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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberWO1995001311 A1
Publication typeApplication
Application numberPCT/ES1994/000069
Publication dateJan 12, 1995
Filing dateJul 1, 1994
Priority dateJul 2, 1993
Publication numberPCT/1994/69, PCT/ES/1994/000069, PCT/ES/1994/00069, PCT/ES/94/000069, PCT/ES/94/00069, PCT/ES1994/000069, PCT/ES1994/00069, PCT/ES1994000069, PCT/ES199400069, PCT/ES94/000069, PCT/ES94/00069, PCT/ES94000069, PCT/ES9400069, WO 1995/001311 A1, WO 1995001311 A1, WO 1995001311A1, WO 9501311 A1, WO 9501311A1, WO-A1-1995001311, WO-A1-9501311, WO1995/001311A1, WO1995001311 A1, WO1995001311A1, WO9501311 A1, WO9501311A1
InventorsMARTIN José Luis RAMOS, LARRUBIA Guadalupe PIÑAR, Martin De Oliva Estrella Duque, Ali Haidour
ApplicantUnion Española De Explosivos S.A.
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: Patentscope, Espacenet
PROCESS FOR THE BIOLOGICAL ELIMINATION OF NITRATES AND/OR NITRITES USING STRAINS OF $i(KLEBSIELLA OXYTOCA)
WO 1995001311 A1
Abstract
Two new strains of Klebsiella oxytoca have been isolated, identified as K. oxytoca clone-15 and clone AH1, which are capable of using nitrates and/or nitrites as nitrogen source and, consequently may be used for the biological elimination of nitrates and/or nitrites contained in industrial effluents, waters and grounds contaminated by said substances, through a process which comprises the inoculation of cultures of said strains into said effluents, waters and grounds contaminated of cultures of said strains. The strain K. oxytoca clone-15 is capable of using, both in aerobic and anaerobic conditions, nitrates and/or nitrites present in a concentration up to 100 mM, whereas the strain K. oxytoca clone AH1 is capable of using, in aerobic conditions, nitrates present in a concentration up to 400 mM. The process applies to the elimination of nitrates and/or nitrites contained in industrial effluents, waters and grounds which have been contaminated.
Claims(9)  translated from Spanish
REIVINDICACIONES CLAIMS
1. Klebsiella oxytoca clón-15, depositada en la CECT con el n E de accesión CECT 4460, capaz de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de nitrógeno bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. 1. Klebsiella oxytoca-clone 15, deposited in the CECT with CECT Accession No E 4460, capable of using nitrate and / or nitrite as a source of nitrogen under aerobic or anaerobic conditions.
2. Klebsiella oxytoca clon AHÍ, depositada en la CECT con el n B de accesión CECT 4500, capaz de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de nitrógeno y etilenglicol como fuente de carbono bajo condiciones aeróbicas. 2. Klebsiella oxytoca AHÍ clone, deposited in the CECT with CECT Accession No B 4500, capable of using nitrate and / or nitrite as nitrogen source and ethylene glycol under carbon source aerobic conditions.
3. Procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales o en aguas contaminadas con dichos compuestos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) neutralizar el efluente o el agua contaminada a tratar; 3. Process for the biological elimination of nitrates and / or nitrites contained in industrial effluents or in water polluted with said compounds, characterized by comprising the steps of: a) neutralizing the effluent or polluted water to be treated; b) añadir los nutrientes necesarios para el funcionamiento óptimo del procedimiento; b) adding nutrients necessary for optimal operation of the procedure; c) inocular el efluente o el agua contaminada a tratar con un cultivo de alguno de los microorganismos citados en las reivindicaciones c) inoculating the effluent or polluted water to be treated with a culture of any of the microorganisms mentioned in the claims
1 ó 2 hasta la desaparición de los nitratos y/o nitritos contenidos en dichos efluente o agua contaminada; 1 or 2 until the disappearance of nitrates and / or nitrites contained in said effluent or polluted water; yd) retirar dichos microorganismos y verter los efluentes y las aguas depuradas. and d) removing said microorganisms and pour effluent and treated water.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el efluente a tratar es un efluente procedente de una fábrica productora de explosivos o de una fábrica que utilice o produzca nitratos y/o nitritos. 4. Method according to claim 3, characterized in that the effluent to be treated is an effluent from a factory producing explosives or factory use or produce nitrates and / or nitrites.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el efluente o el agua a tratar se neutraliza por adición de un álcali hasta alcanzar un pH comprendido entre 6.0 y 10.5, cuando se utilizan bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clón-15. 5. Method according to claim 3, wherein the effluent or treated water is neutralized by adding an alkali to a pH between 6.0 and 10.5, when bacteria are used strain Klebsiella oxytoca clone-15.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el efluente o el agua a tratar se neutraliza por adición de un álcali hasta alcanzar un pH comprendido entre 6.0 y 8.0, cuando se utilizan bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ. 6. Method according to claim 3, wherein the effluent or treated water is neutralized by adding an alkali to a pH between 6.0 and 8.0, when bacteria Klebsiella oxytoca strain used AHÍ clone.
Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque los microorganismos retirados, pueden ser reutilizados en un nuevo ciclo de tratamiento de efluentes o de aguas contaminadas. Method according to claim 3, characterized in that the microorganisms removed can be reused in a new cycle effluent treatment or contaminated water.
8. Procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en suelos superficiales contaminados con dichos compuestos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) efectuar una inyección primaria con un cultivo de los microorganismos de las reivindicaciones 8. Process for the biological elimination of nitrates and / or nitrites contained in surface soils contaminated with said compounds, characterized by comprising the steps of: a) performing a primary injection with a culture of microorganisms of the claims
1 ó 2 en el suelo a tratar; 1 or 2 in the soil to be treated; yb) efectuar inyecciones sucesivas de dichos microorganismos hasta que el suelo quede libre de nitratos y/o nitritos. b) make successive injections of these microorganisms until the soil is free of nitrates and / or nitrites.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el suelo a tratar se inyecta con dichos microorganismos hasta alcanzar una densidad del orden de 10 5 microorganismos por cm 2 de suelo. 9. Method according to claim 8, characterized in that the soil to be treated is injected with said microorganisms to a density of the order of May 10 organisms per cm 2 of soil.
Description  translated from Spanish

PROCEDIMIENTO PARA LA ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE NITRATOS Y/O NITRITOS UTILIZANDO CEPAS DE KT.KRHTTCT.T OXYTOCA PROCEDURE FOR REMOVING NITRATE BIOLOGICAL AND / OR USING STRAINS KT.KRHTTCT.T NITRITES oxytoca

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a nuevas cepas de Klebsiella oxytoca adecuadas para su empleo en un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos. FIELD OF THE INVENTION The invention relates to new strains of Klebsiella oxytoca suitable for use in a process for the biological elimination of nitrates and / or nitrites. En particular, la invención proporciona un procedimiento para la eliminación de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales o urbanos y en suelos, mediante el empleo de cepas de Klebsiella oxγtoca capaces de utilizar dichos compuestos como fuente de nitrógeno, evitando de esta manera la contaminación medioambiental producida por dichos compuestos. In particular, the invention provides a process for eliminating nitrates and / or nitrites contained in industrial or urban effluents and soil, by using Klebsiella oxγtoca capable of using such compounds as nitrogen source, thus avoiding the environmental pollution caused by these compounds.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

