WO1999013330A2 - Aufreinigung von substanzen aus einer biologischen probe - Google Patents

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Helmut Lenz
Jochen Peter
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Definitions

  • the invention relates to a method for the preparative purification of a target substance from a biological sample by immobilizing the target substance on a solid phase via a high-affinity binding pair and subsequent elution by adding a partner of the binding pair in free form. Furthermore, reagent kits for performing the method are disclosed.
  • the immunosorptive purification of biological substances is a long-known method that allows the efficient isolation of such substances from complex biological materials such as serum, urine or cell disruption (Eveleigh and Levy, J. Solid-phase Biochem. 2 (1 977), 45- 78; Cooper, Biochemical Working Methods, pp. 222-241 (1 981), Walterde Gruyter, Berlin; Pharmacia Fine Chemicals, Affinity Chromatography: Principles and Methods (1 983), pp 92-95; Wawrazynczak and Cumber, in: "Immunochemical Protocols ", MM Manson HRSG, Methods in Molecular Biology 10, Chapter 32 (1,992), Humana Press, Totowa, NJ USA).
  • the desorption of the substances bound to the immobilized antibodies is usually carried out using non-specific methods, e.g. by adding buffers with low ( ⁇ 2.5) or high (> 10) pH, chaotropic reagents such as urea or guanidine hydrochloride, organic solvents or detergents to the elution buffer.
  • Hapten analogue or for the isolation of proteins by displacement with a low-molecular peptide.
  • specific desorption processes are, however, the exception in immunosorptive procedures because they can only be carried out with a very limited number of substances.
  • the unspecific desorption methods described above are therefore widely used, especially elution at low pH, such as with 1 M propionic acid.
  • the prostate-specific antigen is present in a concentration of approx. 1 to 1,500 ng / ml in human serum, while other proteins such as human serum albumin (HSA) are present in a 1 0 in approx. 70 mg / ml 5 to 10 7 times higher concentration are present. Since these proteins bind nonspecifically to the immunoadsorber, when it comes to the immunosorptive purification of a substance, such as PSA, which is present in very low concentrations, it occurs that the desired substance makes up only a very small proportion of the total eluted protein in the case of nonspecific desorption and, for example, when the eluate is separated by gel electrophoresis cannot be identified at all (see e.g. Fig.
  • the method should take advantage of the specific immunosorption, while avoiding the disadvantages of non-specific desorption.
  • the method according to the invention is intended to enable elution in an essentially neutral pH range in order to avoid damage to the target substances combined with a loss of immunoreactivity and / or biological activity due to extreme pH values.
  • This object is achieved by a method for purifying a
  • Target substance from a sample comprising the steps: (a) adsorbing the target substance on a solid phase, the binding of the target substance to the solid phase being the interaction between a first and a second partner of a high-affinity binding pair. res, and wherein the first partner of the binding pair is directly or indirectly bound to the target substance and wherein the second partner of the binding pair is bound to the solid phase,
  • a first preferred embodiment of the invention is a method for purifying a target substance from a sample, comprising the steps:
  • R is bound to the solid phase via an immobilized reactant R 2 , which contains a group comprising the second partner of the high-affinity binding pair,
  • a reactant R which is specific to the target substance to be purified and which is coupled to a first partner of a high-affinity binding pair, for example a hapten
  • a second reactant R 2 which is specifically bindable with the first binding partner and which contains the second partner of the binding pair, for example an anti-hapten antibody, is used has such an affinity for the first binding partner that the reactant R- can be efficiently displaced by the first binding partner in free form or by a derivative thereof.
  • the complex from the reactant R and the substance to be detected can be eluted from the solid phase very specifically and free of unspecifically adsorbed impurities.
  • the principle and result of this cleaning method and a comparison with a non-specific acid elution is shown in Figure 2 using the example of the isolation of PSA and a PSA / ACT complex from human serum.
  • the cleaning principle according to the invention can also be used for the direct isolation of a substance if it can be provided with a first binding partner and its presence does not interfere with the further analysis or use of this substance.
  • Corresponding examples are shown for the isolation of double-labeled DNA and of fusion proteins.
  • a second preferred embodiment of the invention thus relates to a method for purifying a target substance, to which a first partner of a high-affinity binding pair is bound, from a sample, comprising the steps:
  • Binding pair is adsorbed on the solid phase
  • the released immune complex is bound to a second polystyrene particle, which contains a receptor directed against the haptenized antibody, and determined quantitatively via the enzymatic activity.
  • the present invention is not aimed at removing a labeled reagent present in the measuring medium, but rather at the accompanying substances present in a biological sample in addition to a substance to be purified in a very large excess. It was therefore not possible to estimate beforehand whether the desorption step described by Ishikawa could even be used for the selective removal of these accompanying substances.
  • the method according to the invention preferably involves a direct analysis of the substance detached from the immunoadsorber and not, as in Ishikawa, a further cleaning step comprising a specific binding to a further solid phase. Surprisingly, it was found that such a further binding is not necessary for efficient cleaning, but that an excellent separation of accompanying substances can already be observed in the solution specifically eluted from the first solid phase.
  • the method according to the invention can be used for all cleaning problems in which substances, in particular biological molecules, which are predominantly present in very low concentrations, from complex biological samples such as body fluids, for example whole blood, plasma, serum, urine, sputum etc., from animal or vegetable Tissues, soil samples or cell extracts or from molecular biological reaction mixtures must be cleaned.
  • the substance to be purified is a biomolecule, that is, an ingredient that occurs in a biological sample. Examples of such substances are cells, cell fractions, cell organelles, viral particles, polypeptides, peptides, glycoproteins, lipoproteins, polysaccharides, nucleic acids, hormones, metabolites, neutransmitters and mediators.
  • Preferred examples of substances to be purified are polypeptides and nucleic acids such as DNA or RNA molecules.
  • a target substance is purified which does not have to be coupled to a first partner of a high-affinity binding pair.
  • This embodiment of the method according to the invention is particularly suitable for purifying unmodified target substances that occur naturally in biological samples.
  • a target substance which is already coupled to a first partner of a high-affinity binding pair is purified.
  • This embodiment of the method is in particular for the purification of target substances modified with corresponding groups from molecular biological reaction batches, e.g. Hapten-modified nucleic acids from amplification batches or suitable for the purification of recombinant polypeptides.
  • the solid phase used in the process according to the invention can contain any carrier materials known from the prior art. Particulate solid phases such as magnetic microparticles are preferred.
  • the reactant R used in the first embodiment is preferably a conjugate comprising at least one group capable of binding specifically to the substance to be purified and at least one group comprising the first partner of a high-affinity binding pair.
  • R preferably contains only one group of the first binding partner.
  • the specifically binding Depending on the type of substance to be detected, this group can be an antibody directed against the substance, a nucleic acid complementary to the substance to be detected, a lectin or a biological receptor that specifically binds to the substance to be detected.
  • the specifically bindable group is preferably an antibody (this term also includes antibody fragments or antibody derivatives) or a nucleic acid (wherein this term also includes nucleic acid analogs such as peptidic nucleic acids).
  • An essential feature of the method according to the invention is that it is possible to elute the target substance bound to the solid phase by contacting the solid phase with the first partner of the binding pair or an analogue thereof in free or soluble form.
  • the partners of the binding pair are preferably selected so that this elution can take place under physiological pH conditions, for example at a pH range from 5 to 8. It is further preferred that the partners of the binding pair are selected such that the affinity constant between the first and the second partner of the binding pair is in the range from 10 6 l / mol to 10 10 l / mol, so that a high affinity binding takes place.
  • the binding between the first and second binding partners should have sufficient reversibility.
  • the first partner of the binding pair is preferably a low molecular weight substance with a molecular weight of preferably up to a maximum of 4 kD, particularly preferably up to a maximum of 2 kD.
  • a hapten group in which case an antibody directed against the hapten group is used as the second partner of the binding pair.
  • suitable haptens are molecules which are able to elicit an immune response in an organism which leads to the production of specific anti-hapten antibodies.
