DNA und RNA aus biologischem Probenmaterial mit Hilfe einer DNA/RNA- Amplifikationsmethode in Kombination z. B. mit der Tem¬ peraturgradienten-Gelelektrophorese (siehe auch K. Henco & M. Heibey (1990) Nucleic Acids Res. 19, 6733 - 6734, J. Kang et al. (1991) Biotech Forum Europ 8, 590 - 593, G. Gilliland et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (1990) 87, 2725 - 2729) .
Mit der in der WO 91/02815 beschriebenen A plifikations- strategie ist es gelungen, die Sensitivität der Amplifi- kationstechniken mit einer sicheren und äußerst genauen Quantifizierung zu verbinden (Variation + 15%) . Die Methode ermöglicht es, die oben genannten Probleme, wie sie sich bei Amplifikationsverfahren ergeben, zu kon¬ trollieren bzw. zu unterdrücken. Mit der Verwendung eines nahezu idealen internen Standards definierter Kopienzahl, der sich nur in einer einzigen Basenposition von dem zu bestimmenden Template unterscheidet, läßt sich eine Am- plifikation unter Beibehaltung des initialen Verhält¬ nisses von Template und Standard durchführen (K. Henco & M. Heibey ((1990) Nucleic Acids Res. 19, 6733 - 6734). Template und Standard werden nachträglich in einem Tem¬ peraturgradientenverfahren mit zeitlichem oder räumlichem Temperaturgradienten im gelelektrophoretischen System durchgeführt. Das Verhältnis von Template und Standard läßt sich einfach ermitteln, indem das Reaktionsgemisch mit einem radioaktiv markierten oder fluoreszenz-markier- ten Standard hybridisiert wird. Die ansonsten störend auftretende Heteroduplex-Bildung kann in diesem System das Ergebnis nicht verfälschen. Vielmehr wird die Hetero¬ duplex-Bildung zur eigentlichen Messung herangezogen.
Übliche Probleme durch ungleichmäßigen Verbrauch der Primer, Fehlpriming-Reaktionen, Sättigungseffekte, Variationen in der Effektivität der Amplifikationen, haben keinen negativen Einfluß auf das Quantifizierungs¬ ergebnis.
Diese Technologie wurde auf wichtige analytische Frage¬ stellungen in der Medizin angewandt. So ist es beispiels¬ weise möglich geworden, die Cytomegalie-Infektion bzw. -Virämie bei transplantierten Patienten oder Neugeborenen quantifizierend zu erfassen. Hier hat sich das Verfahren besonders bewährt, denn angesichts einer stellenweise mehr als 90%-igen Infektionsrate in den europäischen Staaten ist der reine Nachweis von Cyto egalie-Viren nicht bedeutungsvoll, sofern nicht gleichzeitig eine Titer-Bestimmung durchgeführt wird, die den akuten Zu¬ stand einer Virämie anzeigt. Bei viralen Erkrankungen gewinnt der quantifizierende Aspekt an Bedeutung, ins¬ besondere im Zusammenhang mit den im verstärkten Maße angewandten antiviralen Therapie-Schemata. Häufig sind antivirale Therapien, wie zum Beispiel im Falle von HIV mit AZT für den Patienten systemisch äußerst belastend und als antivirales Therapeutikum nur über einen limi¬ tierten Zeitraum erfolgreich einzusetzen. Deshalb wird es für die Zukunft sehr bedeutsam sein, eine wirtschaftliche und einfache Technik zu haben, die sowohl eine Titer-Be- stimmung bzw. eine Bestimmung der Virusgen-Aktivität oder einen Therapie-induzierten Drift zu resistenten Virus- stämmen anzeigt.
Die bislang angewandten gelelektrophoretischen Methoden zur Auftrennung der markierten Homoduplices und Hetero- duplices haben sich bei kleinen bis niedrigen Proben¬ zahlen (10 - 20) als äußerst effizient und korrekt be¬ züglich der gelieferten Ergebnisse herausgestellt. Ein gravierender Nachteil ist jedoch die relativ zeit- und personalaufwendige Analysentechnik, die den Einsatz dieses sehr aussagefähigen Analyseverfahrens als ge¬ nerelle Diagnostik-Methode für die DNA- und RNA-Analytik erschwert. Es ist mit der Temperatur-Gelelektrophorese- Technik kaum möglich, Probenzahlen > 50 pro ausführender Person und Tag durchzuführen. Auch eine Automatisierung ist nur schwer zu erreichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es mithin, ein Verfahren bereitzustellen, daß die oben erwähnten Nach¬ teile der Verfahren gemäß dem Stand der Technik ver¬ meidet, insbesondere ein Nachweisverfahren für Nuklein¬ säuren so auszugestalten, daß keine gelelektrophoretische Trennung erforderlich ist, um somit eine einfachere und automatisierbare Verfahrensweise zu gewährleisten. Gleichzeitig soll eine Vorrichtung geschaffen werden, die es erlaubt, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren detektierten amplifizierten Nukleinsäuren sicher und einfach zu erkennen, wobei die Vorrichtung ebenfalls eine weitestgehend automatisierbare Auswertung erlauben soll. Erfindungsgemäß gelöst wird die Aufgabe durch ein Ver¬ fahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von mindestens einer in vitro-amplifizierten Nukleinsäure in einem verschlossenen Reaktionsraum, wobei während oder nach der Amplifizierung der Nukleinsäure mindestens eine Substanz (Sonde) vor¬ handen ist, die mit der nachzuweisenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, wobei spektroskopisch meßbare Parameter der Substanz (Sonde) eine Änderung erfahren und dabei ein me߬ bares Signal erzeugt wird, die zu messende Probe der Einwirkung eines Gradien¬ ten ausgesetzt wird, der Nukleinsäuren mindestens teilweise denaturieren kann, unter Erfassung des sich durch die Einwirkung des Gradienten ändernden meßbaren Parameters und die gesamte Amplifikationsreaktion einschließlich der qualitativen und quantitativen Bestimmung in einem verschlossenen Reaktionsraum (Meßkompartiment) ohne zwischenzeitliche Öffnung durchführbar ist.
Die Substanz (Sonde) , deren Parameter spektroskopisch meßbar sein soll, enthält vorzugsweise mindestens einen fluoreszierenden Rest, vorzugsweise mit interkalierenden Eigenschaften und einen Nukleinsäureanteil. Die Wechsel¬ wirkung mit den in vitro amplifizierten Nukleinsäuren in Abhängigkeit des Denaturierungszustandes geht einher mit einer Änderung des spektroskopischen Meßsignals. Dies kann beispielsweise durch Interkalation des Farbstoffes in die Nukleinsäuredoppelhelix oder durch Verdünnungs¬ oder Konzentrierungseffekte im Meßkompartiment erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens wird der durch den Gradienten ausgelöste Denaturierungsprozeß der Nukleinsäure über eine Änderung der Wellenlänge und/oder eine Fluoreszenz- intensität-Shift und/oder eine Änderung der Lebenszeit eines angeregten Zustands oder über das Prinzip des soge¬ nannten Energy Transfers (Förster Transfer) oder über einen Konzentrationseffekt erfaßt oder über unterschied¬ liche, vorzugsweise hydrophobe Wechselwirkungseigen- schaften der markierten Sonde.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch eine simultane oder εequenzielle Erfassung mehrerer ver¬ schiedener amplifizierter Nukleinsäuren. Dies erfolgt dadurch, daß mehrere spektroskopisch voneinander unter¬ scheidbare Farbstoffe eingesetzt werden, mit denen sich die verschiedenen amplifizierten Nukleinsäuren analy¬ sieren lassen und/oder über die mindestens eine unab¬ hängige Eichsubstanz eingeführt wird. Dies ist insbe¬ sondere dann möglich, wenn die verschiedenen Nuklein¬ säuren, die analysiert werden sollen mit unterschiedlich markierten Hybridisierungspartnern in Wechselwirkung treten.
Die Aufnahme des Meßsignals erfolgt beispielsweise durch Messung der von den Farbstoffen ausgehenden Fluoreszenz, welche insbesondere durch einen Laser kontinuierlich oder getaktet angeregt werden können.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens beruht darauf, daß die amplifizierten Nukleinsäuren mindestens einen koamplifizierten Nuklein- säurestandard enthalten, dessen Sequenz zu einer zu be¬ stimmenden Sequenz homolog ist, vorzugsweise identisch ist, mit Ausnahme jedoch mindestens einer Punktmutation, die insbesondere in einem Sequenzbereich niedrigster Stabilität liegt. Es ist jedoch darauf zu achten, daß diese Punktmutation außerhalb der Primer-Bindungsstellen liegt, wenn enzymatische Amplifikationen durchgeführt werden. Der Nukleinsäurestandard kann ebenfalls ein na¬ türlicher Bestandteil der zu analysierenden Nukleinsäure sein. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, eine erfolgreiche Amplifizierung einer bestimmten Nukleinsäure zu beobachten, ohne nach erfolgter Amplifikation ein mar¬ kiertes Standardfragment dem Reaktionsansatz zuzufügen. Bei dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden insbesondere die zur Amplifikation erforderlichen Primer eingesetzt (EP-A-0 469 755) . Diese hybridisieren dann an den entsprechenden Stellen in der Sequenz der betreffenden Nukleinsäuren. Die entsprechenden Sequenzen können zwischen den Primerstellen jedoch so unterschied¬ lich sein, daß beim Durchlaufen des Temperaturgradienten beide Sequenzen, die amplifizierte Test- und Standard¬ sequenz, voneinander getrennt denaturieren und vorzugs¬ weise dabei kooperativ denaturieren.