La industria en general, y en particular, la industria de explosivos fabrica grandes cantidades de diversos compuestos sustituidos con grupos nitro que se utilizan como explosivos y propelentes. The general, and in particular, the explosives industry manufactures large quantities of various compounds substituted with nitro groups used as explosives and propellants industry. Los efluentes de lavado de plantas de nitración de diversos compuestos contienen altas cantidades de nitratos y niveles detectables de nitritos, que si no se tratan de manera adecuada, constituyen una fuente de contaminación medioambiental por lo que deben ser eliminados ya que los primeros, a concentraciones moderadas, son tóxicos y los segundos, agentes mutagénicos, y, por tanto, agentes sospechosos de inducir cáncer. Effluent from washing plants nitration of various compounds contain high amounts of nitrates and detectable levels of nitrites, which if not treated properly, are a source of environmental pollution which must be eliminated as the first, at concentrations moderate, they are toxic and the latter, mutagens, and therefore, suspected cancer-inducing agents.

Los efluentes de fábricas de explosivos, especialmente de aquéllas productoras de 2,4,6- trinitrotolueno (TNT) , nitroetilenglicol y nitroglicerina, presentan bajos niveles de los nitroorgánicos mencionados y altos niveles de nitratos, amén de un pH ácido (valores entre 1 y 2). Effluents explosives factories, especially those producing 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and nitroglycerin nitroetilenglicol, have low levels of the aforementioned Nitro-and high levels of nitrates, in addition to an acid pH (values between 1 and 2). Los sistemas actuales de tratamiento de los efluentes procedentes de plantas de fabricación de explosivos incluyen fundamentalmente la neutralización de las aguas y la dilución al infinito de los mismos con agua. Current treatment systems effluents from explosives manufacturing plants primarily include the neutralization of the water and the infinite dilution thereof with water. Este tratamiento conlleva un problema de adición continuada de contaminantes a ríos, aguas subterráneas y suelos, por lo que no resulta adecuado. This treatment involves a problem of continued addition of pollutants to rivers, groundwater and soil, so it is not appropriate.

La microbiología en general y la biotecnología en particular, pueden ofrecer una alternativa biológica a la eliminación de nitratos y nitritos mediante la utilización de los mismos como fuente de N por microorganismos adecuados. Microbiology in general and biotechnology in particular can offer a biological alternative to the removal of nitrates and nitrites using them as a source of N by suitable microorganisms. Así, en varios estudios se recoge la posibilidad de tratar biológicamente efluentes que contienen nitratos. Thus, in several studies the possibility of treating biologically effluents containing nitrates is collected. Entre estos trabajos cabe destacar los siguientes: These works include the following:

Kaplan et al. Kaplan et al. (International Biodeterioration. 23 : 233-248 , 1987 ) utilizaron microorganismos no definidos lo cual genera problemas de reproducibilidad de tratamiento; (. International Biodeterioration 23: 233-248, 1987) used undefined microorganisms which creates problems of reproducibility of treatment; - Hensen Christensen y Harremoes {Prog. - Hensen Christensen and Harremoes {Prog. Wat . Wat. Tech . Tech. 8: 509-555, 1977 ) revisan el estado de la técnica en plantas de tratamientos con cargas bajas de nitrato; 8: 509-555, 1977) reviewed the state of the art in treatment plants with low loads nitrate; du Toit y Davies (Water Res . 7 : 489-500 , 1973 ) estudian la eliminación de nitratos en flujo continuo con residuos domésticos con baja carga de nitrato; du Toit and Davies (. Water Res 7: 489-500, 1973) study the nitrate removal in continuous flow with household waste with low nitrate load;

Hochstein y Tomlinson (Annu . Rev . Microbiol . 42: 231- 261 ) revisan el proceso de desnitrificación desde distintos puntos de vista; Hochstein and Tomlinson (... Annu Rev Microbiol 42: 231- 261) review the denitrification process from different points of view; y Y

Ye et al. Ye et al. (Applied Environmental Microbiology 59 : 250-254 , 1993 ) muestran la versatilidad de enzimas implicados en los procesos de desnitrificación. (Applied Environmental Microbiology 59: 250-254, 1993) show the versatility of enzymes involved in denitrification processes.

Sería conveniente, por tanto, disponer de microorganismos capaces de utilizar los nitratos y/o nitritos presentes en los efluentes de las plantas de fabricación de explosivos, como fuente de N, al objeto de efectuar una eliminación biológica de los mismos, superando los inconvenientes anteriormente citados y evitando de este modo los problemas medioambientales asociados con el vertido incontrolado de dichos efluentes o con su tratamiento inadecuado. It would be desirable, therefore, have microorganisms capable of using nitrates and / or nitrites present in the effluents from plants manufacturing explosives, as a source of N, in order to effect a biological removal thereof, overcoming the drawbacks above cited and thus avoiding the environmental problems associated with the uncontrolled dumping of such effluents or with inadequate treatment.

Por consiguiente, un objeto de esta invención lo constituye el aislamiento y caracterización de microorganismos capaces de eliminar nitratos y/o nitritos. Accordingly, an object of this invention is the isolation and characterization of microorganisms capable of removing nitrates and / or nitrites. Tales microorganismos, pertenecientes a dos cepas de Klebsiella oxytoca. Such microorganisms belonging to two strains of Klebsiella oxytoca. constituyen un objeto adicional de esta invención. constitute an additional object of this invention.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales, aguas residuales urbanas o suelos, mediante el empleo de los microorganismos proporcionados por esta invención. Another additional object of this invention is a process for the biological elimination of nitrates and / or nitrites contained in industrial effluents, soil or waste water, by using the microorganisms provided by this invention.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona nuevas cepas de Klebsiella oxytoca capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de nitrógeno, así como un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales, aguas residuales urbanas y suelos, mediante el empleo de las cepas de Klebsiella oxytoca proporcionadas por esta invención. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The invention provides novel strains of Klebsiella oxytoca able to use nitrates and / or nitrites as a nitrogen source and a process for the biological elimination of nitrates and / or nitrites contained in industrial effluent, waste water and soil , by using Klebsiella oxytoca strains provided by this invention.

A modo de resumen, la invención comprende, por una parte, el aislamiento y caracterización de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de N, y por otra, el empleo de los microorganismos aislados para la eliminación de nitratos y/o nitritos presentes en efluentes de plantas industriales, en aguas residuales urbanas y en suelos contaminados con dichos compuestos. To summarize, the invention comprises, on the one hand, the isolation and characterization of microorganisms capable of using nitrate and / or nitrite as a source of N, and otherwise, the use of microorganisms isolated for elimination of nitrates and / or nitrites present in effluents from industrial plants, urban waste water and soils contaminated with these compounds.

