WO2001059097A1 - Verwendung funktionalisierter, poröser membranen bzw. matrizes zur aufreinigung von nukleinsäuren sowie entsprechende verfahren - Google Patents

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WO2001059097A1
WO2001059097A1 PCT/EP2001/001133 EP0101133W WO0159097A1 WO 2001059097 A1 WO2001059097 A1 WO 2001059097A1 EP 0101133 W EP0101133 W EP 0101133W WO 0159097 A1 WO0159097 A1 WO 0159097A1
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membrane
matrix
nucleic acids
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purification
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PCT/EP2001/001133
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Thomas Kolzau
Heinz-Gerhard KÖHN
Wilhelm PLÜSTER
Mathias Ulbricht
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Eppendorf Ag
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the invention relates to a functionalized membrane or matrix for the purification of nucleic acids and to methods for the purification of nucleic acids in which such membranes / matrices are used.
  • Generic membranes are e.g. known from U.S. Patent 5,438,128.
  • the porous polymer membranes described here e.g. Made of polypropylene or nylon, are functionalized with ion exchange groups. With a low ion concentration, the functionalized membranes bind ionized nucleic acids, while an elution of the bound nucleic acids takes place with a high ion concentration.
  • the known membranes are used in methods or kits for nucleic acid purification.
  • the possibly pre-cleaned starting material containing the nucleic acids is first sucked or pressed through the porous membrane in a binding buffer with a low ion concentration.
  • the nucleic acids are selectively bound by the ion exchange groups on the membrane surface.
  • the membrane is then optionally washed with a buffer of higher ionic strength in order to separate non-specifically bound impurities.
  • the bound nucleic acids are then eluted in a further step with a buffer of even higher ionic strength.
  • a disadvantage of the known method is that, because of the high salt concentration, the eluate generally continues e.g. must be purified by means of ethanol precipitation or dialysis.
  • the essential feature of the membranes used according to the invention for the purification of nucleic acids is that their surface is functionalized with deprotonable groups.
  • Such membranes have been described by Ulbricht and Riedel in Biomaterials 19 (1998) 1229-1237 in connection with the immobilization of proteins.
  • the determination according to the invention, namely the purification of nucleic acids, was not mentioned or hinted at the time.
  • An essential property of the membranes used according to the invention is. that due to the functionalization with deprotonatable groups they have a surface have before, whose affinity for nucleic acids is variably adjustable (switchable). As has been shown, the binding properties of the membrane can be adjusted reproducibly, in particular depending on the pH and / or depending on the ion concentration.
  • the membranes can e.g. for the purification of nucleic acids from PCR batches but also generally for the purification of mRNA, total RNA or DNA, in particular plasmid DNA (pDNA) or genomic DNA.
  • pDNA plasmid DNA
  • nucleic acids are preferably bound in the absence of chaotropic reagent. Elution of the bound nucleic acids is possible under low salt conditions and possibly at room temperature, which considerably simplifies the work-up. Of course, it is also possible to work up in the presence of chaotropic reagents, if this is desired.
  • the membranes have good binding properties for nucleic acids at a pH below or in the range of the pK value of their surface and / or increased ion concentration. encryption if the pH is shifted to alkaline and / or if the ion concentration of the medium surrounding the membrane is reduced, the affinity of the membrane for nucleic acids decreases, and under these circumstances, for example, the elution of the bound nucleic acids is possible.
  • the conditions with which the membranes can be used for nucleic acid purification can therefore be set very variably and adapted to the different purposes.
  • the membranes have hydrophilic surface properties due to their functionalization and are therefore very easy to wet.
  • the volumes of the elution buffers used can be kept very low.
  • the membranes used according to the invention are functionalized in particular with sulfonic acid, carboxylic acid or phosphoric acid groups.
  • Such membranes have particularly precisely switchable surface properties, i.e. their affinity for nucleic acids can be adjusted well via the pH and / or the ion concentration of the surrounding medium.
  • the membrane according to the invention with switchable surface properties, it is basically sufficient to provide the deprotonatable groups directly in or on the membrane surface. It is only important that the groups come into contact with the surrounding medium and, depending on the conditions in the medium, are in a neutral or deprotonated state.
  • the groups are preferably provided on polymer chains, in particular, for example, polyacrylic acid, one end of which is fixed to the surface of the membrane and the other end of which is freely movable.
  • Membranes in this configuration can have different interface states. At a pH value below or in the range of the pK value of the membrane surface or at higher ion concentrations (e.g.> 500mM) the polymer chains lie close to the membrane. In this state, nucleic acid molecules can adsorb on the membrane surface particularly efficiently, presumably heterogeneous interactions such as van der Waals forces or hydrophobic but also ionic interactions between the nucleic acid and the polymer chain and the functional groups of the polymer chain play a role.