Dadurch wird eine Verwendung solcher Sequenzen ermög¬ licht, die eine derart große Sequenzabweichung aufweisen, daß eine Heteroduplexbildung nicht mehr erfolgen kann. Damit entfällt auch die Notwendigkeit, nach der erfolgten Amplifikation ein markiertes Standardfragment zusetzen zu müssen. Ein unterschiedlicher Schmelzpunkt beider Se¬ quenzen läßt sich beispielsweise durch starke Längen¬ variation der Sequenz oder durch die Wahl einer Poly-A/T- Sequenz beeinflussen. Die Frage, ob eine Amplifikations- reaktion stattgefunden hat, läßt sich dann durch An¬ wendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, zum Beispiel in einem Temperaturgradienten bei gleichzeitiger Anwesenheit von Ethidiumbromid entscheiden, wobei auch eine quantita¬ tive Erfassung ermöglicht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Durchführung der Amplifikation in homogener Phase oder an fester Phase, vorzugsweise mit einem an eine feste Phase ge¬ koppelten Primer, an dessen verlängerter Sequenz die markierte Sonde hybridisieren kann. Die Konzentration der Sonde kann somit entweder gezielt auf dem Festphasen- träger oder in der freien Lösung bestimmt werden. Vorzugsweise wird mindestens ein Fluoreszenzfarbstoff- molekül an ein Nukleinsäuremolekül gekoppelt, dessen Sequenz identisch oder homolog mit der nachzuweisenden Nukleinsäure oder dem koamplifizierten Nukleinsäure- standard ist.
Wenn das Nukleinsäuremolekül mit dem daran gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff dem Reaktionsgemisch nach erfolgter Amplifikation zugesetzt wird, erfolgt die Hybridisierung mit den amplifizierten Nukleinsäuren, vorzugsweise durch einen thermischen Denaturierungsschritt mit nachfolgendem Renaturierungsschritt. Es ist erfindungsgemäß jedoch auch möglich, daß das Nukleinsäuremolekül mit gekoppeltem Fluoreszenzfarbstoff dem Reaktionsgemisch vor erfolgter Amplifikation zugesetzt wird. Dabei ist die Sonde als nicht amplifizierbare Doppelstrang-RNA oder als nicht amplifizierbare chemisch modifizierte Nukleinsäure zuzu¬ setzen.
Zur Amplifikation der Nukleinsäure wird in einer mög¬ lichen Ausführungsform ein Primer des zur Amplifikation eingesetzten Primerpaares verwendet, welcher 5'-terminal eine G:C-reiche Region enthält von beispielsweise 15 bis 20 G:C-Resten.
Die bislang beschriebene Standardisierung und Quantifi¬ zierung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die vor¬ stehend bevorzugten Ausführungsformen der beispielsweise fluoreszierenden Sonden ist mit einer tragbaren Ein¬ schränkung behaftet. So dürfen die zur Standardisierung verwendeten Sonden erst nach erfolgter Amplifikation zu¬ gesetzt werden. Dies bedeutet, daß sie zunächst während der Amplifikationsreaktion räumlich vom A plifikationε- geschehen getrennt aufzubewahren sind. Ebenso kann es für verschiedene Anwendungen vorteilhaft sein, Sonden zur Verfügung zu stellen, die als Standardnukleinsäuren verwendet werden und in mehr als einer Position von der zu bestimmenden Nukleinsäure abweichen. Um das Signal- Rausch-Verhältnis bei der späteren Bestimmung mit Hilfe der eingesetzten Sonde zu verbessern, ist es wünschens¬ wert, die Sonde nicht im Unterschuß dem zu amplifizieren- den Gemisch zusetzen zu müssen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des er¬ findungsgemäßen Verfahrens wird daher als Sonde ein Oligo- oder Polynukleotid als Einzelstrangnukleinsäure zugesetzt, welche durch chemische Modifizierung aber nicht an der Amplifizierungsreaktion teilnehmen kann. Erst durch geeignete Manipulationen wird nach der Am¬ plifizierungsreaktion die einzelsträngige Sonde freige¬ legt und kann dann mit den entsprechenden zu bestimmenden Nukleinsäuren hybridisieren. So kann beispielsweise die Sonde, wenn sie in Form einzelsträngiger Nukleinsäure vorliegt, in Form einer "Haarnadelstruktur" inaktiviert werden und somit an der Teilnahme an der Amplifikations- reaktion gehindert werden.
Die als Sonden in besonders bevorzugter Weise zu ver¬ wendenden Oligo- oder Polynukleotide weisen ein oder mehrere Strukturelemente mit mindestens zwei chemischen Substituenten auf, die jeweils in der Lage sind, mit elektromagnetischen Wellen unter Lösen oder Knüpfen dauerhafter Bindungen oder durch Absorption und/ oder Emission von Strahlung in Wechselwirkung zu treten. Als Substituent, der besonders geeignet ist, unter Knüpfen und Lösen von dauerhaften Bindungen, insbesondere kovalenten Bindungen, mit elektromagnetischer Strahlung in Wechselwirkung zu treten, hat sich Psoralen oder dessen Derivate bewährt. Als Strukturelemente, die als eigentliche Marker der Sonde dienen, haben sich insbe¬ sondere Lumineszenzfarbstoffe, wie Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher Quantenausbeute bewährt, wie die Farbstoffe der Thiazolorange-Familie. Farbstoffe mit großen Stoke-Ver- Schiebungen sind bevorzugt, die in Abhängigkeit vom Hybri- disierungszustand die Lu ineszenzeigenschaften ändern.
Es kann vorteilhaft sein, daß die Spektren der Struktur¬ elemente an den jeweiligen sensitiven Stellen, die einer¬ seits zum Lösen und Knüpfen von beispielsweise kovalenten Bindungen anzuregen sind, oder andererseits als Ab- sorptions- oder Emissionsmaximum anzusehen sind, so weit auseinanderliegen, daß eine jeweilige Anregung die Funktion des anderen Strukturelementes nicht stört.
Es ist ebenfalls möglich, die beiden chemischen Struktur¬ elemente in einer einzigen chemischen Struktur zu ver¬ einen, sofern das Knüpfen und Lösen von Bindungen jeweils bei anderen Wellenlängen erfolgt, wie eine mögliche maximale Fluoreszenz dieser Struktur. So können die je¬ weiligen Funktionen, zum einen die Fixierung der Sonde in einer nicht amplifizierten Struktur und zum anderen die spektroskopische Identifizierung dieser Struktur, nicht miteinander interferieren.
Sofern zwei getrennte Strukturelemente die getrennten Funktionen wahrnehmen hat sich als vorteilhaft erwiesen, daß deren Abstand von mindestens 10 Nukleotiden auf dem Oligo- oder Polynukleotidstrang nicht unterschreiten sollten.
Die bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligo- und/oder Polynukleotide funktioniert vorzugsweise so, daß die Sonden dem bereits oben beschriebenen Gemisch von Substanzen zugefügt werden, die Amplifikationsreaktion wie beschrieben durchgeführt wird und danach beispiels¬ weise durch Strahlung induziert, die verkappte Sonde freigesetzt wird, um dann mit dem zu bestimmenden Am- plifikationsprodukt zu hybridisieren und wie beschrieben beispielsweise durch einen zeitlichen Temperaturgradien¬ ten in homogener Lösung, durch Temperaturgelelektro¬ phorese oder einen chromatographischen Verfahren detek- tiert zu werden.
Mit dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird es möglich, die Analyse so durchzuführen, daß die mar¬ kierte Hybridisierungssonde nicht mehr innerhalb des Kom- partimentes des Reaktionsräumes separat angeordnet sein muß, um sie dem Reaktionsgemisch erst unmittelbar vor der eigentlichen Analyse zuzusetzen. Es ist somit möglich, die markierte Sonde mit den übrigen Reagenzien in einer Form vorzulegen, in der sie selbst nicht am nachfolgenden Amplifikationsprozeß teilnehmen kann. Dadurch wird eine Trennung des Amplifikationsgemisches und der Sonde inner¬ halb des Meßraumes vermeidbar.
Zur Durchführung des Verfahrens werden vorzugsweise folienartige Systeme mit Vertiefungen oder Ausbuchtungen, die als Reaktionsräume (Kompartimente) dienen, verwendet. Die Foliensysteme sind vorzugsweise thermisch verschweiß- bar und zur Aufnahme verwendungsfertiger Reagenzienge¬ mische in gefriergetrockneter oder matrixgebundener Form geeignet. Weiterhin ist eine direkte optische Vermessung des Inhalts der Reaktionsräume möglich. Das Folien¬ material ist also zumindest für bestimmte Wellenlängen¬ bereiche elektromagnetischer Strahlung durchlässig bzw. transparent. Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigten Reagenzien werden vorzugsweise in räumlich abgetrennten Matrices gelagert und nach dem Schließen eines Reaktionsraumes zeitlich getrennt dem Reaktionsgeschehen zugeführt. Vorzugsweise sind die Reaktionsräume im Abstand der Löcher handelsüblicher Mikrotiterplatten voneinander getrennt. Dies hat ins¬ besondere den Vorteil, daß Geräte, die zur Bearbeitung von Mikrσtitrationsplatten geeignet sind, in der erfin- dungsgemäß beschriebenen Technologie eingesetzt werden können.
Zur Analyse eines amplifizierten Nukleinsäuregemisches wird nach Zugabe der zur Reaktion benötigten Substanzen vorzugsweise ein zeitlich gesteuerter Temperaturgradient angelegt und das Denaturierungsverhalten der Nuklein¬ säuren gemessen. Dies erfolgt durch die Änderung der spektroskopischen Parameter der mit der Nukleinsäure in Wechselwirkung tretenden Substanz. Die Änderung des spektroskopischen Parameters wird zeitlich oder in äqui¬ valenter Weise, in Abhängigkeit der Temperaturänderung verfolgt.
Die Auswertung der Funktion der Änderung des spektros- kopischen Verhaltens der mit der Nukleinsäure in Wechsel¬ wirkung tretenden Substanz erlaubt dann den Schluß auf Anwesenheit oder Anzahl oder Homologie einer gesuchten Nukleinsäure zum korrespondierenden Standard. Die Aus¬ wertung der Daten erfolgt vorzugsweise on line durch eine Datenverarbeitungsanlage.