1. Aislamiento y caracterización de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos. 1. Isolation and characterization of microorganisms capable of using nitrate and / or nitrite. 1.1 Aislamiento 1.1 Isolation

Para el aislamiento de microorganismos capaces de utilizar nitrato como fuente de N se procedió del siguiente modo. For the isolation of microorganisms capable of using nitrate as a source of N he proceeded as follows. Una muestra de un suelo próximo a una planta generadora de efluentes cargados con nitratos se suspendió en un medio de cultivo mínimo del tipo M8 [el medio M8 es idéntico al medio M9 excepto en que se omite la fuente de nitrógeno (NH 4 C1)]. A sample of a soil near a generator effluent loaded with nitrate plant was suspended in a minimum culture medium of M8 [M8 medium is identical to M9 medium except that the nitrogen source (NH 4 C1) is omitted] . La composición del medio M9 se describe en Abril et al . M9 medium composition described in Abril et al. , Journal of Bacteriology , Vol . , Journal of Bacteriology, Vol. 171 , No. 12, págε . 171, No. 12, págε. 6782-6790, ( 1989 ) . 6782-6790, (1989). A dicha suspensión se añadió un volumen del agua efluente de la fábrica, rica en nitratos, y una cantidad adecuada de una fuente de C. Como fuente de C puede utilizarse un azúcar, preferentemente fructosa o glucosa, o un ácido orgánico adecuado, preferentemente ácido acético o succínico, o alcoholes del tipo de la glicerina y el etilenglicol. To this suspension a volume of water mill effluent rich in nitrates, and a suitable amount of a source of C. As carbon source a sugar, preferably fructose or glucose can be used, or a suitable organic acid, preferably acid was added acetic or succinic, or alcohols of the type of glycerine and ethylene glycol. Posteriormente se incuba la suspensión resultante a temperaturas comprendidas entre 15°C y 42°C, preferentemente entre 25°C y 30°C, con agitación opcional, y, tras una semana de incubación, se siembran diluciones apropiadas en placas de medio sólido selectivo tal como el constituido por M8, agar noble, nitrato potásico (20-100 mM) y una fuente de C. Tras un periodo de incubación comprendido entre 24 hy una semana las colonias aisladas se purifican y su capacidad para crecer a expensas de nitratos y/o nitritos se comprueba en medio liquido. Subsequently the resulting suspension at temperatures incubated at 15 ° C and 42 ° C, preferably between 25 ° C and 30 ° C, with optional agitation, and, after a week of incubation, dilutions are plated appropriate plates selective solid medium such as consisting of M8, noble agar, potassium nitrate (20-100 mM) and a source of C. After an incubation period of between 24 h and one week isolated colonies are purified and their ability to grow at the expense of nitrates and / or nitrite is tested in liquid medium. En el Ejemplos 1 se describe el aislamiento de bacterias capaces de utilizar nitrato como fuente de N, en particular, de las dos cepas de Klebsiella oxytoca de esta invención. In Examples 1 isolation of bacteria capable of using nitrate as nitrogen source, in particular of the two strains of Klebsiella oxytoca of this invention is described.

1.2 Caracterización de los microorganismos aislados 1.2 Characterization of the microorganisms isolated

Siguiendo análisis tipo [Test API 20E, de Biomerieux, Following analysis type [Test API 20E, Biomerieux,

Francia, n B de referencia del catálogo 20.100] se ha podido verificar que los microorganismos aislados capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de N, eran bacterias pertenecientes al género Klebsiella. France, n B Catalog Reference 20,100] has been able to verify that the isolated microorganisms capable of using nitrates and / or nitrites as a source of N, were bacteria belonging to the genus Klebsiella. Dos de las cepas aisladas más eficientes fueron las denominadas Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ, que han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Valencia, España, los días 15 de Junio de 1993 y 10 de Junio de 1994, correspondiéndoles los números de accesión CECT 4460 y CECT 4500, respectivamente. Two of the strains isolated most efficient were called Klebsiella oxytoca clone-15 and Klebsiella oxytoca clone AHI, which have been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), Valencia, Spain, on 15 June 1993 and 10 June 1994 They accounted numbers CECT 4460 and CECT accession 4500, respectively. Las bacterias aisladas presentan forma bacilar, y no presentan pigmentación cuando se cultivan en placas de medio mínimo o medio rico en LB ( Maniatis et al . Molecular Cloning, A Labor atory Manual , Cold Spring Harbor Labor atory , NY , 1982) . The isolated bacteria have bacillary form and have no pigmentation when grown on minimal medium plates or in LB rich medium (Maniatis et al. Molecular Cloning, A Labor atory Manual, Cold Spring Harbor Labor atory, NY, 1982). Una de las cepas aisladas, concretamente, la denominada Klebsiella oxytoca clón-15, en medio mínimo tipo M8 puede utilizar fructosa, glucosa, ácido acético, ácido succínico y glicerol como fuente de C y amoníaco, nitrato y nitrito como fuente de N, en condiciones aeróbicas o anaeróbicas, mientras que la otra cepa aislada, la denominada Klebsiella oxytoca clon AHÍ, puede utilizar nitrato y nitrito como fuente de N y etilenglicol como fuente de C en condiciones aeróbicas. One of the isolates, namely, the so-called Klebsiella oxytoca clone-15, in minimal medium M8 can use fructose, glucose, acetic acid, succinic acid and glycerol as carbon source and ammonia, nitrate and nitrite as a source of N, in aerobic or anaerobic conditions, while the other isolate, clone called Klebsiella oxytoca there can be used nitrate and nitrite as a source of N and ethylene glycol as a source of C aerobically.

Las características taxonómicas comunes de las cepas Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ son las siguientes: Common taxonomic characteristics of Klebsiella oxytoca strains clone-clone 15 and Klebsiella oxytoca THERE are as follows:

1. Características morfológicas Forma: Bacilar Movilidad: No móvil Esporas: No forman 1. Morphological characteristics Shape: Bacillary Mobility: Not mobile Spores: No form

Tinción Gram: Negativa Gram stain: Negative

2. Características de cultivo 2. Cultural characteristics

Cultivo en medio Mac Conkey: Crecimiento Siembra en placas de agar nutritivo: Crecimiento Siembra en tubo inclinado de agar nutritivo: Crecimiento Mac Conkey culture medium: Seeding Growth in nutrient agar plates: Seeding Growth in nutrient agar slant: Growth

3. Características fisiológicas pH: 6.0-10.5 (para K. oxytoca clón-15) 6.0-8.0 (para K. oxytoca clon AHÍ) Temperatura: 15 e C-42 s C Comportamiento frente al 0 2 : ambas son anaeróbicas facultativas, pero la cepa K. oxytoca clon AHÍ sólo utiliza etilenglicol como fuente de C en aerobiosis β-galactosidasa: Positiva Arginina dehidrolasa: Negativa Lisina descarboxilasa: Positiva Ornitina descarboxilasa: Negativa Utilización de citrato: Positiva Producción de H 2 S: Negativa Ureasa: Positiva Triptófano desaminasa: Negativa Producción de indol: Positiva Gelatinasa: Negativa Fermentación/oxidación de azúcares: Glucosa: Positiva Manitol: Positiva Inositol: Positiva 3. Physiological characteristics pH: 6.0-10.5 (for K. oxytoca clone-15) 6.0-8.0 (for K. oxytoca clone AHI) Temperature: 15 and C-42 s C Reaction to 0 2: both are facultative anaerobes, but K. oxytoca strain clone AHÍ only uses ethylene as a source of β-galactosidase C in aerobically: dehidrolasa Positive arginine: Lysine decarboxylase Negative: Positive ornithine decarboxylase: Negative citrate utilization: Positive Production of H 2 S: Negative Urease: Positive Tryptophan deaminase : Negative indole production: Positive gelatinase: Negative fermentation / oxidation of sugars: Glucose: Positive Mannitol: Inositol Positive: Positive

