WO2000029041A1 - Stabilisierte proteinzubereitungen für einen gewebekleber - Google Patents

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WO2000029041A1
WO2000029041A1 PCT/EP1999/008812 EP9908812W WO0029041A1 WO 2000029041 A1 WO2000029041 A1 WO 2000029041A1 EP 9908812 W EP9908812 W EP 9908812W WO 0029041 A1 WO0029041 A1 WO 0029041A1
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fibrinogen
protein preparation
factor xiii
acid
mol
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PCT/EP1999/008812
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Hubert Metzner
Peter Gronski
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Aventis Behring Gmbh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/106—Fibrin; Fibrinogen

Definitions

  • the invention relates to a tissue adhesive and stabilized protein preparations for a tissue adhesive or for parenterally administrable preparations which, when stored in the liquid state or after storage in the frozen state, do not show any significant loss of activity over several months or years when thawed and further stored in the liquid state.
  • tissue adhesives can be used to connect human or animal tissues, which include consist of the main components fibrinogen, factor XIII and thrombin. These protein preparations require careful stabilization so that their full effect and their application properties are retained until they are used for surgery in tissue bonding.
  • Tissue bonding is a method that has been described again and again at the beginning of this century and afterwards (S. Bergel: On effects of fibrin. Dtsch. Med. Wschr. 35: 663-5 (1909); EP Cronkite, EL Lozner, JM Deaver: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting. JAMA 124: 976-8 (1944); H. Matras; HPumbles, H. Lassmann, B. Mammoli, Wr. Med. Wschr. 37: 517 (1972); H Matras, HP 3,s, H. Lassmann, B. Mammoli: J. max. Fac. Surg. 1:37 (1973); H. Matras, F. Braun, H.
  • tissue bonding has become significantly more important and is now used, for example, for seam support, local hemostasis, sealing of body cavities to avoid CSF loss and for wound care.
  • Tissue bonding with fibrin adhesives is a physiological method and therefore has advantages over synthetic adhesives in terms of their compatibility and the degradability of the adhesive components.
  • Tissue adhesives are commercially available either as lyophilisates or as frozen preparations. After reconstitution or thawing, however, the products are only stable in solution for a few days, e.g. in the case of the highly concentrated fibrinogen / factor XIII solutions, there is an aggregation and thus an increase in viscosity or (e.g. proteolytic) inactivation, which makes further use impossible.
  • tissue adhesives described so far in the literature and not yet commercially available generally also consist of frozen or freeze-dried components which have to be thawed or dissolved before use.
  • the use of chaotropic agents or in general is described in European patent 0 085 923, in German patent application 196 17 369 and in European patent application 0 856 317 Solubility of protein-improving additives such as arginine or urea or their derivatives or derivatives of benzene, Imidazole, pyrazole, furan, thiazole and purine have been described.
  • Chaotropic agents are understood here to mean those agents which reduce or destabilize the interaction of proteins or parts thereof and thus reduce their tendency to aggregate. It is important to ensure the stability of components such as fibrinogen and factor XIII even in the presence of these chaotropic agents and under the selected conditions. To date, this has not yet been possible with frozen fibrinogen / factor XIII concentrates which have to be stored for several weeks and months after thawing or with fibrinogen / factor XIII concentrates which are only to be stored in liquid form.
  • European patent 0487 713 also discloses a biological adhesive for human or animal tissue which is stabilized in liquid form at a low temperature. This is to be achieved in that the preparation containing fibrinogen contains at least one chaotropic agent in a concentration between about 0.3 M and 1 M and the adhesive is liquid at the storage temperature.
  • such a fibrinogen concentrate contained about 4 mM trisodium citrate, 240 mM NaCl, 80 mM aminocaproic acid (EACA), 240 mM glycine, 1% polysorbate, 0.6 g / 1 sodium caprolate, 0.5 M urea, possibly 2,000 KIE / l aprotinin and a pH 7.5.
  • EACA aminocaproic acid
  • the stability was assessed after 1 month, which is very short for a therapeutic preparation.
  • the F XIII activity was not determined.
  • J. Chabbat et al. also reported a fibrinogen concentrate that is stable in the liquid state at 4 ° C for 6 months (J. Chabbat, M. Tellier, P. Porte and M.
  • a fibrinogen preparation used for this can also contain factor XIII from the starting material and other plasma proteins such as fibronectin and the Willebrand factor (vWF) or purified factor XIII as an additive.
  • EACA lysine or e-aminocaproic acid
  • PAMBA p-aminomethylbenzoic acid
  • F XIII e-aminocaproic acid
  • PAMBA p-aminomethylbenzoic acid
  • F XIII e.g. Sodium citrate
  • amino acids and sugar can be used.
  • the invention therefore also relates to a tissue adhesive which consists of a solution containing the stabilized factor XIII, a solution containing the stabilized fibrinogen and a stabilized solution containing thrombin, which are provided separately from one another in a packaging unit prepared for joint use.
  • a tissue adhesive which consists of a solution containing the stabilized factor XIII, a solution containing the stabilized fibrinogen and a stabilized solution containing thrombin, which are provided separately from one another in a packaging unit prepared for joint use.
  • Stable, frozen fibrinogen concentrates are known and described, but their stability after thawing is limited to a few days.
  • the limited shelf life of the fibrinogen concentrate is i.a. attributable to the fact that the viscosity increases immediately due to aggregation of the fibrinogen.
  • a low viscosity can be obtained by adding aggregation-preventing, i.e. chaotropic, compounds in the liquid state.
  • aggregation-preventing, i.e. chaotropic i.e. chaotropic
  • these agents have the disadvantage that they lead to a decrease in factor XIII activity in the frozen state (for example at -20 ° C.). The loss of F XIII activity usually occurs faster, the higher the concentration of chaotropic agents.
  • anti-fibrinolytic additives such as 6-aminocaproic acid (EACA), p-aminomethylcyclohexane carboxylic acid (AMCA) or p-aminomethylbenzoic acid (PAMBA) and their physiologically acceptable salts have an effect on fibrinogen aggregation and F XHI stability .
  • AMCA in particular has a negative effect on F XIII activity when stored in the frozen state.
  • EACA although very similar in chemical structure to AMCA, does not cause the same factor XIII drop as AMCA under appropriate conditions.
  • slightly chaotropic agents such as citrulline, nicotinamide or the like or mixtures thereof or with arginine can be used in an amount of up to approximately 0.28 M, in particular 0.1 to 0.20 M.
  • inorganic salts in concentrations of ⁇ IOO mmol / 1, in particular ⁇ 50 nmol / 1, can also be added.
  • both the fibrinogen and factor XIII remain during storage stable in the frozen as well as in the liquid state for at least several weeks / months.
  • additional of other components such as, for example, salts of citric acid or lactic acid or one or more amino acids or a mono- or disaccharide or a sugar alcohol or one of their mixtures can be advantageous for stability.
  • the preparation according to the invention can be frozen and thawed again or frozen again after reconstitution of a fibrin glue lyophilisate and stored in the frozen state as a stable fibrinogen / F XHI preparation.
