WO1995022056A1 - Surfaces hautement specifiques pour reactions biologiques, procede pour leur preparation et procede pour leur utilisation - Google Patents

Surfaces hautement specifiques pour reactions biologiques, procede pour leur preparation et procede pour leur utilisation Download PDF

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WO1995022056A1
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David Bensimon
Aaron Bensimon
François HESLOT
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Institut Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • Y10T436/145555—Hetero-N

Definitions

  • the present invention relates in particular to very highly specific surfaces usable in biology as well as their applications and methods for their preparation.
  • molecular fishing that is to say the possibility of being able to demonstrate each of the molecules which are sought when they are at very low concentrations, does not has so far not been possible.
  • the analysis of a DNA sample involves the use of a so-called "hybridization" probe corresponding to the sequence complementary to the sequence sought.
  • the problem posed is to isolate the hybrid from the medium and to detect with a good signal / noise ratio (S / N) the possibly reduced number of positive reactions.
  • S / N signal / noise ratio
  • the amplification step is sensitive to contaminants and leads to its own errors.
  • French patent 78 10975 describes a process coupling the probe to an enzyme which allows revelation using a chromogenic substrate. It is also possible to quantify the reaction by a measurement of colorimetry.
  • the methods of the prior art or their combinations have a certain number of drawbacks, in particular: either of being potentially dangerous by the use of radioactive products, or of requiring too long revelation times, - or of be hampered by specific problems at the level of the amplification phase, either to pass through insufficiently specific solid surfaces, or to be too insensitive, or, finally, to require in addition to the phase of attachment to a solid the inconvenient use, of course, of an electron microscope.
  • the known methods do not make it possible to recognize the specific position of the desired motif on a given molecule.
  • This type of recognition is important when one seeks to make a mapping, in particular within the framework of genome mapping, one seeks to know first of all the approximate spatial position relative to one end of the molecule of a given gene on a DNA or an RNA.
  • the present invention which proposes to remedy the drawbacks of the prior methods relies on the use of very highly specific surfaces which, when implemented, lead to excessively limited background noise, in particular because they eliminate parasitic fixations. .
  • the present invention relates to a highly specific surface for biological reactions, characterized in that it comprises a support having on the surface at least one essentially compact layer of an organic compound having, outside the layer, a group presentation comprising an ethylenic double bond, in particular a vinyl group, having an affinity for a type of molecule with biological activity under certain reaction conditions, in particular of pH or of ionic contents, the other elements of the layer being essentially inaccessible for said molecules in said reaction conditions.
  • affinity is meant here both a chemical reactivity and an adsorption of any type, this under the conditions of fixation of said biological molecules.
  • support is meant both a solid support and a support consisting of a non-solid element such as a liquid or gaseous particle having, in particular, a compact layer as described above.
  • the surface is "essentially compact", that is to say that it limits the access of the molecule with biological activity to the lower layers and / or to the support, it being understood that defects in the coverage of the surface are tolerable.
  • anchoring is meant here a fixation by covalent bond resulting from a chemical reactivity, or non-covalent bond resulting from physicochemical interactions such as an adsorption of any type, this under the conditions of pH or content ionic medium for fixing said biological molecules.
  • the surfaces according to the present invention can be obtained by the implementation of various methods. As an example, we can cite:
  • the rest of the layer consisting of hydro- or fluorocarbon groups;
  • surfaces obtained by depositing or anchoring on a solid one or more molecular layers these can be obtained by the formation of successive layers fixed by non-covalent bonds, Langmuir-Blodgett film type, or by auto -Molecular assembly, this allowing the formation of a layer fixed by covalent bond.
  • the surface can be obtained by polymerization of at least one monomer generating on the surface of the polymer said group comprising an ethylenic double bond, or else by partial depolymerization of the surface of a polymer to generate said group, or alternatively by polymer deposition.
  • the polymer formed has vinyl bonds such as a polyene derivative, in particular surfaces of the synthetic rubber type, such as polybutadiene, polyisoprene or natural rubber.
  • the highly specific surface for biological reactions according to the present invention comprises: on a support, a substantially monomolecular and compact layer of an organic compound of elongated structure having at least:. an attachment group having an affinity for the support, and an exposed group comprising an ethylenic double bond, having no or little affinity for said support and said attachment group under the conditions of attachment, but having an affinity for a type of biological molecule.
  • the various organic compounds are preferably capable of reacting with one another outside the exposed group to create transverse bonds, thus obtaining a "essentially" compact monomolecular layer thanks to which the support becomes not or hardly accessible for parasitic reactions.
  • the organic compound has a fixing group at one end and an exposed group at the other end. It is of course possible to provide different embodiments in which, for example, the fixing group would be located in the middle of the molecule, the latter having at each of its ends an exposed group.
  • the surfaces can be analyzed according to: a) the support, b) the molecule having an exposed group and a fixing group on the support, c) the interaction between the support and said molecule ensuring the fixing.
  • the attachment may first of all be of the non-covalent type, in particular of the hydrophilic / hydrophilic and hydrophobic / hydrophobic type, as in the films of Langmuir-Blodgett (KB Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935 ) and US 5,102,798).
  • the fixing group will be either hydrophilic or hydrophobic, in particular alkyl or haloalkyl groups such as CH 3 , CF 3 , CHF 3 , CH 2 F.
  • the binding can also be of covalent type, the binding group will then react chemically on the support.
  • Certain surfaces of approaching structure have already been mentioned in the electronic field, in particular when the fixings are covalent, L. Netzer and J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) and US-A-4,539,061.
  • metal alkoxide type groups such as silane, silane chloride, ethoxysilane, methoxysilane.
  • the fixing group is obviously chosen according to the support used.
  • the support according to the invention may consist at least on the surface, of a polymer, a metal, a metal oxide, a semiconductor element or an oxide of a semiconductor element such as a silicon oxide or a combination thereof. . Mention is made in particular of glass and surface oxidized silicon.
  • fixing groups mention should be made more particularly of groups of the metal alkoxide type such as silane, chlorosilane, chlorosilane, silanol, methoxysilane, ethoxysilane, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonic, carboxylic, boronic, halogen, acid halide, aldehyde.
  • groups of the metal alkoxide type such as silane, chlorosilane, chlorosilane, silanol, methoxysilane, ethoxysilane, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, amine, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonic, carboxylic, boronic, halogen, acid halide, aldehyde.
  • attachment group it will be preferred to use groups capable of reacting transversely with an equivalent, neighboring group, to provide the transverse bonds, for example they will be derivatives of the silane type, in particular dichlorosilane, trichlorosilane, dimethoxysilane, trimethoxysilane, diethoxysilane and triethoxysilane.
  • These transverse connections can also be carried out at any point in the thickness of the monolayer, by polymerizing it with the aid of reactive groups possibly present on the chain between the site of fixation and the exposed group.
  • diacetylene groups are known to allow one- or two-dimensional polymerization of the monolayer.
  • the choice of the fixing group will obviously depend on the nature of the support, the silane type groups are well suited for covalent fixing on glass and silica.
  • the chains connecting the group exposed to the fixing group are chains comprising at least 1 carbon atom, preferably more than 6 and in general from 3 to 30 carbon atoms.
  • a gas phase making it possible to avoid the use of solvent.
  • support includes both a single surface such as a blade, but also particles whether it is silica powder or polymer beads, and also any shapes such as bar, fiber or structured support, which can also be made magnetic, fluorescent or colored, as is known in various dosing technologies.
  • the support will be chosen to be little or no fluorescent when the detection is carried out by fluorescence.
  • biotin e.g. biotin
  • proteins mention should be made of antigens and antibodies, ligands, receptors, but also products of avidin or streptavidin type as well as derivatives of these compounds.
  • RNAs and DNAs mention should also be made of ⁇ , ⁇ derivatives as well as thio derivatives and mixed compounds such as PNAs.
  • This end-dependent and specific pH attachment effect has an improvement compared to other surfaces which require functionalization of DNA (biotin, DIG, NHS, etc.) or of specific reagents (carbodiimide, dimethyl pimelidate) which realize a peptide or phosphorimide bond between - NH 2 and -COOH or -POOH.
  • a specific antibody on the surface for example anti-DIG
  • a surface is created whose reactivity is limited to the antigen (for example the DIG group). This indicates that the initial chemical groupings have all been obscured by the anchored antibodies.
  • the present invention also relates to the surfaces obtained by the implementation of the methods according to the present invention and all the methods implementing this type of surface, whether these are methods allowing the detection and / or the quantification of biological molecules, but also the separation of certain biological molecules, in particular a sample by using antigen / antibody and / or DNA, DNA / RNA coupling techniques.
  • the present invention also relates to processes for the preparation of highly specific surfaces for biological reactions as described above for obtaining the layers according to (A) and (B) and, in particular, the process characterized in that: a support a substantially monomolecular and compact layer of an organic compound of elongated structure having at least: a fixing group having an affinity for the support, and.
  • the present invention also relates to the applications of treated surfaces to the detection of isolated molecules using specific reagents and detection methods with an S / N ratio independent of the number of molecules detected.
  • the present invention relates to a method for detecting and / or assaying a molecule with biological activity in a sample, characterized in that a surface as described above is used, on which is fixed a molecule with biological activity capable of recognizing the molecule of the sample, and in that the detection or the assay are carried out using a fluorescent reagent or not detecting the presence of the fixed molecule.
  • the fluorescent reagents contain fluorescent molecules, chosen with advantage to be long molecules of size greater than 0.1 ⁇ m and reacting specifically directly or indirectly with the pretreated surfaces.
  • fluorescent molecules chosen with advantage to be long molecules of size greater than 0.1 ⁇ m and reacting specifically directly or indirectly with the pretreated surfaces.