Vorteilhaft am erfindungsgemäßen Verfahren äußert sich neben dem Abstellen der oben genannten Nachteile des Standes der Technik, daß die Amplifizierung der Nuklein¬ säuren und die spätere Analytik in einem einzigen herme¬ tisch verschlossenen Reaktionskompartiment durchgeführt werden kann. Dadurch wird eine Entsorgung dieser bio¬ logischen Stoffe ohne Öffnung der Kompartimente möglich und eine potentielle Kontaminationsquelle ausgeschaltet. Desweiteren ermöglicht diese Vorgehensweise die Lagerung von Testfolien der oben genannten Art im geschlossenen Zustand auch über längere Zeiträume, so daß eine Archi¬ vierung der oftmals wertvollen Testsubstanzen möglich wird. Die Lagerung erfolgt aber vorzugsweise im ge¬ frorenen Zustand. Das erfindungεgemäße Verfahren ermög- licht ebenfalls in vorteilhafter Weise, daß die Versuche gegebenenfalls zu einem späteren Zeitpunkt auch nach längerer Zwischenlagerung wiederholbar sind, oder das amplifizierte Gemisch danach präparativ aufarbeitbar und analysierbar ist.
Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist eine Einrichtung zur zeitabhängigen Thermostatisierung der im Verfahren zu verwendenden Reaktionsräume auf. Vorzugsweise wird die Thermostati- sierung durch eine programmierbare Einheit gesteuert. Die Ableseeinrichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung be¬ steht vorzugsweise aus einer optischen Einheit, die in der Lage ist, Photonen zu registrieren. Besonders be¬ vorzugt sind solche Einheiten, die zur Registrierung emittierten Fluoreszenzlichts geeignet sind. Ebenfalls in Betracht kommen Geräte, die in der Lage sind, andere spektroskopische Eigenschaften, wie Kernspin oder Elek¬ tronenspin etc., die mit der Änderung der Konformation der Nukleinsäure-Doppelhelix oder anderen Struktur¬ variablen korrelierbar sind, oder chromatographische Ver¬ fahren einzusetzen. Mit der Methode der Chromatographie hydrophober Wechselwirkungen lassen sich Moleküle mit hydrophoben Liganden, wie sie partiell denaturierende Strukturen der zu analysierenden Substanzen darstellen, von den Dublices abtrennen.
Die Vorrichtung- zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der Lage, ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens aufzunehmen, das aus einem System von Reaktionskompartimenten, vorzugsweise aus einem Folien¬ system mit gebrauchsfertigen Reagenzien in gefrierge¬ trockneter Form aufgebaut ist. Die Reaktionskompartimente sind vorzugsweise im Mikrotitrationsformat angeordnet. Die Reagenzien des Mittels zur Durchführung des Verfahren sind vorzugsweise in mindestens einer wasserlöslichen Matrix fixiert und/oder gelagert. Die Matrix enthält vorzugsweise Stabilisatoren, wie Zucker, insbesondere Trehalose oder Saccharose. Bevorzugt enthält das Mittel zur Durchführung des erfindungsge äßen Verfahrens Reaktionskompartimente und/oder weitere Reagenzienreser¬ voire, Amplifikationsprimer, Pufferbestandteile sowie mindestens eine Polymerase und übliche Kofaktoren zur Durchführung der Amplifikationsreaktion. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Mittels zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Reaktionsraum bzw. das Reaktionskompartiment mit einem weiteren abgetrennten Reagenzienreservoir in einer Matrix versehen, die sich in der das Kompartiment verschließen¬ den Folie befindet. Dabei wird vorzugsweise die markierte Sonde mit den für die Hybridisierung notwendigen Puffer- substanzen gelagert.
Das Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens ist vorzugsweise in Kit-Systemen zusammenge¬ stellt, das Reaktionsgefäße, wie Foliensysteme mit lager¬ fähigen und direkt einsetzbaren Reagenziengemischen be¬ inhaltet, wobei die Reaktionsgefäße nur mit der zu analy¬ sierenden Probe beschickt werden müssen, um dann im hermetisch versiegelten Zustand einem Amplifikationsver- fahren und anschließender Analyse unterworfen zu werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Analyse von Stoffgemischen, vorzugsweise Nuklein¬ säuren, in denen mindestens eine Komponente im Tempera¬ turbereich des zeitlichen Temperaturgradienten eine thermische Umwandlung erfährt. Durch Hinzufügen und Ko- amplifikation eines Standards mit genau bekannter Kopien¬ zahl ist das erfindungsgemäße Verfahren standardisierbar und erlaubt quantitative Aussagen über die amplifizierten Nukleinsäuren der zu untersuchenden Probe. Mit dem er¬ findungsgemäßen Verfahren lassen sich zum Beispiel Mu- tationen, Punktmutationen, Deletionen, Insertionen und Umstellungen in der DNA/RNA-Nukleinsäure feststellen. Mit der quantitativen Analyse läßt sich auch die Konzen¬ tration dieser Änderungen in der Nukleinsäure ermitteln. Die Proben können aus unterschiedlichstem Material stammen, wie lebendem, totem, fossilem und in vivo nicht mehr stoffwechselaktivem Gewebe oder aus Körperflüssig¬ keiten, aus in vitro Zellkulturen oder aus Proben der Umwelt. Das erfindungsgemaße Verfahren ermöglicht die qualitative und quantitative Erfassung zellulärer Gene und Gene infektiöser Krankheitserreger direkt oder über ihre RNA-Genprodukte als Wildtypsequenz oder als Varian¬ ten.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich aber auch zur Untersuchung und Bestimmung von potentiell toxischen Sub¬ stanzen oder potentiell pharmazeutischen Wirkstoffen oder chemischen oder biologischen Pflanzenschutzmitteln ein¬ setzen, indem deren Einfluß auf Nukleinsäuren oder deren Amplifikation in zellulären oder nicht zellulären Systemen untersucht werden.
Figur 1
Die Figur 1 beschreibt schematisch einen bevorzugten Ab¬ lauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einer Vorlage von Reaktionskompartimenten in Format einer Platte für die Mikrotitration befinden sich die für eine spezifische Amplifikation einer Nukleinsäure notwendigen Reagenzien, zum Beispiel in lyophilisierter Form inklusive der Sonde. Lediglich die zu analysierende Probe wird beispielsweise in wäßrig-gelöster Form vor der Amplifikationsreaktion zugesetzt. Es wird eine homogene Lösung hergestellt.
Danach werden die Reaktionskompartimente mit einer zwei¬ ten Folie verschlossen, wobei die zweite Folie mindestens eine weitere Matrix enthält mit Reagenzien, die nicht an der eigentlichen Amplifikationsreaktion teilnehmen sol¬ len. Die Folie wird in einem Ther ostatierblock positio¬ niert, um die enzymatische Amplifikationsreaktion durch¬ zuführen. Hierbei können sowohl Amplifikationen bei homo¬ gener Temperatur als auch in zyklisch variierenden Tem¬ peraturabläufen (PCR) ausgeführt werden. Nach erfolgter Amplifikation wird das Reaktionsgemisch mit dem zweiten Reagenzienreservoir in Kontakt gebracht und eine homogene Lösung hergestellt. Nach Durchführen eines Denaturie- rungs-/Renaturierungsprozesses registriert ein optisches Detektionssyεtem die laserangeregte Lumineszenz (Fluo¬ reszenz, Phosphoreszenz) in Abhängigkeit eines linearen Temperaturgradienten, der über den Thermoblock zeitlich gesteuert wird. Der steigende Temperaturgradient kann in einem weiten Bereich variiert werden. Die Anfangstempera¬ tur kann z. B. minimal 5βC, die Endtemperatur maximal 100 °C betragen.
Figur 2
Die Darstellung zeigt in schematiεcher Form den Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens am Beispiel inter- kalierender Farbstoffe auf molekularer Ebene, die nicht an eine Nukleinsäureεonde fixiert εind (z.B. Ethidium- bromid oder Thiazolorange-Farbεtoffe) . Dieεe Farbεtoff- moleküle lagern sich unter nativen Bedingungen zwischen benachbarte Basenpaare in doppelstrangiger DNA oder RNA ein. Im interkalierten Zustand erhöht' sich die Fluoreε- zenzauεbeute biε zum 20-fachen und die Lebenεdauer deε angeregten Zuεtandeε etwa um daε 10-fache. Wird dieεes System einem thermischen Gradienten unterworfen, so beginnen zunächst die thermodynamisch inεtabilεten Bereiche der Nukleinsäurehelix zu denaturieren. Eine Fehlpaarung, wie sie bei der Heteroduplexbildung erzeugt wird, deεtabiliεiert den entsprechenden Sequenzbereich und führt zu dessen frühzeitiger Öffnung. Die in diesem Bereich zunächst gebundenen Farbstoffmoleküle werden freigesetzt, wodurch sich eine Erniedrigung des Ge¬ samtfluoreszenzsignals ergibt. Dabei ist die Farb¬ stoffkonzentration so zu wählen, daß freier Farbstoff und gebundener Farbstoff im thermodyna ischen Gleichgewicht stehen und der freie Farbstoff in deutlichem Überschuß vorliegt. Erst bei höheren Temperaturen öffnet sich der entsprechende Sequenzbereich des Homoduplex, wodurch eine weitere stufenweise Erniedrigung des Fluoreszenzsignals erfolgt. Aus dem Verhältnis der Intensitäten beider Stufen lassen sich die relativen Mengenverhältnisse von Homoduplex und Heteroduplex ermitteln.
Figur 3a und 3b
Die Figur 3a zeigt das Design eines Standards bzw. einer fluoreszenzmarkierten Sonde in einer bevorzugten Aus¬ führungsform. Der Standard soll sich in mindestens einer Basenposition von der nachzuweisenden Nukleinsäure unter¬ scheiden. Diese Mutation befindet sich vorzugsweise in dem Sequenzbereich niedrigster thermodynamischer Stabi¬ lität und kann leicht unter Verwendung des Primers P3 eingeführt werden. Die Mutation soll sich jedoch außer¬ halb der Primer-Bindungsstellen von Pl und P2 befinden. Ein Primer (P2) kann S'-terminal eine GC-reiche Region enthalten, während der andere Primer (Pl) vorzugsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff über einen Spacer chemisch gekoppelt ist, wobei der Fluoreszenzfarbstoff im Bereich der Doppelhelix interkalieren kann. Das Anwendungsprinzip der fluorezenzmarkierten Sonde ist in Figur 3b schema¬ tisiert dargestellt.