Sorbitol: Positiva Ramnosa: Positiva Sacarosa: Positiva Melibiosa: Positiva Amigdalina: Positiva Sorbitol: Positive rhamnose: Sucrose Positive: Positive Melibiose: Amygdalin Positive: Positive

Arabinosa: Positiva Citocromo oxidasa: Negativa Producción de N0 2 : Positiva Reducción a gas N 2 : Positiva La cepa Klebsiella oxytoca clón-15 es capaz de crecer en presencia de altas y bajas cargas de nitratos y/o nitritos. Arabinose: Cytochrome oxidase Positive: Negative Production N0 2: Positive Reduction gas N 2: Positive Klebsiella oxytoca strain clone-15 is capable of growing in the presence of high and low loads of nitrates and / or nitrites. Una característica de esta cepa es el hecho de que es capaz de crecer en presencia de relativamente altas conci traciones de nitratos (hasta 100 mM) , lo que le da un carácter muy particular y constituye una ventaja fundamental para su aplicación en la eliminación de nitratos y/o nitritos presentes en efluentes, aguas residuales y suelos. A feature of this strain is the fact that it is able to grow in the presence of relatively high conci trations of nitrates (up to 100 mM), which gives it a very particular character and is a key advantage for use in removing nitrates and / or nitrites in effluents, sewage and soil. Por otra parte, la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ es capaz de crecer en presencia de altas cargas de nitratos, a concentraciones del orden de 225 mM en sistemas estancos, por lo que es muy adecuada para la eliminación de nitratos y/o nitritos presentes en efluentes, aguas residuales y suelos. Moreover, the Klebsiella strain oxytoca clone AHI is able to grow in the presence of high loadings of nitrate at concentrations of about 225 mM in an enclosed system, so it is very suitable for the removal of nitrates and / or nitrites present in effluents, sewage and soil.

Dado que la vía de asimilación del nitrato incluye, entre otras reacciones, la reducción del nitrato a nitrito y amoniaco, se estudió la posibilidad de que las cepas aisladas fueran capaces de asimilar nitritos, observándose que dichas cepas son capaces de utilizar nitritos como fuente de N, en condiciones aeróbicas o anaeróbicas rKlebsiella oxytoca clón-15], tal como se describe en los Ejemplos 2 a 19, como en condiciones aeróbicas [Klebsiella oxytoca clon AHÍ], como se describe en los Ejemplos 20 a 22. Since assimilation pathway nitrate includes, among other reactions, the reduction of nitrate to nitrite and ammonia, the possibility that the strains isolated were able to assimilate nitrites observed that these strains are able to use nitrites as source studied N, in aerobic or anaerobic conditions rKlebsiella oxytoca clone-15], as described in Examples 2 to 19 as aerobically [Klebsiella oxytoca clone AHÍ], as described in Examples 20 to 22.

Una vez aisladas y purificadas las colonias de bacterias capaces de utilizar nitratos y/o nitritos como fuente de N, éstas pueden utilizarse para eliminar dichos compuestos presentes en efluentes de plantas industriales, en aguas residuales urbanas y en suelos. Once isolated and purified colonies of bacteria capable of using nitrates and / or nitrites as a source of N, they can be used to remove such compounds in effluents from industrial plants, urban waste water and soils.

2. Procedimiento de eliminación biológica de nitratos y/o nitritos. 2. Procedure biological elimination of nitrates and / or nitrites.

Una primera aplicación de las bacterias de esta invención, lo constituye su empleo en un procedimiento de eliminación biológica de nitratos y/o nitritos contenidos en un efluente industrial. A first application of the bacteria of this invention is its use in a process of biological elimination of nitrates and / or nitrites contained in an industrial effluent. Dicho procedimiento comprende básicamente las siguientes etapas: Said process basically comprises the following steps:

a) neutralización del efluente a tratar; a) neutralization of the effluent to be treated; b) suplemento de los nutrientes necesarios para el funcionamiento óptimo del procedimiento; b) supplement the nutrients needed for optimal functioning of the procedure; c) inoculación del efluente a tratar con cultivos de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos hasta la desaparición de los mismos; c) inoculating the effluent to be treated with cultures of microorganisms able to use nitrates and / or nitrites until disappearance thereof; d) retirada de los microorganismos que pueden ser reutilizados en un nuevo ciclo de tratamiento de efluentes, si se desea; d) removal of microorganisms that can be reused in a new effluent treatment cycle, if desired; ye) vertido de las aguas depuradas. e) discharge of treated water.

Como puede apreciarse, el procedimiento comienza con una etapa de neutralización de los efluentes. As shown, the process starts with a neutralization step effluent. Los efluentes susceptibles de ser depurados mediante este procedimiento pueden ser efluentes de cualquier proceso industrial en el que se utilicen o produzcan nitratos y/o nitritos, tales como efluentes procedentes de plantas de fabricación de explosivos. Effluent capable of being released by this process may be effluents from any industrial process in which use or produce nitrates and / or nitrites, such as effluents from explosives manufacturing plants. Asimismo también pueden tratarse cualquier tipo de aguas contaminadas con nitratos y/o nitritos. Also also they are treated any contaminated with nitrates and / or nitrites water.

En general, las aguas de desecho procedentes de las plantas de fabricación de explosivos son aguas acidas que se pueden neutralizar añadiendo cualquier álcali, preferentemente un hidróxido, carbonato o bicarbonato de un metal alcalino o alcalinotérreo, al objeto de qué dichas aguas alcancen un pH comprendido entre 6.0 y 10.5 tras la neutralización. In general, waste water from plants manufacturing explosives are acidic waters may be neutralized by adding any alkali, preferably a hydroxide, carbonate or bicarbonate of an alkali metal or alkaline, in order that such water reaching a pH between 6.0 and 10.5 after neutralization. Este intervalo de pH es adecuado cuando la cepa que se utiliza es la denominada Klebsiella oxytoca clón-15, mientras que si se utiliza la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ, resulta más conveniente neutralizar el efluente y mantener el pH del mismo en un intervalo comprendido entre 6.0 y 8.0, ya que ese es su intervalo de actuación. This pH range is suitable when the strain used is named Klebsiella oxytoca clone-15, whereas if the Klebsiella strain is used oxytoca clone there is more convenient to neutralize the effluent and maintaining the pH thereof in a range between 6.0 and 8.0, since that is its range of action.

