WO2002068475A2 - Composicion farmaceutica de fragmentos f(ab)2 de anticuerpos y un proceso para su preparacion - Google Patents

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Jorge Paniagua Solis
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Juan Lopez De Silanes
Rita Mancilla Nava
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 antibody fragments that are preferably free of albumin and complete antibodies and also substantially free of pyrogens, and an effective amount of a pharmaceutically acceptable carrier. It also refers to a method for the preparation of a pharmaceutical composition comprising F (ab) antibody fragments. using the serum or blood plasma of a mammal, previously immunized, as a source of antibodies. The blood serum or plasma is digested with an enzyme, pepsin, followed by separation and purification until the pharmaceutical composition of the F (ab) 2 fragments is free of albumin and whole antibodies, and substantially free of pyrogens.
  • Antibodies are globulin-like proteins known as immunoglobulins, which are present in the blood serum as a response of the immune system to the invasion of some foreign substance or organism, characterized by specifically binding those substances outside the body, neutralizing and precipitating them, thereby They are eliminated from the circulation.
  • immunoglobulins globulin-like proteins known as immunoglobulins, which are present in the blood serum as a response of the immune system to the invasion of some foreign substance or organism, characterized by specifically binding those substances outside the body, neutralizing and precipitating them, thereby They are eliminated from the circulation.
  • Various industrial applications have been developed for the diagnosis, monitoring, prevention and treatment of various diseases.
  • the anti-cytokine antibodies are applied directly to the patient or the blood that has been extracted from the patient is treated by refeeding it later, in order to eliminate the cytokines generated by the organism itself in response to the disease, which if not removed would eventually cause extremely annoying symptoms (see US patents 5,888,511 and 4,940,670).
  • IgG immunoglobulins
  • IgM immunoglobulins
  • IgD immunoglobulins
  • IgA immunoglobulins
  • IgE immunoglobulins
  • All IgGs have the same general structure (shown in Figure 1) composed of four polypeptide chains, two heavy (H) and two light (L) that are linked together by disulfide bridges.
  • the two heavy chains are joined together by two other disulfide bridges in what is known as the hinge region, approximately half the length of the chains. A little further towards the amino terminal region, each heavy chain is linked by a disulfide bridge with a light chain.
  • Each heavy chain has three constant regions Cnl, C ⁇ 2 and C ⁇ 3, the last two of the carboxy terminal region (before the hinge) and the first in the amino terminal region (immediately after the hinge) and a Variable region (V ⁇ ) in the amino terminal end, while each light chain has only a constant region C L at the carboxy terminal end and a variable region N L at the amino terminal end.
  • Fab and F (ab) 2 are the fragments that retain the ability to specifically bind the antigen that originated them and F (ab) 2 also precipitate it, while the Fe fraction of the antibodies normally acts as a signal marker for macrophages and lymphocyte activation to recognize and phagocyte the antigen-antibody complex.
  • the Fe fragment comprises the antigenic determinants of the antibody in such a way that, by administering to a patient whole antibodies generated in some animal of another species, the patient generates an immune response against those antigenic determinants giving rise to various. Adverse side responses that may include even anaphylactic shock.
  • Fab or F (ab) 2 fragments finds another advantage in what is known as the concept of volume of distribution, which is nothing but the volume of the body in which a certain drug is dissolved, this volume can only refer to the circulating blood as in the case of IgG or include a greater part of body water for the case of fragments. Therefore, Fab and F (ab) 2 because they have a greater body volume can access to neutralize toxins lodged in various tissues, not only in the blood, and can even cross the blood-brain barrier in both directions and can be used to neutralize or Eliminate neurotoxins
  • the use of the F (ab) 2 has an advantage over the Fabs, which is that they have a longer retention time in the organism because they have a double molecular weight, in addition to preserving the ability to precipitate the antigen in conditions physiological, and still retain a size that allows them to access a sufficient volume of distribution for treatment purposes.
  • the applications of the latter extend to the former, with the additional advantage that, lacking the Fe fragment, recognition as alien by the patient's organism to which they are administered it is lower, having a greater tolerance to its application and reducing the possibility of secondary reactions, which is particularly useful for prolonged treatments such as those applied in autoimmune diseases.
  • the application on which Landon is based is with purified antigens which, unlike poisons, can easily be linked to supports to obtain a matrix for the purification of the Fabs of interest, and never use or discuss the method for get Fab fragments against antigens that are mixtures of many substances, such as poisons, besides that it only works with papain and chymopapain and does not discuss the possibility of using pepsin.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 antibody fragments that are preferably free of albumin and of complete antibodies and also substantially free of pyrogens.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 antibody fragments in an effective amount of a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention provides a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 fragments of antibodies that neutralizes or eliminates toxins in tissues and blood.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 fragments of antibodies that neutralizes a complex mixture of antigenic molecules such as poison from poisonous animals.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for the preparation of a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 antibody fragments using the serum or blood plasma of a previously immunized mammal, as a source of antibodies.
  • the blood serum or plasma is digested with an enzyme, pepsin, and subsequently separated and purified until the pharmaceutical composition of the F (ab) 2 fragments is free of albumin and complete antibodies and substantially free of pyrogens.
  • FIGURES Figure 1.
  • H represents a heavy chain.
  • L represents a light chain.
  • C represents a constant region in heavy or light chains and
  • V represents a variable region in heavy or light chains and
  • HiR represents the hinge region.
  • Figure 2. Diagram of the production of F (ab) 2 . The main steps of the present invention for the production of F (ab) 2 fragments are outlined in the figure.
  • Blocks I to XIII represent: Mix of hyperimmune blood plasmas (I); Digestion of plasma (II); Precipitation of unwanted protein fragments (III); Clarification of the solution of F (ab) 2 (IV); Waste containing the precipitate of unwanted protein fragments (V); Solution of partially purified F (ab) 2 (VI); Precipitation of F (ab) 2 from solution (VII); Centrifugation (VIII); Waste containing low molecular components and salts (IX); Dialysis or ultrafiltration (X); Sterile filtration and formulation (XI); Lyophilization (XII); Final product (XIII).
  • H represents a heavy chain fragment.
  • L represents a light chain.
  • C represents a constant region that can be found in a heavy chain or light chain fragment and V represents a variable region in a heavy chain or light chain fragment and HiR represents the hinge region.
  • Lanes 1 and 9 correspond to molecular weight markers: Myosin (205 Kd), ⁇ -galactosidase (121 Kd), Bovine Albumin Serum (70 Kd), Ovalbumin (52.4 Kd), Carbonic Anhydrase (34.9 Kd), Inhibitor of Soybean Trypsin (29.1 Kd), Lysosima (20.7 Kd), and Aprotinin (6.9 Kd); Lanes 3 to 8 represent: blood plasma, digested plasma, the mixture from the first precipitation, filtration, waste and the mixture of the second precipitation and lanes 11 to 16 represent: the paste of the precipitate, dialysis, waste, F ( ab) 2 crude (concentrated), sterile formulated F (ab) 2 solution and the final product. Gels 1 and 2 are under non-reduction conditions and gels 3 and 4 are under reduction conditions.
  • Lane 1 corresponds to molecular weight markers: Myosin (205 Kd), ⁇ -galactosidase (121 Kd), Bovine Albumin Serum (70 Kd), Ovalbumin (52.4 Kd), Carbonic Anhydrase (34.9 Kd), Trypsin Inhibitor of Soy (29.1 Kd), Lysosima (20.7 Kd), and Aprotinin (6.9 Kd); Lanes 2 through 7 are different batches of F (ab) 2 fragments against the venom of the black widow spider.
  • Figure 6 are different batches of F (ab) 2 fragments against the venom of the black widow spider.
  • Lane 1 corresponds to molecular weight markers: Myosin (205 Kd), ⁇ -galactosidase (121 Kd), Bovine albumin serum (70 Kd), Ovalbumin (52.4 Kd) prevailCarbonic anhydrase (34.9 Kd), Trypsin inhibitor of Soy (29.1 Kd), Lysosima (20.7 Kd), and Aprotinin (6.9 Kd); Lanes 2 through 5 are different batches of F (ab) 2 fragments against the venom of the coral snake.
  • FIG. 7 Electrophoresis of different batches of F (ab) 2 fragments against snake venom of the Bothrops, Crotalus Lachesis genera; while lane 10 corresponds to molecular weight markers: Myosin (205 Kd), ⁇ -galactosidase (121 Kd), Bovine albumin serum (70 Kd), Ovalbumin (52.4 Kd), Carbonic anhydrase (34.9 Kd), Inhibitor of Trypsin of Soy (29.1 Kd), Lysosima (20.7 Kd), and Aprotinin (6.9 Kd).
  • Lane 1 corresponds to molecular weight markers: Myosin (205 Kd), ⁇ -galactosidase (121 Kd), Bovine Albumin Serum (70 Kd), Ovalbumin (52.4 Kd), Carbonic Anhydrase (34.9 Kd), Trypsin Inhibitor of Soy (29.1 Kd), Lysosima (20.7 Kd), and Aprotinina (6.9 Kd); lane 2 is empty and lanes 3 to 8 contain blood plasma, digested plasma, filtered, filtrate debris, paste obtained from centrifugation and concentrated after dialysis. Gels 1 and 2 correspond to F (ab) 2 anti- ⁇ TNF under reduction and non-reduction conditions. Gels 3 and 4 correspond to F (ab) 2 anti interferon- ⁇ under reduction and non-reduction conditions.
  • substantially free refers to the absence of pyrogen and non-F (ab) 2 protein material such as albumin or complete antibodies in accordance with the rules of the Mexican Pharmacopoeia.
