ULTRAMIKROEMULSIONEN AUS SPONTAN DISPERGIERBAREN KONZENTRATEN ENTHALTEND ANTITUMORAL, ANTIVIRAL UND ANTIPARASITÄR WIRKSAME ESTER VON PENTACYCLISCHEN TRITERPE- ULTRAMICROEMULSIONS FROM SPONTANEOUSLY DISPERSIBLE CONCENTRATES CONTAINING ANTITUMORAL, ANTIVIRAL AND ANTIPARASITAR EFFECTIVE ESTERS OF PENTACYCLIC TRITERPE-
NENNEN
EINLEITUNGINTRODUCTION
Die vorliegende Erfind ung betrifft Ultramikroemulsionen aus spontan disper- gierbaren Konzentraten mit Estern von pentacyclischen Triterpenverbindun- gen, neue Triterpenester, Verfahren zu ihrer Herstellung u nd Aufbereitung in geeignete pharmazeutische Darreichungsformen, sowie die Verwendung der Ester-haltigen, spontan dispergierbaren Konzentrate und Mikroemulsionen als Arzneimittel mit Wirksamkeit gegen Tumore, Ekzeme, Psoriasis, virale und parasitäre Infektionen , sowie zur Vorbeugung gegen Tumorbildung im Wege der gesteigerten Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Regulatoren .The present invention relates to ultramicroemulsions from spontaneously dispersible concentrates with esters of pentacyclic triterpene compounds, new triterpene esters, processes for their preparation and processing into suitable pharmaceutical dosage forms, and the use of the ester-containing, spontaneously dispersible concentrates and microemulsions as medicaments with effectiveness against tumors, eczema, psoriasis, viral and parasitic infections, as well as for the prevention of tumor formation by increasing the absorption of exogenous activators, modulators and regulators.
Die Ester der ausgewählten, pflanzlichen Grundstoffe und ihrer Transformationsprod ukte haben überraschenderweise eine seh r gute antitumorale, anti- virale und/oder viruzide, sowie antiparasitäre Wirkung , und sie eig nen sich auch zur Behandlung von Ekzemen und Psoriasis. I n vorbeugender und The- rapie-unterstützender Hinsicht sind sie bedeutungsvoll, wei l sie die Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Reg ulatoren erhöhen und dadurch das metabolische wie auch das immunitäre Leistungsvermögen anheben.The esters of the selected plant-based raw materials and their transformation products surprisingly have a very good antitumor, antiviral and / or virucidal and antiparasitic activity, and they are also suitable for the treatment of eczema and psoriasis. In preventive and therapy-supporting respects, they are important because they increase the uptake of exogenous activators, modulators and regulators and thereby increase the metabolic as well as the immune performance.
Die therapeutischen und prophylaktischen Eigenschaften derartiger Ester treten dann verstärkt auf, wenn sie in spontan dispergierbare MARIGENOL®- Konzentrate eingearbeitet und anschliessend mit destilliertem Wasser oder 5%-iger Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt worden sind , wobei sich thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergeben, welche sehr kleine, globuläre Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm enthalten.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGThe therapeutic and prophylactic properties of such esters are more pronounced when they are incorporated into spontaneously dispersible MARIGENOL® concentrates and then diluted with distilled water or 5% glucose solution or physiological saline (Ringer's solution), resulting in thermodynamically stable ultramicroemulsions, which contain very small, globular micelles with a hydrodynamic radius of 2.2 to 3.0 nm. DESCRIPTION OF THE INVENTION
Die erfindungsgemässen Ester von ausgewählten, pflanzlichen Grundstoffen mit pentacyclischer Triterpenstruktur haben die allgemeinen Formeln (I) bis (XI) =The esters according to the invention of selected, vegetable raw materials with a pentacyclic triterpene structure have the general formulas (I) to (XI) =
BETULIN [Lup-20(29)-en-3,28-diol], iup-20(30)-en-3ß,28-diol; Betulinol. Merck- BETULIN [Lup-20 (29) -en-3,28-diol], iup-20 (30) -en-3ß, 28-diol; Betulinol. Merck
Index 11.1212, Sigma B 9757, Aldrich 12,376-5.Index 11.1212, Sigma B 9757, Aldrich 12.376-5.
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta ü, 506 (1936)L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta ü, 506 (1936)
ALLOBETULINALLOBETULIN
BETULINSÄURE; Beil: 10(3), 1059; Aldrich 85,505-7
Betulinic acid; Hatchet: 10 (3), 1059; Aldrich 85.505-7
BETULINSAURE-METHYLESTERBETULINE ACID METHYLESTER
ENOXOLON (3-Hydroxy-11-oxoolean-12-en-29-oic acid); 18ß-Glycyrrhetinsäure; Uralenic acid; Merck-Index 11.3543 L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 26., 2143, 2278 (1943)ENOXOLON (3-hydroxy-11-oxoolean-12-en-29-oic acid); 18β-glycyrrhetic acid; Uralenic acid; Merck Index 11.3543 L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 26., 2143, 2278 (1943)
ENOXOLON-METHYLESTER
OLEA
ryophyllin.ENOXOLON METHYLESTER OLEA ryophylline.
Merck-Index 11.6787; Aldrich 30,170-1Merck Index 11.6787; Aldrich 30, 170-1
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta ü, 114 (1936)L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta ü, 114 (1936)
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 29_, 210 (1946)L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 29_, 210 (1946)
OLEANOLSÄURE-METHYLESTEROLEANOLIC ACID METHYLESTER
LUPEOL (Fagasterol); Merck-Index 11.5478
LUPEOL (fagasterol); Merck index 11.5478
URSOLSÄURE (3ß-Hydroxyurs-12-en-28 oic acid)URSOLIC ACID (3ß-Hydroxyurs-12-en-28 oic acid)
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta, 28, 199 (1945), Beil. 10(2), 202; Merck-Index 11.9802L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta, 28, 199 (1945), Beil. 10 (2), 202; Merck index 11.9802
URSOLSÄURE-METHYLESTER wobei in den Formeln (I) bis (XI) R1 eine C3.3ι-Alkyl-, eine C3-3ι-Alkenyl-, eine C-ι -23-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe ist.URSOLIC ACID METHYLESTER where in the formulas (I) to (XI) R1 a C 3 . 3 ι-alkyl, a C 3-3 ι-alkenyl, a C-ι - 23 -Alkapolyen or a retinoyl group.
Die Verbindungen der Formeln (I) bis (XI) lassen sich allgemein nach folgenden, an sich bekannten Verfahren, herstellen: a) Umsetzung einer Verbindung der Formel (XII) :The compounds of the formulas (I) to (XI) can generally be prepared by the following processes which are known per se: a) Reaction of a compound of the formula (XII):
R— COOH (XII) worin R2 für eine C3-3ι-Alkyl-, eine C3.3ι-Alkenyl-, eine Cι -23-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe steht, mit 1,1 '-Carbonyldiimidazol oder mit N,N'-Dicyclo- hexylcarbodiimid in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, bei 0 bis 70°C, unter Schutzgaszuleitung und Zusatz einer katalytischen Menge eines Alkoholates, und anschliessende Alkoholyse der gebildeten Imidazole mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (XI).R — COOH (XII) in which R2 is a C 3-3 ι-alkyl, a C 3 . 3 -alkenyl, a -23 -Alkapolyen- or a retinoyl group, with 1,1 '-carbonyldiimidazole or with N, N'-dicyclohexylcarbodiimide in an indifferent solvent, such as toluene or tetrahydrofuran, at 0 to 70 ° C, with the supply of protective gas and the addition of a catalytic amount of an alcoholate, and subsequent alcoholysis of the imidazoles formed with a compound of the formulas (I) to (XI).
b) Bildung des Chlorids einer Verbindung der Formel (XII) : R— COOH (XII) worin R2 für eine C3.3ι-Alkyl-, eine C3.31-Alkenyl- oder eine C17.23-Alka- polyengruppe steht, mit einem Chlorierungsmittel, wie z.B. Thionylchlorid
oder Oxalylchlorid, und anschliessende Umsetzung mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (X) bei einer Temperatur von 0°C bis 60°C, unter Schutzgaszuleitung, in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, und in Gegenwart eines Katalysators, wie z.B. Dimethylformamid und/oder p-Dimethylaminopyridin.b) formation of the chloride of a compound of the formula (XII): R - COOH (XII) in which R 2 is a C 3 . 3 ι-alkyl, a C 3 . 31 alkenyl or a C 17 . 2 3-Alka-polyengruppe stands, with a chlorinating agent such as thionyl chloride or oxalyl chloride, and then reacting with a compound of the formulas (I) to (X) at a temperature from 0 ° C. to 60 ° C., with the supply of protective gas, in an inert solvent, such as toluene or tetrahydrofuran, and in the presence of a catalyst, such as dimethylformamide and / or p-dimethylaminopyridine.
c) Bildung des Allobetulins durch Partialsynthese aus Betulin:c) Formation of the allobetulin by partial synthesis from betulin:
und darauf Acylierung an Position 0-C(3) mit einer aktivierten, gesättigten C5.31- oder einer ungesättigten C8-3i-Carbonsäure: and then acylation at position 0-C (3) with an activated, saturated C5. 31 - or an unsaturated C 8 - 3 i-carboxylic acid:
und anschliessende Aufarbeitung wie nachstehend im Einzelnen beschrieben.
and subsequent workup as described in detail below.
) Bildung des Betulinsäure-Methylesters laut Formel (IV):) Formation of the betulinic acid methyl ester according to formula (IV):
und dann Umsetzung an 0-C(3) durch Reaktion mit dem Chlorid einer höheren Carbonsäure, samt anschliessender Aufarbeitung wie nachstehend im Einzelnen beschrieben. In entsprechender Weise kann auch der Methylester der 18ß-Glycyrrhetin- säure: and then reaction at 0-C (3) by reaction with the chloride of a higher carboxylic acid, including subsequent work-up as described in detail below. In a corresponding manner, the methyl ester of 18β-glycyrrhetinic acid can:
bzw. der Oleanolsäure: or the oleanolic acid:
(VIII) bzw. der Ursolsäure:
an 0-C(3) acyliert werden. (VIII) or ursolic acid: be acylated at 0-C (3).
Die Ester der ausgewählten, pentacyclischen Triterpenverbindungen der Formeln (I) bis (XI) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumo- rale, antivirale, viruzide und antiparasitäre Wirkung, und sie eignen sich auch zur Bekämpfung von Ekzemen, von Psoriasis, sowie von metabolischen und von immunitären Störungen, vornehmlich dann, wenn sie gemass der vorliegenden Erfindung in spontan dispergierbare MARIGENOL®-Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit destilliertem Wasser, mit 5%-iger Glu- coselösung oder mit Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile Oel-in- Wasser Ultramikroemulsionen ergeben.The esters of the selected pentacyclic triterpene compounds of the formulas (I) to (XI) surprisingly have an excellent antitumor, antiviral, virucidal and antiparasitic activity, and they are also suitable for combating eczema, psoriasis, as well as metabolic and immune Disruptions, especially when they have been incorporated into spontaneously dispersible MARIGENOL® concentrates according to the present invention, which result in thermodynamically stable oil-in-water ultramicroemulsions diluted with distilled water, with 5% glucose solution or with Ringer's solution.
Derartige Ultramikroemulsionen weisen kugelförmige Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm auf. [Messungen mit QLS = quasielastischer, dynamischer Lichtstreuung wurden an der E.T.H., Zürich, Institut für Polymere (Prof.Dr. Pier-Luigi LUISI und Prof.Dr. Peter SCHURTENBER- GER) durchgeführt]. Zur angewandten Methodik vgl.:Such ultramicroemulsions have spherical micelles with a hydrodynamic radius of 2.2 to 3.0 nm. [Measurements with QLS = quasi-elastic, dynamic light scattering were carried out at E.T.H., Zurich, Institute for Polymers (Prof. Dr. Pier-Luigi LUISI and Prof. Dr. Peter SCHURTENBERGER). For the methodology used, see:
P. Schurtenberger, R. Scartazzini, P.-L. Luisi, Rheol.Acta 28, 372 (1989). P. Schurtenberger, R. Scartazzini, L.J. Magid, M.E. Leser, P.-L. Luisi, J.Phys. Chem.94, 3695 (1990).P. Schurtenberger, R. Scartazzini, P.-L. Luisi, Rheol. Acta 28, 372 (1989). P. Schurtenberger, R. Scartazzini, L.J. Magid, M.E. Reader, P.-L. Luisi, J. Phys. Chem. 94, 3695 (1990).
P.-L. Luisi, R. Scartazzini, G. Haering, P. Schurtenberger, Colloid Polym.Sci. 268, 356 (1990) : Organogels from water-in-oil microemulsions. T. Gisler et al.: "Mode-selective dynamic light scattering: theory versus ex- perimental realization". Applied Optics/Vol.34, No. 18.20 June 1995.P.-L. Luisi, R. Scartazzini, G. Haering, P. Schurtenberger, Colloid Polym. Sci. 268, 356 (1990): Organogels from water-in-oil microemulsions. T. Gisler et al .: "Mode-selective dynamic light scattering: theory versus experimental realization". Applied Optics / Vol.34, No. June 18, 1995.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach vorab spontan dispergierbare Konzentrate mit den antitumoral, antiviral, viruzid oder antiparasitär wirkenden Estern der Verbindungen (I) bis (XI), welche auch die Apoptosis von Tumor- oder Wirtzellen einleiten können. Die bezeichneten Ester sind nahezu wasserunlösliche und hoch agglomerierte Verbindungen. Damit solche Verbindungen aber durch die Membranbarriere der Tumor- oder Wirtzellen,
bzw. die Proteinhü lle von Vi ren oder Parasiten diffundieren und im Innern derThe present invention accordingly relates to spontaneously dispersible concentrates in advance with the antitumoral, antiviral, virucidal or antiparasitic esters of the compounds (I) to (XI), which can also induce the apoptosis of tumor or host cells. The designated esters are almost water-insoluble and highly agglomerated compounds. So that such connections pass through the membrane barrier of the tumor or host cells, or the protein sheath of veins or parasites diffuse and inside the
Zelle, bzw. des Capsids wirksam werden kön nen, müssen sie vorerst i n geeigneter Weise im wässerigen Medium solubilisiert werden . Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen Oel-in-Wasser Ultramikroemulsionen, mithilfe von besonders ausgewählten und als System zusammengefügten Co- tensiden oder Lösungsverm ittlern einerseits und geeig neten Tensiden anderseits geli ngt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der therapeutisch und prophylaktisch wirksamen Ester zu erzielen.Cell, or the capsid can be effective, they must first be suitably solubilized in the aqueous medium. Through the formation of thermodynamically stable oil-in-water ultramicroemulsions, with the help of specially selected and combined as a system surfactants or solubilizers on the one hand and suitable surfactants on the other hand, it is possible to achieve an optimal degree of solubilization of the therapeutically and prophylactically active esters.