  • a double stranded DNA molecule tinted using fluorescent probes ethidium bromide, YOYO, fluorescent nucleotides, etc.
  • DIG dimethyl methoxyribonuentas
  • biotin biotin
  • anti-DIG streptavidin, etc.
  • the non-fluorescent reagents consist, in particular, of beads anchored by means of a molecule specifically attached directly or indirectly to a pretreated surface.
  • these beads have a weak non-specific interaction with the surface.
  • Dynal beads coated with streptavidin and anchored via biotynilized DNA to a surface according to the present invention having sites capable of reacting with the other end of the DNA molecule.
  • reaction volumes For example, but not limited to carrying out the reaction in a volume of a few microliters determined by the spacing between two surfaces, one of which is treated to present reactive sites according to the present invention and the other is inert or treated so as not to present reactive sites.
  • mode X and mode Y two implementations of the present invention can be used for macroscopic low noise detection of a small number of reactions for anchoring the reagent.
  • mode X a test of the number of specific reactions having occurred is obtained directly by a fluorescence technique, allowing for certain embodiments of the present invention to individually identify the number of sites that responded.
  • the highly specific surface is advantageously taken to have a very low rate of fluorescence, in particular the support must have a weak fluorescence.
  • the detection and counting of the possibly small number of anchoring reactions can advantageously be done with the help of a fluorescent optical microscope using a large numerical aperture objective, making it possible to locate either directly at the eye, or after signal acquisition, the number of fluorescent molecules anchored.
  • the observation field can be scanned to explore a larger area than the single fixed field.
  • a macroscopic reagent of the ball type (fluorescent, magnetic, colored, for example) is detected.
  • a new method comprises:
  • the number of these macroscopic beads each characterizing an anchoring reaction is then determined by a macroscopic physical method among which, but not limited to, we can cite the scattering of light on the beads, optical microscopy and the fluorescence of marbles.
  • the specificity of certain biological reactions may be limited.
  • the hybrids can be imperfect (reactions with other sites) while presenting a reduced number of apartments and therefore a lower quality of connection.
  • the present invention also covers the possible use of a step for testing the quality of the links obtained. This test makes it possible to dissociate the paired products in a weak non-specific manner, by adsorption, hybridophobic forces, imperfect hydrogen bonds, imperfect hybridization, in particular.
  • the invention also relates, in a detection or assay method as described above, to a method in which the reaction product between the molecule with biological activity and the molecule of the sample is subjected to a constraint in order to destroy the bad pairings before detection.
  • This method offers, in addition to the possibility of destroying the mismatched couples, the possibility of orienting the products of the coupling, which facilitates measurements or observations.
  • the molecule being immobile one can integrate its fluorescence signal.
  • the DNA molecules are stable (remain intact, even after several weeks) and fluorescent.
  • This property can advantageously be used to delay the anchoring step from the step of locating / counting the anchored molecules, if this detection is done for example, but not limited to, by fluorescence microscopy. Such use is covered by the present invention.
  • a double (or multi) fluorescence technique can possibly be used to improve the S / N ratio or to detect a double or multi functionality.
  • the surfaces and / or reagents and / or detection techniques described in the present invention can be used for numerous applications among which, but not limited to: the identification of one or more DNA sequencing elements or RNA which can be used with advantage for the diagnosis of pathogens or genetic mapping; measuring the size of DNA fragments that can be advantageously used for genetic mapping; improving the sensitivity of ELISA techniques with the possibility of detecting a small number (possibly less than 1000) of immunological reactions.
  • the identification of DNA / RNA sequences can be done first by reaction in the volume of the solution of DNA / RNA molecules with complementary probes (for example by hybridization or using proteins specific to the segment research).
  • FIG. 1 shows diagrammatically the detection of a pathogen in a fluorescent DNA molecule by hybridization with an anchor molecule
  • FIG. 2 diagrams the genetic mapping by DNA extension and the use of a marker DNA
  • FIG. 3 diagrams the detection of an immunological reaction (ELISA) using a “flag” molecule: a fluorescent DNA used as a reaction marker
  • Figure 4 is a fluorescence micrograph showing the extension of phage ⁇ DNA by the advancement of the meniscus, on the left we see DNA molecules in solution stretched by the evaporation flow parallel to the meniscus, on the right DNA molecules in the open air after stretching perpendicular to the meniscus
  • FIG. 5 (a) and 5 (b) are fluorescence micrographs showing, respectively, a DNA labeled with digogixenin (DIG) on a surface covered with anti-DIG and stretched by the meniscus, and, in control, a DNA not labeled on an anti-DIG surface, we will note the very high specificity of the surfaces and the absence of non-specific anchoring;
  • FIG. 6 is a fluorescence photomicrograph showing a conventional commercial surface such as NUNC, note the very large fluorescence inhomogeneities which make these surfaces impossible to use for the fluorescent detection of a single molecule.
  • the probes (the “anchors”) have a reactive group (DIG, biotin, etc.) capable of being anchored in a specific manner to a surface according to the present invention (having for example the site of anchoring an anti-DIG antibody or streptavidin).
  • the detection of the anchoring reaction can be done directly by detecting the fluorescence of the DNA molecule stained by fluorescent molecules (ethidium bromide, YOYO, fluorescent nucleotides) ( Figure 1).
  • a "flag molecule” a reagent according to the present invention capable of binding to the DNA / RNA molecule (for example by hybridization, protein-DNA interaction, etc.), but showing no affinity for the sites for anchoring the probe.
  • the complementary probes can be directly coupled to a fluorescent reagent according to the present invention. It may, for example, be a single strand of complementary DNA having bases modified to be fluorescent or a long double strand of DNA stained with a fluorophore A and ending in a single strand segment complementary to the sequence wanted.
  • fluorophores of different colors can be used. It is also possible, with advantage, to dye the DNA molecule on which the probes come to hybridize with a fluorophore of another color.
  • the DNA-probe hybrid is anchored at one of its ends and stretched by one of the methods described above.
  • the distance from the anchor point to the hybridization points, or between the hybridization points, is determined by detecting the fluorescence of the probe, according to the methods described above ( Figure 2).
  • a marker DNA of approximately 3,000 base pairs and having at one of its ends a single-stranded segment complementary to the gene sought, is stained with a fluorophore A (for example YOYOl) .
  • This DNA is hybrid then ligated with the single strand DNA to be mapped, then the latter is stained with a second fluorophore B (POPOl) (after reaction by "random primming", to transform it into double strand DNA).
  • POPOl second fluorophore B
  • the molecule is then anchored by one of its ends (for example by DIG / anti-DIG bond) and stretched by the action of the meniscus.
  • the distance between the end of the molecule and the position of the labeled gene, observable by double fluorescence microscopy (2 colors A and B) makes it possible to establish the position of the gene sought with an accuracy of the order of 1000 pairs of bases (0.3 ⁇ m).
  • the identification of DNA / RNA sequences can also be done by reaction between the sequence sought and the reactive sites of a surface according to the present invention (for example complementary oligonucleotides or the reaction site of a segment specific protein. research). The detection of the anchoring reaction can then be done directly or indirectly (using a "flag molecule") as described above. It is understood that the identification of DNA / RNA sequences according to the present invention can be used for diagnostic purposes (for example the detection of the presence or absence of a viral or chromosomal pathogen) as well as for genetic mapping purposes. It can be preceded by an amplification step by any method, in particular PCR.
  • the molecules are then stretched by the meniscus and the size of the stretched fragments determined by fluorescence optical microscopy with a resolution and a size limit of the order of 1000 bp (0.3 ⁇ m).
  • the surfaces according to the present invention can be used for the implementation of known methods allowing the detection and / or the quantification of an antigen or of an antibody, in particular the ELISA methods implementing enzymatic systems or methods RIA type using radioactive markers. These are technologies which will not be described again in detail.
  • the surfaces according to the present invention as a support for the immunological reactions of an ELISA method having a step of anchoring a reagent according to the present invention ("flag") on one of the reagents of the ELISA ( Figure 3).
  • the detection can naturally be done globally by measuring fluorescence. It is also possible to count the number of reactions, this can advantageously be carried out according to the detection methods described in the present invention, in particular extension by the meniscus, and this thanks to the low rate of fluorescence and non-specific interaction of the product of the present invention. This allows the detection of a small number of reactions (possibly less than 1000) with an excellent S / N ratio.
  • the chromatography step must allow a specific specificity of the column with respect to eluents, for example a mixture of DNA, some of which have sequences complementary to or very close to the grafted oligonucleotide.
  • eluents for example a mixture of DNA, some of which have sequences complementary to or very close to the grafted oligonucleotide.
  • the present invention finally relates to the use of the surfaces according to the present invention in diagnostic or separation kits.
  • the DNA- ⁇ and the monoclonal antibody come from Boehringer-Mannheim.
  • the trichlorosilanes come from Roth-Sochiel.
  • the fluorescent nucleic probes (YOYOl, YOY03 and POPOl) come from Molecular Probes.
  • the ultra clean glass coverslips come from Erie Scientific (coverslips (ESCO).
  • the magnetic particles come from Dynal.
  • the microscope is a NIKKON Diaphot inverted microscope, equipped with a Xenon lamp for epifluorescence and a CCD camera. intensified Hamamatsu for visualization.
  • the preparation is incubated for about 1 hour at room temperature in an atmosphere saturated with water vapor.
  • an almost general anchoring of the DNA molecules is observed.
  • the evaporating solution will stretch the DNA molecules, anchored to the surface, perpendicular to the meniscus.
  • the capillary force on the DNA molecule (a few tens of picoNewtons) is indeed sufficient to completely stretch the molecule (greater than the forces of entropy elasticity), but too weak to break the bond between the end of the molecule and the surface treated.
