WO1997033884A1

WO1997033884A1 - Reactifs pour marquer les groupes sh, procede pour les preparer et procede pour les marquer

Info

Publication number: WO1997033884A1
Application number: PCT/JP1997/000821
Authority: WO
Inventors: Kazuhiro Imai; Hiromichi Eto; Takeshi Kotsugai; Tadashi Narita
Original assignee: Ss Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 1997-09-18
Also published as: EP0844246A1; KR19990014715A; KR100259761B1; US6171520B1; EP0844246A4; CA2221306A1

Description

明細書

S H基標識用試薬、その製法及びそれを用いた標識法技術分野

本発明は、マレイミド基を持つァクリジン化合物を利用する S H基標識用試薬に関し、更に詳細には、アミノ酸、蛋白質等の被測定物質に含まれ、または容易に導入できる S H基に結合するマレイミド基を有し、化学発光するァクリジン化合物を標識物質とする S H基標識用試薬、その製法およびこれを用いた標識法に関する。背景技術

ァクリジン化合物であるァクリジニゥムエステルは、高い発光効率を持つことから化学発光標識物質として有用である。このァクリジニゥムエステルを臨床検査の免疫発光分析におけるケミルミネッセントラベルとして使用することについては、例えばョ一口ッパ特許出願公開第 8 2 6 3 6号や米国特許第 4 7 4 5 1 8 1号明細書に開示されている。

既知のァクリジニゥムエステルの中には、末端にスルフイエゥムイオンを有するもの（特開平 5— 2 5 5 2 6 4号）、スぺ一サ一部にヒドラゾニゥムイオンを有するもの（特開平 5— 2 5 5 2 6 3号）ゃァクリジニゥムのメチル基などを力ルポキシル基に代えたもの（特開平 6— 2 2 8 1 0 2号）等親水性構造を有するものが知られているが、これらの親水性構造を有するァクリジニゥムエステルは実質的にアミノ基を標識することを目指すものであり、アミノ酸や、蛋白質等を標識し、臨床検査の免疫発光分析におけるケミルミネッセントラベルとして使用するのに適した化合物とされている。

ところで、臨床検査の免疫発光分析における測定対象物質は、アミノ酸や蛋白 - - 質がほとんどであるが、これら物質には多くのァミノ基が存在するので、上記の既知ァクリジニゥム化合物は標識の実行がたやすいという点では大きな利点がある。

しかし逆に、アミノ酸や蛋白質中に多く含まれるアミノ基を標識する結果、被標識部位が多くなり、標識の均一性、再現性、抗体蛋白等対象物の不溶化の問題や、抗体に標識する場合には抗原認識部位にあるアミノ基に標識化合物が結合し、抗体としての働きを低下させ、ないしは失わせるという問題があった。また、被標識物質がァミノ基の数が限定される低分子である場合は、標識反応を制御し、容易にニ定のモル比で標識できる場合もあるが、被標識物質が抗体蛋白等の高分子でアミノ基の数が必ずしも限定できない場合は、試行錯誤により、一定のモル比で標識できる条件を予備検討しなければならないという欠点もあった。

一方、ある化合物を化学発光標識試薬として実用に供するためには、その化合物の標識反応が容易であると共に、その標識条件では発光ないし分解には至らないことが必須である。ァクリジニゥムエステルで標識される相手方は、ァミノ酸等低分子化合物をはじめとして酵素あるいは抗体等の高分子化合物まで様々であるが、上記のように被標識物質のアミノ基を利用する場合、上記引用文献にみられるように、ァクリジニゥムエステルにィミド基を与えてァミノ基と結合させる場合が多い。そして、このイミド基を用いてァミノ基と結合反応させる場合の反応は、アルカリ性で効率良く進むが、一般にアタリジニゥム化合物はアル力リ性で発光ないし分解に至る不安定な化合物であるため、発光活性を有したまま標識を効率良く進めるということは、相矛盾する反応条件を求めることとなって不都合である。

従って、免疫発光分析等に用いる化学発光標識法において、アミノ酸や蛋白質等の被測定物質と穏和な条件下で結合することができ、しかも高い特異性を有しながら十分な結合力を有するような標識化合物を見出し、これを利用して安定に精度良く被測定物質を検出する方法の提供が要望されていた。発明の開示

本発明者は、上記課題の解決のために、まず、標識基として、従来利用されているアミノ基に代え、アミノ酸や蛋白質等に一般にはあまり含まれないが、良好な反応性を有する SH基を利用することに思い至った。そして、この SH基を標識するための SH基標識用試薬として、マレイミド基を導入したアタリジニゥム化合物が有利に利用できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明の目的は、一般式（I)

(式中、 Aは次の基、

- (CH₂) mi—

または、

[ここで、 Qは基一 S + RX — 、基一 N⁺RR i X- (ここで、は炭素数 1から 6のアルキル基またはァリール基を示す）、基

— N+ CHX二

、ノ

(ここで、 R₂および R₃は同一または異なって、それぞれ基— （CH₂) _k— （k は 1〜3の数を意味する）を示す）または一O (CH₂ CH₂0) ！ - (1は 1〜 3の数）を示し、 ]111は1〜6の数を、 11! ₂は0〜2の数を、 nは 1〜2の数を意味する]、 Rは炭素数 1〜6のアルキルまたはァリール基を、 X-はァニオンを示す）

で表されるアタリジン化合物を含有する S Η基標識用試薬を提供することである。

また本発明の別の目的は、上記ァクリジン化合物の中間体である一般式（II)

{式中、 A'は次の基、

- (CH₂) mi—

または、

[ここで、 Q'は基一 S— 、基一 NR,— (ここで、 Riは炭素数 1から 6のァルキル基を示す）、基

, Rへ

N CH

ノ

(ここで、 R₂および R₃は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) k— (k は 1〜 3の数を意味する）を示す）または一 O (CH ₂ CH ₂ O) 1 - ( 1は 1〜 3の数）を示し、 m ₂および nは前記した意味を有する] を示す } で表されるァクリジン化合物を含有する S H基標識用試薬を提供することである。

更に本発明の他の目的は、上記式（I) および（Π) で表されるァクリジン化合物の製造法を提供することである。

更にまた、本発明の他の別の目的は、上記式（I) または（Π) を用いる被測定物質の標識法を提供することである。発明を実施するための最良の形態

本発明の一般式（I) で表される化合物は、例えば、以下の方法 1および 2のいずれかに従って製造することができる。方法 1 ：

本発明のァクリジン化合物の内、 Aが基、

― ( C H ₂) mi - (ここで、 rr は前記した意味を有する）

である化合物（la) は、次の反応式に従い、一般式（Ha) で表される化合物（以下、「中間体（IIa)」という）に、常法に従いアルキル化剤（ΙΠ) を反応させることにより得られる。

(na)

(la)

