WO2002077620A1 - Vorrichtung zur referenzierung von fluoreszenzsignalen - Google Patents

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WO2002077620A1
WO2002077620A1 PCT/EP2002/003140 EP0203140W WO02077620A1 WO 2002077620 A1 WO2002077620 A1 WO 2002077620A1 EP 0203140 W EP0203140 W EP 0203140W WO 02077620 A1 WO02077620 A1 WO 02077620A1
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fluorescence
polymer layers
areas
particularly preferably
fluorescent
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PCT/EP2002/003140
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Eugen Ermantraut
Thomas Kaiser
Jens Tuchscheerer
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Clondiag Chip Technologies Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/27—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using photo-electric detection ; circuits for computing concentration
    • G01N21/274—Calibration, base line adjustment, drift correction
    • G01N21/278—Constitution of standards

Definitions

  • the invention relates to a device which enables the comparison of the imaging properties and signal sensitivity of fluorescence detection systems and the test-specific referencing of fluorescence signals, and methods for their production.
  • Biomedical tests are often based on the detection of an interaction between a molecule or an affinity matrix, the identity or nature of which is known (probe), and an unknown molecule or unknown molecules to be detected (target or target molecule).
  • the probes if they are molecules, are often immobilized on supports in the form of a substance library in a known quantity and position.
  • Such devices are also called probe arrays or chips.
  • a probe array characteristically comprises several so-called array elements, which are the regions of a probe array in which a particular molecular probe is often immobilized in multiple copies. The sum of all occupied array elements thus forms the probe array.
  • the immobilization of molecular probes in the form of a substance library on probe arrays enables a sample containing the target molecules to be detected to be analyzed in parallel on several probes at the same time, which enables systematic analysis with high throughput with little time expenditure (high throughput screening , DJ Lockhart, EA Winzeler, Genomics, Gene Expression and DNA Arrays, Nature 2000, 405, 827-836).
  • the probes are usually immobilized in a predetermined manner on a suitable matrix, for example described in WO 00/12575 (see, for example, US 5,412,087, WO 98/36827) or synthetically generated (see, for example, US 5,143,854).
  • a suitable matrix for example described in WO 00/12575 (see, for example, US 5,412,087, WO 98/36827) or synthetically generated (see, for example, US 5,143,854).
  • an interaction between the probe and the target molecule is detected as follows:
  • the probe or the probes are fixed in a predetermined manner to a specific matrix in the form of a probe array.
  • the targets are then brought into contact with the probes in a solution and incubated under defined conditions. If the probe and the target molecule have an affinity for one another due to complementary properties, a specific interaction takes place during the incubation between the probe and the target. The binding that occurs is significantly more stable than the binding of target molecules to probes that are not specific for the target molecule.
  • the system is washed or heated with appropriate solutions or subjected to measures that have a restrictive effect.
  • the detection of the specific interaction between a target and its probe can then be carried out by a large number of methods, which generally depend on the type of marker which, depending on the structure of the experiment, before, during or after the interaction of the target molecule with the probe.
  • Array has been introduced into the target molecules or into the probe molecules.
  • markers can e.g. are fluorescent groups, radioactive labels, enzymes or chemiluminescent molecules, the detection method to be used depends on the type of marker (A. Marshall, J. Hodgson, DNA Chips: An Array of Possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).
  • this test principle can be used Interactions between nucleic acids and nucleic acids, between proteins and proteins and between nucleic acids and proteins are examined (for an overview, see F. Lottsspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg / Berlin).
  • Antibody libraries, receptor libraries, peptide libraries and nucleic acid libraries can be used as substance libraries that can be immobilized on probe arrays or chips.
  • the nucleic acid libraries play by far the most important role, and these are particularly often DNA molecule or RNA molecule libraries.
  • the probe array-based analysis of nucleic acid-nucleic acid interactions follows the principles of nucleic acid hybridization technology (AA Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, IJ Leitch, 1994, in vitro hybridization, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg / Berlin / Oxford).
  • the detection of specific interactions between a probe and a target is usually carried out by fluorescence-optical evaluation, since these are characterized by a high sensitivity, by versatility with regard to the markers that can be used and by the possibility of location- and time-resolved detection of the interaction with comparatively little effort (especially in the Compared to mass spectroscopic methods) as well as by eliminating the radiation exposure that occurs when using radioactive labeling reagents.
  • the excitation and detection wavelength range can be set depending on the fluorophores used for labeling.
  • the interference must therefore be eliminated or minimized and devices and methods used that allow referencing of the measured fluorescence signals. Such devices are also referred to as the fluorescence drawing standard.
  • detectors based on CCD Charge Coupled Device
  • CCD Charge Coupled Device
  • CCD Charge Coupled Device
  • the illustration of the Probe arrays take place either in an exposure or by rasterization using high-resolution optics. Complicated lighting optics and filter systems are necessary in order to minimize or allow auto-fluorescence or system-related optical effects such as lighting homogeneity across the entire probe array.
  • Confocal scanning systems allow the evaluation of fluorescence signals from selected levels of a sample. They are based on the selection of the fluorescence signals along the optical axis using pinhole diaphragms, which results in a high adjustment effort for the samples and the establishment of a powerful autofocus system.
  • Such systems are highly complex in the technical solution and the necessary components, which include lasers, pinhole diaphragms, (cooled) detectors (e.g. PMT, avalanche diodes, CCD systems), high-precision mechanical translation elements and optics, have to be integrated with each other with considerable effort can be optimized (described in US 5,459,325, US 5,192,980, US 5,834,758).
  • Detection devices using fluorescence drawing standards necessary.
  • a calibration of detection systems by means of fluorescence drawing standards is carried out in order to be able to make statements regarding the sensitivity of the spatial and temporal resolution and the geometric image errors, such as the field curvature of the respective system.
  • the calibration of detection devices with regard to their temporal resolving power is necessary because to distinguish the actual (often long-lived) fluorescence signal from (often short-lived) autofluorescence signals, the signals must be measured over a longer period of time.
  • CCD detectors When using CCD detectors with the help of standards e.g. the linearity and sensitivity of the detector in the fluorescence wavelength range used, the spatial and temporal resolution as well as the field curvature (flat field determination) of the detector are determined. Confocal detection systems must be calibrated with regard to the areas that are stimulated or contribute to the overall intensity.
  • the calibration of different fluorescence detection systems using fluorescence drawing standards is also very important because only such a calibration allows a comparison of fluorescence signals from experiments that were measured with different detection systems but also devices of a system (cross-system or cross-device comparison).
  • WO 01/06227 describes the production of a fluorescence drawing standard based on micro- or nanoparticles and their use for the calibration of both fluorescence detection systems and for referencing fluorescence intensity signals in fluorometric assays. These standards are also not suitable for calibrating the
  • Fluorescence detection systems with regard to their spatial resolution. A cross-device comparison of signal intensity data obtained from experiments based on probe arrays is only possible to a limited extent.
  • long-term emitting marker substances can be used as standard, the signal of which is detected by time-resolved detection methods.
  • These are often phosphorescent chelates of rare earth metals (especially those of Europium or Terpium).
  • these substances have the disadvantage that they can only be excited with UV light sources.
  • the chelates used in aqueous form are often unstable.
  • the object of the present invention is to provide devices which reference fluorescence signals with respect to the measured intensity and / or calibrate fluorescence detection systems with regard to their sensitivity, their spatial and temporal
  • Another object of the present invention is to provide devices which easily allow a cross-device and cross-system comparison of fluorescence signals from experiments, e.g. can be probe array based experiments.
  • Another object of the present invention is to provide methods for producing such fluorescence standards.
  • the objects are achieved in that at least one polymer layer is applied to a substantially non-fluorescent carrier in defined areas in such a way that these areas fluoresce after corresponding irradiation, some of the applied polymer layers differing in terms of their thickness and / or composition.
  • Fluorescence drawing standards can thus be used for the calibration of different fluorescence detection systems with regard to their spatial and temporal resolution, with regard to their geometric and dynamic properties and with regard to their sensitivity.
  • the fluorescence standards according to the invention can be used to calibrate different ones Fluorescence detection systems are used with regard to their dynamic properties.
  • the polymer layers of devices according to the invention are applied in defined areas, the shape and size of which can be predetermined and reproducibly set.
  • fluorescence drawing standards which are also referred to as structured fluorescence drawing standards, can be used for the calibration of different fluorescence detection systems with regard to their spatial resolution.
  • the fluorescent drawing standards according to the invention are suitable for cross-device and cross-detection and / or cross-test evaluation and referencing of fluorescence signals, which e.g. can be measured in probe array based experiments.
  • the polymer layers applied in the defined areas of devices according to the invention can be one or more
  • the polymer layers consist of at least one fluorescent polymer or of a polymer mixture, at least one polymer component of the mixture being fluorescent.
  • Preferred fluorescent polymers include, for example, positive and / or negative photoresists based on epoxy resins such as SU8 and Novo lacquers and / or PMMA and / or photosensitive polyimide and / or benzocyclobutene.
  • Polymers which are suitable for the production of fluorescence standards according to the invention, ie which show fluorescence after appropriate irradiation, are also known from US Pat. No. 6,091,488 or US Pat. No. 4,482,424.
  • the polymer layers of devices according to the invention can additionally contain fluorescent substances which are not polymers. Since these substances are embedded in the polymer layers, their fluorescence properties are influenced by environmental factors (e.g.
  • Such fluorescent substances preferably comprise chromophores, organic dyes such as e.g. Azo dyes, triphenylmethane dyes, porphynine dyes and / or inorganic dyes such as e.g. metallic dyes and especially lanthanides.
  • organic dyes such as e.g. Azo dyes, triphenylmethane dyes, porphynine dyes and / or inorganic dyes such as e.g. metallic dyes and especially lanthanides.
  • inorganic dyes such as e.g. metallic dyes and especially lanthanides.
  • Such substances also include perylene derivatives as described in H. Langhals, J. Karolin, L. B.-A.
  • Johansson Spectroscopic properties of new and convenient Standards for measuring fluorescence quantum yields, J. Chem. Soc, Faraday Trans., 1998, 94, 2919-2922 and S. Kalinin, M. Speckbacher, H. Langhals, LB-A. Johansson, A new and versatile fluorescence standard for quantum yield determination, Phys. Chem. Chem. Phys., 2001, 3, 172-174 may be mentioned. In particular, it can e.g. B.
  • the wavelength range of the fluorescence occurring in the defined ranges after corresponding irradiation can be adjusted by the choice of the composition of the polymer layers.
  • the polymer layers applied to a non-fluorescent carrier in defined areas are characterized by a broadband intrinsic fluorescence, so that they show fluorescence signals in a wavelength range of greater excitation in the visible spectral range and in the near IR and UV range after narrowband excitation.
  • the polymer layers in FIG a narrow-band inherent fluorescence in the defined areas, the wavelength range of which depends on the composition of the polymer layers.
  • the polymer layers consist of only one polymer, so that the wavelength range of fluorescence depends only on this polymer.
  • the polymer layers consist of one or more non-fluorescent polymers and / or one or more additional fluorescent substances, so that the wavelength range of the fluorescence of these devices according to the invention depends on the type and combination of the polymers and / or the fluorescent substances ,
  • the intensity of the fluorescence caused by a polymer layer in a defined area after corresponding irradiation can be set in a variety of ways. According to the invention, the intensity of the fluorescence caused in the defined areas after corresponding irradiation can be adjusted by the composition of the polymer layers and / or the thickness of the polymer layers. According to the invention, the thickness of a polymer layer in a defined area includes both the thickness of the individual polymer layers in one area, if several in one area
  • Polymer layers are applied, as well as the thickness, which results from the sum of the thickness of the individual polymer layers in an area.
  • the intensity is set in a defined range by the successive application of
  • fluorescence drawing standards according to the invention can be produced which have polymer layers of uniform composition but different layer thicknesses in all defined areas.
  • preferred embodiments of the invention can be used to produce fluorescence drawing standards in which the intensity of the fluorescence caused in an area after corresponding irradiation is proportional to the thickness of the polymer layer applied in the respective area.
  • the intensity of the fluorescence in the defined areas of calibration standards according to the invention can also be adjusted by changing the composition of the polymer layers.
  • the type and number of polymer components in one is determined by the composition of the polymer layers
  • polymer layers of uniform thickness are applied in different defined areas, the polymer layers differing only in the amount of additional fluorescent particles per unit area.
  • fluorescence drawing standards according to the invention can be produced, in which the intensity of the fluorescence caused in the areas with corresponding irradiation is proportional to the amount of fluorescent particles in the various defined areas, given the same layer thickness.
  • the resulting intensity can be adjusted quasi linearly by changing the layer thickness at a constant concentration of the fluorescent particles in the polymer.
  • a further possibility for adjusting the intensity of fluorescence drawing standards produced according to the invention is to add physical treatment methods such as radiation and temperature treatment (annealing) to the polymer layers according to the invention during the production process submit.
  • physical treatment methods such as radiation and temperature treatment (annealing)
  • annealing annealing
  • these treatment methods change the degree of crosslinking or crosslinking of the polymer layers and accordingly the fluorescence properties of the polymer layers.
  • crosslinking degree or degree of crosslinking is familiar to the person skilled in the art.
  • Adjustment of the intensity of polymer layers by methods for changing the degree of crosslinking, especially polymers that have a thermosetting crosslink are suitable, e.g. the mentioned photoresists like SU8.
  • fluorescence drawing standards can be produced, which are characterized by a wide range of both the intensities and the wavelength ranges according to the corresponding radiation occurring
  • fluorescence drawing standards according to the invention can be used in many ways for the calibration of fluorescence detection systems with regard to their spatial and temporal resolution as well as their dynamic and geometric properties.
  • Such devices according to the invention can also be used as fluorescence standards, which easily allow a comparison of fluorescence signals between different detection systems, but also devices of a system.
  • the fluorescence properties are subject to changes over the irradiation time due to the chemical and physical properties of the polymers and additional fluorescent substances used, so that the resulting intensity decreases after a certain period of use (bleaching, see also Miehler, 1992, plastic micromechanics: morphology, deformation and fracture mechanisms., Hanser, Kunststoff Vienna).
  • the polymer layers deposited in defined areas can be optimized in terms of their intensity changes over time by means of suitable production protocols (for example, so-called tempering protocols) such that these changes are linear and consequently the intensity ratios of the resulting fluorescence of the individual defined areas of the structured standard remain constant.
  • Such fluorescence drawing standards according to the invention can be used for the calibration of fluorescence detection devices with regard to their temporal
  • Fluorescence drawing standards according to the invention can also be produced as preferred embodiments, the fluorescence yield of which can be described in a linear or sufficiently predeterminable manner over the irradiation duration and the aging process.
  • Such fluorescent standards can e.g. for referencing fluorescence signals from experiments that were carried out at different times. They also allow the cross-device and cross-system comparison of fluorescence signals.
  • the polymer layers are applied in defined areas of different shape and / or size on a substantially non-fluorescent carrier.
  • these defined areas have a square, rectangular and / or circular shape, the side lengths or diameters of which are between 500 nm and 5 mm.
  • Such structured fluorescence drawing standards according to the invention can be used for the calibration of different fluorescence detection systems with regard to their spatial resolution.
  • spatial resolution is to be understood as the separability of two fluorescent dots shown.
  • fluorescence standards according to the invention can be produced, the defined areas of which have dimensional tolerances in the 10 nm range, such fluorescence standards can be used in microscopic techniques, e.g. confocal 3-D microscopy can be used as a standardization instrument for lateral and axial distances.
