WO1995006122A2 - Recombinant alternaria alternata allergenes - Google Patents
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Abstract
The invention concerns recombinant DNA molecules which code for polypeptides possessing the antigenicity of the allergenes Alta53, Alta22 and Alta11 or for peptides having at least one epitope of these allergenes. These molecules are characterized in that they contain nucleic-acid sequences which correspond in homologous fashion to the sequences 1, 3-5, 7-9, 12 and 13 or to parts of these sequences, or nucleic-acid sequences which hybridize with the above nucleic-acid sequences under strictly controlled conditions.
Description
Rekombinante Alternaria alternata Allergene Recombinant Alternaria alternata allergens
Die Erfindung bezieht sich auf rekombinante DNA Moleküle, die für Polypeptide kodieren, die die Antigenität der Allergene Alta53, Alta22 und Altall besitzen, oder für Peptide, die mindestens ein Epitop dieser Allergene aufweisen. The invention relates to recombinant DNA molecules which code for polypeptides which have the antigenicity of the allergens Alta53, Alta22 and Altall, or for peptides which have at least one epitope of these allergens.
Die genannten Allergene von Alternaria alternata, sowie die von den cDNA- Primärsequenzen dieser Allergene abgeleiteten Peptidsequenzen führen bei Pilzallergikern zu einer pathologischen Immunantwort mit einem Überschießen von IgE- Antikörpern. Rekombinante Allergene bzw. immunogen wirkende Teilpeptide können neben einer verbesserten Diagnostik auch zu einer in vivo oder in vitro Induktion einer Immuntoleranz bzw. Anergie von T-Lymphozyten Verwendung finden. The named allergens of Alternaria alternata, as well as the peptide sequences derived from the cDNA primary sequences of these allergens, lead to a pathological immune response with an overshoot of IgE antibodies in allergy sufferers from fungi. In addition to improved diagnostics, recombinant allergens or immunogenic partial peptides can also be used for in vivo or in vitro induction of an immune tolerance or anergy of T lymphocytes.
Allergien nehmen nach epidemiologischen Untersuchungen in den letzten Jahren an Häufigkeit zu. Die Ursachen der allergischen Krankheiten sind vielfältig. Allergene wie Pollen, Tierhaare und Exkremente von Hausstaubmilben sind heute wohl jedem schon eine Begriff (Wüthrich 1991, Miyamoto 1992). Schimmelpilze lassen aber für Fachleute hinsichtlich ihrer biologischen und allergologischen Bedeutung viele Fragen offen. Es sind nicht zuletzt die äußerst große. Variabilität und Adaptionsfähigkeit auf unterschiedliche Lebensbedingungen, die die Forschungsarbeit mit diesen Pilzen erschweren. 98% der bekannten Pilze sind Landbewohner. Für die meisten Pilze stellen klimatische Verhältnisse mit einer Luftfeuchtigkeit von 80% und Temperaturen um 20°C ideale Lebens- und Fortpflanzungsbedingungen dar. According to epidemiological studies, allergies have increased in frequency in recent years. The causes of allergic diseases are many. Allergens such as pollen, animal hair and excrement from dust mites are well known to everyone today (Wüthrich 1991, Miyamoto 1992). However, molds leave many questions open to experts with regard to their biological and allergological significance. Last but not least, they are extremely large. Variability and adaptability to different living conditions, which make research with these mushrooms difficult. 98% of the known mushrooms are rural people. For most mushrooms, climatic conditions with a humidity of 80% and temperatures around 20 ° C represent ideal living and reproductive conditions.
Die Mechanismen bei Schimmelpilzallergien sind nicht genau bekannt und scheinen komplexer und komplizierter als bei üblichen Inhalationsallergien vom Soforttyp zu sein. Möglichkeiten einer Sensibilisierung über den Verdauungstrakt und nicht nur über den Respirationstrakt werden diskutiert und sind Gegenstand intensiver Forschungsarbeit. The mechanisms for mold allergies are not exactly known and appear to be more complex and complicated than with conventional immediate-type inhalation allergies. Possibilities for sensitization via the digestive tract and not just the respiratory tract are discussed and are the subject of intensive research.
Allergien vom Soforttyp (Typ 1 -Allergie) werden durch IgE Antikörper ausgelöst, die Effektorzellen (Mastzellen des Schleimhaut- und Bindegewebstypus sowie Basophile Granulozyten des Blutes) mit ihren Fc-Teil über Rezeptoren kontaktieren und bei Allergenkontakt zu einer Freisetzung von Entzündungsstoffen (Histamin, Heparin, Arachidonsäuremetaboliten etc.) führen (Roitt 1991, Klein 1990). Die Bildung solcher IgE-Antikörper erfolgt durch B-Lymphozyten, die durch lösliche Stoffe (Lymphokine), die von aktivierten T-Lymphozyten sezerniert werden, zur Sekretion der Antikörper stimuliert werden (Parronchi et al. 1991).
Am Beginn jeder Immunantwort stehen Zellen, die vorhandenes Antigen aktiv phagozytieren. Aus diesem Grund werden diese Zellen auch "Freßzellen" genannt. Es handelt sich hierbei um dendritische Zellen aber auch um Monozyten, die im späteren Stadium zu Makrophagen differenzieren. Alle diese Zellen besitzen die Fähigkeit der DIAPEDESE, was ihnen ermöglicht, das Blutsystem zu verlassen und in Körperhohlräume etc. vorzudringen. Den Hauptanteil der Antigenvernichtung tragen die Makrophagen. Sie zerlegen das Antigen nach der Phagocytose in hochimmunogene Peptide (Durchschnittsgröße ca. 15 Aminosäuren) und präsentieren diese zusammen mit dem auf den Makrophagen exprimierten MHC-Proteinen (major histocompatibility), den T-Lymphocyten. Die zentrale Rolle der T-Lymphocyten wird an diesem Punkt unterstrichen. Nur an diesem Punkt der Immunantwort kann unterschieden werden, und das ist die zentrale Rolle der T-Lymphozyten, ob das dargebotene Antigen "fremd" oder "eigen" ist. Erfolgt hier die Entscheidung "fremd", so steht der weiteren Bekämpfung des Antigens nichts mehr im Wege. Die Erkennung des Fremdproteins im Kontakt mit eigenem MHC führt zur weiteren Differenzierung der T-Lymphozyten zu Plasmazellen, die schließlich Interleukine sezernieren. Diese Interleukin-Sekretion führt zur Aktivierung von B-Lymphozyten, die ihrerseits das lösliche Antigen erkannt haben, aber erst die "Mitteilung" der T-Lymphozyten über die Interleukine für die eigene Differenzierung benötigen. Es folgt die Differenzierung der B-Lymphozyten zu Plasmazellen, wo nun beim Atopiker größere Mengen Antikörper der IgE-Klasse sezerniert werden. Allergies of the immediate type (type 1 allergy) are triggered by IgE antibodies, which contact effector cells (mast cells of the mucous membrane and connective tissue type as well as basophilic granulocytes of the blood) with their Fc part via receptors and, in the event of allergen contact, release inflammatory substances (histamine, heparin , Arachidonic acid metabolites etc.) (Roitt 1991, Klein 1990). Such IgE antibodies are formed by B lymphocytes, which are stimulated to secrete the antibodies by soluble substances (lymphokines) that are secreted by activated T lymphocytes (Parronchi et al. 1991). At the beginning of every immune response there are cells that actively phagocytize the existing antigen. For this reason, these cells are also called "feeding cells". These are dendritic cells but also monocytes that differentiate into macrophages at a later stage. All of these cells have the ability of DIAPEDESE, which enables them to leave the blood system and penetrate into body cavities, etc. The main part of the antigen destruction is carried by the macrophages. After phagocytosis, they break down the antigen into highly immunogenic peptides (average size approx. 15 amino acids) and present them together with the MHC proteins (major histocompatibility) expressed on the macrophages, the T-lymphocytes. The central role of T lymphocytes is underlined at this point. It is only at this point in the immune response that a distinction can be made, and this is the central role of the T-lymphocytes, whether the presented antigen is "foreign" or "own". If the decision is "foreign" here, there is nothing standing in the way of further fighting the antigen. The recognition of the foreign protein in contact with its own MHC leads to further differentiation of the T lymphocytes into plasma cells, which ultimately secrete interleukins. This interleukin secretion leads to the activation of B lymphocytes, which in turn have recognized the soluble antigen, but first require the "communication" of the T lymphocytes about the interleukins for their own differentiation. The differentiation of the B lymphocytes into plasma cells follows, where larger amounts of antibodies of the IgE class are now secreted in the atopic.
