WO1995023867A1 - Adenovirus recombinants integratifs, leur preparation et leur utilisation therapeutique - Google Patents

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WO1995023867A1
WO1995023867A1 PCT/FR1995/000233 FR9500233W WO9523867A1 WO 1995023867 A1 WO1995023867 A1 WO 1995023867A1 FR 9500233 W FR9500233 W FR 9500233W WO 9523867 A1 WO9523867 A1 WO 9523867A1
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WO
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adenovirus
adenovirus according
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aav
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Patrice Denefle
Martine Latta
Michel Perricaudet
Emmanuelle Vigne
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Rhone-Poulenc Rorer S.A.
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    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to recombinant vectors of viral origin and their therapeutic use. More particularly, it relates to recombinant adenoviruses comprising a cassette capable of integrating into the genome of infected cells.
  • the invention also relates to the preparation of these vectors, the pharmaceutical compositions containing them and their use for the transfer of genes in vitro, ex vivo and in vivo, in particular in the context of gene and cell therapies.
  • Gene and cell therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) or ensuring the expression of a protein of therapeutic interest by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • Different techniques have been described for the transfer of this genetic information, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al, J. Virol.
  • viruses as vectors for gene transfer has appeared as a promising alternative to these physicochemical transfection techniques.
  • different viruses have been tested for their ability to infect certain cell populations.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses the viral vectors developed so far do not make it possible to satisfactorily resolve all the difficulties linked to the transfer of genes into cells and / or the organism.
  • the adenovirus which has attractive properties for gene transfer (possibility of producing high titers, low pathogenicity) is an extrachromosomal virus.
  • retroviral vectors or derivatives of adeno-associated viruses are capable of integrating into the genome of the cells they infect, they cannot be produced in high quantities, nor for example incorporate large transgenes.
  • the present invention provides an advantageous solution to these problems.
  • the present invention resides in fact in the development of recombinant vectors usable in gene therapy, having the properties of infection of a recombinant adenovirus vector and allowing the integration of a heterologous sequence in the genome of the cell or the infected organ.
  • a first object of the invention relates more particularly to a defective recombinant adenovirus comprising a cassette capable of integrating into the genome of infected cells.
  • the cassette comprises a desired DNA sequence, most often heterologous with respect to the adenovirus, and elements allowing its integration into the genome of the infected cells.
  • the elements allowing integration are of viral origin.
  • the vectors of the invention combine the properties of two types of virus: adenoviruses and integrative viruses.
  • the vectors of the invention are particularly advantageous since they can be produced with high titers, are not pathogenic, have a broad host spectrum, are capable of incorporating large heterologous DNA sequences, and d '' integrate said sequences into the genome of infected cells.
  • the vectors of the invention make it possible to limit the risks of dissemination of the DNA sequence which it is desired to transfer to the cell or the organism. Once it has been integrated into the genome, it can no longer be excised and incorporated into an infectious viral particle.
  • the vectors of the invention advantageously make it possible to transfer to the cells a DNA sequence completely devoid of viral genes. Indeed, the cassette allowing integration into the genome can be totally devoid of any coding sequence of viral origin. The only viral regions that can be introduced are the elements of integration.
  • the vectors of the invention allow integration of the heterogeneous DNA sequence at a precise site in the genome of the infected cell, and without cytotoxicity.
  • the elements allowing the integration of the cassette consist of one or more repeated-inverted terminal sequences. Even more preferably, the elements allowing the integration of the cassette consist of one or more repeated-inverted terminal sequences of an adeno-associated virus (AAV).
  • AAV adeno-associated virus
  • a preferred object of the invention therefore relates to a defective recombinant adenovirus comprising a cassette containing at least one repeat-inverted terminal sequence of AAV and a heterologous DNA sequence.
  • AAV adeno-associated virus
  • AAVs like adenoviruses, are mild pathogenic viruses of the airways. In the absence of a helper virus, AAVs have the property of integrating in a stable manner, in the form of a provirus, at a preferential site of the genome of human cells (region of chromosome 19).
  • the AAV genome has been cloned, sequenced and characterized. It comprises approximately 4700 bases, and contains at each end a terminal inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases.
  • ITR terminal inverted repeat region
  • the rest of the genome is divided into 2 essential regions carrying the packaging functions: the left part of the genome, which contains the reg gene involved in viral replication and the expression of viral genes; the right part of the genome, which contains the cap gene . encoding the capsid proteins of the virus.
  • the inverted terminal repeat regions (ITRs) of AAVs serve as the origin of replication for the virus, and are also responsible for the integration of the virus into the genome of infected cells. It has now been shown that it is possible to introduce one or more of these ITRs on a recombinant adenovirus to target the integration of a heterologous DNA sequence on the chromosome of a target cell, and thus improve the stability. of expression over time.
  • the Applicant has indeed shown that these sequences can be introduced into the genome of an adenovirus, that they retain their functionality in an adeno-viral context, and that they can be used in gene or cell therapy to integrate into human cells. stably a sequence introduced via an adenovirus.
  • the integration cassette according to the invention comprises only a single AAV ITR, linked to the heterologous DNA sequence. It has in fact been shown that a single AAV ITR is sufficient to induce the integration of the heterologous sequence.
  • the ITR can be located downstream or upstream of the heterologous DNA sequence (FIGS. 1a and 1b).
  • the adenovirus according to the invention comprises a cassette containing at least one heterologous DNA sequence bordered by two ITRs of AAV (FIG. Le).
  • This embodiment is particularly advantageous since the integration efficiency is very important.
  • the AAV genome comprises 2 ITRs, located at its 2 ends: a 5 'ITR located at the left end, and a 3' ITR located at the right end.
  • the sequence of these ITRs is identical, and they are oriented in opposite directions to each other.
  • the structure of the ITRs can be modified by rearrangements, but the basic composition is not altered.
  • the cassette comprises a heterologous DNA sequence bordered by an ITR 5 'and an ITR 3' from AAV.
  • AAV ITRs can be obtained in different ways. They can first of all be isolated from the genome of an AAV, by conventional techniques of molecular biology (see in particular WO91 / 18088, WO93 / 09239). As indicated above, these sequences have approximately 145 bp, are located at the ends of the AAV genome, and can be excised using appropriate restriction enzymes. In this regard, they can be isolated from the various AAV serotypes, such as in particular the AAV1, AAV2, AAV3 and AAV4. Furthermore, the sequence of ITRs being known, they can also be synthesized artificially, using nucleic acid synthesizers, or obtained by mixed techniques (isolation from the genome, then elongation by synthesis techniques).
  • these ITRs can also be modified by any technique known to those skilled in the art (molecular biology, chemistry, enzymology, etc.), in the aim of improving their functionality, reducing their size, increasing their stability after integration or their specificity of integration, etc. In particular, they can be modified by mutation, deletion and / or addition of base pairs, according to conventional techniques of molecular biology.
  • the ITR (s) used are ITRs of AAV-2.
  • the ITRs used in the present invention can comprise only the sequences necessary and sufficient for integration into the genome of the cells (strict ITRs).
  • the strict ITRs correspond to 145 bp located on either side of the genome (SEQ ID No. 4).
  • the ITRs used can also include additional sequences, for example adjacent sequences of the AAV genome, and / or deletions, insofar as these sequences and / or deletions do not suppress the integration capacity of The tape.
  • they can be isolated in the form of fragments of greater length (for example up to 1000 bp), which can be used as they are, if they do not remove the integration capacity of the cassette, or previously digested for reduce their size (see for example SEQ ID n ° 1-3 + 5).
  • the chosen sequence or sequences can allow integration into the chromosome, it is for example possible to transfect a human cell line (for example Hela or 293) on the one hand with a plasmid carrying a selection gene of the neoR type between the sequences to be tested or next to the sequence to be tested and on the other hand with a control plamide carrying the same selection gene without said sequences, to select clones by adding the antibiotic G418, then to compare between the two types of transfections the number of clones obtained.
  • the integration frequency obtained with the test sequence (s) must be higher than that obtained by simple selection, for said sequences to be usable.
  • Another way of testing the integration capacity of the sequences is to transfect the same line on the one hand with a plasmid carrying a marker gene (eg ⁇ gal) between the sequences to be tested and on the other hand with a control plamide carrying the same marker gene without said sequences, and to compare as the enzyme activity passes between the two transfections; the activity must decrease exponentially in the control transfections and remain more stable in the other.
  • the "integrating" cells expressing ⁇ gal can be identified, after fixation, by Xgal staining.
  • the heterologous DNA sequence and the ITR (s) must be arranged so as to allow integration of the cassette into the genome of the infected cell. They can either be directly joined or spaced by sequences which do not alter the integration property of the cassette. In particular, it may be one or more restriction sites, regions originating from a plasmid used during construction (example: bacterial plasmid), or any neutral region, etc.).
  • the adenoviruses of the invention contain a cassette allowing the integration of a heterologous DNA sequence into the genome of the infected cell.
  • the heterologous DNA sequence can be any sequence whose transfer to a cell or an organism is desired.
  • the heterologous DNA sequence contains a therapeutic gene.
  • the term “therapeutic gene” in particular means any gene coding for a protein product having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can be a protein, a peptide, etc. This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology).
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can, for example, supplement or bring about a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
  • the therapeutic products within the meaning of the present invention there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc.
  • FR 9203120 growth factors (erythropoietin, G- CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF. aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc; apolipoproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 9111947), the CFTR protein associated with cystic fibrosis, tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k- rev, etc.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF.
  • apolipoproteins Apo
  • FR 93 04745 the genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, the genes involved in DNA repair, the suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), etc. .
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the antisenses also include the sequences coding for ribozymes , which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321,201).
  • the therapeutic gene can also include one or more sequences coding for an antigenic peptide capable of generating an immune response in humans or animals.
  • the recombinant adenoviruses can be used for the production of either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers . These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259 212).
  • the heterologous DNA sequence may comprise, in addition to the therapeutic gene, a marker gene, such as for example the ⁇ -galactosidase gene or the neo gene.
  • a marker gene such as for example the ⁇ -galactosidase gene or the neo gene.
  • the adenoviruses of the invention in which the cassette has two genes (a therapeutic gene and a marker gene in particular) are particularly interesting because their construction is greatly facilitated.
  • the heterologous DNA sequence also comprises sequences allowing the expression of the therapeutic gene in the desired cell or organ.