  • the defined areas are applied to the carrier in array form, i. H. that several defined areas of the same size and shape are grouped into an array element, whereas areas of a different shape and / or size are grouped into other array elements.
  • the thickness of the polymer layers can be set such that the maximum thickness of the various polymer layers is significantly less in an area than the minimum depth of focus of commercially available confocal detection systems.
  • such fluorescence drawing standards should have a preferred layer thickness between a few nanometers and a maximum of 50 micrometers, the layer thicknesses should preferably be between a few nm and 20 ⁇ m, between 100 nm and 10 ⁇ m, particularly preferably between 200 nm and 5 ⁇ m.
  • the depth of focus is to be understood as the area along the optical axis in which a detection of fluorescence signals is possible.
  • fluorescence drawing standards can be used for the calibration of physical structures and devices, for the detection of fluorescence signals and for the referencing of fluorescence signals, appropriately labeled substances and groups of substances.
  • the polymer layers are applied to essentially non-fluorescent, preferably optically transparent supports.
  • these supports consist of glass, particularly preferably of quartz glass and borofloat glass, or of optically transparent, non-fluorescent polymeric panes, particularly preferably of polycarbonate, PMMA and / or foils.
  • optically non-transparent materials are also suitable as carriers, which essentially have no inherent fluorescence.
  • the fluorescence drawing standards are connected to further carrier systems.
  • These carrier systems also consist of essentially non-fluorescent materials. These are preferably optically transparent materials such as glass, particularly preferably quartz glass, but also optically non-transparent materials such as plastic and / or metal, which have essentially no inherent fluorescence.
  • this carrier system is a commercially available slide, as it is for z. B for the
  • Immunofluorescence microscopy is used.
  • Cells or tissue sections can be immobilized on such supports and evaluated directly by comparing the signals against the fluorescence standard according to the invention.
  • the fluorescence drawing standards according to the invention can also be integrated, for example, directly on the supports on which substance libraries are or will be stored in the form of a probe array. Such fluorescence drawing standards allow direct referencing of fluorescence signals and thus enable the evaluation of test-specific examinations.
  • the surface of the supports in at least the areas which are to contain the substance library should be functionalized by amino, carboxy, aldehyde or epoxy groups. Further functional groups for linking substance libraries are known to the person skilled in the art.
  • the supports on which the fluorescence drawing standards or the substance libraries are stored in the form of probe arrays are to be selected such that they are essentially non-fluorescent and, if required, optically transparent.
  • Preferred materials for the production of such supports are glass, particularly preferably quartz glass, borofloat glass and / or polymers and / or silicon. It is also possible to choose materials which are not optically transparent, but which are essentially non-fluorescent.
  • these probe arrays can be functionalized by substance libraries based on proteins, peptides or nucleic acids.
  • the protein substance libraries with which the fluorescence standards according to the invention are functionalized are preferably antibody libraries, receptor libraries, receptor-ligand libraries and / or hormone libraries.
  • the peptide libraries with which fluorescence standards are functionalized according to the invention are usually pharmaceutically or biologically active peptides, antigen libraries and / or receptor-ligand libraries and / or hormone libraries.
  • the nucleic acid libraries with which fluorescence drawing standards are functionalized according to the invention are preferably DNA molecule libraries and / or RNA molecule libraries. It is particularly preferably mRNA libraries, rRNA libraries, genomic DNA libraries and / or cDNA libraries and or plasmids.
  • fluorescence drawing standards according to the invention can be integrated directly into the fluorescence detection systems, so that online calibration of the devices is possible. Since the properties of the fluorescence standards according to the invention by the
  • the fluorescence drawing standards according to the invention can also be used as a universal external tool to calibrate several different detection systems in the manner described.
  • Fluorescence standards according to the invention can also be integrated in closed chamber systems (e.g. PCR and or hybridization chambers).
  • Fluorescence standards according to the invention can be produced by methods in which the layers fluorescent after irradiation are applied in a defined manner to the carrier according to the invention in defined areas. Such methods are known, for example, from semiconductor technology (US 6,091,488).
  • the polymer layers of fluorescence standards according to the invention can preferably by photolithographic methods, by spotting Dry etching, by ion implantation, by printing processes, by rolling, by injection molding or by surface embossing can be applied to the carrier.
  • the polymer layers according to the invention can be applied to the support by chemical and / or physical methods for coating.
  • the polymer layers can be applied from the gas phase (e.g. by CVD or oxidation), from the liquid phase (e.g. by electrolytic, electrochemical and other wet chemical processes) or from the solid phase (e.g. by oxidation).
  • the application can be from the gas phase or from the plasma (e.g. by PVD, sputtering or vapor deposition), from the liquid phase (e.g. by spin-on processes, by painting, spraying or dipping) or from the solid phase (e.g. by lamination ) respectively.
  • Combinations of these methods or subsequent modifications such as ion implantation can also be used.
  • ion implantation e.g. PECVD
  • the respective methods and corresponding configurations are known to the person skilled in the art (see, for example, W. Menz, J. Mohr, Microsystem Technology for Engineers, VCH, 1997).
  • the polymer layers according to the invention can be structured by various methods which are known to the person skilled in the art. These can be biochemical methods, such as, for example, the enzymatically mediated selective structuring (described in WO98 / 08086), but also chemical and / or microtechnical methods. These include selective etching of the functional layer against a mask that is itself insensitive to the etcher (e.g. liquid or dry etching). Methods are also applicable which bring about selective changes in properties by radiation, such as, for example, by irradiation with UV or lasers. This includes photolithography. Other methods include self-assembling layers. These methods can be done using a Masking, but also by means of “directly rubbing” devices (spotting).
  • Printing technology processes such as spotting or offset printing or other processes such as rolling, stamping, injection molding or surface embossing processes can also be used.
  • Different embodiments of the methods are known to the person skilled in the art (see, for example, W. Menz, J. Mohr, Microsystem Technology for Engineers, VCH, 1997).
  • the polymer layers are applied by negative or positive photolithographic methods, particularly preferably by negative photolithographic methods. Negative photolithographic processes are particularly preferred in which the polymer layers become insoluble in the developer after irradiation. In contrast, unexposed areas remain soluble in the developer and can be removed.
  • photolithographic methods for structure transfer using a photoresist are known to the person skilled in the art.
  • Chemical and physical processes which allow the application of a homogeneous functional layer on the carrier are preferred. Particularly preferred methods include CVD, PVD and spin-on methods.
  • the parameters by means of which the thickness of the polymer layers can be set in the case of photolithographic processes (but also other processes) include the processing parameters (process parameters) such as the circulation speed, the duration of the production process, the viscosity of the polymer, the temperature and / or the air humidity , When using photopolymers, the processing parameters also include the radiation dose, the parameters of the development process and the annealing process.
  • processing parameters such as the circulation speed, the duration of the production process, the viscosity of the polymer, the temperature and / or the air humidity .
  • the shape and size of the defined areas in which the polymer layers are applied can be determined by using a mask and / or shadow masks, for example by using a mask on a 1: 1 scale. Depending on the cutout of the mask are with it According to the invention, different geometrical shapes and sizes can be set for the defined areas. Fluorescence standards according to the invention can also be produced according to this method, in which the polymer layers deposited in different defined areas have an array shape. Structured chrome on glass and / or quartz is preferably used as the shadow mask.
  • fluorescence drawing standards according to the invention can be produced, in which polymer layers with different compositions and / or thicknesses are applied in different areas.
  • the degree of crosslinking (and thus the intensity) of the polymer layers can also be specifically changed in defined areas.
  • the bleaching behavior of fluorescence standards according to the invention can also be set in a targeted manner.
  • the fluorescent drawing standard is preferably applied to the carrier system by gluing, by position adjustment or by a vacuum system.
  • the fluorescence drawing standard can be connected to the carrier system on which the substance libraries are located.
  • the fluorescence drawing standards can first be produced on supports on a waver scale, and the correspondingly isolated fluorescence drawing standards can then be functionalized by storing substance libraries in array form.
  • the fluorescence standards according to the invention can be used in different ways for the calibration of fluorescence detection systems.
  • the device properties can be defined by using fluorescence drawing standards according to the invention for device-specific calibrations. For example, the corresponding shape and size of the defined areas in which the polymer layers which are fluorescent after appropriate irradiation are deposited can be used to determine the spatial resolution.
  • Fluorescence drawing standards according to the invention which have polymer layers of different thicknesses but of uniform composition in several defined geometric areas, as a result of which the intensity of the fluorescence in the different areas, which is produced after corresponding irradiation, is proportional to the polymer layer thickness, allow calibration of a corresponding detection system with regard to its dynamic properties.
  • the intensity range in which a CCD detector should work linearly can be defined in this way.
  • fluorescence drawing standards according to the invention can also be used to adjust the sensitivity of the detection system, ie to determine which minimum or maximum fluorescence intensities a detection system should still evaluate as a signal.
  • Fluorescence drawing standards according to the invention in which the intensity of the fluorescence, which is produced after corresponding irradiation in different geometric areas with polymer layers of different thicknesses and / or composition, decays in a predeterminable and controllable manner, can be used to draw conclusions about the device-specific bleaching of fluorescence signals.
  • fluorescence drawing standards according to the invention can be used to calibrate the geometric properties of detection systems, in particular to correct the curvature of the image field (flatfield determination) in CCD detectors.
  • geometric properties are generally understood to mean the local resolution, the image scale, the field curvature and other geometric errors which result from the optical construction.
  • fluorescence drawing standards Since the fluorescence properties of fluorescence drawing standards according to the invention do not depend on external factors and can be predetermined and reproducibly set, they can be used to calibrate different devices of the same detection principle (cross-device calibration) or devices of different detection principle (cross-system calibration).
  • the calibration can be carried out to standard values that are used, for example, in work groups and laboratories, to which fluorescence signals from experimental measurements are then related. This means that the signals that are obtained when evaluating, for example, a probe array-based experiment with different detection systems are directly comparable (cross-test comparison).
  • Fluorescence drawing standards according to the invention which show a wide range with regard to the wavelength and intensity of the fluorescence produced in the defined areas after irradiation of the polymer layers, can also be used for test-specific referencing of fluorescence signals. This is possible because the test-specific signals e.g. can be related to the fluorescence of a defined area, the properties of which in the area of
  • Test signal This enables the test signals to be normalized.
  • the standardized experimental data obtained using fluorescence drawing standards according to the invention significantly eliminates the errors which result from the use of different detectors or different settings of the detectors. They can therefore be compared directly with one another. Fluorescence drawing standards according to the invention thus enable cross-test and cross-device comparison of
  • Fluorescence signal intensities that have been obtained when carrying out probe array based experiments and tests.
  • the settings of scanners are usually adapted to the corresponding measurement results. If the resulting fluorescence signals are weak in a probe array-based experiment, the laser power or the sensitivity of the detector (eg the bias when using a PMT system or the integration time when using a CCD system) are increased. In addition, the devices are subject to device-specific fluctuations. This is particularly critical if results from different time periods are to be compared, since the power of the lasers used can change dramatically, for example with laser scanners. A comparison of fluorescence intensity signals, which, when performing similar probe array-based experiments, however were measured at different times with the fluorescence standards according to the invention without any problems ("time to time” comparison), since the bleaching behavior of the standard can be used to normalize the device fluctuations. With the aid of the fluorescence standards according to the invention, detection systems can also be used with regard to their
  • Aging properties e.g. the change in lamp wattages are calibrated.
  • Detection systems can be calibrated, the results of probe array-based experiments can be analyzed across devices and systems and thus across laboratories.
  • Devices which are characterized in that polymer layers, which are uniform in terms of their layer thickness and composition, are applied to an essentially non-fluorescent carrier in one or more defined areas can also be used for referencing fluorescence signals. Such devices are particularly suitable if they have several defined areas for the device and cross-system calibration of fluorescence detection systems with regard to their spatial resolution.
  • the polymer layers of such devices can have the same composition as stated above, i. H. they can contain fluorescent polymers, polymer mixtures with at least one fluorescent polymer and / or additional fluorescent substances.
  • the intensity and the wavelength range of the fluorescence caused in the areas after corresponding irradiation can be predetermined and reproducibly adjusted by the choice of the composition of the polymer layers, the layer thickness and by changes in the degree of crosslinking. All other properties such as bleaching behavior, size and shape of the defined areas can also be set in the manner described above. Such devices can also be produced by all of the methods described above.
  • Such devices can generally be used for the qualitative and quantitative referencing of fluorescence signals, particularly preferably for referencing fluorescence signals from probe array-based tests and / or for calibrating fluorescence detection systems.
  • Fluorescence detection systems are used in terms of their spatial resolution. Since the polymer layers applied in one or more defined areas are uniform in terms of their composition and layer thickness, they are not suitable for calibrating the dynamic properties of fluorescence detection systems. Also calibration of detection systems by comparing the ratios of different ones Intensities that occur after irradiation from different areas are not possible with these devices.
  • Such devices can e.g. can be used to compare experimentally determined fluorescence signal data with standard values and thus allow the cross-device and cross-system comparison of fluorescence signals. These devices also allow the calibration of fluorescence detection systems with regard to their sensitivity and their device-specific bleaching behavior at the intensities and wavelength ranges defined by the composition and thickness of the polymer layers.
  • the example shows how a universal fluorescence drawing standard according to the invention is produced on a polymer basis by means of negative photolithography.
  • a fluorescence drawing standard according to the invention is produced which, in different areas of the same shape and size, has polymer layers of different thicknesses but essentially the same composition.
  • the intensities of the fluorescence caused in the areas after corresponding irradiation are thus proportional to the layer thickness.
  • Materials that show high transparency and low self-fluorescence in the desired fluorescence spectrum are used as supports.
  • borofloat glass 40 from Schott (BF 40, diameter: 100 mm, thickness: 0.7 mm) was chosen as the carrier material.
  • the actual functional material (these are the
  • polymer layers should have a strong inherent fluorescence.
  • polymer SU8-10 dissolved in PGMEA (organic solvent from Sigma), was chosen as the polymer which fulfills the properties mentioned.
  • PGMEA organic solvent from Sigma
  • Self-fluorescence and the ability to be photostructured have the great advantage that the chosen polymer can be structured using photolithographic processes.
  • the carrier material was annealed (180 ° C, 20 min). This removed any adsorbates (often H 2 O) that hinder the good adhesion of the SU8 polymer layer to the substrate. To reinforce this, the surface of the substrate was modified with 3-glycydoxypropyltrimethoxysilane.
  • a first layer with a thickness corresponding to the desired fluorescence or sensitivity was then applied to the substrate (see Figure 1).
  • the spin-on method was used for this, by selecting the parameters (duration: 30s, rotational speed: 5000 rpm, acceleration: 100 rpm s for 10 s and 1000 rpm s for 20 s, degree of dilution with PGMEA) the desired thickness or the fluorescence was set.
  • the polymer was distributed homogeneously on the substrate and the solvent was driven off.
  • the subsequent tempering above the glass point (95 ° C, 15 min, so-called pre-bake) forms and homogenizes the layer.
  • the polymer layers were then structured using conventional microphotolithography.
  • the solubility in the developer (in this case PGMEA) was changed by irradiating the photopolymer with UV light (15 min at approx. 300-450 nm with 15 mW / cm 2 , so-called exposure).