  • haptens are steroids such as progesterone or synthetic Derivatives thereof, cardenolides such as digoxin or digoxigenin, fluorescent dyes such as fluorescein or derivatives thereof, hormones such as thyroid hormones, for example T3 or T4, medicaments such as barbiturates or theophylline, metal complexes, in particular metal complexes which are capable of electrochemiluminescence, such as ruthenium pyridium or rhodium ( ) 3 - Complexes or other compounds such as dinitrophenol or diphenylhydantoin.
  • steroids such as progesterone or synthetic Derivatives thereof
  • cardenolides such as digoxin or digoxigenin
  • fluorescent dyes such as fluorescein or derivatives thereof
  • hormones such as thyroid hormones, for example T3 or T4
  • medicaments such as barbiturates or theophylline
  • metal complexes in particular metal complexes which are capable of electrochemiluminescence, such as ruthenium
  • Substances against which highly specific antibodies already exist such as digoxigenin, fluorescein, dinitrophenol, thyroid hormones, ruthenium or rhodium complexes, theophylline, barbiturates or diphenylhydantoin are particularly preferred.
  • a sugar in particular a mono- or oligosaccharide, can be used as the first reactant of the binding pair, and a lectin can be used as the second partner of the binding pair.
  • a sugar containing a mannose group and concanavaline A can be used as the second binding partner as the first binding partner.
  • a low-molecular receptor ligand can be used as the first partner of the binding pair and a biological receptor as the second partner of the binding pair.
  • binding pairs are acetylcholine / acetylcholine receptor or histamine / histamine receptor.
  • a peptide epitope is used as the first partner of the binding pair and an antibody directed against the peptide epitope is used as the second partner of the binding pair.
  • a peptide epitope forming the first partner of the binding pair can, on the one hand, be bound to the reactant R- or to the target sequence in a known manner by coupling in the form of an activated derivative, for example an active ester, analogously to a hapten, sugar or receptor ligand.
  • the reactant R or the target substance is a nucleic acid
  • the first binding partner can also be carried out by an enzymatic reaction be introduced, for example by using labeled primers, labeled oligonucleotide building blocks or / and adding labeled nucleic acid fragments.
  • the reactant R, or the target substance is a peptide or polypeptide
  • a peptide epitope as the first partner of the binding pair can also be introduced into R, or into the target substance by genetic modification.
  • the target substance or the complex of R- and the target substance is eluted from the solid phase by contacting the solid phase with the first partner of the binding pair or an analogue thereof in free or soluble form. Elution which is as quantitative as possible can be achieved if the free first partner of the binding pair is used in a molar excess compared to the first partner of the binding pair bound to R 1 . This molar excess is preferably in the range of at least 50 times, particularly preferably 100-500 times.
  • the free first partner of the binding pair is used in the form of a conjugate, comprising a carrier molecule and several molecules of the first partner of the binding pair coupled to it.
  • suitable carrier molecules are polypeptides such as polylysine, albumin, non-specific antibodies etc. or polysaccharides such as dextrins.
  • Several molecules of the first partner of the binding pair can be attached to this carrier molecule by known methods, e.g. be coupled using activated derivatives of the first partner.
  • conjugates are polyhaptenylated carrier molecules such as polylysine digoxigenin, bovine serum albumin digoxigenin etc.
  • Yet another way to improve elution from the solid phase is to use an analogue of the first partner of the binding pair bound to R, as the free first partner of the binding pair, this free analogue having a higher binding affinity to the second partner of the binding pair as the first partner of the binding pair bound to R. or the target substance.
  • the first partner of the binding pair is a hapten
  • a modified hapten can be used as an analog to which the second partner of the binding pair has a higher affinity than to the bound hapten. So you can use digoxigenin as a bound hapten group, an anti-digoxin antibody as a binding partner and digoxin as a free binding partner.
  • Analogous examples are the use of nitrophenol as bound hapten, an anti-dinitrophenol antibody and dinitrophenol as free hapten, the use of T3 as bound hapten, anti-T4 antibody and free T4 or the use of rhodium-bispyridyl 3 complex as bound hapten, an anti-rhodium (bispyridyl) 3 complex antibody and rhodium (bispyridyl) 3 complex as free hapten.
  • Elution can also be improved if the same group is used as a free and bound binding partner, but each with a different linker.
  • a group of hapten linker 1 an antibody directed against hapten linker 2 and a group of hapten linker 2 can be used as the bound partner.
  • a first peptide sequence can be used as the bound partner
  • an antibody directed against a second peptide sequence which differs from the first sequence by an amino acid and the second peptide sequence can be used as the free binding partner.
  • the target substance After elution from the solid phase, the target substance can be subjected to analysis, for example by HPLC, gel electrophoresis or mass spectroscopy. If necessary, further purification steps can be carried out, for example releasing the substance to be purified from the complex with the reactant R .. In addition, undesired portions of the substance to be purified can be split off. In the case of fusion proteins, for example, undesirable components can be table cleavage can be separated with enterokinase, factor Xa or IgA protease.
  • a specific application of the method according to the invention is the purification of recombinant peptides or polypeptides, e.g. more eukaryotic
  • Peptides or polypeptides found in bacterial cells e.g. are produced in E.coli cells. It is possible to produce fusion polypeptides which contain a first domain, which is specifically capable of binding with the reactant R, and a second desired target domain. A protease cleavage site can be introduced between the first and second domains, so that the
  • Fusion polypeptide proteolytic after desorption e.g. can be cleaved with an immobilized protease.
  • Fusion polypeptide can be separated in a further step by binding to an immobilized reactant, so that the desired
  • Target domain is obtained in pure form.
  • the target substance e.g. a target peptide or polypeptide domain without cleavage of the isolation complex R-. and the first domain
  • another detection group that is structurally different from the first partner of the binding pair can be introduced on R.
  • binding to a solid phase can take place, e.g. via the system biotin / streptavidin or hapten / anti-hapten antibody, or a conjugate for detection, e.g. Biotin / streptavidin enzyme (e.g. peroxidase or alkaline phosphatase), hapten / anti-hapten antibody enzyme, can be attached.
  • a directly detectable labeling group can also be used as the detection group, e.g. a luminescent metal complex or a fluorescent dye.
  • Yet another object of the invention is a reagent kit for purifying a target substance from a sample, comprising: (a) a solid phase,
  • a reactant R 2 which contains a group comprising the second partner of the high-affinity binding pair, wherein R 2 is bound to the solid phase or contains a group capable of binding to the solid phase, and (d) the first partner of the binding pair or an analogue thereof in free form.
  • a further reagent kit comprising:
  • Components (a), (b) and (c) can be present as a single reagent or as several separate reagents.
  • Component (d) is separate from the other components.
  • the components of the reagent kit can be in any form, for example as packaged units, lyophilisates, solutions, suspensions. ions etc.
  • the reagent kit is preferably used in a process as described above.
  • Fig. 1 (Upper trace) Normal MALDI mass spectrum of human blood to which 0.05 mg / ml of a snake peptide (myotoxin a) was added. (Middle and lower traces) MALDI spectra after binding of the snake peptide to an anti
  • Myotoxin a antibody and elution with the acidic MALDI matrix In the lower lane, in which only 0.00002 mg / ml myotoxin a had been added, the numerous non-specifically bound peptides and proteins from the blood, eluted with the acid matrix, can be clearly seen. give significantly higher signals than myotoxin a.
  • Prostate carcinoma plasma immunosorbed PSA and PSA / ACT complex after detachment with various eluents A plasma sample without PSA and PSA / ACT was carried as a control.
  • Fig. 3 Result of agarose gel electrophoresis of DIG-labeled PCR products after detachment with digoxigenin-lysine Experimental examples
  • the immunosorption is carried out on streptavidin-coated magnetic beads.
  • 1 ml of a bead suspension (0.72 mg / ml) per sample is used.
  • the beads are washed three times with 1 ml of washing solution (phosphate-buffered saline solution PBS, pH 7.2) and the supernatant is removed with a magnet after the beads have been separated.
  • washing solution phosphate-buffered saline solution PBS, pH 7.2
  • Anti-PSA-IgG digoxigenylated 50 ⁇ g / ml
  • the batches are shaken for 60 min at room temperature and the supernatants are lyophilized after removal of the beads in a Speed Vac.