  • ion concentrations e.g. 500mM
  • the membrane environment is adjusted to a neutral to alkaline pH value and / or a low ion concentration, the polymer chains protrude from the membrane surface.
  • the bound nucleic acids can be eluted from the polymer chains in a particularly simple manner, both ionic interactions (the functional groups in the polymer chains being negatively charged and repelling the likewise negatively charged nucleic acid molecule) and possibly purely mechanical reasons play.
  • the membranes used according to the invention are made in particular of plastic.
  • Preferred materials are polypropylene, polyamide, polyester, polysulfone or PVDF.
  • Membranes in the sense of the invention are all flat solid phases, which preferably have a layer thickness of less than 500 micrometers.
  • the pore diameter is preferably 0.2 to 10 micrometers.
  • membranes according to the invention are to be used in particular in high-throughput applications, a further advantageous embodiment provides that they are assembled for use in microtiter filter plates, spin columns or reaction vessels.
  • the invention is therefore also intended to cover the use of such matrices which are suitable for purifying nucleic acids and which are equipped with a functionalized surface as mentioned above.
  • the configurations mentioned in connection with the membrane according to the invention can also be used with such matrices.
  • a particularly suitable matrix in this context would be e.g. a filter.
  • fleece, felt, fibers or sintered material would also be suitable.
  • Appropriately equipped pipette tips or reaction vessels (e.g. consumables) with e.g. Microstructure channels come into question.
  • the invention also relates to methods for nucleic acid purification in which the membranes or matrices mentioned above can be used.
  • process parameters are initially specified in three independent claims, under which nucleic acids can be selectively bound.
  • the following explanation refers to membranes. However, the explanations also apply analogously to a flowable matrix.
  • the nucleic acid binding is achieved by allowing a solution of the starting material containing the nucleic acids to permeate through the membrane in a binding buffer with an ion concentration of more than 100 mM, the pH value preferably being below or in the range of the pK value of the membrane or matrix surface. During the passage, the nucleic acids are selectively absorbed by the membrane surface.
  • the ion concentration of the binding buffer is particularly preferably set to a value of> 500 mM. A reproducible quantitative yield was observed at these values.
  • the affinity of the membrane / matrix for nucleic acids is adjusted via the pH.
  • a binding buffer with a pH value is selected that is in the range or below or in the range of the pK value, e.g. the membrane surface. Even under these conditions, the nucleic acids are absorbed almost quantitatively if a solution of the starting material containing the nucleic acids is allowed to permeate through the membrane in a binding buffer with the pH mentioned.
  • the third variant provides that the starting material is taken up in a binding buffer which contains a precipitant in a concentration. contains half the value in which nucleic acids fail.
  • Polyethylene glycol (PEG) which can be added to the binding buffer, for example in a concentration of 6% (PEG 8000), has proven to be particularly suitable. In this case too, the nucleic acids in turn bind almost quantitatively to the membrane surface.
  • the binding buffer can be provided separately. However, it is just as possible to combine it with the or a lysis buffer.
  • elution buffers are of course also conceivable.
  • the person skilled in the art can determine which buffer is most suitable without much effort.
  • the general rule is that the ion concentration of the elution buffer should be as low as possible and the pH should be adjusted as far as possible above the pK value of the membrane surface.
  • a higher ion concentration (if necessary) of the elution buffer can be compensated for by a more alkaline pH value and vice versa. Both values can be optimized without much effort.
  • All steps can be carried out in a simple manner, under particularly gentle conditions and with good yields.
  • the chaotropic reagents that are usually required in the prior art and the usual wisely used beads are dispensed with. Due to the good wettability of the membranes and matrices, the elution can be carried out with the smallest buffer volumes and, for example, at room temperature.
  • the invention is particularly suitable e.g. for processing plasmid DNA for sequencing, to name just one preferred field of application.
  • nucleic acids can also be purified from a wide variety of starting materials containing nucleic acid, if necessary after pre-cleaning.
  • BP benzophenone
  • a nylon microfiltration membrane (Schleicher & Schüll, nominal pore size 0.45 ⁇ m, membrane thickness 127 ⁇ m;) is modified under the same conditions as in a).
  • the surface-modified membranes produced according to Examples 1 a and b were clamped in a 96 microfiltration plate.
  • Example 2 The experiment is carried out as described in Example 2, the binding buffers according to Table 1 being used.
  • the amount of pDNA used is 500ng.
  • the semi-quantitative analysis is carried out via gel electrophoresis (results not shown)
  • a pDNA purification is carried out according to the principle of alkaline lysis.
  • 1.5 ml bacterial culture are mixed with the buffers P1-P3 (Pl: 100 ⁇ l, P2: 300 ⁇ l, P3: 300 ⁇ l) from the “Perfect Prep Plasmid Midi” kit from Eppendorf. After centrifugation, the clear lysate is mixed with 700 ⁇ l bin buffer (see Table 2). The sample is worked up under the conditions listed in Example 1.