  • fibrinogen, fibrinogen / factor XIII or factor XIII concentrates for examining the stabilities of different formulations.
  • fibrinogen, F XIII or thrombin from transgenic or recombinant production can also be used as starting materials:
  • a fibrinogen concentrate was prepared from cryoprecipitate by precipitation, Al (OH) 3 adsorption, virus inactivation and further precipitation [see P. Fuhge, P. Gratz, H. Geiger. Modern methods for the production of coagulation therapeutics. Behring Inst. Mitt. 79: 164-176, (1986)]. Different chemical or physical methods can be used to inactivate or remove viruses enveloped and / or non-enveloped viruses are effective.
  • the fibrinogen concentrate was adjusted by diafiltration and subsequent concentration to the respective composition and to a final fibrinogen concentration of more than -15 mg / ml, preferably more than 60 mg / ml.
  • the stability of these fibrinogen preparations was determined in the presence of 0.05% sodium azide by storage at the respective temperature and testing relevant analysis parameters such as clottable fibrinogen, F XIII activity, viscosity, protein degradation by SDS-PAGE etc.
  • Purified factor XIII was produced from an F Xlll-containing plasma fraction (Cohn fraction I) (HE Karges and R. Rapp: Production and virus safety of human F XIII concentrates. In: Factor XIII, eds. J. McDonagh, R Seitz, R. Egbring, Schattauer, Stuttgart / New York (1993), pp. 66-76). After dialysis or diafiltration and possibly ultrafiltration, this F XIII solution was mixed with the stabilizers to be tested and, after sterile filtration, stored at various temperatures or used to top up fibrinogen concentrates.
  • Example 4 As in Example 1, a fibrinogen concentrate was prepared and the F XIII content was increased by adding a factor XIII solution. Subsequent dialysis and concentration to about 60 mg / ml fibrinogen and higher and 10 U / ml factor XIII and higher produced the preparations used for the stability test. To prevent bacterial growth, the batches still contained 0.05% sodium azide or were sterile-filtered using filters with a pore size of 0.2 ⁇ m.
  • Example 4 Example 4:
  • the lyophilized fibrinogen concentrate of a commercial fibrin glue (Beriplast P) was reconstituted in water for injections or in aprotinin solution to a fibrinogen content of> 15 mg / ml, preferably to> 60 mg / ml and dialyzed against mixtures of different additives.
  • the fibrinogen / F XIII concentrates were stored and their stability determined after various times.
  • a fibrinogen concentrate is produced from cryoprecipitate with subsequent AL (OH) 3 adsorption and virus inactivation, the F XIII concentration of which may be increased by adding purified F XIII.
  • This concentrate is adjusted by diafiltration and subsequent concentration to the respective composition and to a final fibrinogen concentration of more than 15 mg / ml, preferably more than 40 mg / ml.
  • storage is carried out in the presence of 0.05% sodium azide.
  • fibrinogen / factor XIII concentrates made, dialyzed against different formulation buffers and lyophilized.
  • the resulting lyophilisates were tested directly for stability or, after reconstitution, the solutions obtained were stored at temperatures of 0-10 ° C. and their stability checked as indicated.
  • Arginine, guanidine, citrulline, nicotinamide and their mixtures have been proven when used in the above amount. It is furthermore advantageous to add an antifibrinolytic to the preparation, in particular aprotinin, lysine, e-aminocaproic acid (EACA), p-aminomethylbenzoic acid (PAMBA) or one of their physiologically tolerable salts or derivatives, and also as a further stabilizer the fibrinogen or fibrinogen
  • Factor XHI preparation of physiologically compatible salts of organic carboxylic acids in particular citric acid or lactic acid and, if appropriate, one or more amino acids or a mono- or disaccharide or sugar alcohol.
  • organic carboxylic acids in particular citric acid or lactic acid and, if appropriate, one or more amino acids or a mono- or disaccharide or sugar alcohol.
  • mixtures of fibrinogen and factor XIII are prepared, the simultaneous presence of chaotropic agents and the additives or mixtures mentioned above ensures that the preparations achieve improved stability values for both fibrinogen and F XIII compared to the known formulations.
  • This mixture of fibrinogen and F XIII can be provided together with a preparation containing thrombin in a packaging unit intended for joint use as tissue adhesive.
  • the stability of a liquid preparation containing fibrinogen and F XIII can be further improved if fibrinogen and factor XIII are stored separately and only mixed with one another immediately before or during use.
  • the F XIII concentrate is stabilized independently of fibrinogen.
  • the essentially fibrinogen-free factor XHI preparation can be added by adding a physiologically tolerated salt of an organic di- or tricarboxylic acid, in particular citric acid, and adding other conventional stabilizers for F XIII in an amount of up to 10 percent by weight. especially up to 5 percent by weight, as well as mixtures thereof, can be stabilized for storage in the liquid state at 0 to 10 ° C or 20 to 25 ° C (see Table 3).
  • the usual stabilizers for F XIII are mono- or disaccharides or sugar alcohols and amino acids from the group consisting of glycine, glycylglycine, alanine, cysteine, histidine, glutamine or physiologically tolerable salts of glutamine. acid or aspartic acid or their mixtures advantageously used. Furthermore, additives for regulating the osmolarity, the pH value or other conventional stabilizers for F XIII can optionally be added.
  • the fibrinogen concentrate is stabilized, as already mentioned above.
  • the separate storage of factor XIII and fibrinogen preparations at 0 to 10 ° C, which are each provided with specific stabilizers, allows the production of a fibrin glue that consists of three liquid, stable components, namely the fibrinogen concentrate, F XIII concentrate and Thrombin concentrate exists.
  • the components are stable for a long time and retain their activity until they are mixed with one another immediately before or during use as a tissue adhesive.
  • the formulations given here also allow the individual components to be frozen without significant loss of activity.
  • F XIII and fibrinogen preparations stabilized according to the invention can also be used as individual components parenterally or topically for therapeutic purposes.
  • Fibrinogen (% of zero); Storage temp .: -20 ° C
  • Fibrinogen (% of zero), storage temp .: -20 ° C

Abstract

Es wird ein Gewebekleber beschrieben, der drei voneinander getrennte Komponenten enthält, nämlich eine stabilisierte, im wesentlichen fibrinogenfreie, im flüssigen Zustand lagerfähige, den Blutgerinnungsfaktor XIII enthaltende Proteinzubereitung; eine stabilisierte, im flüssigen Zustand lagerfähige, Fibrinogen enthaltende Proteinzubereitung, der zur Verhinderung oder Verminderung der Fibrinaggregation weniger als 0,28 Mol/l einer chaotropen Substanz zugesetzt ist und eine Thrombin enthaltende Zubereitung, die in einer zur gemeinsamen Anwendung vorbereiteten Verpackungseinheit bereitgestellt werden. Außerdem werden stabilisierte, tiefgefrorene oder lyophilisierte, Fibrinogen und Faktor XIII enthaltende Proteinzubereitungen beschrieben, deren Gehalt an Fibrinogen und Faktor XIII nach dem Auftauen bzw. Rekonstituieren für mehr als vier Wochen stabil ist, die eine oder mehrere, die Fibrinogenaggregation verhindernde oder vermindernde, in einer Menge von weniger als 0,28 Mol/l zugesetzte, chaotrope Substanzen enthalten und deren Gehalte an anorganischen Salzen < 100 mMol/l, vorzugsweise < 50 mMol/l betragen.