Wurde noch auf T-Zellebene das Antigen als "eigen" erkannt, wird die Immunantwort unter normalen Umständen an diesem Punkt abgebrochen. Die komplexe Regulationskaskade des Immunsystems birgt jedoch eine Menge möglicher Fehler in sich. Zeuge dieses Umstandes sind die vielen, meist tödlich verlaufenden, klinischen Fälle von Autoimmunkrankheiten, bei denen das körpereigene Immunsystem nicht zwischen "selbst" und "nicht-selbst" unterscheiden kann. If the antigen was recognized as "own" at the T cell level, the immune response is terminated at this point under normal circumstances. However, the complex regulatory cascade of the immune system harbors a lot of possible errors. This fact is borne out by the many, mostly fatal, clinical cases of autoimmune diseases in which the body's immune system cannot distinguish between "self" and "not self".
Bis zum heutigen Zeitpunkt ist die Diagnose und somit auch die Therapie von allergischen Erkrankungen nicht zufriedenstellend. Die molekulare Charakterisierung der Hauptallergene von Alternaria mittels cDNA-Klonierung, Sequenzierung, Sequenzvergleich des allergenen Proteins mit Proteindatenbanken, sowie die Produktion von rekombinanten Allergenen wird mehr Aufschluß über die in vivo Funktion der Proteine geben, die die falschen Immunreaktionen auslösen. Diese Informationen sind aus folgenden Gründen interessant: To date, the diagnosis and therefore the therapy of allergic diseases has not been satisfactory. The molecular characterization of the main allergens of Alternaria using cDNA cloning, sequencing, sequence comparison of the allergenic protein with protein databases, and the production of recombinant allergens will provide more information about the in vivo function of the proteins that trigger the wrong immune reactions. This information is interesting for the following reasons:
1) Hochreine rekombinante Allergene können für eine sorgfältigere Diagnose, besser als es heute mit Rohextrakten möglich ist, herangezogen werden.
2) Die Sequenz der Allergene wird dabei helfen, tolerogene Peptide zu definieren und eventuell auch den "IgE-Class-switch", der bei der Immunisierung mit dem Allergen passiert, verstehen zu lernen. 1) Highly pure recombinant allergens can be used for a more careful diagnosis, better than is currently possible with crude extracts. 2) The sequence of the allergens will help to define tolerogenic peptides and possibly also to understand the "IgE class switch" that occurs during the immunization with the allergen.
Seit Jahrzehnten werden IgE bedingte Allergien, so z.B. auch Allergien gegen Pilzsporen, durch Hyposensibilisierung therapiert (Bousquet et al. 1991). Diese Therapie besteht in der Zufuhr von Allergenextrakten in Form von Injektionen oder peroraler Applikation in wässriger Form als Tropfen in steigender Dosierung, bis eine Erhaltungsdosis über mehrere Jahre erreicht ist. Resultat dieser Therapie ist das Erreichen einer Toleranz gegenüber den eingesetzten Allergenen, was sich in einer Abnahme der Krankheitssymptome äußert (Birkner et al. 1990). Das Problem bei dieser Art der Behandlung liegt in der Vielzahl der dadurch auftretenden Nebenwirkungen. Bei der Hyposensibilisierungstherapie sind Fälle von anaphylaktischem Schock während der Behandlung aufgetreten. Das Problem hierbei liegt in der schweren Standardisierbarkeit der Pilzprotein-Isolate. Bei einem Einsatz von Allergen-abgeleiteten, aber nicht anaphylaktisch wirkenden Peptiden, könnten risikolos höhere Dosen verabreicht werden, wodurch eine wesentliche Verbesserung der Hyposensibilisierung erreicht werden kann. For decades, IgE-related allergies, e.g. also allergies to fungal spores, treated by hyposensitization (Bousquet et al. 1991). This therapy consists in the supply of allergen extracts in the form of injections or oral application in aqueous form as drops in increasing doses until a maintenance dose over several years is reached. The result of this therapy is tolerance towards the allergens used, which is reflected in a decrease in the symptoms of the disease (Birkner et al. 1990). The problem with this type of treatment lies in the large number of side effects that it causes. Hyposensitization therapy has seen cases of anaphylactic shock during treatment. The problem here is the difficulty in standardizing the fungal protein isolates. If allergen-derived but not anaphylactic peptides are used, higher doses could be administered risk-free, which can lead to a significant improvement in hyposensitization.
Alternaria alternata ist praktisch überall in der Natur anzutreffen. Beliebte Alternaria alternata can be found practically everywhere in nature. Popular
Standorte, bzw. Lebensräume des Pilzes sind verschiedene Bodentypen, Getreidesilos, verottetes Holz, aber auch lebende Pflanzen, Kompostplätze und Vogelnester. Findet man auf Tomaten schwarze Flecken, so rühren auch sie mit großer Wahrscheinlichkeit von Alternaria her. Aber nicht nur in freier Natur ist Alternaria alternata anzutreffen. Sehr häufig findet man den Pilz in feuchten Innenräumen und an Fensterrahmen. Warme Temperaturen und hohe Luftfeuchtigkeit begünstigen das Wachstum des Pilzes im allgemeinen. Locations and habitats of the mushroom are different types of soil, grain silos, rotten wood, but also living plants, composting places and bird nests. If black spots are found on tomatoes, they are also likely to come from Alternaria. But Alternaria alternata is not only found in the wild. The fungus is very often found in damp interiors and on window frames. Warm temperatures and high humidity generally favor the growth of the fungus.
Man zählt heute Alternaria alternata zu den wichtigsten Allergie auslösenden Pilzen. Yunginger et al. (1989) charakterisierten die erste allergene Fraktion und isolierten das erste als Allergen wirkende Protein Altai. Ein großes Problem bei Alternaria alternata ist die Variationsbreite des Pilzes: Variationen im Proteinmuster aber auch variable Potenz der Allergieauslösung sind des öfteren beschrieben worden. Nyholm et al. (1983) zeigten, daß es sich bei Agl und Alt-1 um dasselbe Allergen handelt, daß aber in unterschiedlichen Stämmen von Alternaria alternata eine Variationsbreite des Proteins möglich ist. Der Reviewartikel von Budd (1986) beschreibt die Isolierung des allergenen Proteins Alt-1, nun Altal. Vollständige cDNA Sequenzen von allergenen Proteinen von Alternaria alternata sind bis heute nicht publiziert worden. Verschiedene Studien zeigen jedoch starke Kreuzreaktionen zwischen Alternaria alternata, Stemphylium und Curvularia (Agarwal 1982).
Erfindungsgemäß werden Rekombinante DNA Moleküle der eingenags geannten Art geschaffen, die Nucleinsäuresequenzen aufweisen, die mit dem Sequenzen 1, 3-5, 7-9 sowie 12 und 13, oder mit Teilbereichen dieser Sequenzen in homologer Weise übereinstimmen, bzw. Nucleinsäuresequenzen, die mit den genannten Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Die DNA Moleküle können auch Nucleinsäuresequnzen aufweisen, die durch Degeneration aus den vorgenannten Sequenzen ableitbar sind. Alternaria alternata is one of the most important allergy-causing fungi today. Yunginger et al. (1989) characterized the first allergenic fraction and isolated the first allergenic protein Altai. A big problem with Alternaria alternata is the range of variation of the fungus: Variations in the protein pattern but also variable potency of the triggering of allergies have been described many times. Nyholm et al. (1983) showed that Agl and Alt-1 are the same allergen, but that the protein can be varied in different strains of Alternaria alternata. The review article by Budd (1986) describes the isolation of the allergenic protein Alt-1, now Altal. Complete cDNA sequences of allergenic proteins from Alternaria alternata have not been published to date. However, various studies show strong cross-reactions between Alternaria alternata, Stemphylium and Curvularia (Agarwal 1982). According to the invention, recombinant DNA molecules of the kind mentioned above are created which have nucleic acid sequences which homologously match sequences 1, 3-5, 7-9 and 12 and 13, or parts of these sequences, or nucleic acid sequences which correspond to hybridize said sequences under stringent conditions. The DNA molecules can also have nucleic acid sequences which can be derived from the aforementioned sequences by degeneration.
Weitere Merkmale des Erfindungsgegenstandes gehen aus den nachstehenden Darlegungen hervor. Further features of the subject matter of the invention emerge from the explanations below.