  • a plasmid preparation is carried out using the “Perfect Prep Plasmid Mini” kit from Eppendorf, from the identical 1.5 ml bacterial culture, using the complete purification procedure.
  • the mixture of clarified lysate and the respective binding buffer (see Table 2) is centrifuged for 30 minutes at 12000 g, room temperature and the supernatant is removed. This is followed by washing twice with 200 ⁇ l 70% ethanol, drying under vacuum, and addition of 30 ⁇ l Tris-HCl, pH 7.5.
  • Table 2 The plasmid DNA of the GFP-NI was analyzed after separation in the 0.8% ethidium bromide agarose gel, which is shown as FIG. 1. The traces of the gel were documented as follows:
  • pDNA can only be purified using the modified nylon membrane.
  • the purification depends on the selected pH value.
  • a successful pDNA isolation could only be carried out after using the binding buffer with pH 4.6, but not when the pH was 7.4.

Abstract

Verwendung einer funktionalisierten porösen Membran zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, deren Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren über die Bedingungen in einem umgebenden Medium einstellbar sind, wobei die Membran mit deprotonierbaren Gruppen funktionalisiert ist und entsprechende Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.

Description

Verwendung funktionalisierter, poröser Membranen bzw. Matrizes zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie entsprechende Verfahren
Die Erfindung bezieht sich auf eine funktionalisierte Membran bzw. Matrix zur Aufreinigung von Nukleinsäuren und auf Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, bei denen derartige Membranen/Matrizes zum Einsatz kommen.
Gattungsgemäße Membranen sind z.B. aus dem US-Patent 5438128 bekannt. Die hier beschriebenen porösen Polymermembranen, z.B. aus Polypropylen oder Nylon, sind mit Ionenaustauschergruppen funktionalisiert. Bei geringer Ionenkonzentration binden die funktionalisierten Membranen ionisierte Nukleinsäuren, während eine Elution der gebundenen Nukleinsäuren bei hoher Ionenkonzentration erfolgt.
Die bekannten Membranen werden in Verfahren bzw. Kits zur Nukleinsäureauf- reinigung eingesetzt. Üblicherweise wird dabei zunächst das ggf. vorgereinigte, die Nukleinsäuren enthaltene Ausgangsmaterial in einem Bindungspuffer mit niedriger Ionenkonzentration durch die poröse Membran gesaugt oder gedrückt. Beim Passieren der Membran werden die Nukleinsäuren selektiv von den Ionenaustauschergruppen an der Membranoberfläche gebunden. In einem nächsten Schritt wird die Membran dann ggf. mit einem Puffer höherer Ionenstärke gewaschen, um unspezifisch gebundene Verunreinigungen abzutrennen. Die Elution der gebundenen Nukleinsäuren erfolgt dann in einem weiteren Schritt mit einem Puffer noch höherer Ionenstärke.
Nachteilig an der bekannten Methode ist, daß wegen der hohen Salzkonzentration das Eluat vor einer weiteren Aufarbeitung in aller Regel weiter z.B. mittels Etha- nolfällung oder Dialyse aufgereinigt werden muß.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine bezüglich ihrer Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren schaltbare Membran bzw Matrix für eine einfachere Aufreinigung von Nukleinsäuren bereitzustellen sowie auf die Membran bzw. Matrix abgestimmte Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren anzugeben.
Diese Aufgaben werden gemäß der unabhängigen Ansprüche 1, 10, 16, 18 und 19 gelöst.
Die erfindungsgemäß zur Aufreinigung von Nukleinsäuren eingesetzten Membranen weisen als wesentliches Merkmal auf, daß ihre Oberfläche mit deproto- nierbaren Gruppen funktionalisiert ist. Solche Membranen sind von Ulbricht und Riedel in Biomaterials 19 (1998) 1229-1237 in Verbindung mit der Immobilisierung von Proteinen beschrieben worden. Die erfindungsgemäße Bestimmung, nämlich die Aufreinigung von Nukleinsäuren, ist seinerzeit nicht erwähnt oder angedeutet worden.
Wesentliche Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten Membranen ist. daß sie aufgrund der Funktionalisierung mit deprotonierbaren Gruppen eine Oberflä- ehe aufweisen, deren Affinität für Nukleinsäuren variabel einstellbar (schaltbar) ist. Wie sich gezeigt hat, lassen sich die Bindungseigenschaften der Membran insbesondere pH-abhängig und/oder in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration reproduzierbar einstellen.
Die Membranen können dabei z.B. zur Reinigung von Nukleinsäuren aus PCR- Ansätzen aber auch generell zur Reinigung von mRNA, Gesamt RNA oder DNA, insbesondere Plasmid-DNA (pDNA) oder genomischer DNA eingesetzt werden.