  • These may be sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus.
  • these expression sequences can be modified by adding activation, regulation sequences, or conferring specificity of tissue expression on the gene of interest.
  • heterologous DNA sequence may also include a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention are adenoviruses incapable of replicating autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective adenoviruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the cassette.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • serotypes of adenoviruses the structure and properties of which vary somewhat.
  • adenoviruses of type 2 or 5 Ad 2 or Ad 5
  • Ad 2 or Ad 5 adenoviruses of animal origin
  • adenoviruses of animal origin mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or even simian (example: SAV).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying, inter alia, the cassette. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%).
  • Strategies for the construction of vectors derived from adenoviruses have also been described in applications No. WO94 / 26914 and FR 2,707,664 which are incorporated into the present application by reference.
  • the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • the recombinant adenoviruses prepared according to the present invention can be used for the transfer of genes of interest in vitro, ex vivo or in vivo.
  • in vitro they can make it possible to transfer a gene to a cell line, for example in order to produce a recombinant protein.
  • Ex vivo they can be used to transfer a gene onto a population of cells taken from an organism, optionally selected and amplified, in order to confer on these cells desired properties with a view to their re-administration to an organism.
  • they can be used for gene transfer by direct administration of a purified solution, optionally combined with one or more pharmaceutical vehicles.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenoviruses as described above.
  • These pharmaceutical compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of defective recombinant adenovirus used for injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 101 pfu / ml, and preferably 10 ⁇ to 1010 pfu / ml.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the present invention thus provides a very efficient means for the transfer of genes into cells.
  • the vectors of the invention can be used in many applications, such as genetic diseases (myopathy, cystic fibrosis, SCID, etc.), pathologies of the central nervous system (Alzheimer, Parkinson, etc.), cardiovascular diseases (hemophilia, atherosclerosis ), AIDS, cancers, etc.
  • the vectors of the invention are very particularly advantageous for the transfer of genes in dividing cells. Indeed, thanks to the infection capacities of the adenoviral vector and to the integration properties of the casette, the vectors of the invention make it possible to confer stable properties over generations on cells which divide. Preferred examples of these cell types include hematopoietic cells (stem cells, progenitors, etc.), and cancer cells.
  • the vectors of the invention can be used for the transfer of genes into CD34 cells.
  • the invention also relates to any mammalian cell modified by an adenovirus as defined above. More preferably, it is a human cell, and even more preferably, chosen from hematopoietic cells, in particular CD34, or tumor cells.
  • vectors of the invention can be used both for modifying human and animal cells (sheep, cattle, domestic animals (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc.).
  • the invention thus provides a particularly effective method for the administration of genes in vivo, comprising the administration of a vector as defined above comprising a cassette composed of said gene and of elements allowing its integration into the genome of any or part of the infected cells.
  • the adenoviruses of the invention comprising a cassette consisting of a heterologous DNA sequence bordered by 2 AAV ITRs can also be used for the production of recombinant AAVs.
  • AAVs indeed need to replicate the presence of a helper virus. It may in particular be an adenovirus of a herpes virus or a vaccinia virus. In the absence of such a helper virus, AAVs remain in latent form in the genome of infected cells, but cannot replicate.
  • recombinant AAVs are generally produced by co-transfection in a cell line infected with the helper virus (in particular adenovirus) of a plasmid carrying the AAV cassette (gene bordered by ITR) and of a plasmid carrying the packaging genes (rep / cap plasmid).
  • helper virus in particular adenovirus
  • a plasmid carrying the AAV cassette gene bordered by ITR
  • a plasmid carrying the packaging genes (rep / cap plasmid).
  • another application of the invention resides in a process for the preparation of recombinant AAVs according to which the producer cells are infected with an adenovirus as described above and transfected with a plasmid carrying the rep and cap genes.
  • the rep and cap genes are also carried by a virus (in particular an adenovirus) used to co-infect the producer cells.
  • a virus in particular an adenovirus
  • the method of the invention uses a production line containing, integrated into its genome, the rep and cap genes.
  • a single step of infection with the virus of the invention is sufficient.
  • a virus according to the invention containing, in addition to the heterologous DNA / ITR AAV cassette, an expression cassette for the rep and cap genes.
  • the rep and cap genes can be placed under the control of a strong and / or inducible promoter.
  • the adenovirus is deleted from all of the viral genes except for the E4 region, and it is co-infected with another adenovirus carrying the entire genome except for the E4 region, in the 293 cells. This embodiment is particularly advantageous.
  • the E4 virus used is the same for all heterologous DNAs.
  • the construction of the virus takes place via a plasmid carrying E4, the PSI sequence and the ITRs of the adenovirus (plasmid ⁇ E4ITR, cf. FR 2,707,664), in which the rep and cap genes are introduced. and heterologous DNA framed by AAV ITRs.
  • This strategy thus makes it possible to propagate the 2 viruses to all cells, in contrast to the transfection of a repapid plasmid which affects only a fraction of the cell population and therefore gives only low AAV titers.
  • Figure 1 Schematic representation of cassettes according to the invention.
  • Figure 2 Representation of vector pXL2373
  • Figure 3 Construction of vector pXL2373
  • Figure 4 Representation of vector pXL2384
  • Figure 5 Construction of vector M 13 ITR FL
  • Figure 6 Representation of vector pITRFL
  • Figure 7 Representation of vector pXL2388
  • Figure 8 Representation of vector pXL2389
  • Figure 9 Representation of the vector papoAI ITRAAV
  • the pBR322, pUC and phage plasmids of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 12 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5477] using the kit distributed by Amersham.
  • Example 1 Construction of a plasmid carrying the ⁇ -galactosidase gene inserted between the ITRs of 1 ⁇ AV2.
  • This example describes the construction of a vector, designated pXL2373, carrying 2 ITRs regions flanking a marker gene ( ⁇ gal) and a polyadenylation site, serving as an intermediary for the preparation, by recombination, of a recombinant adenovirus.
  • the plasmid pXL2373 (FIG. 2) contains in particular a fragment comprising
  • Rous sarcoma virus RSV
  • the vector pXL2373 also contains an adenovirus region allowing homologous recombination.
  • the vector pXL2373 was constructed in the following manner (FIG. 3): The DNA fragment carrying the LTR ("long terminal repeat") of the Rous sarcoma virus (RSV), the lacZ gene of Escherichia coli with the sequences localization and polyadenylation signals from the SV40 early region was isolated as an Xbal-Kpnl fragment from the plasmid pRSV- ⁇ gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin.Invest.90 (1992 ) 626). This fragment was then inserted at the corresponding sites of the plasmid pAICMVIXCAT.3 (Philip et al., Molecular and Cellular Biology, in press). This step allows this fragment to be inserted between the first 650 and the last 191 base pairs (bp) of 1 ⁇ AV2. The resulting plasmid was called pXL2359 ( Figure 3a).
  • the Xbal-BglII fragment of pXL2359 comprising the Rous sarcoma virus (RSV) LTR, the Escherichia coli lacZ gene with the nuclear localization sequences and polyadenylation signals from the SV40 early region, as well as the 191 last bp of AAV, was inserted at the corresponding sites of pBS KS +, to generate the plasmid pXL2360. This subcloning makes it possible to isolate this same fragment in the form of an Xbal-Smal fragment.
  • the Xbal-Smal fragment of pXL2360 was then inserted at the compatible Xbal-EcoRV sites of pRSV- ⁇ gal to give the vector pXL2364 (FIG. 3a).
  • the plasmid psub201 has been described in Samulski et al. (J. Virol 61 (1987) 3096).
  • the Xbal-PvuII fragment of this plasmid carrying the sequences 4484 to 4675 of the AAV was inserted at the Xbal-EcoRV sites of pCRII (Invitrogen) to generate the plasmid pXL2362.
  • the Spel-Xbal fragment of pXL2362 was introduced into the Xbal compatible site of pXL2364 (FIG. 3b).
  • the plasmid obtained was designated pXL2373 ( Figure 2).
  • the capacity of this vector to allow the integration of the cassette is verified by transfection in the Hela and 293 cell lines.
  • Example 2 Construction of a plasmid carrying the ⁇ -galactosidase gene inserted between the ITRs of 1 ⁇ AV2.
  • This example describes the construction of a vector, designated pXL2384, carrying 2 ITRs regions flanking a marker gene ( ⁇ gal) and a polyadenylation site, serving as an intermediary for the preparation, by recombination, of a recombinant adenovirus.
  • the plasmid pXL2384 (FIG. 4) contains in particular a fragment comprising
  • Rous sarcoma virus RSV
  • the vector pXL2384 also contains an adenovirus region allowing homologous recombination.
  • the vector pXL2384 was obtained by inserting the fragments
  • Example 3 Construction of a plasmid carrying the ⁇ -galactosidase gene inserted between the strict ITRs of AAV2.
  • the ITRs sequences used have a 46 bp extension downstream of the left ITR or upstream of the right ITR, and / or a 9 bp deletion 5 ′ of the left ITR (see SEQ ID n ° 1-3).
  • This example describes the construction of a plasmid comprising a gene of interest inserted between the strict ITRs of AAV2. More particularly, this example describes the construction of a vector, designated pITRFL, carrying 2 strict ITR regions surrounding a marker gene ( ⁇ gal) and a polyadenylation site, serving as an intermediary for the preparation, by recombination, of a recombinant adenovirus. .
  • the plasmid pITRFL (FIG. 6) contains in particular a fragment comprising - the LTR ("long terminal repeat") of the Rous sarcoma virus (RSV),
  • the pITRFL vector also contains an adenovirus region allowing homologous recombination.
  • the vector pITRFL was constructed as follows: The strict ITR sequence was constructed using the following oligodeoxynucleotides: seq 4259: (SEQ ID No. 6)
  • M13ITR5 oligodeoxynucleotides
  • seq 4560 and seq 4561 on the one hand and seq 4263 and seq 4264 on the other hand are hybrid two by two and introduced between the Hindi ⁇ and BamHI sites of M13mpl8, the bacteriophage obtained is called M13ITR3 '.
  • the KpnI-Ahall fragment of M13ITR5 'comprising the 5' region of the AAV ITR to the Ahall site (region 1 to 63 on the AAV sequence) and the AhalI-BamHI fragment comprising the 3 'region of ITR (region 64 to 145) are introduced at the Kpnl-BamHI sites of M13mpl8 to give the vector M13 "ITRFL".