(式中、 Xは容易にァニオンとなる脱離基を示し、 R、は前記した意味を有する）

この反応において使用されるアルキル化剤（R— X) としては、例えばヨウ化メチル、臭化工チルゃヨウ化工チル等のアルキルハライド、トリフルォロメタンスノレホン酸メチノレ、フノレオロスルホン酸メチル、メタンスノレホン酸メチルや p— トルエンスルホン酸メチル等が挙げられる。従って、式（la) 中の X_は 1 _、 B r ^_等のハロゲンイオン、 C F 3 S O3 、 FS0₃—、 CH₃ S 0₃—や ρ— CH 3 C ₆ Η ₄ SO ₃ が最も代表的であり、また Rはメチル、ェチル等の炭素数 1から 6のアルキル基またはァリール基である。また、この反応において用いる溶媒としては、例えばエーテル、トルエン、ァセトニトリル等が例示される。

化合物（la) を製造するための出発原料である、中間体（Ila) は、次式に従つて ω アミノアルキレンフエ二ノレ 9—ァクリジン力ボキシレート（IV) と無水マレイン酸（V) とを塩基の存在下、反応させることにより製造される。

+ 0 0

(IV) (V)

(na)

(式中、は前記した意味を有する）

具体的には、例えばクリニカルケミストリ一（C I i n.C h e m.1 9 8 5， 3 1 ( 1 0) ，1 6 6 4— 1 6 6 8) に記載されている方法に準じ、塩基として、酢酸ナトリウム、炭酸カリウム等を用い、また溶媒としては酢酸、プロピオン酸等を用い、 8 0〜1 4 0 程度の温度で、化合物（IV) と（V) を反応させることにより化合物（Π) を得ることができる。

なお、上記中間体（Ila) は、一般式としては、特開昭 6 2— 6 1 9 6 9号の中に記載されているものの、この公報中では実施例をはじめこの化合物の製造の手がかりになる記載は全くないので、事実上新規な化合物と思われる。方法 2 ：

本発明のァクリジン化合物の内、 Aが基、

一（CH2) im-Q'- (CH₂) n- (ここで、 Q'、 m₂および nは前記した意味を有する）

である化合物（lb) は、新規化合物であり、その具体例として、以下の式で表される化合物を挙げることができる。

この化合物（lb) は、例えば、次の反応式に従い、一般式（lib) で表される化合物（以下、「中間体（IIb)」という）に、常法に従いアルキル化剤（ΠΙ) を反応させることにより得られる。

(lib) ひ (^CH2)『 ^N》〇

(lb) [式中、 Q、 Q'、 R、 X—、 m₂および nは前記した意味を有する]

この反応において使用されるアルキル化剤（R— X) としては、方法 1で用いたものと同じものが举げられる。従って、式（lb) 中の X—はに、 B r—等のハロゲンイオン、 CF₃ S03^_、 F S O3—、 CH₃ S0₃—や、 p— CH₃C₆H4 S O 3—が最も代表的であり、また Rはメチル、ェチル等の炭素数 1から 6のアルキル基またはァリール基である。また、この反応において用いる溶媒としては、例えばエーテル、トルエン、ァセトニトリル等が例示される。

また、化合物（lb) を製造するための原料である中間体（Db) は新規化合物であり、その具体例としては、例えば以下の式で表される化合物が挙げられる。

この中間体（lib) は、次の方法に何れかにより製造することができる。

(i) 次の反応式に従い、脱離基を有するフエノール化合物（VI) と 9一アタリジンカルボン酸の反応性誘導体（VII) とを反応させ、末端に脱離基を有するァクリジンエステル誘導体（vm) を製造した後、これに末端に必要に応じ保護基で保護した一級アミノ基を有しかつ他端に一級または二級のアミノ基を有するポリアミン（IX) を適当な塩基のもとで反応させ、末端に必要に応じ保護基で保護した一級アミノ基を有するァクリジンエステル（X) を製造し、末端の一級ァミノ基の保護基が存在する場合は、その保護基をはずした後、無水マレイン酸

(V) と該一級アミノ基とを反応させマレイミド基として化合物（lib') を得る。

(VI) (VII) (vin)

H-Qr(CH₂)irN(R.)2 (jx)

{R-

(X)

0 。 (v)

(lib)

[式中、 R,はそれぞれ水素原子またはァミノ保護基を示し、丫！ぉょび丫ま脱離基を、 Qiは基一 NRi— または基 Rへ

一 N CH—

R₃ノ

(ここで、 R₂および R ₃は前記した意味を有する）を示し、 m₂および nは前記した意味を有する] (ii) 次の反応式に従い、末端に保護基で保護された一級アミノ基がついたチォェ一テルまたはポリエーテルを有するフエノール誘導体（XI) と 9一アタリジンカルボン酸の反応性誘導体（VII) とを反応させてアタリジニゥムエステル (XII) を製造し、次いで、末端にあるアミノ基の脱保護を行った後、無水マレイン酸（V) を末端の一級アミノ基に反応させマレイミド基として化合物（lib") を得る。

(XI)

(VII)

(Xii)

0 。 0 (V)

(lib") - -

(式中、 Q2は基一 S— または基一 O (CH₂CH₂0) 1— を示し、 R_a、 Y ₂、 m₂および nは前記した意味を有する）

方法（i) の、脱離基を有するフユノール化合物（VI) のフユノール化合物の例としては、 4— (トシルォキシメチル）フエノール、 4— (3—クロ口プロピル）フエノール、 4— (2— トシルォキシェチル）フエノール等が挙げられ、その脱離基としては、トシルォキシ基、メシルォキシ基、ハロゲン原子（C 1、 Β r、 I) が例示される。また、 9ーァクリジンカルボン酸の反応性誘導体（νπ) としては、クロリド、ブロミド等の酸ハライド、酸無水物、活性酸エステル等が例示される。更に、ポリアミン（IX) としては、 N— （2—アミノエチル）ピペラジン、 1 ,3—ジァミノプロパン、 4— (アミノメチル）ピぺリジン等が举げられ、その保護基としては、 t—ブトキシカルボニル（B o c)、ベンジルォキシカルボニル（C b z)、フタルイミド等が例示される。更にまた、化合物 (VI) と（VII) の反応および化合物（Vm) と（IX) の反応に用いられる塩基としては、トリェチルァミン、ピリジン等が例示される。なお、この反応においては、溶媒として塩化メチレン、クロ口ホルム（CHC 1 3)、エーテル、トルェン、ピリジン等が挙げられる。

