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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberWO2002035242 A1
Publication typeApplication
Application numberPCT/FR2001/003332
Publication dateMay 2, 2002
Filing dateOct 26, 2001
Priority dateOct 27, 2000
Publication numberPCT/2001/3332, PCT/FR/1/003332, PCT/FR/1/03332, PCT/FR/2001/003332, PCT/FR/2001/03332, PCT/FR1/003332, PCT/FR1/03332, PCT/FR1003332, PCT/FR103332, PCT/FR2001/003332, PCT/FR2001/03332, PCT/FR2001003332, PCT/FR200103332, WO 0235242 A1, WO 0235242A1, WO 2002/035242 A1, WO 2002035242 A1, WO 2002035242A1, WO-A1-0235242, WO-A1-2002035242, WO0235242 A1, WO0235242A1, WO2002/035242A1, WO2002035242 A1, WO2002035242A1
InventorsDelneste Yves, Jeannin Pascale, Magistrelli Giovanni
ApplicantDelneste Yves, Jeannin Pascale, Magistrelli Giovanni, Pf Medicament
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: Patentscope, Espacenet
Method for identifying novel molecules binding with lox receptor
WO 2002035242 A1
Abstract
The invention concerns a method for identifying novel molecules binding with the LOX receptor, and optionally, are further capable of being internalized by an antigen presenting cell. The invention concerns the use of said molecules binding with the LOX receptor for preparing a pharmaceutical composition, in particular for prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, parasitic and fungal infections or for prophylactic or therapeutic treatment of cancers.
Claims  translated from French  (OCR text may contain errors)

REVENDICATIONS CLAIMS

1. 1. Procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX et qui en outre sont capables d'être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène, de préférence par une cellule dendritique immature. A method of identifying new molecules of therapeutic interest, characterized in that one selects the molecules that bind to a receptor and LOX are also capable of being internalized by an antigen presenting cell, preferably a immature dendritic cell.

2. 2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit récepteur LOX ; b) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur LOX ; et c) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur LOX a été mise en évidence à l'étape b). Identification method according to claim 1, characterized in that it comprises the following steps: a) contacting a molecule, or a mixture of molecules, known or unknown test LOX with a receiver, a medium for the possibility of a test molecule with said LOX receptor binding b) the identification of the binding or not said tested with said LOX receptor molecule, and c) the selection of this drug if it is fixed with said receiver LOX was highlighted in step b).

3. 3. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape d) suivante : d) l'identification de la structure de la molécule sélectionnée à l'étape c) si celle-ci n'est pas connue. Identification method according to one of claims 1 and 2, characterized in that it further comprises the step d): d) identifying the structure of the molecule selected in step c) if the it is not known. 4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la sélection des molécules capables de se lier au récepteur LOX est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes : Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the selection of molecules capable of binding to the receptor LOX is performed by a method selected from the following methods:

- une chromatographie d'affinité, - Affinity chromatography,

- une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur LOX, - Identification FACS binding molecules to cells transfected with a receptor LOX,

- une technique de type BIACOR, ou - A technique Biacor type or

- un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur LOX. - An expression cloning from a probe bearing a receptor LOX.

5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit récepteur LOX est le récepteur LOX-1. A method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said receiver is the LOX-1 receptor LOX.

6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule à être internalisée par une cellule présentatrice d'antigène. A method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it further comprises a step of determining the ability of said molecule to be internalized by antigen-presenting cell.

7. 7. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la capacité des molécules se liant à un récepteur LOX à être intemalisées par une cellule présentatrice d'antigène est mise en évidence par une méthode comprenant les étapes suivantes : Identification method according to one of Claims 1 to 6, characterized in that the capacity of the molecules binding to a receptor LOX be internalized by antigen presenting cells is demonstrated by a method comprising the steps of:

A) le marquage de ladite molécule sélectionnée se liant à un récepteur LOX par un marqueur susceptible de permettre la détection directe ou indirecte de la présence de ladite molécule ainsi marquée à la surface ou à l'intérieur d'une cellule ; A) marking said selected binding to a receptor LOX with a label capable of enabling direct or indirect detection of the presence of said labeled molecule and the surface or inside of a cell molecule;

B) la mise en contact de ladite molécule marquée avec une cellule présentatrice d'antigène exprimant un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation de ladite molécule marquée avec ledit récepteur LOX ; B) contacting said labeled with an antigen presenting cell expressing a receptor LOX, in a medium allowing the fixing of said labeled molecule with said receptor molecule LOX;

C) la mise en évidence de l'internalisation ou non de ladite molécule marquée par ladite cellule présentatrice d'antigène ; et C) the identification of internalizing or not said marked by that antigen-presenting cell molecule, and

D) la sélection de cette molécule si l'internalisation de ladite molécule marquée a été mise en évidence à l'étape C). D) the selection of the molecule if the internalization of said labeled molecule has been shown in step C).

8. 8. Procédé d'identification selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule ainsi identifiée d'être immunogène. Identification method according to one of Claims 1 to 7, characterized in that it further comprises a step of determining the ability of said immunogen to be so identified molecule.

9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour l'identification de nouvelles HSP ou des analogues d'HSP. A method according to any one of claims 1 to 8 for the identification of new analogs HSP or HSP.

10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour l'identification de nouveaux adjuvants de l'immunité. A method according to any one of claims 1 to 9 for the identification of novel immunity adjuvants. 1 1. January 1. Nouvelle molécule d'intérêt thérapeutique susceptible d'être identifiée par la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. New molecule of therapeutic interest can be identified by the implementation of the method according to any one of claims 1 to 10.

12. 12. Complexe anticoφs caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX, ledit antîcoφS ou fragment étant associé à une substance biologiquement active. Anticoφs complex characterized in that it comprises at least one monoclonal antibody, polyclonal or a fragment thereof capable of binding specifically to an epitope of a receptor LOX, said antîcoφS or fragment is associated with a biologically active substance.

13. 13. Complexe anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit anticoφs, ou l'un de ses fragments, est en outre capable d'être internalisé dans des cellules présentatrices d'antigènes. Complex antibody according to claim 12, characterized in that said anticoφs, or a fragment thereof, is also capable of being internalized in antigen-presenting cells.

14. 14. Complexe selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments, et ladite substance biologiquement active sont associés par liaison covalente ou par affinité. Complex according to claim 12 or 13, characterized in that said antibody, or a fragment thereof, and said biologically active substance are associated by covalent or affinity.

15. 15. Complexe anticoφs selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un élément de liaison qui lie ledit anticoφs, ou l'un de ses fragments, et ladite substance biologiquement active. Anticoφs complex according to one of Claims 12 to 14, characterized in that it further comprises a connecting element which connects said anticoφs, or a fragment thereof, and said biologically active substance. 16. 16. Complexe anticoφs selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que ladite substance biologiquement active est un immunogène, antigène ou haptène. Anticoφs complex according to one of Claims 12 to 15, characterized in that said biologically active substance is an immunogen, antigen or hapten. 17. 17. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable une molécule se liant à un récepteur LOX, préférentiellement au moins une nouvelle molécule selon la revendication 1 1. A pharmaceutical composition characterized in that it comprises in a pharmaceutically acceptable medium a molecule binding to a receptor LOX, preferably at least another molecule of claim 1 1. 18. 18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un immunogène, antigène ou haptène. A composition according to claim 17, characterized in that it further contains an immunogen, antigen or hapten.

19. 19. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un complexe anticoφs selon l'une des revendications 12 à 16. A pharmaceutical composition characterized in that it comprises in a pharmaceutically acceptable medium, at least one complex according anticoφs one of Claims 12 to 16. 20. 20. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, est choisi parmi les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les poly- ou oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides. A composition according to claim 18 or 19, characterized in that said immunogen, antigen or hapten is chosen from peptides, glycopeptides, lipopeptides, poly-or oligosaccharides, nucleic acids and lipids.

21. 21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon. Composition according to Claim 20, characterized in that said immunogen, antigen or hapten derived from a virus, a bacterium, a fungus or a parasite.

22. 22. Composition selon la revendication 21 , caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (P1V), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les ménîngocoques. Composition according to Claim 21, characterized in that said immunogen, antigen or hapten, comprising at least one peptide derived from microorganism responsible for pathologies of the airways selected from RSV, parainfluenza virus (P1V), influenza viruses, hantavirus, streptococci, pneumococci, Haemophilus influenza type b, rhinoviruses, coronovirus and meningitis.

23. 23. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que l'immunogène, antigène ou haptène, associé est spécifique d'une cellule tumorale. A composition according to claim 18 or 19, characterized in that the immunogen, antigen or hapten, is associated with a tumor cell specific.

24. 24. Composition selon l'une des revendications 17 à 23, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant à un récepteur LOX. Composition according to one of claims 17 to 23, characterized in that said pharmaceutical composition does not contain an adjuvant other than a binding molecule receptor LOX.

25. 25. Composition selon l'une des revendications 17 à 24, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité. Composition according to one of claims 17 to 24, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form suitable to improve its stability and / or immunogenicity.

26. 26. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, de préférence une molécule selon la revendication 1 1 , ou d'un anticoφs monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX, comme porteur et/ou adjuvant pour la préparation d'un vaccin. Use of a molecule binding to a receptor LOX, preferably one molecule of claim 1 1, or a anticoφs monoclonal, polyclonal or a fragment thereof capable of binding specifically to an epitope of a receptor LOX , as a carrier and / or adjuvant for the preparation of a vaccine.

27. 27. Utilisation d'une molécule ou d'un anticoφs, ou l'un de ses fragments, selon la revendication 26, caractérisée en ce que ladite molécule ou ledit anticoφs ou fragment, se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est internalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes. Use of a molecule or anticoφs, or a fragment thereof, according to claim 26, characterized in that said molecule or anticoφs or fragment binds to a receptor LOX antigen presenting cells and internalized into said antigen presenting cells.

28. 28. Utilisation d'un complexe selon la revendication 16, pour la préparation d'un vaccin. Use of a complex according to claim 16 for the preparation of a vaccine.

29. 29. Utilisation d'un complexe selon la revendication 28, caractérisée en ce que ledit immunogène, antigène ou haptène, dudit complexe se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est internalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes. Use of a complex according to claim 28, characterized in that said immunogen, antigen or hapten, said complex binds to a receptor LOX antigen presenting cells and is internalized into said antigen presenting cells.

30. 30. Utilisation selon l'une des revendications 26 à 29, pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. Use according to one of claims 26 to 29 for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, fungal or parasitic infections or for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers.

31. 31. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, de préférence une molécule selon la revendication 1 1 , ou d'un complexe selon la revendication 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. Use of a molecule binding to a receptor LOX, preferably one molecule of claim 1 1, or a complex according to claim 16 for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against a infectious agent or a tumor cell.

32. 32. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, de préférence une molécule selon la revendication 1 1 , ou d'un complexe selon la revendication 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique (CTL) contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. Use of a molecule binding to a receptor LOX, preferably one molecule of claim 1 1, or a complex according to claim 16 for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase a cytotoxic T response ( CTL) against an infectious agent or a tumor cell. 33. 33. Utilisation d'au moins une molécule se liant à un récepteur LOX, de préférence une molécule selon la revendication 1 1, ou d'un complexe selon la revendication 16, pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes. Use of at least one molecule binding to a receptor LOX, preferably one molecule of claim 1 1, or a complex according to claim 16 for the specific targeting of a biologically active substance associated therewith to antigen presenting cells.

34. 34. Utilisation d'un complexe selon l'une des revendications 12 à 16, pour le ciblage spécifique des cellules présentatrices d'antigènes. Use of a complex according to one of claims 12 to 16 for the specific targeting of antigen presenting cells.

35. 35. Utilisation selon la revendication 33 ou 34, caractérisée en ce que lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont choisies parmi les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, et préférentiellement parmi les cellules dendritiques immatures. Use according to claim 33 or 34, characterized in that said antigen presenting cells are chosen from dendritic cells, macrophages, B cells or monocytes, and preferably from immature dendritic cells. 36. 36. Utilisation selon la revendication 33, caractérisée en ce que ladite substance biologiquement active est un antigène ou haptène ou un facteur de croissance. Use according to claim 33, characterized in that said biologically active substance is an antigen or hapten or a growth factor.

37. 37. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, de préférence une molécule selon la revendication 1 1, à l'exception des HSP 60/65, ou d'un complexe selon l'une des revendications 12 à 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de l'artériosclérose. Use of a molecule binding to a receptor LOX, preferably one molecule of claim 1 1, with the exception of HSP 60/65, or a complex according to one of claims 12 to 16 for the preparation a pharmaceutical composition for the prophylactic or therapeutic treatment of arteriosclerosis.

38. 38. Utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, de préférence une molécule selon la revendication 1 1 , ou d'un complexe selon l'une des revendications 12 à 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de maladies liées au dysfonctionnement des récepteurs LOX ou au dysfonctionnement des ligands de ces récepteurs et plus particulièrement des HSP. Use of a molecule binding to a receptor LOX, preferably one molecule of claim 1 1, or a complex according to one of claims 12 to 16 for preparing a pharmaceutical composition for prophylaxis or treatment-related dysfunction of the receptor LOX dysfunction or ligands of these receptors and especially diseases of HSP.

39. 39. Utilisation selon l'une des revendications 26 à 38, caractérisée en ce que ladite molécule capable de se lier spécifiquement sur ledit récepteur LOX, de préférence le récepteur LOX- 1 , et capable d'être internalisée après ladite fixation dans une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX, est identifiée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10. Use according to one of claims 26 to 38, characterized in that said molecule capable of specifically binding to said receptor LOX, preferably the LOX-1 receptor and capable of being internalized after mounting in said presenting cell LOX expressing said antigen receptor is identified by a method according to one of claims 1 to 10.

Description  translated from French  (OCR text may contain errors)

PROCEDE D'IDENTIFICATION DE NOUVELLES MOLECULES SE LIANT AU RECEPTEUR LOX METHOD FOR IDENTIFYING NOVEL MOLECULES RECEPTOR BINDING LOX

L'invention concerne un procédé d'identification de nouvelles molécules se liant 5 au récepteur LOX et, le cas échéant, qui sont capables en outre d'être internalisées par une cellule présentatrice d'antigène. The invention relates to a method for identifying new molecules binding to LOX 5 receiver and, if applicable, which are also capable of being internalized by antigen-presenting cell. L'invention concerne l'utilisation desdites molécules se liant au récepteur LOX pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires et fongiques ou au traitement The invention relates to the use of said molecules binding to the receptor LOX for preparing a pharmaceutical composition, particularly for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, parasitic and fungal or treatment

10 prophylactique ou thérapeutique des cancers. 10 prophylactic or therapeutic treatment of cancers.

La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. The success of vaccination campaigns in these areas has extended the concept of vaccine previously used in the field of infectious diseases in the fields of cancer and autoimmune diseases. Les antigènes The antigens

15 vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité. 15 vaccine administered alone in the host are often not sufficiently immunogenic to induce an immune response, and should be combined with an adjuvant or coupled to a carrier protein to induce (or increase) their immunogenicity. Dans ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite, réponse au cours de laquelle les antigènes exogènes sont présentés dans le contexte des molécules Under these conditions, only a humoral immune response type can be induced response during which exogenous antigens are presented in the context of molecules

20 du CMH de classe II aux lymphocytes T CD4. 20 MHC class II to the CD4 + T lymphocytes.

Ainsi, de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou d'induire l'immunogénicité sont constamment recherchés. Thus, new carriers or adjuvants to increase or induce immunogenicity are constantly sought.

De plus, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute Moreover, as part of an antiviral therapy, the generation of cytotoxic T lymphocytes (CTL) can recognize and destroy the virus is any

25 importance (Bachmann et al., Eur. J. Immunol., 24, 2228-2236, 1994 ; Borrow P., J. Vîrol. Hepat., 4, 16-24, 1997), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM., J. Inf. Dis., 166, S35-S41 , 1992 ; oszînowski et al, Immunol. Lett., 16, 185- 192, 1987). 25 importance (Bachmann et al, Eur J Immunol, 24, 2228-2236, 1994... Borrow P., J. Virol Hepat, 4, 16-24, 1997..), As evidenced by numerous studies showing in vivo, the protective role of responses against viral epitopes (Arvin AM, J. Inf Dis, 166, S35-S41, 1992; oszînowski et al, Immunol Lett, 16, 185-192,..... 1987). L'importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses The importance of CTL responses was also heavily documented in the responses

30 antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., Crit. Rev. Immunol. 18, 55-63, 1998). 30 antitumor including those directed against melanoma cells (reviewed in Rivoltini et al., Rev. Crit. Immunol. 18, 55-63, 1998). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules du CMH de classe I et présentées aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. The epitope (CTL peptide sequences that interact with MHC class I and presented to CD8 + T cells) have been defined for several antigens. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de ces peptides (Melief. Adv. Cancer Res., 58, 143-175, 1992 ; Nandaz et Sercaz, Cell, 82, 13-17, 1995). However, the difficulty lies in the generation of CTL in vivo, due to the low immunogenicity of these peptides (Melief. Adv Cancer Res, 58, 143-175, 1992.. Nandaz and Sercaz, Cell, 82, 13-17, 1995).