Beispiele: Examples:
a) Beschreibung der allergenen Proteine von Alternaria alternata mittels Western-Blotting a) Description of the allergenic proteins of Alternaria alternata using Western blotting
Für die Klonierung der vorliegenden Allergene von Alternaria alternata standen 142 Patientensera zur Verfügung. Um die Reaktivität der Patienten mit Pilzproteinextrakt zu testen, wurde Alternaria alternata (Sammlung Prof. Windisch Berlin Nummer: 08-0203) auf festem Medium (2% Glukose, 2% Pepton, 1 % Hefeextrakt) gezüchtet. Für die Proteinextraktion wurde die Pilzmatte nach 3 Tagen Wachstum bei 28°C abgezogen und mit flüssigem Stickstoff aufgebrochen. Die Auftrennung der extrahierten Proteine erfolgte auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel, das anschließend geblottet, mit Patientenserum inkubiert und mit 125I-markiertem anti human IgE detektiert wurde. In Prozentzahlen ausgedrückt reagierten die Patienten auf die allergenen Proteine wie folgt: 142 patient sera were available for cloning the existing allergens from Alternaria alternata. In order to test the reactivity of the patients with fungal protein extract, Alternaria alternata (Prof. Windisch Berlin collection: 08-0203) was grown on solid medium (2% glucose, 2% peptone, 1% yeast extract). For the protein extraction, the mushroom mat was removed after 3 days of growth at 28 ° C. and broken up with liquid nitrogen. The extracted proteins were separated on a denaturing polyacrylamide gel, which was then blotted, incubated with patient serum and detected with 125 I-labeled anti-human IgE. Expressed in percentages, the patients reacted to the allergenic proteins as follows:
Alta53 44,8% Alta53 44.8%
Alta22 3.4% Alta22 3.4%
Alta11 10,3% Alta11 10.3%
Wurde Protein aus gekauftem Pilzmaterial der Firma Allergon (Schweden) isoliert und für den Immunblot verwendet, konnte nahezu dasselbe Bandenmuster detektiert werden. Wie aus diesen Zahlen ersichtlich ist, handelt es sich bei Alta53 um ein Haupt-, bei Alta22 und Alta11 um ein Nebenallergen. If protein from isolated mushroom material from Allergon (Sweden) was isolated and used for immunoblotting, almost the same band pattern could be detected. As can be seen from these figures, Alta53 is a major allergen, Alta22 and Alta11 a minor allergen.
Figur 1 zeigt einen Überblick über das zur Klonierung der beschriebenen Allergene zur Verfügung gestandene Patientenspektrum. Das Bild zeigt ein 12,5 %iges Polyacrylamidgel. Die Patienten mit der Nummer 35 und 40 (es handelt sich hier auch um die Patienten die für das spätere Screenen verwendet wurden) zeigen Banden in der Größenordnung 53kD, 22kD und l lkD.
Fig.1 zeigt dabei ein Westernblotting eines 12,5%iges Polyacrylamidgels, nach Auftrennung von Alternaria alternata Proteinextrakt; Inkubation mit Sera verschiedener Patienten; Detektion mit 125I- markiertem anti human IgE. FIG. 1 shows an overview of the patient spectrum available for cloning the allergens described. The picture shows a 12.5% polyacrylamide gel. The patients with the numbers 35 and 40 (these are also the patients who were used for the later screening) show bands in the order of magnitude of 53 kD, 22 kD and l lKD. 1 shows a Western blotting of a 12.5% polyacrylamide gel after separation of Alternaria alternata protein extract; Incubation with sera from different patients; Detection with 125 I-labeled anti human IgE.
b) Konstruktion der cDNA Expressionsbank b) Construction of the cDNA expression bank
Gesamt RNA wurde nach der sauren Guanidium-Phenol-Extraktionsmethode aus selbst gezüchtetem Pilzmaterial gewonnen. poly(A)plus Anreicherung erfolgte mit Oligo(dT) Cellulose der Firma Böhringer. Die cDNA Synthese (1. und 2. Strang) wurde durchgeführt, wie im Manual des Lambda ZAP-Systems der Firma Stratagene beschrieben. Die cDNA wurde anschließend (3'- seitig) mit EcoRI und (5'-seitig) mit Xbal Linkern versehen, in vorverdaute Lambda-ZAP-Arme ligiert und verpackt. Der Titer der Primärbank betrug 900000 Klone. c) Screening der cDNA Genbank mit Patientensera, in vivo Excision, Sequenzierung Total RNA was obtained from self-grown mushroom material using the acid guanidium phenol extraction method. poly (A) plus enrichment was carried out with oligo (dT) cellulose from Böhringer. The cDNA synthesis (1st and 2nd strand) was carried out as described in the manual of the Lambda ZAP system from Stratagene. The cDNA was then provided (3 'side) with EcoRI and (5' side) with Xbal linkers, ligated into predigested Lambda-ZAP arms and packaged. The primary bank titer was 900,000 clones. c) Screening of the cDNA library with patient sera, in vivo excision, sequencing
Das Screenen der Expressionsbank erfolgte mittels Inkubation der "gelifteten" Phagenplaques mit einem Seragemisch aus 2 Patienten, von denen man durch das Westernblotting wußte, daß sie das Spektrum der detektierten Antigene abdecken. Die Detektion erfolgte wieder mit anti human IgE RAST Antikörper der Firma Pharmacia. Nach Sekundär- und Tertiärscreening blieben 150 positive Klone übrig. Aus 12 Klonen wurde mit Hilfe eines Helferphagen der bereits fertig sequenzierbare Bluescriptvektor mit cDNA exzisiert (Durchführung wie im Manual des Lambda ZAP-Kits). Restriktionsverdaue der exzisierten Plasmide zeigten (EcoRI-Xbal Doppelverdaue) 3 verschiedene Inserttypen. Diese 3 Klone wurden nach der Sangermethode (Sanger 1977) sequenziert. d) Expression der Alta53, Alta22 und Alta11 cDNAs als ß-Galaktosidasefusionsprotein The expression bank was screened by incubating the "lifted" phage plaques with a sera mixture from 2 patients who were known by western blotting to cover the spectrum of the detected antigens. The detection was again carried out using anti-human IgE RAST antibody from Pharmacia. After secondary and tertiary screening, 150 positive clones remained. With the help of a helper phage, the ready-to-sequence bluescript vector was excised from 12 clones with cDNA (implementation as in the manual of the Lambda ZAP kit). Restriction digests of the excised plasmids showed (EcoRI-Xbal double digestion) 3 different insert types. These 3 clones were sequenced using the Sanger method (Sanger 1977). d) Expression of the Alta53, Alta22 and Alta11 cDNAs as β-galactosidase fusion protein
Mit Hilfe des vorher beschriebenen IgE-Screenings konnten 3 vollständige cDNA-Klone erhalten werden. Die jeweiligen rekombinanten Plasmide wurden in den E.coli Stamm XLl-Blue transformiert und mit IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) induziert. Der E.coli Gesamtproteinextrakt wurde anschließend elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Das Fusionsprotein wurde mittels Serum IgE von Pilzallergikern und einem jodmarkiertem Kaninchen anti human IgE Antikörper (Pharmacia, Uppsala Schweden) detektiert.
Die nachfolgenden zwei Figuren zeigen die rekombinanten ß-Galaktosidasefusionsproteine nach Inkubation mit Patientenserum und Detektion mit jodmarkiertem anti-human IgE. Der ß-Galaktosidaseanteil des Fusionsproteins beträgt 36 Aminosäuren, was einem Molekulargewicht von 3800 Dalton gleichkommt. Unter Berücksichtigung dieser "Vergrößerung" des allergenen Proteins sind auch die nachfolgenden Figuren 3 und 4 zu sehen. Spuren (Klone) 1,2,4,5,6,7 zeigen das rekombinante Fusionsprotein Altal l, Spuren 3 und 12 zeigen das rekombinante Fusionsprotein Alta22 und Spuren 8 und 10 das um den Fusionsanteil größer gewordene rekombinante Alta53. With the help of the IgE screening described above, 3 complete cDNA clones could be obtained. The respective recombinant plasmids were transformed into the E.coli strain XLl-Blue and induced with IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). The E. coli total protein extract was then electrophoresed and blotted onto nitrocellulose. The fusion protein was detected by means of serum IgE from fungal allergy sufferers and an iodine-labeled rabbit anti-human IgE antibody (Pharmacia, Uppsala Sweden). The following two figures show the recombinant β-galactosidase fusion proteins after incubation with patient serum and detection with iodine-labeled anti-human IgE. The β-galactosidase portion of the fusion protein is 36 amino acids, which is equivalent to a molecular weight of 3800 daltons. Taking this "enlargement" of the allergenic protein into account, the following FIGS. 3 and 4 can also be seen. Lanes (clones) 1, 2, 4, 5, 6, 7 show the recombinant fusion protein Altal 1, lanes 3 and 12 show the recombinant fusion protein Alta22 and lanes 8 and 10 show the recombinant Alta53 which has increased by the amount of fusion.