  • the lyophilisates are then taken up in 10 ⁇ l of water and used for SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, the result of which is shown in FIG. 3.
  • Immunosorptive isolation of PSA from human serum was carried out in accordance with the procedure described in Example 1. Instead of digoxigenin, ruthenium (bispyridyl) 3 complex and rhodium (bispyridyl) 3 complex and corresponding anti-hapten antibodies were used as haptens. Elution was carried out by adding the free metal complexes.
  • a fusion protein is constructed consisting of a protein 1 or peptide 1, against which a digoxigenylated antibody is available, and the desired target protein 2.
  • cell disruption is carried out.
  • the homogenate is shaken with the magnetic streptavidin beads described above, which are loaded with MAK anti-digoxigenin, with stirring at room temperature for one hour.
  • the supernatant contains the pure complex of the digoxigenylated antibody and the fusion protein.
  • this enzyme can be used to cleave the fusion protein.
  • the pure target protein 2 is present in the solution.
  • the digoxigenylated antibody can carry a further detection group, for example a hapten other than digoxigenin.
  • a further detection group for example a hapten other than digoxigenin.
  • a 397 bp PCR fragment (0.1 pmol / ⁇ l) of the chloramphenicol gene (CAT) is used as DNA;
  • Primer 1 (TAT CCG GCC TTT ATT CAC ATT CTT G) is 5 'digoxigenin, primer 2 (CCA GCG GCA TCA GCA CCT T) 5' biotin-labeled.
  • Each ⁇ O ⁇ l 1: 10000 in buffer 100 mmol / l sodium phosphate pH 7.5, 50 mmol / l NaCl, 0.5 mmol / l EDTA, 1% casein, 0, 1% Tween 20 and 0.02% MIT) with 0.1 mg / ml of herring DNA-diluted CAT fragment are bound to AD-MTP in 8 double batches for 30 min at room temperature with shaking. It is washed ten times with 250 ⁇ l washing buffer (PBS with 0.1% Tween).
  • the elution is carried out by applying 50 ⁇ l of finished PCR mixture (PCR master mix with 0.4 pmol / ⁇ l of primers 1 and 2) with 50% to 0.78% content of dig-lysine-saturated, distilled water (1: 2 dilution series) at 37 ° C, 1 h with shaking. Buffer without dig-lysine is used as negative control and a solution with 50% dig-lysine content and 1 ⁇ l CAT fragment diluted 1: 200 is used as positive control.
  • DNA conjugate dilution buffer 100 mmol / l sodium phosphate pH 7.5, 50 mmol / l NaCl, 0.5 mmol / l EDTA, 1% casein, 0.1% Tween 20 and CAT fragment (Genbank ACC.NO.X65321) diluted with 0.02% MIT (methylisothiazolone) is bound to AD microtiter plates in 7 duplicate batches and an empty sample without CAT for 30 min at room temperature with shaking, and is washed five times with 250 ⁇ l wash buffer .
  • Elution is carried out by adding 100 l of PBS with 10% to 0.001% of dig-lysine-saturated, double-distilled water (1:10 dilution series) and 100% of control without dig-lysine at 37 ° C. for 1 h while shaking.
  • the evaluation of the ELISA data shows a specific desorption of the Dig-labeled DNA.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer biologischen Probe durch Immobilisierung der Zielsubstanz an einer Festphase über ein hochaffines Bindepaar und anschließende Elution durch Zugabe eines Partners des Bindepaares in freier Form. Weiterhin werden Reagenzienkits zur Duchführung des Verfahrens offenbart.

Description

Aufreinigung von Substanzen aus einer biologischen Probe
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur präparativen Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer biologischen Probe durch Immobilisierung der Zielsubstanz an einer Festphase über ein hochaffines Bindepaar und anschließende Elution durch Zugabe eines Partners des Bindepaares in freier Form. Weiterhin werden Reagenzienkits zur Durchführung des Verfahrens offenbart.
Die immunsorptive Reinigung von biologischen Substanzen, z.B. Makromolekülen wie etwa Proteinen, ist eine seit langem bekannte Methode, welche die effiziente Isolierung solcher Substanzen aus komplexen biologischen Materialien wie etwa Serum, Urin oder Zellaufschlüssen erlaubt (Eveleigh und Levy, J. Solid-phase Biochem. 2 (1 977), 45-78; Cooper, Biochemische Arbeitsmethoden, pp. 222-241 (1 981 ), Walterde Gruyter, Berlin; Pharmacia Fine Chemicals, Affinity Chromatography: Principles und Methods (1 983), pp 92-95; Wawrazynczak und Cumber, in: "Immunochemical Protocols", M. M. Manson HRSG, Methods in Molecular Biology 10, Kapitel 32 (1 992), Humana Press, Totowa, N.J. USA). Die Desorption der an die immobilisierten Antikörper gebundenen Substanzen erfolgt dabei üblicherweise mit unspezifischen Methoden, z.B. durch Zusatz von Puffern mit niedrigem ( < 2,5) oder hohem ( > 10) pH-Wert, chaotropen Reagenzien wie etwa Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid, organischen Lösungsmitteln oder Detergenzien zum Elutionspuffer.
In einigen Fällen wurden auch spezifische Desorptionsmethoden be- schrieben, z.B. zur Isolierung von Haptenen durch Verdrängung mit einem
Haptenanalogon oder zur Isolierung von Proteinen durch Verdrängung mit einem niedermolekularen Peptid. Solche spezifischen Desorptionsvorgänge sind bei immunsorptiven Verfahren jedoch die Ausnahme, da sie nur mit einer sehr beschränkten Anzahl von Substanzen überhaupt durchführbar sind . Weitgehend werden daher die oben beschriebenen unspezifischen Desorptionsmethoden eingesetzt, vor allem die Elution bei niedrigem pH- Wert wie z.B. mit 1 M Propionsäure.
Bei immunsorptiven Reinigungsverfahren aus biologischen Materialien zeigt sich nun allerdings, daß die darin vorhandenen Biomoleküle, z.B. Proteine, zum Teil in beträchtlichem Ausmaß auch unspezifisch, d.h. nicht über eine Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, an den Immunadsorber binden. Bei einer unspezifischen Desorption, z.B. mit saurem Puffer, werden diese Substanzen nun ebenfalls von dem Immunadsorber eluiert und liegen neben der gewünschten Substanz als Verunreinigung vor. Dies ist vor allem dann ein sehr großer Nachteil, wenn die aufzureinigende Substanz nur in sehr geringer Konzentration vorliegt, da sie dann nur einen geringen Anteil des insgesamt vom Immunadsorber eluierten Materials darstellt, so daß weitere aufwendige Reinigungsschritte notwendig sind, bevor die gewünschte Substanz in genügender Reinheit zur Verfügung steht, falls dies bei den zum Teil sehr geringen Mengen der Substanz überhaupt möglich ist.