Alle experimentel len Beobachtungen an dergestalt ausgebi ldeten Ultramikroemulsionen lassen sich einheitl ich durch die An nahme deuten, dass die ausgewählten Tenside und Cotenside, als ausgewogene Formulierung genommen, in der wässerigen Phase organisierte Aggregate, sog . Mizellen bilden. Diese besitzen meh r oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynam ischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm. Die Tenside u nd Hyd rotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusseren, wässerigen Phase u nd der inneren , öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die Ester der Formeln (I) bis (XI), gelöst im biotensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung d ieser beiden Phasen unterbleibt, also keine Marangoni- Effekte auftreten . In der öligen, i nneren Phase sind d ie Moleküle der bezeichneten Esterverbindu ngen gelöst und liegen im mizel laren Kern in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor, was einen ganz entscheidenden Unterschied zu blossen Makro-Emulsionen (z.B. Liposomen) ausmacht. Die Mizellen der Ester-haltigen inneren Phase der erfind ungsgemässen Ultramikroemulsionen sind dem nach an ihrer Oberfläche, d .h . an ihrer Grenzsch icht mit einem Tensidmantel gesch ützt, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran oder die Proteinhülle ins I nnere der Tumor- oder Wirtzelle zu diffundieren. Die Diffusion d urch die Plasmamembran von abartigen Zellen erfolgt aussch liessl ich aufgrund thermischer Moleku larbeweg ungen ; die frak- talen Verhältnisse an der Zel lmembran kommen ihr dabei entgegen . Es lässt sich aufzeigen, dass die Geschwindig keit des Diffusionsvorganges, bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Zielzelle bestimmt wird :All experimental observations on ultramicroemulsions designed in this way can be uniformly interpreted by the assumption that the selected surfactants and cosurfactants, taken as a balanced formulation, aggregates organized in the aqueous phase, so-called Form micelles. These have more or less spherical shape, with a hydrodynamic radius of 2.2 to 3.0 nm. The surfactants and hydrotropes (cosurfactants) allow between the outer, aqueous phase and the inner, oily phase of the microemulsion [containing the esters of Formulas (I) to (XI), dissolved in the biosurfactant solubilizer], a boundary layer is formed, as a result of which the mixing of these two phases does not occur, that is to say no Marangoni effects occur. The molecules of the designated ester compounds are dissolved in the oily inner phase and are present in the micellar core in monomeric or in oligomeric agglomerated form, which makes a very decisive difference to mere macro-emulsions (e.g. liposomes). The micelles of the ester-containing inner phase of the ultramicroemulsions according to the invention are accordingly on their surface, i.e. protected at its boundary layer with a surfactant coat, which it repairs, easily diffusing through the cell membrane or the protein envelope into the interior of the tumor or host cell. The diffusion through the plasma membrane of abnormal cells occurs exclusively due to thermal molecular movements; the fractal conditions on the cell membrane accommodate her. It can be shown that the speed of the diffusion process or the strength of the active substance transport is determined by the membrane of the target cell:
1 . vom Konzentrationsunterschied zwischen dem intrazellulären u nd dem interzellulären Bereich1 . the difference in concentration between the intracellular and the intercellular area
2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wi rkstoffmoleküls oder2. of the particle radius of the diffusing Wi rmstoffkoleks or
Wirkstoff SystemsActive ingredient systems
3. von der Viskosität der diffund ierenden wässerigen Lösung3. the viscosity of the diffusing aqueous solution
(Emulsion)(Emulsion)
4. von der Temperatur.
Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, hat eine globuläre "Mizelle" mit ei nem hydrodynamischen Radius von einem Centimeter ein Volumen von 4,189 cm3 und eine Phasenoberfläche von 1 2,564 cm2. Demgegenüber weisen 1Q18 Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von je nur 10-6 cm (10 nm), welche zusammen das g leiche Vol umen von 4,1 87 cm3 ausmachen , schon ei ne Gesamt-Phasenoberfläche von 1 '256,4 m2 auf.4. on the temperature. As can be seen from the table below, a globular "micelle" with a hydrodynamic radius of one centimeter has a volume of 4.189 cm 3 and a phase surface area of 1 2.564 cm2. In contrast, 1Q18 micelles with a hydrodynamic radius of only 10-6 cm (10 nm) each, which together make up the same volume of 4.1 87 cm 3 , already have a total phase surface of 1 '256.4 m2 .
MIZELLEN: VERHÄLTNIS VOLUMEN ZU GESAMTOBERFLÄ CHEMICELLES: RELATIONSHIP VOLUME TO TOTAL SURFACE
Kugelvol umen = — π r3 3Spherical volume = - π r3 3
Kugeloberfläche = 4 π r2Spherical surface = 4 π r2
Fazit: Durch die enorm grosse Phasenoberfläche, welche die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 1 bis 5 nm in Ultramikroemulsionen ausbilden, wird zusätzlich zu deren gesteigertem Diffusionsvermögen die rheologische Verteilung (Spreitung = "spreading ") und somit die Bioverfügbarkeit und Bioreaktivität der Wirkstoffe, welche in der inneren Phase der Mizellen in monomer oder oligomer agglomerierter Form vorliegen, ebenfalls stark verbessert, weil keine Marangoni-Effekte auftreten. Das kann eine beträchtliche Ermässigung der kritischen Dosierung erlauben und damit unerwünschte Nebenwirkungen ganz vermeiden oder wenigstens verringern helfen.Conclusion: Due to the enormously large phase surface, which the micelles form with a hydrodynamic radius of 1 to 5 nm in ultramicroemulsions, in addition to their increased diffusion capacity, the rheological distribution (spreading) and thus the bioavailability and bioreactivity of the active substances, which are present in the inner phase of the micelles in monomeric or oligomeric agglomerated form, also greatly improved because there are no Marangoni effects. This can allow a significant reduction in the critical dosage and thus completely avoid or at least reduce unwanted side effects.
Die " Packungsdichte" eines spontan disperg ierbaren, stabilen MARIGENOL®- Konzentrates nimmt i n exponentieller Fu nktion mit der kleiner werdenden Teilcheng rösse der Mizellen zu . Entscheidend sind die richtige Ausbildung
der inneren Phase, i hr ausgewogenes Verhältnis zum Gesamtkonzentrat und die Auswah l der je dazu passenden Tenside.The "packing density" of a spontaneously dispersible, stable MARIGENOL® concentrate increases exponentially with the smaller particle size of the micelles. The right training is crucial the inner phase, its balanced ratio to the total concentrate and the selection of the appropriate surfactants.
ZUSAMMENS ETZUNG der MARIGENOL®-KONZENTRATE Die erfindungsgemäss spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten : 0,1 bis 1 0 Gewichts-% einzelner Ester der Formeln (I) bis (XI), bzw. Kombinationen solcher Ester, sowieCOMPOSITION OF MARIGENOL® CONCENTRATES The concentrates which are spontaneously dispersible according to the invention contain: 0.1 to 10% by weight of individual esters of the formulas (I) to (XI), or combinations of such esters, and
0 bis 5 Gewichts-% einer synergistischen, pharmazeutischen oder kosmetischen Wirksu bstanz, wie i n der Patentschrift CH 683*426 (U.S . 08/179,729, erteilt 03. September 1996) im Einzelnen aufgezählt,0 to 5% by weight of a synergistic, pharmaceutical or cosmetic active substance, as enumerated in detail in patent specification CH 683 * 426 (US. 08 / 179,729, issued September 3, 1996),
1 bis 25 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträgl ichen Lösu ngsmittels oder Lösu ngsmittelgem isches,1 to 25% by weight of a pharmaceutically acceptable solvent or solvent mixture serving as a hydrotrope or co-emulsifier,
5 bis 90 Gewichts-% ei nes pharmaverträglichen Tensides oder Tensidge- misches, bis zu 1 0 Gewichts-% ei nes Vitamins oder Provitamins, bis zu 10 Gewichts-% eines Stabil isators, Radi kalfängers, biolog ischen Vektors oder Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe u nd/oder Verdünnungsmittel.5 to 90% by weight of a pharmaceutically compatible surfactant or surfactant mixture, up to 10% by weight of a vitamin or provitamin, up to 10% by weight of a stabilizer, scavenger, biological vector or penetration enhancer and carriers and the like / or diluent.
Wegen ihrer ausgeprägten Schutzwirkung auf die Wirtzelle und ih rer unmittelbaren Aktivität gegen Viren und Parasiten lassen sich zu r therapeutischen Unterstützung die nachstehend bezeichneten, in der Patentschrift CH 2239-95 besonders genannten , synergistisch wirksamen Esterverbindungen i n die erfind ungsgemässen , spontan d isperg ierbaren Konzentrate m it einarbeiten : trän s-2-B ute nsäu re-3ß-hydroxy-5 -cholestanylesterBecause of their pronounced protective action on the host cell and their direct activity against viruses and parasites, the synergistically active ester compounds described below, mentioned particularly in patent specification CH 2239-95, can be used for therapeutic support in the spontaneously dispersible concentrates according to the invention Incorporate it: Trän s-2-B ute nsäu re-3ß-hydroxy-5-cholestanylester
(Cholestanyl-Crotonat) lsovaleriansäure-3ß-hydroxy-5α-cholestanyl-Ester(Cholestanyl crotonate) isovaleric acid 3β-hydroxy-5α-cholestanyl ester
(Cholestanyl-iso-Valerat)(Cholestanyl iso-valerate)
1 0-Undecensäure-3ß-hydroxy-5 -cholestanyl -Ester1 0-undecenoic acid 3ß-hydroxy-5-cholestanyl ester
(Cholestanyl-1 0-Undecenoat)(Cholestanyl-1 0-undecenoate)
Laurylsäure-3ß-hydroxy-5α-cholestanyl-EsterLauryl acid 3β-hydroxy-5α-cholestanyl ester
(Cholestanyl-Laurat)(Cholestanyl Laurat)
Palmitinsäure-3 ß-hydroxy-5α-cholestanyl -Este rPalmitic acid-3β-hydroxy-5α-cholestanyl -Este r
(Cholestanyl-Pa Imitat)(Cholestanyl-Pa imitation)
3ß-Stigmast-5-en-3-laurat (ß-Sitosteryl-laurat)3ß-stigmast-5-en-3-laurate (ß-sitosteryl laurate)
3ß-Stigmast-5-en-3-palmitat (ß-Sitosteryl-pa Im itat)3ß-stigmast-5-en-3-palmitate (ß-sitosteryl-pa im itat)
3ß-Stigmast-5-en-3-stearat (ß-Sitosteryl-stearat)3ß-stigmast-5-en-3-stearate (ß-sitosteryl stearate)
3ß-Stigmast-5-en-3-arachidat ( ß-Sitosteryl-arachidat)
3ß-Stigmast-5-en-3-behenat (ß-Sitosteryl-behenat)3ß-stigmast-5-en-3-arachidate (ß-sitosteryl arachidate) 3ß-stigmast-5-en-3-behenate (ß-sitosteryl-behenate)
3ß-Stigmast-5-en-3-1 0-u ndecenoat (ß-S itosteryl-1 0-undecenoat)3ß-stigmast-5-en-3-1 0-u-undecenoate (ß-S itosteryl-1 0-undecenoate)
3ß-Stigmast-5-en-3-oleat (ß-Sitosteryl-oleat)3ß-stigmast-5-en-3-oleate (ß-sitosteryl-oleate)
3ß-Stigmast-5-en-3-all trans-reti nat (ß-S itosteryl-all-trans-retinat).3ß-Stigmast-5-en-3-all trans-retinate (ß-S itosteryl-all-trans-retinate).
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-1 0-undecenoat(3ß, 22E) -Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-1 0-undecenoate
[Ergosteryl-10-u ndecenoat, Provitamin D2-undecenoat][Ergosteryl-10-u undecenoate, provitamin D2-undecenoate]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-laurat(3ß, 22E) -Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-laurate
[Ergosteryl-Iau rat, Provitami n D2-Iaurat][Ergosteryl-Iau rat, Provitami n D2-Iaurat]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-palmitat(3ß, 22E) -Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-palmitate
[Ergosteryl-palmitat, Provitamin D2-palmitat][Ergosteryl palmitate, provitamin D2 palmitate]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-arachidat(3ß, 22E) -Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-arachidate
[Ergosteryl-Iaurat, Provitamin D2-arachidat][Ergosteryl laurate, provitamin D2 arachidate]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-al l-trans-retinat(3ß, 22E) -Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-al l-trans-retinate
[Ergosteryl-retinat, Provitami n D2-retinat][Ergosteryl retinate, provitami n D2 retinate]
10-Undecensäure-9,10-Secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol10-undecenoic acid-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3-ol
[Vitamin D3-undecenoat, Cholecalciferyl-undecenoat,[Vitamin D3 undecenoate, cholecalciferyl undecenoate,
Calciol-undecenoat]Calciol undecenoate]
Laurinsäure-9, 10-Secocholesta-5,7,10(1 9)-trien-3-olLauric acid-9, 10-secocholesta-5,7,10 (1 9) -trien-3-ol
[Vitamin D3-Iaurat, Cholecalciferyl-Iaurat, Calciol-Iaurat][Vitamin D3-Iaurate, Cholecalciferyl-Iaurate, Calciol-Iaurate]
Palm itinsäure-9,10-Secocholesta-5, 7,10(1 9)-trien-3-olPalm itic acid-9,10-secocholesta-5,7,10 (1 9) -trien-3-ol
[Vitamin D3-palmitat, Cholecalciferyl-palmitat, Calciol-palmitat][Vitamin D3 palmitate, cholecalciferyl palmitate, calciol palmitate]
Oelsäure-9,1 0-Secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-olOleic acid-9,1-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3-ol
[Vitamin Dß-oleat, Cholecalciferyl-oleat, Calciol-oleat][Vitamin Dß-oleate, cholecalciferyl-oleate, calciol-oleate]
Reti nsäure-9,1 0-Secocholesta-5,7, 10(19)-trien-3-olRetinoic acid-9,1-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3-ol
[Vitamin Dß-all trans-retinat, Cholecalciferyl-all trans-retinat,[Vitamin Dß-all trans-retinate, cholecalciferyl-all trans-retinate,
Calciol-al l trans-retinat]Calciol-al l trans-retinate]
Z-Gly-Phe-Vitamin D3Z-Gly-Phe-Vitamin D3
[CBO-Glycyl-L-phenylalanin-di peptid Calciol -Ester].[CBO-Glycyl-L-phenylalanine dipeptide calciol ester].