  • aseptic conditions refers to the precautionary measures or methods used in the handling of the different products of each stage of the method of the present invention to prevent contamination of the culture or sterile medium and infection by foreign microorganisms.
  • the term "effective amount” or "pharmaceutically effective amount” of a compound in unit dose of the composition depends on a number of factors. Among these is the amount of the other ingredients used, tolerance of the active ingredient of the composition. The effective amount of the active ingredient ranges from about 8% to about 35% by weight based on the total weight of the composition.
  • the amount of the preparation of F (ab) 2 with which each bottle will be filled varies according to the species from which the poison was prepared. For antialacranes compositions, the preparation of F (ab) with which each bottle will be filled is the amount necessary to neutralize from about 135 to about 220 average lethal doses of the poison.
  • compositions against the black widow spider For compositions against the black widow spider, the amount needed to neutralize from about 540 to about 880 average lethal doses of the poison. For anticoral compositions, the amount necessary to neutralize from about 360 to about 660 average lethal doses of the poison. In the case of compositions against Bothrops and Crotalus, the bottles are filled with the amount necessary to neutralize from about 700 to about 1100 average lethal doses of the poison.
  • pharmaceutically acceptable carrier is meant a solid or liquid excipient, diluent or substance which can be safely used in systemic or topical administration.
  • pharmaceutically acceptable carriers include solid or liquid excipients, diluents, hydrotropes, surface active agents, and encapsulating substances. The amount of the carrier used in conjunction with the F (ab) 2 fragments to provide the practical amount of material per unit dose of the composition.
  • Carriers acceptable for systemic administration that can be incorporated into the composition of the invention include sugar, starches, cellulose, vegetable oils, buffers, polyols and alginic acid. Specific pharmaceutically acceptable carriers are described in the following documents, all of which are incorporated by reference herein: US Patent 4,401,663 Buckwalter et al. issued on August 30, 1983; European Patent Application No. 089710, LaHann et al., Published September 28, 1983; and European Patent Application No. 0068592, Buckwalter et al., published January 5, 1983.
  • Preferred carriers for parenteral administration include propylene glycol, pyrrolidol, ethyl oleate, aqueous ethanol and combinations of the foregoing.
  • Representative carriers include acacia, agar, alginates, hydroxyalkylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose, carboxymethylcellulose, carrageenan, cellulose powder, guar gum, cholesterol, gelatin, agar gum, arabic gum, karaya gum, ghatti gum, gum of carob, octoxinot 9, olympic alcohol, pectin, polyacrylic acid and its counterparts, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, sodium lauriyl sulfate, polyethylene oxide, polyvinylpyrrolidone, glycol monostearate, propylene glynta monostearate, gumol gum, gum, monostearate of sorbitan, stearyl alcohol, starch and its modifications The appropriate ranges vary from about 0.5% to about 1%.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising F (ab) 2 fragments of albumin free antibodies and complete and substantially pyrogen free antibodies.
  • the antibodies from which the fragments are obtained can be generated against purified molecules, that is, free from other antigenic molecules.
  • purified molecules include cytokines, particularly -TNF and interferon- ⁇ or other pharmaceutical drugs and the like.
  • the antibodies from which the fragments are obtained can also be generated against complex mixtures of immunogenic molecules such as poisonous animal poisons that are complex mixtures of peptides and toxins, and even a mixture of the poisons of various spices.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has been successfully obtained from antibodies generated against the ⁇ -TNF and interferon- ⁇ cytokines, against the total venom of the black widow spider (Lairodectus mactans), the total venom of the coral snake ( Micrurus nigi-oscinctus), against snake venoms of the genus Bolhrops, Crotalus, Agkistrodon, Lachesis and Sis / ruriis and against a mixture of venoms (polyvalent venus) of scorpions, particularly Cenfruroides noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus Tecomanus and C. suffussus .suffussus.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises F (ab) 2 fragments whose general structure is presented in Figure 3 and lacking the Fe region and being free of albumin and complete antibodies lack antigenic determinants, by which the organism of the patient would recognize them as outsiders.
  • the pharmaceutical composition of this invention can be administered on more than one occasion, drastically reducing the possibility of some secondary response.
  • Administration is usually systemic, either intramuscularly or intravenously. The amount varies according to the characteristics of the subject to whom the substance is applied, the species that bit or itched and the degree of administration. For example, for scorpions or black widow spiders, approximately 1 or 3 bottles are used, while 1 to 10 bottles are used in the case of snake bites.
  • the present invention is directed to a method for the production of F (ab) 2 fragments substantially free of albumin, whole antibodies and pyrogens, from a source of antibodies such as the serum, plasma or blood of an animal , which has undergone an immunization scheme with an immunogen, stimulating the generation of specific antibodies against the immunogen.
  • the starting material ie the source of antibodies
  • the source of antibodies must come from several animals to have a larger universe of different specific antibodies against the different epitopes of the immunogen.
  • the source of antibodies may be blood, serum or preferably plasma.
  • the first step of the method is the digestion of the protein material contained in the antibody source, although it is optionally recommended to dilute the antibody source, especially when it comes to plasma.
  • the pH is lowered to around 3.2 + 0.2 and sufficient amounts of the pepsin enzyme are added (about 0.5 to 1 g / 1 depending on the enzymatic activity) and the time necessary to achieve a high degree of hydrolysis is stirred with stirring (close to 100% hydrolyzed antibodies) at a temperature close to 20 degrees Celsius.
  • a precipitation is then carried out by adding ammonium sulfate in a proportion of between 16 and about 22% (P / V), preferably about 21%, incubating the mixture for 30 minutes at a temperature around 55 + 4 degrees centigrade Subsequently, the mixture is allowed to cool and stand at a temperature between 8 and 12 degrees Celsius for a time of at least 2 hr. This resting period is of great importance in the formation of larger particles, which results in greater precipitation efficiency, in addition to absorbing other impurities of smaller size that would not otherwise precipitate. In this step, a large part of the serous proteins such as albumin and fibrinogen are precipitated and the large fragments resulting from their digestion are precipitated, while the F (ab) 2 fragments resulting from the digestion of the antibodies remain in the solution.
  • the next step is to clarify the solution by removing even the smallest particles formed during precipitation.
  • the supernatant from the previous step is subjected to a new precipitation by the addition of ammonium sulfate in a proportion of between 32 and 38%, preferably about 35% Weight / Nolumen at a pH of 6.8 ⁇ 0.5. Again it is important to give a period of rest as long as possible, in refrigeration, at least about 12 hours ideally, which results in larger particles with greater precipitation efficiency.
  • the salts and some low molecular weight components that do not precipitate the conditions that were handled in the previous steps remain in soluble form.
  • the crystal paste can be subjected to dialysis or alternatively ultrafiltration, in both cases the pore size of the membrane must have a size that allows the passage of salts and components of low molecular weight and not of the F (ab) 2 fragments, which decrease the concentration of salts again solubilize.
  • the solution formed in the previous step is passed through a sterile filter and subsequently formulated with pharmaceutically acceptable excipients for injections.
  • a sterile filter and subsequently formulated with pharmaceutically acceptable excipients for injections.
  • Polyvinylpyrrolidone, mannitol or dextrose can be used.
  • Osmolytes such as glycerol
  • stabilizers such as sucrose
  • some salts such as NaCl
  • the product is üofi ⁇ izado, and the vials that contain it are hermetically sealed.
  • an easily soluble product is obtained (the content of a bottle in 5 ml in less than 1 minute), substantially free of pyrogens according to the Pharmacopoeia and of non-F (ab) 2 protein material (0% albumin) , 0% complete antibodies).
  • Electrophoresis was performed using 10% acrylamide gels) under conditions of reduction and non-reduction.
  • the protein concentration of each sample was standardized at 18 ⁇ g per lane. They were revealed with bright blue comassie R-250.
  • the solubility was performed by adding 5 ml of double-distilled water to each bottle, vigorously stirring and observing the solubility of the contents of the bottle after less than a minute against the light.
  • mice were injected intraperitoneally with 100 ⁇ l of the dilutions to eight groups of 5 mice (Balb / c) of an average weight of 15g, one group for each dilution of each venom.
  • the mortality of the mice was read after 24 hours.
  • Lyophilized poisons were reconstituted in a 0.1M sodium carbonate buffer pH9.5 at a concentration of 5 ⁇ g / ml. 2. 96 ELISA wells were coated by adding 100 ⁇ l of venom per well and incubated overnight at 4 ° C.
  • reaction solution 100 ⁇ l of the reaction solution (dilutions) was added to each well and 50 ⁇ l of the antivenom solution was mixed and then 50 ⁇ l of the dilution was transferred to the next well and so on until well 10 , and incubated for one hour at room temperature. 7. Again, the wells were washed three times with 200 ⁇ l / well of wash solution. 8. A second horse antibody was added which was conjugated to the enzyme peroxidase diluted 1: 2500 in reaction buffer and incubated at room temperature for one hour. 9. The reaction was revealed by adding 100 ⁇ l / well of the ABTS chromogenic substrate and incubating for 10 minutes at room temperature.
  • the reaction was stopped by adding 25 ⁇ l / well of concentrated hydrofluoric acid.
  • the absorbance at 405 nm was read with an ELISA reader.
  • EXAMPLE 1 Development of an adequate source of antibodies. In order to have an adequate source of antibodies, one must seek to have the following requirements: a) a high antibody titer, which implies a high concentration of the same and that a high percentage of these be specific against the antigen in question and b) a population of broad spectrum antibodies, that is to say against the different epitopes of each of the molecules that make up the antigen, this is particularly relevant in the case of poisons.