  • the DNA being fluorescently labeled, the stretched molecules are observed individually and easily (total length about 22 ⁇ m).
  • the anchoring between the surface and the DNA being limited to the ends, it was also possible to stretch DNA from phage ⁇ , YAC or E. coli (total length greater than 400 ⁇ m).
  • This preparation of stretched, fluorescent and air DNA free is stable for several days and can be observed non-destructively, by epifluorescence (Nikkon Diaphot inverted microscope with x100 objective, ON: 1.25).
  • Detection of anchoring by electrophoresis An electrophoretic cell is formed by a paraffin ring (thickness approximately 100 ⁇ m) caught between a treated coverslip and an untreated glass coverslip between which two platinum electrodes are inserted. The whole is made integral by briefly melting the paraffin ring. Thanks to two openings left in the paraffin ring, the DNA solution is introduced into this cell by capillary action, then the two openings are sealed with paraffin. Incubate, as before, at room temperature.
  • the sensitivity of the method according to the invention allows individual detection and counting of less than 1000 DNA molecules.

Abstract

La présente invention concerne notamment une surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche essentiellement compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé comportant une double liaison éthylénique ayant une affinité pour un type de molécule à activité biologique dans certaines conditions de réaction, les autres éléments de la couche étant essentiellement non accessibles pour lesdites molécules dans lesdites conditions de réaction.

Description

SURFACES HAUTEMENT SPECI FIQUES POUR REACTIONS BIOLOGIQUES , PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ET PROCEDE POUR LEUR UTILISATION .
5 La présente invention concerne notamment des surfaces très hautement spécifiques utilisables en biologie ainsi que leurs applications et des procédés pour leur préparation.
On connaît depuis longtemps la très grande spécificité et la très grande sélectivité de certaines réactions biologiques, notamment les 10 réactions antigènes/anticorps, les réactions d'hybridation d'ADN ou d 'ARN, les réactions interprotéines ou de type avidine/streptavidine/biotine, de même que les réactions des ligands et de leurs récepteurs.
On sait maintenant tirer partie de ces spécificités, notamment 15 pour mettre en évidence la présence ou l'absence de l'un des éléments du couple réactionnel dans un échantillon ou bien éventuellement pour séparer l'un des éléments du couple d'un milieu plus complexe.
Toutefois, lorsque l'on souhaite détecter la présence d'une molécule à très faible concentration dans un milieu très complexe, les
20 procédés actuellement connus donnent parfois des résultats très aléatoires, compte tenu notamment du problème des bruits de fond intervenant lors des étapes de séparation et/ou de détection.
C'est pourquoi, ce qui sera appelé ci-après "pêche moléculaire", c'est-à-dire la possibilité de pouvoir mettre en évidence 25 chacune des molécules qui sont recherchées lorsqu'elles sont à des concentrations très faibles, n'a jusqu'ici pas été possible.
A titre d'exemple, l'analyse d'un échantillon d'ADN passe par l'utilisation d'une sonde dite d' "hybridation" correspondant à la séquence complémentaire de la séquence recherchée. Dans ces conditions, le 30 problème posé est d'isoler l'hybride du milieu et de détecter avec un bon rapport signal/bruit (S/N) le nombre éventuellement réduit de réactions positives. C'est pourquoi on utilise maintenant, dans la plupart des cas, une étape intermédiaire destinée à amplifier la séquence que l'on cherche à détecter, par exemple en utilisant la méthode PCR ou des méthodes d'amplification conduisant aux mêmes résultats, dans ces conditions on augmente la concentration de la séquence à déterminer dans l'échantillon et cette détection est évidemment beaucoup plus commode.
Cependant, l'étape d'amplification est sensible aux contaminants et conduit à des erreurs qui lui sont propres.
Il serait donc préférable, dans la mesure du possible, de pouvoir détecter la présence de la séquence d'acide nucléique sans phase d'amplification.
On a proposé d'utiliser, de façon à mettre en évidence la réaction d'hybridation spécifique, une étape intermédiaire d'ancrage du produit d'hybridation sur une surface solide présentant certaines spécificités. Par exemple, il est possible d'utiliser certaines surfaces prétraitées permettant de fixer certaines protéines ou de l'ADN, qu'il ait été ou non modifié.
De telles surfaces sont commercialement disponibles
(Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal par exemple) sous forme de billes ou de puits présentant à leur surface des groupements COOH, NH2 ou OH par exemple.
Il a été proposé également pour obtenir de tels groupements d'utiliser une étape intermédiaire présentant un groupement vinyl qui est ensuite oxydé pour présenter des groupes COOH ou OH (USA 4.539.061 et EP 435 785).
On peut alors fonctionnaliser l'ADN avec un groupement réactif, aminé par exemple, et procéder à une réaction avec ces surfaces.
Ces méthodes nécessitent cependant une fonctionnalisation particulière de l'ADN à fixer. On a également décrit une technique permettant l'ancrage sans traitement préalable de l'ADN. Ce procédé consiste à faire réagir le phosphate libre de l'extrémité 5' de la molécule avec une aminé secondaire (surface NH Covalink). On peut aussi fixer l'ADN à un groupement ou une protéine Po pour la faire réagir avec une sufaçe recouverte d'un groupement ou une protéine Pi, susceptible de réagir spécifiquement avec Po- Le couple Po/ Pi peut être un couple de type biotine/streptavidine ou digoxigénine/anticorps dirigé contre la digoxigénine, (anti-DIG) par exemple.
De telles surfaces sont, cependant, dans la plupart des cas insuffisamment spécifiques (V. Lund et al., Nucl. Acids Res., 16, 1861 ( 1988)). Ainsi, la présence d'interactions parasites, même faibles, de type adsorption non-spécifique conduit à des adsorptions efficaces pour des molécules longues, capables de contracter avec le solide un grand nombre de points d'interaction faible. Ces surfaces conduisent à des applications potentielles manquant de sensibilité et/ou avec un grand taux de bruit de fond dans le cas d'un petit nombre de molécules à pêcher. De plus, certaines de ces surfaces présentent un fort taux de fluorescence parasite potentiellement gênante lors de la phase de détection.
Pour ce qui concerne la détection proprement dite, en particulier pour la mise en évidence de l'ADN, le brevet Français 78 10975 décrit un procédé couplant la sonde à une enzyme qui permet la révélation à l'aide d'un substrat chromogène. Il est, en outre, possible de quantifier la réaction par une mesure de colorimétrie.
Une telle technique n'est cependant pas adaptée directement à la détection de traces, c'est pourquoi, là aussi, elle doit être précédée dans la plupart des cas d'une étape d'amplification de la quantité d'acide nucléique recherchée, par exemple par la méthode PCR.
Ce procédé de détection dit "par sonde froide" a été développé pour éviter l'utilisation de marqueurs radioactifs qui donnent des résultats qui en sensibilité sont voisins mais qui évidemment présentent des problèmes de manipulation, compte tenu de la présence de produits radioactifs et des problèmes de temps de révélation longs si on cherche une grande sensibilité. Pour certaines applications particulières, notamment des méthodes dérivées de l'imagerie ex-vivo, on a proposé une méthode directe d'observation de la réaction en couplant le produit de l'hybridation à des microbilles, notamment de PMMA, convenablement traitées chimiquement à leur surface. La méthode repose sur l'identification directe sous microscope à balayage électronique de la présence de ces microbilles d'un diamètre typique de 60 nm et de plus repose sur les techniques d'ancrage sur solides connues mais insuffisamment spécifiques, ainsi qu'il a été décrit plus haut. Les techniques ci-dessus ne sont évidemment pas limitées à la détection d'acides nucléiques. Dans le même esprit, on a proposé par exemple la détection d'anticorps. Il s'agit des tests de type ELISA que nous ne redécrirons pas ici et qui, pour résumer, permettent de coupler la présence d'un anticorps à un ancrage associé d'une molécule d'antigène sur un solide. A nouveau, les problèmes de spécificité et de réactions parasites se posent. La phase de détection peut se baser ensuite sur un couplage à une réaction chromogène ayant ses propres problèmes de sensibilité.
En résumé, les méthodes de la technique antérieure ou leurs combinaisons présentent un certain nombre d'inconvénients, notamment : soit d'être potentiellement dangereuses par mise en oeuvre de produits radioactifs, soit de nécessiter des temps de révélation trop longs, - soit d'être gênées par des problèmes spécifiques au niveau de la phase d'amplification, soit de passer par des surfaces solides insuffisamment spécifiques, soit d'être trop peu sensibles, soit, enfin, de nécessiter en plus de la phase d'accrochage sur un solide l'utilisation peu commode, évidemment, d'un microscope électronique.
Enfin, dans la plupart des cas, les procédés connus ne permettent pas de reconnaître sur une molécule donnée la position spécifique du motif recherché. Or ce type de reconnaissance est important lorsque l'on cherche à faire une cartographie, en particulier dans le cadre de la cartographie du génome, on cherche à connaître dans un premier temps la position spatiale approximative par rapport à une extrémité de la molécule d'un gène donné sur un ADN ou un ARN. La présente invention qui se propose de remédier aux inconvénients des procédés antérieurs repose sur l'utilisation de surfaces très hautement spécifiques qui lors de leur mise en oeuvre conduisent à des bruits de fond excessivement limités, en particulier du fait qu'elles éliminent les fixations parasites. Plus particulièrement, la présente invention concerne une surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche essentiellement compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé comportant une double liaison éthylénique, notamment un groupement vinyl, ayant une affinité pour un type de molécule à activité biologique dans certaines conditions de réactions, notamment de pH ou de teneurs ioniques, les autres éléments de la couche étant essentiellement inaccessibles pour lesdites molécules dans lesdites conditions de réaction. Par "affinité", il faut entendre ici, aussi bien une réactivité chimique qu'une adsorption d'un type quelconque, ceci dans les conditions de fixation desdites molécules biologiques.