Die erfindungsgemäss einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische kön nen anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhältnis (d.h. eine "hydro- philic-lipophilic balance") zwischen 2 und 1 8; für Gemische liegt es vorzugsweise zwischen 2 bis 6 ei nerseits und 1 0 bis 15 anderseits. In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfi ndungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind ei nerseits Phosphorsäu reestertenside, wie z.B. : das praktisch wasserfreie Tristyryl phenolpolyoxyethylen-18-phosphor- säureester TEA-Salz-Tensid :
The surfactants or surfactant mixtures to be used according to the invention can be anion-active, cation-active, amphoteric or non-ionic. They are preferably amphoteric or non-ionic and have an HLB ratio (ie a “hydrophilic-lipophilic balance”) between 2 and 1 8; for mixtures it is preferably between 2 to 6 on the one hand and 1 0 to 15 on the other. Highly preferred for the production of spontaneously dispersible concentrates according to the invention are, on the one hand, phosphoric acid ester surfactants, such as, for example: the practically anhydrous tristyryl phenol polyoxyethylene-18-phosphoric acid ester TEA salt surfactant:
(Soprophor® FL, RHONE-POULENC);(Soprophor® FL, RHONE-POULENC);
Ferner.:Further.:
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50 % der beiden Verbindungen mit denDiphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), or the identical Sermul® EA 188 (SERVO), a mixed emulsifier, each consisting of 50% of the two compounds with the
Formeln:Formulas:
OO
C9H1 (-CH2-CH2-θ7π P— °CH3
OH C 9 H 1 (-CH 2 -CH 2 -θ7π P- ° CH 3 OH
OO
C9H1! CH3 C 9 H 1! CH 3
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), ein Alkylphenol Polyglycolether- Phosphat-TensidDiphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), an alkylphenol polyglycol ether phosphate surfactant
TensiTensi
(Tensid 508, CIBA-GEIGY); Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Ethoxy-Phosphorsäure- ester(Surfactant 508, CIBA-GEIGY); Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), a hydroxybiphenyl-10-ethoxy-phosphoric acid ester
Butyl-mono-4-Ethoxy-Phosphorsäureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw.
CH3-( CH2 )—CH-CH2-O (-CH2— CH2-O )5 -OCH,Butyl mono-4-ethoxy phosphoric acid ester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), or CH 3 - (CH 2 ) —CH-CH 2 -O (-CH 2 - CH 2 -O) 5 -OCH,
C2 H5 C 2 H 5
OCH,OCH,
(Zerostat ® AN , CI BA-G EIGY) und anderseits Betai nverbi ndungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B. :(Zerostat ® AN, CI BA-G EIGY) and on the other hand betai n associations, i.e. amphoteric, salt and water-free imidazole derivatives, e.g. :
worin Me[+] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome u nd Rx fü r C1 -32-Alkyl oder C2-32-Alkenylgruppen stehen . where Me [ + ] stands for hydrogen, alkali and alkaline earth atoms and R x for C 1 -32 -alkyl or C 2-32 -alkenyl groups.
Verwendung finden auch sog . "multi-functional g lucose derivatives", wie z.B.So-called "multi-functional glucose derivatives" such as e.g.
Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesq uistearat) und G l ucamate® SSE-20 (PEG-20Glucate® SS (methyl glucose sesq uistearate) and Glucate® SSE-20 (PEG-20
Methyl-Gl ucose-Sesquistearat) von Amerchol , Edison, N.J. , U.S.A.Methyl Glucose Sesquistearate) from Amerchol, Edison, N.J. , UNITED STATES.
Gute Ergebn isse sind fallweise auch zu erzielen unter Mitverwendung von nicht-ionogenen Verbi ndu ngen aus der "TWEEN®"-Reihe (Atlas Chem. Ind.,In some cases, good results can also be achieved by using non-ionogenic compounds from the "TWEEN®" series (Atlas Chem. Ind.,
Inc. ; bzw. ICI Specialty Chemicals), sog. Polyoxyethylen-Sorbitan-Mono- estern oder "Polysorbate" 20 bis 85-Verbind ungen i n der CTFA ClassificationInc.; or ICI Specialty Chemicals), so-called polyoxyethylene sorbitan monoesters or "polysorbates" 20 to 85 compounds in the CTFA Classification
[Fluka 93'773 bis 93'783].[Fluka 93'773 to 93'783].
Als Hydrotrop, bzw. als Co-Em ulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungsmittel lassen sich einsetzen, z.B. :Pharmaceutically acceptable solvents which can be used as hydrotropes or as co-emulsifiers can be used, e.g. :
Ester eines aliphatischen Alkohols (C3-18) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C10-22). wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllau rat, Isopropyl- myristat, Isopropylpalmitat und Laurylmyristat; Koh lenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C12 -32), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen. Mono-Ester aus Ethyleng lykol oder Propylenglykol mit ei ner aliphatischen Carbonsäure (C6 -22). wie etwa Propyleng lykolmonolaurat und Propylenglykol- monomyristat.Ester of an aliphatic alcohol (C 3-18 ) with an aliphatic carboxylic acid (C 10 - 22 ). such as isopropyl laurate, hexyl laurate, decyl laurate, isopropyl myristate, isopropyl palmitate and lauryl myristate; Hydrocarbons with a straight carbon chain (C 12 -32 ) which is substituted with 6 to 16 methyl groups and can have 1 to 6 double bonds, of which terpenes such as polymethylbutanes and polymethylbutenes may serve as examples. Mono-esters from ethylene glycol or propylene glycol with an aliphatic carboxylic acid (C 6-22 ). such as propylene glycol monolaurate and propylene glycol monomyristate.
Ester aus einem al iphatischen Alkohol (C12.22) mit Mi lchsäure, wie z.B. Myristyl- oder vorzugsweise Lau ryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Gly- cerins mit einer ali phatischen Carbonsäure (C6.22), wie z.B. G lyceryl- capryolat, oder Miglyol® 812 Neutralöl (Oleum neutrale).
Ester aus ei nem Poly(2-7)ethyleng lykolglyzerinether mit mindestens ei ner freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6.22), wie z.B. aliphatische Alkohole (Cι2-22), somit u.a. Dodecanol , Tetradecanol, Oleyl- alkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol.Esters of an al iphatischen alcohol (. C 12 22) with lchsäure Mi, such as myristyl or preferably Lau ryl-lactate; Mono-, di- or triesters of Gly cerins (neutral oleum) with an ali phatic carboxylic acid (C 6. 22), such as G lyceryl- capryolat, or Miglyol® 812 neutral oil. Esters of a poly (2-7) ethylene glycol glycerol ether with at least one free hydroxyl group with an aliphatic carboxylic acid (C 6. 22 ), such as, for example, aliphatic alcohols (Cι 2-22 ), thus, inter alia, dodecanol, tetradecanol, oleyl alcohol, 2-hexyldecanol and 2-octyldecanol.
Ester m it mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-1 0)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäu re (Cβ-22). Monoether aus einem Polyethylen- g lykol mit einem aliphatischen Alkohol (C12-18). wie z.B. Polyoxyethylen (Cι o)-octylether.Ester with at least one free hydroxyl group, from poly (2-1 0) glycol with an aliphatic carboxylic acid (Cβ- 22 ). Monoether from a polyethylene glycol with an aliphatic alcohol (C 12 - 18 ). such as polyoxyethylene (Cι o) octyl ether.
Heterocyclische Verbi ndungen , wie z.B. 1 -Methyl-2-Pyrrolidon . Biotenside Ester der allgemeinen Formel (XII) :Heterocyclic compounds, e.g. 1-methyl-2-pyrrolidone. Biosurfactant esters of the general formula (XII):
R^COO-R 4 (XII), wori n R3 ei ne C .3i -Alkyl-, eine C3.3ι -Alkenyl- oder eine C3.31 -Alkapolyen- gruppe und R4 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten .R ^ COO-R 4 (XII), where R 3 is a C. 3 i -alkyl-, a C 3 . 3 ι alkenyl or a C 3 . 31 -Alkapolyengruppe and R4 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- or Phytyl- mean.
Alle techn ischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dispergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Ch romatog raphie über neutralem Alumini umoxyd mit einem inerten Lösungsm ittel wie z.B. Tetrahydrofuran, Ethylalkohol oder Dichlormethan gerei nigt.Before being added to the spontaneously dispersible concentrates, all technical surfactants were filtered or chromatographed over neutral aluminum oxide with an inert solvent such as e.g. Tetrahydrofuran, ethyl alcohol or dichloromethane cleaned.
Als Zusätze in die erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitami n A-Säure, Retinol, To- copherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Fl ux enhan- cers") und Radikalfänger.Vitamins and provitamins (such as vitamins A acid, retinol, tocopherols), as well as selected penetration enhancers ("flux enhancers") and radical scavengers are suitable as additives in the spontaneously dispersible concentrates according to the invention.
HERSTELLUNG a) Herstellung von 3-O-AII-trans-Retinoyl OleanolsäurePRODUCTION a) Production of 3-O-AII-trans-retinoyl oleanolic acid
Zu 600 mg AII-trans-Retinsäure in 50 m l Dioxan oder Chloroform gibt man bei 15°C unter Luftabschluss 650 mg N,N'-Carbonyld iim idazol. Die Reaktionslösung wird bei 15°C während 24h stehen gelassen . Anschliessend wird die Lösung mit dem entstandenen AII-trans-Retinsäure-lmidazolid bei 20°C zu einer Lösung von 900 mg Oleanolsäure, 60 mg Dimethylformamid und 50 mg p-Dimethylami nopyridin in 50 ml Dioxan oder Ch loroform zugetropft. Nach 3- stündiger Erwärmung auf 40°C wi rd das Lösungsmittel durch Vaku umdestillation entfernt. Der Rückstand wi rd i n Essigester oder Dichlormethan aufgenommen , neutral isiert, getrocknet und dan n auf einer Aluminiumoxydsäu le (neutral, Brockman n Aktivität I) mit Cyclohexan/Essigester oder Methylcyclo- hexan/Dichlormethan (90: 10, bzw. 98 :2) als Elu iermittel chromatographiert. Man erhält das Produ kt 3-all-trans-Retinoyl-Oleanolsäure.
Smp. 147, 5-149, 5°C; Rf.-Wert auf DC Hexan/Essigester (90: 10): 0,75.To 600 mg of AII-trans-retinoic acid in 50 ml of dioxane or chloroform are added 650 mg of N, N'-carbonyldiim idazole at 15 ° C. with exclusion of air. The reaction solution is left to stand at 15 ° C. for 24 hours. The solution with the resulting AII-trans-retinoic acid imidazolide is then added dropwise at 20 ° C. to a solution of 900 mg of oleanolic acid, 60 mg of dimethylformamide and 50 mg of p-dimethylamino nopyridine in 50 ml of dioxane or chloroform. After heating for 3 hours at 40 ° C, the solvent is removed by vacuum distillation. The residue is taken up in ethyl acetate or dichloromethane, neutralized, dried and then on an aluminum oxide column (neutral, Brockman activity I) with cyclohexane / ethyl acetate or methylcyclohexane / dichloromethane (90:10 or 98: 2). chromatographed as eluent. The product 3-all-trans-retinoyl-oleanolic acid is obtained. M.p. 147, 5-149, 5 ° C; Rf. value on DC hexane / ethyl acetate (90:10): 0.75.
In vergleichbarer Weise können auch folgende Verbindungen hergestellt werden :The following connections can also be made in a comparable manner:
3-O-all-trans-Retinoyl Glycyrrhetinsäure,3-O-all-trans-retinoyl glycyrrhetinic acid,
Smp. 159-160,5 °C; Rf.-Wert auf DC Hexan/Essigester (90: 1 0): 0,70.M.p. 159-160.5 ° C; Rf. value on DC hexane / ethyl acetate (90: 1 0): 0.70.