  • the BamHI-Spel fragment of M13 "ITRFL” containing the entire sequence of the ITR of AAV (bases 1 to 145) is introduced between the unique BglII-Spel sites of pXL2384 to give the plasmid pRSV ⁇ gal ITRlss.
  • the Kpnl-HincIIde fragments M13 "ITRFL” containing the entire sequence of the ITR of AAV (bases 1 to 145) and EcoRV-XhoI of pXL2384 carrying the protein IX of Ad5 are introduced between the Xhol-Kpnl compatible sites of pRSVBgaUTRlss to give pITRFL ( Figure 6).
  • Example 4 Construction of a plasmid carrying the ⁇ -galactosidase gene and the neoR gene inserted between the ITRs of TAAV2.
  • This example describes the construction of a vector, designated pXL2388, carrying 2 ITRs regions flanking 2 genes ( ⁇ gal and neoR) and a polyadenylation site, serving as an intermediary for the preparation, by recombination, of a recombinant adenovirus.
  • the plasmid pXL2388 (FIG. 7) contains in particular a fragment comprising:
  • neoR neomycin
  • RSV Rous sarcoma virus
  • the vector pXL2388 also contains an adenovirus region allowing homologous recombination.
  • the vector pXL2388 was constructed as follows: The DNA fragment carrying the gene conferring resistance to neomycin (neoR) under the control of the SV40 promoter, as well as the polyadenylation signals of the SV40 virus was isolated in the form of 'a BamHI fragment from the plasmid pMAMneoluc (Clontech). This fragment was then introduced into the BamHI site of the plasmid pBS KS + (Stratagene) to introduce new restriction sites on either side of this fragment. The plasmid thus obtained is called pXL2363.
  • the DNA fragment carrying the gene conferring resistance to neomycin (neoR) under the control of the SV40 promoter, as well as the polyadenylation signals of the SV40 virus was then isolated from pXL2363 in the form of an EcoRI-Xbal fragment. and introduced to the EcoRI-Xbal sites of pCRII (Invitrogen) to give rise to the plasmid pXL2372.
  • the DNA fragment carrying the gene conferring resistance to neomycin (neoR) under the control of the SV40 promoter, as well as the polyadenylation signals of the SV40 virus was then isolated in the form of a Spel fragment from pXL2372, and introduced into the Spel site of pXL2384 (Example 2) to give rise to the plasmid pXL2388 ( Figure 7).
  • the sequence of the neomycin resistance gene under the control of the SV40 promoter comes from the plasmid pXL2388 digested with Spel, and this fragment was inserted at the Spel site of pRSVGAIIX to give pXL2429.
  • the capacity of this vector to allow the integration of the cassette is verified by transfection into the Hela and 293 cell lines.
  • the 293 cells (2,106 cells cultured in 100 mm dishes) are transfected with the plasmids pXL2388, pXL2429 according to the technique. with calcium phosphate.
  • the day after the transfection the medium is changed. After 72 hours, the cells are harvested and returned to culture after dilution 1/10 and 1/50 in a non-selective medium. 72 hours later, the medium is changed and a selective medium containing geneticin at 400 microg / ml is applied.
  • Clones appear after approximately 2 weeks of culture in this medium and it is found that the frequency of appearance of the clones is 100 times higher with the plasmid pXL2388 than with the plasmid pXL2429 which testifies to the capacity of the ITRs to integrate the transgene in the genome of the cell.
  • Example 5 Construction of a plasmid carrying a Sh ble :: lacZ fusion gene inserted between the ITRs of AAV2.
  • This example describes the construction of a vector, designated pXL2389, carrying 2 ITRs regions framing 1 fusion gene (Sh ble :: lacZ), serving as an intermediary for the preparation, by recombination, of a recombinant adenovirus.
  • the plasmid pXL2389 contains in particular a fragment carrying, under the control of the SV40 promoter, a fusion between the gene for resistance to Phleomycin (or zeomycin) and the reporter gene lacZ, followed by polyadenylation signals from the virus SV40, which fragment being inserted between the sequences of two ITRs of the AAV (sequences shown in SEQ ID No. 2 and 3).
  • the vector pXL2389 also contains an adenovirus region allowing homologous recombination.
  • the fusion carrying a dominant marker (Sh ble) and the reporter gene lacZ makes it possible to obtain a dominant phenotype associated with a rapidly identifiable phenotype (blue coloration on X-gal) with a size which does not exceed 3.5 kb. Therefore the region inserted between the two ITRs of the AAV has a size which does not exceed 4.3 kb.
  • the vector pXL2389 was constructed as follows: The Spel-NdeI fragment of the plasmid pUT593 (Cayla, Toulouse) carrying the promoter SV40 and the start of the Sh ble :: lacZ fusion was isolated, then inserted between the Spel- Ndel of pXL2384 (example 2). The plasmid thus obtained was designated pXL2389 ( Figure 8). The capacity of this vector to allow the integration of the cassette is verified by transfection in the Hela and 293 cell lines.
  • Example 6 Construction of a plasmid carrying the apolipoprotein AI gene inserted between the ITRs of 1 ⁇ AV2.
  • Apolipoprotein AI is a protein made up of 243 amino acids, synthesized in the form of a prepropeptide of 267 residues, having a molecular mass of 28,000 daltons. It is synthesized in humans specifically in the liver and the intestine and it constitutes the essential protein of HDL particles (70% of their mass in proteins). It is abundant in plasma (1.0-1.2 g / 1). Its activity which is best characterized biochemically is the activation of lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT), but many other activities are attributed to it, such as in particular the stimulation of the efflux of cellular cholesterol.
  • LCAT lecithin cholesterol acyl transferase
  • Apolipoprotein AI plays a major role in resistance to atherosclerosis, probably linked to the reverse transport of cholesterol, since the mere expression of this apolipoprotein in transgenic mice makes it possible to reduce the surface of lipid deposits at the level of 40 times.
  • aorta versus control mice (Rubin et al. 1993 Science, In Press). Its gene, 1863 bp long, was cloned and sequenced (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12 (9) (1984) 3917).
  • various natural variants of apoAI have been described in the prior art.
  • the plasmids used to generate, by homologous recombination, the recombinant adenoviruses expressing the apoAI gene were constructed as follows: Construction of the papoAI ITR AAV plasmid (FIG. 9): The papoAI ITR AAV plasmid contains in particular the cDNA encoding the preproapoAI under the control of the RSV promoter, the polyadenylation signals of the SV40 virus, the whole inserted between the AAV ITRs, as well as an adenovirus region allowing homologous recombination.
  • DNA fragment carrying in particular the left ITR and the packaging sequence of the adenovirus 5 as well as the LTR of the RSV virus was isolated in the form of an XmnI-ClaI fragment of the plasmid pXL2384 (Example 2) and the fragment of DNA carrying the cDNA encoding preproapoAI and the SV40 virus polyadenylation signals was isolated in the form of a ClaI-BamHI fragment from the plasmid pXL2244 (FR93 05125). These two fragments were then inserted at the XmnI-BamHI sites of the plasmid pXL2384, to generate the plasmid papoAI ITR AAV. During this last step, the lacZ region followed by the polyA of SV40 was eliminated.
  • This example describes the construction of a vector pXL2629 carrying 2 ITRs regions flanking the lacZ marker gene and a polyadenylation site, serving as an intermediary for the preparation by recombination of a recombinant adenovirus.
  • This plasmid differs from plasmid pXL2384 by the sequence of the left AAV ITR (SEQ ID No. 5).
  • the plasmid pXL2359 (Example 1) was digested with Hinfl, the end of which was made blunt by treatment with the DNA polymerase of bacteriophage T4 and then digested with PstI, a fragment of approximately 200 bpd carrying the ITR of the AAV (sequence figure) was isolated and introduced into the plasmid pBSKS-i- at the PstI and Smal sites (blunt end).
  • the plasmid thus constructed is pXL2580.
  • the plasmid pXL2581 is derived from pXL2384 by insertion of 2 oligonucleotides seq 4674 and sep 4675 at the BglII-Spel sites of pXL2384, this plasmid therefore carries in place of the ITR of the left AAV of pXL2384 a unique BstBI site which could be used to construct recombinant AdITRsAAVRSVBgal adenoviruses by the technique of transfection of a ligation mixture of two linearized plasmids into cells 293.
  • seq4674 5'GATCTTTCGAAT3 '(SEQ ID No. 12)
  • seq 4675 5'CTAGATTCGAAA3' (SEQ ID n ° 13)
  • the plasmid pXL2629 was constructed as follows: the plasmid pXL2580 was digested with BamHI-BglII and the fragment of approximately 170 bp containing the complete sequence of the ITR of AAV was introduced into the plasmid pXL2581 previously linearized by BglII.
  • Example 8 Preparation of the Ad ITRsAAVRSV ⁇ Gal Adenovirus
  • This example describes the construction of a defective recombinant adenovirus comprising a cassette allowing the integration of a gene into the genome of cells. More particularly, this adenovirus, designated Ad ITRsAAVRSV ⁇ Gal comprises a cassette composed of 2 ITRs of AAV surrounding the ⁇ gal gene.
  • This adenovirus was obtained by cotransfection of the plasmid pXL2384 for recombination with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the E1 (E1A and E1B) regions of adenovirus.
  • the Ad ITVsAAVRSV ⁇ gal adenovirus was prepared by homologous in vivo recombination between the AdRSV ⁇ Gal adenovirus (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin.Invest. 90 (1992) 626) and the plasmid ⁇ XL2384 according to the following protocol:
  • the plasmid pXL2384 linearized by the enzyme Xmnl and the adenovirus AdRSV ⁇ Gal linearized by Clal are cotransfected in line 293 in the presence of calcium phosphate to allow recombination.
  • the recombinant adenoviruses thus generated are selected by plaque purification.
  • the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately l ⁇ 1 "pfu / ml.
  • the viral particles are centrifuged on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • Ad ITRsAAVRSV ⁇ gal is stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • Example 9 Preparation of Ad ⁇ ITRsAAVRSV ⁇ gal adenovirus.
  • This example describes the construction of a defective recombinant adenovirus comprising a cassette allowing the integration of a gene into the genome of cells. More particularly, this adenovirus, designated Ad ⁇ ITRsAAVRSV ⁇ Gal, comprises a cassette composed of 2 truncated AAV ITRs surrounding the ⁇ gal gene.