Figur 4
in einer bevorzugten Ausführungεform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Primer eingesetzt, wie beschrieben in: Thuong, N.T. & Chassignol, M. (1987) Tetrahedron Letters 28, 4157-4160; Thuong, N.T. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84, 5129-5133; Helene, C. in DNA-Ligand Interactions (1987) Plenum Publiεhing Corporation, 127-140, W. Guεhelbauer & W. Saenger Ed. Sie εind bereits teilweise kommerziell erhältlich (Appligene, Straßburg, Frankreich) Er enthält einen Spacer-gekoppelten Fluores- zenzfarbεtoff, der interkalationεfähig ist, wenn sich der Primer in einem doppelhelikalen Bereich befindet. Wird die Doppelhelix thermiεch denaturiert, so ändern sich die Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffeε.
Figur 5
Die Figur zeigt schematisch eine bevorzugte Herstellung der im erfindungεge äßen Verfahren verwendbaren Sonden, die modifiziert εind und nicht an der Amplifikations¬ reaktion teilnehmen.
Die europäischen Patentanmeldungen EP 469 755 und EP 379 369 beschreiben die Erzeugung von Nukleinsäureεtrukturen. Dort wird beispielhaft eine Struktur erzeugt, deren Enden zueinander komplementär εind. Hierfür kommen zunächεt die Primer pl und (pl) zum Einsatz. Zur Herstellung der Son¬ den wird aus dem entsprechenden Amplifikat des Standards mit einem Primer pl, der das Strukturelement, welches dauerhafte Bindungen zu knüpfen vermag ("chemische Klam¬ mer") , ein Amplifikat hergestellt.
pl wird vorzugsweise so gewählt, daß auf der 3 '-Seite eine Restriktionsschnittstelle mit einem 5'-überhängenden Ende entsteht. Somit entsteht nach Restriktionsschnitt eine Struktur, die mit Nukleotiden aufgefüllt werden kann, welche ihrerεeits beispielsweise einen Chromophor tragen, der der eigentliche Marker der Sonde ist. Da nach diesem Herstellungsverfahren beide Stränge den Farbstoff- label und die "chemische Klammer" enthalten, wird eine Strangtrennung und Isolierung erforderlich. Dies verur¬ sacht jedoch keine Probleme und kann beispielεweiεe mit einer präparativen Hochdruckflüssigkeitschromatographie erfolgen.
Die chemische Verknüpfung der komplementärhybridisieren¬ den Enden der Einzelstrang-Haarnadelstruktur wird danach photochemisch oder chemisch induziert und verhindert somit die Template-Aktivität dieser Sonde während der enzymatiεchen Amplifikationεphase, wie sie in Figur 5 ebenfalls dargestellt ist. Die in Form eines Haarnadel- Loops vorliegende Sonde kann aufgrund ihrer verkappten Struktur in die Amplikation nicht mit einbezogen werden. Nach erfolgter Amplifikation kann beispielsweise bei Verwendung von Psoralenderivaten als "chemische Klammer" im kurzwelligen UV-Bereich die Verklammerung wieder ge¬ löst werden. So wird der Sondeneinzelstrang im De- naturierungs-/Renaturierungsprozeß wieder freigesetzt und kann durch wiederholte Bestrahlung bei 360 nm, sofern Psoralenderivate verwendet werden, wieder verknüpft werden. Dieser Zusammenhang ist in Figur 6 schematisch dargestellt.
Wenn die chemische Verknüpfung mit dem Gegenstrang wie¬ derum durch Strahlung induziert werden kann, kommt dieser chemischen Verknüpfung eine weitere vorteilhafte Funktion zu. Sie kann die Aufgabe der zuvor eingesetzten G/C-Klam- mern übernehmen und somit dafür sorgen, daß hybridisierte Stränge sich während der Analyse nicht mehr trennen können und somit eine irreversible Denaturierung ermög¬ licht wird. Wie bereits erwähnt, werden vorzugsweise als "chemische Klammern" Verbindungen mit Psoralengrundstruk- tur eingesetzt, welche die Eigenschaft beεitzen, nach Aktivierung mit Licht mit einer Wellenlänge von 360 nm mit Pyrimidinbaεen kovalent zu reagieren. Die Voraus- εetzung iεt allerdings, daß die Pyrimidinbasen um eine Basenposition versetzt auf dem gegenüberliegenden Strang positioniert sind (J. E. Hearst (1988) . An. Rev. Phyε. Chem., 39, 291 biε 315).
Eine andere Alternative zur Syntheεe der erfindungεge äß zu bevorzugenden Sonde ist in Figur 7 gezeigt. Dabei wird die "chemische Klammer" über den Primer (pl) eingeführt. Somit trägt später lediglich der gewünschte Strang den chemischen Vernetzer. Durch den Vernetzer, der insbeson¬ dere photochemisch aktivierbar ist, wird in vorteilhafter Weise die benachbarte Schnittstelle des Restriktions- enzymε Rl inaktiviert. Auf diese Weise iεt dafür Sorge getragen, daß anεchließend der Farbεtoff, der die eigent¬ liche Markierung der Sonde besorgt, nur auf dem gewünsch¬ ten Strang eingebaut wird. Ungünstig im Vergleich zur oben beschriebenen Sondenkonstruktion ist hier der etwas längere Primer (pl) mit Modifikation.
Eine dritte mögliche, bevorzugte Ausführungεform der er¬ findungsgemäßen Nukleinsäuresonde iεt erhältlich durch den Einεatz einer einzelεträngigen Sonde, die ebenfallε einen quervernetzenden Liganden beεitzt, dessen Position sich allerdings am 3'-Ende der Sonde befindet, während das Farbstoffmarkierungsmolekül am 5'-Ende eingebaut ist. Dieεe Situation wird in Figur 8 veranschaulicht. Die Sonde wird in diesem Falle so konstruiert, daß am 3'-Ende die Primerbindestelle fehlt, daε 5'-Ende identisch mit der pl-Primerεequenz ist, das 3 '-Ende enzymatisch nicht verlängert werden kann und zwar dadurch, daß beiεpiels- weiεe endständig ein Didesoxynukleotid eingebaut wird. Daε quervernetzende Reagenz trennt räumlich die homologe Doppelstrangregion mit dem Markierungεεtrukturele ent von der dieεe nicht tragende Einzelstrangregion der Hybride. Wenn die Einzelstrangregion alε Folge eineε fehlerhaften Amplifikationsprozeεεes nicht einheitlich synthetisiert wird, iεt dieε für daε Ergebnis der Sondenkonεtruktion nicht beeinträchtigend. Bei Verfolgung dieεer Strategie der Sondenkonεtruktion nimmt die Sonde deεhalb nicht am Amplifikationsgeschehen teil, weil sie am 3 '-Ende nicht verlängerbar ist, und somit selbεt bei intermediär erfolgter Hybridiεierung mit amplifiziertem Gegenstrang keine elongierte Primer-Bin¬ dungsstelle enzymatisch synthetisiert wird.
Nach erfolgter Amplifikation muß der vernetzende Ligand somit nicht zunächst aus einer vernetzten Struktur durch Bestrahlung herausgelöst werden um nachfolgend in der rehybridisierten Struktur mit Amplifikat wiederum ver¬ netzt zu werden; es reicht ein einmaliger Bestrahlungs- vorgang, um die Vernetzung mit dem Amplifikat zu be¬ wirken.
Figur 9
Die Figuren 9a - 9e zeigen schematisch mögliche experi¬ mentelle Resultate, die mit der erfindungsgemäßen Technik erhalten werden können. Auf der Ordinate ist das Fluores¬ zenzsignal 1 bezogen auf die jeweilige Intensität (10) bei der niedrigsten experimentellen Temperatur (nativ) aufgetragen. Die X-Achse beschreibt den Temperaturverlauf des Aufheizungsvorgangs, der vorzugsweise zeitlich linear verläuft. Die zwei gestrichelten Linien markieren die Position des Standard Homoduplex (2) sowie die Position des aus markierter Sonde und zu erwartender Wildtyp- Sequenz (1) bestehenden Heteroduplex 1. Trägt die zu analysierende Sequenz mindestens eine weitere Mutation, so ergibt sich ein stufenweises Absinken des Fluoreszenz¬ signals bereits bei tieferer Temperatur, die für die Mutation charakteristisch ist (B3) . Die relative Höhe der Stufen zueinander (1/2, 3/4, 6/7/8) gibt direkt das Ver¬ hältnis der relativen Konzentration der beteiligten Moleküle wieder. Ein Ergebnis gemäß Abbildung C wird er¬ halten, wenn lediglich die Standard-Nukleinsäure ampli- fiziert wird und die biologische Probe keine oder nur geringe Mengen der entsprechenden Nukleinsäure enthält. Ein Ergebnis gemäß D6 wird erhalten, wenn die Amplifi¬ kationsreaktion nicht ordnungsgemäß abgelaufen iεt und nicht einmal der Standard amplifiziert worden ist. Ent¬ hält die biologiεche Probe mehr als eine homologe Nukleinsäurespezies εo ergeben sich mehrere voneinander unterschiedliche Stufen des temperaturabhängigen Fluores¬ zenzverlaufes (6 und 7) .
Figur 10
Die Figur 10 beschreibt den schematischen Temperaturver¬ lauf und die zugehörigen Einzelschritte bei dem erfin¬ dungsgemäßen Verfahren. Im oberen Teil der Figur iεt der Ablauf der Analyse mit der PCR Technik dargestellt, im unteren Teil der Figur der Verlauf bei einer Amplifikation bei homogener Temperatur (37'C) , z. B. bei der 3SR- Technik (siehe unten) .