3-O-Linoleoyl Glycyrrhetinsäure3-O-linoleoyl glycyrrhetinic acid
3-O-Linolenoyl Glycyrrhetinsäure3-O-linolenoyl glycyrrhetinic acid
3-O-Li noleoyl Oleanolsäure3-O-Li noleoyl oleanolic acid
3-O-Linolenoyl Oleanolsäure3-O-linolenoyl oleanolic acid
b) Herstellung von 3-O-(10-Undecenoyl) Oleanolsäureb) Preparation of 3-O- (10-undecenoyl) oleanolic acid
Zu 900 mg Oleanolsäure und 75 mg Dimethylformamid in 50 ml Toluol werden bei 20°C 600 mg 10-Undecenoylchlorid in 30 ml Toluol zugetropft. Die Reaktionslösung wird am Rückfluss während drei Stunden auf 60°C erhitzt. An- schliessend wird das Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt. Der Rückstand wird auf einer Silicalgelsäule mit Cyclohexan/Essigester (95 :5) als Eluiermittel chromatographiert. Man erhält das Produkt:600 mg of 10-undecenoyl chloride in 30 ml of toluene are added dropwise to 900 mg of oleanolic acid and 75 mg of dimethylformamide in 50 ml of toluene at 20 ° C. The reaction solution is heated to 60 ° C. under reflux for three hours. The solvent is then removed by vacuum distillation. The residue is chromatographed on a silica gel column using cyclohexane / ethyl acetate (95: 5) as the eluent. The product is obtained:
3-O-(10-Undecenoyl) Oleanolsäure, mit einem Brechungsindex (Bl) von 1 .44455. In vergleichbarer Weise können auch hergestellt werden :3-O- (10-undecenoyl) oleanolic acid, with a refractive index (B1) of 1.44455. The following can also be produced in a comparable manner:
3-lsovaleroyl Oleanolsäure, Bl 1.431503-isovaleroyl oleanolic acid, Bl 1.43150
3-O-Lauroylester Oleanolsäure, Bl 1.431503-O-lauroyl ester oleanolic acid, Bl 1.43150
3-Oleyl Oleanolsäure3-oleyl oleanolic acid
3-Lauroyl Glycyrrhetinsäure3-lauroyl glycyrrhetinic acid
3-Oleyl G lycyrrhetinsäure3-oleyl G lycyrrhetinic acid
3,28-Diundecenoylbetulin3,28-diundecenoyl betulin
3,28-Dilauroylbetulin3,28-dilauroyl betulin
3,28-Dipalmitoylbetulin3,28-dipalmitoyl betulin
c) Herstellung von 3-0, 28-O-Dilauroylbetulinc) Preparation of 3-0, 28-O-dilauroylbetulin
In einem trockenen Dreihalskolben, versehen mit Magnetrührer, Einlass für Schutzgas, Kühler und Septum wurde die Lösung von 347 mg Betulin in 4 ml abs. Pyridin mit einigen Kristallenen 4-Dimethylaminopyridin versetzt und dann auf 0°C gekühlt. Hierauf erfolgte die tropfenweise Zugabe von 0,3 ml Lauroylchlorid d urch das Septum mittels einer S pritze. Nach dem Entfernen des Kühlbades wurde die Lösung unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur gebracht. Nach 12 h wurde sie mit Benzol verdünnt, dann die S uspen-
sion filtriert und das Filtrat mit H20, 2N H2S04 und Sole ausgewaschen und die Benzollösung über Na2S04 getrocknet.In a dry three-necked flask equipped with a magnetic stirrer, inlet for protective gas, cooler and septum, the solution of 347 mg betulin in 4 ml abs. Some crystallines 4-dimethylaminopyridine were added to pyridine and then cooled to 0.degree. Then 0.3 ml of lauroyl chloride was added dropwise through the septum using a syringe. After removing the cooling bath, the solution was brought to room temperature with constant stirring. After 12 h it was diluted with benzene, then the suspension sion filtered and the filtrate washed with H 2 0, 2N H 2 S0 4 and brine and the benzene solution dried over Na 2 S0 4 .
DC auf Kieselgel mit Essigester/Toluol/Aceton 11:9:1 und Besprühen mit dem Cer-Ammoniummolybdat-Reagens ergab für Betulin einen Rf-Wert von 0,03 und für das Dilaurat einen solchen von 0,93.TLC on silica gel with ethyl acetate / toluene / acetone 11: 9: 1 and spraying with the cerium ammonium molybdate reagent gave an Rf value of 0.03 for betulin and 0.93 for the dilaurate.
Die weitere Reinigung erfolgte durch Säulenchromatographie an basischem Alox, Aktivität II. Ausbeute 83% an blassgelbem, sehr viskosem Oel nach Trocknen bei 50°C und 0,01 Torr. IR (CH2CI2) : 1722 cm- ssThe further purification was carried out by column chromatography on basic Alox, activity II. Yield 83% of pale yellow, very viscous oil after drying at 50 ° C. and 0.01 Torr. IR (CH 2 CI 2 ): 1722 cm-ss
CIMS (NH3) : m/z 624,2 (6,2%; M+ +1 von Allobetulinlaurat); 608,2 (46,4, M+ +1 - Laurinsäure); 607,2 (100%, M+ - Laurinsäure); 407,2 (31,65% M+ - 2 Laurin- säure); 409,2 (5,32%, M+ von Allobetulinlaurat - Laurinsäure). {Bei der HV-Destillation tritt teilweise Abspaltung von Laurinsäure und Um- lagerung in Allobetulin ein}.CIMS (NH 3 ): m / z 624.2 (6.2%; M + +1 of allobetulin laurate); 608.2 (46.4, M + +1 - lauric acid); 607.2 (100%, M + - lauric acid); 407.2 (31.65% M + - 2 lauric acid); 409.2 (5.32%, M + of allobetulin laurate - lauric acid). {In the case of HV distillation, lauric acid is partially split off and rearranged in allobetulin}.
1H-NMR (CDCI3), 300 MHz): 4,69 (d, J=2,1 , 1H von C = CH.2); 4,60 (q, J = 1,3 , 1H von C=CH.2); 4,48 (d,d, J=9,5 und 10,6 (H-C(3)); 4,27 (d, breit, J = 10,3 , 1H von H2-C(28); 3,84 (d, J = 11,0, 1H von CH2; 1,69 (s, CH3(29); 1,26 (s, Rest der (CH2)-Protonen.1H NMR (CDCI3, 300 MHz): 4.69 (d, J = 2.1, 1H of C = CH.2); 4.60 (q, J = 1.3, 1H of C = CH.2); 4.48 (d, d, J = 9.5 and 10.6 (HC (3)); 4.27 (d, broad, J = 10.3, 1H of H2-C (28); 3.84 (d, J = 11.0, 1H of CH2; 1.69 (s, CH3 (29); 1.26 (s, balance of the (CH2) protons.
13C-NMR ; 174,3 und 173,7 (je ein Lauroyl-CO), 150,2 (C(22)); 109,8 (C(30)); 80,6 (C(3)); 62,5 (C(28)).13C NMR; 174.3 and 173.7 (each a lauroyl CO), 150.2 (C (22)); 109.8 (C (30)); 80.6 (C (3)); 62.5 (C (28)).
d) Herstellung von 3-O-Lauroylbetulind) Preparation of 3-O-lauroyl betulin
Die Darstellung erfolgt aus 30,280-Dilauroylbetulin analog einer Vorschrift von L. Ruzicka et al. [Helv.Chim.Acta 1938, 21_, 1708]: die Lösung von 495 mg 3,28-Di-O-lauroylbetulin in 3 ml Benzol wurde mit 6,25 ml 0,1N KOH in Etha- nol versetzt und unter Rühren während 12h bei 50°C gehalten. Die klar gewordene Lösung gaben wir auf eine Kieselgelsäule (Kieselgel Merck, 0,04 - 0,063 mm/2, 6 x 43 cm, nass gefüllt mit Essigester/Benzol/Aceton 11:9:1). De- tektion der gesuchten Substanz mit dem Cer-Ammoniummolybdat-Reagens. Das Monolaurat hat einen Rf-Wert von 0,84. Ausbeute 280 mg farbloses, sehr zähes Oel, das beim Trocknen bei 50°C/0,01 Torr langsam zu einer halbfesten Masse erstarrt.The preparation is made from 30,280-dilauroyl betulin analogous to a rule by L. Ruzicka et al. [Helv.Chim.Acta 1938, 21_, 1708]: the solution of 495 mg of 3,28-di-O-lauroylbetulin in 3 ml of benzene was mixed with 6.25 ml of 0.1N KOH in ethanol and while stirring Maintained at 50 ° C for 12 hours. We poured the clear solution on a silica gel column (silica gel Merck, 0.04 - 0.063 mm / 2, 6 x 43 cm, wet filled with ethyl acetate / benzene / acetone 11: 9: 1). Detection of the desired substance with the cerium ammonium molybdate reagent. The monolaurate has an Rf value of 0.84. Yield 280 mg of colorless, very viscous oil which slowly solidifies to a semi-solid mass when dried at 50 ° C./0.01 Torr.
Rf (Kieselgel Merck, AcOEt/Toluon/Aceton 11:9:1) : 0,84. Zum Vergleich: Betulin 0,63; 3,28-Di-O-Lauroylbetulin: 0,94. IR (CH2CI2) : 3615 (OH frei), 2930, 2858, 1720; (CHCI3) : 3627, 3492, 2954, 2856, 1717.Rf (silica gel Merck, AcOEt / Toluon / Acetone 11: 9: 1): 0.84. For comparison: Betulin 0.63; 3,28-di-O-lauroyl betulin: 0.94. IR (CH2CI2): 3615 (OH free), 2930, 2858, 1720; (CHCI3): 3627, 3492, 2954, 2856, 1717.
CIMS / NH3) : m/z 425,3 (100%, M+ +1 - Laurinsäure);CIMS / NH3): m / z 425.3 (100%, M + +1 - lauric acid);
1H-NMR : weitgehend analog zu dem von c), charakteristisch sind die Signale von H2-C(28) bei 3,80 (d,d, J = 1,5 und 10,8), und bei 3,34 (d, J = 10,8)
e) Herstellung von 3-O-Lauroylallobetuli n1H-NMR: largely analogous to that of c), the signals of H2-C (28) are characteristic at 3.80 (d, d, J = 1.5 and 10.8), and at 3.34 (d , J = 10.8) e) Preparation of 3-O-Lauroylallobetuli n
Allobetulin wurde nach der Vorschrift von H. Schulze und K. Pieroh (Ber. Deutsch. Chem . Ges., 1922, 55_, 2332) dargestellt. Je 0,31 und 0,47 g von reinem Allobetu lin wurden in 2 ml abs. Pyridin und 10 ml 1 ,2-Dichlorethan gelöst, dann mit einigen Kriställchen 4-Dimethylaminopyridin versetzt und bei RT via Spritze m it je 1 ,2 Äquivalenten Säurechlorid tröpfchenweise versetzt. Nach 2 h bei RT wurde während 30 m in. auf 50°C erwärmt, dann gekühlt, mit genügend Et2θ versetzt und mit Wasser, 2N HCI und Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach Trocknen ü ber Na2Sθ4, Filtrieren und Eindampfen wurde in Benzol aufgenommen und die Lösung durch eine kurze Säule von aktiviertem Aluminiumoxid filtiert und das Filtrat eingedampft.Allobetulin was prepared according to the instructions of H. Schulze and K. Pieroh (Ber. Deutsch. Chem. Ges., 1922, 55_, 2332). 0.31 and 0.47 g each of pure Allobetu lin were in 2 ml abs. Dissolved pyridine and 10 ml of 1, 2-dichloroethane, then mixed with a few crystals of 4-dimethylaminopyridine and added dropwise at room temperature via syringe with 1, 2 equivalents of acid chloride. After 2 h at RT, the mixture was heated to 50 ° C. for 30 m, then cooled, sufficient Et2θ was added and the mixture was shaken out with water, 2N HCl and brine. After drying over Na2SO4, filtering and evaporation, the mixture was taken up in benzene and the solution was filtered through a short column of activated aluminum oxide and the filtrate was evaporated.
3-O-Lauroylallobetulin (n = 10) : farbloses, zähes Öl , das im Vaku um allmählich erstarrt. Rf 0,853-O-lauroylallobetulin (n = 10): colorless, viscous oil that gradually solidifies in a vacuum. Rf 0.85
IR (CH2CI2) : keine OH-Banden , 2925, 2855, 1 720 ( Estercarbonyl) CIMS (NH3) : 425,3 (100%, M+ +1 - Lau rinsäure) ; NMR: analog zu 3-O-Palmitoylbetulin (n = 14)IR (CH2CI2): no OH bands, 2925, 2855, 1720 (ester carbonyl) CIMS (NH3): 425.3 (100%, M + +1 - lauric acid); NMR: analogous to 3-O-palmitoyl betulin (n = 14)
3-O-Palmitoylallobetul in (n = 14): farblose Kristalle aus Tetrahydrofuran/Pen- tan/Methanol, Smp. (Vak.) 185-189°C; Ausbeute 82%. Rf Laurat : 0,92, Palmitat 0,93 (Allobetulin 0,72, Betulin 0,65) IR (CHCI3) : keine OH-Banden, 2959, 2927, 2855, 1 717 ; (CH2CI2) : keine OH- Banden, 2950, 2931 , 2855, 1767, 1720.3-O-palmitoylallobetul in (n = 14): colorless crystals of tetrahydrofuran / pentane / methanol, mp (vac.) 185-189 ° C; Yield 82%. Rf laurate: 0.92, palmitate 0.93 (allobetulin 0.72, betulin 0.65) IR (CHCI3): no OH bands, 2959, 2927, 2855, 1717; (CH2CI2): no OH bands, 2950, 2931, 2855, 1767, 1720.
1 H-NMR (CDCI3), 300 MHz, Auswah l von strukturbeweisenden Signalen): 4,487 (d,d, H-C3)); 3,775 und 3,444 (je d , J=8,2 , H2-(28)) ; 3,530 (s breit, H-C(19)); 2,294 (t, J = 7,3 , α-CH2).1 H-NMR (CDCI3), 300 MHz, selection of structure-evidencing signals): 4.487 (d, d, H-C3)); 3,775 and 3,444 (each d, J = 8.2, H2- (28)); 3.530 (broad s, H-C (19)); 2.294 (t, J = 7.3, α-CH2).
CIMS (NH3) : 425,4 m/z (1 00%, M + 1 - Palmitinsäure); 13C-NMR : 171 ,4 Palmitoyl-CO); 87,8 (C(3)); 71 ,2 (C(28)); 80,4 (C(19).CIMS (NH3): 425.4 m / z (100%, M + 1 - palmitic acid); 13 C NMR: 171, 4 palmitoyl-CO); 87.8 (C (3)); 71, 2 (C (28)); 80.4 (C (19).
f) Herstellung von 3-O-Palmitoyl-Betulinsäure-Methylesterf) Preparation of 3-O-palmitoyl-betulinic acid methyl ester
Aus reiner Betu linsäure wurde der Methylester durch Verestern ihrer Lösung in THF/MeOh m it frisch hergestellter etherischer Diazomethanlösung im Ü ber- schuss hergestellt (vgl. V. Bruckner, J . Koväcs, J. Kozka, J.Chem.Soc. 1 948. 948). Die Lösu ng von 0,62 g reinem Methylester in 2 m l abs. Pyridin u nd 10 ml 1 ,2-Dichlorethan wurde mit wenig 4-Dimethylaminopyridin versetzt und hierauf wie oben unter e) acyliert und aufgearbeitet. Erhalten wurden 0,75 g farbloses, sehr zähes Öl , das bei RT nicht kristall isierte. Rf : 0,91 (Betulinsäuremethylester 0,74) IR (CHCI3) : 2928, 2855,171 9, 1641 , 1465.