Fig.2 und 3 zeigen somit eine Expression der rekombinanten Protine Alta52, Alta22 und Altal l in Bluescript nach IPTG Induktion. e) Bestimmung von B- und T-Zell Epitopen bei den rekombinanten Allergenen 2 and 3 thus show an expression of the recombinant protins Alta52, Alta22 and Altal 1 in Bluescript after IPTG induction. e) Determination of B and T cell epitopes in the recombinant allergens
Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Allergene bietet die Voraussetzung für die Vorhersage von B- und T-Zellepitopen mittels geeigneter Computerprogramme. Mit diesen Untersuchungen können spezifische T- und B-Zell-Epitope definiert werden, die die Fähigkeit besitzen, zB. T-Lymphozyten zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen, aber die Zellen (bei genau definierter Dosis) auch in einen Zustand der Toleranz bzw. Nicht-Reaktivität (Anergie) zu versetzen (Rothbard et al. 1991). Die bestimmten Epitope werden jeweils bei der Beschreibung des rekombinanten Proteins in eigenen Figuren angeführt. The derived amino acid sequence of the allergens provides the prerequisite for the prediction of B and T cell epitopes using suitable computer programs. With these studies, specific T and B cell epitopes can be defined that have the ability, e.g. To stimulate T lymphocytes and stimulate proliferation, but also to put the cells (at a precisely defined dose) into a state of tolerance or non-reactivity (anergy) (Rothbard et al. 1991). The specific epitopes are given in the description of the recombinant protein in separate figures.
Die Suche nach B-Zellepitopen wurde mit Hilfe des GCG-Programmes (Genetics Computer Group) "PROTCALC", das jedoch von der Arbeitsgruppe um Prof. Modrow mit wesentlichen Parametern erweitert wurde, durchgeführt. Die Bestimmung beruht auf einer Abwägung der Parameter Hydrophilität (Kyte-Doolittle), Sekundärstruktur (Chou-Fasman), Oberflächenlokalisation (Robson-Garnier) und Flexibilität, wodurch die Antigenität von Teilpeptiden errechnet wird. The search for B cell epitopes was carried out using the GCG program (Genetics Computer Group) "PROTCALC", which was expanded by the working group around Prof. Modrow with essential parameters. The determination is based on a weighing of the parameters of hydrophilicity (Kyte-Doolittle), secondary structure (Chou-Fasman), surface localization (Robson-Garnier) and flexibility, whereby the antigenicity of partial peptides is calculated.
Das Prinzip der T-Zellepitop-Voraussage erfolte im Prinzip nach dem The principle of the T cell epitope prediction was in principle based on the
Algorithmus von Margalit et al. (1987). Das Prinzip besteht in der Suche nach amphipathischen Helices laut Primärsequenz des zu bestimmenden Proteins, flankiert von hydrophilen Bereichen. Der berechnete Score muß für relevante T-Zellepitope größer als 10 sein. Bei MHC II assoziierten Peptiden kann kein Konsensus, weder der Sequenz noch der Länge des Peptids nach, wie bei HLA-A2 (human leucocyte antigen) (MHC I) assoziierten definiert werden. Bei HLA-A2 assoziierten Peptiden beträgt die Länge des Peptids 10 Aminosäuren, wobei die 2. Aminosäure ein Tyrosin und die letzte Aminosäure ein Leucin darstellt (Rammensee et al. 1993). Die
berechneten Epitope werden bei der Beschreibung der einzelnen allergenen Sequenzen getrennt angeführt. Margalit et al. (1987). The principle consists in the search for amphipathic helices according to the primary sequence of the protein to be determined, flanked by hydrophilic areas. The calculated score must be greater than 10 for relevant T cell epitopes. No consensus can be defined for MHC II-associated peptides, neither in terms of the sequence nor the length of the peptide, as associated with HLA-A2 (human leucocyte antigen) (MHC I). In the case of HLA-A2-associated peptides, the length of the peptide is 10 amino acids, the second amino acid being a tyrosine and the last amino acid being a leucine (Rammenee et al. 1993). The calculated epitopes are listed separately in the description of the individual allergenic sequences.
Molekulare Charakterisierung der Monierten Pilzallergene (Sequenzprotokolle) Im folgenden werden nun die cDNA Sequenzen und die mit ihnen durchgeführten Analysen der Reihe nach angeführt. Die Computerauswertung der nachfolgenden Sequenzen wurden auf einer Ultrix-DEC 5000 Workstation unter Zuhilfename des GCG-Softwarepaketes (=Wisconsin Paket: die Algorithmen dieses Paketes wurden von der "University of Wisconsin" entwickelt) durchgeführt. A. Alta53 Molecular characterization of the cloned fungal allergens (sequence protocols) In the following the cDNA sequences and the analyzes carried out with them are listed in order. The computer evaluation of the following sequences was carried out on an Ultrix-DEC 5000 workstation using the GCG software package (= Wisconsin package: the algorithms of this package were developed by the "University of Wisconsin"). A. Alta53
Die nachfolgende Sequenz 1 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von Alta53 beginnend mit dem Start-ATG. Die Länge der cDNA beträgt 1488bp, was einem berechneten Molekulargewicht von 53543 Dalton entspricht. Die beobachtete Bande im Westernblot bei 53kD korreliert somit dem Molekulargewicht nach mit dem Monierten und sequenzierten Allergen. Dem reifen Protein dürfte nach bisheriger Analyse kein Signalpeptid voranstehen. Sequence 1 below shows the complete cDNA sequence of Alta53 starting with the start ATG. The length of the cDNA is 1488 bp, which corresponds to a calculated molecular weight of 53543 daltons. The observed band in the Western blot at 53 kD thus correlates in molecular weight with the cloned and sequenced allergen. According to previous analysis, the mature protein should not be preceded by a signal peptide.
Sequenz 1: Alta53=ALDH_alt - > 1-phasen Translation 53543 Dalton Sequence 1: Alta53 = ALDH_alt -> 1-phase translation 53543 Dalton
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:l (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: l
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 1488 Basenpaare / 496 Aminosäurereste (A) LENGTH: 1488 base pairs / 496 amino acid residues
(B) ART: Nukleinsäure / Protein (B) TYPE: nucleic acid / protein
(C) STRANGFORM: ds (C) STRANDFORM: ds
(D) TOPOLOGIE: linear (D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA to mRNA / protein
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(iv) ANTISENSE: nein (iv) ANTISENSE: no
(v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (v) TYPE OF FRAGMENT: overall sequence
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
DNA sequence 1488 b.p. ATGACATCTGTA ... CTGTTCGGTTAA linear
Homologiesuchen mit Alta53 in der SWISSPROT-Proteindatenbank ergaben, daß es sich bei Alta53, wie auch bei Clah53, um eine Aldehyddehydrogenase handelt . Als Beweis der hohen Homologie (über viele Strecken handelt es sich um Identitäten) zeigt die folgende Sequenz 2 ein paarweises Alignment zwischen Alta53 und Clah53. Die Identität (identische Aminosäuren) der beiden Proteine (Allergene) untereinander beträgt 78%. Der Homologiegrad (Identitäten plus homologe Aminosäureaustausche) liegt sogar bei 86%. DNA sequence 1488 bp ATGACATCTGTA ... CTGTTCGGTTAA linear Homology searches with Alta53 in the SWISSPROT protein database showed that Alta53, like Clah53, is an aldehyde dehydrogenase. As proof of the high homology (there are identities over many distances), the following sequence 2 shows a pairwise alignment between Alta53 and Clah53. The identity (identical amino acids) of the two proteins (allergens) among each other is 78%. The degree of homology (identities plus homologous amino acid exchanges) is as high as 86%.
Die nachfolgende Sequenz 3 zeigt die mit Computersuche identifizierten Bereiche mit hohem, antigenen Index. Diese Bereiche stellen hochpotente B-Zellepitope dar. Sequence 3 below shows the areas with high antigenic index identified by computer search. These areas represent highly potent B cell epitopes.