  • This adenovirus was obtained by cotransfection of the plasmid pXL2373 for recombination with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the E1 (E1A and E1B) regions of adenovirus.
  • the protocol used is the same as that described in Example 7 for the preparation of the adenovirus Ad ITRsAAVRSV ⁇ gal.
  • the Ad ⁇ ITRsAAVRSV ⁇ gal adenovirus is stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • Example 10 Preparation of Ad ITRFL adenovirus.
  • This example describes the construction of a defective recombinant adenovirus comprising a cassette allowing the integration of a gene into the genome of cells. More particularly, this adenovirus, designated Ad ITRFL comprises a cassette composed of 2 strict AAV ITRs surrounding the ⁇ gal gene.
  • This adenovirus was obtained by cotransfection of the plasmid pITRFL for recombination with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the E1 (E1A and E1B) regions of adenovirus.
  • Adenovirus Ad ITRFL is stored at -80 ° C in 20% glycerol.
  • Example 11 Preparation of the adenovirus Ad apoAI ITRAAV.
  • This example describes the construction of a defective recombinant adenovirus comprising a cassette allowing the integration of a gene into the genome of cells.
  • this adenovirus designated Ad apoAI ITRAAV, comprises a cassette composed of 2 truncated AAV ITRs surrounding the preproapoAI gene.
  • This adenovirus was obtained by cotransfection of the papoAI ITR AAV plasmid for recombination with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions encoded by the El (El A and E1B) regions of adenovirus.
  • Example 12 Preparation of the Ad2629 adenovirus.
  • This example describes the construction of a recombinant adenovirus Ad2629 carrying a cassette composed of 2 ITRs of AAV surrounding the Bgal gene.
  • This adenovirus was obtained by cotransfection of the plasmid pXL2629 with a deficient adenoviral vector, in helper cells (line 293) providing in trans the functions coded by the E1 (E1A and E1B) regions of adenovirus.
  • Ad2629 adenoviruses were prepared by homologous in vivo recombination between the adenovirus dl324 and the plasmid pXL2629 according to the following protocol: the plasmid pXL2629 linearized by Xmnl and the adenovirus dl324 linearized by Clal are cotransfected in the line 293 in the presence of calcium phosphate to allow recombination. The recombinant adenoviruses thus generated are selected by plaque purification.
  • the recombinant adenovirus is amplified in the cell line 293, which leads to a culture supernatant containing the unpurified recombinant defective adenovirus having a titer of approximately 109-1010 pfu / ml.
  • the viral particles are centrifuged on a cesium chloride gradient according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
  • NAME RHONE-POULENC RORER S.A.
  • RUE 20, avenue Raymond ARON
  • SEQ ID NO: 2 GCGCGCTCGC TCGCTCACTG AGGCCGCCCG GGCAAAGCCC GGGCGTCGGG CGACCTTTGG 60 TCGCCCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGAGAGGGA GTGGCCAACT CCATCACTAG 120 GGGTTCCTTG TAGTTAATGA TTAACCCGCC ATGCTACTTA TCTACGTAGC CATG 174

Abstract

La présente invention concerne des adénovirus recombinants comportant une cassette capable de s'intégrer dans le génome des cellules infectées, leur préparation, les compositions pharmaceutiques les contenant, et leur utilisation. En particulier, la cassette contient au moins une séquence terminale inverse-répétée (ITR) d'AAV et une séquence d'ADN hétérologue.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTS INTEGRATIFS, LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION THERAPEUTIQUE.
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale et leur utilisation thérapeutique. Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus recombinants comportant une cassette capable de s'intégrer dans le génome des cellules infectées. L'invention concerne également la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation pour le transfert de gènes in vitro, ex vivo et in vivo, notamment dans le cadre de thérapies génique et cellulaire.
La thérapie génique et cellulaire consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Différentes techniques ont été décrites pour le transfert de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al, J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al, PNAS 84 (1987) 7413), d'ADN et de polylysine, l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physicochimiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus. Toutefois, les vecteurs viraux développés jusqu'à présent ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante toutes les difficultés liées au transfert de gènes dans les cellules et/ou l'organisme. Ainsi, l'adénovirus, qui possède des propriétés attrayantes pour le transfert de gènes (possibilité de produire des titres élevés, faible pathogénicité) est un virus extrachromosomique. De ce fait, dans les cellules en division, le virus recombinant est dilué au cours des générations et finit par disparaître totalement des cellules filles. En revanche, alors que les vecteurs rétroviraux ou dérivés des virus adéno-associés (AAV) sont capables de s'intégrer dans le génome des cellules qu'ils infectent, ils ne peuvent être produits en quantités élevées, ni par exemple incorporer des transgènes de taille importante.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. La présente invention réside en effet dans la mise au point de vecteurs recombinants utilisables en thérapie génique, possédant les propriétés d'infection d'un vecteur adénovirus recombinant et permettant l'intégration d'une séquence hétérologue dans le génome de la cellule ou l'organe infectés.
Un premier objet de l'invention concerne plus particulièrement un adénovirus recombinant défectif comprenant une cassette capable de s'intégrer dans le génome des cellules infectées.
Généralement, la cassette comprend une séquence d'ADN désirée, le plus souvent hétérologue vis-à-vis de l'adénovirus, et des éléments permettant son intégration dans le génome des cellules infectées. De manière avantageuse, les éléments permettant l'intégration sont d'origine virale. Ainsi, les vecteurs de l'invention combinent des propriétés de deux types de virus : les adénovirus et les virus intégratifs.
Les vecteurs de l'invention sont particulièrement avantageux puisqu'ils peuvent être produits avec des titres élevés, ne sont pas pathogènes, possèdent un large spectre d'hôte, sont capables d'incorporer des séquences d'ADN hétérologue de taille importante, et d'intégrer lesdites séquences dans le génome des cellules infectées. De plus, les vecteurs de l'invention permettent de limiter les risques de dissémination de la séquence d'ADN que l'on désire transférer à la cellule ou l'organisme. Une fois celle-ci intégrée dans le génome, elle ne peut plus être excisée et incorporée dans une particule virale infectieuse. En outre, les vecteurs de l'invention permettent avantageusement de transférer aux cellules une séquence d'ADN totalement dépourvue de gènes viraux. En effet, la cassette permettant l'intégration dans le génome peut être totalement dépourvue de toute séquence codante d'origine virale. Les seules régions virales qui peuvent être introduites sont les éléments d'intégration. Par ailleurs, selon la construction utilisée, les vecteurs de l'invention permettent une intégration de la séquence d'ADN hétérogue en un site précis du génome de la cellule infectée, et sans cytotoxicité.
Préférentiellement, les éléments permettant l'intégration de la cassette sont constitués par une ou plusieurs séquences terminales répétée-inversées. Encore plus préférentiellement, les éléments permettant l'intégration de la cassette sont constitués par une ou plusieurs séquences terminales répétée-inversées d'un virus adéno-associé (AAV).
Un objet préféré de l'invention concerne donc un adénovirus recombinant défectif comprenant une cassette contenant au moins une séquence terminale répétée- inversée d'AAV et une séquence d'ADN hétérologue.
La demanderesse a en effet montré que, de manière particulièrement avantageuse, il est possible d'utiliser les propriétés d'intégration de l'AAV ("adeno- associated virus") pour construire un vecteur viral selon l'invention, tel que défini ci- dessus.
Les AAV, comme les adénovirus, sont des virus pathogènes bénins des voies aériennes. En l'absence de virus auxiliaire, les AAV possèdent la propriété de s'intégrer de façon stable, sous forme d'un provirus, en un site préférentiel du génome des cellules humaines (région du chromosome 19). Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région terminale répétée-inversée (ITR) de 145 bases environ. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène reg impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap. codant pour les protéines de capside du virus.
Les régions terminales répétée-inversées (ITR) des AAV servent d'origine de réplication pour le virus, et sont également responsables de l'intégration du virus dans le génome des cellules infectées. Il a maintenant été montré qu'il est possible d'introduire une ou plusieurs de ces ITRs sur un adénovirus recombinant pour cibler l'intégration d'une séquence d'ADN hétérologue sur le chromosome d'une cellule cible, et améliorer ainsi la stabilité d'expression dans le temps. La demanderesse a en effet montré que ces séquences peuvent être introduites dans le génome d'un adénovirus, qu'elles conservent leur fonctionalité dans un contexte adéno viral, et qu'elles peuvent être utilisées en thérapie génique ou cellulaire pour intégrer dans des cellules humaines de façon stable une séquence introduite via un adénovirus. De plus, ces virus hybrides de l'invention peuvent être préparés à des titres comparables à ceux de l'adénovirus (très supérieurs à ceux obtenus avec l'AAV), permettant de multiples applications thérapeutiques. Dans un premier mode de réalisation, la cassette d'intégration selon l'invention ne comporte qu'une seule ITR d'AAV, liée à la séquence d'ADN hétérologue. Il a en effet été montré qu'une seule ITR d'AAV est suffisante pour induire l'intégration de la séquence hétérologue. Dans ce mode de réalisation, l'ITR peut être localisée en aval ou en amont de la séquence d'ADN hétérologue (figures la et lb).
Avantageusement, l'adénovirus selon l'invention comprend une cassette contenant au moins une séquence d'ADN hétérologue bordée de deux ITR d'AAV (figure le). Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux puisque l'efficacité d'intégration est très importante.
Comme indiqué ci-avant, le génome des AAV comprend 2 ITR, localisées à ses 2 extrémités : une ITR 5' localisée à l'extrémité gauche, et une ITR 3' localisée à l'extrémité droite. La séquence de ces ITR est identique, et elles sont orientées en sens inverse l'une de l'autre. Par ailleurs, dans certains cas, la structure des ITR peut être modifiée par des réarrangements, mais la composition en base n'est pas altérée. Pour la réalisation des vecteurs de l'invention, il est possible d'utiliser indifféremment une ou plusieurs de ces ITRs.
Dans un mode particulièrement avantageux de l'invention, la cassette comprend une séquence d'ADN hétérologue bordée d'une ITR 5' et d'une ITR 3' d'AAV.