Das US-Patent 5693785 beschreibt den Einsatz von hydroxylierten Silka-Beads zur Aufreinigung von Nukleinsäuren. Allerdings ist bei den meisten hierin beschriebenen Aufarbeitungsprotokollen der Einsatz eines chaotropen Bindungspuffers erforderlich, um eine ausreichende Bindung der DNA an den Silika- Beads zu gewährleisten. In Abwesenheit von chaotropen Bindungspuffern erfolgt eine Bindung nur, wenn die Oberfläche stark elektropositiv geladen ist. Die Möglichkeit, die Bindungseigenschaften der Oberfläche in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen zu beeinflussen, wird an keiner Stelle angesprochen oder nahegelegt.
Bei dem erfindungsgemäßen Einsatz von funktionalisierten Membranen erfolgt die Bindung von Nukleinsäuren bevorzugt in Abwesenheit von chaotropen Reagenz. Die Elution der gebundenen Nukleinsäuren ist unter Niedrigsalzbedingungen und ggf. bei Raumtemperatur möglich, was die Aufarbeitung wesentlich vereinfacht. Natürlich ist aber auch eine Aufarbeitung in Gegenwart von chaotropen Reagenzien möglich, falls dies gewünscht ist.
In der Praxis hat sich herausgestellt, daß die Membranen bei einem pH- Wert unterhalb oder im Bereich des pK- Wertes ihrer Oberfläche und/oder erhöhter Ionenkonzentration gute Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren aufweisen. Ver- schiebt man den pH- Wert zum alkalischen und/oder erniedrigt man die Ionenkonzentration des die Membran umgebenden Mediums, so läßt die Affinität der Membran für Nukleinsäuren nach, und unter diesen Umständen ist z.B. die Eluti- on der gebundenen Nukleinsäuren möglich.
Die Bedingungen, mit denen die Membranen zur Nukleinsäureaufreinigung eingesetzt werden können, lassen sich daher sehr variabel und den unterschiedlichen Anwendungszwecken angepaßt einstellen.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist, daß die Membranen aufgrund ihrer Funk- tionalisierung hydrophile Oberflächeneigenschaften aufweisen und deswegen sehr gut benetzbar sind. Im Hinblick auf die gute Benetzbarkeit können die Volumina der eingesetzten Elutionspuffer sehr gering gehalten werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Membranen sind insbesondere mit Sulfonsäu- re-, Carbonsäure- oder Phosphorsäuregruppen funktionalisiert. Solche Membranen besitzen besonders exakt schaltbare Oberflächeneigenschaften, d.h. ihre Affinität zu Nukleinsäuren läßt sich über den pH-Wert und/oder die Ionenkonzentration des umgebenden Mediums gut einstellen.
Zur Ausbildung der erfindungsgemäßen Membran mit schaltbaren Oberflächeneigenschaften genügt es grundsätzlich, die deprotonierbaren Gruppen direkt in bzw. an der Membranoberfläche vorzusehen. Wichtig ist lediglich, daß die Gruppen in Kontakt mit dem umgebenden Medium gelangen und in Abhängigkeit von den Bedingungen in dem Medium in neutralem oder deprotoniertem Zustand vorliegen. Bevorzugt werden die Gruppen jedoch an Polymerketten, insbesondere z.B. Po- lyacrylsäure, vorgesehen, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fixiert ist und deren anderes Ende frei beweglich ist.
Membranen in dieser Ausgestaltung können unterschiedliche Grenzflächenzu- stände einnehmen. Bei einem pH- Wert unterhalb oder im Bereich des pK- Wertes der Membranoberfläche bzw. bei höheren Ionenkonzentrationen (z.B. >500mM) liegen die Polymerketten dicht an der Membran an. In diesem Zustand können Nukleinsäuremoleküle besonders effizient an der Membranoberfläche adsorbieren, wobei vermutlich heterogene Wechselwirkungen, wie van der Waals-Kräfte oder hydrophobe aber auch ionische Wechselwirkungen zwischen der Nuklein- säure und der Polymerkette sowie den funktioneilen Gruppen der Polymerkette eine Rolle spielen.
Wird die Membranumgebung dagegen auf einen neutralen bis alkalischen pH- Wert und/oder eine niedrige Ionenkonzentration eingestellt, stehen die Polymerketten von der Membranoberfläche ab. In diesem Zustand lassen sich die gebundenen Nukleinsäuren in besonders einfacher Weise von den Polymerketten eluie- ren, wobei sowohl ionische Wechselwirkungen (die funktionellen Gruppen in den Polymerketten sind negativ geladen und stoßen das ebenfalls negativ geladene Nukleinsäuremolekül ab) als auch möglicherweise rein mechanische Gründe eine Rolle spielen.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Membranen sind insbesondere aus Kunststoff hergestellt. Bevorzugte Materialien sind Polypropylen, Polyamid, Polyester, Po- lysulfon oder PVDF. Denkbar ist aber auch, Membranen aus anderen, z.B. anorganischen Materialien wie z.B. Aluminiumoxid, Titanoxid, Zirconoxid oder Sili- ciumdioxid herzustellen. Membranen im erfindungsgemäßen Sinne sind alle flächigen Festphasen, die bevorzugt eine Schichtdicke von weniger 500 Mikrometer aufweisen. Bevorzugt beträgt der Porendurchmesser 0,2 bis 10 Mikrometer.