Par "support", on entend désigner aussi bien un support solide qu'un support constitué par un élément non solide tel qu'une particule liquide ou gazeuse présentant, notamment, une couche compacte telle que décrite ci-dessus.
La surface est "essentiellement compacte", c'est-à-dire qu'elle limite l'accès de la molécule à activité biologique aux couches inférieures et/ou au support, étant entendu que des défauts de couverture de la surface sont tolérables. Ces surfaces hautement spécifiques pour réactions biologiques, comportent un support présentant en surface des groupements à double liaison, notamment vinyl (-CH=CH2, ci-après surfaces C = C) accessibles à la solution. Elles sont capables d'ancrer directement des molécules d'intérêt biologique (ADN, ARN, PNA, Protéines, lipides, saccharides) dans certaines conditions de pH ou de teneur ionique du milieu. En particulier, ces surfaces ne nécessitent pas de modification chimique particulière ni de la surface, ni des molécules biologiques à ancrer. Il n'existe pas de documents mentionnant une telle utilisation de surface à groupements vinyl.
Par "ancrage", il faut entendre ici une fixation par lien covalent résultant d'une réactivité chimique, ou lien non covalent résultant d'interactions physico-chimiques telles qu'une adsorption de type quelconque, ceci dans les conditions de pH ou de teneur ionique du milieu de fixation desdites molécules biologiques.
Les surfaces selon la présente invention peuvent être obtenues par la mise en oeuvre de divers procédés. On peut citer à titre d'exemple :
(A) une couche de polymère carboné, éventuellement branché, d'au moins 1 nm d'épaisseur, présentant :
. des groupements comportant une double liaison éthylénique,
. le reste de la couche étant constitué de groupements hydro- ou fluorocarbonés ; (B) des surfaces obtenues par dépôt ou ancrage sur un solide d'une ou plusieurs couches moléculaires, celles-ci peuvent être obtenues par la formation de couches successives fixées par liaisons non- covalentes, type film de Langmuir-Blodgett, ou par auto-assemblage moléculaire, ceci permettant la formation d'une couche fixée par liaison covalente.
Dans le premier cas, la surface peut être obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère ledit groupement comportant une double liaison éthylénique, ou bien par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement, ou encore par dépôt de polymère. Dans ce procédé, le polymère formé présente des liaisons vinyls tel un dérivé polyénique, notamment des surfaces de type caoutchouc synthétique, tel que le polybutadiène, le polyisoprène ou le caoutchouc naturel. Dans le deuxième cas, la surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon la présente invention comporte : sur un support, une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins : . un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et un groupement exposé comportant une double liaison éthylénique, n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique.
Afin d'obtenir une couche essentiellement compacte, les différents composés organiques sont, de préférence, susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales, on obtient ainsi une couche monomoléculaire "essentiellement" compacte grâce à laquelle le support devient pas ou peu accessible pour des réactions parasites.
De préférence, le composé organique présente un groupement de fixation à une extrémité et un groupement exposé à l'autre extrémité. Il est bien entendu possible de prévoir des modes de réalisation différents dans lesquels, par exemple, le groupement de fixation serait situé au milieu de la molécule, celui-ci disposant à chacune de ses extrémités d'un groupement exposé.
Les surfaces peuvent s'analyser selon : a) le support, b) la molécule ayant un groupement exposé et un groupement de fixation sur le support, c) l'interaction entre le support et ladite molécule assurant la fixation. La fixation peut être tout d'abord de type non-covalent, notamment de type hydrophile/hydrophile et hydrophobe/hydrophobe, comme dans les films de Langmuir-Blodgett (K.B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935) et US 5.102.798). Dans ce cas, le groupement de fixation sera, soit hydrophile, soit hydrophobe, notamment des groupements alkyles ou halogénoalkyles tels que CH3, CF3, CHF3, CH2F.
La fixation peut être également de type covalent, le groupement de fixation va alors réagir chimiquement sur le support. Certaines surfaces de structure approchante ont déjà été mentionnées dans le domaine électronique, notamment lorsque les fixations sont covalentes, L. Netzer et J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) et US-A-4 539 061.
L'homme de l'art dispose d'une très large gamme de groupements. A titre d'exemple non limitatif on citera les groupements de type alkoxyde de métal, tel silane, chlorure de silane, éthoxysilane, méthoxysilane.
Le groupement de fixation est évidemment choisi en fonction du support employé. Le support selon l'invention peut être constitué au moins en surface, par un polymère, un métal, un oxyde de métal, un élément semi conducteur ou un oxyde d'élément semi conducteur tel qu'un oxyde de silicium ou une de leur combinaison. On cite en particulier le verre et le silicium oxydé en surface.
Parmi les groupements de fixation il faut citer plus particulièrement les groupements de type alkoxyde de métal tel silane, chlorosilane, chlorosilane, silanol, méthoxysilane, éthoxysilane, silazane, phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, aminé, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide, aldéhyde. Tout particulièrement, comme groupement de fixation on préférera utiliser des groupements susceptibles de réagir transversalement avec un groupe équivalent, voisin, pour fournir les liaisons transversales, par exemple il s'agira de dérivés de type silane, notamment dichlorosilane, trichlorosilane, diméthoxysilane, triméthoxysilane, diéthoxysilane et triéthoxysilane. Ces liaisons transversales peuvent aussi être effectuées à un point quelconque dans l'épaisseur de la monocouche, en la polymérisant à l'aide de groupements réactifs éventuellement présents sur la chaîne entre le site de fixation et le groupement exposé. Ainsi, les groupements diacetyleniques sont connus pour permettre une polymérisation uni- ou bi-dimensionnelle de la monocouche.
Le choix du groupement de fixation dépendra évidemment de la nature du support, les groupements de type silane sont bien adaptés pour la fixation covalente sur le verre et la silice. De préférence, les chaînes reliant le groupement exposé au groupement de fixation sont des chaînes comportant au moins 1 atome de carbone, de préférence plus de 6 et en général de 3 à 30 atomes de carbone. Lorsqu'il y a formation d'un couplage latéral à l'intérieur même de la couche, que ce couplage soit ionique, de coordinance ou covalent, on obtient des couches hautement ordonnées obtenues par auto-assemblage, même si la surface initiale ne présente qu'un nombre réduit de sites d'ancrage actifs comparé au nombre de molécules obtenues dans une monocouche compacte.
On peut avantageusement utiliser, dans le cas du verre ou de la silice, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisant des dérivés silanes, par exemple : Si-OH + Cl3-Si-R-CH=CH2 donne Si-O-Si-R-
CH=CH2, R consistant par exemple en (CH 2)4. Une telle réaction est connue dans la littérature, avec utilisation de solvant ultra-purs. La réaction conduit à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface exposée à l'extérieur.
Dans le cadre de l'obtention de surface à très haute spécificité, la présente invention concerne aussi pour de telles réactions de greffage de molécule à double liaison C=C l'utilisation d'une phase gazeuse, permettant d'éviter l'utilisation de solvant. Dans le cas de l'or, celui-ci étant éventuellement sous la forme d'une couche mince sur un substrat, les techniques connues de fonctionnalisation de surface utilisent des dérivés thiols, par exemple : Au + HS-R-CH=CH2 donne Au-S-R-CH=CH 2, R consistant par exemple en (CH2) .
Une telle réaction est décrite en milieu liquide et conduit, de même que la réaction précédente trichlorosilane-silice, à un tapis de molécules présentant leur extrémité C=C à la surface exposée à l'extérieur.
Bien entendu la terminologie de "support" englobe aussi bien une surface unique telle qu'une lame, mais également des particules qu'il s'agisse de poudre de silice ou de billes de polymère, et aussi des formes quelconques telles que barre, fibre ou support structuré, lesquelles peuvent d'ailleurs être rendues magnétiques, fluorescentes ou colorées, comme cela est connu dans différentes technologies de dosage.
De préférence, le support sera choisi pour être pas ou peu fluorescent lorsque la détection sera effectuée par fluorescence.
Les surfaces obtenues selon les modes (A) ou (B) ci-dessus présentent une grande spécificité grâce à la présence de sites réactifs spécifiques provenant, soit des groupes exposés, soit de la molécule fixée.
En outre, les surfaces obtenues selon les modes (A) ou (B) présentent les caractéristiques inattendues et remarquables suivantes :
(i) un ancrage spécifique fortement pH dépendant de l'ADN par ses extrémités sans nécessité d'une fonctionnalisation particulière de la molécule, accompagné d'un très faible taux d'interactions non-spécifiques ;
(ii) la possibilité d'y ancrer des protéines et d'autres molécules d'intérêt biologique, sans modification chimique particulière ;
(iii) la possibilité de préparer des surfaces spécifiques vis à vis d'un antigène (par exemple digoxigénine) ou d'un ligand
(par exemple biotine) ;
(iv) un très faible taux de fluorescence intrinsèque, lorsque cela est requis, un bruit de fond de fluorescence (d'une aire typique de 100 x 100 μm) plus faible que le signal de fluorescence d'une seule molécule à détecter ;
(v) la possibilité de détecter des molécules isolées avec un rapport S/N indépendant du nombre de molécules, qui est possible grâce à différentes techniques à grand rapport S/N décrites plus bas et basées sur l'identification de la présence d'un marqueur macroscopique présentant une faible interaction non-spécifique avec la surface. Les surfaces ainsi obtenues sont, de préférence, revêtues d'une molécule à activité biologique choisie parmi : les protéines, les acides nucléiques, les lipides, - les polysaccharides et leurs dérivés.