  • SU8-10 shows a tone-negative behavior, ie the UV-exposed areas polymerize and unexposed areas remain soluble in the developer. Irradiation was carried out by mask projection using lithography masks, which had corresponding thin chrome structures on quartz. This quartz mask had the desired lateral geometry of the standard, which was imaged in the polymer on a 1: 1 scale. The smallest structures in the mask therefore also determine the smallest structures of the standard or of the smallest resolution test to be detected on the standard.
  • 3rd layer SU8-10 (MicroChem Inc.) dissolved in PGMEA (Sigma) 20% w / w
  • the SU8-10 photopolymer was dissolved in various weight ratios in PGMEA. As a result, the solutions have different viscosities, which means that polymer layers with different thicknesses can be produced.
  • the Solvent is later largely driven out (more than 95%), so that the polymer layers have essentially the same composition.
  • the polymer structure was then developed by immersion in PGMEA (Sigma) and annealed again (120 ° C., 30 min, so-called hard bake).
  • step-like geometric structures emerged ( Figure 1).
  • the step heights then correspond to a corresponding fluorescence intensity, the lateral geometries to the resolving power.
  • FIG. 2A shows an inventive fluorescence drawing standard in array form, which was produced microlithographically on borofloat glass (Schott) using the method from Example 1.
  • the standard consists of 9 array elements, all of which contain fluorescent polymer layers in a square shape.
  • the squares of the 9 array elements have 3 intensity levels, which result from 3 different thicknesses.
  • Different integration densities of molecular arrays are simulated by different structure sizes and distances.
  • the standards were produced on a wafer scale and separated into chips.
  • the standard is suitable for determining the spatial resolution, the geometric errors, the imaging optical, electromechanical and information technology systems as well as the sensitivity of the respective device at the time of the measurement.
  • the standard can be used for cross-device evaluation of the fluorescence signals from probe array-based experiments.
  • the described fluorescence standard was read out in various reader systems as a 16bit - *. Tif Images exported and analyzed using special software (IconoClust from Clondiag).
  • the differently sized fluorescent structures on the fluorescence drawing standard can be used to correct geometric deviations of the different detection systems.
  • the field curvature of an optical system can be
  • the settings of the detection systems e.g. with regard to the laser or lamp power, the integration time per spot / subarray or the signal amplification / adjustment of the detector to a specific value of the resulting fluorescence of the standard.
  • the long-term drift of a detection apparatus which can be caused by the aging processes of the lasers, lamps or detectors used, are determined.
  • fluorescence signals which are measured with different detection systems when evaluating a probe array-based experiment, can be compared directly with one another.
  • FIG. 2B shows a fluorescence standard according to the invention in array form, which was produced by spotting on borofloat glass (Schott).
  • fluorescent standards were produced on various supports by producing polymer mixtures SU8 (MCC Inc.) and Novolack (AZ 1514 Clariant) in a mass ratio of 1: 2, 1: 3, 1: 5 and applying them to the glass substrates.
  • slides were cleaned and the polymer mixtures using a needle spotting tool (Microgrid 2 / Biorobotics) mocked unslotted spider needle (Solidpins / Biorobotics).
  • the polymer mixtures were applied with a piezo-driven dispenser head (diameter 100 ⁇ m, heated nozzle from microdrop). The dispenser nozzle was heated (55 ° C).
  • Pre-Bake 95 ° C, 15min Exposure: 1min, 15mW / cm 2 , flood exposure
  • Post-Bake 95 ° C, 15min Hard-Bake: 120 ° C, 60min
  • the standard produced in this way consists of circular areas (spots) of uniform dimensions, the polymer layers of which differ both in terms of their thickness and their composition.
  • the standard therefore has a wide spectrum of intensities and wavelength ranges for the fluorescence that can be produced in the spots.
  • the standard came in the same way as that used in Figure 4A.
  • Figure 3 shows how a fluorescence standard according to the invention is applied to a slide by gluing.
  • an annealing protocol can be selected so that the intensity of the fluorescence caused in the defined areas after multiple irradiation decays linearly.
  • Figure 4A shows the bleaching behavior of the three layers without thermal treatment. It is a non-linear bleaching behavior.
  • Figure 4B shows the bleaching behavior of the three layers after thermal treatment. It is a linear bleaching behavior.
  • the samples were subjected to a thermal treatment in the oven for two hours at 180 ° C. during the manufacturing process and then for 40 minutes at a wavelength between 520 and 600 nm at 40 mW / cm 2 irradiated.
  • the intensity behavior changes in such a way that the thickness ratio is no longer directly proportional to the resulting intensity ratio, but the intensity ratios of the structures of different thicknesses are now constant when irradiated (see Figure 4C).
  • Fluorescence drawing standards were produced as in Example 1, in which polymer layers with different thicknesses are applied in the defined areas.
  • Fluorescence drawing standards according to the invention which likewise had a probe array, were used to standardize probe array-based experiments. The fluorescence drawing standard can then be taken into account in the readout process before or after the biochemical interaction reaction has been carried out (see Figure 6A).
  • Fluorescence standards according to the invention were applied to epoxidized slides (company QMT) by ultrasonic drilling and gluing, which had polymer layers in the defined areas with the same polymer thickness but different content with respect to the polymer components. These areas thus show different intensities after appropriate irradiation.
  • a series of PCR products aceA, acs, amiB, ampG, argC, atpA, creB, icdA, napH, rpoA, rpoH, rpoS
  • Specially purified specific cDNA labeled with fluorescent dyes (Cy3 or Cy5 from Amersham) was immobilized on the PCR spots by hybridization.
  • the samples were then read using a confocal laser scanner (Affymetrix, Packard) and the results were analyzed using special software (IconoClust from Clondiag). The results were evaluated with reference to the different intensities of the different areas of the fluorescence drawing standard.
  • the three bars of a cDNA stand for referencing the signal data of the hybridization to three different areas of the standard, which have different intensities.
  • the results were standardized to the different intensity levels and taking into account the content of the Polymer layers calculated on one level.
  • the graph ( Figure 6B) shows that such a back calculation is permissible since the same results are obtained for each cDNA, regardless of the area to which the measurement of the cDNA is related. If the content of the polymer layers is known, it is therefore permissible to use each area for referencing, which increases the universality of the standard.
  • the measurements were carried out with a confocal biochip scanner Scanarray 4000 (Packard) with 100% laser power and 85% PMT gain.
  • Fluorescence standard according to the invention in the form of an array, produced microlithographically on boro float glass.
  • Fluorescence standard according to the invention in array form produced by spotting on borofloat glass.
  • the top line shows the d3 / d2 ratio
  • the bottom line the d2 / dl ratio from Figure 4A.
  • Fig. 5 Measurement results of a scan for different dyes. The intensity is given as a gray value. These standards are suitable for standardizing results in different wavelength ranges.
  • Fig. 6A Inverse scan of a spotted probe array. In the upper part you can see the fluorescence drawing standard (1). Below this is the probe array (2). These are spotted PCR products after hybridization with Cy3 / Cy5-labeled cDNA.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen, wobei die Vorrichtung einen im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger umfasst, auf dem in mehreren definierten Bereichen Polymerschichten mit zum Teil unterschiedlicher Dicke und/oder Zusammensetzung aufgebracht sind. Diese Polymerschichten sind derartig auf den Träger aufgebracht, dass sie nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren und die Vorrichtung damit als Fluoreszenzeichstandard verwendet werden kann. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von solchen Fluoreszenzeichstandards.

Description

Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die den Vergleich der Abbildungseigenschaften und Signalempfindlichkeit von Fluoreszenzdetektionssystemen und die testspezifische Referenzierung von Fluoreszenzsignalen ermöglicht, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Biomedizinische Tests basieren häufig auf dem Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Molekül bzw. einer Affinitätsmatrix, dessen Identität bzw. deren Beschaffenheit bekannt ist (Sonde), und einem nachzuweisenden, unbekannten Molekül bzw. nachzuweisenden, unbekannten Molekülen (Ziel- bzw. Targetmolekül oder Target). Bei modernen Tests sind die Sonden, so es sich bei ihnen um Moleküle handelt, häufig in Form einer Substanzbibliothek in bekannter Menge und Position auf Trägern immobilisiert. Solche Vorrichtungen werden auch Sonden-Arrays oder Chips genannt. Ein Sonden- Array umfasst charakteristischerweise mehrere so genannte Array-Elemente, bei denen es sich um die Bereiche eines Sonden-Arrays handelt, in denen eine bestimmte Molekularsonde häufig in mehrfacher Kopie immobilisiert ist. Die Summe aller belegten Array-Elemente bildet damit das Sonden- Array.
Die Immobilisierung von molekularen Sonden in Form einer Substanzbibliothek auf Sonden-Arrays ermöglicht es, eine Probe, die die nachzuweisenden Target-Moleküle enthält, parallel an mehreren Sonden gleichzeitig zu analysieren, was eine systematische Analyse mit hohem Durchsatz bei geringem Zeitaufwand ermöglicht (high throughput screening, DJ. Lockhart, E.A. Winzeler, Genomics, Gene Expression and DNA Arrays, Nature 2000, 405, 827-836). Für die Herstellung der Sonden-Arrays werden die Sonden üblicherweise in vorgegebener Art und Weise auf einer geeigneten, beispielsweise in WO 00/12575 beschriebenen Matrix immobilisiert (siehe z.B. US 5,412,087, WO 98/36827) bzw. synthetisch erzeugt (siehe z.B. US 5,143,854). Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Targetmolekül erfolgt prinzipiell folgendermaßen:
Die Sonde bzw. die Sonden werden in vorgegebener Art und Weise an einer bestimmten Matrix in Form eines Sonden-Arrays fixiert. Die Targets werden dann in einer Lösung mit den Sonden in Kontakt gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert. Weisen die Sonde und das Targetmolekül aufgrund von komplementären Eigenschaften eine Affinität zueinander auf, so findet während der Inkubation zwischen der Sonde und dem Target eine spezifische Wechselwirkung statt. Die dabei auftretende Bindung ist deutlich stabiler als die Bindung von Targetmolekülen an Sonden, die für das Targetmolekül nicht spezifisch sind. Zum Entfernen von unspezifisch gebundenen Targetmolekülen wird das System mit entsprechenden Lösungen gewaschen oder erwärmt bzw. entsprechend restriktiv wirkenden Maßnahmen unterworfen.
Der Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Target und seiner Sonde kann dam durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, die in der Regel von der Art des Markers abhängen, der je nach Aufbau des Experiments vor, während oder nach der Wechselwirkung des Targetmoleküls mit dem Sonden- Array in die Targetmoleküle oder in die Sondenmoleküle eingebracht worden ist. Bei solchen Markern kann es sich z.B. um fluoreszierende Gruppen, um radioaktive Markierungen, um Enzyme oder chemolumineszierende Moleküle handeln, wobei die zu verwendende Nachweismethode sich nach der Art des Markers richtet (A. Marshall, J. Hodgson, DNA Chips: An Array of Possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).
Abhängig von der auf dem Sonden- Array immobilisierten Substanzbibliothek und der chemischen Natur der Targetmoleküle können anhand dieses Testprinzips Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, zwischen Proteinen und Proteinen sowie zwischen Nukleinsäuren und Proteinen untersucht werden (zur Übersicht siehe F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin).
Als Substanzbibliotheken, die auf Sonden-Arrays oder Chips immobilisiert werden können, kommen dabei Antikörper-Bibliotheken, Rezeptor-Bibliotheken, Peptid- Bibliotheken und Nukleinsäure-Bibliotheken in Frage. Die Nukleinsäure- Bibliotheken nehmen die mit Abstand wichtigste Rolle ein, wobei es sich besonders häufig um DNA-Molekül- oder RNA-Molekül-Bibliotheken handelt. Die Sonden- Array basierte Analyse von Nukleinsäure-Nukleinsäure- Wechselwirkungen folgt dabei den Prinzipien der Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik (A. A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, In vitro-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin/Oxford).
Üblicherweise erfolgt der Nachweis spezifischer Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einem Target durch fluoreszenzoptische Auswertung, da diese sich durch eine hohe Empfindlichkeit, durch Vielseitigkeit hinsichtlich der verwendbaren Marker und durch die Möglichkeit zur orts- und zeitaufgelösten Detektion der Wechselwirkung mit vergleichsweise geringem Aufwand (vor allem im Vergleich zu massenspektroskopischen Verfahren) sowie durch die Eliminierung der Strahlenbelastung, wie sie bei der Verwendung von radioaktiven Markierungsreagenzien auftritt, auszeichnen. Zusätzlich kann abhängig von den zur Markierung verwendeten Fluorophoren der Anregungs- und Detektionswellenlängenbereich eingestellt werden.
Allerdings werden qualitative und quantitative fluoreszenzoptische Auswertungen in der Praxis durch eine Reihe von Faktoren negativ beeinfiusst, die in der Fluoreszenzspektroskopie an sich, in der Art der gewählten Fluoreszenzmarker und in der Art und dem Aufbau der verwendeten Detektionssysteme begründet sind. Zu diesen Faktoren zählen vor allem unspezifische Hintergrundsignale (Signalrauschen), die durch intrinsische optische Eigenschaften der Fluoreszenzmarker (z.B. Bleichen, Quenching bzw. Fluoreszenzlöschung der verwendeten Farbstoffe), durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Sonde bzw. Targets und deren Lösungen (z.B. Autofluoreszenz), durch Schwankungen im optischen System (z.B. Strahlungsintensität der Lichtquelle und Fremdlicht) und durch Aufbau und Art der verwendeten Detektionssysteme (z.B. Autofluoreszenz der Assemblierungselemente, Fähigkeit der Detektoren zur räumlichen und zeitlichen Auflösung, Streuungen, Reflexionen) zustande kommen.
Zur Beurteilung, ob eine gemessene Fluoreszenzintensität ein Signal darstellt oder lediglich zum Signalrauschen gehört, müssen daher die Störeinflüsse beseitigt bzw. minimiert werden und Vorrichtungen und Methoden eingesetzt werden, die eine Referenzierung der gemessenen Fluoreszenzsignale erlauben. Solche Vorrichtungen werden auch als Fluoreszenzeichstandard bezeichnet.
Aus dem Bemühen, das gerätebedingte Signalrauschen zu minimieren, resultiert der hohe technische Aufwand zum Aufbau hochsensitiver Detektoren, die eine qualitative und quantitative Auswertung von Fluoreszenzsignalen erlauben, s- besondere für die Auswertung beim high throughput screening von Sonden-Arrays, das eines gewissen Automatisierungsgrads bedarf, sind speziell angepasste Detektionssysteme erforderlich.
Beim fluoreszenzoptischen Auslesen von molekularen Sonden-Arrays mittels Standardepifluoreszenzaufbauten werden z.B. CCD (Charge Coupled Device) basierte Detektoren verwendet, die zur qualitativen Unterscheidung von optischen Effekten (Streuung, Reflexion) die Anregung der Fluorophore im Dunkelfeld (durch Auflicht oder Durchlichtmikroskopie) realisieren (C.E. Hooper et al., Quantitive Photone Imaging in the Life Sciences using intensifϊed CCD Cameras, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 1990, 337-344). Die Abbildung der Sonden-Arrays erfolgt dabei entweder in einer Belichtung oder durch Rastern unter Verwendung hochauflösender Optiken. Um auftretende Autofluoreszenz oder systembedingte optische Effekte wie die Beleuchtungshomogenität über den gesamten Sonden- Array zu minimieren bzw. zu gewähren, sind komplizierte Beleuchtungsoptiken und Filtersysteme notwendig.