1) Zusatz der biologischen Probe zum lyophilisierten Amplifikationsansatz und Verschweißen des Reaktions¬ kompartimentes.
2) Amplifikation bei homogener Temperatur oder mit Tem¬ peraturprogrammen (PCR) .
3) Zumischen der markierten Sonde(n) im Hybridisierungs- puffer.
4) Denaturierungsschritt bei 98°C.
5) Sondenreasεoziation mit der amplifizierten DNA.
6) Zeitlicher Temperaturgradient mit optiεcher On- Line-Kontrolle.
Figur 11
Die Figur 11 zeigt schematisch eine mögliche Auεführungs- for deε erfindungsgemäßen Verfahrens für die automati- εierte Analyse von Großserien. Zum Testkit gehören die Folienbestandteile mit den lagerfähigen und gebrauchs¬ fertigen Reagenzien. Die Balkenkodierung erlaubt eine Definition des Assay-Typs sowie der Belegung der Positionen. Der beschreibbare Magnetstreifen steht dann den Proben-spezifischen Daten zur Verfügung. Die Test¬ folien können nach der Analyse ohne öffnen entsorgt oder für eventuelle weitere Analyεen archiviert werden.
Figur 12
Die schematische Darstellung erläutert eine spezielle Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein zur Amplifikation verwendeter Primer ist oberflächenfixiert, z.B. an magnetischen Partikeln (magneto beads) . Magneto beads lassen sich zu Zwecken der Amplifikation und Hybri¬ disierung mit Hilfe eines Magnetfeldes in Form einer Suspension halten, zum Zwecke der Laser-Fluoreszenz-Beo¬ bachtung während des Temperaturgradienten-induzierten Dissoziationsprozesses jedoch der Lösung entziehen und an einem definierten Ort fixieren. So läßt sich der Laser¬ strahl direkt auf die Partikeloberfläche richten und gezielt die Fluoreszenz beim Abdissoziieren der Sonde verfolgen. Dieser Prozeεε gelingt z. B. bei Verwendung einer einzigen Schmelzdomäne und ermöglicht den Einsatz oligo erer, nicht-interkalierender Fluoreszenzfarbstoffe als optische Marker.
Reaktion und Analyse können in einem einzigen Reaktions¬ kompartiment durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ein Mikrotiter-Format gewählt, das es erlaubt, simultan 96 Proben oder Anteile von 96 Proben (8er oder 16er Strips) einer Analytik zu unterziehen. Das Reaktionsgefäß ist so konstruiert, daß es vorzugsweiεe Volumina von 20 - 100 μl trägt. Anεtelle einzelner Reaktionsgefäße werden vorzugs- weiεe Folien verwendet, die Vertiefungen oder Aus¬ buchtungen aufweisen, in denen die Proben aufgenommen werden. An sich bekannte Folien (PCT/EP 89/01320, PCT/EP 89/01387, PCT/DE 91/0082, PCT/DE 91/00081, PCT/DE 91/00083) , eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere, da sie beεonderε effizient thermoεtatierbar sind, billig in der Herstellung und problemlos in der umweltverträglichen Entsorgung. Die Verwendung optisch klarer Folien für den Bereich des sichtbaren Lichtes er¬ laubt eine On-Line-Registrierung von Fluoreεzenz-Signalen handelεüblicher Fluroeszenz-Farbstoffe.
Die Folien laεsen sich mit den allgemein benötigten Rea¬ genzien befüllen (Enzyme, Primer, Puffer, Stabilisatoren etc.) und im lyophilisierten Zustand über lange Zeiträume konservieren. Als Stabilisatoren werden vorzugsweise Tre- haloεe oder Saccharoεe eingeεetzt. Die εeriell angeord¬ neten Reaktionsgefäße lassen sich nach Hinzufügen der zu analysierenden Proben hermetiεch verschließen. Dieses kann durch Verschmelzen einer Deckfolie mit der Re- aktionskompartiment-tragenden Folie geschehen. Es lasεen sich auch solche Folien verwerten, die mit einem thermo- plaεtiεchen Polymer beεchichtet sind und sich unterhalb der Schmelztemperatur der eigentlichen Trägerfolien ver¬ schweißen lassen. Im Deckelbereich der Trägerfolie, ober¬ halb der Reaktionskompartimente, lassen sich Reagenzien fixieren oder kompartimentieren, die nicht von Anfang an am Reaktionsgeεchehen teilnehmen sollen. Dieε iεt im erfindungεgemäßen Falle z. B. die εpezifisch markierte Sonde, die in einem Puffergemisch lyophilisiert und εtabiliεiert wird, daε nach erfolgter Amplifikations¬ reaktion für die Hybridisierung vom Amplifikationsprodukt und markierter Sonde benötigt wird. Nach Verschweißen der Reaktionskompartimente findet die Amplifikationsreaktion bei homogener Temperatur (3 SR, Self-suεtained Sequence Replication; TAS, Tranεcription baεed amplification system) (J.C. Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. 87, 1874-1878; Kwoh, D.Y., Davis, G.R. , Whitfield, K.M., Chapelle, H.L. , Dimichele, L.J. & Gingeras, T.R. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 1173-1177) oder im Thermocycler als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) statt. In diesem Schritt werden Standard und Template im konstanten Verhältniε amplifiziert, εo daß das Reaktions¬ endprodukt ca. 100 ng bis l μg amplifizierte Nukleinsäure enthält.
In einer möglichen, technisch sehr einfachen Ausführungs- form (Figur 2) , befindet sich im Reaktionskompartiment ein gelöster Lumineszenz-, vorzugsweise ein Fluoreszenz¬ farbstoff, vorzugsweise mit interkalierenden Eigenschaf¬ ten (siehe unten) , der an mehreren Positionen in doppel- helikalen Strukturen bindet und im gebundenen Zustand veränderte spektroskopische Eigenschaften besitzt. Wenn bei der späteren Analyse im zeitlichen Temperaturgradien¬ ten die entsprechenden DoppelStrangstrukturen denaturiert werden, wird der Farbstoff wieder freigesetzt. Dieser Vorgang wird spektroskopisch registriert. Eine notwendige Bedingung für diese Verfahrensweiεe ist jedoch, die Kon¬ zentration des freien Farbstoffeε so zu wählen, daß sie größer ist als die Anzahl der freien Bindungsplätze. Andererseits führt eine Freisetzung des Farbstoffes aus einer Doppelstrangregion zur Bindung in einer anderen Struktur, ohne Änderung des Fluoreszenzsignales.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die wäßrige Lösung des Reaktionskompartimentes mit einer vorzugsweise an der Verschlußfolie kompartimentiert gelagerten Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonde unter Lösen der Sonde in Kontakt gebracht (Figuren 3 und 4) . Nach De¬ naturierung und Renaturierung wird die Sonde fluoreszenz- spektroskopisch verfolgt. Bei tiefen Temperaturen be- findet sich die Sonde im Doppelstrang-Hybrid mit ampli- fiziertem Standard (Homoduplex) und amplifiziertem Template (Heteroduplex) . Nun wird das Reaktionskomparti¬ ment zeitlich, vorzugsweise linear aufgeheizt, wobei zu¬ nächst der Heteroduplex partiell oder vollständig de¬ naturiert und anschließend der Homoduplex partiell oder vollständig denaturiert. Aus dem relativen Verhältnis der Denaturierungssignale, gemessen über die Stufen der Fluoreszenzabnahmen (Figuren 9a bis 9e) , läßt sich exakt der Template-Titer kalkulieren.
Als Denaturierungssignal wird vorzugεweise ein Fluores- zenzmarker verwandt. Insbesondere eignen sich hierzu Fluoreszenzfarbεtoffe, die die Eigenεchaft besitzen, nur dann stark zu fluoreszieren, wenn sie zwischen den Basenpaaren eingelagert werden (Interkalation) . Wenn εolche Farbεtoffe auε einer Doppelhelix infolge eines Denaturierungsprozesses freigesetzt werden, so läßt sich daε an einer Veränderung der Fluoreszenzintensität registrieren (Fluoreszenzabfall) . Haben Doppelhelices unterεchiedliche Stabilität wie im Falle von Homoduplex und Heteroduplex, dann finden diese Signaländerungen bei unterschiedlichen Temperaturen statt und lassen sich getrennt analysieren und auswerten. Die exakte De- naturierungεtemperatur reflektiert darüberhinaus mögliche Sequenzunterschiede als Indikator für sogenannte Virusdrifts, die infolge von Mutation auftreten können.
Interkalierende Farbstoffe besitzen • gelegentlich eine weitere günstige Eigenschaft, die sich auf die Halbwert¬ zeit des angeregten Zustandes bezieht. Im Falle von Ethidiu bromid ist die Lebensdauer des Anregungεzustandes mehr als 10 x länger, wenn sich das Fluoreszenzmolekül im interkalierten Zustand befindet. Dadurch läßt sich eine getaktete Laseranregung verwenden, wobei die Fluoreεzenz- intenεität in der nachfolgenden Phase der Fluoreszenz- emission ohne Streulicht-Einflüsse des Anregungslichtes gemessen werden können. Es ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, Farbstoffe wie Ethidiumbromid vorzugs¬ weise in niedriger Konzentration (vorzugsweise 10 bis
-7 10 M) zu verwenden.
Außer der direkten Messung einer Fluoreszenzintensität läßt sich auch erfindungsgemäß ein sogenannter Förster- Transfer (Energy-Transfer) zwischen eng benachbarten Fluorophoren oder der Parameter der Fluoreszenzpolari¬ sation verwenden.