Des recherches s'orientent par conséquent vers l'identification de nouveaux adjuvants, ou de système de délivrance d'antigènes («delivery System»), permettant d'induire des CTL. Research is therefore oriented towards the identification of novel adjuvants or antigen delivery system ("delivery system") to induce CTL. Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des réponses CTL antivirales (Ludewig B., et al., J. Nirol., 72, 3812-3818, 1998 ; Brossard P. et al., J. Immunol., 158, 3270-3276, 1997) ou anticancéreuses (Nestlé FO, et al., Nat. M éd., 4, 328-332, 1998). Due to their efficiency and present antigens to stimulate the immune system, dendritic cells, for example, were used to generate antiviral CTL responses (B. Ludewig, et al., J. Nirol., 72, 3812-3818 , 1998..... Brossard P. et al, J. Immunol, 158, 3270-3276, 1997) or cancer (Nestle FO, et al, Nat M ed, 4, 328-332, 1998).

Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d'antigène les plus efficaces et en particulier les seules capables d'initier une réponse CTL (Banchereau, J. et al., Nature, 392, 245-252, 1998 ; Watts, C, Nature Cell Biol., 1 , 152-154, 1999). Dendritic cells (DC) are the most effective presenting cells and antigen especially lone able to initiate a CTL response (Banchereau, J. et al, Nature, 392, 245-252, 1998. Watts, C Nature Cell Biol., 1, 152-154, 1999). Les DC sont la cible de nombreuses stratégies vaccinales (Timmerman JM et al., Annu. Rev. Med., 50, 507-529, 1999). DC is the target of many vaccine strategies (Timmerman JM et al., Rev. Annu. Med., 50, 507-529, 1999). En effet, de nombreux arguments expérimentaux montrent que ce sont les DC immatures qui seraient capables dans certaines conditions de présenter les antigènes exogènes dans le CMH de classe 1 aux CTL. Indeed, many experimental evidence indicates that it is immature DC that are capable under certain conditions to present exogenous antigens on MHC class 1 to CTL. Les DC existent dans deux états de différentiation. DCs exist in two states of differentiation. Les DC présentes dans les tissus périphériques sont immatures et agissent comme des sentinelles qui capturent les antigènes exogènes. DCs present in peripheral tissues are immature and act as sentinels that capture exogenous antigens. Après un contact avec les antigènes ou des signaux de stress, elles subissent un processus de maturation, acquièrent l'expression de nombreuses molécules de costimulation et migrent dans les ganglions ou elles présentent l'antigène aux lymphocytes T naïfs. After contact with antigens or stress signals, they undergo a process of maturation, acquire the expression of costimulatory molecules and many migrate into the lymph where they present antigen to naive T cells. Le phénomène de cross-présentation (encore connu sous le nom de cross-priming) qui permet à un antigène exogène d'accéder à une présentation dans les molécules des CMH de classe I est actuellement très étudié (Yewdell JW, et al., Adv. Immunol., 73, 1-77, 1999). The phenomenon of cross-presentation (also known as cross-priming), which allows an exogenous antigen to access a presentation in the molecules of the MHC class I is currently extensively studied (Yewdell JW, et al., Adv . Immunol., 73, 1-77, 1999). 11 est actuellement admis que la façon dont l'antigène est capturé joue un rôle. 11 is now accepted that the way the antigen is captured plays a role. Bien qu'il ait été observé que des antigènes înternalisés par des moyens non spécifiques de type phagocytose ou macropinocytose étaient dans certains cas présentés par des DC ou des macrophages dans le contexte des molécules du CMH de classe I, il est maintenant admis que la capture des antigènes via un récepteur favorise l'accès des antigènes au cytosol des cellules présentatrices d'antigène et donc à la présentation dans le CMH de classe I. Although it was observed that antigens internalized by non-specific means of phagocytosis or macropinocytosis kind in some cases were presented by DC or macrophages in the context of MHC class I, it is now accepted that the capture antigens via a receiver supports access to the cytosol of antigen presenting cells and thus antigen presentation in the MHC class I. Des exemples sont fournis par les immunocomplexes et les HSP qui sont capturés par les DC via des récepteurs spécifiques et qui sont présentés dans les molécules du CMH de classe I (Rodriguez A., et al., Nat. Cell Biol., 1 , 362-368, 1999). Examples are provided by the immunocomplexes and HSPs are captured by DC via specific receptors, which are presented in MHC class I (A. Rodriguez, et al., Nat. Cell Biol., 1, 362 -368, 1999).

Des approches vaccinales ont ainsi consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et à les réimplanter chez le patient. Vaccine approaches have thus been to load dendritic cells ex vivo with the antigen of interest (peptides or cell lysate) and are implanted in the patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E., et al., Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87, 1998). Other approaches are to be transfected ex vivo dendritic cells with the gene encoding the antigen of interest and inject these transfected cells (Gilboa E., et al., Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87, 1998). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu FJ, et al., Nat. Med., 2, 52- 58, 1996) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou internalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. These approaches have been used successfully in mice and humans (Hsu FJ, et al, Nat Med, 2, 52 -... 58, 1996) but remain complex since these cells must be treated ex vivo (cell transformation or internalization of antigens) and transplanted into the host organism. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton GT, et al., J. Immunol., 151, 1097-1 107, 1993) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IF A) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 24, 1458-1462, 1994) permet de générer des réponses CTL. Similarly, the use of virus-like particles (Layton GT, et al., J. Immunol., 151, 1097-1 107, 1993) or incomplete Freund's adjuvant (IF A) (Valmori et al. , Eur. J. Immunol., 24, 1458-1462, 1994) to generate CTL responses. Toutefois, une vaccination antivirale ou antirumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Nat. Acad. Scî., USA, 93, 7855-7860, 1996). However, antiviral or antirumorale vaccination performed with peptides corresponding to CTL epitopes in the presence of such an adjuvant may lead to a state of specific tolerance that can lead in some cases to the contrary sought, that is, ie a decrease in the immune response (Toes et al., Nat. Acad. Proc. Sci., USA, 93, 7855-7860, 1996).

Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire, et notamment une réponse de type T cytotoxique (CTL), dirigée contre ladite molécule. Thus, today there is a great need for a compound which, combined with a molecule including an antigen or hapten is able to generate an immune response, including a response from type T cytotoxic (CTL) directed against said molecule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire, notamment de type CTL, antivirale, antibactérienne, antifongique, antiparasitaire ou antitumorale. Such a compound may be used in particular for the preparation of a vaccine composition for inducing an immune protection, in particular of CTL, antiviral, antibacterial, antifungal, antiparasitic or antitumor. On recherche également de nouvelles molécules pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active vers les cellules présentatrices d'antigènes, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes. We also find new molecules for the specific targeting of a biologically active substance to the antigen presenting cells, such as dendritic cells, macrophages, B cells or monocytes.

En effet, on recherche des nouvelles molécules qui, associées avec une substance biologiquement active telle que des antigènes ou des facteurs de croissance cellulaire, peuvent se fixer spécifiquement sur les cellules présentatrices d'antigènes et/ou être internalisées dans lesdites cellules et ainsi être capables d'exercer une activité thérapeutique modulée par l'intermédiaire des cellules présentatrices d'antigène. Indeed, research on new molecules associated with a biologically active substances such as antigens or cell growth factors can bind specifically to the antigen-presenting cells and / or be internalized in those cells and thus be able to exert a therapeutic activity modulated via antigen presenting cells.

Les scavengers récepteurs sont des protéines exprimées à la surface de nombreuses cellules et en particulier des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles que sont les DC et les macrophages (Medzhitov R., et al., Curr. Opin. Immunol., 9, 4-9, 1997 ; Lebecque S., Vaccine, 25, 1603-1605, 2000). The scavenger receptors are proteins expressed on the surface of many cells and especially professional antigen presenting cells such as DCs and macrophages (Medzhitov R., et al, Curr Opin Immunol, 9, 4.... - 9, 1997; Lebecque S., Vaccine, 25, 1603-1605, 2000). Ils lient notamment les lipoprotéines modifiées chimiquement. In particular, they bind chemically modified lipoproteins. Plusieurs familles de scavengers récepteurs ont été identifiées, chaque famille pouvant contenir plusieurs membres. Several families of scavenger receptors have been identified, each family can contain multiple members. Ils lient un large panel de ligands différents. They bind a wide range of different ligands. En particulier, certains scavengers récepteurs sont impliqués dans la réponse antibactérienne et lient des molécules bactériennes telles que le LPS ou l'acide lipotéchoique. In particular, some scavenger receptors are involved in the antibacterial response and bind molecules such as bacterial LPS or lipoteichoic acid. La liaison est suivie par une endocytose de la molécule. Binding is followed by endocytosis of the molecule. La demande EP 0 783 892 décrit une méthode pour augmenter l'immunogénicité dans laquelle un antigène et un ligand d'un récepteur scavenger sont conjugués à un adjuvant. Application EP 0,783,892 describes a method for increasing the immunogenicity in which antigen and a scavenger receptor ligand is combined with an adjuvant.

Le récepteur scavenger LOX-1 a été initialement identifié comme un récepteur aux LDL (« Low Density Lipoprotein ») oxydés. The scavenger receptor LOX-1 was originally identified as a receptor for LDL ("Low Density Lipoprotein") oxidized. Comme tout scavenger récepteur, LOX- 1 fixe de nombreux ligands et est également impliqué dans la phagocytose des cellules apoptotîques par liaison à la phosphatidyl serine exprimée à la surface de ces cellules. Like any scavenger receptor LOX-1 fixed numerous ligands and is also involved in the phagocytosis of apoptotic cells by binding to phosphatidylserine expressed on the surface of these cells. LOX-1 est exprimé sur les cellules endothéliales, les monocytes/macrophages ainsi que les fibroblastes. LOX-1 is expressed on endothelial cells, monocytes / macrophages and fibroblasts. Son expression est très augmentée au niveau des plaques d'athérome. Its expression is increased in the atherosclerotic plaques.

La demande WO 99/32520 décrit une méthode pour quantifier les LDL dénaturés utilisant un polypeptîde fusionné composé d'une région extracellulaire d'un récepteur des LDL oxydés et d'une partie d'une chaîne lourde d'une immunoglobulîne. WO 99/32520 describes a method for quantifying LDL denatured using a fusion polypeptide consisting of an extracellular region of a receptor for oxidized LDL and part of an immunoglobulin heavy chain. Des ΛDNc de récepteurs humains et bovins des LDL modifiés sont décrits dans la demande WO 96/17058. ΛDNc of human and bovine modified LDL receptors are described in WO 96/17058. La demande US 5,510,466 décrit des récepteurs scavenger constitués de trois sous-unités capables de lier les LDL acétylés. U.S. application 5510466 describes scavenger receptors consist of three subunits can bind acetylated LDL. Des anticorps contre ces récepteurs sont aussi décrits. Antibodies against these receptors are also described. Des analogues des récepteurs aux LDL et leurs séquences nucléiques sont décrits dans le brevet US 5,665,872. Similar to LDL receptors and their nucleotide sequences are described in U.S. patent 5,665,872. Quant au brevet US 5,521,071 , elle décrit des récepteurs aux LDL solubles et leurs séquences nucléiques. As for U.S. Patent 5,521,071, it describes soluble LDL receptor and nucleic acid sequences. On peut également citer le brevet US 5,945,308 qui décrit la séquence nucléique et peptidique d'un récepteur LOX dénommé HORL. We may also mention the U.S. patent 5,945,308 which describes the nucleic acid sequence and peptide receptor called LOX CLOCK.

Les HSP (Heat Shock Protein) sont des molécules chaperonnes qui contrôlent le repliement des protéines et évitent leur agrégation; elles sont fortement conservées lors de l'évolution (Feldman, DE, et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 10, 26-33, 2000). HSP (Heat Shock Protein) are molecular chaperones that control protein folding and prevent aggregation, and they are highly conserved during evolution (Feldman, DE, et al, Curr Opin Struct Biol, 10..... , 26-33, 2000). De nombreuses études ont démontré que les HSP peuvent être utilisées comme protéines porteuses et favorisent une réponse immune contre des peptides ou des oligosaccharides (Lussow, AR, et al., Eur. J. Immunol., 21 , 2297-2302, 1991). Numerous studies have demonstrated that HSPs can be used as carrier proteins and promote an immune response against peptides or oligosaccharides (Lüssow, AR, et al., Eur. J. Immunol., 21, 2297-2302, 1991). Les HSP n'induisent pas de suppression épitopique (Barrios, C, et al., Eur. J. Immunol., 22, 1365-1372, 1992) et sont efficaces en absence d'adjuvant (Barrios C. et al., 1992), suggérant que les HSP peuvent être considérées comme des adjuvants en tant que tels (Blachere, NE, et al., J. Exp. Med., 186, 1315-1322, 1997). HSPs do not induce epitope suppression (Barrios, C, et al., Eur. J. Immunol., 22, 1365-1372, 1992) and are effective in the absence of adjuvant (C. Barrios et al., 1992 ), suggesting that the HSP can be considered as such adjuvants (Blachere, NE, et al., J. Exp. Med., 186, 1315-1322, 1997).

L'utilisation potentielle des HSP en immunothérapie antitumorale est actuellement très étudiée (Srivastava, PK, et al., 8, 657-665, 1998). The potential use of HSP in tumor immunotherapy is currently extensively studied (Srivastava, PK, et al., 8, 657-665, 1998). Les HSP isolées des cellules tumorales engendrent une puissante réponse CTL CD8+ protectrice et spécifique de la tumeur (Srivastana, PK, et al., 39, 93-98, 1994 ; Tamura, Y., et al., Science, 278, 1 17-120, 1997). HSPs isolated from tumor cells generate a strong CTL response specific CD8 + and protective of the tumor (Srivastana, PK, et al, 39, 93-98, 1994. Tamura, Y., et al, Science, 278, 1 17. -120, 1997). Cette propriété provient de la capacité des HSP à se lier de façon non covalente à des peptides antigéniques spécifiques des tumeurs (Udono, H., et al., J. Exp. Med., 178, 1391-1396, 1993 ; Tamura, Y., et al., 1997 ; Nieland, TJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 6135-6139, 1996). This property comes from the ability of HSPs to bind non-covalently to specific tumor antigen peptides (Udono, H., et al, J. Exp Med 178, 1391-1396, 1993... Tamura, Y ., et al, 1997. Nieland, TJ, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 6135-6139, 1996)...... Parmi les différentes HSP testées, gp96 (un homologue endoplasmique de la HSP90) et la HSP70 sont les plus utilisés dans des vaccins anti-tumoraux prophylactiques ou thérapeutiques contre différents types de tumeurs (Udono, H., et al., J. Immunol., 152, 5398-5403, 1994). Among the various HSPs tested, gp96 (endoplasmic counterpart HSP90) and HSP70 are the most widely used anti-tumor therapeutic or prophylactic vaccines against different types of tumors (Udono, H., et al., J. Immunol. , 152, 5398-5403, 1994).

Des études récentes ont analysé les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les complexes HSP-pcptides dérivés de tumeurs induisent une réponse antitumorale. Recent studies have analyzed the cellular and molecular mechanisms by which complex pcptides HSP-derived tumors induce an antitumor response. Les HSP se lient aux cellules présentatrices d'antigènes (monocytes/macrophages, lymphocytes B et cellules dendritiques immatures) mais pas aux cellules T (Udono, H., et al., 1993). HSPs bind to antigen presenting cells (monocytes / macrophages, B cells and immature dendritic cells) but not T cells (Udono, H., et al., 1993). La liaison est suivie de leur internalisation (endocytose médiée par un récepteur) (Arnold-Schild, D., et al., J. Immunol., 162, 3757- 3760, 1999) qui est nécessaire pour la représentation dans les molécules du CMH de classe I des peptides associés aux HSP et pour une activation subséquente des cellules T. The link is followed by their internalization (receptor-mediated endocytosis) (Arnold-Schild, D., et al, J. Immunol, 162, 3757 -.. 3760, 1999) which is necessary for representation in MHC class I peptides associated with HSP and subsequent activation of T cells L'internalisation des HSP est similaire à celle des complexes FcγR-Ac qui conduit à une présentation des antigènes dans les molécules du CMH de classe I (Rodriguez, A., et al., Nat. Cell Biol., 1, 362-368, 1999). The internalization of HSP is similar to FcγR-Ac complex leading to antigen presentation in MHC class I (Rodriguez, A., et al., Nat. Cell Biol., 1, 362-368 1999).