  • Immunization schemes were followed as recommended in the literature with doses of poisons ranging from 3 to 150 DL 5 per horse for 12 immunizations, administered over a period of 5 to 6 weeks in the case of the base schemes, and 70 to 450 DL 50 per horse by 5 immunizations for 3 weeks for booster schemes, according to the type of poison administered.
  • Freund's Complete and Incomplete adjuvants were used as well as an isotonic saline solution, using a total of 5, 10 or 20 ml in the different inoculations.
  • the source of antibodies used in the present invention was obtained by applying blood to animals, at a rate of 6 to 10 liters per horse for each bleeding, and two bleeding during the 15 days after the last inoculation of each scheme.
  • the source of antibodies for the method of the present invention can be the mixing of the blood of the different animals immunized with the same antigen, or the serum resulting from their coagulation, or preferably the plasma resulting from the separation by sedimentation of the package mobile.
  • the use of plasma in particular has the advantage in large-scale production, that the cell pack can be washed and suspended in physiological solution and fed back to the animal from which it was obtained, thus reducing the stress associated with the loss of blood cells, impacting the lowest possible antibody production.
  • scorpion a polyvalent poison that is a mixture of the venoms of the scorpions Centruriodes noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus and C. suffussus suffussus
  • scorpion a polyvalent poison that is a mixture of the venoms of the scorpions Centruriodes noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus and C. suffussus suffussus
  • Black widow spider Latrodectus mactans
  • coral snakes Micrurus nigroscienctus
  • snakes of the genera Bothrop, Crotalus and Lachesis particularly the rattlesnake (Crotalus durissus durissus), the mute rattlesnake (Lachesis muta stenophry) and the nauyaca (Bothrops asper).
  • a source of antibodies was obtained as mentioned in example 1, using as antigen in this case polyvalent scorpion venom (Centruroid.es noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus and C. suffussus suffussus), obtaining blood plasma as source of antibodies Plasma of different animals immunized against the same polyvalent poison was mixed.
  • polyvalent scorpion venom Certruroid.es noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus and C. suffussus suffus
  • the plasma was diluted 1: 2 with depyrogenated water (reverse osmosis, sterilized and filtered by 0.22 ⁇ m) and the pH was adjusted around 3.2.
  • depyrogenated water reverse osmosis, sterilized and filtered by 0.22 ⁇ m
  • pepsin filtered by 0.22 ⁇ m
  • pepsin was added until it was almost 390,000 units per liter and left react at a temperature close to 20 degrees Celsius, for 1 hour with stirring at intervals of about 15 minutes.
  • the mixture was heated to 54 degrees Celsius and ammonium sulfate was added in a proportion of 21% (weight / volume) and allowed to stand for 30 min. Later it was refrigerated between 4 and 8 degrees Celsius for a space of about 2 hours (but it can be stored up to 24hr.). The supernatant was recovered by decantation and clarified by passing through 12, 8 and 4 ⁇ m plate filters.
  • ammonium sulfate was added again in a proportion of 35% (weight / volume), after adjusting the pH to approximately 6.8. It was allowed to stand for 12 hrs. Subsequently, the mixture was centrifuged at about 15,000 rpm in a Sharples-type centrifuge. The recovered paste contains the F (ab) 2 fragments. The paste was subjected to a cellophane dialysis process, between 4 and 12 degrees Celsius for 8 to 10 days. The resulting solution contained specific F (ab) 2 fragments against substantially pure and pyrogen-free scorpion venom.
  • Example 2 a source of antibodies was obtained according to the description of Example 1, using the black widow spider venom (L. Mactans) and plasma was chosen as the source of antibodies.
  • the plasma obtained was processed in the same manner as in Example 2.
  • Figure 5 shows the electrophoresis gel at different stages of the process where it is clearly seen that the resulting F (ab) 2 fragments have a molecular weight of approximately 100,000 to 110,000 daltons (non-reducing conditions), while under reducing conditions they are present as bands from 25,000 to 30,000 daltons.
  • the potency test showed that the pharmaceutical composition comprising the F (ab) 2 fragments obtained effectively neutralizes the venom of the black widow spider.
  • the contents of all the bottles included in the sampling were soluble in 5 ml of double-distilled water in less than 1 minute.
  • EXAMPLE 4 Application of the method of the present invention for the production of antivenom against the snake venom coral.
  • Example 2 a source of antibodies was obtained according to the description of Example 1, using the venom of the coral snake (M. nigrosinctus) and plasma was chosen as the source of antibodies.
  • the plasma obtained was processed in the same manner as in Example 2.
  • Figure 6 shows the electrophoresis gel at different stages of the process where it is clearly seen that the resulting F (ab) 2 fragments have a molecular weight of approximately 100,000 to 110,000 daltons (non-reducing conditions), while under reducing conditions they are present as bands from 25,000 to 30,000 daltons.
  • the potency test showed that the pharmaceutical composition comprising the F (ab) 2 fragments obtained effectively neutralizes the venom of the coral snake.
  • the contents of all the bottles included in the sampling were soluble in 5 ml of double-distilled water in less than 1 minute.
  • cytosine both ⁇ -TNF and interferon- ⁇ , separately
  • Figure 8 shows the electrophoresis gel at different stages of the process where it is clearly seen that the resulting F (ab) 2 fragments have a molecular weight of approximately 100,000 to 1 10,000 daltons (non-reducing conditions), while under reducing conditions they are present as bands of 25,000 to 30,000 daltons.
  • the potency test showed that the pharmaceutical composition comprising the F (ab) 2 fragments obtained, effectively neutralizes the ⁇ -TNF and interferon- ⁇ cytokines, respectively.
  • the contents of all the bottles included in the sampling were soluble in 5 ml of double-distilled water in less than 1 minute.
  • EXAMPLE 7 Cross-immune reactions of the composition of F (ab) 2 against Bothrops asper and Crotalus durissus (antiviperine composition) with the venom of other species and genera.
  • mice For each of the snake species mentioned below, eight different amounts of the antiviperine composition were incubated for 1 hour together with a fixed amount of venom (equivalent to 5 LD50) and saline solution to fix the volume. Subsequently, eight groups of 5 mice (Balb / c) with an average weight of 15 g were injected intraperitoneally with a fixed volume of 700 ⁇ l, one group for each quantity of the antiviperine composition. The mortality of the mice was read after 24 hours.
  • EXAMPLE 8 Determination of the title of the antiviperine composition against 16 snake species by ELISA.
  • ELISA plates were prepared with the venom of 16 snake species, reacted with the antiviperine composition (against the venom of the Bothrops and Crotalus genera), developed and read at 405 nm.
  • Experimental data were adjusted for Absorbance at 405 nm vs. the logarithm of the dilution factor (of the antiviperine composition) by a non-linear regression with GraphPad PRISM software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) and the Titles were calculated (defined as the dilution factor at which the half of the maximum response) of the antiviperine composition against each poison, which are represented in Table 2.

Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que preferentemente se encuentran libres de albúmina y de anticuerpos completos y también sustancialmente libre de pirógenos, y una cantidad efectiva de un acarreador farmacéuticamente aceptable. También se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos utilizando el suero o plasma de sangre de un mamífero, previamente inmunizado, como fuente de anticuerpos. El suero o plasma de sangre se digiere con una enzima, pepsina, seguido por la separación y purificación hasta que la composición farmacéutica de los fragmentos F(ab)2 quede libre de albúmina y anticuerpos completos, y sustancialmente libres de pirógenos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE FRAGMENTOS F(ab)2 DE ANTICUERPOS Y UN PROCESO PARA SU PREPARACIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que preferentemente se encuentran libres de albúmina y de anticuerpos completos y también sustancialmente libres de pirógenos, y una cantidad efectiva de un acarreador farmacéuticamente aceptable. También se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab) de anticuerpos . utilizando el suero o plasma de sangre de un mamífero, previamente inmunizado, como fuente de anticuerpos. El suero o plasma de sangre se digiere con una enzima, pepsina, seguido por la separación y purificación hasta que la composición farmacéutica de los fragmentos F(ab)2 se quede libre de albúmina y anticuerpos completos, y sustancialmente libre de pirógenos.
ANTECEDENTES
Los anticuerpos son proteínas tipo globulinas conocidas como inmunoglobulinas, que se encuentran presentes en el suero sanguíneo como respuesta del sistema inmune a la invasión de alguna sustancia u organismo ajeno, caracterizándose por unir específicamente aquellas sustancias ajenas al organismo, neutralizándolas y precipitándolas, con lo cual son eliminadas de la circulación. Se les han desarrollado diversas aplicaciones industriales para el diagnóstico, monitoreo, prevención y tratamiento de diversos padecimientos.
En regiones donde, por las condiciones climáticas, abundan los animales ponzoñosos, a los anticuerpos se les ha dado un especial uso para combatir el veneno, aplicándoselos en un elevado número de dosis por tratamiento a pacientes picados o mordidos por alacranes, arañas y serpientes principalmente. Actualmente, un uso que está cobrando gran importancia es como tratamiento para enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, diabetes mellitus inmuno-dependiente, SIDA, anemias nemofϊíicas, fiebre reumática, esclerosis múltiple, tiroiditis y soriasis, entre otras. En estos casos, se aplican los anticuerpos anticitocinas directamente al paciente o se trata la sangre que se ha extraído del paciente realimentándosela posteriormente, con el propósito de eliminar las citocinas generadas por el organismo mismo como respuesta a la enfermedad, mismas que de no removerse finalmente causarían síntomas extremadamente molestos (ver patentes estadounidenses 5,888,511 y 4,940,670).