Eine hohe Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens wird erzielt, wenn eine Sonde verwendet wird, die kova- lent mit einem oder mehreren Farbstoffmolekülen verknüpft ist (Figur 4) . Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß ein Primer zur Herstellung der Sonde verwendet wird, der endständig oder intern mindestens ein Farbstoffmole¬ kül trägt. Nur wenn sich die Sonde im Zustand der Basen¬ paarung des Homoduplex oder Heteroduplex befindet, erhält man eine maximale Fluoreszenzintensität des Doppelstrang- interkalierten Fluoreszenzfarbstoffes. Die Fluoreszenz¬ intensität der parallel geführten Reaktionsansätze kann simultan mit Hilfe einer Kamera erfaßt werden. Die Einzelauswertung der Kanäle ergibt einen Fluoreszenzver¬ lauf, wie er typisch in Figur 9 dargestellt ist. Die relative Höhe der Fluoreszenzänderungen kann über einen On-Line angeschlosεenen Computer direkt in Kopienzahlen umgerechnet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens wird die Reaktion innerhalb des Komparti entes teilweise Festphasenträger-gekoppelt durchgeführt (Figur 12) . Der Vorteil dieser Vorgehens¬ weise ist darin begründet, daß sich mit Hilfe einer Laser-Optik gezielt die Oberfläche eines Festphasenträ¬ gers, oder alternativ die Lösung ohne den Festphaεenträ- ger, vermessen läßt. Das bedeutet für die praktische Durchführung, daß ein Fluoreszenzfarbstoff Verwendung finden kann, der nicht notwendigerweise seine meßbaren Parameter über Interkalation verändert. Somit können Sonden mit beliebigen, oligo eren Farbstoffen verwendet werden, mit denen eine mehr als zehnfache Steigerung der Fluoreszenzintenεität erreicht werden kann. Der thermiεch induzierte Denaturierungsprozesε (εiehe oben) kann dann verfolgt werden, indem die Diεsoziation der Sonde von Oberflächen-gebundenen, amplifizierten Nukleinsäuren (Probe und Standard) in die freie Lösung über die Abnahme der Fluoreszenz gemesεen wird (Verdünnungεeffekt) . Dieses Vorgehen ist auf solche Analysen beschränkt, bei denen die zur Standardisierung herangezogene Doppelstrangregion in der thermodynamisch stabilεten Schmelzregion der Nukleinεäure liegt, oder bei Sonden, die nur eine Schmelzregion aufweisen.
Auf einen Zusatz einer markierten Sonde nach erfolgter Amplifikation kann verzichtet werden, wenn die Sonde auf¬ grund bestimmter Eigenschaften und Prozessführung der Amplifikation nicht am Amplifikationsgeschehen teilnehmen kann. Das kann erfindungsgemäß erreicht werden, wenn die Sonde in einer thermodynamisch stabilen Doppelstrang¬ struktur vorliegt, die während des Amplifikationspro- zesses stabil bleibt und nicht am Reaktionsgeschehen teil¬ nimmt. Es lasεen εich z.B. markierte RNA-Doppelheliceε hoher thermodynamiεcher Stabilität oder chemisch modi¬ fizierte Sonden einsetzen. Auf diese Weise läßt sich der Amplifikationsprozess εo εteuern, daß die Sonde bei der Amplifikationsreaktion immer doppelεträngig bleibt und am Amplifikationsgeεchehen nicht teilnimmt, εei eε, daß die Denaturierungεtemperatur nicht ausreichend ist oder die beteiligten Enzyme doppelεträngige RNA oder die modifi¬ zierte Sonde nicht amplifizieren.
Amplifikationεtechniken bergen die große Gefahr in εich, daß nach erfolgter Amplifikation, amplifizierte DNA- oder RNA-Moleküle in die Umgebung austreten können. Besondere Gefahr iεt immer durch Aerosolbildung gegeben, die technisch nur schwer zu beherrschen ist. Das erfindungs¬ gemäße Verfahren erlaubt es jedoch in seiner besonderen Ausführung, Amplifikationsreaktionen und Analytik am her¬ metisch geschlossenen Reaktionsgefäß durchzuführen und dieses anschließend im geschlossenen Zustand zu ent¬ sorgen. Damit wird ein ganz entscheidender Beitrag zur molekularen Laborhygiene und für die Sicherheit der Er¬ gebnisse einer Routinediagnostik geleistet.
Eine Routinediagnostik ist unmittelbar mit der Notwendig¬ keit einer Archivierung der Ergebnisse und - nach Möglichkeit - der analysierten Proben verbunden. Daε erfindungsgemäße Verfahren bietet hier wiederum eine nahezu ideale Möglichkeit:
Die Folien lassen sich mit Test-spezifischer Strich¬ markierung ausεtatten und somit bezüglich Zieltest, Herstelldatum, Verfallsdatum etc. charakterisieren und datenmäßig erfassen.
Die Folien lassen sich im hermetisch verschlossenen Zustand über lange Zeiräume archiviert lagern.
Analysen lassen sich zu späteren Zeitpunkten wieder¬ holen und überprüfen.
Liefert die erfindungsgemäße Analysenmethode Indi¬ zien für das Vorliegen neuer interessanter DNA/RNA- Varianten, läßt sich das Probengemisch entnehmen und direkt auf dem flächigen Temperatur-Gelelektropho¬ rese-Trennsystem präparativ auftrennen und z.B. einer Sequenzanalyse unterziehen. Die Temperaturgradienten-Gelelektrophorese hatte für kleinere Serien ihre Zuverlässigkeit für eine quantita¬ tive -Amplifikationεanalytik gezeigt. Bei dieser Technik werden vorzugsweiεe solche PCR-Amplifikate verwendet, die G:C-reiche, primer-kodierte Sequenzen am stabileren Frag¬ mentende tragen. Diese sogenannten G:C-Klammern garan¬ tieren den für eine Temperatur-Gelelektrophorese-Analyse notwendigen reversiblen Schmelzverlauf und unterdrücken eine vorschnelle Dissoziation der Fragmente in die Ein¬ zelstränge. Für eine Vielzahl von Analysen mit tempera¬ turabhängiger Gelelektrophorese werden G:C-Klammern, die kostεpielig im Einεatz sind und bei der Amplifikation Schwierigkeiten verursachen können, nicht mehr erforder¬ lich sein. Die sequentielle Freisetzung der Fluoreszenz¬ farbstoffe in einem Assay kann durchaus irreversibel er¬ folgen, ohne daß das Ergebniε verfälεcht wird.
Daε erfindungsgemäße Verfahren hat beträchtliche wirt¬ schaftliche Bedeutung, sowohl für die wirtschaftlichere Herstellung von Testkits, als auch in Bezug auf die Durchführungskosten der Analytik. Die Durchführung ist fast vollständig automatisierbar, wobei daε Ergebniε der Analyse in Form eines Hard-Copy-Berichtes ausdruckbar ist. Damit ist die TESGA-Technik nicht nur auf den Einsatz für kostεpielige, quantifizierende Analyεen großer Wertεchöpfung beschränkt, sondern auch einsetzbar für preiswerte Analyεen. Das betrifft z.B. den Bereich der Mikrobiologie, Humangenetik, Phytoanalytik, fo¬ rensische Analytik und die industrielle Forschung wie z.B. die Wirkstofforεchung, das heißt Reihenuntersuchun¬ gen von Zielsubstanzen auf Wirkεtoffe, die über DNA- oder RNA-Amplifikation oder -Modifikation bewertet werden können biε hin zu einfachen Toxizitätstests.
Das erfindungsgemäße Verfahren mit seinen vorteilhaften Eigenschaften wie PCR/3SR/TAS-Amplifikationεeffizienz Eignung für Reihen- und Einzelunterεuchungen On-Line-Regiεtrierung simultane Nukleinsäuren - Qualifizierung/Quantifi¬ zierung
Eintopf-Mehrkomponenten Analyse
Wegfall der Kontaminationsgefahr durch Amplifikate Niedrigkosten der Testreagenzien und Testdurchführung allgemein gültige - keine Test-spezifischen - Ver¬ fahrensprotokolle
erlaubt neue Einsatzmöglichkeiten der Amplifikations- techniken wie PCR, 3SR oder TAS.
In der genetischen Analytik wird auf längere Sicht ein Screening-Programm angestrebt, mit dem es beispielsweise möglich ist, aus Spuren von Biopsie-Material oder Frucht- wasserproben schwere genetische Erkrankungen nachzuweisen. Die Kostenbelastung für großflächige Programme ist hier¬ bei ebenso eine entscheidende Restriktion wie die Tat¬ sache, daß nur in den seltensten Fällen eine Analyse eines einzigen Genlocus ausreichend ist. Aussagen über das Überträgerpotential zuzulassen. Für die häufigste letale Erberkrankung in der kaukasischen Bevölkerung, der Cystischen Fibröse, sind neben der zunächst gefun¬ denen Mutation (Delta 508) mehr als 18 weitere Mutationen beschrieben worden, die die Mukoviscidose auslösen können. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt bei niedrigem zusätzlichen Kostenaufwand, eine große Anzahl von loci parallel zu analysieren und bei Bedarf - ohne großen Zusatzaufwand - weitere Testpositionen hinzuzu¬ nehmen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt bei¬ spielsweise auch die Untersuchung von Punktmutationen, die für bestimmte genetische Erkrankungen verantwortlich sind. Solche Erkrankungen können bislang nur mit der sehr schwer handhabbaren Allel-spezifischen Oligonukleotid- Hybridisierungstechnik (ASO) diagnostiziert werden. Ähnlich bedeutungsvoll ist die Technologie für Thalaεεä ie Screeningε.
Damit wird deutlich, daß daε erfindungεgemäße Verfahren auch die bisherigen Methoden zum Aufspüren von definier¬ ten Mutationen vereinfachen und erheblich kostengünstiger gestalten kann. Anstelle einer künstlich eingeführten Mutation, kann zur Normierung oder Standardisierung die gesuchte, natürlich auftretende Mutante eingesetzt wer¬ den, bzw. alε Sonde verwandt werden. Somit kommen zur Durchführung deε erfindungεgemäßen Verfahrens alle die¬ jenigen Aεsayε in Betracht, die z.B. mit differentiellen Oligonukleotid-Hybridiεierungen als Filterassayε durch¬ geführt werden.