L'identification des structures qui lient les HSP est d'une grande importance afin de pouvoir les cibler de façon sélective dans le but de générer des réponses immunes de type CTL. The identification of structures that bind the HSP is of great importance to be able to selectively target in order to generate such CTL immune responses. Binder et al ont montré que CD91 est un ligand pour gp96 (Binder, RJ, et al., Nat. Immunol., 1, 151-155, 2000). Binder et al have shown that CD91 is a ligand for gp96 (Binder, RJ, et al., Nat. Immunol., 1, 151-155, 2000). Il est intéressant de noter que la liaison de gp96 au CD91 est nécessaire pour la représentation du complexe gp96-peptide associé. It is interesting to note that the binding of gp96 to CD91 is required for the representation of complex gp96-associated peptide. Toutefois, plusieurs données suggèrent que d'autres structures liant les HSP existent : (i) il n'y a pas de compétition entre gp96 et HSP70 pour la liaison aux cellules présentatrices d'antigène (Binder, RJ, et al., J. Immunol, 165, 2582-2587, 2000), et (ii) la liaison de HSP70 aux cellules mononucléées de souris est hétérogène (Castellino, F., et al., J. Exp. Med., 191, 1957-1964, 2000). However, several data suggest that other structures linking HSP exist: (i) there is no competition between gp96 and HSP70 for binding to antigen-presenting cells (Binder, RJ, et al, J.. Immunol, 165, 2582-2587, 2000) and (ii) the binding of HSP70 in mononuclear cells of mice is heterogeneous (Castellino, F., et al., J. Exp. Med., 191, 1957-1964, 2000 ). De manière surprenante, il a maintenant été mis en évidence que les HSP se liaient à certains types de récepteurs scavenger. Surprisingly, it has now been revealed that the HSP is bound to certain types of scavenger receptors. De manière encore plus surprenante, il a aussi été déterminé que les HSP ne se liaient pas sur tous les types de récepteurs scavenger, mais se liaient spécifiquement sur le récepteur scavenger LOX. Even more surprisingly, it was also determined that the HSP did not bind to all types of scavenger receptors, but bound specifically to the scavenger receptor LOX.

La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX, de préférence un récepteur LOX d'origine humaine. The present invention thus relates to a method for identifying new molecules of therapeutic interest, characterized in that selects the molecules that bind to a receptor LOX, preferably a human LOX receiver.

Ce procédé, et les nouvelles molécules sélectionnées identifiées comme se liant à un récepteur LOX, pourront ainsi répondre aux problèmes mentionnés ci-dessus, à savoir trouver de nouveaux porteurs ou adjuvants permettant d'augmenter ou induire l'immunogénicité notamment de type cellulaire, de nouveaux composés qui, associés à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soient capables de générer une réponse CTL, tout comme de nouveaux composés capables de cibler les cellules présentatrices d'antigènes, de préférence celles exprimant ledit récepteur LOX, et notamment les cellules dendritiques de préférence immatures. This process, and selected new molecules identified as binding to a receptor LOX, and will address the issues mentioned above, namely finding new carriers or adjuvants to increase the immunogenicity or induce particular cell type, novel compounds which, when combined with a molecule such as a hapten or antigen, are capable of generating a CTL response, as new compounds able to target antigen presenting cells, preferably those LOX expressing said receptor, and in particular the cells immature dendritic preference.

Par cellules présentatrices d'antigènes (CPA ou APC), on entendra désigner dans la présente invention, les cellules CPA professionnelles formant partie intégrante du système immunitaire telles que les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, notamment les cellules dendritiques immatures. By antigen-presenting cells (APC or APC) cells, it is intended to refer to in the present invention, professional CPA cells forming part of the immune system such as dendritic cells, macrophages, B cells and monocytes, including dendritic cells immature.

Dans la présente invention, on entendra désigner également par le terme «peptide» les protéines ou les polypeptides, termes qui seront ici employés indifféremment. In the present invention, the expression also designated by the term "peptide" proteins or polypeptides, terms to be used interchangeably here.

Selon l'invention, il est possible d'utiliser tout type de récepteur LOX et notamment le récepteur LOX-1 de préférence d'origine humaine dont la séquence de PADNc codant pour ce récepteur LOX-1 humain est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession AN AB 010710 (correspondant à la séquence SEQ ID No. 1 de la liste des séquences ci-après) et dont la séquence peptidique est décrite dans la banque de données GenBank sous le numéro d'accession AN BAA24580 (correspondant à la séquence SEQ ID No. 2 de la liste des séquences ci- après), ou un peptide dérivé dudit récepteur LOX-1, peptide dérivé dont sa séquence nucléique codante présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, 95 % et 99 % avec la séquence décrite dans ledit document GenBank AN AB 010710, ou encore un de ses fragments comprenant le site de liaison à la molécule identifiée selon le procédé d'identification selon l'invention. According to the invention, it is possible to use any type of receptor LOX including the LOX-1 receptor preferably of human origin, the sequence of cDNA encoding the human receptor LOX-1 is described in the GenBank database under the accession number AN AB 010710 (corresponding to the sequence SEQ ID No. 1 of the Sequence Listing below) and the peptide sequence is described in the GenBank database under accession number AN BAA24580 ( corresponding to the sequence SEQ ID No. 2 of the sequence list below), or a derivative of said peptide receptor LOX-1 derived peptide, its encoding nucleic sequence exhibiting a percentage identity of at least 80%, preferably at least 90%, 95% and 99% with the sequence described in said document GenBank AN AB 010710, or a fragment thereof comprising the binding site of the molecule identified by the identification method according to the invention .

Selon l'invention, on pourra également utiliser tout fragment du récepteur LOX et notamment du récepteur LOX-1 , de préférence d'origine humaine codée par la séquence GenBank AN AB 010710 (séquence SEQ ID No. 1 ), capable de se lier avec au moins l'un des ligands connus de ce récepteur LOX, en particulier les ligands tels que cités ci-après. According to the invention, there may also use any fragment of LOX receiver including receptor LOX-1, preferably of human origin encoded by GenBank AN AB 010710 (SEQ ID NO: 1) sequence capable of binding to at least one of the LOX known receptor ligands, especially ligands such as listed below.

Dans la présente description, par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucleotidcs ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. In the present specification, the term "percent identity" between two nucleic acid sequences or amino acid within the meaning of the present invention, means a percentage of nucleotidcs or amino acid residues identical between the two sequences comparing obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed over their entire length. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci-après, est le plus élevé. The best alignment or optimal alignment is the alignment for which the percentage of identity between the two sequences to be compared, as calculated below, is the highest. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligned, said comparison being carried out by segment or "comparison window" to identify and compare regions local sequence similarity. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Watennan (1981) [Ad. Optimal alignment of sequences for comparison can be conducted, as well as manually, using the local homology Watennan and Smith (1981) algorithm [Ad App. App. Math. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. 2:482], using the local homology algorithm of Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Mol. Biol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. 48:443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore BLASTN ou BLASTX, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215,403,1990). USA 85:2444], by means of computer programs using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis., or BLASTX or BLASTN, Altschul et al., J. Biol. 215,403,1990 Mol.).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. The percentage identity between two nucleic acid sequences or amino acid sequences is determined by comparing these two sequences optimally aligned for comparison window wherein the region of the nucleic acid sequence or amino acid sequence to compare may comprise additions or deletions relative to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. The percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or amino acid residue is identical between the two sequences by dividing the number of identical positions by the total number of positions in the window of comparison and multiplying the result by 100 to get the percentage of identity between these two sequences.

Les récepteurs décrits dans les demandes WO 99/32520 (récepteur LOX- 1 humain et bovin respectivement de séquence peptidique SEQ ID No. 1 et No. 2, et leur séquence nucléique respective SEQ ID No. 5 et No. 6 dans ce document), WO 96/17058 (et particulièrement les séquences nucléiques et protéiques des récepteurs LOX d'origine bovine et humaine identifiées par les séquences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 3 dans ce document), US 5,510,466 (dont les séquences nucléiques et protéiques sont représentées aux figures 3A à 4D de ce document), US 5,665,872 (et particulièrement la séquence nucléique SEQ ID No. 1 et la séquence protéique SEQ ID No. 3) et US 5,521,071 (et particulièrement la séquence nucléique SEQ ID No. 1 et protéique SEQ ID No. 2) pourront être utilisés, de même que le récepteur LOX, dénommé HORL, dont les séquences nucléique et peptidique sont décrites dans le brevet US 5,945,308. Receptors described in WO 99/32520 (human and bovine receptor LOX-1 peptide of sequence SEQ ID No. 1 and No. 2, and their respective nucleic acid sequence SEQ ID No. 5 and No. 6 in this document) , WO 96/17058 (particularly the nucleic acid and protein sequences of LOX bovine and human receptors identified by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID No. 3 in this document), U.S. 5,510,466 (including the nucleic acid and protein sequences are shown in Figures 3A to 4D of this document), U.S. 5,665,872 (particularly the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 and the protein sequence SEQ ID No. 3) and U.S. 5,521,071 (and particularly the sequence nucleic SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 protein) may be used, as well as LOX receptor, called CLOCK, the nucleic and amino acid sequences are described in U.S. patent 5,945,308.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le récepteur LOX utilisé correspond au récepteur LOX-1, de préférence d'origine humaine, notamment de séquence nucléique SEQ ID No. 1 et peptidique SEQ ID No. 2. In a preferred embodiment of the invention, the receiver used is the LOX LOX-1 receptor, preferably of human origin, including nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 and peptide SEQ ID No. 2.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'on sélectionne les molécules qui se lient à un récepteur LOX et qui sont en outre capables d'être internalisées par une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX. In a preferred embodiment, the invention relates to an identification process according to the invention, characterized in that it selects the molecules that bind to a receptor LOX and are also able to be internalized by a cell expressing said antigen-presenting receptor LOX. Les molécules à sélectionner et, le cas échéant, à identifier si elles sont de structure inconnue ou si lesdites molécules sont sélectionnées à partir d'un mélange de composés connus ou inconnus, peuvent être choisies parmi toutes catégories de molécules naturelles ou synthétiques. Selecting molecules and, where appropriate, to identify whether they are of unknown structure, or the said molecules are selected from a mixture of known or unknown compounds may be chosen from all types of natural or synthetic molecules. L'invention n'est nullement limitée à un type de molécules à sélectionner mais au contraire permet d'identifier de nouveaux composés à partir de molécules très diverses, comme par exemple des molécules chimiques ou biologiques, des extraits cellulaires, notamment de bactéries, des extraits de plantes, etc.. The invention is not limited to one type of molecule to select but instead helps to identify new compounds from very different molecules, such as chemical or biological molecules, cell extracts, including bacteria, plant extracts, etc. ..

On pourra, de façon préférée, tester des extraits membranaires, et plus préférentiellement solubles, de pathogènes (bactéries, parasites, etc.) et de cellules eucaryotes, notamment humaines. It may, preferably, test membrane extracts, and more preferably soluble, pathogens (bacteria, parasites, etc..) And eukaryotic cells, including human.

De préférence, le procédé d'identification selon l'invention pour l'identification de nouvelles molécules d'intérêt thérapeutique se liant à un récepteur LOX est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule, ou d'un mélange de molécules, connue ou inconnue à tester avec un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation éventuelle d'une molécule testée avec ledit iécepteur LOX ; b) la mise en évidence de la fixation ou non de ladite molécule testée avec ledit récepteur LOX ; et c) la sélection de cette molécule si sa fixation avec ledit récepteur LOX a été mise en évidence à l'étape b). Preferably the identification method of the invention for the identification of new molecules of therapeutic interest which binds to a receptor LOX is characterized in that it comprises the following steps: a) contacting a molecule, or a mixture of molecules, known or unknown test LOX with a receiver in a medium allowing the possibility of a test molecule with said binding iécepteur LOX b) the detection of the fixation or not of said molecule tested LOX said receiver, and c) the selection of this molecule if its attachment with said LOX receptor was highlighted in step b). Ledit récepteur LOX, ou un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, utilisé à l'étape a) pourra être isolé ou purifié à partir de culture de cellules exprimant naturellement ce récepteur. LOX said receiver, or a fragment thereof comprising its specific binding site, used in step a) may be isolated or purified from a culture of cells naturally expressing this receptor. De préférence, ledit récepteur LOX utilisé à l'étape a), ou l'un de ses fragments comprenant son site de fixation spécifique, notamment sa fraction soluble dépourvue de son domaine transmembranaire, sera de nature recombinante, soit isolé et/ou purifié à partir de cultures de cellules hôtes transformées avec un ADN codant pour cedit récepteur, ou soit sous forme de cesdites cellules hôtes exprimant à leur surface ledit récepteur LOX. Preferably, said receptor LOX used in step a), or a fragment thereof comprising its specific binding site, including the soluble fraction free of the transmembrane domain thereof, is recombinantly nature, or isolated and / or purified from cultures transformed with a DNA encoding this said receiver host cells, or either as these said host cells expressing on their surface receptor LOX said.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape d) suivante : d) l'identification de la molécule sélectionnée à l'étape c) si celle-ci n'est pas connue. In a preferred embodiment, the invention relates to a next identification process of the invention, characterized in that it further comprises the step d) d) the identification of the molecule selected in step c) if it is not known.

En effet, il sera possible d'utiliser dans les procédés selon la présente invention, une molécule à tester, prise de manière isolée et dont la structure n'est pas connue, ou un mélange de molécules à tester connues ou inconnues, dont les étapes a), b) et c) du procédé ci-avant décrites permettront seulement d'identifier leur capacité à se lier audit récepteur. Indeed, it will be used in the methods of the present invention, a test molecule, taken in isolation and whose structure is not known, or a mixture of molecules to test whether known or unknown, including the steps a), b) and c) of the process described above will only identify their ability to bind to said receptor. Ladite étape d) aura pour objectif d'identifier la structure de la molécule inconnue ayant cette capacité, ou d'identifier parmi l'ensemble des molécules connues testées simultanément celle(s) présentant cette capacité. Said step d) will aim to identify the structure of the unknown molecule having this ability, or identify among all known molecules simultaneously tested one (s) with this capability. Par exemple, de telles molécules à tester, seules ou en mélange, pourront être issues de synthèse chimique par chimie combinatoire, de banques de clones d'expression de peptides ou d'extraits naturels contenant des mélanges complexes. For example, such molecules to be tested, either alone or in admixture, can be derived by chemical synthesis of combinatorial chemistry libraries of expression of peptides or of natural extracts containing complex mixtures clones.

Les molécules ayant la capacité de se fixer aux formes recombïnantes des récepteurs LOX pourront ensuite être analysées, si nécessaire, par toute méthode d'analyse permettant de définir la structure d'un composé chimique ou biochimique connue de l'homme de l'art telle que, sans s'y limiter, par spectrométrie de masse, HPLC, infrarouges et/ou par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire). Molecules having the ability to bind to recombinant forms of LOX receivers can then be analyzed, if necessary, by an analytical method to define the structure of a chemical or biochemical compound known to one skilled in the art such as, without limitation, mass spectrometry, HPLC, IR and / or NMR (Nuclear Magnetic Resonance).