In entsprechender Weise kann auch der Methylester der Oleanolsäure, der 18ß-Glycyrrhetinsäure (Enoxolon), bzw. der Ursolsäure hergestellt und an O- C(3) mit einer aktivierten, gesättigten oder ungesättigten Carbonsäure acy- liert werden. Vgl. dazu auch A. Winterstein, W. Hämmerle, Z.Physiol.Chem., 1931, 199.71.The methyl ester was prepared from pure betulinic acid by esterifying its solution in THF / MeOh with an excess of freshly prepared ethereal diazomethane solution (cf. V. Bruckner, J. Koväcs, J. Kozka, J. Chem. Soc. 1 948 . 948). The solution of 0.62 g of pure methyl ester in 2 ml of abs. A little 4-dimethylaminopyridine was added to pyridine and 10 ml of 1,2-dichloroethane and then acylated and worked up as above under e). 0.75 g of colorless, very viscous oil was obtained which did not crystallize at RT. Rf: 0.91 (betulinic acid methyl ester 0.74) IR (CHCI3): 2928, 2855.171 9, 1641, 1465. In a corresponding manner, the methyl ester of oleanolic acid, 18β-glycyrrhetic acid (enoxolone) or ursolic acid can also be prepared and acylated on O-C (3) with an activated, saturated or unsaturated carboxylic acid. See also A. Winterstein, W. Hämmerle, Z. Physiol.Chem., 1931, 199.71.
g) 3-O-Palmitoyloleanolsäuremethylester (n = 14)g) 3-O-palmitoyloleanolic acid methyl ester (n = 14)
Farblose Kristalle aus Diisopropylester/Pentan, Smp.62-63°C, Rf 0,88 (Oelanolsäuremethylester 0,69; Oleanolsäure 0,60). IR (CHCI3) : 2928, 2855, 1717, 1464.Colorless crystals of diisopropyl ester / pentane, mp 62-63 ° C, Rf 0.88 (methyl oleanol acid 0.69; oleanolic acid 0.60). IR (CHCI3): 2928, 2855, 1717, 1464.
h) 3-O-Palmitoylglycyrrhetinsäuremethylester (n = 14)h) 3-O-palmitoylglycyrrhetinic acid methyl ester (n = 14)
Farblose Kristalle aus Diisopropylether/Pentan; Smp. 130°C.Colorless crystals of diisopropyl ether / pentane; Mp 130 ° C.
UV (CH2CI2) : λmax 247 nm (ε 14'500)UV (CH2CI2): λmax 247 nm (ε 14,500)
IR (CHCI3) : keine OH-Banden, 2928, 2855, 1722, 1653, 1465 cm-IR (CHCI3): no OH bands, 2928, 2855, 1722, 1653, 1465 cm -
CIMS (NH3) : 724,6 m/z (50%, M+ +1), 723,5 (100%, M + ), 467,4 (14%, M+ -CIMS (NH3): 724.6 m / z (50%, M + +1), 723.5 (100%, M +), 467.4 (14%, M + -
Palmitinsäure).Palmitic acid).
1H-NMR (600 MHz, CDCI3), Auswahl von Banden): 5,662 (s, H-C(12); 4,48 (dd,1H-NMR (600 MHz, CDCI3), selection of bands): 5.622 (s, H-C (12); 4.48 (dd,
J = 11,3 und 5,0, H-C(3); 3,68 (s, OCH3); 2,80 (m, H-C(18); 1,254 (s, CH2).J = 11.3 and 5.0, H-C (3); 3.68 (s, OCH3); 2.80 (m, H-C (18); 1.254 (s, CH2).
13C-NMR : 200,0 (C-11); 176,9 (C-30), 173,6 (Palmitoyl-CO); 169,1 (C-13); 128,513C NMR: 200.0 (C-11); 176.9 (C-30), 173.6 (palmitoyl-CO); 169.1 (C-13); 128.5
(C-12); 80,2 (C-3); 51,7 (OCH3).
(C-12); 80.2 (C-3); 51.7 (OCH3).
ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren KONZENTRATEN, welche die Wirkstoffe der Formeln (I) bis (VI) enthalten und welche, wen n sie mit Wasser oder 5%-iger G lucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt werden , thermo- dynamisch stabile ULTRAMIKROEMULS IONEN mit ei nem hyd rodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm ergeben.COMPOSITION EXAMPLES of spontaneously dispersible CONCENTRATES according to the invention which contain the active compounds of the formulas (I) to (VI) and which, if diluted with water or 5% glucose solution or physiological saline (Ringer's solution), thermodynamically stable ULTRAMICROEMULS IONS with a hyd rododynamic radius of 2.2 to 3.0 nm.
g) 0,1 bis 10 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von ausgewählten pentacyclischen Triterpenverbindungen der Formeln (I) bis (XI),g) 0.1 to 10% by weight of one or more esters of selected pentacyclic triterpene compounds of the formulas (I) to (XI),
0 bis 5 Gewichts-% ei ner bekannten , pharmazeutsichen Wirksu bstanz,0 to 5% by weight of a known pharmaceutical active substance,
1 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Neutralöl , wie z.B. Mig lyol® 81 2 (DYNAMIT NOBEL oder HÜLS),1 to 25% by weight isopropyl myristate, isopropyl palmitate or neutral oil, e.g. Mig lyol® 81 2 (DYNAMIT NOBEL or HÜLS),
0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsäureester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CI BA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA- GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-G EIGY), Soprophor® FL (RHÖNE-POULENC), 5 bis 90 Gewichts-% Invadin JFC 800 % (CIBA-GEIGY) und/oder Tween®-20 (ICI S pecialty Chemicals), bis zu 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins. bis zu 1 0 Gewichts-% eines Stabil isators, Radikalfängers, biologischen Vektors oder Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel .0 to 45% by weight of a phosphoric acid ester surfactant, e.g. Diphasol® 3873 (CI BA-GEIGY), tenside 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA-GIGY), Tinovetin® JU (CIBA-G EIGY), Soprophor® FL (RHÖNE-POULENC), 5 up to 90% by weight Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY) and / or Tween®-20 (ICI S specialty Chemicals), up to 10% by weight of a vitamin or provitamin. up to 10% by weight of a stabilizer, radical scavenger, biological vector or penetration enhancer and carriers and / or diluents.
h) 0,5 bis 5 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bish) 0.5 to 5% by weight of one or more active compounds of the formulas (I) to
(XI),(XI),
5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen5 to 25% by weight of one or more bio-surfactant esters of the general
Formel (XIII) :Formula (XIII):
R— COO— R 5 (X| | |) worin R4 eine C2-3i -Alkyl-, eine C3.3i -Alkenyl- oder eine C3-3ι -Alkapolyen- gruppe und R5 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten.R - COO - R 5 (X | | |) where R4 is a C 2 - 3 i alkyl, a C 3 . 3 i -Alkenyl or a C 3-3 ι -Alkapolyen- group and R5 citronellyl, farnesyl, geranyl, isophytyl or phytyl mean.
30 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% und/oder Tween®-20, 30 bis 45 Gewichts-% Soprophor® FL oder Diphasol® 3873.30 to 45% by weight Invadin® JFC 800% and / or Tween®-20, 30 to 45% by weight Soprophor® FL or Diphasol® 3873.
N.B.: INVADIN® J FC 800% (CI BA-GEIGY) ist ei n wasserfreies tert. Octylphe- nylpolyoxyethylenether-Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen. TWEEN®-20 ist ei n Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monolaurat, bzw. das Poly- sorbate-20 in der CTFA-Classification.
BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von "multiple units". i) GranulierungNB: INVADIN® J FC 800% (CI BA-GEIGY) is an anhydrous tert. Octylphenyl polyoxyethylene ether surfactant with 9 to 10 oxyethylene groups. TWEEN®-20 is a polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, or the polysorbate-20 in the CTFA classification. EXAMPLE for the pharmaceutical production of a system preparation with concentrates according to the invention in the form of "multiple units". i) granulation
Metolose® 90 SH-4000 (SHIN-ETSU CHEMICAL) 90.0 gMetolose® 90 SH-4000 (SHIN-ETSU CHEMICAL) 90.0 g
Avicel® PH-101 80.3 gAvicel® PH-101 80.3 g
Erfindungsgemässes MARIGENOL®-KONZENTRAT 139.4 gMARIGENOL® CONCENTRATE according to the invention 139.4 g
Aerosil® 200 80.3 gAerosil® 200 80.3 g
Σ 390.0 gΣ 390.0 g
Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40 °C.Granulate / shape in a high-speed mixer or in a rotary bed with the addition of 110 g ethanol, break, seven 18 to 42 mesh, dry for 24 h at 40 ° C.
k) MSR- und RETARD-Ausrüstung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (SHIN-ETSU CHEMICAL) und Talkk) MSR and RETARD equipment in a rotary bed with AQOAT® AS-HG (SHIN-ETSU CHEMICAL) and talc
I) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. MicropelletsI) composition of finished granules / or. Micropellets
Kernmaterial 44 %Core material 44%
Erfindungsgemässes MARIGENOL®-KONZENTRAT 25 %MARIGENOL® CONCENTRATE according to the invention 25%
MSR-Beschichtung 31 %MSR coating 31%
Σ 100 %Σ 100%
N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemass a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1:1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern.
NB: MSR = gastric juice resistance. The pellets / granules according to a) can also be filled directly into capsules, which are made from AQOAT® (HPMC-AS-M or HPMC-AS-N), and sealed with acetone / ethanol 1: 1, and so the functions adequately control the MSR and the delayed release (retard).
BIOLOGISCHE PRÜFUNGENBIOLOGICAL TESTS
Die antitumorale/antivirale/antiparasitäre Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wi rkstoffen gemass den Herstellungsbeispielen a) bis e), sowie den Aufarbeitungsbeispielen f) und g) wi rd anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt:The antitumor / antiviral / antiparasitic effect of spontaneously dispersible concentrates with active substances according to the preparation examples a) to e) and the workup examples f) and g) is confirmed on the basis of the following test results:
1. In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien1. In vitro tests with suitable tumor cell lines
Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiter- platten und Verdün nungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 1 θ4/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so u ndicht ausgesät, dass sie während des Assays in nichtkonfluenten Monolayers wachsen kön nen . Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden , mit 100 μl pro Reihe, die man dann im 1 . Loch mit 100 μl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen u nd in das folgende Loch ei ngebracht, wieder mit 100 μl Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdü n nungsreihe n1/..A biological assay system has been developed that works with microtiter plates and dilution series. In each case, 1 θ4 / ml tumor cells are inactivated in RPMI 1640 culture medium with 10% fetal calf serum (GIBCO); they are sown so densely that they can grow in non-confluent monolayers during the assay. The sample is added after 6 to 24 hours, with 100 μl per row, which is then in the 1st Add 100 μl of medium to the hole. Half of this is removed and placed in the following hole, again mixed with 100 μl medium, etc. A geometric series of dilutions n 1 / .. is formed.
Die Proben werden im Plaque Assay wäh rend 3 bis 5 Tagen bei 37°C mit 31Λ% CO2 inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0,1 % Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70% Methanol, 1 % Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen , Verg rösserung 300-fach. Man bestimmt d ie g rösste cytotoxische Verd ünnung. Die quantitative Auswertung lässt sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessung am S pektrophoto- meter vornehmen .
The samples are incubated in the plaque assay for 3 to 5 days at 37 ° C with 3 1 Λ% CO2. Then dye / fix with 0.1% crystal violet (Fluka, Buchs) in a solution of 70% methanol, 1% formaldehyde, 29% water. The evaluation is carried out on a microscope, magnification 300 times. The largest cytotoxic dilution is determined. The quantitative evaluation can also be carried out by means of scanning and absorption measurement on a spectrophotometer.
2.0 Prüfung auf Zytotoxizität2.0 Test for cytotoxicity
2.1 Zytotoxizität der MARIGENOL®-KONZENTRATE geprüft an Py6-Zel len (Virus infizierten 3T3 Maus-Fibroblasten)2.1 Cytotoxicity of MARIGENOL® CONCENTRATES tested on Py6 cells (virus-infected 3T3 mouse fibroblasts)
') 72 h Verdünnungen: Erste Zeile auf Konzentrat berechnet') 72 h dilutions: First line calculated for concentrate
Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnetSecond line calculated on active substance content
WIEDERHOLUNG in-vitro Test auf Py6-ZellenREPEAT in vitro test for Py6 cells
N.B. Verdünnungen: Obere Zahl auf Konzentrat berechnetN.B. Dilutions: Upper number calculated on concentrate
Untere Zahl auf Wirksubstanzgehalt berechnet
3.0 In-Vitro-Prüfung mit humanen Tumor-Zeil-LinienLower number calculated on active substance content 3.0 In vitro testing with human tumor cell lines
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien 1% Konzentrat mit 3-O-Lauroyl-Oleanolsäure Proliferationstest (Tritium: 1 μCi/pro well H + )VITALITY TEST with human tumor cell lines 1% concentrate with 3-O-lauroyl-oleanolic acid proliferation test (tritium: 1 μCi / per well H +)
Verdünnungen LC 89 U 937 T O M cpm % cpm % cpm %Dilutions LC 89 U 937 T O M cpm% cpm% cpm%
10-2 474 16 583 0.3 788 0.410-2 474 16 583 0.3 788 0.4
10-3 775 26 1*370 0.7 8*328 4.410-3 775 26 1 * 370 0.7 8 * 328 4.4
10-4 7*265 (?) 250 88*61 45.5 17'766 9.510-4 7 * 265 (?) 250 88 * 61 45.5 17'766 9.5
10-5 2*782 95 175*127 89.7 22*895 12.210-5 2 * 782 95 175 * 127 89.7 22 * 895 12.2
10-6 2'926 100 191*432 98.0 46*602 24.810-6 2,926 100 191 * 432 98.0 46 * 602 24.8
10-7 3*800 131 198*796 101.0 159'207 84.910-7 3 * 800 131 198 * 796 101.0 159,207 84.9
cpm-Kontrollen 2'906 195*125 187*601 Zeil-Linien: LC 89: Lungenadenocarcinomcpm controls 2,906 195 * 125 187 * 601 Zeil lines: LC 89: pulmonary adenocarcinoma
U 938: Leucemia mieloide acutaU 938: Leucemia mieloid acuta
TOM: Melanoma umanoTOM: Melanoma umano
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48h mit 1% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässerige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit. Tests durchgeführt von Dottoressa Anna-Rita Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica, Torino, März-April 1995.ID:% vitality after 48h with 1% MARIGENOL® CONCENTRATES, added once to the medium as an aqueous ultra-microemulsion. When assessing, consider the relatively short exposure time. Tests conducted by Dottoressa Anna-Rita Guarini, Università degli Studi di Torino, Clinica medica, Torino, March-April 1995.