Parmi les protéines, il faut citer les antigènes et les anticorps, les ligands, les récepteurs, mais également des produits de type avidine ou streptavidine ainsi que les dérivés de ces composés.
Parmi les ARN et les ADN, il faut également citer les dérivés α, β ainsi que les dérivés thio et les composés mixtes tels que les PNA.
On peut également fixer des composés mixtes tels que les glycopeptides et les lipopolysaccharides par exemple, ou bien d'autres éléments tels que virus, cellules notamment, ou composés chimiques tels que la biotine. La fixation des molécules biologiques peut être covalente ou non-covalente, par exemple par adsorption, liaisons hydrogènes, interactions hydrophobes, ioniques, par exemple, auquel cas on pourra procéder avantageusement à un pontage ("cross-linking") entre les molécules greffées par les méthodes connues ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press ( 1991)) et ceci afin de renforcer leur cohésion.
Avec un groupement exposé comportant un radical -CH=CH2 qui sera nommé ci-après "surface C=C" ou "surface à liaison éthylénique", un ancrage direct, en particulier de l'ADN ou des protéines, est possible. Dans le cadre de la présente invention, il a été démontré que ces surfaces présentent une réactivité très fortement pH dépendante. Cette particularité permet d'ancrer les acides nucléiques ou les protéines, notamment par leur(s) extrémité(s), en utilisant une zone de pH déterminée et souvent avec une vitesse de réaction qui peut être contrôlée par le pH. Ainsi, pour l'ADN à pH 5,5, la réaction d'ancrage est totale en une heure (si pas limitée par la diffusion) et se produit par les extrémités. A pH 8, par contre, l'accrochage est très faible (vitesse de réaction de 5 à 6 ordres de grandeur plus faibles). Cet effet d'accrochage pH dépendant et spécifique des extrémités, présente une amélioration par rapport aux autres surfaces qui nécessitent une fonctionnalisation de l'ADN (biotine, DIG, NHS, ...) ou des réactifs spécifiques (carbodiimide, diméthyle pimélidate) qui réalisent une liaison peptidique ou phosphorimide entre - NH2 et -COOH ou -POOH. Les surfaces selon l'invention peuvent ancrer des protéines directement (protéine A, anti-DIG, anticorps, streptavidine, etc.). Il a été observé que (i) l'activité de la molécule peut être préservée et (ii) que la réactivité de la surface préparée (initialement C=C) est totalement occultée pour faire place à la seule réactivité de la molécule d'intérêt. Il est donc possible, à partir d'une réactivité initiale relativement large, de passer à une surface possédant une réactivité très hautement spécifique, par exemple celle de sites spécifiques sur une protéine.
En ancrant un anticorps spécifique sur la surface (par exemple anti-DIG), on crée une surface dont la réactivité est limitée à l'antigène (par exemple le groupement DIG). Ceci indique que les groupements chimiques initiaux ont tous été occultés par les anticorps ancrés.
On peut aussi ancrer sur les surfaces réactives (chimiquement ou biochimiquement) d'autres molécules à activité biologique, notamment des virus ou d'autres composants : membranes, récepteurs membranaires, polysaccharides, PNA, notamment.
Il est également possible de fixer le produit d'une réaction d'intérêt biologique (par exemple la PCR) sur les surfaces préparées.
La présente invention concerne également les surfaces obtenues par la mise en oeuvre des procédés selon la présente invention et tous les procédés mettant en oeuvre ce type de surface, qu'il s'agisse de procédés permettant la mise en évidence et/ou la quantification de molécules biologiques, mais également la séparation de certaines molécules biologiques, notamment un prélèvement par mise en oeuvre des techniques de couplage antigène/anticorps et/ou ADN, ADN/ARN. La présente invention concerne également des procédés de préparation des surfaces hautement spécifiques pour réactions biologiques tels que décrits précédemment pour l'obtention des couches selon (A) et (B) et, en particulier, le procédé caractérisé en ce que : - on fixe sur un support une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins : un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et . un groupement exposé comportant une double liaison éthylénique, n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et le groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique. La présente invention concerne également les applications des surfaces traitées à la détection de molécules isolées à l'aide de réactifs spécifiques et de méthodes de détection à rapport S/N indépendant du nombre de molécules détectées.
Ainsi de façon générale, la présente invention concerne un procédé de mise en évidence et/ou de dosage d'une molécule à activité biologique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise une surface telle que décrite précédemment, sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique capable de reconnaître la molécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.
Parmi les réactifs on distingue les réactifs fluorescents et les réactifs non-fluorescents.
Les réactifs fluorescents contiennent des molécules fluorescentes, choisies avec avantage pour être des molécules longues de taille supérieure à 0,1 μm et réagissant de manière spécifique directement ou indirectement avec les surfaces prétraitées. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, une molécule d'ADN double brin teintée à l'aide de sondes fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents, etc.) pouvant s'ancrer directement sur une suface C=C, ou par une modification de la molécule (DIG, biotine, etc.) sur une surface présentant des protéines complémentaires (anti-DIG, streptavidine, etc.). Les réactifs non-fluorescents consistent, notamment, en des billes ancrées par l'intermédiaire d'une molécule fixée de manière spécifique directement ou indirectement à une surface prétraitée. Grâce au traitement des surfaces, ces billes présentent une faible interaction non-spécifique avec la surface. Par exemple, mais sans pour autant s'y limiter, des billes Dynal recouvertes de streptavidine et ancrées par l'intermédiaire d'un ADN biotynilé à une surface selon la présente invention, présentant des sites capables de réagir avec l'autre extrémité de la molécule d'ADN. Selon que la molécule recherchée est détectée directement par fluorescence ou indirectement à l'aide des réactifs ci-dessus, on parlera de "détection directe" ou "par drapeau".
Afin de limiter les problèmes associés à des temps de réaction prohibitivement lents, on peut avantageusement réduire les temps de diffusion des réactifs vers la surface en utilisant de petits volumes de réaction. Par exemple, mais sans s'y limiter en conduisant la réaction dans un volume de quelques microlitres déterminé par l'espacement entre deux surfaces dont l'une est traitée pour présenter des sites réactifs selon la présente invention et l'autre est inerte ou traitée pour ne pas présenter de sites réactifs.
La détection du nombre de réactions spécifiques s'étant produites peut être réalisée sur un petit nombre de molécules
(typiquement 1 à 1 000), par un test physique macroscopique faible bruit ne nécessitant ni microscope électronique ni radioactivité ni nécessairement la PCR.
Les procédés de détection sont susceptibles d'être mis en oeuvre . par des personnes n'ayant qu'une expérience de laboratoire réduite.
Selon le réactif, deux mises en oeuvre de la présente invention (mode X et mode Y) sont utilisables pour la détection macroscopique faible bruit d'un petit nombre de réactions d'ancrage du réactif. Dans la mise en oeuvre dite de mode X de la présente invention, un test du nombre de réactions spécifiques s'étant produites est obtenu directement par une technique de fluorescence, permettant pour certaines formes de la réalisation de la présente invention d'identifier individuellement le nombre de sites ayant réagi. Dans ce cas, la surface hautement spécifique est prise avantageusement pour présenter un taux très faible de fluorescence, notamment le support doit présenter une faible fluorescence.
Après ancrage du réactif fluorescent, la détection et le comptage du nombre éventuellement petit de réactions d'ancrage peut se faite avantageusement avec l'aide d'un microscope optique à fluorescence utilisant un objectif à grande ouverture numérique, permettant de repérer soit directement à l'oeil, soit après acquisition de signal, le nombre de molécules fluorescentes ancrées. On peut avantageusement procéder à un balayage du champ d'observation pour explorer une plus grande surface que le seul champ fixe.
Dans la mise en oeuvre dite de mode Y de la présente invention, on détecte un réactif macroscopique de type bille (fluorescente, magnétique, colorée, par exemple).
Une telle technique est dérivée de Manning et al. en ce sens que la réaction est révélée par la présence ou l'absence de microbilles. Dans un mode de réalisation un nouveau procédé comprend :
(i) l'utilisation de billes à réactivité spécifique, (ii) l'utilisation de billes de tailles non pas nanoscopiques mais se situant dans la gamme 0,1 μm-200 μm, décelables par une technique macroscopique, et
(iii) l'absence de réaction non-spécifique entre billes et surface due à l'utilisation du produit selon la présente invention.
Le nombre de ces billes macroscopiques caractérisant chacune une réaction d'ancrage est ensuite déterminé par une méthode physique macroscopique au rang desquelles, mais sans s'y limiter, on peut citer la diffusion de lumière sur les billes, la microscopie optique et la fluorescence des billes. La spécificité de certaines réactions biologiques peut être limitée. Ainsi, dans le cadre de l'hybridation, les hybrides peuvent être imparfaits (réactions avec d'autres sites) tout en présentant un nombre réduit d'appartement et donc une qualité de liaison moindre. La présente invention couvre également l'utilisation possible d'une étape de test de la qualité des liaisons obtenues. Ce test permet de dissocier les produits appariés de façon non-spécifique faible, par adsorption, forces hybrophobes, liaisons hydrogènes imparfaites, hybridation imparfaite, notamment. C'est pourquoi, l'invention concerne également dans un procédé de mise en évidence ou de dosage tel que décrit précédemment, un procédé où l'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection. Ce procédé offre, outre la possibilité de détruire les couples misappariés, la possibilité d'orienter les produits du couplage, ce qui facilite les mesures ou les observations.