Epidemiologiεche Studien bei Infektions- und Erber¬ krankungen werden für die internationale Medizin zu einem immer wichtigeren Aufgabengebiet. Erinnert sei an die beängεtigende Auεbreitungsgeschwindigkeit moderner viraler Erkrankungen wie AIDS (HIV) , bedingt durch die veränderten soziobiologischen Strukturen. Eine ent¬ scheidende Voraussetzung für Vaccinierungs- und Therapie- anεätze iεt eine möglichεt umfassende und sorgfältige epidemiologische Erfassung des Ist-Zustandes mit epi¬ demiologisch-prognostischer Bedeutung. Dies betrifft nicht nur das Auftreten des Virus εelbεt, εondern auch die geografiεche Verteilung seines Variantenspektrumε mit einer datenmäßigen Erfassung der Krankheitssymptomatik. Solche Studien werden erst durch eine ausεagefähige auto¬ matisierte Analytik wirtschaftlich vertretbar.
Die Pharmaforschung stößt seit geraumer Zeit an die Grenzen der Machbarkeit auf ihren angestammten Aktivi¬ tätsfeldern. Es gibt viele Versuche, den offensichtlichen Beschränkungen herkömmlicher Pharmaforschung durch neue Konzeptionen zu begegnen. Angeführt εei daε Beiεpiel des strategiεch-intelligenten Wirkεtoffdeεign, das es er- lauben soll, auf der Basis fundierten Wissens über eine Zielstruktur wie der eines Rezeptors, Effektormoleküle mit vorberechneter Struktur gezielt zu synthetisieren und somit herkömmliche Screening Methoden zu ersetzen. Eine zweite zukunftsträchtige Strategie ist die evolutive Biotechnologie mit ihrem Potential, unter Ausnutzung evolutiver Systeme, Stoffe mit erwünschtem Wirkpotential zu generieren. In der Pharmaforschung der Zukunft müssen aus Kostengründen alε auch projektbedingt perεonal- intenεive, randomisierte Syntheseprogramme vermieden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann hierbei einen wichti¬ gen Beitrag leisten. Die Tauglichkeit für Reihenunter¬ suchungen mit quantifizierenden DNA/RNA-Tests bei niedrigen Kosten erlaubt es, neue Tests für automati¬ siertes Aufspüren von Wirkstoffen in der Onkologie, bei viralen und bakteriellen Infektionen sowie Testε für toxikologische Studien aufzubauen. Es werden neue Aεεay- Systeme in Kombination mit zellulären in vitro-Syεtemen denkbar, die mehr und mehr Tiermodelle ersetzen werden. Dabei darf auch nicht vergessen werden, daß Kulti- vierungs- und Testzeiten erheblich verkürzt werden, da z. B. Variationen auf dem mRNA-Level unmittelbar erfaßt werden, ohne daß langwierig zelluläre Folgereaktionen gemessen werden müssen. Für eine Reihe von Assays könnte es möglich werden, transformierte Zellkulturen durch Primärkulturen z. B. aus Blut zu ersetzen. Die gleich¬ zeitige hohe Sensitivität würde es auch erlauben, Differenzierungsparameter zu registrieren, um Zelltyp- spezifische Wirkungen zu messen. Gedacht ist z.B. an bestimmte Leukozyten-Subpopulationen (Makrophagen, T4- Zellen etc.) mit ihren charakteristischen Rezeptor¬ funktionen und Infizierbarkeiten mit Viren wie HIV.
Biologische Experimente mit rekombinanten Systemen, ins¬ besondere Freisetzungsexperimente verlangen sowohl von wissenschaftlicher Seite als auch von seiten des Umwelt- schutzes nach einer sorgfältigen Analytik von Genen, der Erfassung der Genperεistenz in Populationen, Genver¬ änderungen und Genaktivitäten. Als Beispiel seien anti- virale Therapien bei Pflanzen genannt, bei denen versucht wird, Virusreεiεtenz gegen bestimmte Viren dadurch zu erzeugen, daß transgene Pflanzen konstruiert werden, die virale Hüllproteine erzeugen und so die Pflanzen vor Be¬ fall mit einem Fremdvirus schützen. Ein Freisetzungεex- periment oder ein Einkreuzen in natürlich vorkommende Populationen setzt ein genaues Wissen voraus, zum Bei¬ spiel:
Wie ist das Segregationsverhalten der rekombinanten
Pflanzen bezüglich des rekombinanten Locuε?
Wie aktiv εind die Hüllprotein-Gene bezogen auf die
Population und die Generationszahl?
Wie reagiert der virale Zielorganismus auf den neuen
Selektionsεtreß?
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht hier Reihen¬ untersuchungen und insbesondere die Erfassung von Proben¬ kollektiven in einem einzigen Test, um quantitative Aus¬ sagen über Populationen zu erhalten. Gleichzeitig werden Drift-Phänomene bei Resiεtenzbildung verfolgbar.
Mikrobiologische Tests der Bakteriologie werden tra¬ ditionsgemäß durch Kultivierung oder direkte Dot-Hybridi- sierung durchgeführt. Solche Tests waren bislang durch ausεagefähigere Teεtε kaum zu verdrängen, allein bedingt durch den Koεtenaεpekt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann diese Situation vollständig verändern. Es εtellt bei diesem Verfahren keinen entscheidenden Kostenfaktor dar, wenn eine Probe simultan auf mehrere Erreger gleichzeitig getestet werden muß oder wenn ein Erreger in einem Antibiogramm analysiert werden muß. Der letzgenannte Analysentyp kann insbeεondere bei viro- logischen Analysen eine große Rolle spielen, wenn Virus¬ resistenzen ausgetestet werden müsεen bzw. quantifizierend erfaßt werden müεsen. Für die Virologie ist das erfin¬ dungsgemäße Verfahren vorteilhaft, da es eine stark ver¬ einfachte Analytik durch eine kostengünstige und aufwand¬ reduzierte Kopplung von Anzucht- und Testverfahren einer Viruspropagation erlaubt.
In der Nahrungsmittelindustrie wurden in erster Linie umfangreiche Kontrollen zur Untersuchung von einigen be¬ stimmten mikrobiologischen Erregerklassen durchgeführt, jedoch ausgehend von einer Vielzahl von Probenmaterialien der Ausgangsprodukte, der Verfahrensschritte, des appara¬ tiven Containments und der Endprodukte. Ähnlich wie in der Pharmaindustrie werden bei der Verarbeitung Großan¬ sätze von erheblichem ökonomischen Wert bearbeitet. Die Minimierung der Analysendauer verbunden mit einer zuver¬ lässigen Testaussage stellt hierbei einen kritischen Faktor dar. Zum Beispiel erfordern Salmonellentests häufig langwierige Anzüchtungsverfahren der Krankheits¬ erreger. Das erfindungsgemäße Verfahren bewirkt mit seinen auch quantitativen Aussagen in Reihenuntersuchun¬ gen einen Verzicht auf Anzuchtverfahren und erspart kost¬ spielige Prozessführungsschritte und Lagerungen.
Phytopathologische Analysen sind oft prohibitiv teuer. Selbst wenn in der Regel nur repräsentative Proben¬ kollektive von Saatgut oder Zier- und Nutzpflanzen der Analyse beispielsweise auf Viruεbefall zugeführt werden, so ließ die Anzahl der Proben aus Kostengründen bislang fast ausschließlich immunologische ELISA-Verfahren zu, die häufig nicht oder nur unzureichend funktionieren. Die Phytoanalytik bedarf also anderer Analysenkonzepte, um dem Bedarf gerecht zu werden. Diese Konzepte werden durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt. Nachdem nun erstmals RNA-Para eter gefunden worden εind, die eine exakte Wald-Schadensanalyse zulassen (Riesner et al., in Vorbereitung), läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein umfangreiches Programm zur Erfassung und der zeitlichen und geographischen Ausbreitung von Wald¬ schäden konzipieren.
Die Molekularbiologische Forschung bemüht sich in steigendem Maße um Analysenverfahren, die Serientaug¬ lichkeit haben, um beiεpielεweiεe das sogenannte HUGO- Projekt zur vollständigen Sequenzaufklärung des humanen Genoms sowie der Genome anderer wichtiger Organiεmen erfolgreich durchführen zu können. In Zukunft wird eε bei dieεem Projekt nicht nur darum gehen, ein εinguläres Genom vollεtändig zu analyεieren, εondern auch beεtimmte Loci mit krankheitsbezogenem Potential zu analysieren, wie es vergleichbar bei Identitätsuntersuchungen not¬ wendig ist (HLA-Analytik, Haplotyp-Aεsoziation, genetische Variabilität etc.).
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auf DNA Ebene (amplifizierte loci, Gendosiε) und auf mRNA Ebene Ex- pressionεoptimierungen, Promoterkontrolle etc. zu ver¬ folgen und im Sσreening von Mutageneεeverfahren einzu¬ setzen. Dieses Verfahren erweist sich hierbei als eine wichtige Komplementärtechnik zum "cell sorting".

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Be¬ stimmung von mindestens einer in vitro-amplifizier¬ ten Nukleinsäure in einem verschloεsenen Reaktions¬ raum, wobei während oder nach der Amplifizierung der Nukleinsäure mindestens eine Substanz (Sonde) vorhanden ist, die mit der nachzuweisenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, wobei spektroskopiεch meßbare Parameter der Substanz (Sonde) eine Änderung erfahren und dabei ein meßbares Signal erzeugt wird, die zu messende Probe der Einwirkung eines Gradienten ausgeεetzt wird, der Nukleinsäuren mindestens teilweise denaturieren kann unter Erfassung des sich durch die Einwirkung des Gradienten ändernden meßbaren Parameters und die gesamte Amplifikationsreaktion einschlie߬ lich der qualitativen und quantitativen Be¬ stimmung in einem verschlossenen Reaktionsraum (Meßkompartiment) ohne zwischenzeitliche Öffnung durchführbar ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde, deren spektroskopisch meßbarer Parameter mindestens ein Lumineszenz oder Fluoreszenzfarbstoff ist, einen Nukleinsäureanteil enthält und dessen Wechselwirkung mit den in vitro-amplifizierten Nukleinsäuren in Abhängigkeit des Denaturierungεzuεtandes mit einer Änderung des spektroskopischen Meßsignals einher¬ geht, vorzugsweise durch Interkalation des Färb- Stoffes in die Nukleinsäuredoppelhelix oder durch Verdünnungs- oder Konzentrierungseffekt in dem Meßkompartiment.