Existen varias clases de inmunoglobulinas, denominadas IgG, IgM, IgD, IgA e IgE, de las cuales las más abundantes en la circulación sanguínea son las IgG, además son éstas las que corresponden a una respuesta inmune madura y por tanto incluyen la gran mayoría de los anticuerpos que se producen comercialmente. Todas las IgG tienen una misma estructura general (que se muestra en la figura 1) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos pesadas (H) y dos ligeras (L) que se encuentran unidas entre sí por puentes de disulfuro. A su vez, las dos cadenas pesadas se encuentran unidas entre sí por otros dos puentes de disulfuro en lo que se conoce como región bisagra, aproximadamente a la mitad de la longitud de las cadenas. Un poco más hacia la región amino terminal, cada cadena pesada se une mediante un puente de disulfuro con una cadena ligera. Cada cadena pesada tiene tres regiones constantes Cnl, Cπ2 y Cπ3, las dos últimas de la región carboxi terminal (antes de la bisagra) y la primera en la región amino terminal (inmediatamente después de la bisagra) y una región Variable (Vπ) en el extremo amino terminal, mientras que cada cadena ligera tiene sólo una región constante CL en el extremo carboxi terminal y una región variable NL en el extremo amino terminal.
Cuando las IgG son digeridas enzimáticamente, se obtienen diferentes fragmentos, dependiendo la enzima que se empleó, es decir si se utiliza papaína, se obtienen tres fragmentos, el fragmento cristalizable (Fe) y dos fragmentos de unión a antígeno (Fab) y si se empleó pepsina, se obtienen un fragmento F(ab)2, mientras que el fragmento cristalizable es digerido. Lo anterior se debe a que la papaína corta las cadenas pesadas inmediatamente después (hacia la región amino terminal) de la bisagra, mientras que la pepsina lo hace antes (hacia la región carboxi terminal) de la bisagra. Los Fab y F(ab)2 son los fragmentos que conservan la capacidad de unir específicamente el antígeno que los originó y los F(ab)2 además, lo precipitan, mientras que la fracción Fe de los anticuerpos normalmente actúa como un marcador señal para macrófagos y la activación de linfocitos para que reconozcan y fagociten al complejo antígeno-anticuerpo. Por otro lado, el fragmento Fe comprende los determinantes antigénicos del anticuerpo de tal forma que, al administrarle a un paciente anticuerpos enteros generados en algún animal de otra especie, el paciente genera una respuesta inmune en contra de esos determinantes antigénicos dando origen a variadas .respuestas secundarias adversas que pueden incluir hasta un choque anafiláctico. Estos problemas se reducen significativamente al digerir previamente los anticuerpos ya sea con papaína o pepsina y al administrar solamente los fragmentos Fab o F(ab)2 purificados resultantes.
El uso de fragmentos Fab o F(ab)2 encuentra otra ventaja en lo que se conoce como concepto de volumen de distribución, que no es sino el volumen del cuerpo en el que una determinada droga es disuelta, este volumen puede referirse solo a la sangre circulante como en el caso de las IgG o incluir una mayor parte del agua corporal para el caso de los fragmentos. Por ello, los Fab y F(ab)2 por tener un mayor volumen corporal pueden acceder a neutralizar toxinas alojadas en diversos tejidos, no solo en la sangre, e incluso pueden atravesar la barrera hematoencefálica en ambos sentidos y pueden ser utilizados para neutralizar o eliminar neurotoxinas.
Particularmente, el uso de los F(ab)2 tiene una ventaja sobre los Fab que consiste en que tienen un mayor tiempo de retención en el organismo pues tienen un peso molecular del doble, además de que conservan la capacidad para precipitar al antígeno en condiciones fisiológicas, y aún conservan un tamaño que les permite acceder a un volumen de distribución suficiente para fines de tratamiento.
Al conservar los fragmentos F(ab)2 las principales características de los anticuerpos, las aplicaciones que tienen estos últimos se extienden a los primeros, con la ventaja adicional de que al carecer del fragmento Fe, el reconocimiento como ajenos por parte del organismo del paciente al que se le administran es menor, teniendo una mayor tolerancia a su aplicación y reduciéndose la posibilidad de reacciones secundarias, lo que resulta particularmente útil para tratamientos prolongados tales como los que se aplican en las enfermedades autoinmunes.
Desde hace ya muchos años es bien sabido que las proteínas solubles (particularmente las proteínas séricas) pierden su solubilidad conforme aumenta la concentración de sales neutras (como los sulfatos de amonio y sodio) en la solución. De este modo, por ejemplo la euglobulina precipita con sulfato de sodio al 13.5%, la seudoglobulina lo hace al 17.4% y la seudoglobulina2 al 21.3%. Este hecho ha sido aprovechado para purificar parcialmente anticuerpos a partir de suero o plasma. En la literatura se han reportado varios enfoques de producción de anticuerpos y sus fragmentos. Por ejemplo, en la patente estadounidense 4,849,352 Sullivan et. al. Reivindica la producción tanto de fragmentos Fab mediante la digestión de anticuerpos con papaína inmovilizada en poliacrilamida como la de fragmentos F(ab)2 mediante la digestión de anticuerpos con pepsina inmovilizada, obteniendo fragmentos Fab y Fe o F(ab)2, purificando posteriormente los fragmentos por inmunoafinidad, haciéndolos pasar por una matriz de poliacrilamida que contiene al antígeno específico de los anticuerpos en cuestión, recuperando después los fragmentos Fab o F(ab)2 unidos específicamente a las moléculas en la matriz, con alguna solución fuertemente iónica. No obstante la pureza con que se obtienen los fragmentos en cuestión, para una producción comercial a gran escala de preparaciones de fragmentos de anticuerpos, podría resultar sumamente caro tanto el uso de enzimas inmovilizadas para la digestión como de antígenos inmovilizados para la purificación.
Por otro lado, a pesar de su utilidad para producir fragmentos de anticuerpos generados contra sustancias puras, cuando se trata de anticuerpos generados contra venenos, que son mezclas de gran cantidad de toxinas, muchas de ellas con efecto biológico, resulta muy difícil y particularmente poco_ costeable el obtener la matriz antigénica para la purificación.
Otro enfoque es el que se muestra en la patente estadounidense 5,733,742 en la que
Landon reivindica un proceso para producir fragmentos Fab a partir de Sangre completa en un medio estéril, en donde pone en contacto la sangre completa directamente con la enzima preferentemente purificada, ya sea libre o inmovilizada, removiendo posteriormente los residuos celulares por centrifugación, separando y recuperando los fragmentos resultantes, para posteriormente purificarlos, preferentemente por inmunoafinidad. Nuevamente, la aplicación en la que se basa Landon es con antígenos purificados los cuales, a diferencia de los venenos, fácilmente se pueden ligar a soportes para obtener una matriz para la purificación de los Fab de interés, y nunca utiliza o discute el método para obtener fragmentos Fab contra antígenos que son mezclas de muchas sustancias, como lo son los venenos, además de que solamente trabaja con papaína y quimopapaína y no discute la posibilidad de usar pepsina.
Un enfoque adicional de producción de fragmentos Fab es el de la patente estadounidense 4,814,433 en la que Fredrickson expone un procedimiento para obtener Fab libres de papaína, pues observa que al digerir los anticuerpos con esta enzima, permanecen como contaminantes en la solución compuestos híbridos de la papaína unida por puentes de disulfuro con alguno de los fragmentos resultantes de la digestión, de los que posteriormente la papaína puede continuar digiriendo y degradando los fragmentos obtenidos, Para resolver el problema, utiliza anticuerpos anti papaína, que capturan los compuestos híbridos de la enzima. Posteriormente purifica los fragmentos pasando la solución por una columna con proteína A en donde quedan retenidos los fragmentos Fe y los compuestos híbridos. Este problema que se presenta en la digestión con papaína, no ha sido reportado que se presente con la digestión con pepsina.
Por otro-lado, algunos métodos tradicionales involucran la digestión con pepsina y la precipitación de la fracción de los fragmentos con sulfatos de amonio o de sodio pero suele manejarse primero una pre-separación de los anticuerpos por precipitación con sulfato y luego la digestión de la fracción de anticuerpos. Sin embargo se ha reportado grandes pérdidas de la actividad biológica en los fragmentos resultantes y un alto contenido de anticuerpos intactos y otros contaminantes.
Como se desprende de los antecedentes, aunque existen varios métodos para la producción de fragmentos Fab de anticuerpos, los venenos completos son difíciles de aplicarse como inmunógenos. Además, la ventaja de usarse fragmentos F(ab)2 en este caso queda claro puesto que cuentan con un tiempo de retención mayor que los Fab y sí precipitan las toxinas neutralizadas. Adicionalmente, los informes de la producción de los fragmentos F(ab)2 mediante digestión con pepsina han evidenciado una considerable pérdida de actividad biológica y un alto contenido de anticuerpos enteros y otras impurezas, desalentando la producción comercial de los productos farmacéuticos que comprenden este tipo de fragmentos. RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención está relacionada con una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que se encuentran preferentemente libres de albúmina y de anticuerpos completos y también sustancialmente libres de pirógenos. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos en una cantidad efectiva de un acarreador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto más de la invención, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que neutraliza o elimina las toxinas en tejidos y sangre.
Otro aspecto de la invención está relacionado con una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que neutraliza una mezcla compleja de moléculas antigénicas como el veneno de animales ponzoñosos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos utilizando el suero o plasma de sangre de un mamífero previamente inmunizado, como fuente de anticuerpos. El suero o plasma de sangre se digiere con una enzima, pepsina, y posteriormente se separa y purifica hasta que la composición farmacéutica de los fragmentos F(ab)2 quede libre de albúmina y anticuerpos completos y sustancialmente libre de pirógenos.