Sequenz 3: Alta53=ALDH_aIt: B-Zellepitope Sequence 3: Alta53 = ALDH_aIt: B cell epitopes
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:3 (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: einzeln angeführt (A) LENGTH: listed individually
(B) ART: Protein (B) ART: protein
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (ii) MOLECULE TYPE: Peptides
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (v) TYPE OF FRAGMENT: N-terminus to C-terminus
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
Val Lys Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Glu Phe Glu Gln Pro Thr Gly (4-19) Val Lys Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Glu Phe Glu Gln Pro Thr Gly (4-19)
Ala Val Asp Gly Lys Thr Phe (29-35)
Ile Asn Pro Ser Thr Glu Glu (38-44) Ala Val Asp Gly Lys Thr Phe (29-35) Ile Asn Pro Ser Thr Glu Glu (38-44)
Gly Pro Trp Ala Lys Glu Thr Pro Glu Asn Arg Gly Lys Leu Leu Asn (70-85) Gly Pro Trp Ala Lys Glu Thr Pro Glu Asn Arg Gly Lys Leu Leu Asn (70-85)
Leu Arg Tyr Tyr Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile Glu Gly (125-137) Leu Arg Tyr Tyr Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile Glu Gly (125-137)
Asp Thr Ala Pro Asp Ser Phe Asn Tyr Ile Arg Lys Ser (141-153) Asp Thr Ala Pro Asp Ser Phe Asn Tyr Ile Arg Lys Ser (141-153)
Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val (205-212) Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val (205-212)
Gly Ser Asn Leu Lys Lys Val Thr Leu (254-262) Gly Ser Asn Leu Lys Lys Val Thr Leu (254-262)
Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile (263-271) Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile (263-271)
Tyr Ile Glu Glu Gly Lys Lys Ser Gly Ala Thr (350-360) Tyr Ile Glu Glu Gly Lys Lys Ser Gly Ala Thr (350-360)
Ile Glu Thr Gly Gly Asn Arg Lys Gly Asp Lys Gly Tyr Phe Ile Glu (361-376) Ile Glu Thr Gly Gly Asn Arg Lys Gly Asp Lys Gly Tyr Phe Ile Glu (361-376)
Ile Gly Asn Asn Thr Thr Tyr Gly (413-420) Ile Gly Asn Asn Thr Thr Tyr Gly (413-420)
Ala Val His Thr Ser Asn Leu Thr (424-431) Ala Val His Thr Ser Asn Leu Thr (424-431)
Die nachfolgende Sequenz 4 zeigt die mit Hilfe des Computerprogrammes bestimmten amphipathischen Helices, die von hydrophilen Bereichen flankiert werden. Solche Bereiche, mit einem Score höher als 10, stellen möglicheSequence 4 below shows the amphipathic helices determined with the aid of the computer program and flanked by hydrophilic areas. Such areas, with a score higher than 10, represent possible ones
T-Zellepitope dar. T cell epitopes.
Sequenz 4: Vorausgesagte amphipathatische Segmente Sequence 4: Predicted amphipathic segments
T-Zellepitope EFEQ T-cell epitopes EFEQ
FVKAVDFVKAVD
KTFDNIKTFDNI
KAFΝGPWAKAFΝGPWA
KLLΝKLADLFEKLLΝKLADLFE
IAAVEALDΝGKAIAAVEALDΝGKA
MAKΝNDVP AAGCLRYYGGWADKIEGKMAKΝNDVP AAGCLRYYGGWADKIEGK
VDTAPDSFΝYVDTAPDSFΝY
GVIΝVITGFGKIGVIΝVITGFGKI
IYDKFIQRFKERAAIYDKFIQRFKERAA
ΝAVGDPFAATΝAVGDPFAAT
QFDRIMGYIQFDRIMGYI
GPVCTIGPVCTI
AIEVAΝALR RELGEAALD
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:4 AIEVAΝALR RELGEAALD (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 4
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: einzeln angeführt (A) LENGTH: listed individually
(B) ART: Protein (B) ART: protein
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (ii) MOLECULE TYPE: Peptides
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (v) TYPE OF FRAGMENT: N-terminus to C-terminus
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
Glu Phe Glu Gln (11-16) Glu Phe Glu Gln (11-16)
Phe Val Lys Ala Val Asp (26-31) Phe Val Lys Ala Val Asp (26-31)
Lys Thr Phe Asp Val Ile (33-38) Lys Thr Phe Asp Val Ile (33-38)
Lys Ala Phe Asn Gly Pro Trp Ala (66-73) Lys Ala Phe Asn Gly Pro Trp Ala (66-73)
Lys Leu Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Phe Glu (82-92) Lys Leu Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Phe Glu (82-92)
Ile Ala Ala Val Glu Ala Leu Asp Asn Gly Lys Ala (98-109) Ile Ala Ala Val Glu Ala Leu Asp Asn Gly Lys Ala (98-109)
Met Ala Lys Asn Val Asp Val Pro (112-119) Met Ala Lys Asn Val Asp Val Pro (112-119)
Ala Ala Gly Cys Leu Arg Tyr Tyr Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile Glu Gly Ala Ala Gly Cys Leu Arg Tyr Tyr Gly Gly Trp Ala Asp Lys Ile Glu Gly
Lys (121-138) Lys (121-138)
Val Asp Thr Ala Pro Asp Ser Phe Asn Tyr (140-149) Val Asp Thr Ala Pro Asp Ser Phe Asn Tyr (140-149)
Gly Val Ile Asn Val Ile Thr Gly Phe Gly Lys Ile (211-222) Gly Val Ile Asn Val Ile Thr Gly Phe Gly Lys Ile (211-222)
Ile Tyr Asp Lys Phe Ile Gln Arg Phe Lys Glu Arg Ala Ala (309-322) Ile Tyr Asp Lys Phe Ile Gln Arg Phe Lys Glu Arg Ala Ala (309-322)
Asn Ala Val Gly Asp Pro Phe Ala Ala Thr (324-333) Asn Ala Val Gly Asp Pro Phe Ala Ala Thr (324-333)
Gln Phe Asp Arg Ile Met Gly Tyr Ile (343-351) Gln Phe Asp Arg Ile Met Gly Tyr Ile (343-351)
Gly Pro Val Cys Thr Ile (396-401) Gly Pro Val Cys Thr Ile (396-401)
Ala Ile Glu Val Ala Asn Ala Leu Arg (433-441) Ala Ile Glu Val Ala Asn Ala Leu Arg (433-441)
Arg Glu Leu Gly Glu Ala Ala Leu Asp (469-477) Arg Glu Leu Gly Glu Ala Ala Leu Asp (469-477)
Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden ( =Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der "Score-Index" größer als 10 ist.
B. Alta11 The T cell epitopes are calculated from the amino acid positions of the midpoints, which are flanked at the N-terminal by a lysine (K) and C-terminal by a proline (P). Potential T cell epitopes are only present if the "score index" is greater than 10. B. Alta11
Die folgende Sequenz 5 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von Altal l und der von ihr abgeleiteten Aminosäuresequenz. Der offene Leserahmen umfaßt 342bp bzw. 114 Aminosäuren. Das berechnete Molekulargewicht bertägt 11127 Dalton und entspricht somit dem UkD großen antigenen Protein, das im Westemblot von 10,3% der Patienten erkannt wird. Sequence 5 below shows the complete cDNA sequence of Altal 1 and the amino acid sequence derived from it. The open reading frame comprises 342bp or 114 amino acids. The calculated molecular weight is 11127 daltons and thus corresponds to the UkD-sized antigenic protein, which is recognized by 10.3% of patients in western emblot.