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que la mise en évidence et/ou l'identification des molécules capables de se lier au récepteur LOX est réalisée par une méthode choisie parmi les méthodes suivantes : In a preferred embodiment, the invention relates to an identification process according to the invention, characterized in that the detection and / or identification of molecules capable of binding to the receptor LOX is performed by a method selected of the following methods:

- une chromatographie d'affinité, - Affinity chromatography,

- une identification par FACS des molécules se liant à des cellules transfectées par un récepteur LOX, - une technique de type BIACOR, ou - Identification FACS binding molecules to cells transfected with a receptor LOX - a technique Biacor type or

- un clonage par expression à partir d'une sonde portant un récepteur LOX, tel qu'un screening en utilisant comme sonde une forme soluble d'un récepteur LOX, le domaine extracellulaire du récepteur LOX pouvant être fusionné à une chaîne lourde d'îmmunoglobuline. - An expression cloning from a probe bearing a receptor LOX, such as screening using as a probe a soluble form of a receptor LOX, the LOX receptor extracellular domain can be fused to an immunoglobulin heavy chain . La technique dite de chromatographie d'affinité connue de l'homme du métier pourra être réalisée en utilisant des formes recombinantes des récepteurs LOX immobilisées sur une résine. The technique known as affinity chromatography known in the art may be made using recombinant forms immobilized on a resin LOX receivers. Idéalement, les formes recombinantes des récepteurs LOX seront composées uniquement des domaines extracellulaires des formes recombinantes des récepteurs LOX fusionnées ou non à une séquence Tag (c-myc, His 6 , chaîne lourde de l'immunoglobuline γl murine, GST (Glutathion S-Transférase), ...). Ideally, the recombinant forms of the receptor LOX will consist only of the extracellular domains of recombinant forms a fused or non-receptor LOX Tag sequence (c-myc, His 6, the immunoglobulin heavy chain murine γl, GST (glutathione S-transferase ), ...). Les molécules recombinantes pourront être produites en système procaryote ou eucaryote (cellules COS, CHO ou cellules d'insecte). The recombinant molecules can be produced in prokaryotic or eukaryotic system (COS cells, CHO cells or insect). Les molécules recombinantes seront fixées sur une résine adaptée en utilisant des techniques conventionnelles incluant le couplage chimique h une matrice de colonne appropriée telle que l'agarose, Affi Gel, ou d'autres matrices connues de l'homme de l'art. The recombinant molecules are attached to a suitable resin using conventional techniques including chemical coupling h matrix appropriate column such as agarose, Affi Gel, or other known matrices skilled in the art. Les molécules à tester décrites ci-dessus telles que des extraits protéiques totaux issus de bactéries, parasites, virus, cellules eucaryotes pourront être incubés avec ces résines sont ensuite déposées sur la colonne. The test molecules as described above such that the total protein extracts from bacteria, parasites, viruses, eukaryotic cells can be incubated with these resins are then deposited on the column. Les molécules interagissant avec ledit récepteur LOX sont retenues par la colonne et peuvent être isolées par élution. Molecules interacting with said LOX receiver are retained by the column and can be isolated by elution. L'identification par FACS (« Fluorescence Actîvatcd Cells Sorting ») est une technique connue de cytometrîe en flux, et permet d'analyser la fixation de la molécule testée sur des transfectants stables exprimant un récepteur LOX. The identification by FACS ("Fluorescence Actîvatcd Sorting Cells") is a known technique for flow cytometry, and used to analyze the binding of the molecule tested on stable transfectants expressing a receptor LOX. Les transfectants stables peuvent être générés dans des cellules hôtes qui n'expriment peu ou pas de récepteur scavenger comme les cellules CHO. The stable transfectants can be generated in host cells that express little or no scavenger receptor such as CHO cells. Pour identifier les molécules ayant la capacité de se fixer aux récepteurs LOX, il sera possible de créer une banque d'expression. To identify molecules with the ability to bind to receptors LOX, it will be possible to create an expression library. Brièvement, les ADNc ou l'ADN génomique issu de bactéries, parasites, cellules eucaryotes, etc., seront insérés dans un vecteur d'expression procaryote permettant la production de molécules recombinantes solubles et taggées (marquées) (idéalement, nous choisirons un Tag (ou marqueur) détectable par un anticorps compatible avec un screening par cytofluorométrie). Briefly, cDNA or genomic DNA from bacteria, parasites, eukaryotic cells, etc.., Will be inserted into a prokaryotic expression vector for the production of soluble recombinant molecules and tagged (labeled) (ideally, we will choose a tag ( or marker) antibodies detectable by compatible with screening by flow cytometry). Les molécules recombinantes produites par les clones bactériens seront sélectionnées sur la capacité à se fixer aux transfectants stables exprimant un récepteur LOX. The recombinant molecules produced by bacterial clones will be selected on the ability to bind to stable transfectants expressing a receptor LOX. L'ADN plasmîdique pourra ensuite être identifié par séquençage. The plasmid DNA can then be identified by sequencing.

Dans d'autres méthodes, les molécules susceptibles d'interagir avec ledit récepteur LOX, peuvent être liés à des marqueurs détectables telles que des marqueurs radioactifs, fluorescents ou enzymatiques. In other methods, molecules capable of interacting with said LOX receptor may be associated with detectable labels such as radioactive, fluorescent or enzymatic labels. Ces molécules marquées sont mises en contact avec ledit récepteur LOX immobilisé, dans des conditions permettant une interaction spécifique. These labeled molecules are brought into contact with said immobilized receptor LOX, under conditions allowing a specific interaction. Après élimination des molécules non-fixées spécifiquement, les molécules liées sont détectées par des moyens appropriés. After removal of non-specifically bound molecules, bound molecules are detected by appropriate means.

La technologie du BIACORE peut également être utilisée pour effectuer le criblage de composés capables d'interagir avec ledit récepteur LOX. BIACORE technology can also be used to perform the screening of compounds capable of interacting with said LOX receiver. Cette technologie permet de détecter des interactions entre molécules en temps réel sans utilisation de marquage. This technology enables the detection of molecular interactions in real time without the use of marking. Elle est basée sur le phénomène de SPR (surface plasmon résonance). It is based on the phenomenon of SPR (Surface Plasmon Resonance). Un des principaux avantages de cette méthode est qu'elle permet la détermination des constantes d'association entre le récepteur et les molécules interagissant. A major advantage of this method is that it allows the determination of the association constants between the receiver and the interacting molecules. Ainsi, il est possible de sélectionner spécifiquement les molécules interagissant avec de fortes ou de faibles constantes d'association. Thus, it is possible to select specific molecules interacting with strong or weak association constants.

Le clonage par expression peut aussi être effectué à partir d'une sonde constituée du domaine extracellulaire du récepteur LOX fusionné à un Tag, idéalement une chaîne lourde d'îmmunoglobuline murine. The expression cloning can also be done from a probe consisting of the extracellular domain of LOX receptor fused to a tag, ideally a murine immunoglobulin heavy chain. La détection de cette molécule pourra se faire à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobulîne murine marquée à un fluor, un tluorochrome (Alexa ou FITC) ou de billes magnétiques coatées avec un anticorps anti- Ig de souris. The detection of this molecule may be using an anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with fluorine, tluorochrome (Alexa or FITC) or magnetic beads coatées with anti-mouse Ig antibodies. Les banques d'expression (procaryotique ou eucaryotique) construites avec de l'ADNc ou de l'ADN génomique provenant de bactéries, virus, parasites, cellules eucaryotes, etc. The expression libraries (prokaryotic or eukaryotic) constructed with cDNA or genomic DNA from bacteria, viruses, parasites, eukaryotic cells, etc.. seront screenées à l'aide des formes recombinantes solubles des récepteurs LOX. will screenées using recombinant soluble forms of the receptor LOX. Les clones ainsi isolés pourront être identifiés par séquençage. The isolated clones can be identified by sequencing. Par exemple, mais sans s'y limiter, on pourra également mettre en œuvre dans les procédés d'identification selon l'invention une autre méthode d'identification de molécules capables d'interagir avec ledit récepteur LOX utilisant un système de double hybrides bactériens ou levures tel que le Matchmaker Two Hybrid System 2. For example, but without limitation, there can also be implemented in the identification methods according to the invention another method of identifying molecules capable of interacting with said LOX receiver using a bacterial two hybrid system or yeast as the Matchmaker Two Hybrid System 2. Selon les instructions du manuel accompagnant le Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalogue N° l 604-1 , Clontech), lorsque par exemple les molécules à tester sont des peptides non connus dont les ADNc sont clones dans des banques de plasmides. According to the manual accompanying the Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalog No. 604-1 l, Clontech), for example when the test molecules are not known peptides whose cDNA was cloned into plasmid libraries.

On peut également citer une autre méthode d'identification pour mettre en évidence l'interaction dudit récepteur LOX avec des petites molécules telles que celles générées par chimie combinatoire, mettant en œuvre une microdialyse couplée à une HPLC ou une electrophorèse capillaire d'affinité, techniques connues de l'homme de l'art. We may also mention another identification method to highlight the interaction of said LOX receiver with small molecules such as those generated by combinatorial chemistry, implementing a microdialysis coupled to HPLC or capillary electrophoresis technical affinity known to one skilled in the art.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule se liant à un récepteur LOX à être internalisée par une cellule présentatrice d'antigène. In a preferred embodiment, the invention relates to an identification process according to the invention, characterized in that it further comprises a step of determining the ability of the molecule binds to a receptor LOX to be internalized by an antigen presenting cell.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce que la capacité des molécules se liant à un récepteur LOX à être înternalisées par une cellule présentatrice d'antigène est mise en évidence par une méthode comprenant les étapes suivantes : A) le marquage de ladite molécule sélectionnée se liant à un récepteur LOX par un marqueur susceptible de permettre la détection directe ou indirecte de la présence de ladite molécule ainsi marquée à la surface et/ou à l'intérieur d'une cellule, de préférence d'une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX ; In a preferred embodiment, the invention relates to an identification process according to the invention, characterized in that the ability of molecules binding to a receptor LOX to be internalized by antigen-presenting cell is highlighted by a method comprising the steps of: A) marking said selected binding to a receptor LOX with a label capable of enabling direct or indirect detection of the presence of said labeled molecule and the surface and / or inside molecule a cell, preferably an antigen presenting cell expressing said receptor LOX;

B) la mise en contact de ladite molécule marquée avec une cellule présentatrice d'antigène exprimant un récepteur LOX, dans un milieu permettant la fixation (et/ou le cas échéant l'internalisation dans la cellule) de ladite molécule marquée avec ledit récepteur LOX ; C) la mise en évidence de l'internalisation ou non de ladite molécule marquée dans ladite cellule présentatrice d'antigène ; et D) la sélection de cette molécule si l'internalisation de ladite molécule marquée a été mise en évidence à l'étape C). B) contacting said labeled with an antigen presenting cell expressing a receptor LOX in a medium allowing the attachment (and / or optionally internalization into the cell) of said labeled molecule with said receptor molecule LOX C) the identification of internalizing or not in that said labeled antigen-presenting cell molecule, and D) selection of the molecule if the internalization of said labeled molecule has been shown in step C). Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la capacité de ladite molécule ainsi identifiée d'être immunogène. In a preferred embodiment, the invention relates to an identification method of the invention, characterized in that it further comprises a step of determining the ability of said immunogen to be so identified molecule. Dans ce mode préféré de réalisation de l'invention, après avoir réalisé le procédé selon l'invention, on effectue une étape supplémentaire consistant à analyser ou évaluer l'immunogénicité de la molécule sélectionnée. In this preferred embodiment of the invention, after performing the method according to the invention, an additional step of analyzing or evaluating the immunogenicity of the selected molecule is carried out.

Pour ce faire, on peut coupler un haptène (par exemple le TNP (Trinitrophényl)) ou antigène tel qu'un oligosaccharide, un lipide ou un peptide à la molécule identifiée. To do this, you can pair a hapten (eg TNP (trinitrophenyl)) or antigen such as oligosaccharide, a lipid or a peptide identified the molecule. Des souris sont ensuite injectées par voie intra péritoneale ou sous-cutanée selon des protocoles connus de l'homme de métier. Mice were then injected intra-peritoneal route or subcutaneously by known the art protocols. La production d'Ac anti-haptène, -oligosaccharide, -lipide ou -peptide est analysée par ELISA. Production of anti-hapten Ac-oligosaccharide-or lipid-peptide is analyzed by ELISA.

On pourra également évaluer la capacité de ladite molécule sélectionnée à générer et/ou à augmenter la réponse immune de type CTL par mesure de l'activité cytotoxique de cellules effectrices de type lymphocyte générées après immunisation avec ladite molécule sélectionnée, la mesure du pourcentage de lyse de cellules co- incubées avec lesdites cellules effectrices étant par exemple évaluée par le taux de relargage de Cr comme décrit par exemple, mais sans s'y limiter, dans la demande de brevet WO 00/48628 ou WO 00/48629 aux exemples 4 et 5. It will also assess the ability of generating said selected and / or increase the CTL type immune response by measuring the cytotoxic activity of the effector molecule, cell-like cells generated after immunization with said selected molecule, measuring the percentage of lysis co-incubated with effector cells being said, for example, measured by the rate of release of Cr as described, for example, but without limitation, in the patent application WO 00/48628 and WO 00/48629 in Examples 4 and cells 5. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, caractérisé pour l'identification de nouvelles HSP ou des analogues d'HSP. In a preferred embodiment, the invention relates to an identification method of the invention, wherein the identification of new or similar HSP HSP.

Par analogue d'HSP, on entend désigner ici des composés capables d'exercer au moins l'une des fonctions d'adjuvant de l'immunité, et/ou de protéine porteuse favorisant une réponse immune efficace contre des peptides ou des oligosaccharides, notamment en absence d'adjuvant, notamment une réponse de type CTL, telle que décrite ci-avant dans le paragraphe concernant les HSP. For analog HSP is meant by compounds capable of performing at least one of the functions of the immune adjuvant and / or carrier protein promoting an effective immune response against peptides or oligosaccharides, including in the absence of adjuvant, including CTL response type, as described above in the section on the HSP.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé d'identification selon l'invention, pour : - l'identification en particulier de nouveaux adjuvants de l'immunité ; et/ou In a preferred embodiment, the invention relates to a method for identifying the invention, for: - identifying particularly new immunity adjuvants, and / or

- l'identification de molécule capable de cibler un composé tel qu'une substance à activité biologique, notamment un antigène ou haptène, qui lui est associé, de préférence par couplage covalent ou par affinité, vers une cellule exprimant ledit récepteur LOX, ledit composé associé à la molécule étant de préférence internalisé dans la cellule exprimant ledit récepteur LOX ; et/ou - The identification of molecules capable of targeting a compound such as a biologically active substance, especially an antigen or hapten, which is associated therewith, preferably by covalent coupling or by affinity, to a cell expressing said receptor LOX, said compound associated with the molecule being preferably in the internalized LOX cell expressing said receptor, and / or

- pour l'identification de molécule destinée à moduler l'activité biologique de composé (ou substance) qui lui est associé par l'intermédiaire des cellules exprimant ledit récepteur LOX, notamment les cellules présentatrices d'antigène comme les cellules dendritiques immatures ; et/ou - pour l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un antigène ou haptène qui lui est associé ; et/ou - For the identification of a molecule for modulating the biological activity of compound (or material) which is associated therewith through said LOX receptor expressing cells, including antigen presenting cells such as immature dendritic cells, and / or - for the identification of molecules for generating or increasing an immune response against an antigen or hapten which is associated therewith, and / or

- pour l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire de type T cytotoxique ; et/ou - For the identification of molecules for generating or increasing an immune response of cytotoxic T-type, and / or

- pour l'identification de molécule destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. - For the identification of molecules for generating or increasing an immune response against an infectious agent or a tumor cell.

Un objet de l'invention concerne également de nouvelles molécules susceptibles d'être identifiées par le procédé selon l'invention, tel que décrit ci-dessus, et caractérisées en ce qu'elles sont capables de se lier à un récepteur LOX, de préférence le récepteur LOX-1 , de manière plus préférée d'origine humaine, notamment le récepteur LOX-1 de séquence peptidique SEQ ID No. 2, et, le cas échéant et préférée, en ce qu'elles sont en outre capables d'être internalisées par une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX, ou l'un de ses fragments comprenant le site de liaison à la molécule ainsi identifiée ou tout fragment dudit récepteur LOX capable de se lier avec au moins l'un des ligands connus de ce récepteur LOX. An object of the invention also relates to novel compounds may be identified by the process according to the invention, as described above, and characterized in that they are capable of binding to a receptor LOX, preferably most preferably of human origin, such as LOX-1 receptor peptide sequence SEQ ID No. 2, receptor LOX-1, and so, if necessary, and preferably in that they are also capable of being internalized by an antigen presenting cell expressing said receptor LOX, or a fragment thereof comprising the binding site of the molecule as identified or any fragment of said LOX receptor capable of binding with at least one of the known ligands LOX this receptor. Ces nouvelles molécules susceptibles d'être obtenues par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention n'englobent pas les ligands connus à ce jour susceptibles de se lier à LOX- 1 , tels que les HSP, les LDL modifiés, oxydés ou acétylés, les apolipoprotéines, telles que les Apo B, les dérivés d'acide dcsoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucéliques non naturels tels que l'inositine. These new molecules may be obtained by the implementation of the method according to the invention does not include currently known ligands that bind to LOX-1, such as HSP, modified LDL, oxidized or acetylated, apolipoproteins such as apo B, the tetrameric dcsoxyribonucléotidiques polyinosines acid such as, natural and non nucéliques inositine acids such as derivatives. Par la mise en œuvre du procédé selon l'invention, il sera possible d'identifier de nouveaux anticorps anti-LOX. For the implementation of the method according to the invention, it will be possible to identify new anti-LOX antibodies. Ces derniers, tout comme les anticorps anti-LOX déjà connus, pourront être utilisés de la même façon que les HSP. These, like anti-LOX antibodies already known, can be used in the same way that the HSP.

Ainsi, l'invention concerne plus particulièrement un complexe anticorps Thus, the invention relates more particularly to an antibody

(dénommé également anticorps de fusion), caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX, ledit anticorps ou fragment étant associé à une substance biologiquement active. (Also referred to as fusion antibody), characterized in that it comprises at least one monoclonal antibody, a polyclonal or fragments thereof capable of binding specifically to an epitope of a receptor LOX, said antibody or fragment being associated with a biologically active substance.

De préférence, ledit complexe anticorps est caractérisé en ce que ledit anticorps, ou l'un de ses fragments, est en outre capable d'être internalisé dans des cellules présentatrices d'antigènes. Preferably, said antibody complex is characterized in that said antibody, or fragment thereof, is also capable of being internalized in antigen-presenting cells.

Par « substance biologiquement active », on entend désigner tout composé capable d'exercer une activité thérapeutique, notamment les composés dont l'activité peut être modulée par l'intermédiaire des cellules CPA. By "biologically active substance" is meant any compound capable of exerting a therapeutic activity, including compounds whose activity can be modulated through the CPA cells.

Comme exemple de telles substances biologiquement actives, on peut citer sans s'y limiter les composés immunogènes tels que des antigènes ou haptènes de nature protéique, lipidique, poly ou oligosaccharidique, glycoprotéique, lipoprotéique ou des acides nucléiques. Examples of such biologically active substances include but are not limited immunogenic compounds such as antigens or haptens proteinaceous, lipid, poly-or oligosaccharide, glycoprotein, lipoprotein or nucleic acids.