3. Verfahren gemäß mindeεtenε einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei ein Denaturierungsprozeεs über eine Änderung der Wellenlänge und/oder einen Lumineszenz bzw. Fluoreszenzintensitätεεhift und/oder Fluoreε- zenzpolarisationsänderung und/oder eine Änderung der Lebenszeit eines angeregten Zustandes oder über das Prinzip des sogenannten "Energy Tranεfer" oder über einen Konzentrationseffekt erfaßt wird.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Re¬ aktionsraum mehrere, spektroεkopiεch voneinander unterscheidbare Farbstoffe eingesetzt werden, mit denen εich verschiedene amplifizierte Nukleinsäuren analysieren lassen und/oder über die mindestenε eine unabhängige Eichsubstanz eingeführbar ist.
5. Verfahren gemäß mindestenε einem der Anεprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lumineszenz, ins¬ besondere Fluoreszenz der Farbstoffe durch einen Laser kontinuierlich oder getaktet angeregt wird.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
5, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierten Nukleinsäuren mindestens einen koamplifizierten Nukleinsäure-Standard enthalten, dessen Sequenz zu einer zu bestimmenden Sequenz homolog ist, vorzugs¬ weise identisch mit Ausnahme mindestens einer Punkt¬ mutation, die vorzugsweise in einem Sequenzbereich niedrigster Stabilität liegt, jedoch außerhalb der primer-Bindungεεtellen bei enzymatischer Amplifi¬ kation.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierten Nukleinsäuren mindestens einen koamplifizierten Nukleinsäurestandard enthalten, deεsen Sequenz mindestens in den Primer-Regionen absolut homolog ist, ansonsten jedoch die Sequenz des Nukleinsäure- standards von der Sequenz der amplifizierten Nukleinsäure in mehr als einer Position abweicht.
8. Verfahren gemäß mindestenε einem der Ansprüche 1 bis
7, dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleinsäure Standard teilweise selbst ein natürlicher Bestand¬ teil der zu analysierenden Nukleinsäure ist.
9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
8, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation in homogener Phase oder mit einem Festphasenträger ge¬ koppelten Primer durchgeführt wird, an dessen ver¬ längerter Sequenz die markierte Sonde hybridisieren kann und deren Konzentration und/oder Konformation somit entweder gezielt auf dem Festphasenträger oder in der freien Lösung bestimmt werden kann.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Fluoreszenzfarbεtoff an ein Nukleinsäuremolekül ge¬ koppelt ist, dessen Sequenz identisch oder homolog mit der nachzuweisenden Nukleinsäure oder dem ko¬ amplifizierten Nukleinsäure-Standard ist.
11. Verfahren gemäß mindeεtenε einem der Ansprüche 1 bis
10, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzfarb- stoff-gekoppelte Nukleinsäuremolekül dem Reaktionε- gemisch nach erfolgter Amplifikation zugesetzt wird, wobei die Hybridisierung mit den amplifizierten Nu¬ kleinsäuren durch einen thermischen Denaturierungs- schritt mit nachfolgendem Renaturierungsschritt er¬ folgt.
12. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluores- zenzfarbεtoff-gekoppelte Nukleinsäuremolekül dem Re- aktionsgemisch vor erfolgter Amplifikation zugesetzt wird, wobei die Sonde als nicht amplifizierbare Doppelεtrang-RNA oder alε nicht amplifizierbare chemisch modifizierte Nukleinsäure zugesetzt wird.
13. Verfahren gemäß mindeεtenε einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Amplifikation vorzugsweiεe ein Primer eines Primerpaares verwendet wird, der 5'-terminal eine G:C-reiche Region kodiert von vorzugsweiεe 15 bis 20 G:C - Resten.
14. Verfahren gemäß mindestenε einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Bestimmung verwendete Sonde ein Oligo- oder Polynukleotid ist, welcheε mindeεtens zwei chemische Strukturelemente aufweist, die in der Lage εind elektromagnetiεche Wellen zu absorbieren und/oder aufgrund einer An¬ regung zu emittieren und wobei eineε der Struktur¬ elemente durch Einfluß elektromagnetiεcher Wellen eine dauerhafte Bindung zu einer anderen Poεition deε Oligo- oder Polynukleotids zu knüpfen oder zu lösen vermag.
15. Verfahren nach Anεpruch 14, wobei daε eine elektro¬ magnetiεche Welle abεorbierende und/oder emittieren¬ de Strukturelement ein chromophores System aufweist.
16. Verfahren nach Anεpruch 15, wobei das chromophore System Farbstoffsubstituent lu inesziert.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das unter elektromagnetischem Einfluß dauerhafte Bindungen knüpfende oder lösende Struk¬ turelement ein photochemischer Vernetzer ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der photochemische Vernetzer ein Psoralenderivat ist.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis
18, wobei der Abstand der Strukturelemente 8 bis 12, vorzugsweise 10, Nukleotidpositionen nicht unter¬ schreiten darf.
20. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
19, dadurch gekennzeichnet, daß Foliensysteme mit Vertiefungen oder Ausbuchtungen als Reaktionsräume verwendet werden, die thermisch verschweißbar sind und als Aufnahme für verwendungsfertige Reagenzien¬ gemische in lyophilisierter oder Matrix-gebundener Form dienen, sowie zur direkten optischen Vermessung geeignet sind.
21. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
20, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgelegten Reagenzien in räumlich getrennten Matrices gelagert werden und nach dem Schließen eines Reaktionsraumes zeitlich getrennt dem Reaktionsgeschehen zugeführt werden können.
22. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
21, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand der Reaktionsräume so gewählt ist, daß eine Auswertung mit kommerziellen Apparaturen, wie mikrotitrations- formatierten Geräten erfolgt.
23. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis
22, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurege- isch zur Analyse einem zeitlich gesteuerten Tem- peraturgradienten unterworfen wird mit vorzugsweise linearem Verlauf, wobei die Änderung des spektros- kopiεchen Para eterε alε Funktion der Zeit und/oder der Temperatur verfolgt wird.
24. Verfahren gemäß Anεpruch 23, wobei die Analyse der Konformation des Nukleinsäuregemisches mit Hilfe der Temperaturgelelektrophorese, einem chromato¬ graphischen Verfahren oder direkt in homogener Löεung oder in Kombination dieser Verfahren erfolgt.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23 und/oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Abhängigkeit des optischen Parameters mit der Temperatur und/oder der Zeit auf die Anwesenheit und/oder Anzahl und/oder Homologie einer gesuchten Nukleinsäure zum korrespondierenden Standard geschloεεen werden kann.
26. Verfahren gemäß mindeεtenε einem der Anεprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung der Daten on line durch ein Datenverarbeitungsystem er¬ folgt.
27. Oligo- oder Polynukleotid-Sonde zur Durchführung des Verfahrens nach mindeεtenε einem der Anεprüche 1 biε 26 mit mindeεtenε einem chemiεchen Strukturelement, das in der Lage ist mit elektromagnetischen Wellen unter Lösen oder Knüpfen dauerhafter Bindungen und/oder durch Absorption oder Emission von Strah¬ lung in Wechselwirkung zu treten und wobei dieseε Strukturelement nicht ein Purin- oder Pyrimidin- Substituent der natürlich vorkommenden Nukleotidbau- εteine darεtellt.
28. Sonde nach Anεpruch 27, wobei daε dauerhafte Bindun¬ gen zu knüpfen vermögende Strukturelement Pεoralen oder ein Pεoralenderivat iεt.
29. Sonde nach einem der Ansprüche 27 und/oder 28, wobei mindestens eineε der mit elektromagnetiεcher Strah¬ lung in Wechεelwirkung zu treten vermögende Strukturelement lumineεziert.
30. Sonde nach mindeεtens einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei der Abstand der Strukturelemente des Oligo- oder Polynukleotids mindestens 8 bis 12 Nukleotide beträgt.
31. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30, die eine rechnerge¬ steuerte, zeitabhängige Thermostatierung der Re¬ aktionskompartimente erlaubt.
32. Vorrichtung gemäß Anspruch 31, die eine optische Einheit enthält, wobei vorzugsweiεe ein Laser zur Anregung eingesetzt wird sowie eine optische De- tektionseinheit zur Registrierung des emittierten Fluoreszenzsignals.
33. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß min¬ destens einem der Ansprüche 1 bis 26, bestehend aus einem System von Reaktionskompartimenten, vorzugs¬ weise einem Foliensystem mit gebrauchsfertigen Reagenzien in lyophylisierter Form, wobei die Reaktionskompartimente vorzugsweise in der Mikro- titer-Dimensionierung angeordnet sind.
34. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß An¬ spruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Rea¬ genzien in mindestens einer wasserlöslichen Matrix fixiert und/oder gelagert werden.
35. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß An¬ spruch 33 und/oder 34 , wobei die Matrix Stabili- satoren enthält, vorzugsweise Zucker, insbesondere Trehaloεe oder Saccharoεe.
36. Mittel zur Durchführung deε Verfahrens gemäß min¬ destens einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei das Reaktionskompartiment und/oder weitere Reagenzien¬ reservoire Amplifikationsprimer, Pufferbestandteile, mindestens eine Polymerase und Kofaktoren enthält.
37. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei die Reaktionskom- partiment-verschließende Folie mindestens ein weiteres Reagenzienreservoir in einer Matrix ent¬ hält, wobei vorzugεweiεe dort die markierte Sonde mit den für die Hybridisierung notwendigen Rea¬ genzien gelagert ist.
38. Mittel gemäß mindestens einem der Ansprüche 33 bis 37 in Kit-Systemen zusammengestellt.
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