Otros aspectos de la presente invención serán obvios para las personas de habilidades ordinarias al considerar la presente divulgación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Estructura general de un Anticuerpo. H representa una cadena pesada. L representa una cadena ligera. C representa una región constante en cadenas pesadas o ligeras y V representa una región variable en cadenas pesadas o ligeras y HiR representa la región bisagra. Figura 2. Diagrama de la producción de F(ab)2. En la figura se esquematizan las principales etapas de la presente invención para la producción de fragmentos F(ab)2. Los bloques I a XIII representan: Mezcla de plasmas sanguíneos hiperinmunes (I); Digestión del plasma (II); Precipitación de fragmentos de proteínas no deseados (III); Clarificación de la solución de F(ab)2 (IV); Desechos que contienen el precipitado de fragmentos de proteína no deseado (V); Solución de F(ab)2 parcialmente purificada (VI); Precipitación de F(ab)2 a partir de la solución (VII); Centrifugación (VIII); Desechos que contienen componentes moleculares bajos y sales (IX); Diálisis o ultrafiltr ación (X); Filtración estéril y formulación (XI); Liofilización (XII); Producto final (XIII).
Figura 3. Estructura general de un fragmento F(ab)2.
H representa un fragmento de cadena pesada. L representa una cadena ligera. C representa una región constante que se puede encontrar en un fragmento de cadena pesada o de cadena ligera y V representa una región variable en un fragmento de cadena pesada o en una cadena ligera y HiR representa la región bisagra.
Figura 4. Electroforesis de las diferentes etapas del proceso para la obtención de F(ab)2 contra el veneno polivalente de alacrán. Los carriles 1 y, 9 corresponden a marcadores de peso molecular: Miosina (205 Kd), β-galactosidasa (121 Kd), Suero de albúmina bovina (70 Kd), Ovoalbúmina (52.4 Kd), Anhidrasa carbónica (34.9 Kd), Inihibidor de Tripsina de la Soya (29.1 Kd), Lisosima (20.7 Kd), y Aprotinina (6.9 Kd); Los carriles 3 a 8 representan: plasma de sangre, plasma digerido, la mezcla procedente de la primera precipitación, filtrado, desechos y la mezcla de la segunda precipitación y carriles 11 a 16 representan: la pasta del precipitado, diálisis, desechos, F(ab)2 crudo (concentrado), solución de F(ab)2 formulada estéril y el producto final. Los geles 1 y 2 están bajo condiciones de no reducción y los geles 3 y 4 se encuentran bajo condiciones de reducción.
Figura 5. Electroforesis de diferentes lotes de fragmentos F(ab)2 contra el veneno de la araña viuda negra. Carril 1 corresponde a marcadores de peso molecular: Miosina (205 Kd), β-galactosidasa (121 Kd), Suero de albúmina bovina (70 Kd), Ovoalbúmina (52.4 Kd), Anhidrasa carbónica (34.9 Kd), Inihibidor de Tripsina de la Soya (29.1 Kd), Lisosima (20.7 Kd), y Aprotinina (6.9 Kd); los carriles 2 a 7 son diferentes lotes de fragmentos F(ab)2 contra el veneno de la araña viuda negra. Figura 6. Electroforesis de diferentes lotes de fragmentos F(ab)2 contra el veneno de la serpiente coral. El carril 1 corresponde a marcadores de peso molecular: Miosina (205 Kd), β-galactosidasa (121 Kd), Suero de albúmina bovina (70 Kd), Ovoalbúmina (52.4 Kd)„ Anhidrasa carbónica (34.9 Kd), Inihibidor de Tripsina de la Soya (29.1 Kd), Lisosima (20.7 Kd), y Aprotinina (6.9 Kd); los carriles 2 a 5 son diferentes lotes de fragmentos F(ab)2 contra el veneno de la serpiente coral.
Figura 7. Electroforesis de diferentes lotes de fragmentos F(ab)2 contra el veneno de las serpientes de los géneros Bothrops, Crotalus Lachesis; mientras el carril 10 corresponde a los marcadores de peso molecular: Miosina (205 Kd), β-galactosidasa (121 Kd), Suero de albúmina bovina (70 Kd), Ovoalbúmina (52.4 Kd), Anhidrasa carbónica (34.9 Kd), Inihibidor de Tripsina de la Soya (29.1 Kd), Lisosima (20.7 Kd), y Aprotinina (6.9 Kd).
Figura 8. Electroforesis de las diferentes etapas del proceso para la obtención de F(ab)2 contra las citocinas. El carril 1 corresponde a los marcadores de peso molecular: Miosina (205 Kd), β-galactosidasa (121 Kd), Suero de albúmina bovina (70 Kd), Ovoalbúmina (52.4 Kd), Anhidrasa carbónica (34.9 Kd), Inihibidor de Tripsina de la Soya (29.1 Kd), Lisosima (20.7 Kd), y Aprotinina (6.9 Kd); el carril 2 está vacío y los carriles 3 a 8 contienen plasma de sangre, plasma digerido, filtrado, desechos del filtrado, pasta obtenida a partir de la centrifugación y concentrado después de la diálisis. Los geles 1 y 2 corresponden a F(ab)2 anti-αTNF bajo condiciones de reducción y no reducción. Los geles 3 y 4 corresponden a F(ab)2 anti interferón-γ bajo condiciones de reducción y no reducción.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El glosario que se presenta a continuación es proporcionado como una ayuda para entender ciertos términos que vienen incluidos en el presente documento. La explicación que se proporciona en el glosario es para propósitos ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.
El término "sustancialmente libre" refiere a la ausencia de pirógeno y material proteico ajeno a F(ab)2 tal como albúmina o anticuerpos completos de acuerdo con las normas de la Farmacopea Mexicana. El término "condiciones asépticas" refiere a las medidas o métodos de precaución utilizados en el manejo de los diferentes productos de cada etapa del método de la presente invención para impedir la contaminación del cultivo o medio estéril e infección por parte de microorganismos extraños.
El término "cantidad efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" de un compuesto en dosis unitaria de la composición depende de un número de factores. Entre estos se encuentra la cantidad de los otros ingredientes utilizados, tolerancia del ingrediente activo de la composición. La cantidad efectiva del ingrediente activo oscila de cerca del 8% a alrededor del 35% por peso basada en el peso total de la composición. La cantidad de la preparación de F(ab)2 con la que se llenará cada frasco varía según la especie de la cual se preparó el veneno. Para composiciones antialacranes, la preparación de F(ab) con la que se llenará cada frasco es la cantidad necesaria para neutralizar de alrededor de 135 a cerca de 220 dosis letales medias del veneno. Para composiciones contra la araña viuda negra, la cantidad necesaria para neutralizar de alrededor de 540 hasta unas 880 dosis letales medias del veneno. Para composiciones anticoral, la cantidad necesaria para neutralizar de unas 360 a unas 660 dosis letales medias del veneno. En el caso de composiciones contra Bothrops y Crotalus, se llenan los frascos con la cantidad necesaria para neutralizar de unas 700 a unas 1100 dosis letales medias del veneno.
Con "acarreador farmacéuticamente aceptable" se entiende un excipiente sólido o líquido, diluyente o sustancia la que se puede utilizar con seguridad en la administración sistémica o tópica. Dependiendo de la ruta particular de administración, una variedad de acarreadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el estado del arte incluye excipientes sólidos o líquidos, diluyentes, hidrotopos, agentes activos de superficie, y sustancias encapsuladoras. La cantidad del acarreador que se emplea en conjunción con los fragmentos F(ab)2 para proporcionar la cantidad práctica de material por dosis unitaria de la composición.
Los acarreadores aceptables para la administración sistémica que se pueden incorporar en la composición de la invención incluyen azúcar, almidones, celulosa, aceites vegetales, buffers, polioles y ácido algínico. Los acarreadores específicos farmacéuticamente aceptables se describen en los siguientes documentos, todos los cuales se encuentran incorporados por referencia al presente: patente estadounidense 4,401,663 Buckwalter et al. emitida el 30 de agosto de 1983; Solicitud de Patente Europea Núm. 089710, LaHann et al., publicada el 28 de septiembre de 1983; y Solicitud de Patente Europea Núm. 0068592, Buckwalter et al., publicada el 5 de enero de 1983. Los acarreadores preferidos para la administración parenteral incluyen propilen glicol, pirrolidol, oleato etílico, etanol acuoso y combinaciones de lo anterior.
Los acarreadores representativos incluyen la acacia, agar, alginatos, hidroxialquilcelulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, carboximetilcelulosa, carragenina, celulosa en polvo, goma guar, colesterol, gelatina, goma de agar, goma arábica, goma de karaya, goma de ghatti, goma de algarroba, octoxinot 9, alcohol olílico, pectina, ácido poliacrílico y sus homólogos, polietilenglicol, alcohol polivinílico, poliacrilamida, lauriil sulfato de sodio, óxido de polietileno, polivinilpirrolidona, monoestearato de glicol, monoestearato de propilen glicol, goma xantana, tragacanto, esteres de sorbitan, alcohol estearílico, almidón y sus modificaciones Los rangos apropiados varían de alrededor del 0.5% a alrededor del 1%.