Les ITR d'AAV peuvent être obtenues de différentes façons. Elles peuvent tout d'abord être isolées à partir du génome d'un AAV, par les techniques classiques de biologie moléculaire (voir notamment WO91/18088, WO93/09239). Comme indiqué ci-dessus, ces séquences possèdent environ 145 pb, sont localisées aux extrémités du génome de l'AAV, et peuvent être excisées au moyen d'enzymes de restriction appropriées. A cet égard, elles peuvent être isolées à partir des différents sérotypes d'AAV, tels que notamment les AAV1, AAV2, AAV3 et AAV4. Par ailleurs, la séquence des ITR étant connue, elles peuvent aussi être synthétisées artificiellement, au moyen de synthétiseurs d'acides nucléiques, ou obtenues par des techniques mixtes (isolement à partir du génome, puis élongation par des techniques de synthèse). Enfin, ces ITR peuvent également être modifiées par toute technique connue de l'homme du métier (biologie moléculaire, chimie, enzymologie, etc), dans le but d'améliorer leur fonctionalité, de réduire leur taille, d'augmenter leur stabilité après intégration ou leur spécificité d'intégration, etc. En particulier, elles peuvent être modifiées par mutation, délétion et/ou addition de paires de bases, selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Avantageusement, dans les adénovirus de l'invention, la ou les ITR utilisées sont des ITR d'AAV-2.
Les ITR utilisées dans la présente invention peuvent comprendre uniquement les séquences nécessaires et suffisantes à l'intégration dans le génome des cellules (ITR stricte). Concernant les AAV, les ITR strictes correspondent aux 145 pb situées de part et d'autre du génome (SEQ ID n° 4). Cependant, les ITR utilisées peuvent également comprendre des séquences supplémentaires, par exemple des séquences adjacentes du génome de l'AAV, et/ou des dél étions, dans la mesure où ces séquences et/ou délétions ne suppriment pas la capacité d'intégration de la cassette. Ainsi, elles peuvent être isolées sous forme de fragments de longueur plus grande (par exemple jusqu'à 1000 pb), qui peuvent être utilisés tels quels, s'ils ne suppriment pas la capacité d'intégration de la cassette, ou préalablement digérés pour réduire leur taille (voir par exemple SEQ ID n° 1-3 + 5).
Pour déterminer si la ou les séquences choisies peuvent permettre l'intégration dans le chromosome, il est par exemple possible de transfecter une lignée cellulaire humaine (par exemple Hela ou 293) d'une part avec un plasmide portant un gène de sélection de type neoR entre les séquences à tester ou à coté de la séquence à tester et d'autre part avec un plamide témoin portant le même gène de sélection sans lesdites séquences, de sélectionner des clones par ajout de l'antibiotique G418, puis de comparer entre les deux types de transfections le nombre de clones obtenus. La fréquence d'intégration obtenue avec la ou les séquences test doit être supérieure à celle obtenue par simple sélection, pour que lesdites séquences soient utilisables.
Une autre manière de tester la capacité d'intégration des séqunces est de transfecter la même lignée d'une part avec un plasmide portant un gène marqueur (ex. βgal) entre les séquences à tester et d'autre part avec un plamide témoin portant le même gène marqueur sans lesdites séquences, et de comparer au fur et à mesure des passages l'activité enzymatique entre les deux transfections; l'activité devant diminuer de façon exponentielle dans les transfections témoin et rester plus stable dans l'autre. A cet égard, les cellules "intégrantes" exprimant la βgal peuvent être repérées, après fixation, par coloration Xgal. Quelle que soit la séquence de l'ITR utilisée, il est particulièrement avantageux qu'elle soit dépourvue de séquence virale codante. En effet, cela permet d'éviter d'introduire dans le génome des cellules des régions virales capables de coder pour tout ou partie de messagers ou protéines viraux, potentiellement toxiques ou immunogènes.
Pour la préparation des vecteurs de l'invention, il est donc particulièrement préféré d'utiliser une ou plusieurs ITR dépourvues de séquence virale codante.
Dans les cassettes de l'invention, la séquence d'ADN hétérologue et la ou les ITR doivent être agencées de manière à permettre l'intégration de la cassette dans le génome de la cellule infectée. Elles peuvent être soit directement jointes, soit espacées par des séquences n'altérant pas la propriété d'intégration de la cassette. En particulier, il peut s'agir d'un ou plusieurs sites de restriction, de régions issues d'un plasmide utilisé lors de la construction (exemple : plasmide bactérien), ou de toute région neutre, etc).
Comme indiqué ci-avant, les adénovirus de l'invention contiennent une cassette permettant l'intégration d'une séquence d'ADN hétérologue dans le génome de la cellule infectée. La séquence d'ADN hétérologue peut être toute séquence dont le transfert dans une cellule ou un organisme est désirée. De manière avantageuse, la séquence d'ADN hétérologue contient un gène thérapeutique. Au sens de l'invention, on entend par gène thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé .peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance (érythropoiétine, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF. aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), etc.
Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les antisens comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Le gène thérapeutique peut également comporter une ou plusieurs séquences codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre de l'invention, les adénovirus recombinants peuvent être utilisés pour la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des microorganismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
En outre, avantageusement, la séquence d'ADN hétérologue peut comporter en plus du gène thérapeutique, un gène marqueur, tel que par exemple le gène de la β-galactosidase ou le gène néo. Les adénovirus de l'invention dans lesquels la cassette comporte deux gènes (un gène thérapeutique et un gène marqueur notamment) sont particulièrement intéressants car leur construction est largement facilitée.
Préférentiellement, la séquence d'ADN hétérologue comprend également des séquences permettant l'expression du gène thérapeutique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV. LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou conférant au gène d'intérêt une spécificité d'expression tissulaire.
Par ailleurs, la séquence d'ADN hétérologue peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la cassette. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales. II existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la cassette. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif , de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n° WO94/26914 et FR 2,707,664 qui sont incorporées à la présente demande par référence.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Les adénovirus recombinants préparés selon la présente invention peuvent être utilisés pour le transfert de gènes d'intérêt in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro, ils peuvent permettre de transférer un gène à une lignée cellulaire, par exemple en vue de produire une protéine recombinante. Ex vivo, ils peuvent être utilisés pour transférer un gène sur une population de cellules prélevée à partir d'un organisme, éventuellement sélectionnée et amplifiée, dans le but de conférer à ces cellules des propriétés désirées en vue de leur réadministration à un organisme. In vivo, ils peuvent être utilisés pour le transfert de gènes par administration directe d'une solution purifiée, éventuellement associée à un ou plusieurs véhicules pharmaceutiques. A cet égard, la présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 101 pfu/ml, et de préférence 10^ à 10l0 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le transfert de gènes dans les cellules. Les vecteurs de l'invention peuvent être utilisés dans de nombreuses applications, telles que les maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose, SCID, etc), les pathologies du système nerveux central (Alzheimer, Parkinson, etc), les maladies cardiovasculaires (hémophilie, athérosclérose), le SIDA, les cancers, etc.
Les vecteurs de l'invention sont tout particulièrement avantageux pour le transfet de gènes dans les cellules qui se divisent. En effet, grâce aux capacités d'infection du vecteur adénoviral et aux propriétés d'intégration de la casette, les vecteurs de l'invention permettent de conférer à des cellules qui se divisent des propriétés stables au cours des générations. Des exemples préférés de ces types de cellules sont notamment les cellules hématopoiétiques (cellules souches, progéniteurs, etc), et les cellules cancéreuses. Tout particulièrement, les vecteurs de l'invention peuvent être utilisés pour le transfert de gènes dans les cellules CD34. A cet égard, l'invention concerne également toute cellule de mammifère modifiée par un adénovirus tel que défini précédemment. Plus préférentiellement, il s'agit d'une cellule humaine, et encore plus préférentiellement, choisie parmi les cellules hématopoiétiques, notamment CD34, ou tumorales.
En outre, les vecteurs de l'invention peuvent être utilisés aussi bien pour modifier des cellules humaines que animales (ovins, bovins, animaux domestiques (chiens, chats, etc), chevaux, poissons, etc).
L'invention fournit ainsi une méthode particuulièrement efficace pour l'administration de gènes in vivo, comprenant l'administration d'un vecteur tel que défini ci-avant comprenant une cassette composée dusit gène et d'éléments permettant son intégration dans le génome de tout ou partie des cellules infectées.
Les adénovirus de l'invention comprenant une cassette constituée d'une séquence d'ADN hétérologue bordée de 2 ITR d'AAV peuvent également être utilisés pour la production d'AAV recombinants. Les AAV ont en effet besoin pour se répliquer de la présence d'un virus auxiliaire. Il peut s'agir en particulier d'un adénovirus d'un herpès virus ou d'un virus de la vaccine. En l'absence d'un tel virus auxiliaire, les AAV restent sous forme latente dans le génome des cellules infectées, mais ne peuvent se répliquer. Pour cette raison, les AAV recombinants sont généralements produits par co-transfection dans une lignée cellulaire infectée par le virus auxiliaire (notamment l'adénovirus) d'un plasmide portant la cassette AAV (gène bordé des ITR) et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (plasmide rep/cap). Ce procédé implique trois partenaires = le virus auxiliaire, le plasmide AAV et le plasmide rep/cap. Grâce à la présente invention, ce procédé peut être simplifié à 2 partenaires. En effet, les adénovirus de l'invention jouent à la fois le rôle de virus auxiliaire et de plasmide AAV. Ainsi, une autre application de l'invention réside dans un procédé de préparation d'AAV recombinants selon lequel les cellules productrices sont infectées avec un adénovirus tel que décrit ci-avant et transfectées avec un plasmide portant les gènes rep et cap. Selon une variante de ce procédé, les gènes rep et cap sont également portés par un virus (notamment un adénovirus) utilisé pour co- infecter les cellules productrices. Cette variante est encore plus avantageuse puisqu'elle permet de remplacer l'étape de transfection du plasmide rep/cap par une infection par un virus rep/cap, beaucoup plus efficace. Toujours selon une variante préférée de mise en oeuvre, le procédé de l'invention fait appel à une lignée de production contenant, intégrés dans son génome, les gènes rep et cap. Dans cette variante, une seule étape d'infection avec le virus de l'invention est suffisante. Il est également possible d'utiliser un virus selon l'invention contenant, outre la cassette ADN hétérologue/ITR d'AAV, une cassette d'expression des gènes rep et cap. Selon ce mode de réalisation, les gènes rep et cap peuvent être placés sous le contrôle d'un promoteur fort et/ou inductible. Avantageusement, l'adénovirus est délété de l'ensemble des gènes viraux à l'exception de la région E4, et il est co-infecté avec un autre adénovirus portant l'ensemble du génome à l'exception de la région E4, dans les cellules 293. Ce mode de mise en oeuvre est particulièrement avantageux. En effet, le virus E4 utilisé est le même pour tous les ADN hétérologues. De plus, la construction du virus passe par l'intermédiaire d'un plasmide portant E4, la séquence PSI et les ITR de l'adénovirus (plasmide ρE4ITR, cf FR 2,707,664), facilement manipulable, dans lequel sont introduits les gènes rep et cap et l'ADN hétérologue encadré des ITR d'AAV. Cette stratégie permet ainsi de propager les 2 virus à toutes les cellules, contrairement à la transfection d'un plasmide rep- cap qui ne touche qu'une fraction de la population cellulaire et ne donne donc que des titres peu élevés d'AAV.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Représentation schématique des cassettes selon l'invention. Figure 2 : Représentation du vecteur pXL2373 Figure 3 : Construction du vecteur pXL2373 Figure 4 : Représentation du vecteur pXL2384 Figure 5 : Construction du vecteur M 13 ITR FL Figure 6 : Représentation du vecteur pITRFL Figure 7 : Représentation du vecteur pXL2388 Figure 8 : Représentation du vecteur pXL2389 Figure 9 : Représentation du vecteur papoAI ITRAAV
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éfhanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 12 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR [Polymérase-catalyzed Chain Réaction, Saiki R.K. et al., Science 23JJ (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Exemples
Exemple 1 : Construction d'un plasmide portant le gène de la β-galactosidase inséré entre les ITRs de 1ΑAV2. Cet exemple décrit la construction d'un vecteur, désigné pXL2373, portant 2 régions ITRs encadrant un gène marqueur (βgal) et un site de polyadénylation, servant d'intermédiaire pour la préparation, par recombinaison, d'un adénovirus recombinant.