On peut ainsi appliquer aux surfaces, après fixation des éléments complémentaires, une contrainte qui peut être constituée par l'utilisation simple ou combinée de :
- centrifugation,
- gradient de champ magnétique appliqué aux réactifs non- fluorescents pris alors pour inclure des microbilles magnétisables ou magnétiques, - agitation,
- écoulement liquide,
- passage de ménisque,
- électrophorèse
- variation de température, et/ou gradient de température. On détermine alors par les techniques de détection faible bruit décrites ci-après le nombre de systèmes étant restés intègres ou s'étant détruits. Il convient de remarquer que grâce aux surfaces selon la présente invention, il est possible d'orienter les molécules après leur fixation par au moins un point par passage du ménisque air/eau, notamment sur de l'ADN. Ainsi, on a remarqué que le passage du ménique air/eau sur de l'ADN en solution et ancré à la surface, résultait en une extension régulière des molécules ancrées. Elles se présentent alors à l'air libre sous forme de bâtonnets fluorescents allongés. Ces molécules allongées sont stables à l'air libre et peuvent être observées même après plusieurs semaines, sans présenter de dégradation apparente. Ces observations remarquables et inattendues suggèrent une possibilité de compter le nombre de molécules d'ADN ancrées à la surface : d'une part, les surfaces étant très peu fluorescentes, le rapport signal/bruit (S/N) est bon, d'autre part, recherchant un objet très corrélé (forme de bâtonnets), il est très facile d'augmenter le rapport S/N. C'est-à- dire, ignorer les poussières, les inhomogénéités, qui ne présentent pas de corrélation spatiale particulière. Il faut noter qu'en solution, les molécules en pelote fluctuent thermiquement, ce qui entraîne des variations très importantes de leur signal de fluorescence recueilli, en général, avec une faible profondeur de champ et limite leur observation. La présente invention couvre aussi cette technique d'alignement et d'immobilisation qui permet donc l'observation de molécules isolées avec un très grand rapport S/N.
Il est remarquable que ce rapport est indépendant du nombre de réactions d'ancrage. Le rapport S/N posé par la détection d'une molécule est le même que pour 10 000. De plus cette technique d'étirement permet de discriminer aisément entre des molécules de longueurs variées.
On peut avantageusement procéder aux étapes suivantes pour améliorer encore le rapport S/N :
La molécule étant immobile, on peut intégrer son signal de fluorescence.
L'observation au microscope présente un champ réduit (typiquement 100 μm x 100 μm avec un objectif x 100 à immersion, N.A. = 1.25). Pour un échantillon de 1 cm2 on peut soit procéder à un balayage, soit envisager l'utilisation d'objectifs d'agrandissements moindres (x 10 ou x 20) mais d'ouverture numérique élevée. Les bâtonnets étant toujours parallèles, on peut envisager une méthode de filtrage spatial optique pour augmenter encore le rapport S/N.
D'autres méthodes de fluorescence globale sont envisageables (EP # 103426).
La linéarisation des molécules s'observe aussi bien dans le cadre d'un greffage chimique (C=C) que dans le cas de liaisons de type immunologique (DIG/anti-DIG).
Une fois la surface à l'air libre, les molécules d'ADN sont stables (restent intègres, même après plusieurs semaines) et fluorescentes.
On peut avantageusement utiliser cette propriété pour différer l'étape d'ancrage de l'étape de repérage/comptage des molécules ancrées, si cette détection se fait par exemple, mais sans s'y limiter, par microscopie à fluorescence. Une telle utilisation est couverte par la présente invention.
Une technique de double (ou multi) fluorescence peut éventuellement servir à améliorer le rapport S/N ou à détecter une double ou multi fonctionnalité.
Il est possible d'étendre le ménisque air/eau utilisé ici afin d'étirer la molécule à d'autres systèmes tels que huile/eau ou eau/surfactant/air, notamment.
On peut aussi utiliser une orientation dynamique des molécules en solution ancrées à une extrémité, par électrophorèse ou écoulement dans une ou plusieurs directions successives, une telle technique pouvant ainsi conduire à une détection synchrone de la présence de molécules dans une direction donnée, par analyse des variations temporelles du signal de fluorescence correspondant à une direction donnée (par exemple, mais sans sy limiter pour autant, par utilisation d'un filtre spatial optique convenablement disposé, permettant d'obtenir un signal préférentiel pour certaines orientations des molécules observées).
Néanmoins, les résultats observés montrent que cette technique, dans sa version la plus simple (étirement dans une seule direction, sans détection synchrone) est beaucoup moins performante que l'utilisation du ménisque. Les surfaces et/ou les réactifs et/ou les techniques de détection décrits dans la présente invention peuvent être utilisés pour de nombreuses applications parmi lesquelles, mais sans s'y restreindre : l'identification d'un ou plusieurs éléments de séquençage d'ADN ou d'ARN que l'on peut utiliser avec avantage pour le diagnostic de pathogènes ou la cartographie génétique ; la mesure de la taille de fragments d'ADN que l'on peut utiliser avec avantage pour la cartographie génétique ; l'amélioration de la sensibilité des techniques d'ELISA avec la possibilité de détecter un faible nombre (éventuellement inférieur à 1 000) de réactions immunologiques.
L'identification de séquences d'ADN/ARN peut se faire d'abord par réaction dans le volume de la solution des molécules d'ADN/ARN avec des sondes complémentaires (par exemple par hybridation ou à l'aide de protéines spécifiques du segment recherché).
Deux modes d'opération sont alors possibles.
Les descriptions qui vont suivre seront, pour certaines, faites en se référant aux figures annexées sur lesquelles : la figure 1 schématise la détection d'un pathogène dans une molécule d'ADN fluorescente par hybridation avec une molécule ancre ; la figure 2 schématise la cartographie génétique par extension de l'ADN et l'utilisation d'un ADN marqueur ; la figure 3 schématise la détection d'une réaction immunologique (ELISA) à l'aide d'une molécule "drapeau" : un ADN fluorescent utilisé comme marqueur de réaction ; la figure 4 est une microphotographie de fluorescence montrant l'extension d'ADN de phage λ par l'avancée du ménisque, à gauche on aperçoit des molécules d'ADN en solution étirées par l'écoulement d'évaporation parallèle au ménisque, à droite des molécules d'ADN à l'air libre après leur étirement perpendiculairement au ménisque ; les figures 5 (a) et 5(b) sont des microphotographies de fluorescence montrant, respectivement, un ADN marqué à la digogixénine (DIG) sur une surface recouverte d'anti-DIG et étiré par le ménisque, et, en contrôle, un ADN non marqué sur une surface anti-DIG, on remarquera la très grande spécificité des surfaces et l'absence d'ancrage non-spécifique ; la figure 6 est une microphotographie de fluorescence montrant une surface commerciale classique telle que NUNC, on remarquera les très grandes inhomogénités de fluorescence qui rendent ces surfaces impossibles à utiliser pour la détection fluorescente d'une seule molécule.
Dans le mode "diagnostic", les sondes (les "ancres") possèdent un groupement réactif (DIG, biotine, etc.) capable de s'ancrer de manière spécifique à une surface selon la présente invention (ayant par exemple comme site d'ancrage un anticorps anti-DIG ou la streptavidine). La détection de la réaction d'ancrage peut se faire directement par détection de la fluorescence de la molécule d'ADN teintée par des molécules fluorescentes (ethidium bromide, YOYO, nucléotides fluorescents) (figure 1 ). Elle peut aussi se faire indirectement par détection d'une "molécule drapeau" : un réactif selon la présente invention capable de se fixer sur la molécule d'ADN/ARN (par exemple par hybridation, interaction protéine- ADN, etc.), mais ne présentant pas d'affinité pour les sites d'ancrage de la sonde.
Dans le mode "cartographie", les sondes complémentaires peuvent être directement couplées à un réactif fluorescent selon la présente invention. Il peut s'agir par exemple d'un simple brin d'ADN complémentaire possédant des bases modifiées pour être fluorescentes ou d'un long double brin d'ADN teinté avec un fluorophore A et se terminant par un segment simple brin complémentaire de la séquence recherchée. Pour des sondes différentes, des fluorophores de différentes couleurs peuvent être utilisés. On peut aussi, avec avantage, teindre la molécule d'ADN sur laquelle les sondes viennent s'hybrider avec un fluorophore d'une autre couleur. L'hybride ADN-sondes est ancré en l'une de ses extrémités et étiré par une des méthodes décrites précédemment. La distance du point d'ancrage aux points d'hybridation.ou entre les points d'hybridations, est déterminée par la détection de la fluorescence de la sonde, suivant les méthodes décrites précédemment (figure 2). Par exemple, sans pour autant s'y limiter, un ADN marqueur, d'environ 3 000 paires de bases et ayant en une de ses extrémités un segment simple brin complémentaire du gène recherché, est teinté avec un fluorophore A (par exemple YOYOl). Cet ADN est hybride puis ligué avec l'ADN simple brin à cartographier, puis ce dernier est teinté avec un deuxième fluorophore B (POPOl ) (après réaction par "random primming", pour le transformer en ADN double brin). La molécule est alors ancrée par une de ses extrémités (par exemple par liaison DIG/anti-DIG) et étirée par l'action du ménisque. La distance entre l'extrémité de la molécule et la postion du gène marqué, observable en microscopie par double fluorescence (2 couleurs A et B) permet d'établir la position du gène recherché avec une précision de l'ordre de 1 000 paires de bases (0,3 μm).
L'identification de séquences d'ADN/ARN peut aussi se faire par réaction entre la séquence recherchée et les sites réactifs d'une surface selon la présente invention (par exemple des oligonucléotides complémentaires ou le site de réaction d'une protéine spécifique du segment recherché). La détection de la réaction d'ancrage peut alors se faire directement ou indirectement (à l'aide d'une "molécule drapeau") comme décrit précédemment. II est bien entendu que l'identification de séquences d'ADN/ARN suivant la présente invention peut aussi bien servir à des fins de diagnostic (par exemple la détection de la présence ou l'absence d'un pathogène viral ou chromosomique) qu'à des fins de cartographie génétique. Elle peut être précédée d'une étape d'amplification par une méthode quelconque, notamment la PCR.