3.1 Übrige Befunde3.1 Other findings
Zu den für die unveresterten Grundkörper von Lupeol, Betulin, Betulinsäure und Ursolsäure festgestellten pharmakologischen Wirkungen vgl. u.a.:For the pharmacological effects found for the unesterified body of Lupeol, Betulin, Betulinic acid and Ursolic acid cf. including:
Bhattacharyya J. et al., Phytochemistry, 1976, 15, 431.Bhattacharyya J. et al., Phytochemistry, 1976, 15, 431.
Aszalos Adorjan: "Antitumor Compounds of Natural Origin", CRC Press, BocaAszalos Adorjan: "Antitumor Compounds of Natural Origin", CRC Press, Boca
Raton, Florida, 1980, N° 220, 221, 222, 224.Raton, Florida, 1980, N ° 220, 221, 222, 224.
Recio Maria delCarmen et al., Planta Medica, 57 (1991)Recio Maria delCarmen et al., Planta Medica, 57 (1991)
Yasukawa K. et al., Oncology 48, 72-76Yasukawa K. et al., Oncology 48, 72-76
Macias F.A. et al., Phytochemistry, 1994, 36_, 1369
Recio Maria delCarmen et al. : "Investigations on the Steroidal anti-inflamma- tory Activity of Triterpenoids from Diospyros leucomelas", Planta Medica, 61 (1995) pp. 9-12Macias FA et al., Phytochemistry, 1994, 36_, 1369 Recio Maria delCarmen et al. : "Investigations on the Steroidal anti-inflammatory Activity of Triterpenoids from Diospyros leucomelas", Planta Medica, 61 (1995) pp. 9-12
Pisha Emily et al. : "Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of h uman melanoma that fu nctions by induction of apoptosis", Nature Medicine 1 , (1995), 1046-51 .Pisha Emily et al. : "Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of h uman melanoma that functions by induction of apoptosis", Nature Medicine 1, (1995), 1046-51.
Vgl. auch : O. Gessner: " Die Gift- u nd Arzneipflanzen von Mitteleuropa", Verlag Winter, Heidelberg , 1953.See also: O. Gessner: "The poison and medicinal plants of Central Europe", Verlag Winter, Heidelberg, 1953.
Betulin macht in der weissen Rinde von Betula platyphyl la bis zu 35% des Trockengewichtes aus. [K. Hi rota et al., Chem .Abstr. 1948, 42., 6090], was nahelegt, dass es dort eine Schutzfunktion fü r d ie Pflanze übern immt. Der Extrakt aus der trockenen Destillation diente als Heilmittel fü r verschiedene Anwendu ngen , sowie als "Bi rkenteer" zu r Herstell ung des berühmten russischen J uchten leders.Betulin accounts for up to 35% of the dry weight in the white bark of Betula platyphyl la. [K. Hi rota et al., Chem. Abbstr. 1948, 42., 6090], which suggests that it assumes a protective function for the plant there. The extract from the dry distillation served as a remedy for various applications, and as a "bark tar" for the manufacture of the famous Russian leather.
Therapeutisch ganz besonders bedeutsam scheinen u nter den pentacycli- schen Triterpenverbindungen der Lupanreihe die Wi rkungen der Allobetulin- Monoester, deren G rundgerüst mit seinen fünf anellierten , trans-konfigu- rierten Cyclohexanringen und mit der polaren Hydroxylgruppe auf der einen und dem diagonal dazu stehenden Tetrahydrofuran ri ng auf der anderen Seite über einen ausgesprochen flachen Molekülbau verfügt. Dessen Zentralteil ("Core") wird in seiner Lipophilie durch die sen krecht stehenden Methylgruppen noch verstärkt, während gleichzeitig die hyd rophilen (polaren) Gruppen des Moleküls an entgegengesetzten Seiten des "Core"-Tei ls zu liegen kommen. Damit ist eine Bindung an relativ entfernt l iegende polare Gruppen des Rezeptors möglich geworden . Der Mittelteil dient demnach gewissermas- sen als "Spacer" ; er übernimmt die Haftu ng' an ausgedehnte lipophile Bezirke.
Among the pentacyclic triterpene compounds of the Lupan series, the effects of the allobetulin monoesters, whose backbone structure with its five fused, trans-configured cyclohexane rings and with the polar hydroxyl group on one side and the diagonal tetrahydrofuran appear to be of particular therapeutic importance ri ng on the other hand has an extremely flat molecular structure. Its central part ("core") is reinforced in its lipophilicity by the vertically standing methyl groups, while at the same time the hydrophilic (polar) groups of the molecule come to lie on opposite sides of the "core" part. This has made it possible to bind to relatively distant polar groups of the receptor. The central part therefore serves as a kind of "spacer"; he is responsible for extensive lipophilic areas.
3.2 APOPTOSE TEST mit Py6-Virus transformierten Mausfibroblasten3.2 APOPTOSE TEST with mouse fibroblasts transformed with Py6 virus
%-Zellvitalität% Cell vitality
Cytofluor 2300 System; Inkubation 72h, Alama blue; Platte CoStar 96 Behandlung: 46 h; Messung EX Filter 530/25; EM Filter 590/35, Sensitivity 2Cytofluor 2300 system; Incubation 72h, Alama blue; Plate CoStar 96 treatment: 46 h; Measurement EX filter 530/25; EM filter 590/35, sensitivity 2
Konzentrat Verdünnungen: 1:10*000 (100 ppm) bis 1:160*000 (6,6 ppm) Wirksubstanzgehalt: 1 ppm bis 67 ppbConcentrate dilutions: 1:10 * 000 (100 ppm) to 1: 160 * 000 (6.6 ppm) active substance content: 1 ppm to 67 ppb
Versuch durchgeführt beim STI, Basel, 15. bis 20. Dezember 1996 (File 201296-001/03).Test carried out at STI, Basel, December 15-20, 1996 (File 201296-001 / 03).
4.0 Prüfung auf Stimulierung der Immunresponse4.0 Test for stimulation of the immune response
Mit humanen Tumorzellen (Lungencarcinom LC 89)With human tumor cells (lung carcinoma LC 89)
cpm 27*360, Exposition 48 h
Tests durchgeführt von Dottoressa Anna-Rita Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica, Torino, 21.-24.3.1995cpm 27 * 360, exposure 48 h Tests performed by Dottoressa Anna-Rita Guarini, Università degli Studi di Torino, Clinica medica, Torino, March 21-24, 1995
5.0 Prüfung auf antivirale Wirkung.5.0 Antiviral test.
5.1 Prüfung auf Schutz- und antivirale Wirkung gegenüber sensitiven MT4- Zellen, infiziert mit dem AIDS-VIRUS HIV ("Human Immunodeficiency Virus"). Die Tests wurden am Institut für Infektionskrankheiten der Universität Turin vorgenommen (Direktor: Prof.Dott. P. GIOANNINI), und von Prof.Dott. Alberto BIGLINO, Leiter der Abteilung für Infektionskrankheiten am Ospedale di Asti, U.S.L. 19, unter Mitarbeit von Dotta. Brunella FORNO und Dotta. Annamaria POLLONO durchgeführt. Juni/Juli 1994 und März/April 1995.5.1 Testing for protection and antiviral activity against sensitive MT4 cells infected with the AIDS VIRUS HIV ("Human Immunodeficiency Virus"). The tests were carried out at the Institute of Infectious Diseases at the University of Turin (Director: Prof. Dott. P. GIOANNINI), and by Prof. Dott. Alberto BIGLINO, Head of the Infectious Diseases Department at Ospedale di Asti, U.S.L. 19, with the collaboration of Dotta. Brunella FORNO and Dotta. Annamaria POLLONO performed. June / July 1994 and March / April 1995.
5.2 Schutzeffekt auf die Wirtzellen (MT4-Lymphozyten)5.2 Protection effect on the host cells (MT4 lymphocytes)
MT4-Zellen (eine eternalisierte T-Zell-Linie, welche sehr empfindlich gegen den HIV zytopathogenen Effekt "CEP" ist) aus einer 24h-alten Kultur wurden bei einer Konzentration von 2x1θ5/ml suspendiert, in 1.2 ml aliquote Teile in Polypropylen Röhrchen aufgeteilt und mittels Zentrifugierung pelletiert. Die Pellets wurden dann entweder infiziert mit 200 μl einer Stammlösung von HIV III B Zellen (Titer: 600 CCIDso/ml) oder scheininfiziert mit reinem Medium, für 90 Min. bei 37°C inkubiert und anschliessend mit 1 ml reinem Medium versetzt, um die anfängliche Zellkonzentration wieder einzustellen und die HIV- Konzentration auf 100 CCIDδo/ml zu bringen. [CCIDso/ml = 50% cell -culture mfective d.ose].MT4 cells (an eternalized T cell line, which is very sensitive to the HIV cytopathogenic effect "CEP") from a 24-hour culture were suspended at a concentration of 2x1θ5 / ml, divided into 1.2 ml aliquots in polypropylene tubes and pelleted by centrifugation. The pellets were then either infected with 200 μl of a stock solution of HIV III B cells (titer: 600 CCIDso / ml) or sham-infected with pure medium, incubated for 90 min. At 37 ° C. and then mixed with 1 ml of pure medium to make up the adjust the initial cell concentration again and bring the HIV concentration to 100 CCIDδo / ml. [CCIDso / ml = 50% cell-culture mfective d.ose].
100 μl-Volumina der im Test eingesetzten MARIGENOL®-Konzentrate, verdünnt zu wässerigen Ultramikroemulsionen 10-3 und dann zusätzlich verdünnt von 10-3 auf 10-5 mit Medium RPMI 1640, wurden dreifach eingebracht in flachbödige Mikrotiterplatten mit 96 Löchern. In jedes Loch wurden 100 μl der HlV-infizierten oder der scheininfizierten MT4-Kultur eingegeben, um so 4 Versuchsreihen aufzustellen:100 μl volumes of the MARIGENOL® concentrates used in the test, diluted to aqueous ultramicroemulsions 10-3 and then additionally diluted from 10- 3 to 10-5 with RPMI 1640 medium, were introduced in triplicate into flat-bottomed microtiter plates with 96 holes. 100 μl of the HIV-infected or sham-infected MT4 culture were introduced into each well, in order to set up 4 test series:
- einfache Kultur (Kontrollen; Prüfung auf Lebensfähigkeit der MT4- simple culture (controls; testing the viability of the MT4
Zellen: 1θ5 Zellen/ml oder 2x1θ4/Loch)Cells: 1θ5 cells / ml or 2x1θ4 / well)
- Kultur + HIV (Virus CPE-Kontrolle; Konzentration 50 CCIDso/ml oder- Culture + HIV (virus CPE control; concentration 50 CCIDso / ml or
10 CCIDso/Loch)10 CCIDso / hole)
- Kultur + Wirksubstanz in Mikroemulsion- Culture + active substance in microemulsion
- Kultur + HIV + Wirksubstanz-Mikroemulsion in den- Culture + HIV + active substance microemulsion in the
Verdünnungen 10-3 bis 10-5 ( = 1'000 ppm, 100 ppm und 10 ppm, bzw. 10 ppm, 1 ppm und 0.1 ppm W.S. -Gehalt)
Inkubation der Kulturen bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 + 95% Luftfeuchte. 5 Tage nach der Infektion werden 100 μl der Überstandes in jedem Loch entfernt und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines Methyltetra- azolsalzes überprüft (MTT, Sigma, 25 μl/Loch in 5 mg/ml Lö-sung), in einem 2-h Inkubationstest, dem sich eine Solubilisierung mit 100 μl DMSO/Loch und die photometrische Ablesung auf optische Dichte bei 550 nm anschliesst. Restwerte der Zeil-Vitalität (Überlebenstest) werden ausgedrückt als %-Dif- ferenz gegenüber den HIV CPE-Kontrollen, das Mittel als Null gesetzt. Der gemessene Titer ist Dosis-abhängig. Er sinkt vom Anfangswert von 300% CCID50 auf 120% CCID50 und bis auf 2% CCID50.Dilutions 10- 3 to 10-5 (= 1,000 ppm, 100 ppm and 10 ppm, or 10 ppm, 1 ppm and 0.1 ppm water content) Incubate the cultures at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2 + 95% humidity. 5 days after the infection, 100 μl of the supernatant are removed in each well and the viability of the cells is checked using a methyl tetraazole salt (MTT, Sigma, 25 μl / well in 5 mg / ml solution) in a 2-hour incubation test This is followed by a solubilization with 100 μl DMSO / hole and the photometric reading on optical density at 550 nm. Residual values of the Zeil vitality (survival test) are expressed as a% difference compared to the HIV CPE controls, the mean as zero. The measured titer depends on the dose. It drops from the initial value of 300% CCID50 to 120% CCID50 and down to 2% CCID50.
Die beste Schutzwirkung auf die Wirtzellen wurde bislang mit einem 1%-igen Konzentrat von ß-Sitosteryl-Palmitat bei einer Konzentration von 10-4 (= 100 ppm Konzentrat in wässeriger Ultramikroemulsion) erzielt; sehr beachtenswert sind auch die Ergebnisse mit 1%-igen Konzentraten, enthaltend ß-Sito- steryl-Caproylat, ß-Sitosteryl-Laurat, ß-Sitosteryl-Arachidat oder ß-Sitosteryl- Behenat.The best protective effect on the host cells has so far been achieved with a 1% concentrate of β-sitosteryl palmitate at a concentration of 10-4 (= 100 ppm concentrate in aqueous ultramicroemulsion); The results with 1% concentrates containing ß-sitosteryl caproylate, ß-sitosteryl laurate, ß-sitosteryl arachidate or ß-sitosteryl behenate are also very noteworthy.
5.3 Wirkung auf die HlV-Infizierbarkeit. (Virulenz, direkte antivirale, bzw. viruzide Wirkung gegen die erworbene Immunschwäche, das humane "Aquired Immuno-Deficiency Syndrome: AIDS", bzw. gegen pathologisch wirksame Pri- onen).5.3 Effect on HIV infection. (Virulence, direct antiviral or virucidal activity against the acquired immunodeficiency, the human "Aquired Immuno-Deficiency Syndrome: AIDS" or against pathologically active prions).