Au sens de la présente invention, par « immunogène, antigène ou haptène», on entend notamment désigner tout composé exprimé par un agent infectieux, tel un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. For the purposes of this invention, "immunogen, antigen or hapten" is especially meant any compound expressed by an infectious agent such as a virus, bacteria, yeast, fungus or parasite, a tumor cell, or a structural analogues, which alone or in combination with an adjuvant or carrier is capable of inducing a specific immune response to said infectious agent or said tumor cell.

On entend également désigner par "immunogène, antigène ou haptène" dans la présente description un composé piésentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue. We are also meant by "immunogenic antigen or hapten" herein piésentant a structural analogy with the antigen or hapten capable of inducing directed against the antigen or hapten in an organization previously immunized with said compound analogous immunological response compound. Les composés immunogènes, antigènes ou haptènes, pouvant être portés par ou dérivés des structures complexes telles que des bactéries, des levures, des particules virales, des parasites ou des champignons ou être associés à ou issus de cellules tumorales, telles que ci-après décrites. The immunogenic compounds, antigens or haptens, can be carried by or derived from complex structures such as bacteria, yeast, viral particles, parasites or fungi, or be associated with or derived from tumor cells, as described below .

Par « substance biologiquement active », on entend également désigner tout composé capable de modifier l'activité fonctionnelle des cellules CPA, en particulier leur croissance, leur différentiation ou leur système d'expression. By "biologically active substance" also meant any compound capable of altering the functional activity of CPA cells, especially their growth, differentiation or expression system. On peut citer comme exemple de telles substances biologiquement actives, mais sans s'y limiter, les facteurs de croissance cellulaire dont les cytokines (IL-4, IL-3, GM-CSF, TNF-alpha), les acides nucléiques codant pour des protéines d'intérêt homologues ou hétérologues et capables d'être exprimées par les cellules CPA. An example of such biologically active substances, including but not limited to, cell growth factors including cytokines (IL-4, IL-3, GM-CSF, TNF-alpha), nucleic acids encoding quote homologous or heterologous protein of interest and can be expressed by the CPA cells.

Au sens de la présente invention, le terme anticorps comprend les anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre le récepteur LOX. For the purposes of the present invention, the term antibody includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or fragments thereof, specifically directed against the receptor LOX. On utilisera préférentiellement des anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments qui sont utilisables chez l'homme, et notamment ceux humanisés. Is preferably used monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or fragments thereof that are used in humans, including those humanized.

Ainsi, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant du récepteur LOX. Thus, monoclonal antibodies, polyclonal or a fragment thereof, is capable of binding specifically to an epitope or determinant LOX receiver. Les déterminants epitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaînes latérales de sucres et ayant une structure tridimensionnelle spécifique et/ou une charge spécifique caractéristique. Epitopic determinants usually consist of groups of molecules of chemically active surfaces, such as amino acids or sugar side chains and have specific three-dimensional structure and / or specific charge characteristics.

Les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur un épitope du récepteur LOX sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. The monoclonal or polyclonal fragments of the invention comprise any fragment of said monoclonal antibody capable of binding to an epitope of the receptor LOX on which binds the monoclonal or polyclonal antibodies which said fragment is derived. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ils sont issus. Examples of such fragments include, in particular monoclonal antibodies or single chain monovalent Fab or Fab 'and bivalent fragments such as F (ab') 2, which have the same binding specificity as the monoclonal antibody or polyclonal they come from. Un fragment pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al. A fragment may also be a Fv fragment produced by methods known to one skilled in the art and as described for example by Skerra et al methods simple string. (Science, 240: 1038-1041 , 1988) et King et al. (Science, 240: 1038-1041, 1988) and King et al. (Biochemical J., 290:723-729, 1991). (Biochemical J. 290:723-729, 1991).

Des fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être obtenus à partir des anticoφs monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. Of monoclonal or polyclonal antibodies fragments can be obtained from anticoφs monoclonal or polyclonal antibodies as described by methods such as digestion by enzymes, such as pepsin or papain and / or cleavage of disulfide bonds by chemical reduction . Les fragments d'anticoφs monoclonaux ou polyclonaux, compris dans la présente invention, peuvent également être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al. Fragments anticoφs monoclonal or polyclonal antibodies, including in the present invention can also be synthesized by automated peptide synthesizers such as those provided by Applied Biosystems, etc.., Or can be prepared by hand using techniques known skilled in the art and as described for example by Geysen et al. (J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1978). (J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1978).

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux, polyclonaux ou de leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel "antibodies" (Harlow et al., antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor publications pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite parKohler et Milstein en 1975. In general, for the preparation of monoclonal antibodies, polyclonal antibodies or fragments thereof, reference may be made to the techniques that are described in particular in the "antibodies" manual (Harlow et al antibodies: a. Laboratory manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726, 1988) or the method of preparation from hybridomas described parKohler and Milstein in 1975.

L'invention comprend de préférence un complexe anticoφs selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticoφs, ou l'un de ses fragments, et ladite substance biologiquement active sont associés par liaison covalente ou par affinité. The invention preferably comprises a anticoφs complex according to the invention, characterized in that said anticoφs, or a fragment thereof, and said biologically active substance are associated by covalent or affinity. Les substances biologiquement actives, de préférence les immunogènes, seront couplés à l'anticoφs par liaison covalente (comme par exemple l'emploi des réactifs de couplage (tels que les bis(succinimidyl subérate) ou BS 3 , glutaraldéhyde, les réactifs en général homo- ou hétérobifonctionnels utilisés par l'homme de l'art pour le couplage de deux composés destinés à un usage thérapeutique, ...) ou encore par interaction non covalente de l'anticoφs couplé à la biotine avec l'antigène couplé à la streptavidine. On pourra également envisager un complexe anticorps obtenu par fusion génétique si l'immunogène est de nature peptidique, telle qu'une protéine de fusion du domaine Fab de l'anticoφs avec un antigène protéique recombînant. Dans tous les cas, il sera préféré une technique d'association qui n'affecte pas le site de fixation de l'anticorps. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit complexe anticorps comprend en outre un élément de liaison qui lie ledit anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX et ladite substance biologiquement active, de préférence un immunogène, antigène ou haptène. Biologically active substances, preferably immunogenic, to be coupled by covalent bond anticoφs (such as the use of coupling reagents (such as bis (succinimidyl suberate) or BS 3, glutaraldehyde, reagents generally homo - or heterobifunctional used by the skilled in the art for coupling two compounds for therapeutic use, ...) or by non-covalent interaction anticoφs biotin coupled with the antigen coupled to streptavidin . One may also consider an antibody produced by genetic fusion if the immunogen peptide nature, such as a fusion protein Fab domain of anticoφs with a recombinant protein antigen. In all cases, it will be a favorite Technical Association that does not affect the binding site of the antibody. In one embodiment of the invention, said antibody complex further comprises a connecting element linking said monoclonal antibody or a polyclonal their fragments capable of binding specifically to an epitope of a receptor LOX and said biologically active substance, preferably an immunogen, antigen or hapten.

Dans le cadre de la présente invention, l'élément de liaison est défini comme tout élément permettant de relier ledit anticoφs et ladite substance biologiquement active, de préférence un immunogène, antigène ou haptène. In the context of the present invention, the connecting element is defined as any member for connecting said anticoφs and said biologically active substance, preferably an immunogen, antigen or hapten.

L'élément de liaison est choisi préférentiellement parmi ceux permettant d'obtenir des complexes anticoφs présentant une activité biologique supérieure à celle du complexe anticoφs sans élément de liaison. The connecting element is preferably selected from those for obtaining anticoφs complex exhibiting a biological activity greater than that of the complex without anticoφs connecting element. Ce dernier est notamment choisi parmi : It is in particular chosen from:

- un peptide de liaison, - A peptide linker,

- un pont disulfure, et - A disulfide bridge, and

- un élément de liaison résultant de l'utilisation d'un agent chimique. - A connecting element resulting from the use of a chemical agent. Les agents chimiques sont notamment choisis parmi : - les agents dits "zero-length", c'est-à-dire sans bras de couplage, tels que les carbodiimides, Chemical agents are chosen from: - the so-called "zero-length" agents, that is to say, without coupling arm, such as carbodiimides,

- les agents homobifonctionnels, tels que les aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde), les hydrazides (carbohydrazide), les NHS esters (DSP, DSS, BS3) et les imidoesters (DMA, DMP, DMS), - les agents hétérobifonctionnels tels que les Amino- et thiol-réactifs (SPDP, - Homobifunctional agents, such as aldehydes (formaldehyde, glutaraldehyde), hydrazides (carbohydrazide) NHS esters (DSP, DSS, BS3) and imido (DMA, DMP, DMS) - the heterobifunctional agents such as Amino - and thiol-reactive (SPDP

SMPT, SMCC, MBS), les carbonyl- et thiol-réactifs (MPBH, M2C2H), et les photoactivables (NHS-ASA, SASD, HSAB, ABH). SMTP, SMCC, MBS), the carbonyl and thiol reagents (MPBH, M2C2H) and photoactivatable (NHS-ASA, SASD, HSAB, ABH).

Pour l'utilisation de ces réactifs chimiques ou pour d'autres éléments de liaison chimiques, on pourra se reporter à l'ouvrage "Bîoconjugate Techniques", Greg T. For the use of these chemical reagents or other elements of chemical bonding, we can refer to the book "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson Ed., 1996, Académie press, pages 169 à 286. Ed Hermanson, 1996 Academy Press, pp. 169-286.

Les réactifs chimiques permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité dudit anticorps et de ladite substance biologiquement active, de préférence un immunogène antigène ou haptène, choisi à coupler. Chemical reagents for this coupling will be determined by the end of said antibody and said biologically active substance, preferably an immunogenic hapten or antigen, selected to be coupled.

Parmi les complexes anticorps, on préfère ceux obtenus par voie recombinante. Among antibody complexes are preferred those obtained recombinantly. Ainsi, un mode de réalisation préféré de l'invention concerne ledit complexe anticorps selon l'invention, caractérisé en ce que l'élément de liaison est un peptide de liaison. Thus, a preferred embodiment the invention relates to said antibody complex according to the invention, characterized in that the connecting element is a connecting peptide. Les procédés de synthèse de telles protéines de fusion englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. The methods of synthesis of such fusion proteins include the methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the polypeptide sequences sought. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par DN Goeddel (Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990). We can, for example, advantageously refer to the technique of obtaining genes encoding fusion proteins described by Goeddel DN (Methods in Enzymology, Vol. 185, 3-187, 1990).

Le peptide de liaison est notamment un peptide de 1 à 50 acides aminés et préférentiellement de 10 à 30 et plus préférentiellement de 15 à 25 acides aminés. The linker peptide is a peptide including from 1 to 50 amino acids and preferably from 10 to 30 and more preferably from 15 to 25 amino acids.

Il est préférentiellement choisi parmi un peptide de séquence (Gly-Gly-Gly-Gly- Ser)n, (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly)n, (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly)n ou (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly)n dans laquelle n désigne un nombre entier, préférentiellement de 1 à 10 et plus préférentiellement de 2 à 4. It is preferably selected from a peptide of sequence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n, (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly) n and (Gly -Gly-Gly-Ser-Gly) n wherein n is an integer, preferably from 1 to 10 and more preferably from 2 to 4.

Il est plus préférentiellement choisi parmi un peptide de séquence (Gly-Gly-Gly- Gly-Ser)n, dans laquelle n désigne un nombre entier, préférentiellement de 1 à 10 et plus préférentiellement de 2 à 4. It is more preferably selected from a peptide of sequence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n, wherein n is an integer, preferably from 1 to 10 and more preferably from 2 to 4. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide de liaison correspond à toute ou à une partie d'une région charnière d'une immunoglobuline. In another embodiment of the invention, the binding peptide corresponds to all or a portion of an immunoglobulin hinge region. Cette région charnière, aussi appelée région hinge, est la région d'une immunoglobuline qui lie les unités Fab (constituée de la chaîne L entière et de la moitié Ν-terminale de la chaîne H) au fragment Fc (constitué des moitiés C-terminales des chaînes H). This hinge region, also called hinge region is the region of an immunoglobulin which binds Fab units (comprising the entire L chain and Ν-terminal half of the H chain) and Fc (C-terminal halves of the fragment consisting H chains). Une séquence hinge préférée est la séquence Ala-Glu. A hinge favorite sequence is the sequence Ala-Glu.

Le peptide de liaison correspond dans un autre mode de réalisation de l'invention à un leucine zipper. Binding peptide corresponding to another embodiment of the invention to a leucine zipper. Les leucines zipper correspondent à des domaines responsables de la dimέrisation de protéines et notamment de protéines se liant à l'ADΝ. Corresponding to the leucine zipper domains responsible dimέrisation protein including proteins which bind to the ADΝ. Ils sont constitués de deux séquences de 7 acides aminés comprenant 4 ou 5 leucines. They consist of two sequences of seven amino acids with 4 or 5 leucine. Ces deux séquences permettent ensuite un appariement des deux protéines sur lesquelles elles sont présentes. These two sequences are then used a pairing of the two proteins to which they are present. On pourra se reporter au brevet US 5,837,816 et plus particulièrement aux leucines zipper artificiels décrits dans ce document, utilisables dans la présente invention. Reference may be made to U.S. Patent 5,837,816 and more particularly artificial leucine zipper described in this document, used in the present invention.

Lesdîts complexes anticorps comprenant un élément de liaison peptidique peuvent être obtenus sous forme de protéines recombinantes, glycosylées ou non, par les techniques standards de recombinaison génétique en utilisant des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par des vecteurs plasmidiques ou viraux contenant des acides nucléiques codant pour lesdites protéines et peptide de liaison. Such antibody complexes comprising a peptide bond can be obtained as recombinant proteins, glycosylated or not, by standard recombinant DNA techniques using prokaryotic or eukaryotic cells transformed with plasmid or viral vectors containing nucleic acids encoding said protein and peptide binding.

L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement au moins une nouvelle molécule susceptible d'être identifiée par le procédé d'identification selon l'invention. The invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, in a pharmaceutically acceptable medium, at least one molecule binds to a receptor LOX, and preferably at least one new molecule may be identified by the process of Identification of the invention.

De préférence, ces molécules utilisées dans une composition pharmaceutique sont différentes des HSP et des dérivés d'acides désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucléiques non naturels tels que l'inositine. Preferably, these molecules used in a pharmaceutical composition are different and HSP derivatives tetrameric deoxyribonucleotide polyinosines acids such as, and non-natural nucleic acids such as inositine. L'invention a ainsi aussi pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines. The invention therefore also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, in a pharmaceutically acceptable medium, at least modified LDL, oxidized or acetylated, apolipoproteins. telles que les Apo B, et/ou du fucoidan. such as Apo B and / or fucoidan.

L'invention a également pour objet cette composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre un immunogène, un antigène ou haptène. The invention also relates to the composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition further comprises an immunogen, antigen or hapten.

L'invention concerne encore une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un complexe anticoφs tel que défini ci-dessus. The invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, in a pharmaceutically acceptable medium, at least one anticoφs complex as defined above. De préférence, dans les compositions selon l'invention, ledit immunogène, antigène ou haptène, est choisi parmi toute substance chimique en général, notamment parmi les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les poly- ou oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides, de manière préférée ledit antigène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'une levure, d'un parasite ou d'un champignon. Preferably, in the compositions according to the invention, the immunogenic antigen or hapten is selected from all chemicals in general, especially among peptides, glycopeptides, lipopeptides, poly-or oligosaccharides, nucleic acids and lipids , preferably said antigen or hapten derived from a virus, a bacterium, a yeast, a parasite or fungus. De manière encore plus préférée, ledit immunogène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le VRS, le para influenza virus (P1V), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les mέningocoques. Even more preferably, said immunogen comprises at least one peptide derived from micro-organisms responsible for diseases of the airways selected from RSV, parainfluenza virus (P1V), influenza virus, hantavirus, streptococci, pneumococci , Haemophilus influenza type b, rhinoviruses, and mέningocoques coronovirus. De manière également encore plus préférée, ledit immunogène, antigène ou haptène, peut être associé à ou spécifique d'une cellule tumorale. Also more preferably, said immunogen, antigen or hapten, or may be associated with specific tumor cell. Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : Among the cancers whose tumors express a tumor-associated antigen that can be prevented or treated by the use of the present invention include in particular, but without limitation:

• le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., Cancer Res., 59:431 -5, 1999) ; • cancer of the breast, lung, colon, and gastric carcinoma (Kawashima et al, Cancer Res 59:431 -5, 1999..)

• le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., J. Natl. Cancer. Inst., 91 : 169-75, 1999) ; • mesothelioma, osteosarcoma, brain cancers (Xie et al, J. Natl Cancer Inst, 91.... 169-75, 1999);

• le mélanome (Zheuten et al., Bratilsl. Lek. Listy, 99:426-34, 1998) ; • melanoma (Zheuten et al Bratilsl Lek Listy, 99:426-34, 1998...)