Posteriormente, y tras análisis del efluente neutralizado, se añaden los nutrientes necesarios tales como fosfato o cualquier otro nutriente o micronutriente que sea necesario para el óptimo funcionamiento del proceso. Subsequently, after analysis of the neutralized effluent, nutrients needed such as phosphate or other nutrient or micronutrient any necessary for optimum operation of the process are added. A modo de ejemplo, pueden añadirse cantidades adecuadas de la solución de micronutrientes A9, cuya composición se describe en Abril et al . For example, suitable solution A9 micronutrients amounts, whose composition is described in Abril et al may be added. citado εupra , junto con cantidades apropiadas de Fe, Mg, Co y Mo (del orden de microraolar). εupra cited, together with appropriate Fe, Mg, Co and Mo (about microraolar) amounts. En cualquier caso, la elección y cantidad de nutrientes y micronutrientes a añadir será función de la composición del efluente a tratar y de la demanda microbiológica. In any case, the choice and quantity of nutrients and micronutrients to add will depend on the composition of the effluent to be treated and microbiological demand. Adicionalmente se añade una fuente de C de las mencionadas anteriormente, apropiada para la cepa que se va a utilizar en el procedimiento. Additionally adds a source of C mentioned above, suitable for the strain to be used in the process.

A continuación se inoculan los efluentes neutralizados y debidamente suplementados con un cultivo de las bacterias proporcionadas por esta invención (Klebsiella oxytoca clón-15 o Klebsiella oxytoca clon AHÍ). Then effluent neutralized and duly supplemented inoculated with a culture of bacteria provided by this invention (clone Klebsiella oxytoca Klebsiella oxytoca-15 or clone AHI). La carga bacteriana puede estar comprendida entre 0.01 y 0.1 unidades de absorbancia a 660 n por i de cultivo, preferentemente, alrededor de 0.03 unidades de absorbancia a 660 nm por mi de cultivo. The bacterial load may range from 0.01 to 0.1 absorbance units at 660 n for i cultivation preferably about 0.03 absorbance units at 660 nm per ml of culture.

La incubación debe realizarse a una temperatura comprendida entre 20° y 30°C con un aporte de hasta 2 litros de aire por litro de cultivo, si el procedimiento se realiza utilizando Klebsiella oxytoca clon AHÍ, mientras que puede no aportarse aire o pueden aportarse hasta 2 litros de aire por litro de cultivo si en el procedimiento se utiliza Klebsiella oxγtoca clón-15. Incubation must be performed at a temperature between 20 ° and 30 ° C with a contribution of up to 2 liters of air per liter of culture, if the procedure is performed using Klebsiella oxytoca clone AHI, while it can not be furnished air or may be provided to 2 liters of air per liter of culture in the process if Klebsiella oxγtoca clone-15 is used. El curso de la incubación se sigue midiendo periódicamente la cantidad de nitrato y nitrito presente en el efluente o agua a depurar, mediante un electrodo especifico de nitrato (por ejemplo, un electrodo de nitrato del tipo Crison) y mediante un ensayo químico extremadamente sensible para la detección de nitrito (Snell y Snell , Colorimetric Methods of Analysis, Vol . 3 , págε . 804-805, Van Nostrand Co . Inc. , New York, 1949 ) respectivamente, dándose por finalizada esta etapa una vez dejan de detectarse nitratos y/o nitritos y fuente de C. During incubation is followed by periodically measuring the amount of nitrate and nitrite present in the effluent or water to be purified, using a specific electrode nitrate (for example, an electrode nitrate Crison type) and by an extremely sensitive chemical test for detection of nitrite (Snell and Snell, Colorimetric Methods of Analysis, Vol. 3, págε. 804-805, Van Nostrand Co. Inc., New York, 1949) respectively, it being completed this stage once detected stop nitrates and / or nitrites and source C.

Posteriormente se retiran las bacterias por floculación o por cualquier otro método que permita, si se desea, su reutilización en un nuevo proceso y se retiran las aguas depuradas que pueden ser libremente vertidas. Later bacteria by flocculation or by any other process are removed, if desired, be reused in a new process and treated water that can be discharged freely removed.

Este procedimiento puede realizarse en continuo o en estanco, así como en balsas de grandes dimensiones o en fermentadores. This procedure may be performed continuously or sealed, as well as large rafts or fermenters. Cuando se realiza en continuo debe regularse adecuadamente el caudal y la composición del efluente de entrada y del de salida, asi como la concentración de cultivo bacteriano y el aporte de nutrientes y micronutrientes necesarios. When done continuously it should be properly regulated the flow and composition of the effluent input and output as well as the concentration of bacterial culture and the supply of nutrients and micronutrients necessary.

Una segunda aplicación de las bacterias de esta invención lo constituye su empleo en un procedimiento para la eliminación biológica de nitratos y/o nitritos en suelos superficiales contaminados con dichos compuestos. A second application of the bacteria of this invention is its use in a process for the biological elimination of nitrates and / or nitrites in contaminated surface soils such compounds. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas: Said method comprising the following steps:

a) inyección primaria de un cultivo de microorganismos capaces de utilizar nitratos y/o nitritos; a) primary injection of a culture of microorganisms capable of using nitrates and / or nitrites; yb) inyecciones sucesivas de cultivos de los microorganismos antes citados hasta que el suelo quede libre de nitratos y/o nitritos. b) successive injections of the aforementioned crops until the soil is free of nitrates and / or nitrites microorganisms.

La inyección de microorganismos se realiza para alcanzar altas densidades celulares en los suelos, del orden de 10 5 bacterias por cm 2 de suelo, que faciliten la eliminación del contaminante. Microorganisms injection is performed to achieve high cell densities in soils, the order of May 10 bacteria per cm 2 of ground, to facilitate removal of the contaminant. Si fuese necesario se añadiría a los suelos fosfatos y una fuente de carbono que facilite su supervivencia. If necessary to soils phosphate and a carbon source to facilitate their survival would be added.

Finalmente, una tercera aplicación de las bacterias de esta invención lo constituye su empleo en la eliminación de nitratos y/o nitritos contenidos en aguas residuales siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente para la eliminación de nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes industriales. Finally, a third application of the bacteria of this invention is its use in the removal of nitrates and / or nitrites contained in wastewater following a procedure similar to that described above for the removal of nitrates and / or nitrites contained in industrial effluents.

Las ventajas derivadas de los procedimientos de eliminación biológica de los nitratos y/o nitritos de esta invención, pueden resumirse en: The benefits derived from biological removal procedures of nitrates and / or nitrites of this invention can be summarized as:

1) presentan una alta especificidad en la eliminación de nitratos y nitritos; 1) have high specificity in the removal of nitrates and nitrites;

2) funcionan en un amplio intervalo de concentraciones de nitrato, nitrito o sus mezclas, en particular, funciona a concentraciones de: 2) operate in a wide range of concentrations of nitrate, nitrite or mixtures thereof, in particular runs at concentrations of:

0.01 a 100 mM de nitrato y de 0.01 a 50 mM de nitrito o sus mezclas, cuando el procedimiento se efectúa utilizando bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clón-15, o de 0.01 to 100 mM nitrate and 0.01 to 50 mM nitrite or mixtures thereof, when the procedure is performed using bacteria Klebsiella oxytoca strain clone-15, or

0.01 a 225 mM de nitrato en estanco y con suplemento de hasta 400 mM de nitrato en continuo, controlando la velocidad de suministro, cuando el procedimiento se efectúa utilizando bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clon AHÍ; 0.01 to 225 mM nitrate in leaktight and 400 mM supplement nitrate continuously controlling the delivery rate, when the procedure is performed using bacteria Klebsiella oxytoca strain clone AHÍ; y Y

3) presentan una alta versatilidad, ya que pueden ser utilizados ¿n situ para eliminar nitratos y/o nitritos contenidos en efluentes de plantas industriales, aguas residuales y suelos. 3) have great versatility as it can be used zn situ to remove nitrates and / or nitrites in effluents contained industrial plants, waste water and soil.