Aliquote Mengen von 2 klinisch aufbereiteten Präparaten von Aids-Patienten ("Isolates" mit den Stämmen 21/4 und 4/5) wurden in vollständigem RPMI Medium bei einem Titer von 300 CCIDso/ml resuspendiert und während 3 h bei +4°C inkubiert mit einem MARIGENOL®-Konzentrat, als Mikroemulsionen in komplettem Medium auf die Konzentratioen 10-2 bis 10-5 verdünnt, und sodann zusammen mit einem "leeren" Trägerkonzentrat und mit reinem Medium allein auf ihre Wirkung geprüft.Aliquots of 2 clinically prepared preparations from AIDS patients ("isolates" with the strains 21/4 and 4/5) were resuspended in complete RPMI medium at a titer of 300 CCIDso / ml and incubated for 3 hours at + 4 ° C with a MARIGENOL® concentrate, diluted as microemulsions in complete medium to the concentrations 10-2 to 10-5, and then tested for their effect together with an "empty" carrier concentrate and with pure medium alone.
Nach der Vorinkubation wurde der HIV Titer mittels der CCIDso-Methode erfasst (CCID50 = cell c_ulture mfective d_ose 50 %). Von jeder der 6 Virus-Suspensionen wurden kurz zweifache Reihenverdünnungen angefertigt, wovon je 200 μl während 90 Min. mit MT4-Zellen Pellets inkubiert wurden, wie oben angegeben (Siehe 5.1). Am Schluss der Inkubierung werden die Pellets auf die ursprüngliche Zellkonzentration gebracht, indem man jeder Probe die nötige Menge Medium zufügt und sie anschliessend mit je 200 μl in 8 Löcher einer Mikrotiterplatte einbringt. Nach der Inkubation während 5 Tagen wird die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen, wie oben dargestellt. Der HIV Titer wird als reziproker Wert jener Verdünnung angegeben, welche 4 von
8 Proben einer Reihe (50%) infiziert. Der Inhalt eines Lochs gilt als infiziert, wenn die Ablesu ng der O.D. bei 550 nm tiefer ausfäl lt als das Mittel der 8 Kontoll-Löcher mi nus 2.8 Mal die Standard-Abweichung (untere 95% Vertrauensgrenze). Mit den Wirksubstanzen Ergosteryl-1 0-U ndecenoat und ß-Si- tosteryl-Palm itat lässt sich in-vitro als Folge der Vorbehandlung der Stämme eine sehr deutl iche Repl ikationshemmung und ei ne eigentliche Elimination feststellen . Ihre Abweh rwirkung gegen eine Infektion ist Dosis-abhängig. Gar keine Hemmung trat nach der Behandlung mit reinem Carrier-Konzentrat allein ein.
After the pre-incubation, the HIV titer was recorded using the CCIDso method (CCID50 = cell c_ulture mfective d_ose 50%). Two serial dilutions of each of the 6 virus suspensions were made briefly, of which 200 μl each were incubated with MT4 cell pellets for 90 minutes, as indicated above (see 5.1). At the end of the incubation, the pellets are brought to the original cell concentration by adding the required amount of medium to each sample and then introducing them into 8 holes of a microtiter plate with 200 μl each. After 5 days of incubation, the vitality of the cells is measured using the MTT test as shown above. The HIV titer is given as the reciprocal of the dilution which 4 of 8 samples from a series (50%) infected. The content of a hole is considered infected if the reading of the OD at 550 nm is lower than the mean of the 8 control holes minus 2.8 times the standard deviation (lower 95% confidence limit). With the active substances ergosteryl-1 0-u-decenoate and ß-sitosteryl-palm itate, a very clear inhibition of replication and actual elimination can be determined in vitro as a result of the pretreatment of the strains. Your defense against infection is dose-dependent. There was no inhibition at all after treatment with pure carrier concentrate alone.
Auswertu ng der Prüfergebnisse :Evaluation of the test results:
TESTSUBSTRAT RESTWERTE imTEST SUBSTRATE RESIDUAL in
HIV-TITER (CCID50)HIV TITER (CCID50)
(Mittelwert aus(Mean of
3 Kulturen)3 cultures)
HIV-Stamm 21 /4 ("Cli nical isolate") + 300HIV strain 21/4 (clinical isolate) + 300
Mediummedium
HIV-Stamm 4/5 ("Cli n ical i solate") + 200HIV strain 4/5 ("clinical i solate") + 200
Mediummedium
HIV (2 Stämme) + 200HIV (2 strains) + 200
CARRIER-KONZENTRAT (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)CARRIER CONCENTRATE (medium titer from 2 strains)
HIV (2 Stämme) + 25HIV (2 strains) + 25
ERGOSTERYL-1 0-U NDECENOAT (Mittlerer Titer ausERGOSTERYL-1 0-U NDECENOAT (medium titer off
KONZENTRAT 1 *000 ppm 2 Stämmen)CONCENTRATE 1 * 000 ppm 2 strains)
WIRKSUBSTANZ 10 ppmACTIVE SUBSTANCE 10 ppm
HIV (2 Stämme) + 2 ß-SITOSTERYL-PALM ITAT (Mittlerer Titer ausHIV (2 strains) + 2 ß-SITOSTERYL-PALM ITAT (mean titer from
KONZENTRAT 1 *000 ppm 2 Stämmen)CONCENTRATE 1 * 000 ppm 2 strains)
WIRKSUBSTANZ 10 ppmACTIVE SUBSTANCE 10 ppm
HIV (2 Stämme) + 50 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (Mittlerer Titer ausHIV (2 strains) + 50 ß-SITOSTERYL PALMITAT (medium titer from
KONZENTRAT 1 00 ppm 2 Stämmen)CONCENTRATE 1 00 ppm 2 strains)
WIRKSUBSTANZ 1 ppmACTIVE SUBSTANCE 1 ppm
HIV (2 Stämme) + 76 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (Mittlerer Titer ausHIV (2 strains) + 76 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (mean titer from
KONZENTRAT 50 ppm 2 Stämmen)CONCENTRATE 50 ppm 2 strains)
WIRKSUBSTANZ 0.5 ppmACTIVE SUBSTANCE 0.5 ppm
HIV (2 Stämme) + 120 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (Mittlerer Titer ausHIV (2 strains) + 120 ß-SITOSTERYL PALMITAT (mean titer from
KONZENTRAT 10 ppm 2 Stämmen)CONCENTRATE 10 ppm 2 strains)
WIRKSUBSTANZ 0.1 ppmACTIVE SUBSTANCE 0.1 ppm
Restwerte des H IV-1 Titers nach Vorinkubation während 3 h bei + 4°C
Für die angewandte Prüfmethodik vgl. u.a.: Rudi Pauwels, Erik De Clercq et al.: "Sensitive and rapid assay on MT-4 cells for detection of antiviral com- pounds against the AIDS virus". Rega Institute for Medical Research, Katho- lieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science PublishersResidual values of the H IV-1 titer after preincubation for 3 h at + 4 ° C For the test methodology used, cf. et al .: Rudi Pauwels, Erik De Clercq et al .: "Sensitive and rapid assay on MT-4 cells for detection of antiviral compounds against the AIDS virus". Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science Publishers
B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934/87/503.50); J.Virol. Methods 1987;B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934 / 87 / 503.50); J.Virol. Methods 1987;
16, 171-85.16, 171-85.
A. Bergamini, C.F. Perna, et al.: A tetrazolium-based colorimetric assay for quantification of HlV-induced cytopathogenicity in monocyte-macrophages exposed to macrophage colony-stimulating factor. J.Virol. Methods, 1992:A. Bergamini, C.F. Perna, et al .: A tetrazolium-based colorimetric assay for quantification of HIV-induced cytopathogenicity in monocyte-macrophages exposed to macrophage colony-stimulating factor. J.Virol. Methods, 1992:
40(3), 275-86.40 (3), 275-86.
Jay A. Levy: "HIV research: a need to focus on the right target", The Lancet, Vol.345, June 24, 1995, pp.1619-21.Jay A. Levy: "HIV research: a need to focus on the right target," The Lancet, Vol. 345, June 24, 1995, pp. 1619-21.
Molecular Cell Biology, second Edition, by J. Darneil, H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5: Viruses, Structure and Functions, pp.177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co.)Molecular Cell Biology, second edition, by J. Darneil, H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5: Viruses, Structure and Functions, pp.177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co.)
6.0 Andere Viren6.0 Other viruses
6.1 Cytomegalie-Virus (CMV)6.1 Cytomegalovirus (CMV)
Die Prüfung wurde mit humanen, embryonalen Lungenfibroblasten als Wirtzellen vorgenommen, die dann mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert wurden. Der Stamm "CVM umano AD169" wurde während 4h bei +4°C mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz Cι6:o-ß-Sitosterylester, formuliert als 1%-iges Konzentrat und dann verdünnt zu einer wässerigen Mikroemul- sion 10-3, 10-4 und 10-5, inkubiert und daraufhin als vorbehandelte Virus- Suspensionen auf Kulturen von menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten überimpft. Ansatz als konfluente Kultur mit 120*000 Zellen pro shell- vial. Die Infektion wurde mittels Zentrifugation während 45 Minuten bei 1500 rpm und bei RT vollzogen, worauf die Injektionssuspension entfernt und 1 ml Kulturmedium MEM mit 2% fötalem Kalbserum (wie bei der Anzucht) beigegeben wurde; die infizierten Zellen wurden sodann während 20h bei 37°C und unter 5%-iger Cθ2-Atmosphäre gehalten.The test was carried out with human, embryonic lung fibroblasts as host cells, which were then infected with the CMV strain AD 169. The strain "CVM umano AD169" was formulated as a 1% concentrate and then diluted to an aqueous microemulsion 10-3, 10 for 4 h at + 4 ° C. with different concentrations of the test substance C 6: o-ß-sitosterylester -4 and 10-5, incubated and then inoculated as pretreated virus suspensions on cultures of human, embryonic lung fibroblasts. Approach as a confluent culture with 120 * 000 cells per shell vial. The infection was carried out by centrifugation for 45 minutes at 1500 rpm and at RT, whereupon the injection suspension was removed and 1 ml of culture medium MEM with 2% fetal calf serum (as in the case of cultivation) was added; the infected cells were then kept at 37 ° C. and under a 5% CO 2 atmosphere for 20 hours.
Am Schluss der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen gesammelt, mit 2% Aceton-Methanol (2:1) fixiert und 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte mittels Immunofluoreszenz-Messung. Die Vials wurden mit dem monoklonalen Antikörper "Anti-P-72 CMV" (einem unmittelbaren Vorläuferprotein des CMV, das schon nach 6 h in den infizierten Zellen nachgewiesen werden kann) versetzt und während 30 Minuten bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert.
Es folgten 3 Waschungen in PBS, eine zweite Inkubation mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper IgG Ziege anti-IgG Maus. Es schliesst sich eine nochmalige Inkubation während 30 Minuten bei 37°C, wie oben angegeben , an, gefolgt von einer 3-maligen Waschung mit PBS . Die Proben werden dann mit 50% Glycerol i n PBS auf Glasträger montiert.At the end of the incubation, the medium was removed, the cells were collected, fixed with 2% acetone-methanol (2: 1) and washed 3 times with PBS. The quantification was carried out by means of immunofluorescence measurement. The vials were mixed with the monoclonal antibody "Anti-P-72 CMV" (an immediate precursor protein of the CMV, which can be detected in the infected cells after 6 hours) and incubated for 30 minutes at 37 ° C. in a moist atmosphere. This was followed by 3 washes in PBS, a second incubation with the fluorescence-labeled antibody IgG goat anti-IgG mouse. This is followed by another incubation for 30 minutes at 37 ° C., as indicated above, followed by a 3-wash with PBS. The samples are then mounted on glass slides with 50% glycerol in PBS.
Gleichzeitig wurden Kontrollen aufbereitet mit infizierten Zellen, die unter gleichen Bed ingu ngen , aber ohne Vorbehandlung mit der Prüfsubstanz aufbereitet worden sind.At the same time, controls were prepared with infected cells, which were prepared under the same conditions but without pretreatment with the test substance.
Gezählt werden die für das CMV-spezifische Antigen positiven Nuclei , mithilfe eines Fluoreszenz-Mikroskopes bei 25-facher Vergrösserung in wässeriger Phase.The nuclei positive for the CMV-specific antigen are counted using a fluorescence microscope at 25x magnification in the aqueous phase.
Es lässt sich ganz eindeutig eine Dosis-abhängige, direkt viruzide Wirkung feststellen. Das Virus ist nicht mehr virulent genug , um die empfindl ichen Wirtzellen zu infizieren .A dose-dependent, direct virucidal effect can be clearly determined. The virus is no longer virulent enough to infect the sensitive host cells.
ERGEBNIS :RESULT :
VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-PALMITA TESVIRUZIDE EFFECT OF ß-SITOSTERYL-PALMITA TES
(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)(formulated as MARIGENOL® CONCENTRATE)
Anzahl der "Nuclei positivi per P-72" (der infizierten Fibroblasten)Number of "Nuclei positivi per P-72" (the infected fibroblasts)
Prüfungen d urchgefü hrt von Dottoressa Rossäna CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä di Torino, J uli-November 1 995.Examinations carried out by Dottoressa Rossäna CAVALLO, Istituto di Microbiologia, Universita di Torino, J uli-November 1 995.
6.2 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)6.2 Herpes virus (herpes simplex, HSV)
Die antivirale/viruzide Wirkung einer wässerigen Mikroemulsion von geeigneten MARIGENOLΘ-Konzentraten wird mithilfe einer konfluenten Monolayer- Kultur von VERO-Zel len (d.h . "African green mon key kidney cells") festgestellt. Die Wirtzellen werden während 3 h bei 4°C mit der Mikroemulsion oder mit dem Ku lturmedi um allei n vorbehandelt und dann mit einer konstanten Dosis von 104 Herpes Simplex Viren , sog. "plaque forming units" = PFU infiziert. Dauer der Virus-Absorption 1 h. Dan n Zugabe von 2% Methylcellulose zur Verhinderu ng der Spreitung des Virus; es entsteht ei n elastisches Vlies
im Kulturmedium MEM + 2% Kalbserum . Anzüchtung wäh rend 48h , dann Fixieren und Färben der Monolayers mit 1 % Kristallviolett i n Methanol. Die antivirale Wirkung korreliert mit der Zahl von "pIaques" von lysierten Zellen , die sich im Kulturmedium MEM + 2% FCS noch bilden . Die Herabsetzung des viralen Titers wird im %-Verhältnis zu den Kontrollen (21 PIaques pro Zelle) angegeben.The antiviral / virucidal effect of an aqueous microemulsion of suitable MARIGENOLΘ concentrates is determined using a confluent monolayer culture from VERO cells (ie "African green mon key kidney cells"). The host cells are pretreated for 3 hours at 4 ° C. with the microemulsion or with the cooling medium alone and then infected with a constant dose of 104 herpes simplex viruses, so-called "plaque forming units" = PFU. Duration of virus absorption 1 h. Then addition of 2% methyl cellulose to prevent the spread of the virus; an elastic fleece is created in the culture medium MEM + 2% calf serum. Cultivation for 48 hours, then fixing and coloring the monolayers with 1% crystal violet in methanol. The antiviral effect correlates with the number of "pIaques" from lysed cells which still form in the culture medium MEM + 2% FCS. The reduction in viral titer is given as a percentage ratio to the controls (21 PIaques per cell).