Le plasmide pXL2373 (figure 2) contient notamment un fragment comprenant
- le LTR ("long terminal repeat") du virus du sarcome de Rous (RSV),
- le gène lacZ d'Escherichia coli avec les séquences de localisation nucléaire, et, - les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40, lequel fragment étant inséré entre deux séquences ITRs tronquées de 1ΑAV2. La séquence des ITR utilisées est représentée sur les SEQ ID n° 1 et 2.
Le vecteur pXL2373 contient également une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue.
Le vecteur pXL2373 a été construit de la manière suivante (figure 3) : Le fragment d'ADN portant le LTR ("long terminal repeat") du virus du sarcome de Rous (RSV), le gène lacZ d'Escherichia coli avec les séquences de localisation nucléaire et les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40 a été isolé sous forme d'un fragment Xbal-Kpnl à partir du plasmide pRSV-βgal (Stratford- Perricaudet et al., J.Clin.Invest.90 (1992) 626). Ce fragment a ensuite été inséré aux sites correspondant du plasmide pAICMVIXCAT.3 (Philip et al., Molecular and Cellular Biology, sous presse). Cette étape permet d'insérer ce fragment entre les 650 premières et les 191 dernières paires de bases (pb) de 1ΑAV2. Le plasmide résultant a été appelé pXL2359 (figure 3a).
Le fragment Xbal-BglII de pXL2359, comportant le LTR du virus du sarcome de Rous (RSV), le gène lacZ d'Escherichia coli avec les séquences de localisation nucléaire et les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40, ainsi que les 191 dernières pb de l'AAV, a été inséré aux sites correspondants de pBS KS+, pour générer le plasmide pXL2360. Ce sous-clonage permet d'isoler ce même fragment sous forme d'un fragment Xbal-Smal. Le fragment Xbal-Smal de pXL2360 a ensuite été inséré aux sites Xbal-EcoRV compatibles de pRSV-βgal pour donner le vecteur pXL2364 (figure 3a).
Le plasmide psub201 a été décrit dans Samulski et al. (J. Virol 61 (1987) 3096). Le fragment Xbal-PvuII de ce plasmide portant les séquences 4484 à 4675 de l'AAV a été inséré aux sites Xbal-EcoRV de pCRII (Invitrogen) pour générer le plasmide pXL2362. Enfin le fragment Spel-Xbal de pXL2362 a été introduit au site compatible Xbal de pXL2364 (figure 3b).
Le plasmide obtenu a été désigné pXL2373 (figure 2). La capacité de ce vecteur à permettre l'intégration de la cassette est vérifiée par transfection dans les lignées cellulaires Hela et 293.
Exemple 2 : Construction d'un plasmide portant le gène de la β-galactosidase inséré entre les ITRs de 1ΑAV2.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur, désigné pXL2384, portant 2 régions ITRs encadrant un gène marqueur (βgal) et un site de polyadénylation, servant d'intermédiaire pour la préparation, par recombinaison, d'un adénovirus recombinant.
Le plasmide pXL2384 (figure 4) contient notamment un fragment comprenant
- le LTR ("long terminal repeat") du virus du sarcome de Rous (RSV),
- le gène lacZ d'Escherichia coli avec les séquences de localisation nucléaire, et, - les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40, lequel fragment étant inséré entre deux séquences ITRs de 1ΑAV2. La séquence des ITR utilisées est représentée sur les SEQ ID n° 2 et 3.
Le vecteur pXL2384 contient également une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue.
Le vecteur pXL2384 a été obtenu en insérant les fragments
- EcoRV-Xhol de pRSVβgal portant la partie de la protéine IX de l'Ad5 servant à la recombinaison, et,
- EcoRV-Kpnl de pXL2360 (exemple 1) portant la région 3' du gène lacZ à partir du site EcoRV, les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40, la région ITR de l'AAV plus les 47 pdb situées en amont de l'ITR gauche de 1ΑAV2, aux sites Xhol-Kpnl de pXL2373 (exemple 1).
Une carte de ce vecteur est donnée sur la figure 4. La capacité de ce vecteur à permettre l'intégration de la cassette est vérifiée par transfection dans les lignées cellulaires Hela et 293. Exemple 3 : Construction d'un plasmide portant le gène de la β-galactosidase inséré entre les ITRs strictes de l'AAV2.
Dans les plasmides décrits ci-avant, les séquences ITRs utilisées comportent une extension de 46 pb en aval de l'ITR gauche ou en amont de l'ITR droite, et/ou une délétion de 9 pb en 5' de l'ITR gauche (voir SEQ ID n° 1-3). Cet exemple décrit la construction d'un plasmide comportant un gène d'intérêt inséré entre les ITRs strictes de l'AAV2. Plus particulièrement, cet exemple décrit la construction d'un vecteur, désigné pITRFL, portant 2 régions ITRs strictes encadrant un gène marqueur (βgal) et un site de polyadénylation, servant d'intermédiaire pour la préparation, par recombinaison, d'un adénovirus recombinant.
Le plasmide pITRFL (figure 6) contient notamment un fragment comprenant - le LTR ("long terminal repeat") du virus du sarcome de Rous (RSV),
- le gène lacZ d'Escherichia coli avec les séquences de localisation nucléaire, et,
- les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40, lequel fragment étant inséré entre deux séquences ITRs strictes de l'AAV2. La séquence des ITR utilisées est représentée sur la SEQ ID n° 4.
Le vecteur pITRFL contient également une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue.
Le vecteur pITRFL a été construit de la façon suivante : La séquence ITR stricte a été construite au moyen des oligodéoxynucléotides suivants : seq 4259: (SEQ ID n°6)
5' CTA GAT TGG CCA CTC CCT CTC TGC GCG CTC GCT CGC TCA CTG AGG CCG GGC GAC CAA AGG TCG CCC GAC GCC A 3 * seq4260: (SEQIDn°7) 5' AGC TTG GCG TCG GGC GAC CTT TGG TCG CCC GGC CTC AGT GAG CGA GCG AGC GCG CAG AGA GGG AGT GGC CAA 3'T seq4560: (SEQIDn°8) 5' AGC TTG ACG CCC GGG CTT TGC CCG GGC GGC CTC AGT GAG CGA GCG A 3' seq4561: (SEQIDn°9) 5 ' GCG CGC TCG CTC GCT CAC TGA GGC CGC CCG GGC AAA GCC CGG GCG TCA 3 ' seq4263: (SEQID n°10) 5' GCG CGC AGA GAG GGA GTG GCC AAC TCC ATC ACT AGG GGT TCC TAC TAG TG 3* seq4264: (SEOIDn°ll) 5' GAT CCA CTA GTA GGA ACC CCT AGT GAT GGA GTT GGC CAC TCC CTC TCT 3 ' Les oligodéoxynucléotides seq 4259 et seq 4260 sont hybrides et forment à leurs extrémités un demi-site Xbal et un demi-site Hindiπ (figure 5). Ces oligodéoxynucléotides sont ensuite introduits entre les sites correspondant de M13mpl8, et le bactériophage obtenu est appelé M13ITR5' (figure 5). Les oligodéoxynucléotides seq 4560 et seq 4561 d'une part et seq 4263 et seq 4264 d'autre part sont hybrides deux à deux et introduits entre les sites Hindiπ et BamHI de M13mpl8, le bactériophage obtenu est appelé M13ITR3'. Le fragment Kpnl- Ahall de M13ITR5' comportant la région 5' de l'ITR d'AAV jusqu'au site Ahall (région 1 à 63 sur la séquence de l'AAV) et le fragment AhalI-BamHI comportant la région 3' de l'ITR (région 64 à 145) sont introduits aux sites Kpnl-BamHI de M13mpl8 pour donner le vecteur M13 "ITRFL".
Le fragment BamHI-Spel de M13 "ITRFL" contenant la séquence entière de l'ITR de l'AAV (bases 1 à 145) est introduite entre les sites uniques BglII-Spel de pXL2384 pour donner le plasmide pRSVβgal ITRlss. Enfin les fragments Kpnl-HincIIde M13 "ITRFL" contenant la séquence entière de l'ITR de l'AAV (bases 1 à 145) et EcoRV-XhoI de pXL2384 portant la protéine IX de Ad5 sont introduits entre les sites compatibles Xhol-Kpnl de pRSVBgaUTRlss pour donner pITRFL (figure 6).