A continuación se describen unos ejemplos que sirven para ilustrar realizaciones particulares de la presente invención sin que deban ser tomados en sentido limitativo del alcance de la misma. The following are examples which serve to illustrate particular embodiments of the present invention should be taken without as limiting the scope thereof are described.

EJEMPLO 1 Aislamiento de las bacterias \Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ] EXAMPLE 1 Isolation of bacteria \ Klebsiella oxytoca clone-clone 15 and Klebsiella oxytoca AHI]

Una muestra de 10 g de un suelo de Páramo de Masa (Burgos) se suspendió en un medio de cultivo mínimo del tipo M8, en una relación 1:10 (p/v). A 10 g sample of a soil mass Paramo (Burgos) was suspended in a minimum culture medium M8 type, in a ratio of 1:10 (w / v). Posteriormente se añadió KN0 3 al medio hasta alcanzar una concentración de 20 mM o de 100 mM, y de la suspensión se tomaron 3 alícuotas idénticas a las que se añadieron: Subsequently KN0 3 was added to the medium to a concentration of 20 mM or 100 mM, and the suspension 3 identical aliquots to which were added were taken:

MUESTRA GLICEROL ETILENGLICOL FRUCTOSA (g/1) (g/1) (g/1) I 5 Glycerol SAMPLE ETHYLENE FRUCTOSE (g / 1) (g / 1) (g / 1) I 5

II 5 II 5

III 5 III 5

Las suspensiones I a III resultantes se incubaron a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, con agitación opcional, durante una semana. The resulting suspensions I to III were incubated at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, with optional agitation, for one week. Posteriormente se sembraron diluciones apropiadas de dichas suspensiones en placas de medio sólido selectivo constituido por medio M8, agar noble 1.5% (p/v) y Subsequently appropriate plates such suspensions in solid selective medium consisting of half dilutions were plated M8, 1.5% noble agar (w / v) and

20 mM KN0 3 + 5 g/1 de glicerol (muestra I) 100 mM KNO3 + 10 g/1 de glicerol (muestra I) 20 mM KN0 3 + 5 g / 1 of glycerol (sample I) 100 mM KNO3 + 10 g / 1 of glycerol (sample I)

20 mM KNO 3 + 5 g/1 de etilenglicol (muestra II) 100 mM KNO 3 + 5 g/1 de etilenglicol (muestra II) 20 mM KNO 3 + 5 g/1 de fructosa (muestra III) 100 mM KNO 3 + 5 g/1 de fructosa (muestra III) 20 mM KNO 3 + 5 g / 1 of ethylene glycol (sample II) 100 mM KNO 3 + 5 g / 1 of ethylene glycol (sample II) 20 mM KNO 3 + 5 g / 1 fructose (sample III) 100 mM KNO 3 + 5 g / 1 fructose (sample III)

Tras incubar entre 24 horas y una semana, se purificaron las colonias aisladas y se comprobó su fenotipo cultivándolas en los medios arriba indicados. After incubating between 24 hours and one week, the isolated colonies were purified and their phenotype was tested by culturing in the above means. Siguiendo los análisis del Kit API 20E (Biomerieux) , las bacterias aisladas fueron clasificadas como Klebsiella oxytoca. Following the analysis of the Kit API 20E (Biomerieux), the isolated bacteria were classified as Klebsiella oxytoca. Las dos cepas más eficientes fueron las denominadas Klebsiella oxytoca clón-15 y Klebsiella oxytoca clon AHÍ, que presentan las características mencionadas previamente en la descripción. The two most efficient strains were Klebsiella oxytoca called clone-clone 15 and Klebsiella oxytoca there, having the characteristics mentioned above in the description. Sendos cultivos de esas cepas, se depositaron los días 15 de Junio de 1993 y 10 de Junio de 1994 en la CECT correspondiéndoles los n B de accesión CECT 4460 y CECT 4500 respectivamente. Two separate cultures of these strains were deposited day June 15, 1993 and June 10, 1994 in the CECT They accounted n B CECT 4460 and CECT accession 4500 respectively.

EJEMPLO 2 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas 100 mi de medio mínimo M8 se suplementan con: 250 μl de solución de micronutrientes A9; EXAMPLE 2 Use of nitrate as a source of N aerobically 100 ml of minimal medium supplemented with M8 250 ul of solution of A9 micronutrients; - 6 μg de citrato de hierro; - 6 g of iron citrate;

100 μl de solución de Mg S0 4 1M; 100 ul of solution 1M Mg S0 4; 20 mM KN0 3 ; 20mM KN0 3; y 1 g de glicerol. and 1g glycerol. El cultivo se inicia añadiendo una cantidad de bacteria (Klebsiella oxytoca clón-15) tal que se alcanza una turbidez inicial a 660 nm de 0.03 unidades y se incuba a 30°C con agitación (150 rpm en un incubador orbital) y aerobiosis. Culturing is started by adding a quantity of bacteria (Klebsiella oxytoca clone-15) such that an initial 660 nm of 0.03 units is achieved turbidity and incubated at 30 ° C with shaking (150 rpm in an orbital incubator) and aerobically. Tras 24 horas de incubación la turbidez del cultivo a 660 nm está comprendida entre 1 y 2 unidades y la concentración de nitrato en el medio de cultivo es indetectable mediante análisis selectivo con un electrodo de nitrato de sobrenadante. After 24 hours of incubation the culture turbidity at 660 nm is between 1 and 2 units and the concentration of nitrate in the culture medium was undetectable by selective electrode analysis nitrate supernatant. Es igualmente indetectable la concentración de fuente de C. It is also undetectable concentration source C.

EJEMPLO 3 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas EXAMPLE 3 Use of nitrate as nitrogen source under aerobic conditions

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando nitrato potásico en una concentración de 100 mM. The procedure described in Example 2 was repeated, but using potassium nitrate in a concentration of 100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas. Nitrate completely disappeared within 48 hours. EJEMPLO 4 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas EXAMPLE 4 Using as a source of N nitrate under aerobic conditions

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando agua de una factoría de manera que la concentración final en HN0 3 fuera de 25-30 mM. The procedure described in Example 2 was repeated, but using water of a factory so that the final concentration in HN0 3 out of 25 to 30 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 24 horas. Nitrate completely disappeared within 24 hours.

EJEMPLO 5 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando agua de una factoría de manera que la concentración en HN0 3 fuera de 75-100 mM. EXAMPLE 5 Use of nitrate as nitrogen source under aerobic conditions The procedure described in Example 2 was repeated using water of a factory so that the concentration HN0 3 out 75-100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 h. Nitrate completely disappeared within 48 h.