• l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 10:345-8, 1998) ; • cystic adenoma of the pancreas (Hammel et al, Eur J Gastroenterol Hepatol, 10:345-8, 1998....)

• le cancer colorectal (Ogura et al., Anticancer Res., 18:3669-75, 1998) ; • Colorectal cancer (Ogura et al, Anticancer Res, 18:3669-75, 1998..)

• le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., Cancer Res., 58:3078-86, 1998); et • renal cell carcinoma (Jantzer et al, Cancer Res, 58:3078-86, 1998..) And

• le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., Cancer., 77: 1501-9, 1996). • cancer of the ovary and cervix (Sonoda et al, Cancer, 77:.. 1501-9, 1996).

Ainsi, l'antigène pourra notamment être choisi parmi les épitopes CTL tumoraux. Thus, the antigen may be chosen from the tumor CTL epitopes. Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. The compositions according to the invention may also contain an adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG, la Leif, la CT (toxoïde du choléra), la LT (Heat labile enterotoxine) et les versions détoxifiées de la CT ou la LT. The latter can be chosen from the MPL-A, Quil-A, ISCOM, the dimethyl dioctadecyl ammonium bromide form (DDAB) or chloride (DDAC), CpG, Leif, CT (toxoid cholera), LT (heat labile enterotoxin) and detoxified versions of CT or LT. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que la molécule se liant au récepteur LOX, et notamment aucun autre adjuvant permettant d'induire ou d'augmenter l'immunogénicité ou une réponse CTL. In a preferred embodiment of the invention, the pharmaceutical composition of the invention does not contain an adjuvant other than the molecule binds to receptor LOX, including any other adjuvant to induce or increase the immunogenicity or a CTL response.

Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. For the purposes of the present invention, the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably an injectable medium humans. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol. It may consist of water, of a saline aqueous solution or of an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.

L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une tonne permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, miciosphères ou miciocapsules. The invention also comprises a composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed under a ton to improve its stability and / or immunogenicity, so it can be conveyed in the form of liposomes, virosomes, nanospheres , miciosphères or miciocapsules. L'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre du procédé d'identification selon l'invention ou d'un anticoφs monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope d'un récepteur LOX, comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin constitue un autre objet de l'invention. The use of a molecule binds to a receptor LOX, and preferably a new molecule may be obtained by the implementation of the identification process according to the invention or a anticoφs monoclonal or polyclonal a fragment thereof capable of binding specifically to an epitope of a receptor LOX, as the carrier and / or adjuvant in a vaccine is another object of the invention.

L'invention comprend également l'utilisation d'un complexe anticoφs selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin, de préférence, ledit antigène ou haptène dudit complexe anticoφs se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est internalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes. The invention also comprises the use of a anticoφs complex of the invention for the preparation of a vaccine, preferably, said antigen or hapten anticoφs said complex binds to a receptor LOX antigen presenting cells and internalized into said antigen presenting cells. De préférence, ces molécules utilisées comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin sont différentes des HSP, des dérivés d'acides désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et des acides nucléiques non naturels tels que l'inositine. Preferably, these molecules used as a carrier and / or adjuvant in a vaccine are different from HSP, deoxyribonucleotide derivatives tetrameric polyinosines acids such as, and non-natural nucleic acids such as inositine.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, ou d'un complexe anticoφs selon l'invention pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. The invention further relates to the use of a molecule binds to a receptor LOX, and preferably a new molecule may be obtained by the implementation of the method according to the invention or a complex anticoφs according to the invention for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, fungal or parasitic infections or for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers sont différentes des HSP et des dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucéliques non naturels tels que l'inositine. Preferably, these molecules used for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, parasitic or fungal or for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of cancer are different from and HSP tetrameric deoxyribonucleotide acid derivatives such as polyinosines, and unnatural acids such as nucéliques inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéînes, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers. The invention also relates to the use of modified LDL, or oxidized to acetyl, apolipoproteins such as Apo B, and / or fucoidan for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial , parasitic or fungal or for the preparation of a vaccine for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, ou d'un complexe anticorps selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. The invention also relates to the use of a molecule binds to a receptor LOX, and preferably a new molecule may be obtained by the implementation of the method according to the invention, or antibody complex according to the invention for preparing a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against an infectious agent or a tumor cell. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP et des dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et les acides nucéliques non naturels tels que l'inositine. Preferably, these molecules used for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against an infectious agent or a tumor cell and are different HSP derivatives such as tetrameric polyinosines of deoxyribonucleotide acid, and acid unnatural nucéliques such as inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou cétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. The invention also relates to the use of modified LDL, or oxidized to ketyl, apolipoproteins such as Apo B, and / or fucoidan for the preparation of a pharmaceutical composition for generating or enhancing an immune response against a infectious agent or a tumor cell. La présente invention est aussi relative à l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre d'un procédé d'identification selon l'invention, ou d'un complexe anticoφs selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. The present invention also relates to the use of a molecule binding to a receptor LOX, and preferably a new molecule which can be obtained by the implementation of a method of identification according to the invention, anticoφs or a complex of the invention for preparing a pharmaceutical composition intended to generate or enhance a T cytotoxic response against an infectious agent or a tumor cell. On pourra utiliser de telles compositions en thérapie ex vivo ou in vivo. We may use such compositions ex vivo or in vivo therapy. De préférence, ces molécules utilisées pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale sont différentes des HSP, des dérivés d'acide désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et des acides nucéliques non naturels tels que l'inositine. Preferably, these molecules used for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or enhance a T cytotoxic response against an infectious agent or a tumor cell are different from HSP, deoxyribonucleotide acid derivatives such as tetrameric polyinosines and unnatural nucéliques acids such as inositine.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. The invention also relates to the use of modified LDL, or oxidized to acetyl, apolipoproteins such as Apo B, and / or fucoidan for the preparation of a pharmaceutical composition for generating or increasing a cytotoxic T response against an infectious agent or a tumor cell. L'invention concerne encore l'utilisation d'un complexe antîcoφs selon l'invention pour le ciblage spécifique des cellules présentatrices d'antigènes, de préférence vers une cellule présentatrice d'antigène exprimant le récepteur LOX. The invention further relates to the use of a antîcoφs complex according to the invention for the specific targeting of antigen-presenting cells, preferably to an antigen-presenting cell expressing the receptor LOX.

L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre du procédé d'identification selon l'invention, ou d'un complexe anticoφs selon l'invention pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associée vers les cellules présentatrices d'antigènes, de préférence vers une cellule présentatrice d'antigène. The invention further relates to the use of a molecule binds to a receptor LOX, and preferably a new molecule may be obtained by the implementation of the identification process according to the invention, or anticoφs complex according to the invention for the specific targeting of a biologically active substance associated therewith to the antigen presenting cells, preferably to an antigen presenting cell. De préférence, lesdites cellules présentatrices d'antigènes sont choisies parmi les cellules dendritiques, les macrophages, les lymphocytes B ou les monocytes, et préférentiellement parmi les cellules dendritiques immatures. Preferably said antigen presenting cells are chosen from dendritic cells, macrophages, monocytes or B, and preferentially from among immature DC cell.

De préférence, ladite substance biologiquement active est un antigène ou haptène ou un facteur de croissance tel que ci-avant décrit. Preferably, said biologically active substance is an antigen or hapten or growth factor as described above. L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule ou d'un anticoφs, ou l'un de ses fragments, ou un complexe anticoφs selon l'invention, caractérisé en ce que ladite molécule, ledit anticoφs ou fragment, ou ledit complexe anticoφs se lie à un récepteur LOX de cellules présentatrices d'antigènes et est internalisé dans lesdites cellules présentatrices d'antigènes, de préférence dans les cellules dendritiques immatures. The invention further relates to the use of a molecule or a anticoφs, or a fragment thereof, or a complex of the invention anticoφs, characterized in that said molecule or said fragment anticoφs or said complex anticoφs binds to a receptor LOX antigen presenting cells and is internalized into said antigen presenting cells, preferably into immature dendritic cells.

De préférence, ces molécules utilisées pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associé vers les cellules présentatrices d'antigènes sont différentes des HSP, des dérivés d'acides désoxyribonucléotidiques tétramériques tels que les polyinosines, et des acides nucléiques non naturels tels que l'inositine. Preferably, these molecules used for the specific targeting of a biologically active substance associated therewith to the antigen presenting cells are different from HSP, acid derivatives such as deoxyribonucleotide tetrameric polyinosines and non natural nucleic acids such as inositine. L'invention a aussi pour objet l'utilisation des LDL modifiés, oxydés ou acétylés, des apolipoprotéines, telles que les Apo B, et/ou du fucoidan pour le ciblage spécifique d'une substance biologiquement active qui lui est associé vers les cellules présentatrices d'antigènes. The invention also relates to the use of modified LDL, or oxidized to acetyl, apolipoproteins such as Apo B, and / or fucoidan for the specific targeting of a biologically active substance which is associated to the presenting cells antigen.

Il a également été constaté que l'expression de LOX-1 était augmentée dans les plaques d'athérome humaines (Kataoka, et al., 1999), suggérant ainsi que le dysfonctionnement de l'expression de LOX- 1 pourrait être associé avec le développement de l'athérogénèse (Kita, et al., 2000). It was also found that the expression of LOX-1 was increased in the human atherosclerotic plaques (Kataoka et al., 1999), suggesting that the dysfunction of the expression of LOX-1 could be associated with the development of atherogenesis (Kita et al., 2000). De plus, une augmentation de l'expression/localisation des HSP et particulièrement des HSP70 (Berberian, et al., 1990), a été signalée dans les plaques d'athérome humaines. In addition, an increased expression / localization of HSP, especially HSP70 (Berberian et al., 1990), has been reported in the human atherosclerotic plaques. On peut citer à ce sujet les références suivantes : Kita, T., et al., Ann. Mention may be made about the following references: Kita, T., et al, Ann.. NY Acad. NY Acad. Sci., 902, 95-100, 2000 ; Kataoka, H., et al., Circulation, 99, 31 10-31 17, 1999 et Berberian, PA, et al., Am. J. Sci, 902, 95-100, 2000. Kataoka, H., et al, Circulation, 99, 31, 17, 10-31, 1999 and Berberian, PA, et al, J. Am.. Pathol., 136, 71-80, 1990. Pathol., 136, 71-80, 1990.

La demande WO 00/20019 décrit une composition pour la prévention et/ou le traitement de l'athérosclérose, comprenant un composé actif choisi parmi les LDL oxydés ou modifiés, les lipoprotéines, les HSP 60/65 et la béta2-glycoprotéine- 1. WO 00/20019 discloses a composition for the prevention and / or treatment of atherosclerosis comprising an active compound selected from oxidized LDL or modified lipoproteins, HSP 60/65 and the beta2-glycoprotein-1. La demande WO 99/32520 quant à elle décrit un polypeptide fusionné composé d'une région extracellulaire d'un récepteur des LDL oxydés et d'une partie d'une chaîne lourde d'une immunoglobuline, polypeptide pouvant être utilisé pour le traitement de l'artériosclérose. WO 99/32520 in turn discloses a fused polypeptide composed of an extracellular region of an oxidized LDL receptor and a part of a heavy chain of an immunoglobulin polypeptide can be used for the treatment of arteriosclerosis.

L'invention a ainsi encore pour objet l'utilisation d'un complexe anticoφs selon l'invention ou d'une molécule se liant à un récepteur LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention, à l'exception des HSP 60/65, pour la préparation d'une composition phaπnaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de l'artériosclérose. The invention therefore also relates to the use of a anticoφs complex according to the invention or a molecule binds to a receptor LOX, and preferably a new molecule may be obtained by the implementation of the method according to the invention, with the exception of HSP 60/65, for the preparation of a phaπnaceutique composition for the prophylactic or therapeutic treatment of arteriosclerosis. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une molécule se liant à un récepteur The invention also relates to the use of a molecule that binds to a receptor

LOX, et préférentiellement d'une nouvelle molécule susceptible d'être obtenue par la mise en œuvre de la méthode selon l'invention ou d'un complexe anticoφs selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique de maladies liées au dysfonctionnement des récepteurs LOX ou au dysfonctionnement des ligands de ces récepteurs et plus particulièrement des HSP. LOX, and preferably a new molecule which can be obtained by the implementation of the method according to the invention or a anticoφs complex according to the invention for preparing a pharmaceutical composition for the prophylactic or therapeutic treatment -related dysfunction of the receptor LOX dysfunction or ligands of these receptors and especially diseases of HSP.

Enfin, la présente invention a pour objet l'ensemble des utilisations si avant décrites selon l'invention, caractérisées en ce que ladite molécule capable de se fixer ou de se lier spécifiquement sur ledit récepteur LOX, de préférence le récepteur LOX- 1 , notamment d'origine humaine, et, le cas échéant, capable d'être internalisée après ladite fixation dans une cellule présentatrice d'antigène exprimant ledit récepteur LOX, est sélectionnée, et, le cas échéant, identifiée par un procédé d'identification selon l'invention. Finally, the present invention uses if all before described the invention, characterized in that said molecule capable of binding or specifically binding to said receptor LOX, preferably LOX-1 receptor, including of human origin and, where appropriate, capable of being internalized after binding to a said antigen presenting cell expressing said receptor LOX, is selected, and, where appropriate, identified by an identification process of the invention.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Figure legends and examples that follow are intended to illustrate the invention without limiting its scope.

Figures 1A et 1B. Figures 1A and 1B. HSP70 se lie à un récepteur scavenger HSP70 binds to a scavenger receptor

Figure 1A. Figure 1A. HSP70 se lie aux cellules dendritiques humaines immatures. HSP70 binds to immature human dendritic cells. Les cellules dendritiques humaines immatures sont incubées pendant 20 minutes à 4°C avec 20 μg/ml de HSP70 marquée à la biotine. Immature human dendritic cells were incubated for 20 min at 4 ° C with 20 g / ml of HSP70 labeled with biotin. Après lavage, les cellules sont incubées avec de la streptavidine marquée par du FITC (Isothiocyanate de fluorrescéïne). After washing, cells were incubated with FITC-labeled streptavidin (isothiocyanate fluorrescéïne).

Figure 1 B. Figure 1 B. La liaison des HSP70 aux cellules dendritiques immatures est inhibée par la BSA maléylέe. The binding of HSP70 to immature dendritic cells is inhibited by maléylέe BSA. Les cellules dendritiques immatures sont incubées pendant 20 minutes à 4°C avec 20 μg/ml de BSA maléylée ou de BSA (sérum albumine bovine). Immature dendritic cells were incubated for 20 min at 4 ° C with 20 mg / ml BSA maléylée or BSA (bovine serum albumin). Après lavage, les cellules sont incubées avec 2 μg/ml de HSP70 marquée à la biotine et révélée avec de la streptavidine marquée par du FITC. After washing, the cells were incubated with 2 mg / ml of HSP70 labeled with biotin and revealed with FITC-labeled streptavidin.

La fluorescence a été analysée par un cytofluoromètre FACScan. The fluorescence was analyzed by FACScan cytofluorometer. Figures 2A à 2E. 2A to 2E. Les HSP70 se lient au scavenger récepteur LOX-1 HSP70 bind to the scavenger receptor LOX-1

Les cellules CHO ont été transfectées avec le vecteur pEBS contenant l'ADNc codant pour les scavenger récepteurs LOX- 1 (figure 2 A), SR-Al (figure 2B), CD36 (figure 2C), SR-C l (figure 2D) et MARCO (figure 2E). CHO cells were transfected with the PEBS vector containing the cDNA encoding the scavenger receptor LOX-1 (Fig. 2 A), SR-Al (Fig. 2B), CD36 (Fig. 2C), the SR-C (Figure 2D) and MARCO (Figure 2E). Les cellules CHO ont été incubées pendant 20 minutes à 4°C avec 20 μg/ml de HSP70 marquée à la biotine avant incubation avec de la streptavidine marquée par du FITC. CHO cells were incubated for 20 min at 4 ° C with 20 g / ml of HSP70 labeled with biotin before incubation with FITC-labeled streptavidin. La fluorescence a été analysée par un cytofluoromètre FACScan. The fluorescence was analyzed by FACScan cytofluorometer. Figures 3A et 3B. Figures 3A and 3B. LOX-1 est un récepteur des HSP70 sur les cellules dendritiques Figure 3A. LOX-1 is a receptor on dendritic cells HSP70 Figure 3A. L'ARNm de LOX- 1 est exprimé par les APCs humaines. The LOX-1 mRNA is expressed by human APCs. L'expression de LOX- 1 a été analysée par RT-PCR dans des lymphocytes humains B ( 1), des monocytes (2), des macrophages (3), des cellules dendritiques immatures (4), des lymphocytes T (5) et des cellules endothéliales (6). The LOX-1 expression was analyzed by RT-PCR from human B cells (1), monocyte (2), macrophages (3), immature dendritic cells (4), T cells (5) and endothelial cells (6). Les segments amplifiés ont été séparés en fonction de leur taille sur un gel d'agarose à 1 % et visualisés par coloratin au bromure d'éthidium. The amplified segments were separated according to size on a 1% agarose gel and visualized by ethidium bromide coloratin. L'intégrité des ARN et des ADNc synthétisés a été vérifiée en amplifiant l'ADNc GAPDH. The integrity of RNA and cDNA synthesized was verified by amplifying GAPDH cDNA. Figure 3B. Figure 3B. Les structures liant les HSP70 sont diminuées quand les DC (cellules dendritiques) sont activées. Structures linking HSP70 are reduced when DC (dendritic cells) are activated. La liaison des HSP70 a été évaluée par FACS sur les cellules dendritiques immatures non stimulées ou activées avec 1 μg/ml LPS ou 20 ng/ml TNF . The binding of HSP70 was assessed by FACS on immature dendritic cells unstimulated or activated with 1 g / ml LPS or 20 ng / ml TNF. La fluorescence a été analysée par un cytofluoromètre FACScan. The fluorescence was analyzed by FACScan cytofluorometer. Figure 4. Figure 4. LOX-l-Fc inhibe la présentation dans le CMH de classe I de l'ovalbu ine associée à HSP70. LOX-l-Fc inhibits the presentation in the MHC class I ovalbu ine associated with HSP70.