Description

Stabilisierte Proteinzubereitungen für einen Gewebekleber
Gegenstand der Erfindung ist ein Gewebekleber sowie stabilisierte Proteinzubereitungen für einen Gewebekleber oder für parenteral applizierbare Präparate, die bei der Lagerung im flüssigen Zustand oder nach Lagerung im gefrorenen Zustand beim Wiederauftauen und bei weiterer Lagerung im flüssigen Zustand über mehrere Monate oder Jahre keinen wesentlichen Wirkungsverlust zeigen.
Es ist bekannt, dass zur Verbindung menschlicher oder tierischer Gewebe Gewebekleber eingesetzt werden können, die u.a. aus den Hauptkomponenten Fibrinogen, Faktor XIII und Thrombin bestehen. Diese Proteinpräparate bedürfen einer sorgfältigen Stabilisierung, damit ihre volle Wirkung und ihre Anwendungseigenschaften bis zu ihrem chirurgischen Einsatz bei der Gewebeklebung erhalten bleiben.
Die Gewebeklebung ist eine Methode, die schon zu Beginn dieses Jahrhunderts und danach immer wieder beschrieben wurde (S. Bergel: Über Wirkungen des Fibrins. Dtsch. med. Wschr. 35:663- 5 (1909); E.P. Cronkite, E.L. Lozner, J.M. Deaver: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting. JAMA 124:976-8 (1944); H. Matras; H.P. Dinges, H. Lassmann, B. Mammoli, Wr . med. Wschr. 37:517 (1972); H. Matras, H.P. Dinges, H. Lassmann, B. Mammoli: J. max. fac. Surg. 1:37 (1973); H. Matras, F. Braun, H. Lassmann, H.P. Ammerer, B. Mammoli: Plasma clot welding of nerves (experimental report) J. max. fac. Surg. 1:236-4 (1973); H. Kuderna, H. Matras. Wiener klin. Wschr. 87:495-496 (1975)). Während anfangs noch Plasma oder Fibrinogen als Pulver eingesetzt wurden, wurde später gereinigtes Fibrinogen zum Beispiel in der Form von Kryopräzi- pitat verwendet.
Mit der kommerziellen Herstellung von Fibrinogen-/Faktor XIII- und Thrombin-Konzentraten seit den siebziger Jahren hat die Gewebeklebung erheblich an Bedeutung gewonnen und wird heute beispielsweise zur Nahtunterstützung, lokalen Hämostase, Versiegelung von Körperhöhlen zur Vermeidung von Liquorverlust sowie zur Wundversorgung eingesetzt. Die Gewebeklebung mit Fibrinklebern ist eine physiologische Methode und hat deshalb bezüglich ihrer Verträglichkeit und der Abbaubarkeit der Kleberkomponenten Vorteile gegenüber synthetischen Klebern.
Kommerziell verfügbar sind Gewebekleber entweder als Lyophili- sate oder als eingefrorene Präparate. Nach der Rekonstitution bzw. nach dem Auftauen sind die Produkte jedoch nur wenige Tage in Lösung stabil, da z.B. bei den hochkonzentrierten Fi- brinogen-/Faktor XIII-Lösungen eine Aggregation und somit eine Viskositätserhöhung oder eine (z.B. proteolytische) Inakti- vierung erfolgt, die eine weitere Anwendung unmöglich macht.
Auch die bislang in der Literatur beschriebenen und noch nicht kommerziell verfügbaren Gewebekleber bestehen in der Regel aus eingefrorenen oder gefriergetrockneten Komponenten, die vor der Verwendung aufgetaut oder aufgelöst werden müssen. Um die Verarbeitung, die Löslichkeit, das Auftauen oder die Stabili- tat des Fibrinogenkonzentrats zu verbessern, ist im europäischen Patent 0 085 923, in der deutschen Patentanmeldung 196 17 369 und in der europäischen Patentanmeldung 0 856 317 der Einsatz von chaotropen Agentien oder generell die Löslichkeit von Proteinen verbessernden Zusätzen wie Arginin oder Harnstoff oder ihren Derivaten oder Derivaten von Benzol, Imidazol, Pyrazol, Furan, Thiazol und Purin beschrieben worden. Unter chaotropen Agentien sind hier solche Agentien zu verstehen, die die Wechselwirkung von Proteinen oder Teilen davon reduzieren bzw. destabilisieren und somit deren Aggregationstendenz verringern. Dabei ist von Bedeutung, die Stabilität der Komponenten wie Fibrinogen und Faktor XIII auch in Anwesenheit dieser chaotropen Agentien und unter den gewählten Bedingungen zu gewährleisten. Dies ist bei gefrorenen und nach dem Auftauen noch für mehrere Wochen und Monate flüssig zu lagernden Fibrinogen-/Faktor XIII-Konzentraten oder bei nur flüssig zu lagernden Fibrinogen-/Faktor XIII-Konzentraten bisher noch nicht gelungen.
Sowohl bei der Flüssiglagerung, besonders aber auch bei der Lagerung im gefrorenen Zustand ist bei den bislang hierfür beschriebenen Formulierungen der Verlust an F XIII-Aktivität so hoch, dass der F XIII-Gehalt in Anwesenheit wirksamer Mengen chaotroper Agentien oft nach wenigen Wochen oder Monaten deutlich abfällt, teilweise bis unter die Nachweis- grenze.
Bei Formulierungen entsprechend der europäischen Patentanmeldung 0 856 317 hat sich hier gezeigt, dass Tranexamsäure (AMCA) , besonders auch in Anwesenheit von chaotropen Agentien wie zum Beispiel Arginin und von anorganischen Salzen, den F XIII-Gehalt im Verlaufe der Lagerung bei -20 °C deutlich reduziert (Tab. lb, Ansatz 1). Die Lagerung bei 4°C führt bei dieser Formulierung zu einem Anstieg der Viskosität (Tab. la, Ansatz 1), was eine längere Lagerung auch ausschließt. Somit sind diese Formulierungen in Hinblick auf die gleichzeitige Stabilität von Fibrinogen und F XIII als nicht-stabil zu bezeichnen. Auch im Falle von Formulierungen entsprechend DE 196 17 369 zeigen sich Probleme beim Erhalt der F XIII- Aktivität (siehe Tab. 1, Ansatz 2 und 3). Aus der europäischen Patentschrift 0487 713 ist außerdem ein biologischer Kleber für menschliche oder tierische Gewebe bekannt, der in flüssiger Form bei niedriger Temperatur stabilisiert ist. Dies soll dadurch erreicht werden, dass die Fibrinogen enthaltende Zubereitung mindestens ein chaotropes Agens in einer Konzentration zwischen etwa 0,3 M und 1 M enthält und der Kleber bei der Lagertemperatur flüssig ist.