また、化合物（IX) からの一級ァミノ基の保護基の除去を行う場合は、常法に従い、酸、接触還元条件または塩基を用いて無溶媒または適当な溶媒中で行うことができる。用いる酸としては、例えば三フッ化ホウ素（BF₃)、トリフノレオ口酢酸、塩酸等が挙げられ、接触還元の溶媒としては、パラジウム—炭素、パラジゥム黒、白金黒等が挙げられ、塩基としてはヒドラジン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等とが挙げられる。溶媒としては、例えばエーテル、 1，4ージォキサン、メタノール、エタノール、水、ァセトニトリル、齚酸等が挙げられる。更に、必要により保護基を除去した化合物（X) の一級ァミノ基のマレイミド化は、無水マレイン酸と塩基の存在下、溶媒中で加熱して反応させることにより行うことができる。用いる塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、炭酸力リウ - - ム等が挙げられ、また溶媒としては、例えば酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。一方、方法（ii) の、末端アミノ基を有するチォエーテルまたはポリエーテル構造を有する基を持つフヱノール誘導体（XI) のうち、チォエーテルを有するフエノール誘導体の例としては、 4— (2—アミノエチルチオ）フエノール、 4 - (3—ァミノプロピルチオ）フエノール等が、また、ポリエーテル構造を有するフエノール誘導体の例としては、 4— [3— (2—アミノエトキシ）プロピルォキシ] フエノール、 4— [2— （2—アミノエトキシ）エトキシ] フエノール等がそれぞれ挙げられ、これらのァミノ保護基としては、 B o c、 Cb z、フタルイミド等が挙げられる。また用いられる塩基としては、トリェチルァミン、ピリジン等が挙げられ、溶媒としては塩化メチレン、エーテル、トルエン、ピリジン等が挙げられる。

1級のアミノ基の保護の除去およびマレイミド化は、（i) の方法で説明したのと同様にして行うことができる。

次に、本発明の化合物（I) を、アミノ酸または蛋白質中の SH基に反応させ、これら物質を標識する方法について説明する。

例えば、本発明の化合物（I) により抗体を標識する場合には、まず、抗体をペプシン消化して F (a b') 2を得、これを穏和な条件下で還元して F a b'を調製する。次いで、溶液中でこの F a b'の SH基に本発明化合物（I) のマレイミド基を反応させ、標識することができる。

F a b'と本発明化合物（I) の反応は、反応溶液中の溶存酵素による SH基の酸化を 1〜5mM程度の EDTAにより保護しつつ、 pH5〜7、好ましくは、 p H 6〜6.5の水溶液中で、温度:！〜 3 7°C、好ましくは、 4〜： 1 0 で、 1 0分から 72時間、好ましくは、 48時間程度、 F a b'と本発明の化合物（I) とをモル比 1 ： 1〜 1 0で反応させればよい。

化合物（I) による標識は、一般に水系媒体中、 P H 7以下で行うことができるが、もし被標識物質が水に難溶または不溶の場合には、以下の方法で標識を行 - - うことができる。すなわち、被標識物質を水と良く混じり合う不活性な少量の溶媒（以下、「不活性な溶媒」という）で溶解した液に水を加え、被標識物質の水系溶液とし、その液に化合物（I) の水系溶液を混和し、 p H 7以下でS H基とマレイミド基の反応を行えばよい。この反応は、本発明の化合物（I) のマレィミド基の不飽和結合に対して被標識物質が求核付加することにより進むため、被標識物質に S H基のほかにァミノ基が存在する場合でも、 p H 7以下で反応を行うためにこのアミノ基の求核性が抑えられ、ァミノ基との反応生成物は作らない点で、本発明の化合物は S H基に選択的な試薬として使うことができる。

ここで、標識に用いる不活性な溶媒としては、 Ν,Ν—ジメチルァセトアミド、 . ジメチルスルホキシド、 Ν,Ν—ジメチルホルムアミド（DM F )、 1 , 4—ジォキサンあるいはピリジン等が挙げられる。

この標識後、ゲルクロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法、ァフィ二ティーク口マトグラフ法、高速液体クロマトグラフ法等の分離手法により、被標識体を単離することができる。すなわち、以上の方法により、モル比一定の摞識が可能である。

また、被標識物質が S H基を有しない場合は、例えば被標識物質の水酸基ゃァミノ基等に対し、 S—ァセチルメルカプトこはく酸無水物等を用いて穏和な条件下で S H基を導入し、本発明の標識法を適用することができる。この場合、導入された S H基の定量により、被標識物質と S H基とのモル比を見積ることができる。したがって、本発明の標識法において利用できる被測定物質としては、 S H基を有するか、あるいは S H基を導入できる物質であれば何でもよく、アミノ酸等の低分子にも、上記同様、穏和な条件により本発明の化合物（I) を標識することができる。

斯くして得られた被標識物質は、公知のァクリジニゥムエステルの発光条件、例えば、アルカリ性条件下、 H 2 O ₂等の添加により化学発光させ、この発光を化学発光検出器により検出することにより、その存在を知ることができ、またその化学発光量から、被標識物質の量を知ることができ、微少量の検出が必要な、医薬品の体内動態の追跡おょぴ診断薬等の各種分野で定性分析や定量分析に応用することができる。

次に、本発明の化合物（I) を利用した標識法の具体的応用例について説明する。

本発明の標識法の応用としては、例えば、いわゆるケミルミネッセントィムノアツセィサンドイッチ法におけるように、試料中の被測定物質と、担体に結合させておいた被測定物質と特異的に結合する物質との結合反応により被測定物質を捕捉後、この被測定物質に対し別途特異的に結合する物質を本発明の化合物（I) で標識したものとを結合させ、この発光強度を測定することによる被測定物質の測定法が挙げられる。

また、いわゆるケミルミネッセントィムノアッセィ競合法におけるように、被測定物質を本発明の化合物（I) で標識し、これを予め一定濃度で添加し、試料中の被測定物質と標識された被測定物質のいずれにも特異的に結合する物質に対してこれらの被測定物質同士が拮抗的に結合する反応を利用し、この発光強度を測定することによる被測定物質の測定法が挙げられる。

これらの場合、特異的に結合する物質の組合せの例としては、抗原と抗体、核酸と相補的配列、エフェクター分子とレセプタ一分子、酵素とインヒビタ一、ァビジンとビォチン、糖鎖を有する物質と対応するレクチン等が挙げられる。

また別の応用としては、例えば、いわゆるポストカラム高速液体クロマトグラフ法におけるように、被測定物質を本発明の化合物（I) で標識し、前記のクロマトグラフ法等の分離手法により単離し、化学発光検出器により、被測定物質を測定する方法が挙げられる。

以上説明した標識法において、本発明の化合物（I) により、従来知られたァクリジニゥムエステルが有していた欠点である、標識された被測定物質の不溶化、生物活性に必要なァミノ基まで標識により失活させる恐れや、一定の結合モル比 - - で結合させにくく、結合反応に再現性を得ることが容易でなく、結合反応条件下で既に発光や分解が生じること等の各種問題を克服できる。