So liegt beispielsweise das Prostata-spezifische Antigen (PSA) in einer Konzentration von ca. 1 bis 1 500 ng/ml in humanem Serum vor, während andere Proteine wie etwa humanes Serumalbumin (HSA) mit ca. 70 mg/ml in einer 1 05 bis 107-fach höheren Konzentration vorhanden sind. Da diese Proteine unspezifisch an den Immunadsorber binden, kommt es bei der immunsorptiven Reinigung einer in sehr geringen Konzentrationen vorliegenden Substanz wie z.B. PSA vor, daß bei einer unspezifischen Desorption die gewünschte Substanz nur einen sehr geringen Anteil des eluierten Gesamtproteins ausmachtund z.B. bei einergelelektrophoretischen Auftrennung des Eluats überhaupt nicht identifiziert werden kann (vgl. z.B. Abb. 2) . In diesem Fall ist eine Charakterisierung des Proteins, z.B. nach einem Proteaseverdau, aufgrund der Anwesenheit der verunreinigenden Proteine nicht oder nur sehr schwer möglich. Ähnliche Probleme treten auch bei anderen analytischen Methoden, wie etwa z.B. Massenspektrometrie auf, da auch hier eine Analyse aufgrund der Vielzahl von verunreinigenden Proteinen sehr schwierig oder unmöglich ist, vor allem wenn die genaue Masse des zu untersuchenden Proteins nicht bekannt ist. So ist zwar eine Kombination von MALDI-TOF Massenspektroskopie und Immunsorption beschrieben, bei der das immunsorptiv gebundene Material durch die saure MALDI Matrix (Zimtsäurederivate gelöst in Trifluoressigsäure/Acetonitril) eluiert und direkt vermessen wird (Nelson et al., Anal. Chem. 67 (1 995), 1 1 53-1 1 58) . Es ist aber zu erkennen, daß bei einer nur in sehr geringen Konzentrationen vorkommenden aufzureinigenden Substanz eine Vielzahl weiterer Proteine auftaucht, die teilweise bedeutend höhere Signale geben als die gewünschte Zielsubstanz (vgl. Abb. 1 ; entnommen aus Krone et al. Mass Spectrometric Immunoassay, Poster Session ABRF'96: Biomolecular Techniques ( 1 996), San Francisco, USA) .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine generell anwendbare Methode zur Aufreinigung von Substanzen aus biologischen Proben zu finden, bei der die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt sind. Insbesondere soll das Verfahren die Vorteile der spezifischen Immunsorption ausnutzen, während die Nachteile der unspezifischen Desorption vermieden werden. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren eine Elution in einem im Wesentlichen neutralen pH-Bereich ermöglichen, um eine Schädigung der Zielsubstanzen verbunden mit einem Verlust an Immunreaktivität oder/und biologischer Aktivität durch extreme pH-Werte zu vermeiden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Aufreinigung einer
Zielsubstanz aus einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Adsorbieren der Zielsubstanz auf einer Festphase, wobei die Bindung der Zielsubstanz an die Festphase die Wechselwirkung zwischen einem ersten und einem zweiten Partner eines hochaffinen Bindepaa- res umfaßt, und wobei der erste Partner des Bindepaares direkt oder indirekt an die Zielsubstanz gebunden ist und wobei der zweite Partner des Bindepaares an die Festphase gebunden ist,
(b) Abtrennen nicht adsorbierter Probenbestandteile von der Festphase, (c) Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des Bindepaares oder einem Analogon davon in freier Form, wobei die Zielsubstanz von der Festphase desorbiert wird und
(d) Abtrennen der Zielsubstanz von der Festphase.
Eine erste bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, ist ein Verfahren zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Festphase mit einem immobilisierten Reaktanden R,, wobei R, mindestens eine mit der Zielsubstanz spezifisch bindefähige Gruppe und mindestens eine Gruppe umfassend einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares enthält, und wobei die
Bindung von R, an die Festphase über einen immobilisierten Reaktanden R2 erfolgt, der eine Gruppe umfassend den zweiten Partner des hochaffinen Bindepaares enthält,
(b) Inkontaktbringen der Probe mit der Festphase, wobei die Zielsubstanz über eine Bindung mit H auf der Festphase adsorbiert wird,
(c) Abtrennen nicht adsorbierter Probenbestandteile von der Festphase,
(d) Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des Bindepaares oder einem Analogon davon in freier Form, wobei die Zielsubstanz als Komplex mit R-, von der Festphase desorbiert wird, und (e) Abtrennen des Komplexes von der Festphase.
Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein mit der aufzureinigenden Zielsubstanz spezifischer bindefähiger Reaktand R verwendet, der mit einem ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares, z.B. einem Hapten gekoppelt ist. Weiterhin wird ein spezifisch mit dem ersten Bindepartner bindefähiger zweiter Reaktand R2 verwendet, der den zweiten Partner des Bindepaares, z.B. einen Anti-Hapten-Antikörper, enthält und gegenüber dem ersten Bindepartner eine solche Affinität aufweist, daß der Reaktand R-, durch den ersten Bindepartner in freier Form oder durch ein Derivat davon effizient verdrängt werden kann. Durch Elution mit dem freien ersten Bindepartner kann der Komplex aus dem Reaktanden R und nachzuweisender Substanz sehr spezifisch und frei von unspezifisch adsorbierten Verunreinigungen von der Festphase eluiert werden. Das Prinzip und Ergebnis dieser Reinigungsmethode sowie ein Vergleich mit einer unspezifischen sauren Elution ist in Abbildung 2 am Beispiel der Isolierung von PSA und einem PSA/ACT-Komplex aus Humanserum dargestellt.
Das erfindungsgemäße Reinigungsprinzip kann auch zur direkten Isolierung einer Substanz eingesetzt werden, wenn diese mit einem ersten Bindepartner versehen werden kann und dessen Anwesenheit bei der weiteren Analytik oder Verwendung dieser Substanz nicht stört. Entsprechende Beispiele sind für die Isolierung von doppelt markierter DNA sowie von Fusionsproteinen gezeigt.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Aufreinigung einer Zielsubstanz, an die ein erster Partner eines hochaffinen Bindepaares gebunden ist, aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Festphase, die einen immobilisierten zweiten Partner eines hochaffinen Bindepaares enthält,
(b) Inkontaktbringen der Probe mit der Festphase, wobei die Zielsubstanz über eine Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten Partner des
Bindepaares auf der Festphase adsorbiert wird,
(c) Abtrennen nicht adsorbierter Probenbestandteile von der Festphase,
(d) Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des Bindepaares oder einem Analogon davon in freier Form, wobei die Zielsubstanz von der Festphase desorbiert wird, und
(e) Abtrennen der Zielsubstanz von der Festphase. Das Prinzip der spezifischen Ablösung eines Hapten/Anti-Hapten-Im- munkomplexes von einer Festphase zur Aufreinigung von Substanzen aus biologischen Proben ist bisher unbekannt. Zwar beschreibt Ishikawa (europäische Patentanmeldung Nr. 88 1 1 2 927.4) einen quantitativen lmmunoas- say, bei dem ein an ein Polystyrolpartikel immobilisierter Komplex aus Anti- Dinitrophenyl (DNP)-Antikörper/DNP-markierte-Anti-Analyt-Antikörper/ Analyt/Anti-Analyt-Antikörper-Enzymkonjugat durch Zusatz von Dinitrophe- nol freigesetzt wird. Der freigesetzte Immunkomplex wird an einem zweiten Polystyrolpartikel, der einen gegen den haptenisierten Antikörper gerichteten Rezeptor enthält, gebunden und über die enzymatische Aktivität quantitativ bestimmt. Im Gegensatz zu dem bei Ishikawa beschriebenen Verfahren, ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Entfernung eines im Meßmedium vorhanden markierten Reagenz, sondern auf die in einer biologischen Probe neben einer aufzureinigenden Substanz in sehr hohem Überschuß vorhande- nen Begleitsubstanzen gerichtet. Es war somit vorher nicht abschätzbar, ob der von Ishikawa beschriebene Desorptionsschritt überhaupt zur selektiven Entfernung dieser Begleitsubstanzen anwendbar ist. Dies gilt vor allem, weil bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise eine direkte Analyse der vom Immunadsorber abgelösten Substanz und nicht wie bei Ishikawa ein weiterer Reinigungsschritt umfassend eine spezifische Bindung an eine weitere Festphase erfolgt. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß eine solche weitere Bindung für eine effiziente Reinigung nicht notwendig ist, sondern daß schon in der spezifisch von der ersten Festphase eluierten Lösung eine hervorragende Abtrennung von Begleitsubstanzen zu beo- bachten ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für alle Reinigungsprobleme anwendbar, bei denen Substanzen, insbesondere biologische Moleküle, die vorwiegend in sehr geringer Konzentration vorliegen, aus komplexen biologischen Proben wie etwa Körperflüssigkeiten, z.B. Vollblut, Plasma, Serum, Urin, Sputum etc., aus tierischen oder pflanzlichen Geweben, Bodenproben oder Zellextrakten oder aus molekularbiologischen Reaktions- gemischen aufgereinigt werden müssen. Die aufzureinigende Substanz ist im weitesten Sinne ein Biomolekül, d.h. ein in einer biologischen Probe vorkommender Bestandteil. Beispiele für solche Substanzen sind Zellen, Zelifraktionen, Zellorganellen, virale Partikel, Polypeptide, Peptide, Glyko- proteine, Lipoproteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Hormonen, Metaboli- ten, Neutransmitter und Mediatoren. Bevorzugte Beispiele für aufzureinigende Substanzen sind Polypeptide und Nukleinsäuren wie etwa DNA oder RNA Moleküle.
Gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Zielsubstanz aufgereinigt, die nicht mit einem ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares gekoppelt sein muß. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren ist insbesondere zur Aufreinigung von nichtmodifizierten, natürlicherweise in biologischen Proben vorkommenden Zielsubstanzen geeignet. Gemäßder zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird eine Zielsubstanz, die bereits mit einem ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares gekoppelt ist, aufgereinigt. Diese Ausführungsform des Verfahrens ist insbesondere zur Auf reinigung von mit entsprechenden Gruppen modifizierten Zielsubstanzen aus molekularbiologischen Reaktionsansätzen, z.B. Hapten-modifizierten Nukleinsäuren aus Amplifikationsansätzen, oder zur Aufreinigung von rekombinanten Polypeptiden geeignet.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Festphase kann beliebige aus dem Stand derTechnik bekannte Trägermaterialien enthalten. Bevorzugt sind partikuläre Festphasen wie etwa magnetische Mikropartikel.
Der in der ersten Ausführungsform verwendete Reaktand R, ist vorzugsweise ein Konjugat, umfassend mindestens eine mit der aufzureinigenden Substanz spezifisch bindefähige Gruppe und mindestens eine Gruppe umfassend den ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares. Bevorzugt enthält R, nur eine Gruppe des ersten Bindepartners. Die spezifisch bindefä- hige Gruppe kann - je nach Art der nachzuweisenden Substanz - ein gegen die Substanz gerichteter Antikörper, eine mit der nachzuweisenden Substanz komplementäre Nukleinsäure, ein Lectin oder ein spezifisch an die nachzuweisende Substanz bindender biologischer Rezeptor sein. Vorzugs- weise ist die spezifisch bindefähige Gruppe ein Antikörper (wobei dieser Begriff auch Antikörperfragmente oder Antikörperderivate umfaßt) oder eine Nukleinsäure (wobei dieser Begriff auch Nukleinsäureanaloga wie etwa peptidische Nukleinsäuren umfaßt) .
Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß eine Elution der an die Festphase gebundenen Zielsubstanz durch Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des Bindepaares oder einem Analogon davon in freier bzw. löslicher Form möglich ist. Vorzugsweise werden die Partner des Bindepaares so ausgewählt, daß diese Elution unter physiologischen pH-Bedingungen, z.B. bei einem pH Bereich von 5 bis 8 erfolgen kann. Weiterhin ist es bevorzugt, daß die Partner des Bindepaares so ausgewählt werden, daß die Affinitätskonstante zwischen dem ersten und dem zweiten Partner des Bindepaares im Bereich vom 106 l/mol bis 1010 l/mol liegt, so daß eine hochaffine Bindung erfolgt. Um eine gute Ver- drängung durch den ersten Bindepartner in freier Form zu ermöglichen, soll die Bindung zwischen ersten und zweiten Bindepartner eine ausreichende Reversibilität aufweisen.
Vorzugsweise verwendet man als ersten Partner des Bindepaares eine niedermolekulare Substanz mit einem Molekulargewicht bis vorzugsweise maximal 4 kD, besonders bevorzugt bis maximal 2 kD. Ein Beispiel hierfür ist eine Haptengruppe, wobei man in diesem Fall als zweiten Partner des Bindepaares einen gegen die Haptengruppe gerichteten Antikörper verwendet. Beispiele für geeignete Haptene sind Moleküle, die in der Lage sind, in einem Organismus eine Immunantwort hervorzurufen, die zur Produktion von spezifischen Anti-Hapten-Antikörpern führt. Spezifische Beispiele für Haptene sind Steroide wie etwa Progesteron oder synthetische Derivate davon, Cardenolide wie etwa Digoxin oder Digoxigenin, Fluoreszenzfarbstoffe wie etwa Fluorescein oder Derivate davon, Hormone wie etwa Schilddrüsenhormone, z.B. T3 oder T4, Arzneimittel wie Barbiturate oder Theophyllin, Metallkomplexe, insbesondere elektrochemilumineszenz- fähige Metallkomplexe wie etwa Ruthenium- oder Rhodium-(Bispyridyl)3- Komplexe oder andere Verbindungen wie etwa Dinitrophenol oder Diphenyl- hydantoin. Substanzen, gegen die bereits hochspezifische Antikörper existieren, wie Digoxigenin, Fluorescein, Dinitrophenol, Schilddrüsenhormone, Ruthenium- od r Rhodium-Komplexe, Theophyllin, Barbiturate oder Diphenylhydantoin sind besonders bevorzugt.
Weiterhin kann man als ersten Reaktanten des Bindepaares einen Zucker, insbesondere ein Mono- oder Oligosaccharid, und als zweiten Partner des Bindepaares ein Lectin verwenden. So kann man beispielsweise als ersten Bindepartner einen eine Mannosegruppe-enthaltenden Zucker und Concana- valin A als zweiten Bindepartner verwenden.
Darüber hinaus kann man als ersten Partner des Bindepaares auch einen niedermolekularen Rezeptorliganden und als zweiten Partner des Bindepaa- res einen biologischen Rezeptor verwenden. Beispiel für solche Bindepaare sind Acetylcholin/Acetylcholinrezeptor oder Histamin/Histaminrezeptor.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verwendet man als ersten Partner des Bindepaares ein Peptidepitop und als zweiten Partner des Bindepaares einen gegen das Peptidepitop gerichteten Antikörper.
Ein den ersten Partner des Bindepaares bildendes Peptidepitop kann einerseits analog wie ein Hapten, Zucker oder Rezeptoriigand auf bekannte Weise durch Kopplung in Form eines aktivierten Derivats, z.B. eines Aktivesters, an den Reaktanden R- , oder an die Zielsequenz gebunden werden. Wenn der Reaktand R, oder die Zielsubstanz eine Nukleinsäure ist, kann der erste Bindepartner auch durch eine enzymatische Reaktion eingeführt werden, z.B. durch Verwendung markierter Primer, markierter Oligonukleotidbausteineoder/und Anfügen markierter Nukleinsäurefragmen- te. Wenn der Reaktand R, oder die Zielsubstanz ein Peptid oder Polypeptid ist, kann ein Peptidepitop als erster Partner des Bindepaares auch durch gentechnische Modifizierung in R, oder in die Zielsubstanz eingeführt werden.
Die Elution der Zielsubstanz bzw. des Komplexes aus R- und der Zielsubstanz von der Festphase erfolgt durch Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des Bindepaares oder einem Analogon davon in freier, bzw. löslicher Form. Eine möglichst quantitative Elution kann erreicht werden, wenn man den freien ersten Partner des Bindepaares in einem molaren Überschuß gegenüber dem an R1 gebundenen ersten Partner des Bindepaares verwendet. Dieser molare Überschuß liegt vorzugsweise im Bereich von mindestens 50-fach, besonders bevorzugt 100-500-fach.
Weiterhin kann eine Verbesserung der Elution von der Festphase erreicht werden, wenn man den freien ersten Partner des Bindepaares in Form eines Konjugats einsetzt, umfassend ein Trägermolekül und mehrere daran gekoppelte Moleküle des ersten Partners des Bindepaares. Beispiele für geeignete Trägermoleküle sind Polypeptide wie etwa Polylysin, Albumin, unspezifische Antikörper etc. oder Polysaccharide wie etwa Dextrine. An dieses Trägermolekül können mehrere Moleküle des ersten Partner des Bindepaares nach bekannten Methoden, z.B. unter Verwendung von aktivierten Derivaten des ersten Partners gekoppelt werden. Beispiele für solche Konjugate sind polyhaptenylierte Trägermoleküle wie etwa Polylysin- Digoxigenin, Rinderserumalbumin-Digoxigenin etc.