Konfokale Scanning-Systeme (beschrieben in US 5,304,810) erlauben die Auswertung von Fluoreszenzsignalen aus ausgewählten Ebenen einer Probe. Sie beruhen auf der Selektion der Fluoreszenzsignale entlang der optischen Achse mittels Lochblenden, woraus sich ein hoher Justageaufwand für die Proben sowie die Etablierung eines leistungsfähigen Autofokussystems ergibt. Solche Systeme sind in der technischen Lösung hochkomplex und die erforderlichen Komponenten, zu denen Laser, Lochblenden, (gekühlte) Detektoren (z.B. PMT, Avalanche-Dioden, CCD-Systeme), hochgenaue mechanische Translationselemente und Optiken gehören, müssen mit erheblichem Aufwand integriert und aufeinander optimiert werden (beschrieben in US 5,459,325, US 5,192,980, US 5,834,758).
Es sind also Detektionssysteme bekannt, mit denen die molekulare Wechselwirkung eines mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Targets und einer spezifischen Sonde, wie sie z. B bei Sonden- Array basierten Experimenten auftritt, nachgewiesen werden kann. Trotz des beschriebenen hohen technischen Aufwands, der je nach Art und Aufbau des verwendeten Detektionssystems für die Minimierung des Signalrauschens betrieben wird, kann dies nicht gänzlich beseitigt werden. Daher ist für die qualitative und quantitative Auswertung von gemessenen Fluoreszenzsignalen nac wie vor eine Referenzierung oder Kalibrierung der Experimente und der
Detektionsgeräte mittels Fluoreszenzeichstandards notwendig. Eine Kalibrierung von Detektionssystemen mittels Fluoreszenzeichstandards wird durchgeführt, um u.a. Aussagen hinsichtlich der Sensitivität des räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens und der geometrischen Bildfehler, wie z.B. der Bildfeldwölbung des jeweiligen Systems vornehmen zu können. Die Kalibrierung von Detektionsgeräten hinsichtlich ihres zeitlichen Auflösungsvermögens ist notwendig, da zu Unterscheidung des eigentlichen (häufig langlebigen) Fluoreszenzsignals von (häufig kurzlebigen) Autofluoreszenzsignalen die Messung der Signale über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden muss.
Bei der Verwendung von CCD-Detektoren müssen mit Hilfe von Standards z.B. die Linearität und Sensitivität des Detektors im verwendeten Fluoreszenzwellenlängenbereich, das räumliche und zeitliche Auflösungsvermögen sowie die Bildfeldwölbung (Flatfieldbestimmung) des Detektors bestimmt werden. Konfokale Detektionssysteme müssen hinsichtlich der Bereiche, die angeregt bzw. zur Gesamtintensität beitragen, kalibriert werden.
Eine Kalibrierung von Experimenten mittels Fluoreszenzeichstandards ist notwendig, da die als Marker verwendeten Fluorophore hinsichtlich ihrer Fluoreszenzausbeuten aufgrund der Umgebungsbedingungen, denen sie ausgesetzt sind (z.B. Autofluoreszenz von Lösungskomponenten, pH- Wert, Temperatur, Bestrahlungszeit), beträchtlichen Schwankungen unterworfen sind und die absolute Quantifizierung von z.B. Hybridisierungsausbeuten auf Sonden-Arrays damit nur bedingt möglich ist.
Das Kalibrieren von verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen mittels Fluoreszenzeichstandards ist auch deswegen sehr wichtig, da nur eine solche Kalibrierung einen Vergleich von Fluoreszenzsignalen von Experimenten, die mit unterschiedlichen Detektionssystemen aber auch Geräten eines Systems gemessen wurden, erlaubt (system- oder geräteübergreifender Vergleich).
Im Stand der Technik sind unterschiedliche Lehren bekannt, die eine Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen bzw. Fluoreszenzsignalen ermöglichen sollen. Zur Kalibrierung von Fluroeszenzdetektionsgeräten können z.B. Chips, die aus einer fluoreszierenden Plastikschicht bestehen, verwendet werden. Diese Eichstandards haben den Nachteil, dass sie keine Kalibrierung der Detektionssysteme hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens oder hinsichtlich deren dynamischen Eigenschaften über einen weiten Fluoreszenzbereich erlauben. Auch eine
Bestimmung der Bildfeldwölbung von z.B. CCD-Detektoren ist mit diesen Standards nicht möglich, da aufgrund der Dicke des Chips eine Homogenisierung des Fluoreszenzsignals durch den Chip stattfindet. Damit ist eine Kalibrierung des Einflusses der geometrischen Verhältnisse auf die Detektion von Fluoreszenzsignalen, der insbesondere bei unterschiedlichen Detektionssystemen und Prinzipien eine entscheidende Rolle haben kann, weder gerate- noch systemübergreifend einstellbar.
Bei der Verwendung von CCD-basierten Fluoreszenzdetektoren und insbesondere bei der Anregung durch aufgeweitete oder strahlgeformte Laser oder multispektrale Beleuchtungssysteme wie z.B. Kaltlichtquellen sind zum Abgleich der Beleuchtungshomogenität bei der Verwendung von z.B. bewegten Streuscheiben aufwändige Berechnungen und Bildmanipulationen zur Definition des Flatfϊelds nötig. Fluoreszenzeichstandards, die eine Definition des Flatfields zur Korrektur der Beleuchtungshomogenität bei solchen direkt abbildenden Systemen ermöglichen, sind aus dem Stand der Technik nicht bekannt.
Weiterhin gibt es Fluoreszenzeichstandards, die auf der Basis von dotierten Gläsern beruhen. Auch diese Standards haben den Nachteil, dass sie keine Kalibrierung der Detektionssysteme hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens bzw. hinsichtlich deren geometrischen Eigenschaften erlauben, da wegen der Dimensionen solcher Standards eine Homogenisierung der Signale durch das Volumen der Glases stattfindet. Konfokale Systeme, bei denen nur bestimmte Bereiche und Schichten entlang der optischen Achse angeregt werden bzw. zur Gesamtintensität beitragen und das Problem von Transmissionsverlusten durch darüberliegende Strukturschichten besteht, können mit solchen Standards ebenfalls nicht hinsichtlich ihrer geometrischen Eigenschaften kalibriert werden.
In WO 01/06227 ist die Herstellung eines Fluoreszenzeichstandards auf der Basis von Mikro- bzw. Nanopartikeln und deren Anwendung zur Kalibrierung sowohl von Fluoreszenzdetektionssystemen als auch zur Referenzierung von Fluoreszenzintensitätssignalen in fluorometrischen Assays beschrieben. Diese Standards eignen sich ebenfalls nicht zur Kalibrierung der
Fluoreszenzdetektionssysteme hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens. Damit ist ein geräteübergreifender Vergleich von aus Sonden- Array basierten Experimenten gewonnenen Signalintensitätsdaten nur bedingt möglich.
Um die kurzlebige Untergrundfluoreszenz (z.B. von autofluoreszierenden Lösungsmittelmolekülen) von dem eigentlichen Fluoreszenzsignal zu unterscheiden und das eigentliche Signal referenzieren zu können, können langlebig emittierende Markerstoffe als Standard verwendet werden, deren Signal durch zeitaufgelöste Detektionsmethoden nachgewiesen wird. Dabei handelt es sich häufig um phosphoreszierende Chelate der Seltenerdmetalle (insbesondere die des Europium oder Terpium). Diese Stoffe besitzen aber den Nachteil, dass sie nur mit UV- Lichtquellen angeregt werden können. Darüber hinaus sind die verwendeten Chelate in wässriger Form häufig instabil.
Um eine quantitative Auswertung von molekularen Wechselwirkungen bei Sonden- Array basierten Experimenten durch Fluoreszenzmessung und eine Normierung solcher Signale zu erreichen, werden zur Eichung bzw. Referenzierung die
Experimente unter zweifacher Färbung der Sondenmoleküle, z.B. durch kompetative Hybridisierung, durchgeführt (M. Shena, D. Shalon, R.W. Davis, P.O. Brown, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science, 1995, 220,467-70 und D. Shalon, S.J. Smith, P.O. Brown, A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe for hybridization, Genome Res., 1996, 6, 639-45). Dabei solchen Eichstandards die durch die Referenzmoleküle erhaltenen Signale stets von den konkreten experimentellen Bedingungen abhängig sind, ist ein quantitativer, geräte- oder systemübergreifender Vergleich schwer möglich.
Anhand der Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Fluoreszenzeichstandards wird deutlich, dass ein großer Bedarf an Vorrichtungen besteht, die eine Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens sowie hinsichtlich deren geometrischen und dynamischen Eigenschaften ermöglichen.
Zusätzlich besteht ein großer Bedarf an Vorrichtungen zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen die den System- und geräteübergreifenden Vergleich und/oder den testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen von z.B. Sonden- Array basierten Experimenten ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die eine Referenzierung von Fluoreszenzsignalen hinsichtlich der gemessenen Intensität und/oder eine Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren Sensitivität, deren räumlichen und zeitlichen
Auflösungsvermögens und/oder hinsichtlich deren geometrischen und dynamischen Eigenschaften erlauben. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die leicht einen gerate- und systemübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen aus Experimenten, wobei es sich z.B. um Sonden- Array basierte Experimente handeln kann, ermöglichen.
Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Fluoreszenzeichstandards zur Verfügung zu stellen, die einen testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignaldaten erlauben. Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die eine Referenzierung bzw. Normierung von Fluoreszenzsignalen unter Berücksichtigung von Bleich- und Fluoreszenzlöschungseffekten erlauben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung von solchen Fluoreszenzeichstandards zur Verfügung zu stellen.
Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben, die sich aus der Beschreibung der Erfindung ergeben, dienen die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen definiert.
Erfindungsgemäß werden die Aufgaben dadurch gelöst, dass auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger in definierten Bereichen mindestens eine Polymerschicht so aufgebracht ist, dass diese Bereiche nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, wobei einige der aufgebrachten Polymerschichten sich hinsichtlich ihrer Dicke und/oder Zusammensetzung unterscheiden.
Solche erfindungsgemäßen Vorrichtungen, die im Folgenden auch als Fluoreszenzeichstandard bzw. Standard bezeichnet werden, zeigen in den definierten Bereichen nach entsprechender Bestrahlung eine Fluoreszenz, deren Intensität vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar ist. Damit können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards zur Kalibrierung von verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens, hinsichtlich deren geometrischen und dynamischen Eigenschaften sowie hinsichtlich deren Sensitivität verwendet werden.
Da der Wellenlängenbereich der in den definierten Bereichen eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch Änderung der Zusammensetzung der Polymerschichten vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar ist, können die erfindungsgemäß en Fluoreszenzeichstandards zur Kalibrierung von verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren dynamischen Eigenschaften verwendet werden.
Die Polymerschichten von erfindungsgemäßen Vorrichtungen werden in definierten Bereichen aufgebracht, deren Form und Größe vorbestimmbar und reproduzierbar eingestellt werden kann. Solche Fluoreszenzeichstandards, die auch als strukturierte Fluoreszenzeichstandards bezeichnet werden, können zur Kalibrierung von unterschiedlichen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden.
Da die Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards nur von der Dicke und/oder der Zusammensetzung der in den definierten Bereichen aufgebrachten Polymerschichten abhängen und z.B. nicht von Komponenten der Target-Lösungen beeinflusst werden, eignen sich die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards zur gerate- und detektionsübergreifenden und/oder zur testübergreifenden Bewertung und Referenzierung von Fluoreszenzsignalen, die z.B. bei Sonden- Array basierten Experimenten gemessen werden.
Bei den in den definierten Bereichen von erfindungsgemäßen Vorrichtungen aufgebrachten Polymerschichten kann es sich um eine oder mehrere
Polymerschichten handeln, die sich in ihrer Zusammensetzung und/oder Dicke unterscheiden. Die Polymerschichten bestehen aus mindestens einem fluoreszierenden Polymer oder aus einem Polymergemisch, wobei mindestens eine Polymerkomponente des Gemischs fluoreszierend ist. Bevorzugte fluoreszierende Polymere umfassen z.B. Positiv- und oder Negativ-Photolacke auf Basis von Epoxidharzen wie z.B. SU8 und Novo lacke und/oder PMMA und/oder photosensitives Polyimid und/oder Benzocyclobuten. Polymere, die für die Herstellung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards geeignet sind, d. h. die nach entsprechender Bestrahlung eine Fluoreszenz zeigen, sind auch aus US 6,091,488 oder US 4,482,424 bekannt. Die Polymerschichten von erfindungsgemäßen Vorrichtungen können neben mindestens einem Polymer zusätzlich fluoreszierende Stoffe enthalten, bei denen es sich nicht um Polymere handelt. Da diese Stoffe in die Polymerschichten eingebettet sind, werden ihre Fluoreszenzeigenschaften von Umgebungsfaktoren (z.B.
Komponenten der Target-Lösungen) nicht beeinflusst. Bevorzugt umfassen solche fluoreszierenden Stoffe Chromophore, organische Farbstoffe wie z.B. Azofarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Porphyninenfarbstoffe und/oder anorganische Farbstoffe wie z.B. metallische Farbstoffe und insbesondere Lanthanide. Solche Stoffe umfassen auch Perylen-Derivate, wie sie in H. Langhals, J. Karolin, L. B.-A.
Johansson, Spectroscopic properties of new and convenient Standards for measuring fluorescence quantum yields, J. Chem. Soc, Faraday Trans., 1998, 94, 2919-2922 und S. Kalinin, M. Speckbacher, H. Langhals, L. B.-A. Johansson, A new and versatile fluorescence Standard for quantum yield determination, Phys. Chem. Chem. Phys., 2001, 3, 172-174 erwähnt werden. Insbesondere kann es sich z. B. um N,N'- bis(l -hexylheptyl)-3,4:9, 10-perylenbis(dicarboximid), perlyene-3,4,9, 10- tetracarboxyltetramethylester, perlyene-3,4,9,10-tetracarboxyltetranatriumsalz und N2,N3-[bis(l-hexylheptyl)-benzo[ghi]perylen-2,3,8,9,ll,12-hexacarboxyl- 2,3:8,9:11, 12-tris(dicarboximid)-N1,N1'-(l,2-ethyl)-[N2'-(I-octylnonyl)-perylen- 3,4:9, 10-bis(dicarboximid) handeln.
Bei erfindungsgemäßen Vorrichtungen kann der Wellenlängenbereich der in den definierten Bereichen nach entsprechender Bestrahlung auftretenden Fluoreszenz durch die Wahl der Zusammensetzung der Polymerschichten eingestellt werden. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die auf einem nicht fluoreszierenden Träger in definierten Bereichen aufgebrachten Polymerschichten durch eine breitbandige Eigenfiuoreszenz gekennzeichnet, so dass sie im sichtbaren Spektralbereich sowie im nahen IR- und UV-Bereich nach schmalbandiger Anregung Fluoreszenzsignale in einem Wellenlängenbereich größerer Anregung zeigen. In einer anderen bevorzugten Ausführung der Erfindung zeigen die Polymerschichten in den definierten Bereichen eine schmalbandige Eigenfluoreszenz, deren Wellenlängenbereich von der Zusammensetzung der Polymerschichten abhängt.
Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bestehen die Polymerschichten nur aus einem Polymer, so dass der Wellenlängenbereich der Fluoreszenz nur von diesem Polymer abhängt. In weiteren bevorzugten Ausführungen der Erfindung bestehen die Polymerschichten aus einem oder mehreren nicht fluoreszierenden Polymeren und/oder einem oder mehreren zusätzlichen fluoreszierenden Stoffen, so dass der Wellenlängenbereich der Fluoreszenz dieser erfindungsgemäßen Vorrichtungen von der Art und der Kombination der Polymere und/oder der fluoreszierenden Stoffe abhängt.
Erfindungsgemäß kann die Intensität der von einer Polymerschicht in einem definierten Bereich nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz auf vielfältige Weise vorbestimmbar eingestellt werden. Die Intensität der in den definierten Bereichen nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz ist erfindungsgemäß durch die Zusammensetzung der Polymerschichten und/oder die Dicke der Polymerschichten einstellbar. Erfindungsgemäß ist unter der Dicke einer Polymerschicht in einem definierten Bereich sowohl die Dicke der einzelnen Polymerschichten in einem Bereich, wenn in einem Bereich mehrere
Polymerschichten aufgebracht sind, als auch die Dicke, die sich aus der Summe der Dicke der einzelnen Polymerschichten in einem Bereich ergibt, zu verstehen.
Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung erfolgt die Einstellung der Intensität in einem definierten Bereich durch das sukzessive Aufbringen von
Polymerschichten einheitlicher Zusammensetzung in diesem Bereich. Die in diesem Bereich entstehende Polymerschicht zeigt eine einheitliche Zusammensetzung. Entsprechend können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, die in allen definierten Bereichen Polymerschichten einheitlicher Zusammensetzung, aber unterschiedlicher Schichtdicke tragen. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung können auf diese Weise Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, bei denen die Intensität der in einem Bereich nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz sich proportional zu der Dicke der in dem jeweiligen Bereich aufgebrachten Polymerschicht verhält.
Die Intensität der Fluoreszenz in den definierten Bereichen von erfindungsgemäßen Eichstandards ist auch durch Änderung der Zusammensetzung der Polymerschichten einstellbar. Unter Zusammensetzung der Polymerschichten wird dabei erfindungsgemäß die Art und Anzahl der Polymerkomponenten in einer
Polymerschicht und/oder der zusätzlichen fluoreszierenden Stoffe sowie Menge der Polymerkomponenten und/oder zusätzlichen fluoreszierenden Stoffe pro Flächeneinheit verstanden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden Polymerschichten einheitlicher Dicke in verschiedenen definierten Bereichen aufgebracht, wobei die Polymerschichten sich nur hinsichtlich der Menge der zusätzlichen fluoreszierenden Teilchen pro Flächeneinheit unterscheiden. Auf diese Weise sind erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards herstellbar, bei denen die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz sich bei gleicher Schichtdicke proportional zu der Menge der fluoreszierenden Teilchen in den verschiedenen definierten Bereichen verhält. In einer anderen bevorzugten Ausführung der Erfindung kann damit bei konstanter Konzentration der fluoreszierenden Teilchen im Polymer durch Änderung der Schichtdicke quasi linear die resultierende Intensität eingestellt werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Einstellung der Intensität von erfindungsgemäß hergestellten Fluoreszenzeichstandards besteht darin, während des Herstellungsprozesses die erfindungsgemäßen Polymerschichten physikalischen Behandlungsmethoden wie Bestrahlung und Temperaturbehandlung (Tempern) zu unterwerfen. Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird momentan davon ausgegangen, dass durch diese Behandlungsmethoden der Vernetzungs- bzw. Quervernetzungsgrad der Polymerschichten und entsprechend die Fluoreszenzeigenschaften der Polymerschichten verändert werden. Der Begriff Vernetzungs- bzw. Quervernetzungsgrad ist dem Fachmann geläufig. Für die
Einstellung der Intensität von Polymerschichten durch Verfahren zur Veränderung des Vernetzungsgrads, eignen sich insbesondere Polymere, die eine duroplastische Vernetzung aufweisen wie z.B. die erwähnten Photolacke wie SU8.
Erfindungsgemäß können durch das sukzessive Aufbringen von Polymerschichten unterschiedlicher Dicke und/oder unterschiedlicher Zusammensetzung und/oder unterschiedlichen Quervernetzungsgrads in mehreren definierten Bereichen auf ein und dem selben Träger Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, die sich durch eine große Bandbreite sowohl hinsichtlich der Intensitäten als auch der Wellenlängenbereiche der nach entsprechender Bestrahlung auftretenden
Fluoreszenz unterscheiden. Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards sind vielfältig zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens sowie deren dynamischen und geometrischen Eigenschaften einsetzbar. Solche erfindungsgemäßen Vorrichtungen können auch als Fluoreszenzeichstandards verwendet werden, die leicht einen Vergleich von Fluoreszenzsignalen zwischen unterschiedlichen Detektionssystemen, aber auch Geräten eines Systems zulassen.
Die Fluoreszenzeigenschaften, wie z.B. die Quantenausbeute der fluoreszierenden Bereiche sind wegen der chemischen und physikalischen Eigenschaften der verwendeten Polymere und zusätzlichen fluoreszierenden Stoffe über die Bestrahlungszeit Änderungen unterworfen, so dass sich die resultierende Intensität nach einer gewissen Zeit der Nutzung verringert (Bleichen, siehe auch Miehler, 1992, Kunststoff-Mikromechanik: Morphologie, Deformations- und Bruchmechanismen., Hanser, München Wien). Erfindungsgemäß können die in definierten Bereichen abgelegten Polymerschichten durch geeignete Herstellungsprotokolle (z.B. durch so genannte Temperprotokolle) hinsichtlich ihrer Intensitätsveränderungen über die Zeit derartig optimiert werden, dass diese Veränderungen linear sind und demzufolge die Intensitätsverhältnisse der resultierenden Fluoreszenz der einzelnen definierten Bereiche des strukturierten Standards konstant bleiben.
Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können für die Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionsgeräten hinsichtlich deren zeitlichen
Auflösungsvermögens und zur Normierung von Experimenten hinsichtlich ihres zeitlichen Verlaufs verwendet werden. Da bei solchen erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards die Veränderungen der Intensität über die Zeit linear sind, können diese Standards auch für die Normierung von Experimenten auf Detektionsgeräten verwendet werden, deren optische Eigenschaften zeitlichen Änderungen (z.B. Laser- oder Lampenleistung) unterworfen sind.
Als bevorzugte Ausfuhrungsformen können damit auch erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, deren Fluoreszenzausbeute über die Bestrahlungsdauer und den Alterungsprozess linear bzw. hinreichend vorbestimmbar beschrieben werden kann. Solche Fluoreszenzeichstandards können z.B. zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen von Experimenten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt wurden, verwendet werden. Außerdem erlauben sie den gerate- und systemübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Polymerschichten in definierten Bereichen unterschiedlicher Form und/oder Größe auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger aufgebracht. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen haben diese definierten Bereiche eine quadratische, rechteckige und/oder kreisförmige Gestalt, deren Seitenlängen bzw. Durchmesser sich zwischen 500 nm und 5 mm bewegen.
Solche erfindungsgemäßen strukturierten Fluoreszenzeichstandards können zur Kalibrierung von unterschiedlichen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden. Unter räumlichem Auflösungsvermögen ist dabei erfindungsgemäß die Separierbarkeit zweier abgebildeter fluoreszierender Punkte zu verstehen.
Da erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden können, deren definierte Bereiche Maßtoleranzen im 10 nm-Bereich aufweisen, können solche Fluoreszenzeichstandards bei mikroskopischen Techniken, wie z.B. der konfokalen 3 -D-Mikroskopie als Normierungsinstrument für laterale und axiale Distanzen verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die definierten Bereiche in Array-Form auf dem Träger aufgebracht, d. h. dass mehrere definierte Bereiche gleicher Größe und Form zu einem Array-Element gruppiert sind, wohingegen Bereiche anderer Form und/oder Größe zu anderen Array-Elementen gruppiert sind.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards kann die Dicke der Polymerschichten so eingestellt werden, dass die maximale Dicke der verschiedenen Polymerschichten in einem Bereich deutlich geringer ist als die minimale Fokustiefe handelsüblicher konfokaler Detektionssysteme. Erfindungsgemäß sollten solche Fluoreszenzeichstandards eine bevorzugte Schichtdicke zwischen wenigen Nanometern und maximal 50 Mikrometern aufweisen, bevorzugt sollten die Schichtdicken zwischen einigen nm und 20 μm, zwischen 100 nm und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 200 nm und 5 μm liegen. Unter Fokustiefe ist erfindungsgemäß der Bereich entlang der optischen Achse zu verstehen, in dem eine Detektion von Fluoreszenzsignalen möglich ist. Dieser Bereich wird bei konventioneller Mikroskopie durch die numerische Apertur und bei konfokaler Scanningmikroskopie durch die Größe der Lochblenden (Pinholes) bestimmt. Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können zur Kalibrierung von physikalischen Aufbauten und Geräten, zur Erfassung von Fluoreszenzsignalen sowie zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen entsprechend markierte Substanzen und Substanzgruppen verwendet werden.
Die Polymerschichten werden erfindungsgemäß auf im Wesentlichen nicht fluoreszierenden, bevorzugt optisch durchlässigen Trägern aufgebracht. Bei bevorzugten Ausführungen der Vorrichtung bestehen diese Träger aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas und Borofloatglas oder aus optisch durchlässigen, nicht fluoreszierenden polymeren Scheiben, besonders bevorzugt aus Polycarbonat, PMMA und/oder Folien. Als Träger eignen sich unter Umständen auch optisch nicht transparente Materialien, die im Wesentlichen keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
In einer bevorzugten Ausfuhrung der Erfindung sind die Fluoreszenzeichstandards mit weiteren Trägersystemen verbunden. Diese Trägersysteme bestehen aus ebenfalls im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien. Bevorzugt handelt es sich dabei um optisch durchlässige Materialien wie Glas, besonders bevorzugt um Quarzglas, aber auch um optisch nicht transparente Materialien wie Plastik und/oder Metall, die im Wesentlichen keine Eigenfluoreszenz aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich bei diesem Trägersystem um einen handelsüblichen Objektträger, wie er für z. B für die
Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet wird. Auf solchen Trägern können z.B. Zellen oder Gewebeschnitte immobilisiert und durch Abgleich der Signale gegen den erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandard direkt ausgewertet werden. Eine Integration der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards kann z.B. auch direkt auf den Trägern erfolgen, auf denen Substanzbibliotheken in Form eines Sonden-Arrays abgelegt sind oder werden. Solche Fluoreszenzeichstandards erlauben eine unmittelbare Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und ermöglichen so die Bewertung von testspezifischen Untersuchungen. Zur Anbindung der Substanzbibliotheken kami die Oberfläche der Träger in mindestens den Bereichen, die die Substanzbibliothek enthalten sollen, durch Amino-, Carboxy-, Aldehyd- oder Epoxidgruppen funktionalisiert sein. Weitere funktionelle Gruppen zur Anbindung von Substanzbibliotheken sind dem Fachmann bekannt.
Dabei sind erfindungsgemäß die Träger, auf denen die Fluoreszenzeichstandards bzw. die Substanzbibliotheken in Form von Sonden-Arrays abgelegt werden, so zu wählen, dass sie im Wesentlichen nicht fluoreszierend und, wenn benötigt, optisch durchlässig sind. Bevorzugte Materialien für die Herstellung von solchen Trägern sind Glas, besonders bevorzugt Quarzglas, Borofloatglas und/oder Polymere und/oder Silicium. Es können auch Materialien gewählt werden, die optisch nicht durchlässig sind, aber im Wesentlichen nicht fluoreszierend sind.
Bei der Integration der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards in Sonden- Arrays können diese Sondenarrays durch Substanzbibliotheken auf Protein-, Peptid- oder Nukleinsäurebasis funktionalisiert sein. Bevorzugt handelt es sich bei den Proteinsubstanzbibliotheken, mit denen die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards funktionalisiert sind, um Antikörperbibliotheken, um Rezeptorbibliotheken, Rezeptor-Ligand-Bibliotheken und/oder Hormonbibliotheken.
Bei den Peptidbibliotheken, mit denen erfindungsgemäß Fluoreszenzeichstandards funktionalisiert sind, handelt es sich üblicherweise um pharmazeutisch oder biologisch aktive Peptide, um Antigenbibliotheken und oder um Rezeptor-Ligand- Bibliotheken und/oder um Hormonbibliotheken. Bei den Nukleinsäurebibliotheken, mit denen erfindungsgemäß Fluoreszenzeichstandards funktionalisiert sind, handelt es sich bevorzugt um DNA- Molekül-Bibliotheken und/oder RNA-Molekülbibliotheken. Besonders bevorzugt handelt es sich um mRNA-Bibliotheken, um rRNA-Bibliotheken, um genomische DNA-Bibliotheken und/oder cDNA-Bibliotheken und oder Plasmide.
In einer bevorzugten Ausführungsform können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards direkt in die Fluoreszenzdetektionssysteme integriert werden, so dass eine online-Kalibrierung der Geräte möglich ist. Da die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards durch den
Herstellungsprozess und durch die Zusammensetzung und Dicke der Polymerschicht sowie die Größe und Form der definierten Bereiche, in denen die Polymerschichten, die nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, aufgebracht sind, vorbestimmbar einstellbar sind, können die mit verschiedenen Detektionssystemen gemessenen Fluoreszenzintensitäten von Sonden- Array basierten Experimenten system- und geräteübergreifend direkt miteinander verglichen werden.
Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können auch als universelles externes Werkzeug verwendet werden, um mehrere unterschiedliche Detektionssysteme in der beschriebenen Weise zu kalibrieren.
Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards können auch in geschlossene Kammersysteme (z.B. PCR- und oder Hybridisierungskammern) integriert sein.
Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards können nach Verfahren hergestellt werden, bei denen die nach Bestrahlung fluoreszierenden Schichten gezielt in definierten Bereichen auf erfindungsgemäßen Träger aufgebracht werden. Solche Verfahren sind z.B. aus der Halbleitertechnik bekannt (US 6,091,488). Die Polymerschichten von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können bevorzugt durch photolithographische Verfahren, durch Spotten, durch Trockenätzen, durch Ionenimplantation, durch drucktechnische Verfahren, durch Walzen, durch Spritzgießen oder durch Oberflächenprägung auf den Träger aufgebracht werden.
Allgemein können die erfindungsgemäßen Polymerschichten, die auch als funktionelle Polymerschichten bzw. als Funktionsschichten bezeichnet werden, durch chemische und/oder physikalische Methoden zur Beschichtung auf dem Träger aufgebracht werden. Bei chemischen Methoden kann die Aufbringung der Polymerschichten dabei aus der Gasphase (z.B. durch CVD oder Oxidation), aus der Flüssigphase (z.B. durch elektrolytische, elektrochemische und andere nasschemische Verfahren) oder aus der Festphase (z.B. durch Oxidation) erfolgen. Bei physikalischen Methoden kann die Aufbringung aus der Gasphase oder aus dem Plasma ( z.B. durch PVD, Sputtern oder Bedampfen), aus der Flüssigphase (z.B. durch Spin-On-Verfahren, durch Lackieren, Spritzen oder Tauchen) oder aus der Festphase (z.B. durch Lamination) erfolgen. Es können auch Kombinationen dieser Verfahren oder nachträgliche Modifikationen wie Ionenimplantation angewandt werden (z.B. PECVD). Die jeweiligen Methoden und entsprechende Ausgestaltungen sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. W. Menz, J. Mohr, Mikrosystemtechnik für Ingenieure, VCH, 1997).