更に、本発明の応用の別の例としては、以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明化合物（I) 合成のためにも利用される中間体（Π) を、予め S H基を有する被測定物質に反応させて結合（以下、「前標識」という）させる。次いで、適当な N—アルキル化剤を反応させ、更にアルカリ性条件下、 H ₂ O ₂等適当な化学発光剤を作用させ、この化学発光を化学発光検出器により検出し、被測定物質を測定する方法が挙げられる。

一般式（II) で表されるァクリジンエステルは、その末端のマレイミド基が S H基に対し結合活性があり、しかも安定な化合物として単離可能であるため、予め S H基を有する物質と結合させることができる。

上記の中間体（Π) による被測定物質の前標識反応における結合方法、得られた前標識体の分離方法等は、化合物（I) についての方法とほぼ同様にして行うことができる。

上記の前標識体は、更に、アルキル化剤（ΙΠ) と適当な溶媒中で反応させることにより、アタリジニゥムエステル標識体とすることができる。使用されるァルキル化剤（ΙΠ) としては、前記した如く、例えばヨウ化メチル、ヨウ化工チル、臭化工チル等のハロゲン化アルキル、トリフルォロメタンスルホン酸メチル、フノレオロスルホン酸メチル、メタンスルホン酸メチルや p —トルエンスルホン酸メチル等を用いることができる。また、用いる溶媒としては、例えば上記の前標識反応に用いられた溶媒のほ力、、テトラヒドロフラン、ァセトニトリル等が挙げられる。

この反応後用いた溶媒中より、結晶として析出する場合はァクリジニゥムエステル標識体を濾取して単離することができるし、析出してこない場合は、カラムク口マトグラフ法を用い単離することができる。

中間体（Π) による前標識反応後、更にアルキル化剤 π) により Ν—アルキ - ル化され、標識された被測定物質の化学発光や、その利用等も化合物（I) について説明したのと同様である。

なお、中間体（Π) を用いる標識方法は、結合後、アルキル化剤（ΙΠ) で標識するということから見て、 SH基以外のアルキル化剤に活性な基がある被測定物質には適さず、この場合にはこれらの活性な基を適当な保護基で保護する等の手段を採る必要性がある。

以下、実施例を挙げ、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等になんら制約されるものではない。実施例 1

4— (2—トシルォキシェチル）フエノール（1) の合成：

3.2 gの 4—ヒドロキシフエネチルアルコールを 50 m 1のピリジンに溶かし、氷冷下 4.0 gのトシルクロリドを少量ずつ添加した。室温に戻し 2時間擾拌後、不溶物を濾去し、ピリジンを減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムク口マト（溶離液： CHC 1 ₃) にて単離精製し、（1) を 3.4 g得た（収率 59 %)。実施例 2

9—ァクリジンカルボン酸クロリド（2) の合成：

9—ァクリジンカルボン酸 2.2 gに塩化チォニル 2 Om l を加え、 5時間加熱還流した。塩ィ匕チォニルを减圧留去した後、更に塩化メチレン 2 Om lを加え、減圧留去を 2回繰り返し、（2) を 2.4 g得た（収率定量的）。実施例 3

4— (2—トシルォキシェチル）フエニル 9—ァクリジルカルボキシレート（3) の合成： - - 実施例 2で得た（2) 2.4 gを 3 Om 1のピリジンに溶かし、水冷攪拌下実施例 1で得た（1) 2.9 gを少量ずつ添加し、室温で 2時間攪拌した後、ピリジンを減圧留去した。更に CHC 1 ₃を加え、減圧留去を 2回行なった。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃) にて単離精製し、（3) を 2. 7 g得た（収率 54%)。実施例 4

4一 [2— (4—アミノメチルビペリジン一 1—ィル）ェチル] フエニル 9—ァクリジンカルボキシレ一ト（4) の合成：

実施例 3で得た（3) 2.9 gを 3 Om 1の DMFに溶かし、 0.59 gの 4 —アミノメチルビリジンを加えた。室温で攪拌し、氷冷下 0.60 gの t— B u OKを加え、室温で 5時間攪拌した。 DMFを減圧留去し、残渣を CHC 1 ₃ に溶かし、水洗した後、無水硫酸マグネシウム（Mg SO ₄) にて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃ : M e OH=7 ： 3) にて単離精製し、（4) を 0.4 1 g得た（収率 1 8%)。実施例 5

4 - [2— [4— [(マレイミド一 1—ィル）メチル] ピぺリジン一 1—ィル] ェチル] フエニル 9—ァクリジン力ノレボキシレート（5) の合成：

実施例 4で得た（4) 0.4 1 g、無水マレイン酸 0.30 gおよび齚酸ナトリウム 0.3 O gを醉酸 20m l 中に加え、 3時間加熱還流した。次いで、酌酸を减圧留去し、水を加え、 CHC 1 ₃にて抽出した。 Mg SO ₄で乾燥させ、 CHC 1 ₃ を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CH C 1 ₃) にて精製し、（5) を 0.22 g得た（収率 43%)。この物質の分析値を下記する。 -

NMR (CDC 1 3) 6 :

8.3 (m,4 H) , 8.0- 7.6 (m,4H) 7.3 ( s - 1 i k e,4 H) 6.7 (s,2H) , 3.4 (d, J = 7，2H) 3.1 - 2.5 (m,6H) , 2.2- 1.5 (m,7H)

MAS S (F AB) : 520 (M+ 1 ) 実施例 6

4— [2— [4— (マレイミドー 1一ィル）メチルー 1—メチルピベリジニゥム一 1—ィル] ェチノレ] フエ二ノレ 1 0—メチノレアクリジ二ゥム一 9 一カルボキシレート（6) の合成：

実施例 5で得た（5) 0.22 gを 20m lのトルエンに溶かし、室温攪拌下、 0.30 gのトリフルォロメタンスルホン酸メチルを加え、室温で 1時間攪拌した後、一晩放置した。赤色析出物を濾取し、トルエンで洗浄後、風乾し、（6) を 30mg得た（収率 9.2%)。この物質の分析値を下記する。

NMR (DMS 0- d 6) δ ：

8.8-8.0 (m,8H) , 7.5 ( s - 1 i k e,4 H) , 6.8 ( s ,2 H) , 5.1 (s,3H) , 3.3 (s,3H) , 3.7-3.0 (m, 1 0 H) ,

2.0- 1.6 (m,5 H)

MAS S (FAB) : 550 (M+ 1 ) 実施例 7

4— (2—アミノエチルチオ）フエノール（7) の合成：

4—メルカプトフエノール 1.2 g、 2—ブロモェチルァミン塩酸塩 2.1 g および炭酸カリウム 1.4 gを 3 Om 1のエタノールに加え、 3時間室温で擾拌した。水を加え、エーテル抽出した。 Mg SO ₄にて乾燥させ、エーテルを减圧留去し、（7) を 1.7 g得た（収率定量的)。 - -