Sequenz 5: Alta11 =rla2_alt - > 1-phasen Translation 11127 Dalton Sequence 5: Alta11 = rla2_alt -> 1-phase translation 11127 Dalton
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:5 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (1) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 5 (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 342 Basenpaare / 114 Aminosäurereste (A) LENGTH: 342 base pairs / 114 amino acid residues
(B) ART: Nukleinsäure / Protein (B) TYPE: nucleic acid / protein
(C) STRANGFORM: ds (C) STRANDFORM: ds
(D) TOPOLOGIE: linear (D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA to mRNA / protein
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(iv) ANTISENSE: nein (iv) ANTISENSE: no
(v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (v) TYPE OF FRAGMENT: overall sequence
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria altemans (A) ORGANISM: Alternaria altemans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
DNA Sequenz 342 b.p. ATGAAGCACCTC ... CTCTTCGACTAA linearDNA sequence 342 b.p. ATGAAGCACCTC ... CTCTTCGACTAA linear
1 / 1 31 / 11 1/31/11
ATG AAG CAC CTC GCG GCA TAC CTC CTC CTC GGC CTT GGT GGC AAC ACC TCG CCC TCC GCT ATG AAG CAC CTC GCG GCA TAC CTC CTC CTC GGC CTT GGT GGC AAC ACC TCG CCC TCC GCT
met lys his leu ala ala tyr leu leu leu gly leu gly gly asn thr ser pro ser alamet lys his leu ala ala tyr leu leu leu gly leu gly gly asn thr ser pro ser ala
61 / 22 91 / 31 61/22 91/31
GCC GAC GTC AAG GCC GTC CTT GAG TCC GTT GGT ATC GAG GCT GAC TCC GAC CGT CTT GAC GCC GAC GTC AAG GCC GTC CTT GAG TCC GTT GGT ATC GAG GCT GAC TCC GAC CGT CTT GAC
ala asp val lys ala val leu glu ser val gly ile glu ala asp ser asp arg leu asp ala asp val lys ala val leu glu ser val gly ile glu ala asp ser asp arg leu asp
122 / 41 151 / 51 122/41 151/51
AAG CTG ATC TCC GAG CTT GAG GGC AAG GAC ATC AAC GAG CTC ATC GCT TCC GGT TCC GAG AAG CTG ATC TCC GAG CTT GAG GGC AAG GAC ATC AAC GAG CTC ATC GCT TCC GGT TCC GAG
lys leu ile ser glu leu glu gly lys asp ile asn glu leu ile ala ser gly ser glu lys leu ile ser glu leu glu gly lys asp ile asn glu leu ile ala ser gly ser glu
181 / 61 221 / 71 181/61 221/71
AAG CTT GCT TCC GTT CCC TCC GGT GGT GCC GgT GGT GCT GCC GCT TCC GGT GGT GCT GCT lys leu ala ser val pro ser gly gly ala gly gly ala ala ala ser gly gly ala ala AAG CTT GCT TCC GTT CCC TCC GGT GGT GCC GgT GGT GCT GCC GCT TCC GGT GGT GCT GCT lys leu ala ser val pro ser gly gly ala gly gly ala ala ala ser gly gly ala ala
241 / 81 271 / 91 241/81 271/91
GCC GCT GGT GGC TCC GCT CAG GCT GAG GcC GCT CCT GAG GCC GCC AAG GAG GAG GAG AAG ala ala gly gly ser ala gln ala glu ala ala pro glu ala ala lys glu glu glu lys GCC GCT GGT GGC TCC GCT CAG GCT GAG GcC GCT CCT GAG GCC GCC AAG GAG GAG GAG AAG ala ala gly gly ser ala gln ala glu ala ala pro glu ala ala lys glu glu glu lys
301 / 101 331 / 111 301/101 331/111
GAG GAG TCT GAC GAG GAC ATG GGT TTC GGT CTC TTC GAC TAA GAG GAG TCT GAC GAG GAC ATG GGT TTC GGT CTC TTC GAC TAA
glu glu ser asp glu asp met gly phe gly leu phe asp OCH Homologiesuchen in der SWISSPROT-Proteindatenbank ergaben hierglu glu ser asp glu asp met gly phe gly leu phe asp OCH homology searches in the SWISSPROT protein database yielded here
Homologien zum ribosomalen Protein P2. Dieses ribosomale Protein ist an der
Bildung der großen Untereinheit der Ribosomen beteiligt. Somit ist auch zwangsläufig eine Homologie zu Clah11, dem Gegenstück von Alta11 in Cladosporium herbarum, vorhanden. Die Identitäten und Homologien zwischen Alta11 und Clah11 werden aus der folgenden Sequenz 6 heraus ersichtlich. Die Identität der beiden Proteine liegt bei 74%, der Homologiegrad wächst auf 84%, was zweifelsohne auf eine ähnliche Funktion dieser beiden Proteine hinweist. Homologies to the ribosomal protein P2. This ribosomal protein is at the Formation of the large subunit of the ribosomes involved. This means that homology to Clah11, the counterpart of Alta11 in Cladosporium herbarum, is inevitable. The identities and homologies between Alta11 and Clah11 are evident from the following sequence 6. The identity of the two proteins is 74%, the degree of homology increases to 84%, which undoubtedly indicates a similar function of these two proteins.
Saure ribosomale Proteine (wie P0, P1 und P2) von verschiedenen Organismen wurden mit einer Vielzahl von Techniken analysiert. Man unterscheidet Acidic ribosomal proteins (such as P0, P1 and P2) from various organisms have been analyzed using a variety of techniques. One differentiates
A-Proteine (acidic) oder P-Proteine (phosphorylierte A-Proteine). Ein Merkmal derA proteins (acidic) or P proteins (phosphorylated A proteins). A characteristic of
A-Proteine sind die große Zahl hydrophober Aminosäuren. Sie können deshalb relativ leicht vom Ribosom dissoziiert werden (50% Ethanol und hoheA proteins are the large number of hydrophobic amino acids. They can therefore be relatively easily dissociated from the ribosome (50% ethanol and high
Salzkonzentration). Das am besten charakterisierte A-Protein in Prokaryonten ist dasSalt concentration). The best characterized A protein in prokaryotes is that
L7/L12 Protein von Escherichia coli. Die eukaryontischen Homologen sind dieL7 / L12 protein from Escherichia coli. The eukaryotic homologues are
Proteine P1 und P2, die wie auch das L7/L12 Protein mit dem ElongationsfaktorProteins P1 and P2 which, like the L7 / L12 protein, have the elongation factor
EF1 und EF2 interagiert. Die C-terminale Sequenz beinhaltet ein Epitop, das vonEF1 and EF2 interacts. The C-terminal sequence contains an epitope, which of
Autoantikörpern von Lupus-patienten erkannt wird (Francoeur et al. 1985, Rieh et al. 1987 , Hines et el. 1991). Das P2 Protein entspricht in seiner Homologie dem allergenen Protein Alta11. Autoantibodies from lupus patients is recognized (Francoeur et al. 1985, Rieh et al. 1987, Hines et el. 1991). The homology of the P2 protein corresponds to the allergenic protein Alta11.
Die gezeigten B-Zellepitope in der nächsten Sequenz 7 sind unter Berücksichtigung von Sekundärstruktur, Oberflächenlage, Hydrophilität, Flexibilität etc. berechnet worden.
Sequenz 7: Altall =rla2_alt: B-Zellepitope The B cell epitopes shown in the next sequence 7 have been calculated taking into account the secondary structure, surface position, hydrophilicity, flexibility etc. Sequence 7: Altall = rla2_alt: B cell epitopes
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:7 (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 7
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: einzeln angeführt (A) LENGTH: listed individually
(B) ART: Protein (B) ART: protein
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (ii) MOLECULE TYPE: Peptides
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (v) TYPE OF FRAGMENT: N-terminus to C-terminus
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
Leu Gly Gly Asn Thr Ser Pro Ser Ala Ala Asp (12-22) Leu Gly Gly Asn Thr Ser Pro Ser Ala Ala Asp (12-22)
Ile Glu Ala Asp Ser Asp Arg Leu Asp Lys Leu Ile Ser (32-44) Ile Glu Ala Asp Ser Asp Arg Leu Asp Lys Leu Ile Ser (32-44)
Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Asn Glu Leu (45-54) Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Asn Glu Leu (45-54)
Ala Ser Gly Ser Glu Lys Leu Ala Ser (56-64) Ala Ser Gly Ser Glu Lys Leu Ala Ser (56-64)
Pro Glu Ala Ala Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Asp Met Gly Phe (92-109) Pro Glu Ala Ala Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Asp Met Gly Phe (92-109)
Die folgende Sequenz 8 zeigt die berechneten T-Zellepitope und stellt die Aminosäuren im 1-Lettercode dar. The following sequence 8 shows the calculated T cell epitopes and represents the amino acids in the 1-letter code.