Die erfindungsgemäßen Polymerschichten können durch verschiedene Verfahren strukturiert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Dabei kann es sich um biochemische Methoden handeln, wie z.B. die enzymatisch vermittelte selektive Strukturierung (in WO98/08086 beschrieben), aber auch um chemische und/oder mikrotechnische Verfahren. Zu diesen gehören selektives Ätzen der Funktionsschicht gegen eine Maskierung, die selbst gegen den Ätzer unempfindlich ist (z.B. Flüssigoder Trockenätzen). Ebenfalls anwendbar sind Verfahren, die selektive Eigenschaftsveränderungen durch Strahlung, wie z.B. durch Bestrahlung mit UV oder Lasern bewirken. Dazu zählt die Photolithographie. Andere Methoden umfassen self-assembling layers. Diese Methoden können unter Verwendung einer Maskierung, aber auch durch „direkt scl reibende" Vorrichtungen (Spotten) durchgeführt werden. Drucktechnische Verfahren wie Spotten oder Offsetdruck oder andere Verfahren wie Walzen, Stempeln, Spritzgießen oder Oberflächenpräge- Verfahren können ebenfalls verwendet werden. Unterschiedliche Ausführungsformen der Methoden sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. W. Menz, J. Mohr, Mikrosystemtechnik für Ingenieure, VCH, 1997).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polymerschichten durch negative oder positive photolithographische Verfahren, besonders bevorzugt durch negative photolithographische Verfahren aufgebracht. Besonders bevorzugt sind negative photolithographische Verfahren, bei denen die Polymerschichten nach Bestrahlung im Entwickler unlöslich werden. Unbelichtete Bereiche bleiben dagegen im Entwickler löslich und können entfernt werden. Solche photolithographische Verfahren zur Strukturübertragung mittels eines Photoresists sind dem Fachmann bekannt. Dabei sind chemische und physikalische Verfahren, die das Aufbringen einer homogenen Funktionsschicht auf dem Träger erlauben, bevorzugt. Besonders bevorzugte Verfahren umfassen CVD-, PVD- und Spin-On-Verfahren.
Die Parameter, durch deren Wahl bei photolithographischen Verfahren (aber auch anderen Verfahren) die Dicke der Polymerschichten eingestellt werden kann, umfassen die Bearbeitungsparameter (Verfahrensparameter) wie die Umlaufgeschwindigkeit, die Dauer des Herstellungsprozesses, die Viskosität des Polymers, die Temperatur und/oder die Luftfeuchtigkeit. Bei der Verwendung von Photopolymeren umfassen die Bearbeitungsparameter auch die Bestrahlungsdosis, die Parameter des Entwicklungsprozesses und den Temperprozess.
Bei photolithographischen Verfahren kann die Form und Größe der definierten Bereiche, in denen die Polymerschichten aufgebracht werden, durch Verwendung einer Maske und/oder Lochmasken, z.B. durch Verwendung einer Maske im 1:1 Maßstab festgelegt werden. Je nach Aussparung der Maske sind damit erfindungsgemäß verschiedene geometrische Formen und Größen für die definierten Bereiche einstellbar. Ebenfalls können nach diesem Verfahren erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, bei denen die in verschiedenen definierten Bereichen abgelegten Polymerschichten eine Array-Form aufweisen. Als Lochmasken wird bevorzugt strukturiertes Chrom auf Glas und/oder Quarz verwendet.
Durch Wiederholen des photolithographischen Verfahrens können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, bei denen in verschiedenen Bereichen Polymerschichten mit unterschiedlicher Zusammensetzung und/oder Dicke aufgebracht sind. Durch Ändern der Temper- und/oder Bestrahlungsprotokolle, die bei photolithographischen Verfahren verwendet werden, kann zudem der Vernetzungsgrad (und damit die Intensität) der Polymerschichten in definierten Bereichen gezielt geändert werden. Durch Ändern der Temperprotokolle kann ebenfalls das Bleichverhalten von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards gezielt eingestellt werden.
Um erfindungsgemäß hergestellte Fluoreszenzeichstandards mit einem z.B. optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem zu verbinden, können alle Verfahren verwendet werden, die den Eichstandard mit dem
Trägersystem verbinden und die Eigenschaften des Fluoreszenzeichstandards nicht negativ beeinflussen. Zur Montage ist es notwendig, die Oberfläche der Standards durch geeignete Verfahren und Vorrichtungen in die Ebene von Probenträgern derart auszurichten, dass eine eindeutige Zuordnung der Lage der fluoreszierenden Schichten in Höhe und örtlicher Lage bezüglich definierter Bereiche des Trägers (z.B. Außenkanten) möglich ist. Dazu sind z.B. temporäres Aufkleben oder Vakuumeinrichtungen geeignet. Bevorzugt wird der Fluoreszenzeichstandard auf dem Trägersystem durch Kleben, durch Lagejustage oder durch ein Vakuumsystem aufgebracht. Bei der Herstellung solcher erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandards ist zu berücksichtigen, dass die Methoden zur Assemblierung der Fluoreszenzeichstandards und der Sonden-Arrays die Funktion der Bauelemente nicht negativ beeinflussen. Dementsprechend ist zu gewährleisten, dass z.B. die verwendeten Klebstoffe keine Autofluoreszenz zeigen und durch die verwendeten Bauteile keine wesentlichen Streuungen oder Reflektionen auftreten.
Werden die Fluoreszenzeichstandards z.B. mit Substanzbibliotheken als Sonden- Arrays funktionalisiert, kann der Fluoreszenzeichstandard mit dem Trägersystem, auf dem sich die Substanzbibliotheken befinden, verbunden sein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Fluoreszenzeichstandards auf Trägern zunächst im Waver-Maßstab gefertigt werden und die entsprechend vereinzelten Fluoreszenzeichstandards dann durch Ablegen von Substanzbibliotheken in Array-Form funktionalisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards lassen sich in unterschiedlicher Art und Weise zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen einsetzen. Durch die Verwendung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards für gerätespezifische Kalibrierungen lassen sich die Geräteeigenschaften definieren. Zum Beispiel kann die entsprechende Form und Größe der definierten Bereiche, in denen die nach entsprechender Bestrahlung fluoreszierenden Polymerschichten abgelegt sind, zur Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden. Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards, die in mehreren definierten geometrischen Bereichen Polymerschichten unterschiedlicher Dicke, aber einheitlicher Zusammensetzung aufweisen, wodurch die nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufene Intensität der Fluoreszenz in den verschiedenen Bereichen sich proportional zur Polymerschichtdicke verhält, erlauben eine Kalibrierung eines entsprechenden Detektionssystems hinsichtlich seiner dynamischen Eigenschaften. Erfindungsgemäß wird unter dynamischen Eigenschaften der Bereich auswertbarer Fluoreszenzintensitäten bei einer Messung verstanden. Z.B. lässt sich so der Intensitätsbereich festlegen, in dem ein CCD- Detektor linear arbeiten soll. Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können auch für die Einstellung der Sensitivität des Detektionssystems verwendet werden, d. h. der Festlegung, welche minimalen oder maximalen Fluoreszenzintensitäten ein Detektionssystem noch als Signal werten soll.
Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards, bei denen die nach entsprechender Bestrahlung in verschiedenen geometrischen Bereichen mit Polymerschichten unterschiedlicher Dicken und/oder Zusammensetzung hervorgerufene Intensität der Fluoreszenz vorbestimmbar und regulierbar abklingt, können benutzt werden, um Rückschlüsse auf das gerätespezifische Bleichen von Fluoreszenzsignalen zu ziehen.
Ferner können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards zur Kalibrierung der geometrischen Eigenschaften von Detektionssystemen, insbesondere zur Korrektur der Bildfeldwölbung (Flatfieldbestimmung) bei CCD-Detektoren verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird unter geometrischen Eigenschaften allgemein die örtliche Auflösung, der Abbildungsmaßstab, die Bildfeldwölbung und andere geometrische Fehler, die aus der optischen Konstruktion resultieren, verstanden.
Da die Fluoreszenzeigenschaften von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards nicht von äußeren Faktoren abhängen und vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar sind, können sie verwendet werden, um verschiedene Geräte des gleichen Detektionsprinzips (geräteübergreifende Kalibrierung) oder Geräte unterschiedlichen Detektionprinzips (systemübergreifende Kalibrierung) zu kalibrieren. Die Kalibrierung kann dabei auf Normwerte, die z.B. in Arbeitsgruppen und Labors verwendet werden, erfolgen, auf die dann Fluoreszenzsignale aus experimentellen Messungen bezogen werden. Damit sind die Signale, die bei der Auswertung z.B. eines Sonden- Array basierten Experiments mit unterschiedlichen Detektionssystemen erhalten werden, direkt vergleichbar (testübergreifender Vergleich).
Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards, die eine große Bandbreite hinsichtlich der Wellenlänge und Intensität der nach Bestrahlung der Polymerschichten in den definierten Bereichen hervorgerufenen Fluoreszenz zeigen, können auch für testspezifische Referenzierung von Fluoreszenzsignalen verwendet werden. Dies ist möglich, weil die testspezifischen Signale z.B. auf die Fluoreszenz eines definierten Bereichs bezogen werden können, deren Eigenschaften in dem Bereich des
Testsignals liegen. Damit ist eine Normierung der Testsignale möglich. Die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards erhaltenen normierten experimentellen Daten sind signifikant der Fehler, welche aus der Verwendung unterschiedlicher Detektoren bzw. verschiedener Einstellungen der Detektoren resultieren, behoben. Sie können daher direkt miteinander verglichen werden. Damit ermöglichen erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards den testübergreifenden und geräteübergreifenden Vergleich von
Fluoreszenzsignalintensitäten, die bei der Durchfuhrung von Sonden-Array basierten Experimenten und Tests erhalten worden sind.
Üblicherweise werden die Einstellungen von Scannern den entsprechenden Messergebnissen angepasst. Sind bei einem Sonden-Array basierten Experiment die resultierenden Fluoreszenzsignale schwach, werden die Laserleistung oder die Sensitivität des Detektors (z.B. die Vorspannung bei Verwendung eines PMT- Systems oder die Integrationszeit bei Verwendung eines CCD-Systems) erhöht. Außerdem unterliegen die Geräte gerätespezifischen Schwankungen. Dies ist insbesondere kritisch, wenn Ergebnisse aus unterschiedlichen Zeiträumen verglichen werden sollen, da z.B. bei Laserscannern die Leistung der eingesetzten Laser sich dramatisch ändern kann. Ein Vergleich von Fluoreszenzintensitätssignalen, die zwar bei der Durchführung von gleichartigen Sonden- Array-basierten Experimenten, aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen wurden, ist mit erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards problemlos möglich („time to time"- Vergleich), da über das Bleichverhalten des Standards die altersbedingten Geräteschwankungen normiert werden können. Damit können mit Hilfe von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards Detektionssysteme auch hinsichtlich ihrer
Alterungseigenschaften, wie z.B. der Änderung der Lampenleistungen kalibriert werden.
Sollen die Fluoreszenzsignale, die bei der Durchführung von verschiedenen Sonden- Array basierten Experimenten gemessen wurden, miteinander verglichen werden, stellen für die Bewertung der Ergebnisse insbesondere die Inhomogenität der biochemischen und fluidischen Prozesse in der Probe sowie die Schwierigkeiten bei der Spoterkennung während der Auswertung ein erhebliches Problem dar. Diese Probleme erschweren den qualitativen Vergleich verschiedener Sonden-Arrays. Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards erlauben eine erhebliche
Einschränkung der Fehler und qualitative Vergleiche von Ergebnissen, die bei der Durchführung von Experimenten mit verschiedenen Sonden-Arrays an demselben Gerät, durchgeführt wurden, werden möglich („test to test"- Vergleich).
Da mit dem dargestellten Fluoreszenzeichstandard auch unterschiedliche
Detektionssysteme kalibriert werden können, können die Ergebnisse von Sonden- Array basierten Experimenten gerate- und system- und damit auch laborübergreifend analysiert werden.
Vorrichtungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger in einem oder mehreren definierten Bereichen Polymerschichten, die hinsichtlich ihrer Schichtdicke und Zusammensetzung einheitlich sind, aufgebracht sind, können ebenfalls zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen verwendet werden. Solche Vorrichtungen eignen sich insbesondere, wenn sie über mehrere definierte Bereiche verfügen, zur gerate- und systemübergreifenden Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens.
Die Polymerschichten solcher Vorrichtungen können erfindungsgemäß die gleiche Zusammensetzung wie oben ausgeführt aufweisen, d. h. sie können fluoreszierende Polymere, Polymergemische mit mindestens einem fluoreszierenden Polymer und/oder zusätzliche fluoreszierende Stoffe enthalten.
Bei diesen Vorrichtungen sind die Intensität und der Wellenlängenbereich der in den Bereichen nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz gleichermaßen durch die Wahl der Zusammensetzung der Polymerschichten, der Schichtdicke und durch Veränderungen des Quervernetzungsgrads vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar. Auch alle anderen Eigenschaften wie Bleichverhalten, Größe und Form der definierten Bereiche sind auf die oben beschriebene Art und Weise einstellbar. Ebenso können solche Vorrichtungen durch alle oben dargestellten Verfahren hergestellt werden.
Solche Vorrichtungen können generell zur qualitativen und quantitativen Referenzierung von Fluoreszenzsignalen, besonders bevorzugt zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen aus Sonden-Array basierten Tests und/oder zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen verwendet werden.
Besonders bevorzugt können sie zur Kalibrierung von
Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden. Da die in einem oder mehreren definierten Bereichen aufgebrachten Polymerschichten hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Schichtdicke einheitlich sind, eignen sie sich nicht zur Kalibrierung der dynamischen Eigenschaften von Fluoreszenzdetektionssystemen. Auch eine Kalibrierung von Detektionssystemen über den Vergleich der Verhältnisse von unterschiedlichen Intensitäten, die nach Bestrahlung von unterschiedlichen Bereichen auftreten, ist mit diesen Vorrichtungen nicht möglich.
Solche Vorrichtungen können aber z.B. zum Abgleich von experimentell ermittelten Fluoreszenzsignaldaten auf Normwerte verwendet werden und erlauben so, den gerate- und systemübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen. Diese Vorrichtungen erlauben auch die Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren Sensitivität und deren gerätespezifischen Bleichverhaltens bei denen durch die Zusammensetzung und Dicke der Polymerschichten festgelegten Intensitäten und Wellenlängenbereichen.
Im Folgenden sind Beispiele dargestellt, die besonders bevorzugte Ausführungsformen bzw. Verwendungen von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards darstellen. Die Beispiele sind in keiner Weise einschränkend zu deuten.