Acorde con lo anterior, la presente invención está relacionada con una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos libres de albúmina y de anticuerpos completos y sustancialmente libres de pirógenos. Los anticuerpos de donde se obtienen los fragmentos pueden ser generados contra moléculas purificadas, es decir, libres de otras moléculas antigénicas. Ejemplos de moléculas purificadas incluyen las citocinas, particularmente -TNF e interferón- γ u otras drogas farmacéuticas y similares. Los anticuerpos a partir de los cuales se obtienen los fragmentos también pueden generarse contra mezclas complejas de moléculas inmunogénicas tales como los venenos de animales ponzoñosos que son mezclas complejas de péptidos y toxinas, e inclusive una mezcla de los venenos de varias especias. Particularmente la composición farmacéutica de la presente invención ha sido obtenida exitosamente a partir de anticuerpos generados contra las citocinas α-TNF e interferón- γ, contra el veneno total de la araña viuda negra (Lairodectus mactans), el veneno total de la serpiente coral (Micrurus nigi-oscinctus), contra los venenos de serpientes de los géneros Bolhrops, Crotalus, Agkistrodon, Lachesis y Sis/ruriis y contra una mezcla de venenos (veneo polivalente) de alacranes, particularmente Cenfruroides noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus y C. suffussus .suffussus. La composición farmacéutica de la presente invención comprende fragmentos F(ab)2 cuya estructura general se presenta en la figura 3 y que carecen de la región Fe y al estar libre de albúmina y de anticuerpos completos carecen de determinantes antigénicos, mediante los cuales el organismo del paciente los reconocería como ajenos. De esta manera, se puede administrar la composición farmacéutica de esta invención en más de una ocasión, reduciéndose drásticamente la posibilidad de alguna respuesta secundaria. Normalmente la administración es sistémica, sea intramuscular o intravenosa. La cantidad varía de acuerdo con las características del sujeto a quien se aplica la sustancia, la especie que le mordió o picó y el grado de administración. Por ejemplo, para alacranes o arañas viuda negra, se emplean de 1 o 3 frascos aproximadamente, mientras se utilizan de 1 a 10 frascos en el caso de mordida de serpientes.
Asimismo, la presente invención está dirigida a un método para la producción de fragmentos F(ab)2 sustancialmente libres de albúmina, de anticuerpos completos y de pirógenos, a partir de una fuente de anticuerpos tal como el suero, plasma o sangre de algún animal, el cual ha sido sometido a un esquema de inmunización con un inmunógeno, estimulando la generación de anticuerpos específicos contra el inmunógeno.
La obtención de una fuente de anticuerpos de buena calidad, es decir con un elevado título de anticuerpos de alta especificidad contra el inmunógeno y con una alta representatividad de los diferentes posibles anticuerpos que pueden reconocer los diversos determinantes antigénicos del inmunógeno, resulta de gran ayuda para obtener fragmentos F(ab)2 de anticuerpos, sustancialmente libres de pirógenos y de material proteico ajeno a dichos fragmentos.
Preferentemente, el material de partida, es decir la fuente de anticuerpos, debe provenir de varios animales para contar con un universo mayor de diferentes anticuerpos específicos contra los diferentes epítopes del inmunógeno. La fuente de anticuerpos puede ser sangre, suero o preferentemente plasma.
Con la finalidad de obtener un producto sustancialmente libre de pirógenos, durante todo el proceso se deben manejar condiciones muy rigurosas de asepsia, aunque no es necesario que se tenga un sistema cerrado estéril durante todo el proceso como lo establece Landon en la patente estadounidense 5,733,742.
El primer paso del método es la digestión del material proteico contenido en la fuente de anticuerpos, aunque opcionalmente se recomienda diluir la fuente de anticuerpos, especialmente cuando se trata de plasma. Para ello se baja el pH a alrededor de 3.2 + 0.2 y se adicionan cantidades suficientes de la enzima pepsina (de unos 0.5 a 1 g/1 según la actividad enzimática) y se incuba con agitación el tiempo necesario para lograr un alto grado de hidrólisis (cercano al 100% de anticuerpos hidrolizados) a una temperatura cercana a los 20 grados centígrados.
A continuación se lleva a cabo una precipitación adicionando sulfato de amonio en una proporción de entre 16 y alrededor del 22% (P/V), preferentemente cerca del 21%, incubando la mezcla por 30 minutos a una temperatura alrededor de 55 + 4 grados centígrados. Posteriormente se deja enfriar y reposar la mezcla a una temperatura de entre 8 y 12 grados centígrados por un tiempo de al menos 2 hr. Este período de reposo resulta de gran importancia en la formación de partículas de mayor tamaño lo que repercute en una mayor eficiencia de precipitación, además de que absorben otras impurezas de menor tamaño que de otro modo no precipitarían. En este paso se precipitan gran parte de las proteínas serosas tales como la albúmina y fibrinógeno y se precipitan los grandes fragmentos producto de su digestión, mientras que en la solución permanecen los fragmentos F(ab)2 producto de la digestión de los anticuerpos.
El siguiente paso consiste en clarificar la solución eliminando hasta las partículas más pequeñas formadas durante la precipitación. Para tal fin se sugiere el uso de filtros de platos de 12, 8 y 4 y opcionalmente 0.22μm para reducir la posible presencia de pirógenos.
En el sobrenadante recuperado se encuentran los fragmentos F(ab)2 y algunos péptidos solubles producto de la degradación de la albúmina y fibrinógeno.
El sobrenadante del paso anterior es sometido a una nueva precipitación mediante la adición de sulfato de amonio en una proporción de entre 32 y 38%, preferentemente de alrededor del 35% Peso/Nolumen a un pH de 6.8 ± 0.5. Nuevamente es importante dar un período de reposo lo mayor posible, en refrigeración, al menos unas 12 horas idealmente, con lo que se obtienen partículas de mayor tamaño con una mayor eficiencia de precipitación. En el sobrenadante permanecen en forma soluble las sales y algunos componentes de bajo peso molecular que no precipitan a las condiciones que se manejaron en los pasos anteriores.
A fin de separar las partículas del sobrenadante, es recomendable centrifugar la suspensión formada a unas 10,000 y 15,000 rpm, recuperándose una pasta de fragmentos F(ab)2 precipitados.
A efecto de purificar los fragmentos F(ab)2 producidos y aislados, es necesario remover las sales y componentes de bajo peso molecular que hayan sido capturados en la precipitación. Para ello, la pasta de cristales se puede someter a diálisis o alternativamente a ultrafiltración, en ambos casos el tamaño del poro de la membrana debe tener un tamaño tal que permita el paso de las sales y los componentes de bajo peso molecular y no de los fragmentos F(ab)2, los cuales al disminuir la concentración de sales vuelven a solubilizarse.
Para garantizar que el producto final esté sustancialmente libre de pirógenos, la solución formada en el paso anterior se hace pasar por un filtro estéril y posteriormente es formulado con excipientes farmacéuticamente aceptables para inyectables. Se puede emplear polivinilpirrolidona, manitol o dextrosa. También se pueden utilizar osmolitos (como glicerol), estabilizantes como sacarosa, y algunas sales como NaCl con el fin de lograr isotonía en la solución por administrarse, dosificando el producto de forma que cada dosis (vial) contenga la potencia adecuada.
Posteriormente, el producto es üofiíizado, y los viales que lo contienen son sellados herméticamente. De este modo se obtiene un producto fácilmente soluble (el contenido de un frasco en 5 mi en menos de 1 minuto), sustancialmente libre de pirógenos de acuerdo con la Farmacopea y de material proteico ajeno a los F(ab)2 (0% albúmina, 0% anticuerpos completos).
METODOLOGÍA Prueba de Pirógenos Se realizó la prueba de acuerdo con la Prueba de Pirógenos 071 1 de la Farmacopea de México MGA.
Ensayo Biológico de Potencia Se realizó el ensayo de acuerdo con 050 de la Farmacopea de México MPB.
Potencia de sueros antivenenos.
Electroforesis SDS
Se realizó la electroforesis utilizando geles de acrilamida al 10%) en condiciones de reducción y de no reducción. La concentración proteica de cada muestra fue estandarizada a 18 μg por carril. Se revelaron con azul brillante de comassie R-250.
Solubilidad
Se realizó la solubilidad adicionando 5 mi de agua bidestilada a cada frasco, agitando vigorosamente y observando la solubilidad del contenido del frasco después de menos de un minuto contra la luz.
Determinación de las Dosis Letales 50%
Con el fin de determinar las dosis letales 50% de cada venenoutilizado, se prepararon ocho diluciones seriales (1 :3) de cada veneno en una solución salina.
Posteriormente, se inyectaron intraperitonealmente con 100 μ l de las diluciones a ocho grupos de 5 ratones (Balb/c) de un peso promedio de 15g, un grupo por cada dilución de cada veneno. Se leyó la mortalidad de los ratones después de 24 horas.
Se ajustaron mediante una regresión no lineal con software GraphPad PR1SM
(GraphPad Software Inc., San Diego, CA) los datos experimentales del porcentaje de la mortalidad vs. el logaritmo de las dosis del veneno y se calcularon las Dosis Letales 50% (LD50) por cada veneno como la dosis en la que murió el 50% de los ratones administrados con tal dosis.
Procedimiento ELISA para la determinación del título del antiveneno.
1. Se reconstituyeron los venenos liofilizados en un buffer carbonato de sodio 0.1M pH9.5 a una concentración de 5 μg/ml. 2. Se revistieron 96 pozos de ELISA mediante la adición de 100 μl de veneno por pozo y se incubaron durante la noche a 4°C.
3. Se lavaron los pozos tres veces con 200 μl/pozo de solución de lavado (Tris HCl 50 mM pH8.0, NaCl 0.150 mM, Tween 20 al 0.05%). 4. Se bloquearon las uniones inespecíficas con solución de bloqueo (Tris/HCl 50 mM pH8.0, gelatina al 0.5%, Tween 20 al 0.2%) durante 2 horas a temperatura ambiental.