Noch eine weitere Möglichkeit, die Elution von der Festphase zu verbessern, besteht darin, als freien ersten Partner des Bindepaares ein Analogon des an R, gebundenen ersten Partners des Bindepaares zu verwenden, wobei dieses freie Analogon eine höhere Bindungsaffinität an den zweiten Partner des Bindepaares aufweist als der an R. oder die Zielsubstanz gebundene erste Partner des Bindepaares. So kann - wenn der erste Partner des Bindepaares ein Hapten ist - als Analogon ein modifiziertes Hapten verwendet werden, an das der zweite Partner des Bindepaares eine höhere Affinität als an das gebundene Hapten aufweist. So kann man als gebundene Haptengruppe Digoxigenin, als Bindepartner einen Anti-Digoxin- Antikörper und als freien Bindepartner Digoxin verwenden. Analoge Beispiele sind die Verwendung von Nitrophenol als gebundenem Hapten, einem Anti-Dinitrophenol-Antikörper und Dinitrophenol als freiem Hapten, die Verwendung von T3 als gebundenem Hapten, Anti-T4-Antikörper und freiem T4 oder die Verwendung von Rhodium-Bispyridyl3-Komplex als gebundenemHapten,einemAnti-Rhodium-(Bispyridyl)3-Komplex-Antikörper und Rhodium-(Bispyridyl)3-Komplex als freiem Hapten.
Eine Verbesserung der Elution erhält man auch, wenn zwar als freier und gebundener Bindepartner die gleiche Gruppe verwendet wird, aber jeweils mit einem verschiedenen Linker. So kann man als gebundenen Partner eine Gruppe Hapten-Linker 1 , einen gegen Hapten-Linker 2 gerichteten Antikörper und als freien Bindepartner die Gruppe Hapten-Linker 2 verwenden. Bei Peptidepitopen kann man als gebundenen Partner eine erste Peptidsequenz verwenden, einen gegen eine zweite, sich von der ersten Sequenz um eine Aminosäure unterscheidende Peptidsequenz gerichteten Antikörper und die zweite Peptidsequenz als freien Bindepartner verwenden.
Nach der Elution von der Festphase kann die Zielsubstanz einer Analyse, z.B. durch HPLC, Gelelektrophorese oder Massenspektroskopie unterzogen werden. Gegebenenfalls können noch weitere Reinigungsschritte durchgeführt, werden, z.B. eine Freisetzung der aufzureinigenden Substanz aus dem Komplex mit dem Reaktanden R.. Außerdem können unerwünschte Anteile der aufzureinigenden Substanz abgespalten werden. So können beispielsweise bei Fusionsproteinen unerwünschte Anteile durch proteoly- tische Spaltung etwa mit Enterokinase, Faktor Xa oder IgA-Protease abgetrennt werden.
Eine spezifische Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Aufreinigung rekombinanter Peptide oder Polypeptide, z.B. eukaryontischer
Peptide oder Polypeptide, die in Bakterienzellen, z.B. in E.coli Zellen hergestellt werden. Dabei kann man Fusionspolypeptide herstellen, die eine erste Domäne, die spezifisch mit dem Reaktanden R, bindefähig ist, und eine zweite gewünschte Zieldomäne enthalten. Zwischen erster und zweiter Domäne kann eine Proteasespaltstelle eingeführt werden, so daß das
Fusionspolypeptid nach der Desorption proteolytisch, z.B. mit einer immobilisierten Protease gespalten werden kann. Der im Reaktionsgemisch verbleibende Reaktand R, mit der daran gebundenen ersten Domäne des
Fusionspolypeptids kann in einem weiteren Schritt durch Bindung an einen immobilisierten Reaktanden abgetrennt werden, so daß die gewünschte
Zieldomäne in reiner Form erhalten wird.
Für den Fall, daß die Zielsubstanz, z.B. eine Peptid- oder Polypeptid- Zieldomäne ohne Abspaltung des zur Isolierung dienenden Komplexes R-. und der ersten Domäne untersucht werden soll, kann an R, eine weitere, strukturell zum ersten Partner des Bindepaares unterschiedlichen Nachweisgruppe eingeführt werden. Mit Hilfe dieser weiteren Gruppe, kann eine Bindung an eine Festphase erfolgen, z.B. über das System Biotin/Streptavi- din oder Hapten/Anti-Hapten-Antikörper, oder ein Konjugat zur Detektion, z.B. Biotin/Streptavidin-Enzym (beispielsweise Peroxidase oder alkalische Phosphatase), Hapten/Anti-Hapten-Antikörper-Enzym, angeheftet werden. Alternativ kann als Nachweisgruppe auch eine direkt nachweisbare Markierungsgruppe verwendet werden, z.B. ein lumineszierender Metallkomplex oder ein Fluoreszenzfarbstoff.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer Probe umfassend: (a) eine Festphase,
(b) einen Reaktanden R- , der mindestens eine mit der aufzureinigenden Substanz spezifisch bindefähigen Gruppe und mindestens eine Gruppe umfassend einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaa- res enthält,
(c) einen Reaktanden R2, der eine Gruppe umfassend den zweiten Partner des hochaffinen Bindepaares enthält, wobei R2 an der Festphase gebunden ist oder eine an die Festphase bindefähige Gruppe enthält, und (d) den ersten Partner des Bindepaares oder ein Analogon davon in freier Form.
Zur Einführung des ersten Bindepartners in eine Zielsubstanz und die anschließende Aufreinigung derZielsubstanz wird ein weiterer Reagenzienkit bereitgestellt umfassend:
(a) eine Festphase,
(bi) einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares in einer Form, die zur Einführung in eine Zielsubstanz geeignet ist,
(bii) Mittel zur Einführung des ersten Partners des Bindepaares in die Zielsubstanz,
(c) den zweiten Partner des Bindepaares gebunden an der Festphase, und
(d) den ersten Partner des Bindepaares oder ein Analogon davon in freier Form.
Bevorzugte Ausführungsformen hinsichtlich der Bestandteile des Reagenzienkits sind wie vorstehend erläutert. Die Komponenten (a), (b) und (c) können als einziges Reagenz oder als mehrere separate Reagenzien vorliegen. Komponente (d) liegt separat von den anderen Komponenten vor. Die Komponenten des Reagenzienkits können in jeder beliebigen Form vorliegen, z.B. als abgepackte Einheiten, Lyophilisate, Lösungen, Suspen- sionen etc. Der Reagenzienkit wird vorzugsweise in einem Verfahren wie vorstehend beschrieben, eingesetzt.
Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Abbildungen erläutert:
Abb. 1 : (Obere Spure) Normales MALDI Massenspektrum von humanem Blut, dem 0,05 mg/ml eines Schlangenpeptids (Myotoxin a) zugesetzt wurden. (Mittlere und untere Spuren) MALDI Spektren nach Bindung des Schlangenpeptids an einen Anti-
Myotoxin a-Antikörper und Elution mit der sauren MALDI Matrix. Bei der unteren Spur, bei der nur 0,00002 mg/ml Myotoxin a zugesetzt worden war, sind deutlich die zahlreichen unspezifisch gebundenen und mit der sauren Matrix eluierten Peptide und Proteine aus dem Blut zu erkennen, die z.T. bedeutend höhere Signale als das Myotoxin a ergeben.
Abb. 2: Vergleich der gelelektrophoretischen Auftrennungen von aus
Prostata Carcinom Plasma immunsorbiertem PSA und PSA/ACT Komplex nach Ablösen mit verschiedenen Elutions- mitteln. Eine Plasmaprobe ohne PSA und PSA/ACT wurde jeweils als Kontrolle mitgeführt.
Abb. 3: Ergebnis einer Agarosegelelektrophorese von DIG-markierten PCR Produkten nach Ablösen mit Digoxigenin-Lysin Experimentelle Beispiele
Beispiel 1 Immunsorptive Isolierung von PSA aus Humanserum: Vergleich der Elution mit einem Hapten und mit Säuren
Die Immunsorptionen erfolgen jeweils an Streptavidin-beschichteten Magnetbeads. Dazu wird jeweils 1 ml einer Bead-Suspension (0,72 mg/ml) pro Probe eingesetzt. Die Beads werden vor Zugabe der Proben dreimal mit jeweils 1 ml Waschlösung (Phosphat-gepufferte Salzlösung PBS, pH 7,2) gewaschen und der Überstand nach Separierung der Beads mit einem Magneten entfernt. Es werden sechs Ansätze der folgenden Zusammensetzung jeweils zu einem Aliquot von Beads zugegeben:
Ansätze 1 und 2: (1 ) 500 μ\ monoklonaler Antikörper (MAK) Anti-Digoxi- genin-igG, biotinyliert (50 μg/ml) und (2) 500 μl MAK
Anti-PSA-IgG, digoxigenyliert 50 μg/ml)
Ansätze 3 bis 6: 500 μl MAK Anti-PSA-Fab', biotinyliert (1 6,6 μg/ml)
Nach Zugabe jeder Lösung erfolgt eine Inkubation für 60 min bei Raumtemperatur und unter Schütteln. Die Zugabe der Lösungen ( 1 ) und (2) zu den Ansätzen 1 und 2 erfolgt jeweils sequentiell. Danach werden die Beads vom Überstand abgetrennt, jeweils viermal mit Waschlösungen gewaschen und der Überstand entfernt.