Da die erfindungsgemäßen Membranen insbesondere in Hochdurchsatz- Applikationen eingesetzt werden sollen, sieht eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung vor, daß sie zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten, Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert sind.
Bislang wurde die Erfindung im Hinblick auf den möglichen Einsatz von Membranen erläutert. Die zugrunde liegenden Prinzipien lassen sich aber auch auf andere zur Trennung von Nukleinsäuren einsetzbare durchströmbare Matrizes anwenden.
Die Erfindung soll daher zusätzlich auch den Einsatz solcher zur Aufreinigung von Nukleinsäuren geeigneten Matrizes abdecken, die mit einer wie oben angesprochenen funktionalisierten Oberfläche ausgestattet sind. Die in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Membran angesprochenen Ausgestaltungen können auch bei solchen Matrizes Anwendung finden.
Eine besonders geeignete Matrix in diesem Zusammenhang wäre z.B. ein Filter. Geeignet wären aber auch Vließ, Filz, Fasern oder Sintermaterial. Als Matrix könnten weiterhin auch entsprechend ausgerüstete Pipettenspitzen oder Reaktionsgefäße (Consumables) mit z.B. Mikrostrukturkanälen in Frage kommen.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch Verfahren zur Nukleinsäureaufreinigung, in denen die oben erwähnten Membranen oder Matrizes Anwendung finden können. In diesem Zusammenhang sind zunächst in drei unabhängigen Ansprüchen jeweils Verfahrensparameter angegeben, unter denen Nukleinsäuren selektiv gebunden werden können. In der nachfolgenden Erläuterung wird auf Membranen Bezug genommen. Die Ausführungen gelten aber auch sinngemäß für eine durchströmbare Matrix.
In einer ersten Variante erreicht man die Nukleinsäurebindung, in dem man eine Lösung des die Nukleinsäuren enthaltenen Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer mit einer Ionenkonzentration von mehr als 100 mM durch die Membran permeieren läßt, wobei man bevorzugt den pH-Wert auf einen Wert unterhalb oder im Bereich des pK- Werts der Membran- oder Matrixoberfläche einstellt. Während des Hindurchtretens werden die Nukleinsäuren selektiv von der Membranoberfläche absorbiert.
Besonders bevorzugt wird die Ionenkonzentration des Bindungspuffers auf einen Wert von > 500 mM eingestellt. Bei diesen Werten wurde eine reproduzierbare quantitative Ausbeute beobachtet.
In einer weiteren Variante ist es möglich, daß die Affinität der Membran/Matrix zu Nukleinsäuren über den pH- Wert eingestellt wird. Bei dieser Variante wird ein Bindungspuffer mit einem pH- Wert gewählt, der im Bereich oder unterhalb oder im Bereich des pK- Wertes z.B. der Membranoberfläche liegt. Auch bei diesen Bedingungen werden die Nukleinsäuren nahezu quantitativ absorbiert, wenn man eine Lösung des die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterial in einen Bindungspuffer mit dem angesprochenen pH- Wert durch die Membran permeieren läßt.
Die dritte Variante schließlich sieht vor, daß man das Ausgangsmaterial in einen Bindungspuffer aufnimmt, der ein Fällungsmittel in einer Konzentration unter- halb des Wertes enthält, in der Nukleinsäuren ausfallen. Als besonders geeignet hat sich hierbei Polyethylenglykol (PEG) herausgestellt, das dem Bindungspuffer z.B. in einer Konzentration von 6 % (PEG 8000) zugesetzt sein kann. Auch in diesem Fall binden die Nukleinsäuren wiederum nahezu quantitativ an der Membranoberfläche.
In allen drei angesprochenen Varianten erfolgte eine Adsorbtion nur, wenn die Membranen entsprechend funktionalisiert waren. Bei nicht funktionalisierten Membranen erfolgte keine, bzw. keine nennenswerte Bindung. Dies spricht dafür, daß die angesprochenen Umgebungsbedingungen unabhängig voneinander, aber nur in Verbindung mit der speziellen Membranoberfläche eine Bindung von Nukleinsäure favorisieren.
Selbstverständlich ist es aber auch möglich, die einzelnen Parameter miteinander zu verknüpfen, d.h. die Membran zur Bindung von Nukleinsäuren auf ein Umgebungsmedium mit hoher Ionenkonzentration und niedrigem pH-Wert einzustellen etc.