実施例 8

4一（2— N— B o cアミノエチルチオ）フヱノール（8) の合成：実施例 7で得た（7) 1.7 gを 30m 1のァセトニトリルに溶かし、無水 B o c 2.4 gを加え、 1時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、ピリジンを加え、減圧留去し、（8) を 2.7 g得た（収率定量的)。実施例 9

4一（2— N— B o cアミノエチルチオ）フエニル 9—ァクリジンカルボキシレート（9) の合成：

実施例 2で得た（2) 2.4 gを 3 Om 1のピリジンに溶かし、水冷擾拌下、実施例 8で得た（8) 2.7 gを少量ずつ添加した。室温で 2時間擾拌した後、ピリジンを減圧留去した。更に CHC 1 ₃を加え、減圧留去を 2回行なった。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃) にて単離精製し、（9) を 3.2 g得た（収率 68。/₀)。実施例 1 0

4 - (2—アミノエチルチオ）フエニル 9ーァクリジンカルボキシレ一ト（1 0) の合成：

実施例 9で得た（9) 1.9 gに、 2 Om 1の C F 3 CO ₂ Hを加え、室温で 3 0分攪拌した。 CF ₃ CO ₂ Hを減圧留去し、（1 0) を 1.4 g得た（収率定量的)。実施例 1 1

4— [2— (マレイミドー 1一ィル）ェチルチオ] フエニル 9—ァクリジンカルボキシレート（1 1) の合成：実施例 1 0で得た（1 0) 1.4 g、無水マレイン酸 1.0 gおよび酢酸ナトリウム 1.0 gを酢酸 2 Om l中に加え、 3時間加熱還流した。次いで酢酸を減圧留去し、水を加え CHC 1 ₃にて抽出した。 Mg S0₄で乾燥させ、 CHC 1 3を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃) にて精製し、（1 1) を 1.1 g得た（収率 63%)。この物質の分析値を下記する。

NMR (CDC 13) δ ：

8.3 (m,4 Η) , 8.0- 7.6 (m,4 H) , 7.3 ( s— 1 i k e,4 H) , 6.7 (s,2H) , 3.8 (t,J = 7,2Hz) , 3.2 ( t, J = 7,2H)

MAS S (FAB) : 455 (M+ 1 ) 実施例 1 2

4 - [[2— （マレイミドー 1一ィル）ェチル] メチノレスルホニゥム] フェニル 1 0—メチルァクリジニゥム _ 9—カルボキシレ一ト（1 2) の合成：

実施例 1 1で得た（1 1) 0.90 gを 20m lのトルエンに溶かし、室温携拌下、 1.0 gのトリフルォロメタンスルホン酸メチルを加え、室温で 1時間搛拌した後、一晩放置した。赤色析出物を濾取し、トルエンで洗浄後、風乾し、 (1 2) を 1.1 gを得た（収率 71%)。この物質の分析値を下記する。

NMR (DMS 0- d ₆) δ ：

9.0— 8.0 (m,8H) , 7.6 (d, J = 7,2 H) , 7.4 (d, J = 7,2 Η) , 6.7 (s，2H) , 5.1 ( s,3 Η) , 3.8 (t,J = 7,2H) , 3.7 ( s, 3 Η) , 3.2 ( t, J = 7,2Η)

MAS S (FAB) ： 467 (M+ 1 ) 実施例 1 3 - -

2— (2— N_B o c—アミノエトキシ）ェタノ一ル（1 3) の合成： 2—アミノエトキシエタノール 2.1 gを 3 Om 1 のァセトニトリルに溶かし、無水 B o c 4.8 gを加え、 1時間慷拌した。溶媒を減圧留去後、ピリジンを加え、減圧留去し、（1 3) を 3.7 g得た（収率定量的)。実施例 1 4

2— (2—トシノレオキシエトキシ）一N— B o cェチルァミン（14) の合成：

実施例 1 3で得た（1 3) 3.7 gを 50m lのピリジンに溶かし、氷冷攪拌下、 4.0 gのトシルク口リドを少量ずつ添加した。室温に戻し 2時間擾拌した。不溶物を濾去し、ピリジンを减圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト (溶離液： CHC 1 ₃) にて単離精製し、（14) を 5.5 g得た（収率 76%)。実施例 1 5

4 - [2— (2— N— B o cアミノエトキシ）エトキシ] フエニルベンジルエーテル（1 5) の合成：

p—ベンジルォキシフエノ一ノレ 2.0 gを 30 m 1の DMFに溶かし、 t— B uOK 1.2 gを加え、室温で 30分撹拌した後、実施例 14で得た（1 4) 3.9 gを加え、 3時間室温で «拌した。 DMFを減圧留去した後、エーテルに溶かし、希塩酸で 1回、水で 2回、飽和食塩水で 1回洗浄した。 Mg SO ₄ にて乾燥させた後、エーテルを減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃) にて精製し、（1 5) を 3.2 g得た（収率 83%)。実施例 1 6

4 - [2 - (2— N— B o cアミノエトキシ）エトキシ] フエノール（1 6) の合成： - - 実施例 1 5で得た（1 5) 3.0 gを 4 Om 1の酢酸に溶かし、 2.0 gのパラジウム黒を加え、水素雰囲気下、室温で 2時間攪拌した。パラジウムを濾去し、濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃ : MeOH=9 ： 1)にて単離精製し、（1 6) を 2.4 g得た（収率定量的）。実施例 1 7

4— [2 - ( 2— N— B o cアミノエトキシ）エトキシ] フエニル 9一ァクリジンカルボキシレ一ト（1 7) の合成：

実施例 2で得た（2) 2.4 gを 3 Om 1のピリジンに溶かし、水冷攪拌下、実施例 1 6で得た（16) 2.0 gを少量ずつ添加し、室温で 2時間擾拌した後、ピリジンを減圧留去した。更に CHC I ₃ を加え減圧留去を 2回行なった後、残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃) にて単離精製し、（1 7) を 2.1 g得た（収率 47%)。実施例 1 8

4— [2- (2—アミノエトキシ）エトキシ] フエニル 9—ァクリジンカルボキシレート（1 8) の合成：

実施例 1 7で得た（1 7) 2.1 gに 20m lの CF ₃ C0 ₂ Hを加え、室温で 30分橾拌した。 CF ₃ COHを减圧留去し、水を加え、 NaHC0₃にて中和し析出物を濾取した。濾取物をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 ₃ : Me OH=9 ： 1) にて単離精製し、（1 8) を 1.7 g得た（収率定量的)。実施例 1 9