Dann wird die Probe (Plasma) in einer Menge von 0,5 ml zu den einzelnen Ansätzen gegeben. Als Kontrolle wird Plasma ohne PSA verwendet. Nach Inkubation über 60 min und anschließendem viermaligen Waschen wie vorstehend beschrieben, werden die Überstände entfernt und folgende Elutionslösungen zugesetzt: Ansätze 1 und 2: 200 μl gesättigte Digoxigenin-Lysin-HCI Lösung, pH = 7,2 Ansätze 3 und 4: 200 μl Propionsäure 1 M
Ansätze 5 und 6: 200 μl Ameisensäure/Wasser/Acetonitril im Verhältnis 1 :3:2
Die Ansätze werden 60 min bei Raumtemperatur geschüttelt und die Überstände nach Abtrennung der Beads in einer Speed Vac lyophilisiert. Die Lyophilisate werden dann in 1 0 μl Wasser aufgenommen und für eine SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen eingesetzt, deren Ergebnis in Abb. 3 dargestellt ist.
Ergebnis der Gelelektrophorese:
In den Ansätzen 3 bis 6, bei denen jeweils sauer eluiert wurde, sind sehr viele Proteinbanden aus dem Humanserum zu erkennen, die von unspezifischer Bindung an die Magnetbeads herrühren und durch die sauren Elutionsmittel abgelöst wurden. Dabei ist weiter zu sehen, daß das Acetonitril-haltige Elutionsmittel, welches für die anschließende MALDI-TOF- MS günstig ist, noch bedeutend mehr Proteine unspezifisch ablöst als die 1 M Propionsäure. Im Gegensatz dazu sind bei dem Ablösen mit Digoxigenin-Lysin-HCI neben den gesuchten Banden PSA und PSA/ACT nur die IgG Banden des digoxigenylierten Anti-PSA MAKs zu erkennen, sowie eine geringe Menge an Serumalbumin, das aufgrund seiner hohen Konzentration im Serum auch bei dieser spezifischen Elution der Beads zu einem geringen Teil abgelöst wird. Aufgrund der Vielzahl der bei der sauren Elution erhaltenen Proteinbanden ist es bei diesen Gelen sehr schwer, die spezifischen, gesuchten Proteine zu identifizieren. Dies erschwert dann auch eine weitere Analytik solcher Banden, z.B. durch MALDI-TOF-MS nach einem Proteaseverdau beträchtlich. Beispiel 2 Verwendung von lumineszierenden Metallkomplexen als Haptene
Entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise wurde eine immunsorptive Isolierung von PSA aus humanem Serum durchgeführt. Anstelle von Digoxigenin wurden als Haptene Ruthenium(Bispyridyl)3- Komplex und Rhodium(Bispyridyl)3-Komplex und entsprechende Anti- Hapten-Antikörper verwendet. Die Elution erfolgte durch Zugabe der freien Metallkomplexe.
Wie in Beispiel 1 wurde eine spezifische Elution gefunden.
Beispiel 3 Isolierung eines Fusionsproteins
Es wird ein Fusionsprotein konstruiert bestehend aus einem Protein 1 oder Peptid 1 , gegen das ein digoxigenylierter Antikörper verfügbar ist, sowie dem gewünschten Zielprotein 2. Nach rekombinanter Expression dieses Fusionsproteins, z.B. in E.coli, wird ein Zellaufschluß durchgeführt. Das Homogenat wird mit den oben beschriebenen magnetischen Streptavidin Beads, welche mit MAK Anti-Digoxigenin beladen sind, eine Stunde unter Rühren bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach magnetischer Trennung befindet sich im Überstand der reine Komplex aus dem digoxigenyliertem Antikörper und dem Fusionsprotein. Befindet sich zwischen dem Teil 1 und 2 des Fusionsproteins eine Proteasespaltstelle, z.B. für Enterokinase, kann mit Hilfe dieses Enzyms eine Spaltung des Fusionsproteins durchgeführt werden. Nach Abtrennung des digoxigenylierten Antikörpers mit dem daran gebundenen Protein 1 , z.B. mit Protein A-Sepharose, liegt das reine Zielprotein 2 in der Lösung vor.
Der digoxigenylierte Antikörper kann eine weitere Nachweisgruppe tragen, z.B. ein von Digoxigenin verschiedenes Hapten. Mittels dieser weiteren Nachweisgruppe kann durch Bindung an einen Anti-Hapten-Antikörper eine Immobilisierung oder Detektion erreicht werden.
Beispiel 4 Spezifische Desorption von digoxigenylierter DNA
Die Immunsorptionen erfolgen an mit polyklonalem Anti-Dig-Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten (AD-MTP, Boehringer Mannheim Produkt Kat. Nr. 1 754 289). Als DNA wird ein 397 bp langes PCR-Fragment (0, 1 pmol/μl) des Chloramphenicol-Gens (CAT) verwendet; dabei ist Primer 1 (TAT CCG GCC TTT ATT CAC ATT CTT G) 5' Digoxigenin-, Primer 2 (CCA GCG GCA TCA GCA CCT T) 5' Biotin-markiert.
A) Desorptionsnachweis mit PCR
Je δOμl 1 : 10000 in Puffer (100 mmol/l Natriumphosphat pH 7,5, 50 mmol/l NaCI, 0,5 mmol/l EDTA, 1 % Casein, 0, 1 % Tween 20 und 0,02% MIT) mit 0, 1 mg/ml Herings-DNA verdünntes CAT-Fragment werden in 8 Doppelansätzen für 30 min bei Raumtemperatur unter Schütteln an AD-MTP gebunden. Es wird zehnmal mit 250 μl Waschpuffer (PBS mit 0, 1 % Tween) gewaschen.
Die Elution erfolgt mittels Aufgabe von 50 μl fertigem PCR-Ansatz (PCR Mastermix mit je 0,4 pmol/μl Primer 1 und 2) mit 50% bis 0,78% Gehalt an Dig-Lysin gesättigtem bidestilliertem Wasser (1 :2 Verdünnungreihe) bei 37 ° C, 1 h unter Schütteln. Als Negativkontrolle wird Puffer ohne Dig-Lysin und als Positivkontrolle eine Lösung mit 50% Dig-Lysin Gehalt und 1 μl 1 :200 verdünntes CAT-Fragment verwendet.
Anschließend wird mit den Ansätzen folgendes PCR-Programm gefahren:
Denaturieren: 94°C, 2 min
20x bzw. 25x: 94°C, 1 0 sec; 68°C, 30 sec Finale Extension: 72°C, 7 min
Je 1 0 l pro PCR-Ansatz werden mittels 1 , 5 % Agarosegelelektrophorese analysiert. Wie Abb. 3 zeigt, findet sich in allen Dig-Lysin haltigen PCR- ansätzen nach 20 (obere Reihe) bzw. 25 (untere Reihe) Zyklen das erzeugte CAT-Fragment analog der Positivkontrolle (Spuren 2 und 3 von rechts) . Die Negativkontrolle (Spuren 4 und 5 von rechts) bleibt erwartungsgemäß leer.