Der Bindungspuffer kann separat vorgesehen werden. Genauso gut ist es aber auch möglich, ihn mit dem oder einem Lyse-Puffer zu kombinieren.
Bislang wurde in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nur über die selektive Bindung der Nukleinsäuren an der Membran gesprochen. In den meisten Anwendungsfällen ist zusätzlich gewünscht, daß sich die gebundenen Nukleinsäure ggf. nach Waschen wieder in einfacher Weise von der Membran eluieren lassen. Auch hier hat sich wieder herausgestellt, daß die oben angesprochenen unabhängigen Varianten, die eine Bindung der Nukleinsäuren an der Membran favorisieren, unter umgekehrten Vorzeichen zur Elution der gebundenen Nukleinsäuren eingesetzt werden können. Im einfachsten Fall erfolgt eine Elution mit Wasser bei neutralem pH-Wert. In Gegenwart von Wasser sind die funktionellen Gruppen der Membran größtenteils deprotoniert und die Ladungen sowohl der Membran als auch der Nukleinsäuren liegen in nicht abgeschirmten Zustand vor. Es kommt zu ionischen Abstoßungsreaktionen, die eine leichte Ablösung der Nukleinsäuren von der Membran ermöglichen. Weist die Membran oder Matrix die oben angesprochenen Polymerketten auf, an denen die funktionellen Gruppen vorgesehen sind, so tritt als weiterer Effekt hinzu, daß sich die Ketten von der Membran abstrecken und die Nukleinsäuren (zusätzlich zu den beschriebenen ionischen Wechselwirkungen) rein mechanisch abstoßen.
Neben der Elution mit reinem Wasser sind selbstverständlich auch andere Eluti- onspuffer denkbar. Welcher Puffer am ehesten geeignet ist, kann vom Fachmann ohne großen Aufwand ermittelt werden. Die generelle Regel ist, daß die Ionenkonzentration des Elutionspuffers möglichst niedrig und der pH- Wert möglichst oberhalb des pK- Wertes der Membranoberfläche eingestellt wird. Im Zweifelsfall kann man eine höhere Ionenkonzentration (falls erforderlich) des Elutionspuffers ggf. über einen alkalischeren pH-Wert ausgleichen und umgekehrt. Eine Optimierung beider Werte ist ohne größeren Aufwand möglich.
Die erfindungsgemäße Verwendung von funktionalisierten Membranen bzw. die entsprechenden Verfahren erlauben eine besonders einfache Aufreinigung von Nukleinsäuren mit den üblichen Schritten: Bindung der Nukleinsäuren an einer Membran, Waschen der Membran und Elution der gebundenen Nukleinsäuren.
Alle Schritte lassen sich in einfacher Weise, unter besonders schonenden Bedingungen und mit guten Ausbeuten durchführen. Insbesondere kann auf die im Stand der Technik meist erforderlichen chaotropen Reagenzien und die üblicher- weise eingesetzten Beads verzichtet werden. Die Elution kann aufgrund der guten Benetzbarkeit der Membranen und Matrizes mit geringsten Puffervolumina und z.B. bei Raumtemperatur erfolgen.
Besonders geeignet ist die Erfindung z.B. zur Aufarbeitung von Plasmid-DNA für die Sequenzierung, um nur ein bevorzugtes Anwendungsfeld zu nennen. Natürlich lassen sich auch andere Nukleinsäuren aus den unterschiedlichsten nu- kleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien, ggf nach Vorreinigung, aufreinigen.
Im folgenden soll die Erfindung anhand einiger Beispiele näher erläutert werden, die besonders bevorzugte Ausführungsbeispiele betreffen.
A: Herstellung funktionalisierter Membranen Beispiel 1:
a) Modifizierung von Polypropylenmembranen
Eine Polypropylen-Mikrofiltrationsmembran (Accurel 2E HF, nominale Porengröße 0.2 μm, Membrandicke 150 μm; Membrana GmbH, Wuppertal oder Versuchsmuster #1333-12A, nominale Porengröße 0.45 μm, Membrandicke 110 μm, 3M, St. Paul, USA) mit einem Durchmesser von d = 80 mm wird unter Schütteln für 2 h mit einer 100 mM Lösung von Benzophenon (BP) in Aceton equilibriert. Nachfolgend wird die Membran mit einer 10%igen wässrigen Acrylsäurelösung überschichtet. Anschließend wird für 15 min mit UV-Strahlung (UVA-Spot 2000; Dr. Hönle GmbH, Planegg) belichtet. Abschließend wird die modifizierte Membran für 24 h bei 60°C mit Wasser extrahiert und getrocknet. b) Modifizierung von Nylonmembranen
Eine Nylon-Mikrofiltrationsmembran (Schleicher&Schüll, nominale Porengröße 0,45 μm, Membrandicke 127 μm;) wird unter den gleichen Bedingungen wie bei a) modifiziert.