Typischerweise enthielt ein solches Fibrinogenkonzentrat etwa 4 mM Tri-Natriumcitrat, 240 mM NaCl, 80 mM -Aminocapronsäure (EACA), 240 mM Glycin, 1% Polysorbat, 0,6 g/1 Natriumcaprolat, 0,5 M Harnstoff ggf. 2.000 KIE/ l Aprotinin und einen pH 7,5. Die Stabilität wurde bereits nach 1 Monat bewertet, was für ein therapeutisches Präparat sehr kurz ist. Die F XIII- Aktivität wurde dabei nicht bestimmt. J. Chabbat et al. berichteten auch von einem Fibrinogenkonzentrat, das bei 4°C über 6 Monate im flüssigen Zustand stabil ist (J. Chabbat, M. Tellier, P. Porte und M. Steinbuch: Properties of a new fibrin glue stable in liquid State. Thromb. Res. 76: 525-533 (1994)). Dieses Konzentrat enthielt als chaotrope Zusätze 0,5 M Harnstoff oder 5% Arginin (= 0,29 M) neben anderen Formulierungsbestandteilen, typischerweise 60 mM/1 NaCl, 20 mM/1 EACA und 60 mM/1 Glycin. Allerdings wurde auch hier nicht der F XIII-Gehalt getestet.
Diese in der europäischen Patentschrift 0 487 713 und in der Literatur beschriebenen, flüssigen Formulierungen zeichnen sich dadurch aus, daß die Aggregation (Polymerisation) und somit die Viskositätserhöhung der konzentrierten Fibrinogen- komponente bei Kühlschranktemperatur verhindert oder reduziert wird. Allerdings wird Faktor XIII, ein wesentlicher Bestandteil von Fibrinogenkonzentraten für Fibrinkleber, unter diesen Bedingungen mehr oder weniger stark inaktiviert. Bei den für eine Lagerung im gekühlten Zustand entsprechend der europäi- sehen Patentschrift 0 487 713 bzw. der verwandten Publikation von Chabbat et al. [J.Chabbat, M.Tellier, P.Porte und M. Steinbuch: Properties of a new fibrin glue stable in liquid State. Thromb. Res. 76: 525-533 (1994)] vorgesehenen Formulierungen stellt die Instabilität von F XIII dementsprechend ein wesentliches Problem dar, das auch durch die vorgeschlagenen Formulierungen nicht gelöst wird (siehe Tabelle 1, Ansätze 4- 5). Weiterhin liegt der Gehalt an chaotropen Agentien mit ca. 0,3 bis 1,0 M/1 relativ hoch, was geringere Konzentrationen chaotroper Agentien wünschenswert erscheinen läßt (<0,3 M/1).
Es lässt sich also feststellen, dass bei der Untersuchung der Stabilität von Fibrinogen/Faktor XHI-Zubereitungen sowie der Viskosität verschiedener bekannter Fibrinogen/Faktor XIII- Zubereitungen im gekühlten Zustand (0 bis 10°C) oder im gefro- renen Zustand mit anschließender Lagerung im gekühlten Zustand (0 bis 10 °C) gefunden wurde, dass die bislang beschriebenen Formulierungen zu keinen stabilen Protein-Zubereitungen führen. Entweder Fibrinogen oder Faktor XIII zeigen im Laufe der Lagerzeit erhebliche Aktivitätsverminderungen oder die Aggregation von Fibrinogen führt zu einem viskosen, nicht mehr applizierbaren Material (siehe Tab. 1, Ansätze 1 bis 5).
Es stellte sich deshalb die Aufgabe, flüssige und über mehrere Monate stabile oder gefrorene und nach dem Auftauen über mehrere Monate stabile Proteinzubereitungen zu entwickeln, in der Fibrinogen bzw. Faktor XIII über Monate oder Jahre ohne wesentlichen Wirkungsverlust stabilisiert sind.
Gelöst wird diese Aufgabe durch stabilisierte Protein- Zubereitungen, die gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil haben, dass in einer ersten Ausführungsform nicht nur Fibrinogen, sondern auch Faktor XIII durch die Zusätze stabilisiert wird und dass der Gehalt an chaotropen Reagentien reduziert werden kann oder dass in einer zweiten Ausführungs- form Fibrinogen und Faktor XIII getrennt formuliert und somit stabil erhalten werden.
Dies erfolgt dadurch, dass bei eingefrorenen und nach dem Auftauen noch mehrere Wochen oder Monate stabil zu haltenden Präparaten ein chaotropes Agens entsprechend der hier gegebenen Definition in geringerer Konzentration zur Vermeidung der Fibrinogen-Aggregation eingesetzt wird, dass die Konzentration anorganischer Salze reduziert wird und dass ggf. ein Antifibrinolytikum sowie weitere übliche Zusätze und Puffersubstanzen verwendet werden. Ein hierfür eingesetztes Fibrinogenpräparat kann dabei noch aus dem Ausgangsmaterial stammenden Faktor XIII und noch weitere Plasmaproteine wie zum Beispiel Fibronectin und den von Willebrand-Faktor (vWF) enthalten oder gereinigten Faktor XIII als Zusatz.
Als Antifibrinolytikum können Aprotinin oder Lysin oder e- Aminocapronsäure (EACA) oder p-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA) oder deren physiologisch unbedenkliche Salze eingesetzt werden. Bei Untersuchungen zum Einfluss verschiedener Antifibrinolytika hat sich überraschenderweise gezeigt, dass Lysin, PAMBA oder EACA die F XIII-Aktivität nicht negativ beinflussen, während bei Tranexamsäure dies der Fall ist. Besonders bei eingefrorenen, aber auch bei flüssig gelagerten Fibrinogen/F XIII-Mischungen ist deshalb die Verwendung von EACA oder Lysin der Verwendung von AMCA vorzuziehen. Als weitere Stabilisatoren für F XIII können z.B. Natrium-Citrat, Aminosäuren und Zucker eingesetzt werden.
An Stelle der vorstehend beschriebenen Proteinzubereitungen, die sowohl Faktor XIII als auch Fibrinogen mit ihren jeweiligen Stabilisatoren enthalten, ist es auch möglich und aus Gründen der besseren Stabilität sogar vorzuziehen, beide Konzentrate getrennt voneinander aufzubewahren und erst un- mittelbar vor der Anwendung als Gewebekleber zusammen mit der thrombinhaltigen Zubereitung zu vermischen. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein Gewebekleber, der aus einer den stabilisierten Faktor XIII enthaltenden Lösung, einer das stabilisierte Fibrinogen enthaltenden Lösung sowie einer stabilisiertes Thrombin enthaltenden Lösung besteht, die getrennt voneinander in einer zur gemeinsamen Anwendung vorbereiteten Verpakkungseinheit bereitgestellt werden. Dies hat auch den weiteren Vorteil, dass bei Bedarf das Verhältnis von Faktor XIII und Fibrinogen geändert und der jeweiligen Situation angepasst werden kann.