Exemple 4 : Construction d'un plasmide portant le gène de la β-galactosidase et le gène néoR insérés entre les ITRs de TAAV2.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur, désigné pXL2388, portant 2 régions ITRs encadrant 2 gènes (βgal et néoR) et un site de polyadénylation, servant d'intermédiaire pour la préparation, par recombinaison, d'un adénovirus recombinant. Le plasmide pXL2388 (figure 7) contient notamment un fragment comprenant :
- le gène conférant la résistance à la néomycine (néoR) sous le contrôle du promoteur SV40, suivi des signaux de polyadénylation du virus SV40, - le LTR ("long terminal repeat") du virus du sarcome de Rous (RSV),
- le gène lacZ d'Escherichia coli avec les séquences de localisation nucléaire, et,
- les signaux de polyadénylation de la région précoce de SV40, lequel fragment étant inséré entre deux séquences ITRs de l'AAV2 (séquences représentées sur les SEQ ID n° 2 et 3).
Le vecteur pXL2388 contient également une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue.
Le vecteur pXL2388 a été construit de la manière suivante : Le fragment d'ADN portant le gène conférant la résistance à la néomycine (néoR) sous le contrôle du promoteur SV40, ainsi que les signaux de polyadénylation du virus SV40 a été isolé sous forme d'un fragment BamHI à partir du plasmide pMAMneoluc (Clontech). Ce fragment a ensuite été introduit au site BamHI du plasmide pBS KS+ (Stratagene) pour introduire des sites de restriction nouveaux de part et d'autre de ce fragment. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pXL2363.
Le fragment d'ADN portant le gène conférant la résistance à la néomycine (néoR) sous le contrôle du promoteur SV40, ainsi que les signaux de polyadénylation du virus SV40 a ensuite été isolé à partir de pXL2363 sous forme d'un fragment EcoRI-Xbal et introduit aux sites EcoRI-Xbal de pCRII (Invitrogen) pour donner naissance au plasmide pXL2372.
Le fragment d'ADN portant le gène conférant la résistance à la néomycine (néoR) sous le contrôle du promoteur SV40, ainsi que les signaux de polyadénylation du virus SV40 a ensuite été isolé sous forme d'un fragment Spel à partir de pXL2372, et introduit au site Spel de pXL2384 (exemple 2) pour donner naissance au plasmide pXL2388 (figure 7). Un plasmide témoin, pXL2429, portant le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur SV40 et le gène lacZnls sous le contrôle du promoteur RSV insérés entre les séquences de l'adénovirus, mais dépourvu des séquences ITR de l'AAV a également été construit. La séquence du gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur SV40 provient du plasmide pXL2388 digéré par Spel, et ce fragment a été inséré au site Spel de pRSVGAIIX pour donner pXL2429.
La capacité de ce vecteur à permettre l'intégration de la cassette est vérifiée par transfection dans les lignées cellulaires Hela et 293. Les cellules 293 (2 106 cellules cultivées en boites de 100 mm) sont transfectées avec les plasmides pXL2388, pXL2429 selon la technique au phosphate de calcium. Le lendemain de la transfection le milieu est changé. Après 72 heures les cellules sont récoltées et remises en culture après dilution au 1/10 et au 1/50 dans un milieu non sélectif. 72 heures après, le milieu est changé et on applique un milieu sélectif contenant de la généticine à 400 microg/ml. Des clones apparaissent après environ 2 semaines de culture dans ce milieu et on constate que la fréquence d'apparition des clones est 100 fois plus élevée avec le plasmide pXL2388 qu'avec le plasmide pXL2429 ce qui témoigne de la capacité des ITRs à intégrer le transgène dans le génome de la cellule.
Exemple 5 : Construction d'un plasmide portant un gène de fusion Sh ble::lacZ inséré entre les ITRs de l'AAV2.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur, désigné pXL2389, portant 2 régions ITRs encadrant 1 gène de fusion (Sh ble::lacZ), servant d'intermédiaire pour la préparation, par recombinaison, d'un adénovirus recombinant.
Le plasmide pXL2389 (figure 8) contient notamment un fragment portant, sous le contrôle du promoteur SV40, une fusion entre le gène de la résistance à la Phleomycine (ou à la zéomycine) et le gène reporter lacZ, suivie des signaux de polyadénylation du virus SV40, lequel fragment étant inséré entre les séquences de deux ITRs de l'AAV (séquences représentées sur les SEQ ID n° 2 et 3).
Le vecteur pXL2389 contient également une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue. La fusion portant un marqueur dominant (Sh ble) et le gène reporter lacZ permet d'obtenir un phénotype dominant associé à un phénotype rapidement identifiable (coloration bleue sur X-gal) avec une taille qui n'excède pas 3.5 kb. De ce fait la région insérée entre les deux ITRs de l'AAV a une taille qui n'excède pas 4.3 kb. Le vecteur pXL2389 a été construit de la façon suivante : Le fragment Spel- Ndel du plasmide pUT593 (Cayla, Toulouse) portant le promoteur SV40 et le début de la fusion Sh ble::lacZ a été isolé, puis inséré entre les sites Spel-Ndel de pXL2384 (exemple 2). Le plasmide ainsi obtenu a été désigné pXL2389 (figure 8). La capacité de ce vecteur à permettre l'intégration de la cassette est vérifiée par transfection dans les lignées cellulaires Hela et 293.
Exemple 6 : Construction d'un plasmide portant le gène de l'apolipoprotéine AI inséré entre les ITRs de 1ΑAV2.
L'apolipoprotéine AI est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la forme d'une prépropeptide de 267 résidus, ayant une masse moléculaire de 28.000 daltons. Elle est synthétisée chez l'homme spécifiquement dans le foie et l'intestin et elle constitue la protéine essentielle des particules HDL (70% de leur masse en protéines). Elle est abondante dans le plasma (1.0-1.2 g/1). Son activité la mieux caractérisée sur le plan biochimique est l'activation de la lécithine-cholestérol acyl-transférase (LCAT), mais de nombreuses autres activités lui sont attribuées, comme notamment la stimulation de l'efflux de cholestérol cellulaire. Le rôle physiologique de l'apolipoprotéine AI semble contrebalancé par l'apolipoprotéine AU puisque chez l'homme, le rapport des deux concentrations plasmatiques (AII/AI) est très étroitement corrélé avec le risque coronarien. L'apolipoprotéine AI joue un rôle majeur dans la résistance à l'athérosclérose, probablement lié au transport inverse du cholestérol, puisque la seule expression de cette apolipoprotéine dans des souris transgéniques permet de réduire de 40 fois la surface des dépôts lipidiques au niveau de l'aorte par rapport à des souris contrôles (Rubin et al. 1993 Science, In Press). Son gène, long de 1863 bp, a été clone et séquence (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Par ailleurs, différents variants naturels de l'apoAI ont décrits dans l'art antérieur.
Les plasmides utilisés pour générer, par recombinaison homologue, les adénovirus recombinants exprimant le gène de l'apoAI ont été construits comme suit : Construction du plasmide papoAI ITR AAV (figure 9) : Le plasmide papoAI ITR AAV contient notamment l'ADNc codant pour la préproapoAI sous le contrôle du promoteur RSV, les signaux de polyadénylation du virus SV40 , le tout inséré entre les ITRs de l'AAV, ainsi qu'une région d'adénovirus permettant la recombinaison homologue. Il a été construit de la manière suivante : Le fragment d'ADN portant notamment l'ITR gauche et la séquence d'encapsidation de l'adénovirus 5 ainsi que le LTR du virus RSV a été isolé sous forme d'un fragment XmnI-Clal du plasmide pXL2384 (exemple 2) et le fragment d'ADN portant l'ADNc codant pour la préproapoAI et les signaux de polyadénylation du virus SV40 a été isolé sous forme d'un fragment Clal-BamHI à partir du plasmide pXL2244 (FR93 05125). Ces deux fragments ont ensuite été insérés aux sites XmnI-BamHI du plasmide pXL2384, pour générer le plasmide papoAI ITR AAV. Lors de cette dernière étape, la région lacZ suivie du polyA de SV40 a été éliminée.
La capacité de ce vecteur à permettre l'intégration de la cassette est vérifiée par transfection dans les lignées cellulaires Hela et 293.
Exemple 7 : Construction du plasmide pXL2629.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur pXL2629 portant 2 régions ITRs encadrant le gène marqueur lacZ et un site de polyadénylation, servant d'intermédiaire pour la préparation par recombinaison d'un adénovirus recombinant. Ce plasmide diffère du plasmide pXL2384 par la séquence de l'ITR AAV gauche (SEQ ID n°5). Le plasmide pXL2359 (exemple 1) a été digéré par Hinfl dont l'extrémité a été rendue franche par un traitement par l'ADN polymérase du bactériophage T4 puis redigéré par PstI, un fragment d'environ 200 pdb portant l'ITR de l'AAV (séquence figure) a été isolé et introduit dans le plasmide pBSKS-i- aux sites PstI et Smal (extrimité franche). Le plasmide ainsi construit est pXL2580. Le plasmide pXL2581 est dérivé de pXL2384 par insertion de 2 oligonucléotides seq 4674 et sep 4675 aux sites BglII-Spel de pXL2384, ce plasmide porte donc à la place de l'ITR de l'AAV gauche de pXL2384 un site unique BstBI qui pourrait être utilisé pour construire des adénovirus recombinants AdITRsAAVRSVBgal par la technique de transfection d'un mélange de ligation de deux plasmides linéarisés dans les cellules 293. seq4674 : 5'GATCTTTCGAAT3' (SEQ ID n°12) seq 4675 : 5'CTAGATTCGAAA3' (SEQ ID n°13)
Le plasmide pXL2629 a été construit de la façon suivante : le plasmide pXL2580 a été digéré par BamHI-BglII et le fragment d'environ 170 pb contenant la séquence complète de l'ITR de l'AAV a été introduit dans le plasmide pXL2581 préalablement linéarisé par BglII. Exemple 8 : Préparation de l'adénovirus Ad ITRsAAVRSVβGal
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif comportant une cassette permettant l'intégration d'un gène dans le génome des cellules. Plus particulièrement, cet adénovirus, désigné Ad ITRsAAVRSVβGal comporte une cassette composée de 2 ITR d'AAV entourant le gène βgal. Cet adénovirus a été obtenu par cotransfection du plasmide pXL2384 pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad ITRsAAVRSVβgal a été préparé par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus AdRSVβGal (Stratford- Perricaudet et al., J.Clin.Invest. 90 (1992) 626) et le plasmide ρXL2384 selon le protocole suivant : Le plasmide pXL2384 linéarisé par l'enzyme Xmnl et l'adénovirus AdRSVβGal linéarisé par Clal sont cotransfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ lθl" pfu/ml. Pour la purification, les particules virales sont centrifugées sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456).