Par ailleurs, comme mentionné par K.R. Allan et al. (US 84 114), La cartographie génétique peut procéder par une mesure de la taille de fragments d'ADN. Or le couplage entre les surfaces selon la présente invention et les techniques originales d'étirement des molécules décrites plus haut (en particulier et avec avantage l'étirement par le ménisque) permet une mesure de la longueur des molécules étirées et cela sur un très petit échantillon (quelques milliers de molécules).
On peut, par exemple, mais sans sy restreindre, procéder de la manière suivante : Un échantillon d'ADN est fragmenté (à l'aide d'enzymes de restriction), teinté avec un fluorophore puis ancré sur une surface présentant des groupements réactifs (par exemple les surfaces C=C). Les molécules sont ensuite étirées par le ménisque et la taille des fragments étirés déterminée par microscopie optique à fluorescence avec une résolution et une taille limite de l'ordre de 1 000 bp (0,3 μm).
Les surfaces selon la présente invention peuvent être utilisées pour la mise en oeuvre des procédés connus permettant la mise en évidence et/ou la quantification d'un antigène ou d'un anticorps, notamment les méthodes ELISA mettant en oeuvre des systèmes enzymatiques ou des méthodes de type RIA mettant en oeuvre des marqueurs radioactifs. Il s'agit là de technologies qui ne seront pas redécrites en détail.
On peut aussi et avantageusement utiliser les surfaces selon la présente invention comme support des réactions immunologiques d'un procédé ELISA possédant une étape d'ancrage d'un réactif selon la présente invention ("drapeau") sur l'un des réactifs de l'ELISA (figure 3). La détection peut naturellement se faire de façon globale par mesure de fluorescence. Il est possible aussi de procéder au comptage du nombre de réactions, ceci peut avantageusement s'effectuer suivant les méthodes de détection décrites dans la présente invention, en particulier l'extension par le ménisque, et ceci grâce au faible taux de fluorescence et d'interaction non-spécifique du produit de la présente inention. Ceci permet la détection d'un petit nombre de réaction, éventuellement inférieur à 1 000) avec un excellent rapport S/N.
On peut donc, par une modification mineure des méthodes ELISA en sandwich (anticorps-antigène-anticorps modifié, par exemple biotynilé), venir greffer sur la surface un réactif selon la présente invention, par exemple de l'ADN fluorescent ancré à la streptavidine. Toutes les variantes de la technique ELISA s'appliquent avec une sensibilité bien meilleure. Des techniques de mesure de fluorescence globale sont déjà utilisées pour déterminer la qualité des réactions d'ELISA. Cependant, le procédé selon l'invention permet une détection bien meilleure car sensible au signal de fluorescence d'une seule molécule. Bien entendu, il est possible d'utiliser ces surfaces comme surfaces de fixation d'au moins un produit d'une réaction d'intérêt biologique, à titre d'exemple sans pour autant s'y limiter, des produits de la réaction d'amplification, qu'il s'agisse de PCR ou d'une méthode apparentée et, enfin, il est possible d'utiliser ce type de surfaces comme support pour une chromatographie d'affinité, quelle soit préparative ou de détection.
Dans ce cas, on peut par exemple greffer une population d'oligonucléotides donnée sur des billes de silice qui constitueront la phase stationnaire d'une colonne de chromatographie.
L'étape de chromatographie doit permettre une spécificité particulière de la colonne vis à vis d'éluants, par exemple un mélange d'ADN dont certains présentent des séquences complémentaires ou très voisines de l'oligonucléotide greffé. La présente invention concerne enfin l'utilisation des surfaces selon la présente invention dans des trousses de diagnostic ou de séparation.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après. Matériels et méthodes
L'ADN-λ et l'anticorps monoclonal (Anti-DIG) proviennent de Boehringer-Mannheim. Les trichlorosilanes proviennent de Roth- Sochiel. Les sondes nucléiques fluorescentes (YOYOl, YOY03 et POPOl) proviennent de Molecular Probes. Les lamelles de verre ultrapropres proviennent de Erie Scientific (Lamelles (ESCO). Les particules magnétiques proviennent de Dynal. Le microscope est un microscope inversé Diaphot de NIKKON, équipé d'une lampe Xénon pour l'épi- fluorescence et d'une caméra CCD intensifiée Hamamatsu pour la visualisation. Traitement de surface
Des lamelles de verre sont nettoyées pendant une heure par irradiation UV sous atmosphère d'oxygène (par formation d'ozone). Elles sont ensuite immédiatement déposées dans un dessicateur préalablement purgé de traces d'eau par un courant d'argon. Un volume d'environ 100 à 500 μl du trichlorosilane approprié (H2C=CH-(CH2)N-SiCl3 est introduit dans le dessicateur, d'où les surfaces sont retirées après environ 12 heures (n = 6) ou 1 heure (n = 1). Au sortir les surfaces sont nettes et non-mouillantes. Les lamelles ainsi fonctionnalisées peuvent réagir avec des protéines. Un volume de 300 μl d'une solution aqueuse (20 μg/ml) de protéines (protéine A, streptavidine, etc.) est déposé sur une lamelle fonctionnalisée en groupement (H2C=CH-). Cette lamelle est incubée environ deux heures à température ambiante, puis rincée trois fois dans de l'eau ultrapure. Les surfaces ainsi traitées sont nettes et mouillantes. Les surfaces traitées à la protéine A peuvent ensuite réagir avec un anticorps, par exemple anti-DIG, par incubation dans une solution de 20 μg/ml d'anticorps. Ancrage d'ADN natif sur surface double liaison
Une goutte de 2 μl d'une solution d'ADN-λ marqué par fluorescence (YOYOl, POPOl ou YOY03, mais sans terminaison particulière) de concentration variable et dans différents tampons (nombre total de molécules < 107) est déposé sur une lamelle prétraitée (H2C=CH-) et recouverte d'une lamelle de verre non traitée (diamètre 15 mm). La préparation est incubée environ 1 heure à température ambiante dans une atmosphère saturée en vapeur d'eau. Dans un tampon de 0,05 M MES (pH = 5,5), on observe un ancrage quasi-général des molécules d'ADN. Par contre dans un tampon de 0,01 M Tris (pH = 8) il n'y a presqu'aucune molécule d'ancrée (rapport > 106. Cette dépendance peut permettre le contrôle de l'activation/désactivation des surfaces (vis-à-vis de l'ADN) par l'intermédiaire du pH. Détection de l'ancrage par l'action du ménisque
En transférant la préparation précédente dans une atmosphère sèche, la solution en s'evaporant va étirer les molécules d'ADN, ancrées à la surface, perpendiculairement au ménisque. La force capillaire sur la molécule d'ADN (quelques dizaines de picoNewtons) est en effet suffisante pour étirer complètement la molécule (plus grande que les forces d'élasticité entropique), mais trop faible pour briser la liaison entre l'extrémité de la molécule et la surface traitée. L'ADN étant marqué par fluorescence, on observe individuellement et aisément les molécules étirées (longueur totale environ 22 μm). L'ancrage entre la surface et l'ADN étant limité aux extrémités, on a pu aussi bien étirer des ADN de phage λ, de YAC ou de E. coli (longueur totale supérieure à 400 μm). Cette préparation d'ADN étirés, fluorescents et à l'air libre est stable pendant plusieurs jours et peut être observée de façon non destructive, par épifluorescence (microscope inversé Nikkon Diaphot avec objectif xlOO, O.N.: 1.25). Détection de l'ancrage par électrophorèse Une cellule électrophorétique est formée par un anneau de paraffine (épaisseur environ 100 μm) pris entre une lamelle traitée et une lamelle de verre non-traitée entre lesquelles deux électrodes de platine sont insérées. L'ensemble est rendu solidaire en fondant brièvement l'anneau de paraffine. Grâce à deux ouvertures laissées dans l'anneau de paraffine on introduit la solution d'ADN dans cette cellule par capillarité, puis on scelle les deux ouvertures à la paraffine. On incube, comme précédemment, à température ambiante. En appliquant une faible tension (quelques volts) entre les deux électrodes de platine, on observe par fluorescence un mouvement des molécules d'ADN libre(quelques dizaines de microns par seconde) et une extension dans la direction de l'écoulement des molécules ancrées que l'on peut ainsi identifier aisément et individuellement par microscopie en épifluorescence. Ancrage et détection spécifiques
En traitant les surfaces comme décrit précédemment avec un anticorps monoclonal spécifique, on peut contrôler très précisément leur spécificité. Ainsi, on a testé la spécificité de surfaces traitées anti-DIG vis- à-vis d'ADN-λ hybrides avec un oligonucléotide complémentaire d'une des extrémités Cos et possédant un groupement digoxigénine (DIG) et vis-à-vis d'ADN non hybrides. Dans le premier cas, on a observé une extension, par action du ménisque, quasi-générale des molécules ancrées. Dans le second cas, on n'a observé que quelques molécules d'ADN (< 10) ancrées dans tout l'échantillon. On estime donc que la spécificité de la méthode selon l'invention est meilleure que 106. Sensibilité de la détection Afin de déterminer la sensibilité de la méthode de détection par extension du ménisque, on a déposé sur des surfaces double liaison des gouttes de 2,5 μl d'une solution d'ADN-λ dans 0,05 M MES (pH = 5,5) contenant un total de 105, 104 et 1 000 molécules. L'ancrage s'effectue comme décrit précédemment. Les lamelles sont ensuite observées en microscopie par épifluorescence, pour déterminer la densité de molécules ancrées. Celle-ci correspond bien à celle estimée : environ 4-6 molécules d'ADN par champ de vision ( 100 μm x 100 μm) pour un total de 105 molécules d'ADN. Pour la plus faible concentration, on a pu observé une dizaine de molécules étendues par action du ménisque. Ce nombre est essentiellement limité par le grand nombre de champs de vision nécessaires à couvrir tout l'échantillon (environ 25 000), ce qui rend une recherche manuelle difficile, mais peut être avantageusement effectuée automatiquement et avec un objectif plus faible, mais à plus grand champ. En conclusion, la sensibilité de la méthode selon l'invention permet une détection et un comptage individuel de moins de 1 000 molécules d'ADN.