4— [2 - [2— (マレイミドー 1—ィル）ェトキシ] ェトキシ] フエ二ル 9—ァクリジンカルボキシレート（1 9) の合成：

実施例 1 8で得た（1 8) 1.7 g、無水マレイン酸 1.2 gおよび酢酸ナト - - リウム 1.2 gを酢酸 4 Om l中に加え、 3時間加熱還流した。冷後、酢酸を減圧留去し、水を加え CHC 1 ₃にて抽出した。 Mg S0₄で乾燥させ、 CHC 1 ₃を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液： CHC 1 3) にて精製し、（1 9) を 0.8 1 g得た（収率 4 2%)。この物質の分析値を下記する。

NMR (CDC 1 ₃) 6 ：

8.3 (m,8 H) , 7.4- 7.0 (m,4 H) , 6.8 ( s , 2 Η) ， 4.2 (m， 2H) , 3.9 (m,2 H) , 3.8 ( s - 1 i k e,4 H)

MAS S (FAB) ： 483 (M+ 1 ) 実施例 20

4— [2— [2— (マレイミドー 1—ィル）ェトキシ] ェトキシ] フエニル 10—メチルアタリジニゥムー 9 _カルボキシレート（20) の合成：

実施例 1 9で得た（1 9) 0.8 1 gを 50m lのトルエンに溶かし、室温攪拌下、 0.60 gのトリフルォロメタンスルホン酸メチルを加え、室温で 1時間攪拌した後、一晚放置した。黄色析出物を濾取しトルエンで洗浄後風乾し、（2 0) を 0.39 g得た（収率 37%)。この物質の分析値を下記する。

NMR (DMS 0- d 6) δ ：

9.0-8.0 (m,8H) , 7.4 (d, J = 7,2Η) ， 7.1 (d, J = 7, 2 H) , 6.8 ( s,2H) , 5.1 ( s,3 H) , 4.2 (m, 2H) , 3.9 (m, 2H) , 3.8 ( s - 1 i k e ,4 H)

MAS S (F AB) : 497 (M+ 1 ) 実施例 2 1

4 - [2 - (マレイミド一 1—ィル）ェチル] フエニル 9—ァクリジンカルボキシレート（22) の合成

4 - (2—アミノエチル）フエニル 9—ァクリジンカルボキシレ一ト（2 1 )

0.7 1 gおよび無水マレイン酸 0.60 gと、酢酸ナトリウム 0.60 gとを酢酸 2 Om l中に加え、 3時間加熱還流した。冷後、酢酸を減圧留去し、水を加え、 CHC 1 ₃ にて抽出した。抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、 CHC 1 ₃ を减圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマ卜（溶離液： CH C 1 ₃) にて精製し、（22) を 0.1 4 g得た（収率 9.5%)。この物質の分析値を下記する。

NMR (CD₃ OD) 6 ：

8.2-7.6 (m,8H) , 7.4 ( s ,4 H) , 6.8 ( s ,2 Η) , 3.8 ( t, J = 8,2 H) , 3.0 ( t， J = 8,2 H)

MAS S (FAB) ： 423 (M+ 1 ) 実施例 22

4— [ 2 - (マレイミドー 1—イスレ）ェチノレ] フエ二ノレ 10—メチルァクリジニゥム _ 9—カルボキシレート（23) の合成：

(22)

(23) 上記マレイミド（22) 0.1 7 gを 20 m 1のトルエンに溶かした。この溶液に、室温、撹拌下、 0.1 0 gのトリフルォロメタンスルホン酸メチルを加え、室温で 1時間撹拌した後一晚放置した。放置後、析出する黄色析出物を濾取し、これをトルエンで洗浄した。これを風乾して、（23) を 0.1 2 g得た (収率 5 1 %)。この物質の分析値を下記する。

NMR (CDsOD) 6 ：

8.9-8.0 (m,8 Η) , 7.4 ( s,4 Η) , 6.8 ( s ,2 Η) , 5 1 ( s , 2Η) , 3.8 ( t, J =8,2Η) , 3.0 ( t, J = 8,2Η)

MAS S (FAB) ： 437 (M+) 実施例 23

抗ヒ卜へモグロビン抗体の標識：

(1 ) 0.1 M N a C 1 を含む、 0.1M 酢酸ソ一ダ緩衝液（pH4.5) 3 m 1中に、精製抗ヒトヘモグロビンゥサギポリクロ一ナル抗体 1 0mgを加え、この溶液に、ブタ胃液由来精製ペプシン粉末 0.4 gを添加溶解し、 37°Cで 4 8時間インキュベートしてゥサギ I g Gの F c部分を消化した。これを溶離液として 5mM EDTAを含む、 0.1 M リン酸ソ一ダ緩衝液（pH6) [以下 p H 6緩衝液と略す] とスーパ一デックス 200カラム（フアルマシア製）とを用いるゲル濾過により分画し、 pH6緩衝液 3111 1 中に（3 13 ') ₂ 5mgを含 - - む溶液を得た。

この溶液に、 2—メルカプトェチルァミン 24m gを添加し、 37¾：で24 時間インキュベートし、 F (a b') ₂ を F a b'に還元した。次いで、セフアデックス G 25カラム（フアルマシア製、溶離液： pH6緩衝液）によりゲル濾過し、 pH6緩衝液 3m 1中に F a b' 2 m gを含む溶液を得た。

この溶液の一部分を用い、 4,4'—ジチォピリジンが F a b'の SH基と定量的に反応した結果得られる 4—メルカプトピリジンの量を波長 324 nmで吸光度測定することにより SH基の定量を実施した。この結果、 F a b'l分子当たりの SH基は 1個であった。

(2) 次いで、 F a b' 0.5mgを含む pH6緩衝液 0.75m 1に、実施例 6で合成された化合物（ 6 ) 0.04 mgを含む p H 6緩衝液 0.5 m 1を加えた。すなわち、 F a b'と化合物（6) の結合反応のモル比が 1対 5となるように加え、 4°Cで 48時間インキュベートし、 F a b'を化合物（6) で標識し、反応後、セフアデックス G25カラム（フアルマシア製、溶離液 pH6緩衝液）によりゲル濾過し過剰に加えられた化合物（6) を分離して p H 6緩衝液 3m 1中に標識抗体 0.5 mgを得た（標識抗体 A)。これを、？ 31)'の£ 28oおよび化合物（6) の E 260 モル吸光係数より定量したところ、得られた標識抗体 A は F a b'と化合物（6) とが 1対 1のモル比で結合していた。

同様にして、 F a b' 0.5mgを含む pH6緩衝液 0.75 m 1に、実施例 1 2で合成された化合物（1 2) 0.04m gを含む pH 6緩衝液 0.5 m 1を加えて反応後ゲル濾過し、 PH6緩衝液 3m l中に標識抗体 0.5mgを得た（標識抗体 B)。