Sequenz 8: Vorausgesagte amphipathatische Segmente Sequence 8: Predicted amphipathic segments
T-Zellepitope T cell epitopes
- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - -
RLDKLISELEGKDINELIASG EKLASVPSGG (1) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8 RLDKLISELEGKDINELIASG EKLASVPSGG (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 8
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: einzeln angeführt (A) LENGTH: listed individually
(B) ART: Protein (B) ART: protein
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (ii) MOLECULE TYPE: Peptides
(iü) HYPOTHETISCH: nein (iü) HYPOTHETICAL: no
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (v) TYPE OF FRAGMENT: N-terminus to C-terminus (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
Arg Leu Asp Lys Leu Ile Ser Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Asn Glu Leu Ile Ala Ser Gly (38-58) Arg Leu Asp Lys Leu Ile Ser Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Asn Glu Leu Ile Ala Ser Gly (38-58)
Glu Lys Leu Ala Ser Val Pro Ser Gly Gly (60-69) Glu Lys Leu Ala Ser Val Pro Ser Gly Gly (60-69)
Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden (=Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der "Score-Index" größer als 10 ist. The T cell epitopes are calculated from the amino acid positions of the midpoints, which are flanked N-terminally by a lysine (K), C-terminally by a proline (P). Potential T cell epitopes are only present if the "score index" is greater than 10.
C. Alta22 C. Alta22
Die nachfolgende Sequenz 9 zeigt die vollständige cDNA Sequenz von Alta22. Die daraus abgeleitete Protein Primärsequenz ist ebenfalls aus der Sequenz ersichtlich. Der offene Leserahmen des allergenen Proteins beträgt 615bp, was einer Aminosäurelänge von 205 Aminosäuren entspricht. Das errechnete Molekulargewicht des rekombinanten Proteins beträgt 22041 Dalton. Laut bisheriger Analyse steht dem reifen Protein keine Signalseqenz voran. Sequence 9 below shows the complete cDNA sequence of Alta22. The protein primary sequence derived therefrom can also be seen from the sequence. The open reading frame of the allergenic protein is 615 bp, which corresponds to an amino acid length of 205 amino acids. The calculated molecular weight of the recombinant protein is 22041 daltons. According to previous analysis, the mature protein is not preceded by a signal sequence.
Sequenz 9: YCP4_alt - > 1-phasen Translation 22041 Dalton Sequence 9: YCP4_alt -> 1-phase translation 22041 Dalton
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:9 (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 9
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 615 Basenpaare / 205 Aminosäurereste (A) LENGTH: 615 base pairs / 205 amino acid residues
(B) ART: Nukleinsäure / Protein (B) TYPE: nucleic acid / protein
(C) STRANGFORM: ds (C) STRANDFORM: ds
(D) TOPOLOGIE: linear (D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA / Protein (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA to mRNA / protein
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(iv) ANTISENSE: nein (iv) ANTISENSE: no
(v) ART DES FRAGMENTS: Gesamtsequenz (v) TYPE OF FRAGMENT: overall sequence
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
DNA sequence 615 b.p. ATGGCTCCCAAG ... GCGCATCAGTGA linear DNA sequence 615 b.p. ATGGCTCCCAAG ... GCGCATCAGTGA linear
Homologiesuchen mit dem sequenzierten Protein in der SWISSPROT-Proteindatenbank zeigten, daß das Allergen Alta22 signifikante Homologie zu dem Hefeprotein YCP4 aufweist. Die Identität der beiden Proteine beträgt 56%, die Homologie steigt sogar auf 72% an. Eine so hohe Ähnlichkeit läßt wohl eine gemeinsame Funktion dieser beiden Proteine annehmen. Die nachfolgende Sequenz 10 spiegelt die hohe Homologie von Alta22 und YCP4 wieder. Homology searches with the sequenced protein in the SWISSPROT protein database showed that the allergen Alta22 has significant homology to the yeast protein YCP4. The identity of the two proteins is 56%, the homology increases to 72%. Such a high degree of similarity suggests that these two proteins function together. Sequence 10 below reflects the high homology of Alta22 and YCP4.
Was ist aber nun die Funktion von YCP4: Die Sequenz, bzw. der offene Leserahmen von YCP4, wurde im Rahmen des Hefegenomprojektes am Chromosom 3 von Saccharomyces cerevisiae lokalisiert und publiziert (Biteau et al. 1992). Eine Disruption von YCP4 zeigte nach Biteau et al. (1992) keinen Phänotyp. Durchgeführte verfeinerte Phänotypanalysen deuten aber darauf hin, daß Hefe YCP4 eine Funktion als Hitzeschockprotein besitzen könnte. Dieser Versuch zeigt nebenbei, wie wichtig Saccharomyces cerevisiae für die Funktionsanalyse von Allergenen sein kann. Die leichte Transformierbarkeit, verbunden mit ausgereiften Methoden der Molekulargenetik ermöglichen es, Gene in Hefe zu disruptieren und den daraus resultierenden Phänotyp zu analysieren. But what is the function of YCP4: The sequence or the open reading frame of YCP4 was localized and published as part of the yeast genome project on chromosome 3 of Saccharomyces cerevisiae (Biteau et al. 1992). Disruption of YCP4 showed according to Biteau et al. (1992) no phenotype. However, refined phenotype analyzes carried out suggest that yeast YCP4 may have a function as a heat shock protein. This experiment also shows how important Saccharomyces cerevisiae can be for the functional analysis of allergens. The ease of transformability combined with sophisticated methods of molecular genetics make it possible to disrupt genes in yeast and to analyze the resulting phenotype.
Es hat sich auch gezeigt, daß auch Alta22 seinen homologen Partner in Cladosporium herbarum besitzt. Die folgende Sequenz 11 zeigt ein "multiple sequence alignment" zwischen dem Hefe YCP4 und den Allergenen Alta22 und Clah22. It has also been shown that Alta22 also has its homologous partner in Cladosporium herbarum. The following sequence 11 shows a "multiple sequence alignment" between the yeast YCP4 and the allergens Alta22 and Clah22.
pileup.msf{YCP4_cladopro} KvnfQz.................................................... pileup.msf {YCP4_cladopro} KvnfQz ........................................... .........
pileup.msf{ycp4_yeast} Klfpakeakp stekktttsd aakrqtkpaa attaekkedk gllscctvm pileup.msf {ycp4_yeast} Klfpakeakp stekktttsd aakrqtkpaa attaekkedk gllscctvm
Consensus K - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Consensus K - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Die mit Computerunterstützung gefundenen B-Zellepitope sind in der nächsten Sequenz 12 zu sehen. The B cell epitopes found with computer support can be seen in the next sequence 12.
Sequenz 12: Alta22=YCP4_alt: B-Zellepitope Sequence 12: Alta22 = YCP4_alt: B cell epitopes
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12 (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 12
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: einzeln angeführt (A) LENGTH: listed individually
(B) ART: Protein (B) ART: protein
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (ii) MOLECULE TYPE: Peptides
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (v) TYPE OF FRAGMENT: N-terminus to C-terminus
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
Lys Met Tyr Ala Pro Pro Lys Asp Ser Ser Val (50-60) Lys Met Tyr Ala Pro Pro Lys Asp Ser Ser Val (50-60)
Ile Pro Thr Arg Tyr Gly Asn Phe Pro (79-87) Ile Pro Thr Arg Tyr Gly Asn Phe Pro (79-87)
Gln Phe Lys Thr Phe Trp Asp Lys Thr Gly Lys Gln Trp Gln Gln Gly Ala Phe Trp Gly Lys Tyr Gln Phe Lys Thr Phe Trp Asp Lys Thr Gly Lys Gln Trp Gln Gln Gly Ala Phe Trp Gly Lys Tyr
Ala Gly (89-112) Ala Gly (89-112)
Gly Thr Leu Gly Gly Gly Gln Glu Thr Thr Ala Ile Thr Ser (118-131) Gly Thr Leu Gly Gly Gly Gln Glu Thr Thr Ala Ile Thr Ser (118-131)
Leu Asp Glu Val His Gly Gly Ser Pro Trp Gly Ala Gly Thr (157-170) Leu Asp Glu Val His Gly Gly Ser Pro Trp Gly Ala Gly Thr (157-170)
Phe Ser Ala Gly Asp Gly Ser Arg Gln Pro Ser Glu Leu Glu Leu (171-185) Phe Ser Ala Gly Asp Gly Ser Arg Gln Pro Ser Glu Leu Glu Leu (171-185)
Die nachfolgende Sequenz 13 zeigt die berechneten T-Zellepitope. Amphipathische Bereiche mit einem Score geringer als 10 werden als nicht relevant angenommen. Sequence 13 below shows the calculated T cell epitopes. Amphipathic areas with a score less than 10 are assumed to be irrelevant.