A) Gefrorene oder lyophilisierte Konzentrate, die auch im flüssigen Zustand noch mehrere Wochen/Monate bei 0 bis 10°C gelagert werden können (siehe Tabelle 1)
Stabile, gefrorene Fibrinogenkonzentrate sind bekannt und beschrieben, wobei deren Stabilität nach dem Auftauen aber auf wenige Tage begrenzt ist. Die beschränkte Haltbarkeit des Fibrinogenkonzentrats ist u.a. darauf zurückzuführen, dass die Viskosität durch Aggregation des Fibrinogens alsbald ansteigt. Zwar kann eine niedrige Viskosität durch den Zusatz von aggregationsverhindernden, also chaotropen Verbindungen im flüssigen Zustand erhalten werden. Diese Agentien haben aber den Nachteil, dass sie im gefrorenen Zustand (zum Beispiel bei -20°C) zu einem Abfall der Faktor XIII-Aktivität führen. Der Verlust an F XIII-Aktivität tritt dabei in der Regel umso schneller ein, je höher die Konzentration an chaotropen Agentien ist.
Bei der Entwicklung der erfindungsgemäßen stabilisierten Proteinzubereitungen hat sich nun gezeigt, daß nicht jedes chaotrope Agens die Stabilität des Faktor XIII gleichermaßen beeinflusst und dass vor allem auch die anderen erfindungsgemäß zuzusetzenden Additive von erheblichem Einfluß auf die Faktor Xlll-Stabilität und auf die von der Fibrinogen- aggregation beeinflußte Viskosität sind. So ist Arginin bei gleicher Molarität wesentlich effektiver beim Verhindern der Fibrinogenpolymerisation bzw. Aggregation als Harnstoff. Außerdem wirken sich anti- fibrinolytische Zusätze wie die 6- Aminocapronsäure (EACA), die p-Aminomethylcyclohexancarbon- säure (AMCA) oder die p-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA) sowie deren physiologisch unbedenkliche Salze auf die Fibrinogen- Aggregation und die F XHI-Stabilität aus. Besonders AMCA wirkt hier negativ auf die F XIII-Aktivität bei Lagerung im gefrorenen Zustand. Überraschenderweise verursacht EACA, obwohl von der chemischen Struktur dem AMCA sehr ähnlich, unter entsprechenden Bedingungen nicht den gleichen Faktor XIII-Abfall wie AMCA. Ausserdem wurde gefunden, daß die F XIII-Aktivität bei gefrorenen Protein-Konzentraten in Anwesen- heit bestimmter Konzentrationen chaotroper Agentien nicht vermindert wird, wenn auf den in derartigen Zubereitungen bisher üblichen Zusatz anorganischer Salze ganz oder weitgehend verzichtet wird. So wurde erfindungsgemäß eine Zubereitung entwickelt, in der Fibrinogen und Faktor XIII nach dem Einfrieren und Wiederauftauen für mindestens mehrere Wochen oder sogar Monate flüssig bleiben und die Aktivität erhalten wird, wenn diese Formulierung als eine die Fibrinogen- aggregation verhindernde oder vermindernde Substanz eine chaotrope Verbindung in einer Menge von weniger als 0,28 Mol/1 enthält. Insbesondere Arginin in einer Menge von etwa 2 Gewichtsprozent hat sich bewährt. Andere, leicht chaotrope Agentien wie Citrullin, Nicotinamid o.a. oder Mischungen davon bzw. mit Arginin können in einer Menge von bis zu ca. 0,28 M, insbesondere von 0,1 bis 0,20 M eingesetzt werden. Außerdem können neben Antifibrinolytika auch anorganische Salze in Konzentrationen von ≤IOO mMol/1, insbesondere von ≤50 rnMol/1 zugesetzt sein.
In einer der erfindungsgemäßen Zubereitungen bleibt sowohl das Fibrinogen als auch der Faktor XIII sowohl bei der Lagerung im gefrorenen als auch im flüssigen Zustand mindestens mehrere Wochen/Monate stabil. Für die Stabilität günstig kann noch der Zusatz anderer Komponenten wie zum Beispiel Salze der Zitronensäure oder der Milchsäure oder eine oder mehrere Aminosäuren oder ein Mono- oder Disaccharid oder ein Zuckeralkohol oder eine ihrer Mischungen sein. Bei diesen Zusammensetzungen kann die erfindungsgemäße Zubereitung wieder eingefroren und aufgetaut werden bzw. nach Rekonstitution eines Fibrinkleberlyophilisates wieder eingefroren und im gefrorenen Zustand als stabiles Fibrinogen/F XHI-Präparat gelagert werden. Da das Wiedereinfrieren bei den handelsüblichen, für einen Gewebekleber eingesetzten, gefrorenen oder lyophilisierten Proteinzubereitungen nicht möglich ist, zeigt sich hierin ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Formulierungen. Diese Eigenschaft erleichtert den Umgang mit Lyophilisaten nach dem Rekonstituieren oder von gefroren gelagerten Präparaten, falls nicht die gesamte Menge auf einmal verbraucht werden kann.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Fibrinogen-, Fibrinogen/Faktor XIII- bzw. Faktor XIII- Konzentraten zur Untersuchung der Stabilitäten unterschiedlicher Formulierungen. Als Ausgangsmaterialien sind zum Beispiel aber auch Fibrinogen, F XIII oder Thrombin aus transgener bzw. rekombinanter Herstellung einsetzbar:
Beispiel 1:
Ein Fibrinogenkonzentrat wurde aus Kryopräzipitat durch Fällung, Al(OH)3-Adsorption, Virusinaktivierung und weitere Fällung hergestellt [siehe P. Fuhge, P. Gratz, H. Geiger. Moderne Methoden zur Herstellung von Gerinnungstherapeutika. Behring Inst. Mitt. 79:164-176, (1986)]. Zur Virusinaktivierung bzw. -Entfernung können unterschiedliche chemische oder physikalische Verfahren eingesetzt werden, die gegen umhüllte und/oder nicht-umhüllte Viren effektiv sind. Das Fibrinogenkonzentrat wurde durch Diafiltration und anschließende Ankonzentrierung auf die jeweilige Zusammensetzung sowie auf eine Fibrinogen-Endkonzentration von mehr als - 15 mg/ml, bevorzugt auf mehr als 60 mg/ml eingestellt. Die Stabilität dieser Fibrinogen-Präparate wurde in Anwesenheit von 0,05% Natriumazid durch Lagerung bei der jeweiligen Temperatur und Prüfung relevanter Analysenparameter wie gerinnbarem Fibrinogen, F XIII-Aktivität, Viskosität, Proteinabbau durch SDS-PAGE etc. bestimmt.
Beispiel 2:
Gereinigter Faktor XIII wurde aus einer F Xlll-haltigen Plasmafraktion (Cohn-Fraktion I) hergestellt (H.E. Karges und R. Rapp: Production and virus safety of human F XIII concen- trates. in: Factor XIII, eds . J. McDonagh, R. Seitz, R. Egbring, Schattauer, Stuttgart/New York (1993), S. 66-76). Diese F XIII-Lösung wurde nach Dialyse oder Diafiltration und ggf. Ultrafiltration mit den zu testenden Stabilisatoren versetzt und nach Sterilfiltration bei verschiedenen Temperaturen gelagert oder zur Aufstockung von Fibrinogenkonzentraten verwendet.