L'ovalbumine (Ova) a été traitée ou non avec BS (Ova-BS ) ou couplée à HSP70 (HSP70-Ova). The ovalbumin (Ova) was treated or not with BS (BS-Ova) or coupled to HSP70 (HSP70-Ova). Les cellules dendritiques immatures ont été puisées pendant 8 h avec Ova, Ova-BS . Immature dendritic cells were pulsed for 8 h with Ova, Ova-BS. ou HSP70-Ova avant leur mise en culture avec 5 x 10 cellules T d'hybridome B3Z. or HSP70-Ova before cultivation with 5 x 10 T cell hybridoma B3Z. Dans certaines expériences, les cellules dendritiques ont été incubées avec de l'Ova-HSP70 en présence de 10 mg/ml de LOX-l-Fc ou de CD86-Fc. In some experiments, dendritic cells were incubated with Ova-HSP70 in the presence of 10 mg / ml LOX-l-Fc or CD86-Fc. La production d'IL-2 a été mesurée par ELISA. The production of IL-2 was measured by ELISA. Les résultats sont exprimés en pg/ml (moyenne ± sd, n=3). The results are expressed in pg / ml (mean ± sd, n = 3).

Exemple I : Matériel et méthodes Purification des cellules Example I: Materials and methods Purification of cells

Des cellules dendritiques humaines immatures et des macrophages ont été générés in vitro, de façon connue de l'homme du métier. Immature human dendritic cells and macrophages were generated in vitro, known to the skilled way. Des monocytes humains ont été isolés à partir de PBMC (peripheral blood mononuclear cells) en utilisant un anticoφs monoclonal anti-CD14 mAb marqué avec des billes magnétiques (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Germany). Human monocytes were isolated from PBMC (peripheral blood mononuclear cells) anticoφs using a monoclonal anti-CD14 mAb labeled with magnetic beads (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). La pureté déteπninée par analyse FACS a été supérieure à 98 %. Déteπninée purity by FACS analysis was greater than 98%. Les monocytes humains ainsi purifiés ont été mis en culture pendant 5 jours avec 20 ng/ml d'IL-4 plus 20 ng/ml de GM-CSF (R&D Systems, Abîngdon, UK) de manière à générer des cellules dendritiques immatures DC ou avec 20 ng/ml de GM-CSF pour générer des macrophages. Human monocytes and purified were cultured for 5 days with 20 ng / ml IL-4 plus 20 ng / ml GM-CSF (R & D Systems, Abingdon, UK) to generate immature dendritic cells or DC with 20 ng / ml GM-CSF for generating macrophages. Les cellules dendritiques humaines ont été caractérisées par l'expression de CD la et l'absence de CD83. Human dendritic cells were characterized by expression of the CD and the absence of CD83. Les cellules dendritiques matures ont été générées par une nouvelle culture des cellules dendritiques immatures avec de l'IL-4 et du GM-CSF et 10 ng/ml de LPS (de Escherichia coli isotype Ol ll :B4) (Sigma, St Louis, MO). Mature dendritic cells were generated by a new culture of immature dendritic cells with IL-4 and GM-CSF and 10 ng / ml LPS (Escherichia coli isotype Ol ll: B4) (Sigma, St Louis, MO). Seules les populations de cellules caractérisées par une expression homogène de CD83 ont été utilisées comme cellules dendritiques matures. Only populations characterized by a homogeneous expression of CD83 cells were used as mature dendritic cells. Les cellules T ont été isolées par rosetting avec des érythrocytes de mouton. T cells were isolated by rosetting with sheep erythrocytes. Après la lyse des erythrocytes, la pureté déterminée a été supérieure à 95 %. After lysis of erythrocytes, determined the purity was greater than 95%. Production et purification de LOX-l-Fc Production and purification of LOX-l-Fc

L'ADNc de la séquence codante pour LOX-1 humain (accession number #AB010710 dans la banque GenBank ; Sawamura, et al., 1997) correspondant au domaine 71-273 de la protéine a été inséré dans le vecteur d'expression Signal plg-Tail The cDNA sequence coding for human LOX-1 (accession number AB010710 in GenBank # bank. Sawamura et al, 1997) corresponding to the 71-273 domain of the protein was inserted into the expression vector Signal plg Tail-

(R&D Systems, Abingdon, UK) avec la séquence Fcγl humaine. (R & D Systems, Abingdon, UK) with human Fcγl sequence. La protéine chimère a été produite dans les cellules CHO en culture dans le milieu « Optimem médium » (Life technologies, Cergy Pontoise, France) et purifié en utilisant la protéine A immobilisée sur de l'agarose (Pierce, Rockford, IL). The chimeric protein was produced in CHO cells cultured in the middle "Optimem medium" (Life Technologies, Cergy Pontoise, France) and purified using protein A immobilized on agarose (Pierce, Rockford, IL).

Expériences de fixation Binding experiments

La HSP 70 recombinante (StressGen Biotechnologies Coφ, Victoria BC, The recombinant HSP 70 (StressGen Biotechnologies Coφ, Victoria BC,

Canada) a été biotinylée en utilisant un kit commercial (Pierce). Canada) was biotinylated using a commercial kit (Pierce). La HSP70 marquée à la biotine a été incubée à 4°C pendant 30 minutes dans un tampon pour FACS (PBS contenant 0, 1 % BSA et 0,05 % NaN 3 ). HSP70 labeled biotin was incubated at 4 ° C for 30 minutes in FACS buffer (PBS containing 0, 1% BSA and 0.05% NaN 3). Après lavage dans le tampon FACS, les cellules ont été incubées avec de la streptavidine marquée au FITC (Molecular Probes, Eugène, After washing in FACS buffer, cells were incubated with FITC-labeled streptavidin (Molecular Probes, Eugene,

OR) pendant 20 min à 4°C avant le lavage avec le tampon FACS. OR) for 20 min at 4 ° C before washing with the FACS buffer. La fluorescence a été analysée par FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). The fluorescence was analyzed by FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Dans certaines expériences, les cellules ont été préincubées avec de la HSP70 non marquée, de la BSA, de la BSA maléylée (mBSA), de l'acide polyinosinique (poly[FJ). In some experiments, cells were preincubated with HSP70 unlabeled BSA, the maléylée BSA (mBSA), the polyinosinic acid (poly [FJ). de l'acide polyadénosique the acid polyadénosique

(poly[A]) (Sigma), des Ac-LDL (Biogenesis, Poole, UK), du LOX-l -Fc ou CD86-Fc pendant 20 min à 4°C avant incubation avec de la HSP70 marquée à la biotine. (Poly [A]) (Sigma), the Ac-LDL (Biogenesis, Poole, UK), LOX-l-Fc or CD86-Fc for 20 min at 4 ° C before incubation with biotin-labeled HSP70.

Analyse de l'expression de l'A Nm de LOX-1 par RT-PCR Analysis of the expression of LOX-A Nm 1 by RT-PCR

L'expression de l'ARNm codant pour LOX-1 dans les APCs professionnelles comparée avec les cellules endothéliales a été évaluée par RT-PCR. The expression of mRNA encoding LOX-1 in professional APCs compared with endothelial cells was evaluated by RT-PCR. Les cellules ont été resuspendues dans 1 ml de réactif Trizol (Life technologies). The cells were resuspended in 1 ml of Trizol reagent (Life Technologies). Après extraction au chloroforme, l'ARN total a été précipité avec l'alcool d'isopropyl. After extraction with chloroform, total RNA was precipitated with isopropyl alcohol. L'ADNc simple brin a été synthétisé en utilisant 2 μg de l'ARN total par transcription inverse en utilisant des amorces oligo-dT et la reverse transcriptase (Promega, Madison, WI). The single-stranded cDNA was synthesized using 2 mg of total RNA by reverse transcription using oligo-dT primers and reverse transcriptase (Promega, Madison, WI). L'amplification par PCR a été effectuée avec une quantité d'ADNc correspondant à 25 ng de l'ARN total (2 minutes à 94°C suivi par 30 cycles (30 secondes à 94°C, 1 minute à 60°C et 1 minute à 72°C) suivi d'une extension finale de 4 minutes à 72°C) en utilisant des oligonucléotides spécifiques. PCR amplification was performed with an amount of cDNA corresponding to 25 ng of total RNA (2 minutes at 94 ° C followed by 30 cycles (30 seconds at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C and 1 minute at 72 ° C) followed by a final extension of 4 minutes at 72 ° C) using specific oligonucleotides. L'intégrité de l'ARN a été estimée en amplifiant l'ADNc GAPDH. The integrity of the RNA was estimated by amplifying GAPDH cDNA. Les produits de la PCR ont été analysés sur un gel à 1 % d'agarose par electrophorèse en présence de bromure d'éthidium. The PCR products were analyzed on a 1% gel agarose electrophoresis in the presence of ethidium bromide. Les transfectants Transfectants

L'ADNc codant pour les récepteurs scavenger SR-A1, CD36, SR-Cl, MARCO et LOX-1 a été clone dans le vecteur d'expression pEBS/PL. The cDNA encoding the scavenger receptor SR-A1, CD36, SR-Cl, MARCO and LOX-1 was cloned into the PEBS / PL expression vector. Les cellules CHO (ATCC, Manassas, VA) ont été transfectées en utilisant le réactif Effecten (Qiagen, Courtaboeuf, France) et mis en culture dans un milieu DMEM supplémenté de 10 % de FCS et sélectionnées à l'aide d'hygromycine (Life technologies). CHO cells (ATCC, Manassas, VA) were transfected using the reagent Effecten (Qiagen, Courtaboeuf, France) and cultured in DMEM supplemented with 10% FCS and selected with hygromycin (Life technologies).

Activation de l'hybridome T B3Z spécifique de l'ovalbumine (Ova) Activation of specific T hybridoma B3Z of ovalbumin (Ova)

Les cellules T hybridome B3Z sont spécifiquement activées par le peptide dérivé d'Ova SIINFEKL présenté par H-2K b . B3Z hybridoma T cells are specifically activated by the peptide derived from Ova SIINFEKL presented by H-2K b. Les cellules dendritiques de souris ont été générées par culture de cellules de moelle de souris C57BL/6 (H-2 b ) dans le milieu RPMI contenant 10 % de FCS et des antibiotiques (Life technologies) et 3 ng/ml de GM-CSF (R&D Systems). The mouse dendritic cells were generated by culturing bone marrow cells from C57BL / 6 (H-2 b) in RPMI medium containing 10% FCS and antibiotics (Life Technologies) and 3 ng / ml GM-CSF (R & D Systems). L'Ovalbumin (Ova) (Sigma) a été couplée à 1ΗSP70 (Ova- HSP70) en utilisant du bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) à 0.25 mM tel que décrit par le fabricant (Pierce). The Ovalbumin (Ova) (Sigma) was coupled to 1ΗSP70 (Ova-HSP70) using bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3) to 0.25 mM as described by the manufacturer (Pierce). Comme contrôle, l'Ova a été traitée par BS 3 (Ova-BS 3 ). As a control, the Ova was treated with BS 3 (Ova-BS 3). Les protéines et les conjugués ont été mesurés avec le kit BCA (Pierce). Proteins and conjugates were measured with the BCA kit (Pierce). Les cellules dendritiques immatures (caractérisées par des niveaux intermédiaires d'IA b ) ont été puisées pendant 8 h avec de 1ΗSP70, Ova, Ova-BS 3 ou Ova-HSP70. Immature dendritic cells (characterized by intermediate levels of IA b) were pulsed for 8 h with 1ΗSP70, Ova, Ova-BS 3 or Ova-HSP70. Après plusieurs lavages, 5x10 5 cellules dendritiques puisées sont mis en culture avec 5xl0 5 cellules T hybridome B3Z T. After several washes, 5x10 5 pulsed dendritic cells were cultured with 5 5xl0 T. T cell hybridoma B3Z Dans certaines expériences, les cellules dendritiques ont été incubées avec Ova-HSP70 en présence de 10 μg/ml de LOX- l-Fc, 100 μg/ml d'Ac-LDL ou 10 μg/ml de CD86-Fc. In some experiments, dendritic cells were incubated with Ova-HSP70 in the presence of 10 ug / ml LOX-l-Fc, 100 micrograms / ml Ac-LDL or 10 ug / ml CD86-Fc. La production d'IL-2 a été mesurée par ELISA (Endogen, Woburn, MA) dans les surnageants de 16 h. The production of IL-2 was measured by ELISA (Endogen, Woburn, MA) in the supernatants of 16 h.

Exemple II : La liaison de PHSP70 sur des cellules présentatrices d'antigène humaine est inhibée par la BSA maléylée Example II: The link PHSP70 on human antigen-presenting cells is inhibited by BSA maléylée

La liaison de 1ΗSP70 marquée à la biotine a été évaluée par FACS. The binding of biotin-labeled 1ΗSP70 was assessed by FACS. HSP70 se lie aux cellules dendritiques humaines immatures (figure 1A) de façon dose-dépendante, détectable à 100 ng/ml (MFI = 6 ± 3 ; moyenne ± sd, n = 5) et maximale à la concentration la plus élevée testée (MFI = 92 ± 12 using 20 mg/ml HSP70). HSP70 binds to immature human dendritic cells (Fig. 1A) in a dose-dependent, detectable at 100 ng / ml (MFI = 6 ± 3, mean ± sd, n = 5) and a maximum at the highest concentration tested (MFI = 92 ± 12 using 20 mg / ml HSP70). La liaison de 1ΗSP70 marquée à la biotine aux cellules dendritiques immatures est empêchée par une préincubation avec de 1ΗSP70 non marquée (55 ± 9 % inhibition ; moyenne + SD, n = 5) et également avec 100 μg/ml de BSA maléylée (92 + 5 % inhibition) mais pas avec de la BSA (figure 1B). Binding 1ΗSP70 labeled with biotin to immature dendritic cells is inhibited by preincubation with 1ΗSP70 unmarked (55 ± 9% inhibition, mean ± SD, n = 5) and also with 100 mg / ml BSA maléylée (92 + 5% inhibition) but not with BSA (Figure 1B).

La BSA maléylée se lie aux récepteurs scavenger (SR) (Rhaindts, D., et al., Eur. J. Biochem., 261, 227-235, 1999), ces derniers pourraient donc être impliqués dans la liaison avec les HSP70. BSA maléylée binds to scavenger receptors (SR) (Rhaindts, D., et al., Eur. J. Biochem., 261, 227-235, 1999), they could be involved in binding with HSP70. Ces tests d'inhibition ont également été réalisés avec d'autres molécules se liant aux SR. These inhibition assays were also performed with other molecules binding to SR. Les résultats obtenus ont montré que la liaison de 1ΗSP70 marquée à la biotine aux cellules dendritiques immatures est empêchée par Ox-LDL (75 ± 8 % inhibition), Ac-LDL (85 + 10 %) poly[I] (94 ± 6 % inhibition) mais pas par la poly[A]. The results showed that the binding of biotin-labeled 1ΗSP70 to immature dendritic cells is inhibited by Ox-LDL (75 ± 8% inhibition), Ac-LDL (85 + 10%) poly [I] (94 ± 6% inhibition), but not the poly [A].

Ainsi, la liaison de 1ΗSP70 aux CPA (Cellules Présentatrices d'Antigènes) est empêchée par des molécules se liant aux SR, suggérant ainsi que les FISP70 se lient à un SR. Thus, the binding of 1ΗSP70 the CPA (Antigen Presenting Cells) is prevented by molecules binding to SR, suggesting that FISP70 bind to SR.