EJEMPLO 6 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas, en continuo EXAMPLE 6 Using nitrate as nitrogen source under aerobic conditions, continuous

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando un sistema de adición en continuo de nitrato. The procedure described in Example 2 was repeated but using a continuous addition system nitrate. El fermentador contenía 110 mi de medio y la turbidez del cultivo era del orden de 3 unidades a 660 mm. The fermentor contained 110 ml of medium and the culture turbidity was in the order of 3 units to 660 mm. Agua de una factoría diluida para suministrar de 25 a 30 mM de HN0 3 se añadía a un flujo de 1-20 ml/h. Factory a dilute water to provide 25 to 30 mM of HN0 3 was added at a rate of 1-20 ml / h. El volumen de aire era de 0.5 volúmenes/min. The air volume was 0.5 volumes / min. El nitrato en el medio que rebosaba era indetectable. Nitrate in the medium was undetectable overflowing.

EJEMPLO 7 Utilización de nitrato como fuente de N EXAMPLE 7 Use of nitrate as a source of N

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, pero se utilizaron 2 litros de medio de cultivo y la incubación se realizó en un fermentador. The procedure described in Example 4 was repeated, but 2 liters of culture medium was used and incubation was performed in a fermenter. Las condiciones de operación fueron las siguientes: pH: 6.5-8.0 The operating conditions were as follows: pH: 6.5-8.0

Temperatura: 25°C-35°C. Temperature: 25 ° C-35 ° C. Agitación: 400-800 rpm Aire: 0.5 volúmenes/minuto. Agitation: 400-800 rpm Air: 0.5 volumes / minute. El nitrato desapareció tras 24-30 h de cultivo. Nitrate disappeared after 24-30 h of culture. EJEMPLO 8 Utilización de nitrato como fuente de N en anaerobiosis EXAMPLE 8 Use of nitrate as nitrogen source in anaerobiosis

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, pero utilizando condiciones anaeróbicas. The procedure described in Example 2 was repeated, but using anaerobic conditions. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 24 horas. Nitrate completely disappeared within 24 hours.

EJEMPLO 9 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas EXAMPLE 9 Use of nitrate as nitrogen source under anaerobic conditions

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando nitrato potásico a una concentración de 100 mM. The procedure described in Example 8 was repeated, but using potassium nitrate at a concentration of 100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas. Nitrate completely disappeared within 48 hours.

EJEMPLO 10 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas EXAMPLE 10 Using as a source of nitrate N in anaerobic conditions

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando agua de una factoría hasta alcanzar una concentración en HN0 3 de 25-30 mM. The procedure described in Example 8 was repeated but using a factory water to a concentration in HN0 3 25-30 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 24 horas. Nitrate completely disappeared within 24 hours.

EJEMPLO 11 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 8, pero utilizando agua de una factoría hasta alcanzar una concentración en HN0 3 de 75-100 mM. EXAMPLE 11 Use of nitrate as nitrogen source under anaerobic conditions the process described in Example 8 was repeated using water of a factory to a concentration in HN0 3 75-100 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas. Nitrate completely disappeared within 48 hours.

EJEMPLO 12 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones anaeróbicas, en continuo Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 6 excepto que no se burbujeaba aire. EXAMPLE 12 Use of nitrate as nitrogen source under anaerobic conditions, the continuous process described in Example 6 except that air bubbling was repeated. El fermentador contenia 110 mi de medio y la turbidez del cultivo era del orden de 1 unidad a 66? The fermentor contained 110 ml of medium and the culture turbidity was in the range of 1 to 66 unit? mm. mm. Agua diluida de una factoría que contenía una concentración de 25 a 30 mM en HN0 3 se añadía a un flujo de 1-20 ml/h. Diluted water of a factory containing a concentration of 25 to 30 mM in HN0 3 was added at a rate of 1-20 ml / h. El nitrato en el medio que rebosaba era indetectable. Nitrate in the medium was undetectable overflowing.

EJEMPLO 13 Utilización de nitrato como fuente de N EXAMPLE 13 Use of nitrate as a source of N

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 4, pero se utilizaron 2 litros de medio de cultivo y la incubación se realizó en un fermentador. The procedure described in Example 4 was repeated, but 2 liters of culture medium was used and incubation was performed in a fermenter. Las condiciones de operación fueron las siguientes: pH: 6.5-8.0 The operating conditions were as follows: pH: 6.5-8.0

Temperatura : 25°C-35°C . Temperature: 25 ° C-35 ° C. Agitación : 400-800 rpm Agitation: 400-800 rpm

Sin Aire . Without air .

El nitrato desapareció tras 24-30 horas de cultivo. Nitrate disappeared after 24-30 hours of culture.

EJEMPLO 14 Tratamiento de un efluente real Un efluente procedente de una fábrica de explosivos presentaba las siguientes características: EXAMPLE 14 Treatment of actual effluent An effluent from an explosives plant exhibited the following characteristics:

- Composición: - Composition:

Nitratos: 200 mg/ml Sulfatos: 1000 mg/ml - pH: 2.0 Nitrates: 200 mg / ml Sulfates: 1000 mg / ml - pH: 2.0

Un volumen de 1 litro de dicho efluente se neutralizó con NaOH hasta alcanzar un pH de 7.0. A volume of 1 liter of said effluent was neutralized with NaOH to pH 7.0. 100 mi de este efluente se llevaron hasta 1 litro con agua destilada y se añadieron los nutrientes y micronutrientes del medio M8, utilizándose una fuente apropiada de C tal como las mencionadas en el Ejemplo 1. 100 ml of this effluent were brought to 1 liter with distilled water and nutrients and micronutrients M8 medium were added, using a suitable source of C such as those mentioned in Example 1.

Posteriormente se inoculó un cultivo de las bacterias de la cepa Klebsiella oxytoca clón-15, con una turbidez inicial de 0.05 a 660 nm. Subsequently a culture of bacteria Klebsiella oxytoca strain clone-15, with an initial turbidity at 660 nm 0.05 inoculated. Las condiciones de la incubación fueron las siguientes: The incubation conditions were as follows:

- agitación: 600 rpm en un incubador orbital - Agitation: 600 rpm in an orbital incubator

- temperatura: 25°C - Temperature: 25 ° C

- tiempo: 24 h - Time: 24 h

La evolución de la incubación se siguió midiendo periódicamente el contenido de nitrato mediante un electrodo selectivo, comprobándose que al cabo de 24 horas había desaparecido completamente el nitrato. The evolution of incubation was followed by periodically measuring the nitrate selective electrode, proving that after 24 hours had completely disappeared nitrate.