Beispiel 3:
Wie in Beispiel 1 wurde ein Fibrinogenkonzentrat hergestellt und der F XIII-Gehalt durch Zugabe einer Faktor XIII-Lösung aufgestockt. Durch anschließende Dialyse und Ankonzentrierung auf ca. 60 mg/ml Fibrinogen und höher sowie 10 E/ml Faktor XIII und höher wurden die für die Stabilitätsuntersuchung verwendeten Zubereitungen hergestellt. Zur Verhinderung von Bakterienwachstum enthielten die Ansätze noch 0,05% Natriumazid oder wurden mit Filtern von 0,2 μm Porengröße sterilfil- triert. Beispiel 4 :
Das lyophilisierte Fibrinogenkonzentrat eines kommerziellen Fibrinklebers (Beriplast P) wurde in Wasser für Injektions- zwecke oder in Aprotinin-Lösung auf einen Fibrinogengehalt von >15 mg/ml, bevorzugt auf >60 mg/ml rekonstituiert und gegen Mischungen unterschiedlicher Zusätze dialysiert. In Anwesenheit von 0,05% NaN3 zur Vermeidung von Bakterienwachstum wurden die Fibrinogen/F Xlll-Konzentrate gelagert und ihre Stabilität nach verschiedenen Zeiten bestimmt.
Beispiel 5:
Aus Kryopräzipitat mit nachfolgender AL(OH)3-Adsorption und Virusinaktivierung wird ein Fibrinogenkonzentrat hergestellt, dessen F XIII-Konzentration ggf. durch Zugabe von gereinigtem F XIII aufgestockt wird. Dieses Konzentrat wird durch Diafiltration und anschließende Ankonzentrierung auf die jeweilige Zusammensetzung sowie auf eine Fibrinogen-Endkonzen- tration von mehr als 15 mg/ml, bevorzugt auf mehr als 40 mg/ml eingestellt. Zur Überprüfung der Lagerstabilität wird in Anwesenheit von 0,05% Natriumazid gelagert.
Beispiel 6:
Entsprechend den o.g. Beispielen wurden Fibrinogen-/Faktor XIII-Konzentrate hergestellt, gegen unterschiedliche Formulierungspuffer dialysiert und lyophilisiert . Die resultierenden Lyophilisate wurden direkt auf Stabilität getestet oder nach Rekonstitution wurden die erhaltenen Lösungen bei Temperaturen von 0-10 °C gelagert und deren Stabilität wie angegeben überprüft.
Die Stabilität von Fibrinogen-, F XIII- sowie Fibrinogen-/F XHI-Präparaten hergestellt entsprechend einem der Beispiele 1-6 wurde durch Lagerung bei der jeweiligen Temperatur und Testung relevanter Analysenparameter bestimmt. Ergebnisse dieser Testungen sind in Tabelle 1 bis 3 aufgeführt. Generell sind jedoch auch andere Methoden zur Herstellung von Fibrino- gen oder Faktor XIII geeignet, die z.B. andere Reiningungs- schritte enthalten können.
B) Flüssig gelagerte Konzentrate enthaltend Fibrinogen- oder Fibrinogen/Faktor XIII-Konzentrat (siehe Tabellen 1 und 2)
Auch bei flüssigen Fibrinogen- bzw. Fibrinogen-/Faktor XIII- Konzentraten, die nicht eingefroren, sondern nur im gekühlten Zustand bei ca. 0 bis 10°C gelagert werden, muß die Ag- gregation und somit die Viskositätserhöhung durch den Zusatz von chaotropen Agentien kontrolliert werden. Im Allgemeinen fällt dadurch die Faktor XIII-Aktivität mehr oder weniger stark ab (vgl. Tab 1, Ansatz 4 und 5 ) . Es wurde nun gefunden, dass die Viskositätserhöhung verhindert oder vermindert und der Faktor XIII-Abfall verringert werden kann, wenn die chaotrope Substanz in einer Menge von weniger als 0,28 Mol/1 eingesetzt wird. Als geeignete chaotrope Substanzen haben sich z.B. Arginin, Guanidin, Citrullin, Nicotinamid und ihre Mischungen erwiesen, wenn sie in der vorstehend genannten Menge eingesetzt werden. Vorteilhaft ist es weiterhin, der Zubereitung noch ein Antifibrinolytikum zuzusetzen, wobei vor allem Aprotinin, Lysin, e-Aminocapronsäure (EACA), p-Amino- methylbenzoesäure (PAMBA) oder eines ihrer physiologisch verträglichen Salze oder Derivate in Betracht kommen, sowie als weiteren Stabilisator der Fibrinogen- bzw. Fibrinogen-
/Faktor XHI-Zubereitung physiologisch verträgliche Salze organischer Carbonsäuren, insbesondere der Zitronensäure oder der Milchsäure und ggfs. eine oder mehrere Aminosäuren oder ein Mono- oder Disaccharid oder Zuckeralkohol. Damit ist es möglich, in Fibrinogenkonzentraten mit einem Fibrinogengehalt von mehr als 15 mg/ml, insbesondere von mehr als 60 mg/ml, beim Einsatz von chaotropen Agentien bis zu einer Menge von 0,28 M verbesserte Stabilitäten zu erzielen.
Werden Mischungen von Fibrinogen und Faktor XIII hergestellt, dann sichert die gleichzeitige Anwesenheit von chaotropen Agentien und den obengenannten Zusätzen oder Mischungen, dass die Zubereitungen gegenüber den bekannten Formulierungen verbesserte Stabilitätswerte sowohl für Fibrinogen als auch für F XIII erreichen. Diese Mischung aus Fibrinogen und F XIII kann zusammen mit einer Thrombin enthaltenden Zubereitung in einer zur gemeinsamen Anwendung als Gewebekleber vorgesehenen Verpackungseinheit bereitgestellt werden.
C) Flüssige Konzentrate mit getrennter Aufbewahrung von Fibrinogen und F XIII (siehe Tabellen 1-3)
Es hat sich gezeigt, dass die Stabilität einer flüssigen, Fibrinogen und F XIII enthaltenden Zubereitung weiter verbessert werden kann, wenn Fibrinogen und Faktor XIII getrennt aufbewahrt und erst unmittelbar vor bzw. während der Anwendung miteinander gemischt werden. In diesem Falle wird das F XIII-Konzentrat unabhängig von Fibrinogen stabilisiert. Wie sich gezeigt hat, kann die im wesentlichen fibrinogenfreie Faktor XHI-Zubereitung durch Zusatz eines physiologisch verträglichen Salzes einer organischen Di- oder Tricarbonsäu- re, insbesondere der Zitronensäure und den Zusatz weiterer üblicher Stabilisatoren für F XIII in einer Menge von bis zu 10 Gewichtsprozent, besonders bis zu 5 Gewichtsprozent, sowie Mischungen davon für die Lagerung im flüssigen Zustand bei 0 bis 10°C oder 20 bis 25 °C stabilisiert werden (siehe Tabelle 3). Als übliche Stabilisatoren für F XIII werden Mono- oder Disaccharide oder Zuckeralkohole und Aminosäuren aus der Gruppe Glycin, Glycylglycin, Alanin, Cystein, Histidin, Glutamin oder physiologisch verträgliche Salze der Glutamin- säure oder der Asparaginsäure oder ihre Mischungen vorteilhaft eingesetzt. Weiterhin können ggf. Zusätze zur Regelung der Osmolarität, des pH-Wertes oder andere übliche Stabilisatoren für F XIII zugesetzt werden. Das Fibrinogenkonzentrat wird, wie bereits oben erwähnt, stabilisiert.