Beispiel 1
Photolithographische Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards im Wafermaßstab (Abbildung 1):
Im Beispiel wird gezeigt, wie ein erfindungsgemäßer universeller Fluoreszenzeichstandard auf polymerer Basis durch negative Photolithographie hergestellt wird. Dabei wird ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard hergestellt, der in unterschiedhchen Bereichen gleicher Form und Größe Polymerschichten unterschiedlicher Dicke, aber im Wesentlichen gleicher Zusammensetzung trägt. Damit sind die Intensitäten der in den Bereichen nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz proportional zur Schichtdicke. Als Träger werden Materialien, die im gewünschten Fluoreszenzspektrum eine hohe Transparenz und geringe Eigenfluoreszenz zeigen, benutzt. Im vorliegenden Fall wurde Borofloatglas40 der Firma Schott (BF 40, Durchmesser: 100 mm, Dicke: 0,7 mm) als Trägermaterial gewählt. Das eigentliche Funktionsmaterial (dies sind die
Polymerschichten) sollte dagegen eine starke Eigenfluoreszenz aufweisen. Im gewählten Ausführungsbeispiel wurde als Polymer SU8-10, gelöst in PGMEA (organisches Lösungsmittel der Firma Sigma), gewählt, das die genannten Eigenschaften erfüllt. SU8-10 ist ein negatives, epoxy-basiertes Photopolymer, das bei UV-Bestrahlung unter 365nm polymerisiert (US 4,882,245). Die
Eigenfluoreszenz und die Photostrukturierbarkeit haben den großen Vorteil, dass das gewählte Polymer durch photolithographische Verfahren strukturiert werden kann.
Zu Beginn des Herstellungsprozesses wurde das Trägermaterial getempert (180°C, 20 min). Dadurch wurden etwaige Adsorbate (oft H2O) entfernt, die eine gute Haftung der SU8 Polymerschicht auf dem Substrat behindern. Um dies zu verstärken, wurde die Oberfläche des Substrats mit 3- Glycydoxypropyltrimethoxysilan modifiziert.
Auf das Substrat wurde dann eine erste Schicht mit einer Dicke entsprechend der gewünschten Fluoreszenz bzw. der gesuchten Sensitivität aufgebracht (siehe Abbildung 1). Dafür wurde das Spin-On-Verfahren verwendet, wobei durch Wahl der Parameter (Dauer: 30s, Umdrehungsgeschwindigkeit: 5000 rpm, Beschleunigung: 100 rpm s für 10 s und 1000 rpm s für 20 s, Grad der Verdünnung mit PGMEA) die gewünschte Dicke bzw. die Fluoreszenz eingestellt wurde. Dadurch wurde das Polymer homogen auf dem Substrat verteilt und das Lösungsmittel ausgetrieben. Die nachfolgende Temperung oberhalb des Glaspunktes (95°C, 15 min, so genanntes Pre-Bake) formiert und homogenisiert die Schicht. Die Polymerschichten wurden danach mittels üblicher Mikrophotolithographie strukturiert. Dazu wurde durch Bestrahlung des Photopolymers mit UV-Licht (15 min bei ca. 300-450 nm mit 15 mW/cm2, so genanntes Exposure) seine Löslichkeit im Entwickler (in diesem Fall PGMEA) verändert. SU8-10 zeigt ein Tonwert- negatives Verhalten, d. h. die UV-belichteten Bereiche polymerisieren und unbelichtete Bereiche bleiben im Entwickler lösbar. Die Bestrahlung erfolgte durch Maskenprojektion mittels Lithographiemasken, die entsprechende dünne Chrom- Strukturen auf Quarz aufwiesen. Diese Quarz-Maske besaß die gewünschte laterale Geometrie des Standards, die im Maßstab 1 :1 in das Polymer abgebildet wurde. Die kleinsten Strukturen in der Maske bestimmten daher auch die kleinsten Strukturen des Standards bzw. des zu detektierenden kleinsten Auflösungstests auf dem Standard.
Nachfolgend wurde durch einen Temperschritt die Vernetzung der belichteten Bereiche vervollständigt (95° C, 15 min, so genanntes Post-Exposure-Bake). Die unbelichteten Bereiche blieben vom Entwickler noch unberührt. Diese o.g. Prozedur (Spin-On, Pre-Bake, Exposure, so genanntes Post-Exposure-Bake) wurde nun mehrfach wiederholt, wobei die zuvor belichteten (und somit vernetzten) Bereiche in nachfolgenden Belichtungsschritten durch entsprechenden Masken unbelichtet blieben. Im Beispiel wurden aufeinander folgend die Belackung, Belichtung und Temperung drei Mal durchgeführt (Abbildung 1). Die drei Schichten hatten dabei bezüglich des Polymers die folgende Zusammensetzung:
1. Schicht: SU8-10 (Fa. MicroChem Inc.) gelöst in PGMEA (Fa. Sigma) 50% w/w 2. Schicht: SU8-10 (Fa. MicroChem Inc.) gelöst in PGMEA (Fa. Sigma) 33% w/w
3. Schicht: SU8-10 (Fa. MicroChem Inc.) gelöst in PGMEA (Fa. Sigma) 20% w/w
Das Photopolymer SU8-10 wurde in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen in PGMEA gelöst. Dadurch haben die Lösungen unterschiedliche Viskositäten, wodurch Polymerschichten mit unterschiedlicher Dicke herstellbar sind. Das Lösungsmittel wird später weitestgehend ausgetrieben (zu mehr als 95%), so dass die Polymerschichten eine im Wesentlichen gleiche Zusammensetzung aufweisen.
Danach wurde die Polymerstruktur durch Eintauchen in PGMEA (Fa. Sigma) entwickelt und nochmals getempert (120° C, 30 min, so genannter Hard-Bake).
Infolgedessen entstanden stufenförmige geometrische Strukturen (Abbildung 1). Die Stufenhöhen korrespondieren dann mit einer entsprechenden Fluoreszenz-Intensität, die lateralen Geometrien mit dem Auflösungsvermögen.
Beispiel 2:
Beispiele für erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards
In Abbildung 2A ist ein erfmdungs gemäßer Fluoreszenzeichstandard in Array-Form gezeigt, der auf Borofloatglas (Firma Schott) mikrolithographisch gemäß des Verfahrens aus Beispiel 1 hergestellt wurde. Der Standard besteht aus 9 Array- Elementen, die alle fluoreszierende Polymerschichten in quadratischer Form enthalten. Die Quadrate der 9 Array-Elemente verfügen über 3 Intensitätsstufen, welche aus 3 verschiedenen Dicken resultieren. Durch verschiedene Strukturgrößen und Abstände werden verschiedene Integrationsdichten von molekularen Arrays simuliert. Die Standards wurden im Wafermaßstab erzeugt und in Chips vereinzelt.
Der Standard eignet sich, um eine Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögens, der geometrischen Fehler, der abbildenden optischen sowie elektromechanischen und informationstechnischen Systeme als auch der Sensitivität des jeweiligen Geräts zum Zeitpunkt der Messung vorzunehmen. Zusätzlich kann der Standard zur geräteübergreifenden Bewertung der Fluoreszenzsignale von Sonden- Array basierten Experimenten verwendet werden. Dazu wurde der beschriebene Fluoreszenzstandard in verschiedenen Readersystemen ausgelesen, als 16bit-*.tif Bilder exportiert und mittels einer speziellen Software (IconoClust der Firma Clondiag) analysiert. Die unterschiedlich großen fluoreszierenden Strukturen auf dem Fluoreszenzeichstandard können verwendet werden, um geometrische Abweichungen der verschiedenen Detektionssysteme zu korrigieren. So lässt sich beispielsweise die Bildfeldwölbung eines optischen Systems zur
Fluoreszenzdetektion anhand des dargestellten Fluoreszenzeichstandards durch geeignete Bildverarbeitungsprozesse analysieren und durch entsprechende Einstellung der optischen oder informationstechnischen Elemente beheben.
Es ist fernerhin möglich, die Einstellungen der Detektionssysteme z.B. hinsichtlich der Laser- oder Lampenleistung, der Integrationszeit pro Spot/Subarray oder der Signalverstärkung/Einstellung des Detektors auf einen bestimmten Wert der resultierenden Fluoreszenz des Standards abzustimmen. Damit kann z.B. der Langzeitdrift eines Detektionsapparats, welcher durch Alterungsprozesse der verwendeten Laser, Lampen oder Detektoren hervorgerufen werden kann, bestimmt werden.
Unterschiedliche Fluoreszenzsysteme können also mittels des Fluoreszenzeichstandards hinsichtlich ihrer leistungsbestimmenden Parameter kalibriert werden. Entsprechend können die Fluoreszenzsignale, die bei der Auswertung eines Sonden-Array basierten Experiments mit verschiedenen Detektionssystemen gemessen werden, direkt miteinander verglichen werden.
In Abbildung 2B ist ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard in Array-Form gezeigt, der auf Borofloatglas (Firma Schott) durch Spotten hergestellt wurde. Zunächst wurden fluoreszierende Standards auf verschiedenen Trägem erzeugt, indem Polymergemische SU8 (MCC Inc.) und Novolack (AZ 1514 Clariant) im Massenverhältnis 1:2, 1:3, 1:5 hergestellt und auf die Glassubstrate aufgebracht wurden. Dazu wurden Objektträger gereinigt und mittels eines Nadelspotters (Microgrid 2 /Biorobotics) mit den Polymergemischen unter Benutzung einer ungeschlitzten Spotternadel (Solidpins/Biorobotics) bespottet. Alternativ wurden die Polymergemische mit einem piezogetriebenen Dispenserkopf (Durchmesser 100 μm, beheizte Düse der Firma microdrop) aufgebracht. Dabei wurde die Dispenserdüse geheizt (55°C).
Anschließend wurde folgende Behandlung der Proben vorgenommen.
Pre-Bake: 95°C, 15min Exposure: 1min, 15mW/cm2, Flutbelichtung Post-Bake: 95°C, 15min Hard-Bake: 120°C, 60min
Der so hergestellte Standard besteht aus kreisförmigen Bereichen (Spots) einheitlicher Dimensionen, deren Polymerschichten sich sowohl hinsichtlich der Dicke als auch der Zusammensetzung unterscheiden. Daher verfugt der Standard über ein breites Spektrum an Intensitäten und Wellenlängenbereichen der in den Spots hervorrufbaren Fluoreszenz. Der Standard kam in gleicher Weise wie der in Abbildung 4A eingesetzt werden.
Beispiel 3:
Integration von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards in Trägersysteme.
In Abbildung 3 ist gezeigt, wie ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard auf einem Objektträger durch Kleben aufgebracht ist. Als Kleber wurde
Polydimethylsiloxan (Sylgard® der Firma Dow) verwendet. Solche Standards können als externes Werkzeug zur Kalibrierung von unterschiedlichen Detektionssystemen verwendet werden. Beispiel 4:
Einstellung der Intensität und des Bleichverhaltens bei erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards - Verwendung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards über mehrere Messungen hinweg.
Im Beispiel ist gezeigt, dass bei der mikrolithographischen Herstellung von Fluoreszenzeichstandards mit Polymerschichten in drei unterschiedlichen Dicken (dl, d2, d3) ein Temperprotokoll so gewählt werden kann, dass die Intensität der in den definierten Bereichen nach mehrfacher Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz linear abklingt.
Abbildung 4A zeigt das Bleichverhalten der drei Schichten ohne thermische Behandlung. Es handelt sich um ein nicht-lineares Bleichverhalten. Abbildung 4B zeigt das Bleichverhalten der drei Schichten nach thermischer Behandlung. Es handelt sich um ein lineares Bleichverhalten. Zur Linearisierung des zeitlichen Verlaufs der Änderung der resultierenden Fluoreszenzintensitäten wurden die Proben während des Herstelluiigsprozesses einer thermischen Behandlung von zwei Stunden bei 180°C im Ofen unterzogen und anschließend für ca. 40 Minuten bei einer Wellenlänge zwischen 520 und 600 nm mit 40 mW/cm2 bestrahlt. Dabei ändert sich das Intensitätsverhalten dergestalt, dass sich das Dickenverhältnis nicht mehr direkt proportional zu dem resultierenden Intensitätsverhältnis verhält, allerdings sind die Intensitätsverhältnisse der verschieden dicken Strukturen nun bei Bestrahlung konstant (siehe Abbildung 4C).
Man erkennt, dass durch Ändern des Temperprotokolls Fluoreszenzeichstandards herstellbar sind, die über ein wesentlich weniger ausgeprägtes und wesentlich konstanteres Bleichverhalten verfugen. Die Messungen erfolgten mit einem konfokalen Biochip-Sanner Scanarray 4000 (Packard) bei 100% Laserleistung und 85% PMT-gain. Solche langzeitstabilen Fluoreszenzeichstandards können hervorragend zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich ihrer alterungsbedingten Eigenschaften verwendet werden, da die Intensitäten der drei Schichtdicken sich gleichermaßen verändern und damit das Verhältnis der
Intensitäten der verschieden dicken Schichten konstant bleibt (siehe Abbildung 4C).
Beispiel 5:
Referenzierung von Fluoreszenzsignalen
Es wurden Fluoreszenzeichstandards wie in Beispiel 1 hergestellt, bei denen in den definierten Bereichen Polymerschichten mit unterschiedlicher Dicke aufgebracht sind.
Aus Abbildung 5 wird deutlich, dass mit diesen Standards die Referenzierung von Messungen in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen möglich sind (Cy3 und Cy5 absorbieren bei unterschiedlichen Wellenlängen) und die gemessenen Intensitäten sich proportional zur Schichtdicke (dl, d2, d3) verhalten. Dieser Fluoreszenzstandard kann daher wegen seines breitbandigen Fluoreszenzverhaltens in verschiedenen Wellenlängenbereichen zur Kalibrierung von Readersystemen verwendet werden. Mit solchen Fluoreszenzeichstandards, die über eine breitbandige Eigenfluoreszenz verfugen, ist zudem eine Referenzierung von Fluoreszenzsignalen in verschiedenen Wellenlängenbereichen möglich. Darüber hinaus können mit solchen Standards Laserscanner hinsichtlich ihrer Sensitivität kalibriert werden. Die Messungen erfolgten mit einem konfokalen Biochip-Sanner Scanarray 4000 (Packard) bei 100% Laserleistung und 85% PMT-gain. Beispiel 6:
Standardisierung von Sonden-Array basierten Experimenten.
Zur Standardisierung von Sonden-Array basierten Experimenten wurden erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards verwendet, die ebenfalls ein Sonden- Array aufwiesen. Der Fluoreszenzeichstandard kann dann beim Auslesevorgang vor oder nach der Durchführung der biochemischen Wechselwirkungsreaktion jeweils mitberücksichtigt werden (siehe Abbildung 6A)
Es wurden erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards auf epoxidierten Objektträgern (Firma QMT) durch Ultraschallbohrung und Einkleben aufgebracht, die in den definierten Bereichen Polymerschichten mit gleicher Polymerdicke aber unterschiedlichem Gehalt bezüglich der Polymerkomponenten aufwiesen. Damit zeigen diese Bereiche nach entsprechender Bestrahlung unterschiedliche Intensitäten. Auf den Träger wurde dann eine Reihe von PCR-Produkten (aceA, acs, amiB, ampG, argC, atpA, creB, icdA, napH, rpoA, rpoH, rpoS) durch Spotting (Firma BioRobotics Microgrid II) aufgebracht. Speziell aufgereinigte und mit Fluoreszenzfarbstoffen (Cy3 oder Cy5 der Firma Amersham) markierte spezifische cDNA wurde durch Hybridisierung an den PCR-Spots immobilisiert. Anschließend wurden die Proben mittels eines konfokalen Laserscanners (Affymetrix, Packard) ausgelesen und die Ergebnisse mittels einer speziellen Software (IconoClust der Firma Clondiag) analysiert. Dabei erfolgte die Bewertung der Ergebnisse unter Referenzierung auf die verschiedenen Intensitäten der unterschiedlichen Bereiche des Fluoreszenzeichstandards.