B: Aufreinigung von Nukleinsäuren
Für die nachfolgenden Aufreinigungen wurden die gemäß der Beispiele 1 a und b hergestellten oberflächenmodifizierten Membranen in eine 96er Mikrofiltrations- platte eingespannt.
Beispiel 2:
Als Basismaterial für diesen Versuch wird oberflächenmodifiziertes PP (Beispiel la) mit einer nominalen Porenweite von 0,45 μm eingesetzt. Die Aufreinigung erfolgte mittels Zentrifugation bei 3000 rpm, Raumtemperatur (Eppendorf 5810R; A-2 DWP Rotor) nach dem Prinzip: Bind-Wash-Elute.
Hierfür wird 1 μg pDNA mit jeweils 200μl der Bindungspuffer 1 (BPl) oder 2 (BP2) versetzt (BPl: 5mM Tris, pH=7,5; BP2: 4M NaCl, pH=4,6). Nach der Inkubation wird 2x mit je 200μl 70% EtOH gewaschen. Die Elution erfolgt mit 30μl Tris (5 mM, pH=7,5). Abschließend wird ein zweites Mal mit lOOμl eluiert. Die halbquantitative Auswertung von 4 μl Eluat erfolgte mittels Ethidiumbromid- Gelelektrophorese (nicht dargestellt).
Während bei Einsatz des Bindungspuffers BPl keine Adsorption an die Membran erfolgt, läßt sich die pDNA bei Verwendung von BP2 nahezu quantitativ an die Membran binden und im ersten Elutionsschritt wieder eluieren. Beispiel 3:
Die Durchführung des Versuches erfolgt wie im Beispiel 2 beschrieben, wobei die Bindungspuffer gemäß Tabelle 1 eingesetzt wurden. Die eingesetzte Menge pDNA beträgt 500ng. Die halbquantitative Analyse erfolgt über Gelelektrophorese (Ergebnisse nicht dargestellt)
Die Auswertung ist in (Tabelle 1) zusammengefaßt und erlaubt eine erste Einschätzung der Rückgewinnungsrate (von - bis +++)
Tabelle 1 :
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Wie sich aus der Tabelle ergibt, läßt sich lediglich bei der Acrylsäure- modifizierten PP-Membran die DNA nahezu quantitativ binden und wieder eluie- ren. Die Abhängigkeit der Bindung vom pH-Wert der Inkubationslösung ist in Tabelle 1 deutlich zu erkennen. Bei einem Wert unterhalb des pK- Wertes der Membranmodifizierung findet eine Bindung statt. Bei einem pH-Wert darüber erfolgt keine Bindung.
Beispiel 4:
Es wird eine pDNA-Aufreinigung nach dem Prinzip der alkalischen Lyse durchgeführt. Hierzu werden 1,5ml Bakterienkultur mit den Puffern P1-P3 (Pl:100μl, P2: 300μl, P3: 300μl) aus dem Kit „Perfect Prep Plasmid Midi,, der Fa. Eppendorf versetzt. Nach Zentrifugation wird das klare Lysat mit jeweils 700μl Bin- dungspuffer (s. Tabelle 2) versetzt. Die Aufarbeitung der Probe erfolgt unter den im Beispiel 1 aufgeführten Bedingungen. Zur Kontrolle wird eine Plasmidpräpa- ration unter Durchführung der kompletten Aufreinigungsprozedur mit dem Kit „Perfect Prep Plasmid Mini,, der Fa. Eppendorf, aus der identischen l,5mL Bakterienkultur durchgeführt. Als weitere Kontrolle wird das Gemisch aus geklärtem Lysat und jeweiligem Bindungspuffer (s. Tabelle 2) für 30 Minuten bei 12000g, Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entfernt. Danach erfolgt zweimaliges Waschen mit 200 μl 70 % Ethanol, Trocknung unter Vacuum, sowie die Zugabe von 30 μl Tris-HCl, pH 7,5.
Ausbeute und Reinheit wurden mittels Photometrie und Analyse durch Ethidi- umbromid-Gelelektrophorese bestimmt (Tabelle 2, Abb. 1). Die Tabelle gibt die mittels Photometer (Biophotometer der Fa. Eppendorf) bestimmte Konzentration der eluierten pDNA in ng/μl an.