Als Prüfsubstanzen wurden folgende Konzentrate i n wässeriger Verd ünnung (ausgehend von einer Mikroemulsion 1 : 100) eingesetzt:The following concentrates were used as test substances in an aqueous dilution (based on a microemulsion 1: 100):
1 % C2o:θ-ß-SITOSTERYL-ESTER1% C 2 o: θ -ß-SITOSTERYL-ESTER
1 % QUERCETIN-PENTA-10-U NDECENOAT1% QUERCETIN-PENTA-10-U NDECENOAT
1 % C16 :o-ß-SITOSTERYL-ESTER1% C 16: o-ß-SITOSTERYL-ESTER
1 % C 2 :o-ERGOSTERYL-ESTER1% C 2: o-ERGOSTERYL ESTER
Auswertung :Evaluation:
Die Ergebnisse zeigen eine deutliche direkte Wirkung auf die HS-Virus- infizierten VERO-Wirtzel len. Bei einer Konzentration von 10-4 ß-Sitosterylara- chidat erscheint die Zah l der PIaques, im Verg leich mit den Kontrollen, umThe results show a clear direct effect on the VERO Wirtz cells infected with HS virus. At a concentration of 10-4 ß-sitosteryl arachidate, the number of PIaques appears in comparison to the controls
76% herabgesetzt. Der HSV-Titer ist deutlich vermindert.76% reduced. The HSV titer is significantly reduced.
Bei dieser Konzentration der geprüften S ubstanzen findet auch keineWith this concentration of the tested substances, none is found
Lysierung von eternalisierten Lym phozyten vom Typus MT-4, noch der VERO-Lysis of eternalized lymphocytes of the MT-4 type, still the VERO-
Zellen selber statt. (Siehe oben unter 5.0)Cells themselves instead. (See above under 5.0)
Prüfungen durchgefü hrt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä deg li Studi d i Torino, Juli 1995.Tests carried out by Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Microbiologia, Universita deg li Studi d i Torino, July 1995.
6.3 Herpes-Virus (Herpes Sim plex, HSV)6.3 Herpes virus (Herpes Sim plex, HSV)
Wiederholu ng der Prüfung mit Fluoreszenz-Markierung wie beim CMV-Ver- such. Vg l. oben. Ergebnis:
VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-ARACHIDATESRepetition of the test with fluorescence labeling as in the CMV test. See. above. Result: VIRUCID EFFECT OF ß-SITOSTERYL ARACHIDATE
(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)(formulated as MARIGENOL® CONCENTRATE)
6.4 Hepatitis B Virus (HBV)6.4 Hepatitis B Virus (HBV)
Die Tests wurden mit immortalisierten Leberhämatom-Zellen vorgenommen, die nach Infektion mit dem Hepatitis B Virus die beiden Antigene Hbs Ag (ein "surface antigen" aus der äusseren Hülle des Virus) und Hbe Ag (ein "core antigen" aus dem Kern des DNA Virus) sezernieren. Orientierende Versuche in-vitro wurden mit je einem 1%-igen Konzentrat der drei Prüfsubstanzen ß- Sitosteryl-Palmitat, ß-Sitosteryl-Arachidat und Ergosteryl-Isovalerat von Prof. Dott. Antonio Ponzetto und von Dotta Rossana Cavallo, Universitä degli Studi di Torino, durchgeführt .The tests were carried out with immortalized liver hematoma cells which, after infection with the hepatitis B virus, the two antigens Hbs Ag (a "surface antigen" from the outer shell of the virus) and Hbe Ag (a "core antigen" from the core of the DNA) Virus) secrete. Orientative tests in vitro were carried out with a 1% concentrate of the three test substances ß-sitosteryl palmitate, ß-sitosteryl arachidate and ergosteryl isovalerate by Prof. Dott. Antonio Ponzetto and performed by Dotta Rossana Cavallo, Università degli Studi di Torino.
Bei einer Verdünnung von 10-5 und Inkubation über 72h zeigte bislang das ß- Sitosteryl-Palmitat Konzentrat die stärkste Wirksamkeit. Die Ergebnisse sind deutlich Dosis-abhängig und variieren auch mit der Inkubationszeit. Besonders ausgeprägt tritt die Wirkung beim Oberflächen-Antigen Hbs Ag in Erscheinung.With a dilution of 10-5 and incubation for 72 hours, the ß-sitosteryl palmitate concentrate has so far shown the greatest effectiveness. The results are clearly dose-dependent and also vary with the incubation period. The effect of the surface antigen Hbs Ag is particularly pronounced.
HEPATITIS B VirusHEPATITIS B virus
Sezernierte AntigeneSecreted antigens
7.0 Antiparasitäre Wirkungen 7.0 Antiparasitic effects
Orientierende Prüfungen wurden am Schweizerischen Tropeninstitut Basel (PD. Dr. Ronald Kaminsky und Frau Yvonne Grether) durchgefü hrt. Es wurde in ersten Testrei hen untersucht, ob signifi kante Ergebnisse in-vitro zu verzeichnen seien gegen Trypanosoma rhodesiense (den Erreger von Schlafkrankheit), gegen Trypanosoma cruzi (den Erreger der Chagas-Kran kheit) und gegen Leishmania donovani (den Erreger von Leishmaniose). Eine beachtliche antiparasitäre Wirksam keit Hess sich vorab für ausgewäh lte Cholestanyl- und Bioflavonoid-Ester-Konzentrate, sowie für das Z-Gly-Phe- D3-Esterkonzentrat nachweisen , bei Konzentrationen, welche keine basale zy- totoxische Wirku ng auf mu rine Muskelzellen oder Makrophagen erzeugen. Sie ist spezifisch gegen Leishmania donovani.Orientative examinations were carried out at the Swiss Tropical Institute Basel (PD. Dr. Ronald Kaminsky and Ms. Yvonne Grether). In the first series of tests, it was examined whether significant results could be reported in vitro against Trypanosoma rhodesiense (the causative agent of sleeping sickness), against Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas disease) and against Leishmania donovani (the causative agent of leishmaniasis). . Significant antiparasitic activity Hess has been demonstrated in advance for selected cholestanyl and bioflavonoid ester concentrates, as well as for the Z-Gly-Phe-D 3 ester concentrate, at concentrations that do not have a basic cytotoxic effect on murine muscle cells or generate macrophages. It is specific against Leishmania donovani.
Vorläufige Ergebn isse :Preliminary results :
SWISS TROPICAL I NSTITUTE, BASEL In-vitro assays, WHO-screeni ng as SOPSWISS TROPICAL I NSTITUTE, BASEL In-vitro assays, WHO screening as SOP
All values as: μg/mlAll values as: μg / ml
Legend* r = active on T.b.rhodesinense d = active on L. donovani t = cytotoxic on mammalian cells c = active on T. cruzi - = i nactive or low activityLegend * r = active on T.b.rhodesinense d = active on L. donovani t = cytotoxic on mammalian cells c = active on T. cruzi - = i nactive or low activity
MIC = minimum inhibitory concentration IC50 = 50% killi ng rate concentration
MIC = minimum inhibitory concentration IC50 = 50% killi ng rate concentration
EP 1 1% Konzentrat CHOLESTANYL-ISOVALERATEP 1 1% concentrate CHOLESTANYL-ISOVALERAT
EP 2 1% Konzentrat CHOLESTANYL-10-UNDECENOATEP 2 1% concentrate CHOLESTANYL-10-UNDECENOAT
EP 3 1% Konzentrat CHOLESTANYL-PALMITATEP 3 1% concentrate CHOLESTANYL-PALMITAT
EP 4 1% Konzentrat CHOLESTERYL-n-VALERATEP 4 1% concentrate CHOLESTERYL-n-VALERAT
EP 5 1% Konzentrat CHOLESTERYL-LAURATEP 5 1% concentrate CHOLESTERYL-LAURAT
EP 6 1% Konzentrat CHOLESTERYL-PALMITATEP 6 1% concentrate CHOLESTERYL-PALMITAT
EP 7 1% Konzentrat SITOSTERYL-LAURATEP 7 1% concentrate SITOSTERYL-LAURAT
EP 8 1%-Konzentrat ß-SITOSTERYL-PALMITATEP 8 1% concentrate ß-SITOSTERYL-PALMITAT
EP 9 1%-Konzentrat ß-SITOSTERYL-ARACHIDATEP 9 1% concentrate ß-SITOSTERYL ARACHIDATE
EP 10 1%-Konzentrat ß-SITOSTERYL-BEHENATEP 10 1% concentrate ß-SITOSTERYL-BEHENAT
EP 11 1%-Konzentrat STIGMASTERYL-LAURAT
EP 12 1 %-Konzentrat STIGMASTERYL-PALMITATEP 11 1% concentrate STIGMASTERYL-LAURAT EP 12 1% concentrate STIGMASTERYL PALMITAT
EP 13 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-n-VALERATEP 13 1% concentrate ERGOSTERYL-n-VALERAT
EP 14 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-LAURATEP 14 1% concentrate ERGOSTERYL-LAURAT
EP 15 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-PALMITATEP 15 1% concentrate ERGOSTERYL PALMITAT
EP 16 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-BEHENATEP 16 1% concentrate ERGOSTERYL BEHENATE
1 N 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-PALMITAT1 N 1% concentrate ß-SITOSTERYL-PALMITAT
2N 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-PALMITAT2N 1% concentrate ß-SITOSTERYL-PALMITAT
TO 100% Cι ι : ι -CITRONELLYL-ESTER (COEMULGATOR)TO 100% Cι ι : -CITRONELLYL-ESTER (COEMULGATOR)
T1 1 00% COEMULGATOR + TENSIDET1 1 00% COEMULGATOR + TENSIDE
T10 1 %-Konzentrat ß-S ITOSTERYL-PALMITATT10 1% concentrate ß-S ITOSTERYL-PALMITAT
T1 1 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-ARACHIDATT1 1 1% concentrate ß-SITOSTERYL ARACHIDATE
T12 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-LAURATT12 1% concentrate ERGOSTERYL-LAURAT
Werden die Messwerte der Konzentrate auf W.S. -Gehalt bezogen, sind sie um den Faktor 100 kleiner.Are the measured values of the concentrates on W.S. - In terms of content, they are 100 times smaller.
8.0 Allgemeine Verträglichkeit der MARIGENOL®Präparate8.0 General compatibility of MARIGENOL® preparations
8.1 Toxizität i n-vivo8.1 Toxicity in vivo
Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mäusen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Während 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i.v. von je 0,250 ml wässeriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiologischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grünwald-G iemsa. Zeit der Behandlung : 28 Tg. Blutanalyse : nach der letzten InjektionTest with normal 8-week female BALB / c nAncr (H-2d) mice supplied by Charles River Laboratories, Calco (Italy). IV injection twice daily for 4 weeks. of 0.250 ml each of aqueous microemulsion, formed from the specified concentrates, or with physiological buffer for the controls. Coloring with May Grünwald-G iemsa. Treatment time: 28 days. Blood analysis: after the last injection
Anzahl Tiere: 1 3 Gruppen zu 5 je TierenNumber of animals: 1 3 groups of 5 per animal
RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede zu den Kontrollen auf. Es konnte zudem keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche.RESULT: There are no significant differences from the controls. In addition, no toxicity of the concentrates to the leukocyte population was found. The erythrocyte population also showed normal values. All animals were and remained healthy until the end of the experiments.
Durchführu ng der Proben : Prof. Dott. Guido FORNI, Dotta stefania VAI, Universitä di Torino, Dipartimento di Scienze Cli niche e Biologiche, Ospe- dale San Luigi Gonzaga, I-10O43 ORBASSANO (TO).
8.2 Untersuchung des BlutbildesCarrying out the samples: Prof. Dott. Guido FORNI, Dotta stefania VAI, University of Torino, Dipartimento di Scienze Cli niche e Biologiche, Ospedale San Luigi Gonzaga, I-10O43 ORBASSANO (TO). 8.2 Examination of the blood picture
Effekt auf normale humane LYMPHOMONOCYTENEffect on normal human LYMPHOMONOCYTEN
Zel len : normale humane phagozytische weisse BlutzellenCells: normal human phagocytic white blood cells
(Macrophagen); 2 x 105 Zellen pro well(Macrophages); 2 x 10 5 cells per well
Stimulation der Kontrol len : 1 % PHA (Phytohemaggl utinin)Control stimulation: 1% PHA (Phytohemaggl utinin)
Test 1 : 2 %-Konzentrat enthaltend Cι2:o-Cholesteryl EsterTest 1: 2% concentrate containing Cι 2: o-cholesteryl ester
Test 2 : 2 %-Konzentrat enthaltend Ci6:o-Ergosteryl EsterTest 2: 2% concentrate containing Ci 6 : o-ergosteryl ester
Test 3 : 2 %-Konzentrat enthaltend C5 :0-Cholecalciferyl EsterTest 3: 2% concentrate containing C 5: 0 cholecalciferyl ester
(Vitamin D3-iso-Valerate) Tests du rchgefüh rt von Dottoressa Anna-Rita G UARINI, Universitä degli Studi di Torino, Clin ica medica, 1-10'1 26 TORINO, 21 . bis 24. März 1994.
(Vitamin D3-iso-valerate) Tests carried out by Dottoressa Anna-Rita G UARINI, Universitadegli Studi di Torino, Clin ica medica, 1-10'1 26 TORINO, 21. until March 24, 1994.