B) Desorptionsnachweis mit ELISA
Je 1 00 μl 1 : 1000 in DNA-Konjugat-Verdünnungspuffer ( 1 00 mmol/l Natriumphosphat pH 7,5, 50 mmol/l NaCI, 0,5 mmol/l EDTA, 1 % Casein, 0, 1 % Tween 20 und 0,02% MIT (Methylisothiazolon) verdünntes CAT- Fragment (Genbank ACC.NO.X65321 )werden in 7 Doppelansätzen sowie einer Leerprobe ohne CAT für 30 min bei Raumtemperatur unter Schütteln an AD-Mikrotiterplatten gebunden. Es wird fünfmal mit 250 μl Waschpuffer gewaschen.
Eine Elution erfolgt mittels Aufgabe von 100 l PBS mit 1 0% bis 0,001 % Dig-Lysin gesättigtem bidestilliertem Wasser ( 1 : 10 Verdünnungreihe) sowie 1 00% Kontrolle ohne Dig-Lysin bei 37 °C, 1 h unter Schütteln.
Anschließend wird wie oben gewaschen und 30 min mit 100 μl Streptavi- din-Peroxidase-Konjugat (200 mU/ml) in Verdünnungspuffer detektiert. Dann wird nochmals wie oben gewaschen und mit 1 00 μl TMB-Substrat (Tetramethylbenzidin) entwickelt. Die Reaktion wird mit 50 μl 1 M H2SO4 gestoppt und im ELISA-Reader bei 450 nm vermessen.
Die Auswertung der ELISA-Daten zeigt eine spezifische Desorption der Dig- markierten DNA.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Adsorbieren der Zielsubstanz auf einer Festphase, wobei die Bindung der Zielsubstanz an die Festphase die Wechselwirkung zwischen einem ersten und einem zweiten Partner eines hochaffinen Bindepaares umfaßt, und wobei der erste Partner des Bindep: ares direkt oder indirekt an die Zielsubstanz gebunden ist und wobei der zweite Partner des Bindepaares an die Festphase gebunden ist,
(b) Abtrennen nicht adsorbierter Probenbestandteile von der Festphase, (c) Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des
Bindepaares oder einem Analogon davon in freier Form, wobei die Zielsubstanz von der Festphase adsorbiert wird und (d) Abtrennen der Zielsubstanz von der Festphase.
2. Verfahren zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Festphase mit einem immobilisierten Reaktanden R,_ wobei R, mindestens eine mit der Zielsubstanz spezifisch bindefähige Gruppe und mindestens eine Gruppe umfassend einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares enthält, und wobei die Bindung von R an die Festphase über einen immobilisierten Reaktanden R2 erfolgt, der eine Gruppe umfassend den zweiten Partner des hochaffinen Bindepaares enthält, (b) Inkontaktbringen der Probe mit der Festphase, wobei die
Zielsubstanz über eine Bindung mit R- auf der Festphase adsorbiert wird, (c) Abtrennen nicht adsorbierter Probenbestandteile von der Festphase,
(d) Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des Bindepaares oder einem Analogon davon in freier Form, wobei die Zielsubstanz als Komplex mit R, von der Festphase desorbiert wird, und
(e) Abtrennen des Komplexes von der Festphase.
3. Verfahren zur Aufreinigung einer Zielsubstanz, an die ein erster Partner eines hochaffinen Bindepaares gebunden ist, aus einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Festphase, die einen immobilisierten zweiten Partner eines hochaffinen Bindepaares enthält,
(b) Inkontaktbringen der Probe mit der Festphase, wobei die Zielsubstanz über eine Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten Partner des Bindepaares auf der Festphase adsorbiert wird,
(c) Abtrennen nicht adsorbierter Probenbestandteile von der Festphase, (d) Inkontaktbringen der Festphase mit dem ersten Partner des
Bindepaares oder einem Analogon davon in freier Form, wobei die Zielsubstanz von der Festphase desorbiert wird, und (e) Abtrennen der Zielsubstanz von der Festphase.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die aufzureinigende Substanz ausgewählt wird aus Zellen, Zellfraktionen, Zellorganellen, viralen Partikeln, Polypeptiden, Peptiden, Glykoproteinen, Lipoproteinen, Polysacchariden, Nu- kleinsäuren, Hormonen, Metaboliten, Neurotransmittern und Mediatoren.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die aufzureinigende Substanz ausgewählt wird aus Polypeptiden und Nukleinsäuren.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine partikuläre Festphase verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifisch mit der aufzureinigenden Substanz bindefähige Gruppe von R1 aus Antikörpern und Nukleinsäuren ausgewählt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Partner des Bindepaares so auswählt, daß die Affinitätskonstante zwischen dem ersten und dem zweiten Partner des Bindepaares im Bereich von 1 06 l/mol - 1 010 l/mol liegt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Partner des Bindepaares eine Haptengruppe und als zweiten Partner des Bindepaares einen gegen die Haptengruppe gerichteten Antikörper verwendet.
1 0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hapten auswählt aus Digoxigenin, Fluorescein, Dinitrophenol, Schilddrüsenhormonen, Ruthenium- oder Rhodium-
(Bispyridyl)3-Komplexen, Theophyllin, Barbituraten oder Diphenyl- hydantoin.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Partner des Bindepaares einen Zucker und als zweiten Partner des Bindepaares ein Lectin verwendet.
1 2. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen eine Mannosegruppe enthaltenden Zucker als ersten Bindepartner und Concanavalin A als zweiten Bindepartner ver- wendet.
1 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Partner des Bindepaares einen niedermolekularen Rezeptoriiganden und als zweiten Partner des Bindepaares einen biologischen Rezeptor verwendet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Partner des Bindepaares ein Peptidepitop und als zweiten Partner des Bindepaares einen gegen das Peptidepitop gerichteten Antikörper verwendet.
1 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Desorption von der Festphase unter physiologischen Bedingungen durchführt.
1 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Desorption den freien ersten Partner des Bindepaares in einem molaren Überschuß gegenüber dem gebundenen ersten Partner des Bindepaares verwendet.
1 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Desorption den freien ersten Partner des Bindepaares in Form eines Konjugats umfassend ein Trägermolekül und mehrere daran gekoppelte Moleküle des ersten Partners verwendet.
1 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Desorption als freien ersten Partner des Bindepaares ein Analogon des gebundenen ersten Partners des Bindepaares verwendet, wobei das freie Analogon eine höhere Bindungsaffinität an den zweiten Partner des Bindepaares aufweist als der gebundene erste Partner des Bindepaares.
1 9. Verfahren nach Anspruch 2, weiterhin umfassend das Freisetzen der aufzureinigenden Substanz aus dem Komplex mit dem Reaktanden
R
20. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktand R-, eine vom ersten Partner des Bindepaares verschiedene Nachweisgruppe trägt.
21 . Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Aufreinigung rekombinant hergestellter Polypeptide.
22. Verwendung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fusionspolypeptid herstellt, umfassend eine erste Domäne, die spezifisch mit dem ersten Partner des Bindepaares bindefähig ist, und eine zweite gewünschte Zieldomäne.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen erster und zweiter Domäne eine Proteasespaltstelle eingeführt wird und daß nach der Desorption das Fusionspolypeptid proteolytisch gespalten wird.
24. Reagenzienkit zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer Probe umfassend: (a) eine Festphase,
(b) einen Reaktanden R17 der mindestens eine mit der aufzureinigenden Substanz spezifisch bindefähigen Gruppe und mindestens eine Gruppe umfassend einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares enthält, (c) einen Reaktanden R2, der eine Gruppe umfassend den zweiten
Partner des hochaffinen Bindepaares enthält, wobei R2 an der
Festphase gebunden ist oder eine an die Festphase bindefähige
Gruppe enthält, und
(d) den ersten Partner des Bindepaares oder ein Analogon davon in freier Form.
25. Reagenzienkit zur Aufreinigung einer Zielsubstanz aus einer Probe umfassend
(a) eine Festphase, (bi) einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares in einer
Form, die zur Einführung in eine Zielsubstanz geeignet ist, (bii) Mittel zur Einführung des ersten Partners des Bindepaares in die Zielsubstanz, (c) den zweiten Partner des Bindepaares gebunden an der
Festphasen, und (c) den ersten Partner des Bindepaares oder ein Analogon davon in freier Form.
26. Verwendung des Reagenzienkits nach Anspruch 24 oder 25 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 9.
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