Tabelle 2:
Figure imgf000014_0001
Die Plasmid DNA des GFP-Nl wurde nach Auftrennung im 0,8 % Ethidiumbro- mid-Agarosegel analysiert, das als Fig. 1 wiedergegeben ist. Die Spuren des Gels wurden wie folgt belegt:
1.) Kontrolle (ohne Membran) zum Nachweis eines Fällungsmechanismus, Bindungspuffer pH 7,4
2.) Kontrolle (ohne Membran) zum Nachweis eines Fällungsmechanismus, Bindungspuffer pH 4,6
3.) Bindungspuffer pH 4.6 unmodifizierte Membran
4.) Bindungspuffer pH 7,4 unmodifizierte Membran
5.) Bindungspuffer pH 4,6 modifizierte Membran
6.) Bindungspuffer pH 7,4 modifizierte Membran
7.) leer
8.) Kontrolle Plasmid Mini Präparation (Eppendorf Perfect Prep Mini)
Wie das Gel (Fig. 1) deutlich zeigt, läßt sich nur unter Verwendung der modifizierten Nylon-Membran pDNA aufreinigen. Die Aufreinigung ist abhängig vom gewählten pH-Wert. So konnte eine erfolgreiche pDNA Isolierung nur nach Verwendung des Bindungspuffer mit pH 4,6 durchgeführt werden, nicht jedoch, wenn der pH 7,4 beträgt.
Die Fällungsprozedur eines DNA- Bindungspuffergemisches ohne Einsatz einer Membran verlief erfolglos. Hieraus läßt sich ableiten, daß die Isolierung auf die Modifizierung der Membran unter ausgewählten pH Bedingungen zurückzuführen ist und nicht auf eine Fällungsreaktion.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verwendung einer funktionalisierten porösen Membran zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, deren Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren über die Bedingungen in einem umgebenden Medium einstellbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit deprotonierbaren Gruppen funk- tionalisiert ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran mit Sulfonsäure- oder Carbonsäure-Gruppen funktionalisiert ist.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Membran fixiert ist, und deren anderes Ende frei beweglich ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Kunststoff hergestellt ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Polypropylen, Polyamid, Polyester, Polysulfon, PVDF besteht.
7. Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran Poren mit einem Durchmesser von 0,2-10 μm aufweist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran eine Dicke < 500 μm aufweist.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten Spin-Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert ist.
10. Verwendung einer durchströmbaren Matrix zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, wobei die Matrix mit einer funktionalisierten Oberfläche ausgestattet ist, deren Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren in Abhängigkeit über die Bedingungen in einem umgebenden Medium einstellbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit deprotonierbaren Gruppen funktio- nalisiert ist.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein Filter ist.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix Vliess, Filz, Fasern, Sintermaterial, entsprechend ausgerüstete Pipettenspitzen oder Reaktionsgefäße (Consumables) mit Mi- krostrukturkanälen ist.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppen an Polymerketten gebunden sind, deren eines Ende an der Oberfläche der Matrix fixiert ist, und deren anderes Ende frei beweglich ist.
14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierte Polymerkette eine Polyacrylsäure ist.
15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix zum Einsatz in Mikrotiterfilterplatten Spin- Säulen oder Reaktionsgefäßen konfektioniert ist.
16. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer Membran gemäß der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Matrix gemäß der Ansprüche 10 bis 15,
bei dem man eine Lösung des Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer mit hoher Ionenkonzentration (>100mM) durch die Membran/Matrix permeieren lässt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche der Membran/Matrix binden
und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran/Matrix eluiert.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenkonzentration des Bindungspuffers >500mM beträgt.
18. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer Membran gemäß der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Matrix gemäß der Ansprüche 10 bis 15, bei dem man eine Lösung des Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer durch die Membran/Matrix permeieren lässt, dessen pH- Wert unterhalb oder im Bereich des pK- Werts der Membran(Matrix)oberfläche liegt, wobei die Nukleinsäuren selektiv an der Oberfläche der Membran/Matrix binden
und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran/Matrix eluiert.
19. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigem Ausgangsmaterial mit einer Membran gemäß der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Matrix gemäß der Ansprüche 10 bis 15,
bei dem man eine Lösung des Ausgangsmaterials in einem Bindungspuffer durch die Membran/Matrix permeieren lässt, der ein Fällungsmittel in einer Konzentration unterhalb des Werts enthält, in der Nukleinsäuren ausfallen,
und ggf. die gebundenen Nukleinsäuren in einem weiteren Schritt wieder von der Membran/Matrix eluiert.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspuffer PEG in einer Konzentration < 10% enthält.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution der gebundenen Nukleinsäuren einen Eluti- onspuffer durch die Membran/Matrix permeieren läßt, dessen pH- Wert auf einen Wert oberhalb des pK- Werts der Membran(Matrix)oberfläche eingestellt ist.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution der gebundenen Nukleinsäuren einen Eluti- onspuffer durch die Membran/Matrix permeieren läßt, dessen Ionenkonzentration auf einen Wert <500mM eingestellt ist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungs-, Wasch- und/oder Elutionspuffer mittels Vakuum durch die Membran/Matrix gesaugt werden.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution der an der Membran/Matrix gebundenen Nukleinsäuren bei Raumtemperatur erfolgt.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial einer Vorreinigung zur Abtrennung von groben Zelltrümmern und dergleichen unterzogen wird.
26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial geklärtes Zelllysat ist.
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