Die getrennte Lagerung von Faktor XIII- und Fibrinogen- Zubereitungen bei 0 bis 10°C, die jeweils mit spezifischen Stabilisatoren versehen sind, erlaubt die Herstellung eines Fibrinklebers, der aus drei flüssigen, stabilen Komponenten, nämlich dem Fibrinogenkonzentrat, F XIII-Konzentrat und dem Thrombin-Konzentrat besteht. In dieser Form sind die Komponenten über lange Zeit haltbar und behalten ihre Aktivität bis sie unmittelbar vor oder während der Anwendung als Gewebekle- ber miteinander gemischt werden. Die hier angegebenen Formulierungen erlauben auch das Einfrieren der einzelnen Komponenten ohne signifikanten Aktivitätsverlust.
Die erfindungsgemäß stabilisierten F XIII und Fibrinogenzube- reitungen können außerdem auch als Einzelkomponenten parenteral oder topisch zu therapeutischen Zwecken eingesetzt werden.
Formulierungen enthaltend Fibrinogen und/oder F XIII:
Formulierungen analog dem Stand der Technik:
1. 0,1 Mol/1 NaCl, 3 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 8 g/1 Glycin, 0,09 Mol/1 L-Arginin, 0,58 Mol/1 AMCA, pH 7 , 4
2. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 1% Glycin, 2% Nicotinamid, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7,5
3. 1,8 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 16,3 g/1 Glycin, 0,36 g/1 Triton, 8,1 g/1 HSA, 0,2 Mol/1 Nicotinamid, pH 7,3 4. 0,15 Mol/1 NaCl, 0,29 Mol/1 L-Arginin, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7,0
5. 0,15 Mol/1 NaCl, 0,5 Mol/1 Harnstoff, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7,0
Erfindungsgemäße Formulierungen sowie Vergleichsansätze enthaltend Fibrinogen oder Fibrinogen/Faktor XIII:
6. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,12 Mol/1 L-Arginin, pH 7 , 4
7. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,12 Mol/1 L-Arginin, 0,14 Mol/1 Citrullin, pH 7 , 4
8. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,095 Mol/1 L-Arginin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,4
9. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,12 Mol/1 L-Arginin, 0,14 Mol/1 Citrullin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,4
10. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,12 Mol/1 L-Arginin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,4 *
11. 0,1 Mol/1 NaCl, 6 g/1 Na3.-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,4
12. 0,1 Mol/1 NaCl, 6 g/1 Na3.-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 320 mMol/1 L-Lys , pH 7 , 4
13. 6 mg/ml Na3-Citrat x 2 H20, 0,12 Mol/1 L-Arginin, 0,14 Mol/1 Citrullin, 80 mMol/1 EACA, pH 7 , 4
14. 3 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,0 15. 0,15 M NaCl, 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7,0
16. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin x HC1,' 80 mMol/1 EACA, pH 7 , 5
17. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin x HC1, 80 mMol/1 PAMBA, pH 7 , 2
18. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin x HCl, 8% Mannit, 80 mMol/1 EACA, pH 7 , 5
19. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,15 M NaCl, 2% Nikotinamid, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7,5
20. 0,15 Mol/1 NaCl, 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 320 mMol/1 Lys , pH 7 , 5
21. 0,15 Mol/1 NaCl, 6 g/1 Na3.-Citrat x 2 H20 0,24 Mol/1 L-Arginin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,5
22. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 320 mMol/1 Lys, pH 7,0
23. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 80 mMol/1 EACA, pH 7,0
24. 0,15 Mol/1 NaCl, 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 2% L-His, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7 , 5
25. 0,15 Mol/1 NaCl, 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 0,24 Mol/1 L-Arginin, 2% Saccharose, 1.000 KIE/ml Aprotinin, pH 7,5
* Ansatz hergestellt durch Rekonstitution des entsprechenden Lyophilisates mit Wasser für Injektionszwecke Erfindungsgemäße Formulierungen enthaltend F XIII als Einzelkomponente
26. 1,5 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 2,9 g/1 NaCl, 3 g/1 L-Arginin x HC1, pH 7 , 4
27. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, pH 7 , 4
28. 1,5 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 2,9 g/1 NaCl, pH 7,4
29. 3 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 1% Gly, pH 7 , 4
30. 3 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 2% Mannit, 10 mMol/1 L-His, pH 7,4
31. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 2% Mannit, pH 7,4
32. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 1% HSA, pH 7 , 4
33. 5 mMθl/1 EDTA, 50 mMol/1 Tris x HC1, pH 7 , 4
34. 6 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 1% L-His, pH 7 , 4
35. 1,5 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 2,92 g/1 NaCl, 50 mMol/1 Glycylglycin, pH 7 , 4
36. 3 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 1% L-His, pH 7,4
37. 3 g/1 Na3-Citrat x 2 H20, 38 mMol/1 Glycylglycin, pH 7 , 4 - II
Tabelle la: Stabilität von Fibrinogen bzw. Fibrinogen/F XIII in verschiedenen Formulierungen bei 4°C
Beurteilung Viskosität (Lagertemperatur: 4°C): 1 = geringe Viskosität, 2 = mittlere Viskosität, 3 = hohe Viskosität, 4 = fest bei 4°C
Figure imgf000020_0001
Fibrinogen (% vom Nullwert), Lagertemp.: 4°C
Figure imgf000020_0002
Faktor XIII (% vom Nullwert); Lagertemp.: 4°C
Figure imgf000021_0001
Tabelle lb: Stabilität von Fibrinogen bzw. Fibrinogen/F XIII in verschiedenen Formulierungen bei -20°C
Beurteilung Viskosität nach dem Auftauen (Lagertemperaturen: -20°C); 1 = geringe Viskosität, 2 = mittlere Viskosität, 3 = hohe Viskosität, 4 = fest bei 4°C
Figure imgf000021_0002
Fibrinogen (% vom Nullwert); Lagertemp.: -20°C
Figure imgf000022_0001
Faktor XIII (% vom Nullwert); Lagertemp.: -20°C
Figure imgf000022_0002
Tabelle 2a: Stabilität von Fibrinogen bzw. Fibrinogen/F XIII in verschiedenen Formulierungen bei 4°C
Beurteilung Viskosität (Lagertemperatur 4°C); 1 = geringe Viskosität, 2 = mittlere Viskosität, 3 = hohe Viskosität, 4 = fest bei 4°C
Figure imgf000023_0001
Fibrinogen (% vom Nullwert), Lagertemp.: 4°C
Figure imgf000023_0002
Faktor XIII (% vom Nullwert), Lagertemp.: 4°C
Figure imgf000024_0001
Tabelle 2b: Stabilität von Fibrinogen bzw. Fibrinogen/F XIII in verschiedenen Formulierungen bei -20°C
Beurteilung Viskosität nach dem Auftauen (Lagertemperatur : 20°C): 1 = geringe Viskosität, 2 = mittlere Viskosität, 3 hohe Viskosität, 4 = fest bei 4°C
Figure imgf000024_0002
Fibrinogen (% vom Nullwert), Lagertemp.: -20°C
Figure imgf000025_0001
Tabelle 3: Stabilität von Faktor XIII in verschiedenen Formulierungen bei 4°C, 20 bis 25 °C und -20°C
Faktor XII (% vom Nullwert), Lagertemp.: 4°C
Figure imgf000025_0002
Faktor XIII (% vom Hundert), Lagertemp.: -20°C
Figure imgf000026_0001
Faktor XIII (% vom Nullwert), Lagertemp.: 20 bis 25°C
Figure imgf000026_0002

Claims

Patentansprüche:
1. Lagerfähiger Gewebekleber, dadurch gekennzeichnet, dass er drei voneinander getrennte Komponenten enthält, nämlich
eine stabilisierte, im wesentlichen fibrinogen- freie, im flüssigen Zustand lagerfähige, den Blutgerinnungsfaktor XIII enthaltende Proteinzubereitung,
eine stabilisierte, im flüssigen Zustand lagerfähige, Fibrinogen enthaltende Proteinzubereitung, der zur Verhinderung oder Verminderung der Fibrino- genaggregation weniger als 0,28 Mol/1 einer chaotropen Substanz zugesetzt ist,
eine Thrombin enthaltende Zubereitung,
die in einer zur gemeinsamen Anwendung vorbereiteten Verpak- kungseinheit bereitgestellt werden.