また同様にして、 F a b' 0.5mgを含むpH6緩衝液 0.75m lに、実施例 20で合成された化合物（20) 0.03 m gを含む p H 6緩衝液 0.5m l を加えて反応後ゲル濾過し、 p H 6緩衝液 3 m 1中に標識抗体 0.5 m gを得た (標識抗体 C)。 - - さらに同様にして、 F a b' 0.5mgを含む p H6緩衝液 0.75m lに、実施例 22で合成された化合物（23) 0.04mgを含む p H 6緩衝液 0.5m 1を加えて反応後ゲル濾過し、 p H6緩衝液 3m l中に標識抗体 0.5m gを得た（標識抗体 D)。

得られた標識抗体 B、標識抗体 Cおよび標識抗体 Dはいずれも、それぞれ F a b'と化合物（1 2)、 F a b'と化合物（20)、または、 F a b'と化合物（23) とが 1対 1のモル比で結合していた。実施例 24

標識抗体によるヒトヘモグロビンのアツセィ：

0.1 5M N a C 1を含む、 pH7の 0.05M リン酸緩衝液（以下 P B Sと略す） 0.1 m 1中に、精製抗ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体 5 μ gを含む液を調製した。この液をマイクロプレ一トの各ゥエルに 0.1 m 1ずつ分注し、 4 で一昼夜放置してこのモノクローナル抗体をゥエル內部表面に吸着させ固相化した。

この抗体固相化プレートを、ゥシ血清アルブミン l mgを含む PB S 0.1 m 1にてブロッキング処理した。別途、精製ヒトへモグロビンをそれぞれ 0、 0.2、 1、 5、 25および 1 25 μ g/m 1 となるように P B Sにて溶解しておき、これらのそれぞれ 0.1m lを前記マイクロプレートの各ゥエルに分注し、 4 tで一昼夜放置して試料中のヒトへモグロビンを固相化抗体に捕捉させた。次いで、各ゥエルを PBSで洗浄し、結合しなかったヒトヘモグロビンを分離後、実施例 23で作成した標識抗体 A 5 μ gをそれぞれ含む PB S 0.1 m l を各ゥエルに分注し、 4 °Cで一昼夜放置して反応させた。各ゥエルを PB で洗浄し、結合しなかった標識抗体 Aを分離後、 0.1 N— Na OH 0.05m l および 0.5%H₂O₂ 0.04 m lを加えることで発光させ、化学発光測定用マイクロプレートリーダ一の一種であるルミナス CT— 9000 D (ダイアヤトロン製）により測定した。発光量は 2秒間の積算値とした。

同様にして、標識抗体 B、標識抗体 Cおよび標識抗体 Dによるヒトへモグロビンのァッセィを実施した。以上の結果をまとめて次の表 1に示す。

ヒトへモグロ化学発光量（カウント）

ビン濃度

( // g / m 1 ) 標識抗体 A 標識抗体 B 標識抗体 C 標識抗体 D

0 3 8 5 2 3 0 8 9 1 6 5 5 2 0 3 7

0 . 2 3 9 4 1 0 3 3 3 0 1 1 8 3 8 9 1 9 5 2 7

1 9 9 7 8 4 8 8 1 3 1 4 9 1 3 6 5 2 4 1 0

5 2 5 5 6 9 1 2 2 9 7 4 9 1 4 4 8 5 6 1 4 9 3 9 7

2 5 7 2 7 5 0 0 7 0 7 1 3 6 5 0 1 8 9 2 4 4 3 5 9 9 1 2 5 2 5 1 1 3 7 7 2 2 8 1 5 0 1 1 7 3 6 8 7 6 1 3 5 4 8 5 8

表 1から、ヒトヘモグロビン濃度に応じて、標識抗体 A、標識抗体 B、標識抗体 Cおよび標識抗体 Dに由来する化学発光量は、いずれも増大し、ヒトへモグロビンの定量に有用であることが明らかである。産業上の利用可能性

本発明の化合物（I) または（II) による被測定物質の標識は、 S H基とマレイミド基の安定な結合であって、穏和な条件下で行われるものである。そして、穏和な条件で標識が行われる結果、例えば標識された抗体等の抗原認識部位は損なわれることなく、また、ァクリジンエステルが発光して消耗することや、分解失活することもない。

また、本発明の標識法では、アミノ酸や蛋白質中では、比較的少ない基である S H基を使用するために、被測定物質に対し特異的な標識をすることができ、ひいては被測定物質と化学発光物質と一定の結合モル比での結合が得られる等の利点がある。

例えば、本発明の標識方法を抗体の F a b 'に適用した場合、 F a b 'の S H基は 1個であるため、本発明の化合物（I) (または中間体（II) ) を F a b 'に比べ、やや過剰に加えて F a b 'を全て標識した場合でも、高々、モル比 1 ： 1の標識となるにすぎず、更に、この結合に関する S H基は F a b 'の生物活性部位とは無関係であるため、 F a b 'の抗原認識部位が損なわれることはない。

従って、化学発光量から、被測定物質の定性や定量が容易にでき、とりわけ、微少量の検出が必要な医薬品の体内動態の追跡や診断薬等の分野に応用することができる。

Claims

請求の範囲

1. 一般式（I)

(式中、 Aは次の基、

一 (CH₂) mi—

または、

[ここで、 Qは基一 S + RX-— 、基一 N⁺RR i X一 (ここで、 R !は炭素数 1から 6のアルキル基またはァリール基を示す）、基

— N+ CH X—

、ノ

(ここで、 R₂および R₃は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) k- (k は 1〜3の数を意味する）を示す）または— O (CH₂ CH₂0) I — ( 1は1〜 3の数）を示し、 m iは 1〜6の数を、 πΐ 2は 0〜2の数を、 nは 1〜2の数を意味する]、 Rは炭素数 1〜6のアルキルまたはァリール基を、 X—はァニオンを示す }

で表されるァクリジン化合物を含有する SH基標識用試薬。

2.一般式 (Π)

{式中、 A'は次の基、

一（CH2) mi - または、

[ここで、 Q'は基一 S— 、基一 NR!— (ここで、 Riは炭素数 1から 6のァルキル基を示す）、基

, ^R2

一 N ヽ CH—

ノ

(ここで、 R ₂および R ₃は同一または異なって、それぞれ基— （CH₂) _k- (k は 1〜3の数を意味する）を示す）または一O (CH₂ CH₂0) 1 - ( 1は 1〜 3の数）を示し、 m₂および nは前記した意味を有する] を示す）で表されるァクリジン化合物を含有する SH基標識用試薬。

3. 一般式（na)

(式中、 n は 1〜6の整数を意味する）

で表されるァクリジン化合物に次の式（ΠΙ)

R - X (III)

(式中、 Rは炭素数 1〜 6のアルキルまたはァリ一ル基を、 Xは容易にァニオンとなる脱離基を示す）

で表されるアルキル化剤を作用させることを特徴とする、次の式（la)

(式中、 X はァニオンを示し、 Rおよびは前記した意味を有する）で表されるァクリジン化合物の製造法。

4 . 次の式（IV)