Exemple III : HSP70 se lie à LOX-1 Example III: HSP70 binds to LOX-1

De façon à déterminer la nature du récepteur des HSP70, des cellules CHO ont été transfectées avec de l'ADNc codant pour des SR. So as to determine the nature of HSP70 receptor, CHO cells were transfected with cDNA encoding SR. Les cellules CHO ont été choisies car elles ne lient pas le Dil-Ac-LDL fluorescent, suggérant qu'elles expriment les SR à un taux très faible. CHO cells were chosen because they do not bind the Dil-Ac-LDL fluorescent, suggesting that they express the SR at a very low rate. Une analyse par FACS a montré que les HSP70 se lient à des cellules transfectées par LOX-1 mais pas à des cellules exprimant d'autres récepteurs scavenger testés : SR-A l , CD36, SR-Cl et MARCO (figures 2B à 2E). FACS analysis showed that HSP70 bind to cells transfected with LOX-1 but not to cells expressing other scavenger receptors tested: the SR-A, CD36, SR-Cl and MARCO (Figures 2B to 2E) . La liaison de HSP70 à des cellules transfectées par LOX-1 (MFI = 75 + 9) a été inhibée par HSP70 en tant que tel et également par d'autres molécules connues pour se lier à LOX- 1 telles que Ox-LDL, Ac-LDL, polyfl] mais pas par la poly[A]. HSP70 binding to cells transfected with LOX-1 (MFI = 9 + 75) was inhibited by HSP70 as such and also by other molecules known to bind to LOX-1 such as Ox-LDL, Ac LDL-polyfl] but not by poly [A]. De plus, la liaison des HSP70 à LOX-1 a été inhibée par LOX-l -Fc (MFI = 26 + 8 à comparer avec 75 + 9 respectivement en présence ou en absence de LOX- l -Fc ; expériences réalisées en utilisant 20 μg/ml de HSP70) mais pas par CD86-Fc. In addition, the binding of HSP70 to LOX-1 was inhibited by LOX-l-Fc (MFI = 26 + 8 + 75 compared with 9 respectively in the presence or absence of LOX-l-Fc; experiments using 20 g / ml of HSP70), but not CD86-Fc.

Ainsi, LOX- 1 est un récepteur liant HSP70. Thus, LOX-1 is a receptor binding HSP70. Exemple IV : Expression de LOX-1 par des cellules dendritiques humaines LOX-1 est exprimé dans les cellules endothéliales, les monocytes/macrophages, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. Example IV: Expression of LOX-1 by human dendritic cells LOX-1 is expressed in endothelial cells, monocytes / macrophages, smooth muscle cells and fibroblasts. Nous avons analysé son expression dans les CPA humaines. We analyzed its expression in human APCs. De l'ARNm de LOX-1 a été détecté par RT-PCR dans les cellules dendritiques immatures, les lymphocytes B, les monocytes et les macrophages (figure 3 A). The LOX-1 mRNA was detected by RT-PCR in immature dendritic cells, B lymphocytes, monocytes and macrophages (Figure 3A). Comme contrôle, des transcripts de LOX-1 ont aussi été détectés dans des cellules endothéliales humaines (figure 3A). As a control, transcripts of LOX-1 were also detected in human endothelial cells (Figure 3A). La liaison des HSP70 aux cellules dendritiques immatures est inhibée par LOX-l-Fc mais pas par CD86-Fc (55 + 6 et 5 ± 4 % inhibition, respectivement ; moyenne ± sd, n = 5), démontrant que le récepteur LOX- 1 exprimé par les cellules dendritiques est un récepteur de HSP 70. The binding of HSP70 to immature dendritic cells is inhibited by the LOX-Fc-but not CD86-Fc (55 + 6 and 5 ± 4% inhibition, respectively, mean ± sd, n = 5), demonstrating that the receptor LOX- 1 expressed by dendritic cells is a receptor for HSP 70. Nous avons ensuite évalué par une analyse FACS si l'activafion des cellules dendritiques avec TNFα ou du LPS pouvait moduler la liaison de HSP70. We then evaluated by FACS analysis if activafion dendritic cells with TNF or LPS could modulate the binding of HSP70. Le LPS et TNFalpha induisent la maturation des cellules dendritiques. TNFalpha and LPS induce maturation of dendritic cells. Les résultats ont montré que l'activafion des cellules dendritiques immatures avec le TNFalpha et le LPS induit une diminution de la liaison de HSP70 (figure 3B). The results showed that activafion immature dendritic cells with TNF-alpha and LPS induced a decrease in the binding of HSP70 (Fig. 3B). Ces résultats montrent que le récepteur des HSP70 est sélectivement exprimé par les cellules dendritiques immatures et non par les cellules dendritiques matures. These results show that the receiver of HSP70 is selectively expressed by immature dendritic cells and not by mature dendritic cells.

Exemple V : LOX-l-Fc inhibe la présentation dans le CMH de classe I des antigènes associés à HSP70 Example V: LOX-l-Fc inhibits the presentation in the MHC class I antigens associated with HSP70

Il a été montré que les HSP70 permettaient d'initier une réponse CTL dans le CMH de classe I-CD8+ (Udono et ai, 1993 ; Udono et ai, 1994). It has been shown that HSP70 allowed to initiate a CTL response in the MHC class I-CD8 + (Udono et al, 1993; Udono et al, 1994). De plus, les HSP70 requièrent une endocytose médiée par un récepteur avant de parvenir dans le circuit du CMH de classe I. In addition, HSP70 require receptor-mediated endocytosis before reaching the circuit MHC class I. Nous avons analysé le rôle de LOX- 1 dans la réponse MHC classe I induite par HSP70 en utilisant l'activafion spécifique par l'ovalbumine du modèle CTL de cellules hybritlomes H-2 -restreints B3Z. We analyzed the role of LOX-1 in response MHC class I-induced HSP70 using specific activafion by ovalbumin CTL cell model hybritlomes H-2-restricted B3Z. Les cellules dendritiques immatures murines ont été puisées avec de l'ovalbumine (Ova) couplée à HSP70 en utilisant du bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) (HSP70-Ova) et exposé aux cellules T hybridomes B3Z. Immature murine dendritic cells were pulsed with ovalbumin (Ova) coupled to HSP70 using bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3) (HSP70-Ova) and exposed to T cell hybridoma B3Z. Les résultats ont montré qu'une concentration 1000 fois moindre d'Ova est requise lorsqu'elle est couplée à la HSP70 comparativement à l'Ova soluble pour induire des concentrations équivalentes d'IL-2. The results showed a concentration 1000 times lower Ova is required when coupled with the HSP70 compared with soluble Ova to induce equivalent levels of IL-2. Aucune IL-2 n'a été produite en utilisant de l'Ova couplée à BS 3 à la même concentration qu'HSP70-Ova (figure 4). No IL-2 was produced using the Ova coupled to BS 3 at the same concentration qu'HSP70-Ova (Figure 4). La production d'IL-2 induite par HSP70-Ova a été inhibée en utilisant 10 mg/ml de LOX-l-Fc (52 + 8 % d'inhibition) mais pas par CD86-Fc (figure 4). Production of IL-2-induced HSP70 Ova was inhibited using 10 mg / ml LOX-l-Fc (8 + 52% inhibition), but not CD86-Fc (Figure 4). Ainsi, LOX- 1 est impliqué dans le processing des antigènes couplés à HSP70 dans la présentation au CMH de classe I. Thus, LOX-1 is involved in the processing of antigens coupled to HSP70 in presenting MHC class I. Exemple V : Méthode de screening de nouveaux ligands du récepteur LOX-1 Example V: Method for screening of new ligands of LOX-1

La méthodologie décrite ci-dessous permet l'identification de molécules se liant à un récepteur LOX- 1. The methodology described below allows the identification of molecules binding to LOX-1 receptor.

Dans l'exemple, nous présenterons une méthode d'identification de molécules d'origine bactérienne à l'aide d'une banque d'expression. In the example, we present a method of identifying bacterial molecules using an expression library. Cette méthodologie est applicable à l'identification de molécules exprimées par n'importe quel organisme multicellulaire en utilisant des banques d'expression procaryotiques ou eucaryotiques et contenant soit des ADNc, soit de l'ADN génomique. This methodology is applicable to the identification of molecules expressed by any multicellular organism banks using prokaryotic or eukaryotic expression and containing either cDNA, or genomic DNA. a. a. Génération de clones stables exprimant des récepteurs LOX-1 Generation of stable clones expressing receptors LOX-1

Les ADNc codant pour les récepteurs LOX-1 identifiés jusqu'à maintenant sont intégrés dans un vecteur d'expression eucaryotique en aval d'une séquence codant pour un peptide signal (permettant de produire des molécules recombinantes solubles). CDNAs encoding the LOX-1 receptors identified so far are integrated into a eukaryotic expression vector downstream of a sequence encoding a signal peptide (for producing soluble recombinant molecules). Les cellules CHO sont transfectées par lipofecfion puis mises en culture avec un agent de sélection, comme par exemple l'hygromycine. CHO cells are transfected with lipofecfion then cultured with a selection agent, such as hygromycin. La sélection de clones exprimant le transgène pourra se faire de différentes manières en fonction des sondes disponibles : The selection of clones expressing the transgene can be done in different ways depending on the available probes:

- utilisation d'un anticoφs monoclonal, couplé ou non à une molécule fluorescente, - utilisation de Dil-Ac-LDL fluorescent [une molécule est définie comme un SR lorsqu'elle fixe les LDL modifiés comme les LDL oxydés (Ox-LDL) ou les LDL acétylés (Ac-LDL), (Dil pour l ,r-dioctadécyl-3,3,3,'3'-tétraméthylindo-carbocyanine- perchlorate), - Use of a monoclonal anticoφs, coupled or not with a fluorescent molecule, - use of Dil-Ac-LDL fluorescent [a molecule is defined as when a fixed SR modified as oxidized LDL (Ox-LDL) or LDL acetylated LDL (Ac-LDL) (Dil to l, r-dioctadecyl-3, 3,3, '3 '-tétraméthylindo-carbocyanine perchlorate-)

- sélection de transfectants exprimant de manière contemporaine le récepteur et une molécule comme l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). - Selection of transfectants expressing a contemporary way the receiver and a molecule such as EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). Dans ce cas, l'expression des deux molécules recombinantes (EGFP et récepteur LOX-1 ) est sous le contrôle d'un même promoteur, les ADNc sont séparés par une séquence IRES qui permet la synthèse de deux protéines à partir d'un seul ARNm. In this case, the expression of both recombinant molecules (EGFP and receptor LOX-1) is under the control of the same promoter, the cDNAs are separated by an IRES sequence that enables the synthesis of two proteins from a single mRNA. Dans ce cas, toute cellule exprimant la EGFP exprime de manière contemporaine le récepteur LOX-1. In this case, all cells expressing EGFP expression in a contemporary way the LOX-1 receptor. Les clones exprimant le plus fortement le récepteur LOX-1 recombinant seront sélectionnés par cytofluorométrie (utilisation d'un trieur de cellules), par exemple. Clones expressing the strongest LOX-1 receptor recombinant will be selected by flow cytometry (using a cell sorter), for example. Les transfectants seront maintenus en culture en présence de l'agent de sélection. Transfectants are maintained in culture in the presence of the selection agent. b. b. Création de la banque d'expression L'ADN génomique bactérien est cassé mécaniquement afin d'obtenir des fragments d'une taille d'environ 1 kb. Creation of expression library bacterial genomic DNA is mechanically broken to obtain fragments of a size of about 1 kb. Les fragments d'ADN sont ensuite intégrés dans un vecteur d'expression présentant un double promoteur procaryote/eucaryote. The DNA fragments are then incorporated into an expression vector with a dual promoter prokaryote / eukaryote. Ce plasmide présente au moins les caractéristiques suivantes : une séquence codant pour un peptide signal en amont de l'ADN exogène et une séquence codant pour un Tag en aval de l'ADN exogène. This plasmid comprises at least the following characteristics: a sequence encoding a signal peptide upstream of the exogenous DNA and a sequence encoding a tag downstream of the exogenous DNA. Le Tag sera choisi sur la base de l'existence d'anticoφs monoclonaux dirigés contre cette séquence Tag. Tag will be selected on the basis of the existence of anticoφs directed against this sequence tag monoclonal antibodies.

Après transformation avec les plasmides contenant les fragments d'ADN génomique, les bactéries contenant un ADN plasmidique sont sélectionnées (utilisation d'une résistance à un antibiotique exprimée par le plasmide) puis clonées. After transformation with the plasmids containing genomic DNA fragments, bacteria containing the plasmid DNA are selected (using an antibiotic resistance expressed by the plasmid) and then cloned. Les cellules eucaryotes (comme par exemple les cellules CHO ou HEK-293) seront transfectées par électroporation ou lipofecfion avec 10 plasmides (n=10). Eukaryotic cells (such as CHO or HEK-293 cells) are transfected by electroporation with 10 lipofecfion or plasmids (n = 10). 24 heures après la transfection, le milieu de culture est changé et les cellules sont maintenues en culture dans un milieu sans FCS ni acides gras. 24 hours after transfection, the culture medium was changed and the cells are maintained in culture medium without FCS or fatty acids. Les surnageants sont ensuite collectés après 48 h de culture et concentrés. The supernatants were then collected after 48 h of culture and concentrated. La production de protéines recombinantes solubles pourra être évaluée aisément par Dot-blotting. The production of soluble recombinant proteins can be evaluated easily by dot-blotting. c. c. Identification des clones produisant une molécule se fixant à un récepteur LOX-1 Identification of clones producing a molecule binding to LOX-1 receptor

Les surnageants de culture contenant les molécules recombinantes solubles sont incubés avec les différents clones stables exprimant les récepteurs LOX-1. Culture supernatants containing soluble recombinant molecules are incubated with different stable clones expressing the receptor LOX-1. Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticoips fluorescent dirigé contre la séquence Tag choisie. After washing, the cells were incubated with a fluorescent anticoips directed against the tag sequence selected. La fluorescence sera ensuite analysée par cytofluorométrie. The fluorescence is then analyzed by flow cytometry. Après identification des groupes produisant une molécule soluble dirigée contre un récepteur LOX-1 , chacun des plasmides contenu dans le groupe de 10 clones sera analysé individuellement afin d'identifier celui produisant la molécule d'intérêt. After identifying the groups producing a soluble molecule directed against LOX-1 receptor, each of the plasmids contained in the group of 10 clones will be analyzed individually to identify the producing molecule of interest. La nature de la protéine sera ensuite déterminée par séquençage du fragment d'ADN génomique. The nature of the protein is then determined by sequencing the genomic DNA fragment. d. d. Production de la molécule recombinante Dans le cas où la séquence présente dans le plasmide code pour la protéine entière, nous analyserons directement quelle molécule Tir est impliquée dans la signalisation. Production of the recombinant molecule In case the sequence present in the plasmid encodes the entire protein, we analyze directly what Tir molecule is involved in signaling. Si la séquence présente dans le plasmide ne code pas pour la protéine entière, le gène sera clone en entier (détermination du cadre de lecture complet). If the sequence present in the plasmid does not encode the entire protein, the gene will be cloned as a whole (full determination of reading frame). Ceci pourra se faire de différentes manières : This can be done in different ways:

- si la séquence issue de la souche choisie est connue dans la littérature, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques spécifiques, - If the sequence after the selected strain is known in the literature, the complete sequence will be amplified by PCR using specific oligonucleotide probes,

- si la séquence issue de la souche choisie n'est pas connue mais homologue à un gène déjà identifié dans une autre souche, la séquence complète sera amplifiée par PCR à l'aide de sondes oligonucléotidiques dégénérées, - If the sequence from the selected strain is not known, but a gene homologous to previously identified in another strain, the complete sequence is amplified by PCR using degenerate oligonucleotide probes,

- si la séquence n'est pas connue dans les banques de données publiques, la séquence complète sera identifiée par séquençage de l'ADN génomique. - If the sequence is not known in the public databases, the entire sequence will be identified by sequencing genomic DNA.

La séquence complète sera insérée dans un vecteur d'expression procaryotique en aval d'une séquence codant un Tag contre lequel des anticoφs monoclonaux sont disponibles. The complete sequence is inserted into a prokaryotic expression vector downstream of a sequence encoding a tag anticoφs against which monoclonal antibodies are available. Après sélection d'un clone produisant de manière élevée la protéine, la protéine sera produite selon des techniques connues d'homme de métier et purifiée par immunoprécipitation à l'aide d'un anticoφs anti-Tag immobilisé sur une résine. After selection of a clone producing high way protein, the protein will be produced by known business man and purified by immunoprecipitation techniques using an anti-Tag anticoφs immobilized on a resin. La capacité de la molécule recombinante purifiée à se fixer au récepteur LOX-1 sera réévaluée par cytofluorométrie comme décrit ci-dessus. The ability of purified recombinant molecule to bind to receptor LOX-1 will be re-evaluated by flow cytometry as described above.

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Classifications
International ClassificationG01N33/92, A61P35/00, A61K39/39, A61P31/00, A61P33/00
Cooperative ClassificationG01N33/92, A61K39/39, A61K2039/57
European ClassificationA61K39/39, G01N33/92
Legal Events
DateCodeEventDescription
Sep 14, 2005NENP
Ref country code: JP
Dec 17, 2003122
Oct 30, 2002121
Sep 6, 2002DFPE