L'adénovirus Ad ITRsAAVRSVβgal est conservé à -80°C dans 20% de glycérol.
Exemple 9 : Préparation de l'adénovirus Ad ΔITRsAAVRSVβgal.
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif comportant une cassette permettant l'intégration d'un gène dans le génome des cellules. Plus particulièrement, cet adénovirus, désigné Ad ΔITRsAAVRSVβGal comporte une cassette composée de 2 ITR d'AAV tronquées entourant le gène βgal. Cet adénovirus a été obtenu par cotransfection du plasmide pXL2373 pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus. Le protocole utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple 7 pour la préparation de l'adénovirus Ad ITRsAAVRSVβgal. L'adénovirus Ad ΔITRsAAVRSVβgal est conservé à -80°C dans 20% de glycérol.
Exemple 10 : Préparation de l'adénovirus Ad ITRFL.
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif comportant une cassette permettant l'intégration d'un gène dans le génome des cellules. Plus particulièrement, cet adénovirus, désigné Ad ITRFL comporte une cassette composée de 2 ITR strictes d'AAV entourant le gène βgal. Cet adénovirus a été obtenu par cotransfection du plasmide pITRFL pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus.
Le protocole utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple 7 pour la préparation de l'adénovirus Ad ITRsAAVRSVβgal. L'adénovirus Ad ITRFL est conservé à -80°C dans 20% de glycérol.
Exemple 11 : Préparation de l'adénovirus Ad apoAI ITRAAV.
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant défectif comportant une cassette permettant l'intégration d'un gène dans le génome des cellules. Plus particulièrement, cet adénovirus, désigné Ad apoAI ITRAAV comporte une cassette composée de 2 ITR d'AAV tronquées entourant le gène de la préproapoAI. Cet adénovirus a été obtenu par cotransfection du plasmide papoAI ITR AAV pour la recombinaison avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (El A et E1B) d'adénovirus.
Le protocole utilisé est le même que celui décrit dans l'exemple 8 pour la préparation de l'adénovirus Ad ITRsAAVRSVβgal. L'adénovirus Ad apoAI ITRAAV est conservé à -80°C dans 20% de glycérol. Exemple 12 : Préparation de l'adénovirus Ad2629.
Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant Ad2629 portant une cassette composée de 2 ITRs d'AAV entourant le gène Bgal. Cet adénovirus a été obtenu par cotransfection du plasmide pXL2629 avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trans les fonctions codées par les régions El (E1A et E1B) d'adénovirus. Plus précisément les adénovirus Ad2629 ont été préparés par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus dl324 et le plasmide pXL2629 selon le protocole suivant : le plasmide pXL2629 linéarisé par Xmnl et l'adénovirus dl324 linéarisé par Clal sont cotransfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium pour permettre la recombinaison. Les adénovirus recombinants ainsi générés sont sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'adénovirus recombinant est amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 109-1010 pfu/ml. Pour la purification, les particules virales sont centrifugées sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973)456).
LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: : VIRUS RECOMBINANTS, LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION THERAPEUTIQUE.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 13
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D1 EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 135 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE : (D) AUTRE INFORMATION: /product= Séquence ITR droite sur pXL2373
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
CCATGGCTAC GTAGATAAGT AGCATGGCGG GTTAATCATT AACTACAAGG AACCCCTAGT 60 GATGGAGTTG GCCACTCCCT CTCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG GGCGACCAAA 120
GGTCGCCCGA CGCCC 135
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 174 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Séquence ITR gauche sur pXL2384 et sur pXL2373
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GCGCGCTCGC TCGCTCACTG AGGCCGCCCG GGCAAAGCCC GGGCGTCGGG CGACCTTTGG 60 TCGCCCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGAGAGGGA GTGGCCAACT CCATCACTAG 120 GGGTTCCTTG TAGTTAATGA TTAACCCGCC ATGCTACTTA TCTACGTAGC CATG 174
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 192 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Sécjuence ITR droite sur pXL2384
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CCATGGCTAC GTAGATAAGT AGCATGGCGG GTTAATCATT AACTACAAGG AACCCCTAGT 60
GATGGAGTTG GCCACTCCCT CTCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG GGCGACCAAA 120
GGTCGCCCGA CGCCCGGGCT TTGCCCGGGC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG CGCGCAGAGA 180
GGGAGTGGCC AA 192
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 145 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Séquence ITR stricte
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC 60
CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG 120
GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCT 145
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 194 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= ITR AAV gauche de pXL2629 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
AGATCTGGGC CACTCCCTCT CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGGG CGACCAAAGG 60
TCGCCCGACG CCCGGGCTTT GCCCGGGCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG 120
GAGTGGCAAC TCCATCACTA GGGGTTCCTG GAGGGGTGGA GGGGGGATCC ACTAGTTCTA 180 GAACTAGTGG ATCC 1 4
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 73 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE : (D) AUTRE INFORMATION: /product≈ Seq 4259
( i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: CTAGATTGGC CACTCCCTCT CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGGG CGACCAAAGG 60 TCGCCCGACG CCA 73
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 73 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Seq 4260
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: AGCTTGGCGT CGGGCGACCT TTGGTCGCCC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG CGCGCAGAGA 60 GGGAGTGGCC AAT 73
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 46 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Seq 4560
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: AGCTTGACGC CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC GAGCGA 46
( 2 , INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Seq 4561
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GCGCGCTCGC TCGCTCACTG AGGCCGCCCG GGCAAAGCCC GGGCGTCA 48
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 50 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Seq 4263
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC ACTAGGGGTT CCTACTAGTG 50
( 2 ) INFORMATION POUR LA SF.O ID NO: 11 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 48 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE : (D) AUTRE INFORMATION: /product≈ Seq 4264
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11 : GATCCACTAG TAGGAACCCC TAGTGATGGA GTTGGCCACT CCCTCTCT 48
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product≈ Seq 4674
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: GATCTTTCGA AT 12
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 12 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE :
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Seq 4675
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: CTAGATTCGA AA 12

Claims

REVENDICATIONS
1. Adénovirus recombinant défectif comprenant une cassette capable de s'intégrer dans le génome des cellules infectées.
2. Adénovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la cassette comprend une séquence d'ADN hétérologue et des éléments permettant son intégration dans le génome.
3. Adénovirus selon la revendication 2 caractérisé en ce que les éléments permettant l'intégration de la cassette sont d'origine virale.
4. Adénovirus selon la revendication 3 caractérisé en ce que la cassette contient au moins une séquence terminale inverse-répétée (ITR) d'AAV et une séquence d'ADN hétérologue.
5. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'ITR d'AAV est localisée en aval ou en amont de la séquence d'ADN hétérologue.
6. Adénovirus selon la revendication 4 caractérisé en ce que la cassette contient au moins une séquence d'ADN hétérologue bordée de deux ITR d'AAV.
7. Adénovirus selon l'une des revendications 4-6 caractérisé en ce que la ou les ITR sont des ITR strictes ou possédant des régions supplémentaires ou des délétions ne supprimant pas la capacité d'intégration.
8. Adénovirus selon l'une des revendications 3 à 7 caractérisé en ce que la ou les ITR sont des ITR d'AAV-2.
9. Adénovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue comprend un gène thérapeutique.
10. Adénovirus selon la revendication 11 caractérisé en ce que le gène thérapeutique est un gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique, un gène codant pour un ou plusieurs peptides antigéniques, ou un gène ou une séquence antisens.
11. Adénovirus selon la revendication 10 caractérisé en ce que le gène thérapeutique code pour un produit protéique choisi parmi les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, les facteurs de croissance (érythropoiétine, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc), les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc, la dystrophine ou une minidystrophine, la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les suppresseurs de tumeurs : ρ53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, les facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase).
12. Adénovirus selon l'une des revendications 9 à 11 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue comprend un gène thérapeutique sous le contrôle d'un promoteur.
13. Adénovirus selon la revendication 12 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur constitutif, régulé et/ou tissu-spécifique.
14. Adénovirus selon la revendication 13 caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur viral.
15. Adénovirus selon la revendication 14 caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs El A, MLP, CMV et LTR-RSV.
16. Adénovirus selon la revendication 12 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue comprend également, entre le gène thérapeutique et le promoteur, une séquence de sécrétion.
17. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue comprend un gène thérapeutique et un gène marqueur, de préférence le gène de la β-galactosidase.
18. Adénovirus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est dépourvu au moins des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
19. Adénovirus selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad5 ou Ad2 ou canin de type CAV-2.
20. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 19.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication 20 ou 21 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10^ et 10^ pfu/ml, et de préférence 10° à lOlO pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
23. Cellule de mammifère caractérisée en ce qu'elle est modifiée par un adénovirus selon l'une des revendications 1 à 19.
24. Cellule selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'il sagit d'une cellule humaine.
25. Cellule selon la revendication 24 caractérisée en ce qu'il sagit d'une cellule hématopoiétique, notamment CD34, ou tumorale.
26. Utilisation d'un adénovirus selon la revendication 6 pour la production d'AAV recombinants.
27. Utilisation selon la revendication 26 caractérisé en ce que les cellules productrices sont infectées par un adénovirus selon la revendication 6 et transfectées par un plasmide portant les gènes rep et cap.
28. Utilisation selon la revendication 26 caractérisé en ce que les cellules productrices sont co- infectées par un adénovirus selon la revendication 6 et par un adénovirus portant les gènes rep et cap.
29. Utilisation selon la revendication 26 caractérisé en ce que les cellules productrices contiennent les gènes rep et cap intégrés dans leur génome et sont infectées par un adénovirus selon la revendication 6.
30. Utilisation selon les revendications 26-29 caractérisé en ce que les cellules productrices sont les cellules 293.
31. Adénovirus selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'il contient en outre une cassette d'expression des gènes rep et cap.
32. Adénovirus selon la revendication 31 caractérisé en ce qu'il est dépourvu de l'ensemble des gènes viraux à l'exception de la région E4.
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