Sequenz 13:Vorausgesagte amphipathatische Segmente Sequence 13: Predicted amphipathic segments
T-Zellepitope T cell epitopes
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
SMYGHIKKMAD GIQEASMYGHIKKMAD GIQEA
LFQVAETLPQEVLDKMYA AVLEEFDGILFQVAETLPQEVLDKMYA AVLEEFDGI
TRYGNFPAQFKTFWDKTGKQW
TAITSMSTL TRYGNFPAQFKTFWDKTGKQW TAITSMSTL
FSMLANLDEVHG FSMLANLDEVHG
QGKAFYEAVA QGKAFYEAVA
(1) ANGABEN ZU SEQ ID NO:13 (1) INFORMATION ON SEQ ID NO: 13
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: einzeln angeführt (A) LENGTH: listed individually
(B) ART: Protein (B) ART: protein
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptide (ii) MOLECULE TYPE: Peptides
(iii) HYPOTHETISCH: nein (iii) HYPOTHETICAL: no
(v) ART DES FRAGMENTS: N-Terminus bis C-Terminus (v) TYPE OF FRAGMENT: N-terminus to C-terminus
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: (vi) ORIGINAL ORIGIN:
(A) ORGANISMUS: Alternaria alternans (A) ORGANISM: Alternaria alternans
(C) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporen und vegetative Hyphen (C) DEVELOPMENT STAGE: spores and vegetative hyphae
Ser Met Tyr Gly His Ile Lys Lys Met Ala Asp (11-21) Ser Met Tyr Gly His Ile Lys Lys Met Ala Asp (11-21)
Gly Ile Gln Glu Ala (26-30) Gly Ile Gln Glu Ala (26-30)
Leu Phe Gln Val Ala Glu Thr Leu Pro Gln Glu Val Leu Asp Lys Met Tyr Ala (36-53) Leu Phe Gln Val Ala Glu Thr Leu Pro Gln Glu Val Leu Asp Lys Met Tyr Ala (36-53)
Ala Val Leu Glu Glu Phe Asp Gly Ile (67-75) Ala Val Leu Glu Glu Phe Asp Gly Ile (67-75)
Thr Arg Tyr Gly Asn Phe Pro Ala Gln Phe Lys Thr Phe Trp Asp Lys Thr Gly Lys Gln Trp Thr Arg Tyr Gly Asn Phe Pro Ala Gln Phe Lys Thr Phe Trp Asp Lys Thr Gly Lys Gln Trp
(81-101) (81-101)
Thr Ala Ile Thr Ser Met Ser Thr Leu (127-135) Thr Ala Ile Thr Ser Met Ser Thr Leu (127-135)
Phe Ser Met Leu Ala Asn Leu Asp Glu Val His Gly (151-162) Phe Ser Met Leu Ala Asn Leu Asp Glu Val His Gly (151-162)
Gln Gly Lys Ala Phe Tyr Glu Ala Val Ala (191-200) Gln Gly Lys Ala Phe Tyr Glu Ala Val Ala (191-200)
Die T-Zellepitope errechnen sich aus den Aminosäurepositionen der Midpoints, die N-terminal von einem Lysin (K), C-terminal von einem Prolin (P) flankiert werden (=Flags). Es sind nur dann potentielle T-Zellepitope vorhanden, wenn der "Score-Index" größer als 10 ist.
Literatur The T cell epitopes are calculated from the amino acid positions of the midpoints, which are flanked at the N-terminal by a lysine (K) and C-terminal by a proline (P). Potential T cell epitopes are only present if the "score index" is greater than 10. literature
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Claims
1. Rekombinante DNA Moleküle, die für Polypeptide kodieren, die die Antigenität der Allergene Alta53, Alta22 und Altal l besitzen oder für Peptide, die mindestens ein Epitop dieser Allergene aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die mit den Sequenzen 1, 3-5, 7-9, 12 und 13, oder mit Teilbereichen dieser Sequenzen in homologer Weise übereinstimmen, bzw. Nucleinsäuresequenzen, die mit den genannten Nucleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. 1. Recombinant DNA molecules which code for polypeptides which have the antigenicity of the allergens Alta53, Alta22 and Altal 1 or for peptides which have at least one epitope of these allergens, characterized in that they have nucleic acid sequences which correspond to the sequences 1, 3 -5, 7-9, 12 and 13, or with partial regions of these sequences in a homologous manner, or nucleic acid sequences which hybridize with the nucleic acid sequences mentioned under stringent conditions.
2. Rekombinante DNA-Moleküle nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die durch Degeneration aus den Sequenzen 1, 3-5, 7-9, 12 und 13 ableitbar sind. 2. Recombinant DNA molecules according to claim 1, characterized in that they have nucleic acid sequences which can be derived from sequences 1, 3-5, 7-9, 12 and 13 by degeneration.
3. Rekombinante DNA Moleküle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die für Polypeptide kodieren, die als Antigene kreuzreaktiv mit den Allergenen Alta53, Alta22 und Altall sind und zu diesen eine hohe Homologie aufweisen. 3. Recombinant DNA molecules according to claim 1 or 2, characterized in that they have nucleic acid sequences which code for polypeptides which are cross-reactive as antigens with the allergens Alta53, Alta22 and Altall and have a high homology to them.
4. Rekombinante DNA-Moleküle nach Ansprüchen 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß sie funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz zu einem Expressionskonstrukt verbunden sind. 4. Recombinant DNA molecules according to claims 1 to 3, characterized in that they are functionally linked to an expression control sequence to form an expression construct.
5. Wirtssystem zur Expression von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt nach Anspruch 4 transformiert ist. 5. Host system for the expression of polypeptides, characterized in that it is transformed with a recombinant expression construct according to claim 4.
6. Aus einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitetes rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Antigenität von Alta53, Alta22 oder Alta11 , oder zumindest von einem Epitop dieser Proteine, aufweist. 6. Recombinant or synthetic protein or polypeptide derived from a DNA molecule according to one of claims 1 to 3, characterized in that it has the antigenicity of Alta53, Alta22 or Alta11, or at least of an epitope of these proteins.
7. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder ein Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosäuresequenz aufweist, die den gezeigten Sequenzen 1 , 3-5, 7-9, 12 und 13 zur Gänze oder teilweise entspricht. 7. Recombinant or synthetic protein or a polypeptide according to claim 6, characterized in that it has an amino acid sequence which corresponds to the sequences shown 1, 3-5, 7-9, 12 and 13 in whole or in part.
8. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusionsprodukt darstellt, das die Antigenität der Allergene Alta53, Alta22 oder Altai 1 , oder zumindest eines Epitops davon, aufweist und einen zusätzlichen Polypeptidanteil besitzt, wobei das gesamte Fusionsprodukt von der DNA eines Expressionskonstrukts gemäß Anspruch 4 kodiert wird. 8. Recombinant or synthetic protein or polypeptide according to claim 6 or 7, characterized in that it is a fusion product which has the antigenicity of the allergens Alta53, Alta22 or Altai 1, or at least one epitope thereof, and has an additional polypeptide portion, the entire fusion product is encoded by the DNA of an expression construct according to claim 4.
9. Rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte zusätzliche Polypeptidanteil ß-Galaktosidase oder ein anderes zur Fusion geeignetes Polypeptid ist. 9. Recombinant or synthetic protein or polypeptide according to claim 8, characterized in that said additional polypeptide portion is β-galactosidase or another polypeptide suitable for fusion.
10. Diagnostisches oder therapeutisches Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß es ein synthetisches Protein oder Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält. 10. Diagnostic or therapeutic reagent, characterized in that it contains a synthetic protein or polypeptide according to one of claims 6 to 9.
11. Verfahren zum in vitro -Nachweis der Allergie eines Patienten gegen die Allergene Alta53, Alta22 oder Alta11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion der IgE Antikörper im Serum des Patienten mit einem rekombinanten oder synthetischen Protein oder Polypeptid nach einem der Anprüche 6 bis 9 gemessen wird. 11. A method for in vitro detection of a patient's allergy to the allergens Alta53, Alta22 or Alta11, characterized in that the reaction of the IgE antibodies in the patient's serum with a recombinant or synthetic protein or polypeptide is measured according to one of Claims 6 to 9 becomes.
12. Verfahren, zum in vitro - Nachweis der zellulären Reaktion auf die 12. Method for in vitro detection of the cellular response to the
Allergene Alta53, Alta22 oder Alta11 , dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes oder synthetisches Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Stimulierung oder Hemmung der zellulären Reaktion eingesetzt wird. Allergens Alta53, Alta22 or Alta11, characterized in that a recombinant or synthetic protein or polypeptide according to one of claims 6 to 9 is used to stimulate or inhibit the cellular response.
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