2. Gewebekleber nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwei der genannten Komponenten, nämlich
die den Faktor XIII enthaltende Proteinzubereitung und
- die das Fibrinogen enthaltende Proteinzubereitung
miteinander vermischt und außerdem eine davon getrennte, Thrombin enthaltende Zubereitung in einer zur gemeinsamen Anwendung vorbereiteten Verpackungseinheit bereitgestellt werden.
3. Gewebekleber nach den Ansprüchen 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet, dass der den Faktor XIII enthaltenden und im wesentlichen fibrinogenfreien Proteinzubereitung
- ein physiologisch verträgliches Salz einer organischen Di-, Tri- oder Tetracarbonsäure, insbesondere der Zitronensäure, und
weitere, teilweise bekannte Stabilisatoren und/oder Puffersubstanzen für den Faktor XIII zugesetzt sind.
4. Gewebekleber nach den Ansprüchen 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass der den Faktor XIII enthaltenden Proteinzubereitung als weitere Stabilisatoren
ein Mono- oder Disaccharid oder ein Zuckeralkohol und/oder
- eine Aminosäure aus der Gruppe Glycin, Glycylgyl- cin, Alanin, Cystein, Histidin, Glutamin oder ein physiologisch verträgliches Salz der Glutamin- oder Asparaginsäure und/oder
- ein reduzierendes oder oxidationsverhinderndes Agens und/oder
eine oberflächenaktive Substanz zugesetzt sind.
5. Gewebekleber nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der das Fibrinogen enthaltende Proteinzubereitung zur Verhinderung oder Verminderung der Fibrinogen- aggregation eine oder mehrere chaotrope Verbindungen aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Guanidin, Citrullin, Harnstoff oder seinen Derivaten sowie Nicotinamid oder ihre Mischungen in einer Konzentration von weniger als 0,28 Mol/1 zugesetzt sind.
6. Gewebekleber nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der das Fibrinogen entahltenden Proteinzubereitung zusätzlich ein Antifibrinolytikum ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aprotinin, e-Aminocapronsäure (EACA) , p-Aminomethylbenzoesäure (PAMBA), Lysin oder einem ihrer physiologisch verträglichen Salze zugesetzt ist.
7. Gewebekleber nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der das Fibrinogen enthaltenden Proteinzubereitung zusäztlich als Stabilisator
- ein physiologisch verträgliches Salz einer organischen Carbonsäure, insbesondere der Zitronensäure oder der Milchsäure, oder
eine oder mehrere Aminosäuren oder
ein Mono- oder Disaccharid oder
ein Zuckeralkohol
oder eine ihrer Mischungen zugesetzt ist.
8. Stabilisierte, tief efrorene oder lyophilisierte, Fibrinogen und Faktor XIII enthaltende Proteinzubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Gehalt an Fibrinogen und Faktor XIII nach dem Auftauen bzw. Rekonstituieren bei Flüssiglagerung für mehr als vier Wochen stabil ist, dass sie eine oder mehrere, die Fibrinogenaggregation verhindernde oder vermindernde, in einer Menge von weniger als 0,28 Mol/1 zugesetzte, chaotrope Substanzen enthält und dass ihr Gehalt - 21
an anorganischen Salzen <100 mMol/1, vorzugsweise <50 mMol/1 ist.
9. Proteinzubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als eine die Fibrinogenaggregation verhindernde oder vermindernde Substanz eine chaotrope Verbindung aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Guanidin, Harnstoff oder Derivaten davon sowie Citrullin oder ihren Mischungen verwendet wird.
10. Proteinzubereitung nach den Ansprüchen 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein Antifibrinolytikum ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aprotinin, e-Aminoca- pronsäure (EACA), p-Aminomethylbenoesäure (PAMBA), Lysin oder eines ihrer physiologisch verträglichen Salze enthält.
11. Proteinzubereitung nach den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich als Stabilisator
- ein physiologisch verträgliches Salz einer organischen Carbonsäure, insbesondere der Zitronensäure oder der Milchsäure, oder
eine oder mehrere Aminosäuren oder
eine Mono- oder Disaccharid oder
einen Zuckeralkohol
oder eine ihrer Mischungen enthält.
12. Proteinzubereitung nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Gehalt an wasserlöslichen, anorganischem Salz <100 mMol/1, vorzugsweise <50 mMol/1, besonders bevorzugt <20 mMol/1 beträgt.
13. Proteinzubereitung nach den Ansprüchen 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie neben Fibrinogen noch den aus dem Ausgangsmaterial stammenden oder zusätzlich zugegebenen Faktor XIII enthält.
14. Proteinzubereitung nach den Ansprüchen 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie neben Fibrinogen und Faktor XIII noch weitere Plasmaproteine enthält und zur Herstellung eines Gewebeklebers nach Anspruch 1 einsetzbar ist.
15. Verwendung einer Proteinzubereitung entsprechend den Ansprüchen 8 bis 14 als Therapeutikum für die parenterale oder topische Anwendung.
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