5. Se prepararon in situ diluciones seriales de antiveneno con material inicial de 1 : 10, buffer de reacción (Tris(HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, 0.1 mg/ml gelatina, Tween 20 al 0.05%).
6. De esta forma, se agregaron a cada pozo 100 μl de la solución de reacción (diluciones) y se mezclaron 50 μl de la solución antiveneno y posteriormente se transfirieron 50 μl de la dilución al siguiente pozo y así sucesivamente hasta llegar al pozo 10, y se incubaron durante una hora a temperatura ambiental. 7. Nuevamente, se lavaron los pozos tres veces con 200 μl/pozo de solución de lavado. 8. Se agregó un segundo anticuerpo contra caballo lo cual se conjugó a la enzima peroxidasa diluida 1 :2500 en buffer de reacción y se incubó a temperatura ambiental durante una hora. 9. Se reveló la reacción agregando 100 μl/pozo del sustrato cromogénico ABTS e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiental.
10. Se detuvo la reacción agregando 25 μl/pozo de ácido hidrofluórico concentrado.
11. Se leyó la absorbancia a 405 nm con un lector de ELISA.
EJEMPLOS
A fin de ilustrar mejor las composiciones farmacéuticas y el método de la presente invención para la producción de fragmentos F(ab)2 de anticuerpos, se proporcionan los siguiente ejemplos específicos para ayudar mejor al lector en los diversos aspectos de la práctica de la presente invención. Dado que estos ejemplos específicos son simplemente ilustrativos, en ningún caso deberá considerarse las siguientes descripciones como limitantes al alcance de la presente invención:
EJEMPLO 1. Desarrollo de una fuente adecuada de anticuerpos. A fin de contar con una fuente de anticuerpos adecuada, se debe buscar tener los siguientes requisitos: a) un título alto de anticuerpos, lo que implica una alta concentración de los mismos y que un alto porcentaje de éstos sea específico contra el antígeno en cuestión y b) una población de anticuerpos de amplio espectro, es decir contra los diferentes epítopes de cada una de las moléculas que componen al antígeno, esto resulta particularmente relevante para el caso de venenos.
Para lograr un título alto es necesario seguir las siguientes recomendaciones:
Preparar y formular (conjugaciones, uso de adyuvantes) adecuadamente los antígenos para maximizar su capacidad inmunogénica.
Aplicar esquemas de inmunización capaces de activar eficientemente el sistema inmune del animal.
Determinar en cada grupo de animales el momento en el que alcanzan cada etapa de la curva de respuesta inmune (donde alcanzan el pico y meseta principalmente). Esto se puede llevar a cabo mediante ensayos de neutralización.
Mantener una selección de animales altamente productores con cuidados especiales para prolongar su tiempo de vida media en la producción de anticuerpos.
Para lograr una población de anticuerpos de amplio espectro, es recomendable usar una mezcla de la sangre, plasma o suero de los diferentes animales.
Se siguieron esquemas de inmunización como los recomendados en la literatura con dosis de venenos que variaban de 3 a 150 DL5 por caballo durante 12 inmunizaciones, administradas durante un periodo de 5 a 6 semanas en el caso de los esquemas base, y de 70 a 450 DL50 por caballo mediante 5 inmunizaciones durante 3 semanas para los esquemas de refuerzo, de acuerdo con el tipo de veneno administrado. Se utilizaron los adyuvantes Completo e Incompleto de Freund así como una solución salina isotónica, utilizando un total de 5, 10 o 20 mi en las diferentes inoculaciones.
La fuente de anticuerpos empleada en la presente invención fue obtenida mediante la aplicación de sangrías a los animales, a razón de 6 a 10 litros por cada caballo por cada sangría, y dos sangrías durante los 15 días posteriores a la última inoculación de cada esquema.
La fuente de anticuerpos para el método de la presente invención, puede ser la mezcla de la sangre de los diferentes animales inmunizados con un mismo antígeno, o bien el suero resultante de su coagulación, o preferentemente el plasma resultante de la separación por sedimentación del paquete celular. El uso particularmente de plasma tiene la ventaja en producción a gran escala, de que el paquete celular puede ser lavado y suspendido en solución fisiológica y retroalimentado al animal del que se obtuvo, reduciendo así el estrés asociado a la baja de células sanguíneas, impactando lo menor posible la producción de anticuerpos.
De esta manera, las fuentes de anticuerpos fueron producidas contra el veneno del: alacrán (un veneno polivalente que es una mezcla de los venenos de los alacranes Centruriodes noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus y C. suffussus suffussus); de la araña viuda negra (Latrodectus mactans); las serpientes coral (Micrurus nigroscienctus); y serpientes de los géneros Bothrop, Crotalus y Lachesis, particularmente la serpiente cascabel (Crotalus durissus durissus), la cascabel muda (Lachesis muta stenophry) y la nauyaca (Bothrops asper).
EJEMPLO 2. Aplicación del método de la presente invención para la producción de antiveneno contra el veneno de alacrán
Se obtuvo una fuente de anticuerpos como se menciona en el ejemplo 1, utilizándose como antígeno en este caso veneno polivalente de alacrán (Centruroid.es noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus y C. suffussus suffussus), obteniendo plasma sanguíneo como fuente de anticuerpos. Se mezcló plasma de diferentes animales inmunizados contra el mismo veneno polivalente.
El plasma se diluyó 1 :2 con agua despirogenizada (osmosis inversa, esterilizada y filtrada por 0.22μm) y se le ajustó el pH alrededor de 3.2. Para la digestión, se le adicionó pepsina (filtrada por 0.22μm) hasta tener casi 390,000 unidades por litro y se dejó reaccionar a una temperatura cercana a los 20 grados Centígrados, durante 1 hora con agitación a intervalos de unos 15 minutos.
Una vez completada la reacción, la mezcla fue calentada a unos 54 grados centígrados y le adicionó sulfato de amonio en una proporción de 21% (peso/volumen) y se dejó reposar por 30 min. Posteriormente se refrigeró entre 4 y 8 grados centígrados por un espacio de unas 2 horas (pero se puede almacenar hasta 24hr.). Se recuperó el sobrenadante por decantación y se clarificó pasándolo por filtros de platos de 12, 8 y 4 μm.
Al sobrenadante clarificado se le adicionó nuevamente sulfato de amonio en una proporción de 35% (peso/volumen), previo ajuste del pH a aproximadamente 6.8. Se dejó reposar durante 12 hrs. Posteriormente la mezcla fue centrifugada a unas 15,000 rpm en una centrífuga tipo Sharples. La pasta recuperada contiene a los fragmentos F(ab)2. La pasta fue sometida a un proceso de diálisis en celofán, entre 4 y 12 grados centígrados por espacio de 8 a 10 días. La solución resultante contuvo fragmentos F(ab)2 específicos contra el veneno de alacrán sustancialmente pura y libre de pirógenos.
Posteriormente, la parte soluble de aquella fracción que no solubilizó fue separada y formulada mediante la adición de sacarosa, NaCl y glicerol, ajusfando el pH a alrededor de 6.8 y se dosificó de acuerdo con la potencia determinada en frascos libres de pirógenos mismos que se liofilizarán posteriormente.
Se realizaron pruebas de pureza por Electroforesis de las diferentes etapas del proceso y HPLC con los resultados que se muestran en la figura 4 en la que se ve claramente que los fragmentos F(ab)2 resultantes tienen un peso molecular de aproximadamente 100,000 a 110,000 daltones (condiciones no reductoras), mientras bajo condiciones reductoras, están presentes como bandas de 25,000 a 30,000 daltones. Asimismo se realizaron pruebas de potencia mostrando que la composición farmacéutica de los fragmentos F(ab)2 obtenidos neutralizan efectivamente el veneno polivalente de alacrán. Los contenidos de todos los frascos incluidos en el muestreo fueron solubles en 5 mi de agua bidestilada en menos de 1 minuto. EJEMPLO 3. Aplicación del método de la presente invención para la producción de antiveneno contra veneno de la araña viuda negra.
Posteriormente se obtuvo una fuente de anticuerpos de acuerdo a la descripción del Ejemplo 1, utilizando el veneno de la araña viuda negra (L. Mactans) y se escogió plasma como fuente de anticuerpos. El plasma obtenido fue procesado de la misma manera que en el Ejemplo 2.
La figura 5 muestra el gel de electroforesis en diferentes etapas del proceso donde se ve claramente que los fragmentos F(ab)2 resultantes tienen un peso molecular de aproximadamente 100,000 a 110,000 daltones (condiciones no reductoras), mientras bajo condiciones reductoras están presentes como bandas de 25,000 a 30,000 daltones. La prueba de potencia mostró que la composición farmacéutica que comprende los fragmentos F(ab)2 obtenidos, neutraliza efectivamente el veneno de la araña viuda negra. Los contenidos de todos los frascos incluidos en el muestreo fueron solubles en 5 mi de agua bidestilada en menos de 1 minuto.
EJEMPLO 4. Aplicación del método de la presente invención para la producción de antiveneno contra el veneno de serpientes coral.
Posteriormente se obtuvo una fuente de anticuerpos de acuerdo a la descripción del Ejemplo 1, utilizando el veneno de la serpiente coral (M. nigrosinctus) y se escogió plasma como fuente de anticuerpos. El plasma obtenido fue procesado de la misma manera que en el Ejemplo 2.