Die drei Balken einer cDNA stehen für die Referenzierung der Signaldaten der Hybridisierung auf drei verschiedene Bereiche des Standards, die unterschiedliche Intensitäten aufweisen. Dazu wurden die Ergebnisse auf die verschiedenen Intensitätsstufen normiert und unter Berücksichtigung des Gehalts der Polymerschichten auf eine Stufe gerechnet. Die Graphik (Abbildung 6B) zeigt, dass eine solche Rückrechnung zulässig ist, da für jede cDNA gleiche Ergebnisse erhalten werden, unabhängig davon, aufweichen Bereich die Messung der cDNA bezogen wird. Somit ist es bei bekanntem Gehalt der Polymerschichten zulässig, jeden Bereich zur Referenzierung zu verwenden, was die Universalität des Standards erhört. Die Messungen erfolgten mit einem konfokalen Biochip-Sanner Scanarray 4000 (Packard) bei 100% Laserleistung und 85% PMT-gain.
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1
Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzstandards durch mehrstufige Photo lithographie (Negativprozess).
Abb. 2A
Erfindungsgemäßer Fluoreszenzstandard in Array-Form, mikrolithographisch hergestellt auf Boro floatglas.
Abb. 2B
Erfindungsgemäßer Fluoreszenzstandard in Array-Form, hergestellt durch Spotten aufBorofloatglas.
Abb. 3 Fluoreszenzeichstandard auf Objektträger.
Abb. 4A
Veränderungen der resultierenden Luminiszenzintensitäten durch Einwirkung von Strahlung im sichtbaren Bereich (Bleichen oder Bleaching). Die Intensität ist als Grauwert angegeben. Abb. 4B
Änderung der Fluoreszenzintensität über die Anzahl der Messungen in einem Weißlicht/CCD System nach Durchführung eines angepassten Temperprotokolls. Die Intensität ist als Grauwert angegeben.
Abb. 4C
Durch angepasste Temperprotokolle ist es möglich, das Bleichverhalten der polymeren Schichten so anzugleichen, dass Veränderungen der Fluoreszenzausbeute über die Anzahl durchgeführter Messungen keinen Einfluss auf die resultierenden Intensitätsverhältnisse hat. Die obere Linie gibt das d3/d2-Verhältnis, die untere Linie das d2/dl -Verhältnis aus Abbildung 4A an.
Abb. 5 Messergebnisse eines Scans für verschiedene Farbstoffe. Die Intensität ist als Grauwert angegeben. Diese Standards sind geeignet zur Normierung von Ergebnissen in verschiedenen Wellenlängenbereichen.
Abb. 6A Inverser Scan eines gespotteten Sonden-Arrays. Im oberen Teil erkennt man den Fluoreszenzeichstandard (1). Darunter befindet sich der Sonden-Array (2). Es handelt sich um gespottete PCR-Produkte nach Hybridisierung mit Cy3/Cy5 markierter cDNA.
Abb. 6B
Es wurden verschiedene PCR-Produkte gespottet und mit cDNA hybridisiert. Die Ergebnisse wurden auf die verschiedenen Intensitätsstufen von verschiedenen Bereichen normiert (jeweils die drei Balken) und unter Berücksichtigung des Gehalts der Stoffe in den Polymerschichten auf eine Stufe gerechnet. Die Grafik zeigt, dass eine solche Rückrechnung zulässig ist. Es ist also bei bekanntem Gehalt egal, welcher Bereich zur Noπnierung benutzt wird.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenz-Signalen, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger in definierten Bereichen mindestens eine nach entsprechender Bestrahlung fluoreszierende Polymerschicht aufgebracht ist und dass mindestens zwei der Polymerschichten sich hinsichtlich ihrer Dicke und/oder Zusammensetzung unterscheiden.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten ein oder mehrere Polymere enthalten, wobei mindestens eines der Polymere nach entsprechender Bestrahlung fluoresziert.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere Postiv- und/oder Negativ-Photolacke, insbesondere auf Basis von Epoxidharzen wie SU8 und/oder Novolacke und/oder PMMA und/oder photosensitives Polyimid und/oder Benzocyclobuten umfassen.
4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten neben mindestens einem Polymer zusätzlich fluoreszierende Stoffe enthalten.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierenden Stoffe organische Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Porphyninenfarbstoffe und/oder anorganische Farbstoffe, insbesondere metallische Farbstoffe und/oder Lanthanide und/oder Perylen-Derivate umfassen.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Schichtdicke und oder der Zusammensetzung der Polymerschichten einstellbar ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz proportional zu der Dicke der in den Bereichen aufgebrachten Polymerschichten einstellbar ist.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.
9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungswellenlängenbereich der Polymerschichten durch die Wahl der Polymere und/oder der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.
10. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der Polymere und/oder durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.
11. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.
12. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Dicke der Polymerschichten in mindestens einem der Bereiche deutlich kleiner als die minimale Fokustiefe der zur Fluoreszenz-Messung verwendeten Detektionssysteme ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Dicke der Polymerschichten zwischen wenigen Nanometern und maximal 50 μm liegt, bevorzugt zwischen 100 nm und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 200 nm und 5 μm liegt.
14. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche sich in Form und/oder Größe unterscheiden.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche die Form von Quadraten und/oder Rechtecken mit Seitenlängen zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.
16. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche die Form von Kreisen mit Durchmessern zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.
17. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche in Array-Form auf dem Träger aufgebracht sind.
18. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, metallisiertes Glas, Silizium, Metall und/oder Kunststoffe handelt.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18 , dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, besonders bevorzugt um Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder Kunsstoffe, besonders bevorzugt um PMMA und/oder um Polycarbonat handelt.
20. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fluoreszenzeichstandard mit einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, metallisiertem Glas, Silizium, Metall, und/oder Kunststoffen besteht.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fluoreszenzeichstandard mit einem optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder aus Kunststoffen, besonders bevorzugt aus PMMA und/oder aus Polycarbonat besteht.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägersystem um einen üblichen Objektträger handelt.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Träger oder Trägersystem um einen Sonden-Array handelt, auf dem bevorzugt mindestens eine Substanzbibliothek immobilisiert ist.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Peptiden und/oder Proteinen, bevorzugt in Form von Antikörpern, Rezeptoren, Rezeptor-Ligand-Molekülen, Hormonen oder biologisch aktiven Peptiden immobilisiert sind.
25. Vorrichtung nach Anspruch 23 , dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Nukleinsäuremolekülen, bevorzugt in Form von DNA-Molekülen und/oder RNA-Molekülen, besonders bevorzugt in Form von genomischer DNA, mRNA, cDNA und oder rRNA immobilisiert sind.
26. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger-System oder Objektträger Zellen, Gewebeschnitte, pharmazeutisch wirksame Verbindungen und/oder Plasmide immobilisiert sind.
27. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten durch mikrotechnische Verfahren, bevorzugt durch photolitographische Verfahren, durch Trockenätzen und/oder durch Ionenimplantation, und/oder durch drucktechnische Verfahren, bevorzugt durch Spotten, durch Offsetdruck und/oder durch Walzen, durch Spritzgießen oder durch Oberflächenprägung auf den Träger aufgebracht und oder strukturiert werden.
28. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten durch positive oder negative photolithographische Verfahren auf den Träger aufgebracht und/oder strukturiert werden.
29. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten als homogene Schichten durch mikrotechnische Verfahren, bevorzugt durch CVD-, PVD- , besonders bevorzugt durch Spin-On-Verfahren auf den Träger aufgebracht werden.
30. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Polymerschichten in Abhängigkeit von den Verfahrensparametern, besonders bevorzugt in Abhängigkeit von der Viskosität des Polymers, von der Temperatur, von der Luftfeuchtigkeit oder von der
Umlaufgeschwindigkeit, bei photolithographischen Verfahren besonders bevorzugt in Abhängigkeit von der Bestrahlungs-Dosis, dem Entwicklungsprozess und dem Temperverfahren eingestellt werden kann.
31. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der
Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die geometrische Form der bei entsprechender Bestrahlung fluoreszierenden Bereiche durch entsprechende Aussparungen in einer Maske, bevorzugt in einer Lochmaske auf Basis von strukturiertem Chrom auf Quarz definiert wird.
32. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsverhalten der Polymerschichten durch Temper- und/oder Bestrahlungsprotokolle einstellbar ist.
33. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung mit einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden, bevorzugt optisch durchlässigen Trägersystem durch Kleben, durch Lagejustage und/oder durch ein Vakuumsystem verbunden wird.
34. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Kalibrierung, bevorzugt zur on-line Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich ihrer Sensitivität, ihres räumlichen und/oder zeitlichen Auflösungsvermögens und/oder hinsichtlich ihrer geometrischen und/oder dynamischen und/oder alterungsbedingten Eigenschaften.
35. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 34 zur Laserleistungsmessung und/oder -Steuerung und/oder zur Lampenleistungsmessung und/oder zum Integrationszeitabgleich und/oder zur Auflösungsanpassung.
36. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 34 zur Flatfieldbestimmung und/oder zur Linearisierung von CCD-Readersystemen.
37. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Referenzierung und/oder zum system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen, wobei es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Sonden-Array basierten Interaktionsstudien handelt.
38. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 37 zum system- und/oder geräteübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen durch Noπnierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten.
39. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 37 zur Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen durch Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten zur Definition absoluter Ergebnisse oder zur Definition relativer, auf die Fluoreszenz polymerer Schichten bezogener Ergebnisse.
40. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Protein-Protein- Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von Antikörper- Antigen- und/oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstudien, und/oder von Nukleinsäure-Nukleinsäure- Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von DNA-RNA- und/oder DNA-DNA- und/oder RNA-RNA- Interaktionsstudien und/oder von Protein-Nukleinsäure- Interaktionsstudien handelt.
41. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zum system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von zellulären Lokalisationsexperimenten und Gewebeschnitten, die durch Fluoreszenz- Mikroskopie auswertbar sind.
42. Verwendung einer Vorrichtung, umfassend einen im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger, auf dem in einem oder mehreren definierten Bereichen eine hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Dicke einheitliche Polymerschicht so aufgebracht ist, dass dieser Bereich oder diese Bereiche nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen und/oder zum system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen.
43. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Polymerschichten ein oder mehrere Polymere, von denen mindestens ein Polymer nach entsprechender Bestrahlung fluoresziert, bevorzugt Postiv- und/oder Negativ- Photolacke, insbesondere auf Basis von Epoxidharzen wie SU8 und/oder Novolacke und/oder PMMA und/oder photosensitives Polyimid und/oder Benzocyclobuten umfassen.
44. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 oder 43, wobei die Polymerschichten mindestens ein Polymer und zusätzliche fluoreszierende Stoffe, bei denen es sich nicht um Polymere handelt, bevorzugt organische Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Porphyninenfarbstoffe und/oder anorganische Farbstoffe, insbesondere metallische Farbstoffe und/oder Lanthanide und/oder Perylen-Derivate enthalten.
45. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 44, wobei die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Schichtdicke und/oder der Zusammensetzung der Polymerschichten einstellbar ist.
46. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 45, wobei die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.
47. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 46, wobei der Anregungswellenlängenbereich der Polymerschichten durch die Wahl der Polymere und/oder der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.
48. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 47, wobei das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der Polymere und/oder durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.
49. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 48, wobei das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.
50. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 49, wobei die maximale Dicke der Polymerschicht deutlich kleiner als die minimale Fokustiefe der zur Fluoreszenz-Messung verwendeten Detektionssysteme ist.
51. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 50, wobei die maximale Dicke der Polymerschicht zwischen wenigen Nanometern und maximal 50 μm liegt, bevorzugt zwischen 100 nm und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 200 nm und 5 μm liegt.
52. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 51 , wobei die definierten Bereiche sich in Form und/oder Größe unterscheiden.
53. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 52, wobei die definierten Bereiche die Form von Quadraten und/oder Rechtecken mit Seitenlängen zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.
54. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 52, wobei die definierten Bereiche die Form von Kreisen mit Durchmessern zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.
55. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 54, wobei die definierten Bereiche in Array-Form auf den Träger aufgebracht sind.
56. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 55, wobei der Träger aus im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, metallisiertes Glas, Silizium, Metall, und/oder Kunststoffe handelt.
57. Verwendung einer Vorrichtmig nach Anspruch 56, wobei der Träger aus optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, besonders bevorzugt um Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder Kunsstoffe, besonders bevorzugt um PMMA und/oder um Polycarbonat handelt.
58. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 57, wobei der Fluoreszenzeichstandard mit einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, metallisiertem Glas, Silizium, Metall, und/oder Kunststoffen besteht.
59. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 58, wobei der Fluoreszenzeichstandard mit einem optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder aus Kunststoffen, besonders bevorzugt aus PMMA und/oder aus Polycarbonat besteht.
60. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägersystem um einen üblichen Objektträger handelt.
61. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 60, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Träger oder Trägersystem um einen
Sonden-Array handelt, auf dem bevorzugt mindestens eine Substanzbibliothek immobilisiert ist.
62. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 61 , dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Peptiden und/oder Proteinen, bevorzugt in Form von Antikörpern, Rezeptoren, Rezeptor-Ligand-Molekülen, Hormonen oder biologisch aktiven Peptiden immobilisiert sind.
63. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 61 , dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Nukleinsäuremolekülen, bevorzugt in Form von DNA-Molekülen und/oder RNA-Molekülen, besonders bevorzugt in Form von genomischer DNA, mRNA, cDNA und/oder rRNA immobilisiert sind.
64. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger-System oder Objektträger Zellen, Gewebeschnitte, pharmazeutisch wirksame Verbindungen und/oder Plasmide immobilisiert sind.
65. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64 zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen, wobei die Detektionssysteme hinsichtlich ihres räumlichen Auflösungsvermögens, ihrer Sensitivität, ihrer geometrischen und/oder ihrer alterungsbedingten Eigenschaften kalibriert werden.
66. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64, wobei die Detektionssysteme hinsichtlich der Laserleistung und/oder -Steuerung und/oder Lampenleistung und/oder Auflösungsanpassung kalibriert werden.
67. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 65 oder 66, wobei die Kalibrierung der Fluoreszenzdetektionssysteme on-line erfolgt.
68. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64, wobei die Referenzierung den system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen, bei denen es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Sonden-Array basierten Interaktionsstudien handelt, umfasst.
69. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 68, wobei der system- und/oder geräteübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen durch
Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten erfolgt.
70. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 68, wobei die Referenzierung die Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen durch Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten zur Definition absoluter Ergebnisse oder zur Definition relativer, auf die Fluoreszenz polymerer Schichten bezogener Ergebnisse umfasst.
71. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 68 bis 70, wobei es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Protein-Protein- Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von Antikörper- Antigen- und/oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstudien, und/oder von Nukleinsäure-Nukleinsäure- Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von DNA-RNA- und/oder DNA-DNA- und/oder RNA-RNA- Interaktionsstudien und/oder von Protein-Nukleinsäure- Interaktionsstudien handelt.
72. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64, wobei es sich um einen system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von zellulären Lokalisationsexperimenten und Gewebeschnitten, die durch Fluoreszenz-Mikroskopie auswertbar sind, handelt.
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