Claims

REVENDICATIONS
1) Surface hautement spécifique pour réactions biologiques, caractérisée en ce qu'elle comporte un support présentant en surface au moins une couche essentiellement compacte d'un composé organique présentant, à l'extérieur de la couche, un groupement exposé comprenant une double liaison éthylénique ayant une affinité pour un type de molécule à activité biologique dans certaines conditions de réaction, les autres éléments de la couche étant essentiellement inaccessibles pour lesdites molécules dans lesdites conditions de réaction.
2) Surface selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support est un support solide.
3 ) Surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le groupement exposé est un groupement vinyl.
4) Surface selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par polymérisation d'au moins un monomère générant en surface du polymère à double liaison éthylénique ledit groupement exposé, par dépôt de polymère sur le support ou par dépolymérisation partielle de la surface d'un polymère pour générer ledit groupement exposé.
5) Surface selon la revendication 4, caractérisée en ce que le polymère est une polyoléfine ou un dérivé polyénique.
6) Surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comporte : sur un support une couche sensiblement monomoléculaire et compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins : un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et un groupement exposé comprenant une double liaison éthylénique n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et ledit groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule biologique.
7) Surface selon la revendication 6, caractérisée en ce que la fixation est de type non-covalente.
8) Surface selon la revendication 7, caractérisée en ce que la fixation est effectuée par des interactions hydrophiles ou hydrophobes. 9) Surface selon la revendication 8, caractérisée en ce que la molécule biologique est capable de s'ancrer directement par adsorption sur ladite surface dans certaines conditions de pH ou de teneur ionique du milieu.
10) Surface selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les groupements alkyle et alkyle halogène pour réaliser des liaisons hydrophobes.
11) Surface selon la revendication 10, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi : -CH3, CF3, -CH2F, CHF2.
12) Surface selon la revendication 6, caractérisée en ce que la fixation est de type covalent.
13 ) Surface selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les composés organiques sont susceptibles de réagir entre eux en dehors du groupement exposé pour créer des liaisons transversales. 14) Surface selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce que le composé organique présente un groupement de fixation à une extrémité et un groupement exposé à l'autre extrémité.
15) Surface selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les groupements de type alkoxyde de métal, tel silane, chlorosilane, méthoxysilane et éthoxysilane, silanol, silazane, de type phosphate, hydroxy, hydrazide, hydrazine, aminé, amide, diazonium, pyridine, sulfate, sulfonique, carboxylique, boronique, halogène, halogénure d'acide et aldéhyde. 16) Surface selon la revendication 15 caractérisée en ce que le groupement de fixation est choisi parmi les silanes tels que le mono, di ou tri-chlorosilane, mono, di ou tri-éthoxysilanes et mono, di ou tri- méthoxysilanes. 17) Surface selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisée en ce que le groupement exposé est soit relié directement au groupement de fixation, soit par des chaînes comportant au moins un atome de carbone et de préférence de 3 à 30 atomes.
18) Surface selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce que le support est constitué au moins en surface par un polymère, un métal ou un oxyde de métal, un élément semi-conducteur, un oxyde d'élément semi-conducteur, notamment un oxyde de silicium, ou une de leur combinaison.
19) Surface selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que le support est constitué au moins en surface par du verre ou de la silice.
20) Surface selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que le support est sous forme de plaque de bille, de fibre, ou de particules. 21) Surface selon la revendication 20, caractérisée en ce que lesdites particules sont magnétiques, fluorescentes ou colorées.
22) Surface selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi : les protéines, - les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides et leurs dérivés.
23 ) Surface selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est un composé chimique présentant une activité biologique.
24) Surface selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi : les protéines, l'ADN, - TARN et leurs dérivés. 25) Surface selon la revendication 24, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi ; les anticorps, les antigènes, - les ADN et ARN; les ligands ou leurs récepteurs ainsi que leurs dérivés.
26) Procédé de préparation d'une surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon l'une des revendications 1 à 25, caractérisé en ce que : - on fixe sur un support solide une couche sensiblement monomoléculaire et essentiellement compacte d'un composé organique de structure allongée ayant au moins : un groupement de fixation présentant une affinité pour le support, et . un groupement exposé n'ayant pas ou peu d'affinité pour ledit support et le groupement de fixation dans les conditions de fixation, mais présentant une affinité pour un type de molécule à activité biologique.
27) Surface revêtue d'une molécule à activité biologique, caractérisée en ce qu'elle comporte une surface hautement spécifique pour réactions biologiques selon l'une des revendications 1 à 26 sur laquelle est fixée ladite molécule à activité biologique.
28) Surface selon la revendication 27, caractérisée en ce que la molécule à activité biologique est choisie parmi : - les protéines, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides et leurs dérivés.
29) Surface selon la revendication 28, caractérisée en ce que l'ADN fixé comporte la séquence complémentaire d'une séquence d'ADN à isoler d'un échantillon.
30) Surface selon la revendication 28, caractérisée en ce que la protéine fixée est capable de reconnaître et fixer spécifiquement une protéine à isoler d'un échantillon. 31 ) Surface selon l'une des revendications 28 et 29, caractérisée en ce que ladite molécule à activité biologique est choisie parmi la biotine, l'avidine, la streptavidine ou leurs dérivés.
32) Procédé d'identification de la présence d'un ADN ou d'un ARN mettant en oeuvre une surface selon l'une des revendications 1 à 31.
33) Procédé d'identification de la présence d'une protéine ou d'un anticorps mettant en oeuvre une surface selon l'une des revendications 1 à 31.
34) Procédé de mise en évidence et/ou de dosage d'une molécule à activité biologique dans un échantillon, caractérisé en ce qu'on utilise une surface selon l'une des revendications 27 à 31 sur laquelle se trouve fixée une molécule à activité biologique capable de reconnaître la molécule de l'échantillon, et en ce que la mise en évidence ou le dosage sont effectués grâce à un réactif fluorescent ou non détectant la présence de la molécule fixée.
35) Procédé selon la revendication 34, caractérisée en ce que la surface est à faible fluorescence et en ce que le réactif est fluorescent.
36) Procédé selon la revendication 35, caractérisée en ce que le réactif est constitué par des billes. 37) Procédé selon l'une des revendications 34 à 36, caractérisé en ce que la détection est faite par microscopie.
38) Procédé selon l'une des revendications 34 à 37, caractérisé en ce qu'on soumet le produit de réaction entre la molécule à activité biologique et la molécule de l'échantillon à une contrainte afin de détruire les mauvais appariements avant la détection.
39) Procédé de mise en évidence d'une séquence d'ADN ou d'une protéine dans un échantillon, caractérisé en ce que : on utilise une surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à 31 : - on met l'échantillon en contact avec la surface dans des conditions de formation de l'hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou protéine/protéine. l'hybride étant marqué, on l'étiré par tout moyen physico¬ chimique pour orienter les molécules et on effectue la mesure ou l'observation des molécules ainsi orientées. 40) Procédé selon l'une des revendications 38 et 39, caractérisé en ce qu'on étire l'hybride ou produit de réaction par passage d'un ménisque dans le sens de l'étirement.
41) Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que le ménisque est un ménisque air/eau.
42) Procédé selon l'une des revendications 38 et 39, caractérisé en ce que l'étirement est effectué par un champ électrique agissant sur les molécules ou un champ magnétique agissant sur une particule magnétisable ou magnétique. 43) Procédé selon l'une des revendications 38 et 39, caractérisé en ce que l'étirement est effectué par voie mécanique.
44) Procédé selon l'une des revendications 38 à 43, caractérisé en ce que l'ADN fixé et l'ADN de l'échantillon sont "colorés" de façon différente et en ce que, après étirement, on mesure la position de la séquence complémentaire par rapport à l'extrémité de l'ADN de l'échantillon.
45 ) Procédé selon la revendication 44 destiné à la cartographie des gènes.
46) Procédé selon l'une des revendications 44 à 45, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une méthode ELISA ou RIA.
47) Procédé selon l'une des revendications 44 à 45, caractérisé en ce que l'échantillon est le produit d'une amplification d'acide nucléique.
48) Procédé de fixation d'un acide nucléique ou d'une protéine sur une surface présentant des doubles liaisons dans lequel on réalise un ancrage par adsorption de l'ADN ou de la protéine notamment par une extrémité en mettant l'ADN ou la protéine en présence de la surface dans une zone de pH déterminée.
49) Procédé de fixation de l'ADN sur une surface présentent des groupements à double liaison éthylénique selon la revendication 48, caractérisé en ce qu'on met l'ADN en présence de la surface à un pH inférieur à 8.
50) Procédé de fixation selon la revendication 49, caractérisé en ce que la réaction est conduite à un pH compris entre 5 et 6 puis est stoppée à pH 8. 51) Trousse de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une surface hautement spécifique selon l'une des revendications 1 à 33.
52) Trousse de diagnostic selon la revendication 51, caractérisée en ce qu'elle comporte, en outre, un réactif fluorescent ou un réactif comportant des billes.
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