(式中、 m iは 1〜6の整数を意味する）

で表される ω—アミノアルキレンフエニル 9一アタリジンカルボキシレ一トと無水マレイン酸とを塩基の存在下反応させることを特徴とする、次の式（Ila)

(式中、 m !は前記した意味を有する）

で表されるァクリジン化合物の製造法。

5 . 一般式（lb)

[式中、 Qは基一 S + RX—— 、基 — N+RR i X—— （ここで、 R iは炭素数から 6のアルキル基またはァリール基を示す）、基 X

(ここで、 R₂および R₃は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) k- (k は 1〜3の数を意味する）を示す）または基一 O (CH ₂ CH2〇） . - ( 1は 1〜3の数）を示し、 Rは炭素数 1〜6のアルキル基またはァリ一ル基を、 X—はァニオンを示し、 m2は 0〜2の数を、 nは 1〜2の数を意味する] で表されるアタリジン化合物。

6. 上記一般式（lb) で表されるァクリジン化合物の中間体である下記一般式 (lib)

(lib) [式中、 Q'は基一 S—、基一NR,— (ここで、 R 1は炭素数 1から 6のアルキル基を示す）、

, 1¾、

- N CH—

、ノ

(ここで、 R₂および R: (は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) _k- (k は 1〜 3の数を意味する）を示す）または基 —O (CH ₂ CH ₂ O) I - ( 1は 1〜3の数）を示し、 m₂は 0〜2の数、 nは 1〜2の数を意味する] で表されるァクリジン化合物。

7. 次の式（Ub)

(lib)

[式中、 Q'は基 S NR i - (ここで、 R iは炭素数 1から 6のアルキル基を示す）、 R₂、

一 N CH一

、ノ

(ここで、 R₂および R₃は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) k - (k は 1〜3の数を意味する）を示す）または基 — O (CH₂ CH₂0) I - ( 1は 1〜3の数）を示し、 m₂は 0〜2の数、 nは 1〜2の数を意味する] で表されるァクリジン化合物に、次の式（III)

R— X (ΙΠ)

(式中、 Rは炭素数 1〜6のアルキル基またはァリール基を、 Xは容易にァニォンとなる脱離基を示す）

で表されるアルキル化剤を作用させることを特徴とする、次の式（lb)

[式中、 Qは基一 S + RX—— 、一 N+RR i— (ここで、 Riは炭素数 1から 6 のアルキル基またはァリ一ル基を示す）、

- ？ N+ へ CH X

、ノ

(ここで、 R₂および R 3は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) k- (k は 1〜3の数を意味する）を示す）または基一 O (CH₂ CH₂0) 1 - ( 1は 1〜3の数）を示し、 R、 X、 m₂および nは前記した意味を有する] で表されるアタリジン化合物の製法。

8. 次の式（VI) (VI)

(式中、は脱離基を示し、 ₁«₂は0〜2の数を示す）

で表される脱離基を有するフエノール化合物と、次の式（VII)

(式中、 Υ 2は脱離基を示す）

で表される 9ーァクリジンカルボン酸誘導体とを反応させて、次の式（νπΐ)

(式中、 Yiおよび m₂は前記した意味を有する）

で表される化合物とし、次いでこの化合物に次の式（IX)

H - Q〗—(CH₂)frN 2 (IX)

[式中、 Q iは基一 NR!— （ここで、は炭素数 1から 6のアルキル基を示す）または ,Rへ

- N CH—

、ノ

(ここで、 R₂および R 3は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) _k- (k は 1〜3の数を意味する）を示す）を示し、 R _aはそれぞれ水素原子またはアミノ保護基を示し、 nは 1〜2の数を意味する]

で表される末端に必要に応じ保護基で保護した一級アミノ基を有しかつ他端に一級または二級のアミノ基を有するポリアミンとを適当な塩基のもとで反応させ、次の式（X)

(式中、 Qi、 R_a、 m₂および nは前記した意味を有する）

で表される 9—アタリジンエステルを製造し、末端の一級ァミノ基の保護基が存在する場合は、その保護基をはずした後、無水マレイン酸を作用させることを特徴とする次の式（lib')

(式中、 Qi、 m₂および nは前記した意味を有する）

で表されるアタリジン化合物の製法。

9. 次の式（XI)

[式中、 Q 2は基一 S— または基一 0 (CH₂ CH 20) i— ( 1は 1〜3の数）を、 R ,はそれぞれ水素原子またはァミノ保護基を示し、 m₂は 0〜2の数、 nは 1〜2の数を意味する]

で表される末端に保護基で保護された一級アミノ基がついたチォェ一テルまたはポリエーテル構造を有する基を持つフエノーノレ誘導体と、次の式（νπ)

(式中、 Υ 2は脱離基を示す）

で表される 9ーァクリジンカルボン酸誘導体とを反応させて次の式（ΧΠ) Q2 ( 、C、H ，₂)ノr irl N(Rjり_; 2

(XII)

(式中、 Q₂、 R_a、 m 2および nは前記した意味を有する）

で表されるァクリジンエステルとし、次いで末端にあるァミノ基の脱保護を行つた後、無水マレイン酸を作用させることを特徴とする次の式（lib")

(式中、 Q₂、 m₂および nは前記した意味を有する）

で表されるァクリジン化合物の製法。

10. 一般式（I)

(i)

{式中、 Aは次の基、

一 (CH₂) mi—

または、

- (CH₂) m2-Q- (CH₂) n- [ここで、 Qは基一 S + RX—— 、基 N⁺RR i X - (ここで、 R iは炭素数から 6のアルキル基またはァリール基を示す）、基

(ここで、 R ₂および R ₃は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) _k- (k は 1 3の数を意味する X）を示す）または— O (CH₂ CH₂0) 1 - ( 1は 1 3の数）を示し、 111 1は1 6の数を、 111 2は0 2の数を、 nは 1 2の数を意味する]、 Rは炭素数 1 6のアルキルまたはァリ一ル基を、 X—はァニオンを示す）

で表されるァクリジン化合物を、被測定物質中の SH基と反応させることを特徴とする被測定物質の標識法。

1 1. 一般式（Π)

{式中、 A'は次の基、

- (CH₂) mi - または、

一 (CH₂) nu-Q'- (CH₂) _n—

[ここで、 Q'は基一 S— 、基一 NRi— (, で、は炭素数 1から 6のァルキル基を示す）、基 —

CH―

、ノ

(ここで、 R₂および R 3は同一または異なって、それぞれ基一（CH₂) _k- (k は 1〜3の数を意味する）を示す）または— O (CH₂ CH₂0) I - ( 1は 1〜 3の数）を示し、 rrn、 m ₂および nは前記した意味を有する] を示す）で表されるァクリジン化合物を、被測定物質中の SH基と反応させることを特徴とする被測定物質の前標識法。