La figura 6 muestra el gel de electroforesis en diferentes etapas del proceso donde se ve claramente que los fragmentos F(ab)2 resultantes tienen un peso molecular de aproximadamente 100,000 a 110,000 daltones (condiciones no reductoras), mientras bajo condiciones reductoras están presentes como bandas de 25,000 a 30,000 daltones. La prueba de potencia mostró que la composición farmacéutica que comprende los fragmentos F(ab)2 obtenidos, neutraliza efectivamente el veneno de la serpiente coral. Los contenidos de todos los frascos incluidos en el muestreo fueron solubles en 5 mi de agua bidestilada en menos de 1 minuto. Utilizando plasma de sangre obtenido de cabras inmunizadas con una citosina (tanto α-TNF como interferón-γ, por separado) como fuente de anticuerpos, se siguieron los mismos procedimientos que en el Ejemplo 2.
La figura 8 muestra el gel de electroforesis en diferentes etapas del proceso donde se ve claramente que los fragmentos F(ab)2 resultantes tienen un peso molecular de aproximadamente 100,000 a 1 10,000 daltones (condiciones no reductoras), mientras bajo condiciones reductoras están presentes como bandas de 25,000 a 30,000 daltones. La prueba de potencia mostró que la composición farmacéutica que comprende los fragmentos F(ab)2 obtenidos, neutraliza efectivamente las citocinas α-TNF e interferón-γ, respectivamente. Los contenidos de todos los frascos incluidos en el muestreo fueron solubles en 5 mi de agua bidestilada en menos de 1 minuto.
EJEMPLO 7. Reacciones inmunológicas cruzadas de la composición de los F(ab)2 contra Bothrops asper y Crotalus durissus (composición antiviperina) con el veneno de otras especies y géneros.
Para cada una de las especies de serpientes mencionadas a continuación, se incubaron durante 1 hora a 37°C, ocho cantidades diferentes de la composición antiviperina junto con una cantidad fija de veneno (equivalente a 5 LD50) y solución salina para fijar el volumen. Posteriormente, se inyectó intraperitonealmente con un volumen fijo de 700 μl a ocho grupos de 5 ratones (Balb/c) con un peso promedio de 15 g, un grupo por cada cantidad de la composición antiviperina. Se leyó la mortalidad de los ratones después de 24 horas.
Datos experimentales del porcentaje de mortalidad vs. el logaritmo del volumen agregado (de la composición antiviperina) fueron ajustados mediante una regresión no lineal con GraphPad PRISM software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) y se calcularon las Dosis Efectivas 50% (ED50) (definidas como la proporción antiveneno/veneno en la que la actividad letal se reduce a 50% en comparación con el efecto de la misma cantidad de veneno solo) para la composición antiviperina (antiveneno) contra cada uno de los venenos. La tabla 1 muestra las ED50 de la composición
21 antiviperina contra ocho especies de serpientes de 4 diferentes especies/ tres diferentes géneros.
TABLA 1. Dosis Efectivas 50% (ED50) expresadas como miligramos (mg), para 5 dosis letales 50% (LD50) del veneno de diferentes especies de serpientes.
Figure imgf000023_0001
Los resultados anteriores muestran que la composición antiviperina que contiene al menos dos F(ab)2 contra los géneros Bothrops y Crotalus neutraliza especies de los géneros Bothrops, Crotalus y Agkistrodon.
EJEMPLO 8. Determinación del título de la composición antiviperina contra 16 especies de serpiente por ELISA.
Se prepararon placas de ELISA con el veneno de 16 especies de serpiente, se reaccionaron con la composición antiviperina (contra el veneno de los géneros Bothrops y Crotalus), se desarrollaron y se leyeron a 405 nm. Se ajustaron los datos experimentales para la Absorbancia a 405 nm vs. el logaritmo del factor de dilución (de la composición antiviperina) mediante una regresión no lineal con GraphPad PRISM software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) y se calcularon los Títulos (definido como el factor de dilución en la cual se alcanza la mitad de la respuesta máxima) de la composición antiviperina contra cada veneno, mismos que se representan en la tabla 2.
TABLA 2. Títulos de la composición antiviperina contra varios especias de serpientes de cuatro géneros diferentes.
22
Figure imgf000024_0001
Los resultados demuestran que el F(ab)2 contenido en la composición antiviperina de la presente invención neutraliza venenos de serpientes de los géneros Bothrops, Crotalus, Lachesis y Agkistrodon.
Los anteriores ejemplos han sido proporcionados solamente por el propósito de ejemplificación y no tienen la intención de restringir el alcance o contenidos de la invención. La invención se describe con mayor detalle con referencia a las reivindicaciones que se presentan a continuación.
23

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para la preparación de fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que comprende los pasos de: a) Obtener plasma sanguíneo de los mamíferos inmunizados, en condiciones asépticas; b) Contactar el plasma obtenido con pepsina estéril para digerir los anticuerpos. c) Remover la albúmina, fibrinógeno y otras sustancias no deseables presentes en el plasma, o sus productos de digestión; d) Recuperar los fragmentos F(ab)2 resultantes, de la solución y opcionalmente; e) Purificar los fragmentos F(ab)2 así obtenidos.
2. El método de la reivindicación 1, donde paso (c) consiste en: a) Agregar entre alrededor del 16% y el 22% (P/V) de sulfato de amonio al plasma para precipitar la albúmina y fibrinógeno y sus fragmentos de digestión, a una temperatura de 55 + 4°C; b) Enfriar la solución a alrededor de 8 a 12°C durante dos horas por lo menos; c) Clarificar la solución y pasarla por filtros de 12, 8 y 4 μm
3. El método de la reivindicación 1 donde paso (d) consiste en: a) Agregar entre alrededor del 32% y 38% (P/V) de sulfato de amonio a la solución a un pH de alrededor de 6.8+0.2 para recuperar de la solución todos los fragmentos F(ab)2; b) Opcionalmente, centrifugar la suspensión resultante para eliminar el sobrenadante.
4. El método de la reivindicación 1, donde paso (e) consiste en eliminar las sales y componentes de bajo peso molecular mediante diálisis o ultrafiltración de los F(ab)2, permitiendo su disolución.
5. El método de la reivindicación 1, donde dichos pasos de contactar, remover, recuperar y purificar, son llevados a cabo en condiciones asépticas.
6. El método de la reivindicación 1, donde el F(ab)2 liga una molécula purificada.
24
7. El método de la reivindicación 6, donde la molécula purificada es una citosina.
8. El método de la reivindicación 7, donde la citosina es seleccionada del grupo que 5 consiste en el factor de necrosis de tumor alfa (α-TNF) e interferón- γ.
9. El método de la reivindicación 8, donde la citosina es interferón- γ.
10. El método de la reivindicación 8, donde la citosina es el factor de necrosis de tumor 10 alfa (α-TNF).
1 1. El método de la reivindicación 1 , donde los F(ab)2 obtenidos ligan y neutralizan una mezcla compleja de moléculas antigénicas.
15 12. El método de la reivindicación 11, donde la mezcla en el veneno de un animal ponzoñoso.
13. El método de la reivindicación 12, donde el veneno proviene de un animal ponzoñoso seleccionado del grupo que consiste en la araña viuda negra (Lactrodectus mactans),
20 serpiente coral (Micrurus nigi'osinclus), serpiente, alacrán y combinaciones de dichos venenos.
14. El método de la reivindicación 12, donde el veneno es de una serpiente coral (Micrurus nigrosinctus).
25
15. El método de la reivindicación 12, donde el veneno proviene de una araña viuda negra (Lactrodectus mactans).
16. El método de la reivindicación 12, donde el veneno proviene de alacranes 30 seleccionados del grupo que consiste de Centruroides noxius, C. linψidus, C. limpidus tecomanus, C. sirffussus suffussus y combinaciones de dichos venenos.
25
17. El método de la reivindicación 12, donde el veneno es de serpientes de un género seleccionado del grupo que consiste en Bothrops, Crotalus, Agkistrodon, Lachesis, Sistrurus y combinaciones de dichos venenos.
5 18. El método de la reivindicación 1, donde los fragmentos F(ab)2 de anticuerpos son libres de albúmina y anticuerpos completos, y sustancialmente libres de pirógenos.
19. Una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos policlonales libres de albúmina y de anticuerpos completos y sustancialmente libres de
10 pirógenos, y una cantidad efectiva de un acarreador farmacéuticamente aceptable, donde los F(ab)2 son obtenidos mediante el método la reivindicación 1.
20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, donde los F(ab) ligan una molécula purificada.
15
21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, donde la molécula purificada es una citocina.
22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, donde la citosina es seleccionada 20 de un grupo consistente de (α-TNF) e interferón- γ.
23. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, donde los F(ab)2 neutralizan y ligan una mezcla compleja de moléculas antigénicas.
25 24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, donde la mezcla es el veneno de un animal ponzoñoso.
25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, donde el veneno es de un animal ponzoñoso seleccionado del grupo que consiste en la araña viuda negra (Lactrodectus 30 mactans), serpiente coral (Micrurus nigi'osinctus), serpiente, alacrán y combinaciones de dichos venenos.
26
26. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, donde el veneno es de serpientes de un género seleccionado del grupo que consiste en Bothrops, Crotalus, Agkistrodon, Lachesis, Sistrurus y combinaciones de dichos venenos.
27. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, donde el veneno es de alacranes seleccionados del grupo que consiste en Centruruoid.es noxius, C. limpidus, C. limpidus tecomanus, C. suffussus suffussus y combinaciones de dichos venenos.
28. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, donde el veneno es de una serpiente coral (Micrurus nigrosinctus).
29. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, donde el veneno es de una araña viuda negra (Lactrodectus mactans).
27
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