EJEMPLO 15 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones aeróbicas EXAMPLE 15 Use of nitrite as a source of N aerobically

100 mi de medio mínimo M8 estéril se suplementan con: 250 μl de solución de micronutrientes A9; 100 ml sterile minimal medium supplemented with M8 250 ul of solution of A9 micronutrients; 6 μg de citrato de hierro; 6 .mu.g of iron citrate; 100 μl de solución de Mg S0 4 1M; 100 ul of solution 1M Mg S0 4; 2 mM NaN0 2 2mM NaN0 2

1 g de glicerol 1 g of glycerol

El cultivo se inicia añadiendo una cantidad de bacteria (Klebsiella oxytoca clón-15) tal que se alcanza una turbidez inicial a 660 nm de 0.03 unidades y se incuba a 30°C con agitación (150 rpm en un incubador orbital) y aerobiosis. Culturing is started by adding a quantity of bacteria (Klebsiella oxytoca clone-15) such that an initial 660 nm of 0.03 units is achieved turbidity and incubated at 30 ° C with shaking (150 rpm in an orbital incubator) and aerobically. Tras 24 h de incubación la turbidez del cultivo a 660 nm está comprendida entre 0.5 y 1 unidad y la concentración de nitrito en el medio de cultivo es indetectable mediante análisis químico de sobrenadantes. After 24 h incubation the culture turbidity at 660 nm is between 0.5 and 1 unit and the nitrite concentration in the culture medium was undetectable by chemical analysis of supernatants. Es igualmente indetectable la concentración de fuente de It is also undetectable concentration source

Carbono. Carbon.

EJEMPLO 16 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones aeróbicas Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero utilizando una concetración de 10 mM de nitrito sódico. EXAMPLE 16 Use of nitrite as a source of N aerobically the procedure described in Example 15 was repeated but using a 10 mM concetración sodium nitrite. El nitrito desapareció completamente en un plazo de 48 horas. Nitrite completely disappeared within 48 hours.

EJEMPLO 17 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones aeróbicas EXAMPLE 17 Use of nitrite as a source of N aerobically

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero se utilizaron 2 litros de medio de cultivo y la incubación se realizó en un fermentador. The procedure described in Example 15 was repeated, but 2 liters of culture medium was used and incubation was performed in a fermenter. Las condiciones de operación fueron las siguientes: pH : 6 . The operating conditions were as follows: pH: 6. 5-8 . 5-8. 0 0

Temperatura: 25°C-35°C. Temperature: 25 ° C-35 ° C. Agitación: 400-800 rpm Aire: 0.5 volúmenes/minuto. Agitation: 400-800 rpm Air: 0.5 volumes / minute. El nitrito desapareció tras 24-30 horas de cultivo. Nitrite disappeared after 24-30 hours of culture.

EJEMPLO 18 Utilización de nitrito como fuente de N en anaerobiosis EXAMPLE 18 Use of nitrite as a source of N in anaerobiosis

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, pero utilizando condiciones anaeróbicas. The procedure described in Example 15 was repeated, but using anaerobic conditions. El nitrito desapareció completamente en un plazo de 24 horas. Nitrite completely disappeared within 24 hours.

EJEMPLO 19 Utilización de nitrito como fuente de N en condiciones anaeróbicas EXAMPLE 19 Using as a source of N nitrite under anaerobic conditions

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 18, pero utilizando una concentración de 10 mM en nitrito sódico. The procedure described in Example 18 was repeated but using a 10 mM concentration of sodium nitrite. El nitrito desapareció completamente en un plazo de 48 horas. Nitrite completely disappeared within 48 hours.

EJEMPLO 20 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas 100 mi de medio mínimo M8 se suplementan con: 250 μl de solución de micronutrientes A9; EXAMPLE 20 Use of nitrate as a source of N aerobically 100 ml of minimal medium supplemented with M8 250 ul of solution of A9 micronutrients; 6 μg de citrato de hierro; 6 .mu.g of iron citrate;

100 μl de solución de Mg S0 4 1M; 100 ul of solution 1M Mg S0 4; 20 mM KN0 3 ; 20mM KN0 3; y 1.0 g de etilenglicol. and 1.0 g of ethylene glycol. El cultivo se inicia añadiendo una cantidad de bacteria (Klebsiella oxytoca clon AHÍ) tal que se alcanza una turbidez inicial a 660 nm de 0.03 unidades y se incuba a 30°C con agitación (150 rpm en un incubador orbital) y aerobiosis. Culturing is started by adding a quantity of bacteria (Klebsiella oxytoca clone AHI) such that an initial 660 nm of 0.03 units is achieved turbidity and incubated at 30 ° C with shaking (150 rpm in an orbital incubator) and aerobically. Tras 48 horas de incubación la turbidez del cultivo a 660 nm está comprendida entre 5 y 15 unidades y la concentración de nitrato en el medio de cultivo es indetectable mediante análisis selectivo con un electrodo de nitrato de sobrenadante. After 48 hours of incubation the culture turbidity at 660 nm is between 5 and 15 units and the nitrate concentration in the culture medium was undetectable by selective electrode analysis nitrate supernatant. Es igualmente indetectable la concentración de fuente de C. It is also undetectable concentration source C.

EJEMPLO 21 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas EXAMPLE 21 Use of nitrate as nitrogen source under aerobic conditions

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 20, pero utilizando nitrato potásico en una concentración de 225 mM. The procedure described in Example 20 was repeated, but using potassium nitrate in a concentration of 225 mM. El nitrato desapareció completamente en un plazo de 48 horas. Nitrate completely disappeared within 48 hours.

EJEMPLO 22 Utilización de nitrato como fuente de N en condiciones aeróbicas, en continuo EXAMPLE 22 Use of nitrate as nitrogen source under aerobic conditions, continuous

Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 20, pero utilizando un sistema de adición en continuo de nitrato. The procedure described in Example 20 was repeated but using a continuous addition system nitrate. El fermentador contenía 110 mi de medio y la turbidez del cultivo era del orden de 3 unidades a 660 mm. The fermentor contained 110 ml of medium and the culture turbidity was in the order of 3 units to 660 mm. Agua sin diluir de una factoría suministraba de 200 a 400 roM de HN0 3 y se añadía a un flujo de 1-5 ml/h. Undiluted water supplying a factory 200 to 400 HN0 3 and ROM was added to a flow of 1-5 ml / h. El volumen de aire era de 0.5 volúmenes/min. The air volume was 0.5 volumes / min. El nitrato en el medio que rebosaba era indetectable. Nitrate in the medium was undetectable overflowing.

Descrito el objetivo de la presente invención se declara que lo que constituye la esencialidad de la misma es lo que se declara en las siguientes: Described the object of the present invention states that what constitutes the essence of it is what is stated in the following:

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Classifications
International ClassificationC02F3/34, C12P1/04, B09C1/10
Cooperative ClassificationC02F3/34, C12P1/04, C12R1/22, B09C1/10
European ClassificationC12P1/04, C12R1/22, B09C1/10, C02F3/34
Legal Events
DateCodeEventDescription
Jan 12, 1995AKDesignated states
Kind code of ref document: A1
Designated state(s): AT AU BB BG BR BY CA CH CN CZ DE DK FI GB HU JP KP KR KZ LK LU LV MG MN MW NL NO NZ PL PT RO RU SD SE SK UA US UZ VN
Jan 12, 1995ALDesignated countries for regional patents
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Apr 26, 1995121Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
Oct 11, 1995122Ep: pct app. not ent. europ. phase
Apr 18, 1996REGReference to national code
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May 2, 1996NENPNon-entry into the national phase in:
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