WO2003070935A1 - Amorces pour l'amplification d'acides nucleiques servant a la detection de l'arnm d'un gene domestique et methode d'essai faisant intervenir ces amorces - Google Patents

Amorces pour l'amplification d'acides nucleiques servant a la detection de l'arnm d'un gene domestique et methode d'essai faisant intervenir ces amorces Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification primer for detecting a housekeeping gene.
  • the LAMP method is a gene amplification method using a plurality of primers including a primer that forms a hairpin structure at the end of an amplification product as a strand displacement reaction proceeds.
  • the initial reaction single-stranded loops were added at both ends from type I DNA using two types of inner primers (FIP and RIP), two types of outer primers (F3 primer and R3 primer), and a strand displacement DNA polymerase.
  • a dumbbell-like structure is synthesized.
  • Actin is a protein found abundantly in all eukaryotic cells. This protein provides a number of structural and regulatory functions, including mitotic roles, motility and structural integrity in cells of higher organisms. In vertebrates, six actin isoforms have been identified, broken down into four muscle types (skeletal, cardiac, aortic and gastric smooth muscle actins) and two non-muscle types (actin). (-Actin and T / -actin in the cytoplasm). Muscle actin is tissue-specific in its presence and is involved in muscle contraction. In contrast, cytoplasmic actin is found essentially in all cells and is involved in many cell functions. Actin present in cells depends on its diversity Nevertheless, the amino acid sequence is highly conserved among actin types and eukaryotic species.
  • Non-Patent Document 1 Bio Venture, 2001, Vol. 1, No. 1, p. 109-115
  • a primer for nucleic acid amplification for detecting GAPDH comprising an oligonucleotide selected from any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 58, 62 to 64, and 73 to 96,
  • a primer for nucleic acid amplification for detecting actin comprising an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 10 and 14 to 17, 29 to 32, 35 to 42, and 43 to 50, a) FIP: SEQ ID NO: 35-42, (b) RIP: arrangement (J number 43-50, (c) F3: SEQ ID NO: 10 and 14-; 17, and (d) R3: SEQ ID NO: 29- In the case of classification into 32, one primer is selected from each classification, and a primer set consisting of combinations,
  • FIP SEQ ID NO: 80-87
  • RIP a primer set characterized by including a combination of one primer selected from each classification when classified into SEQ ID NO: 88-96.
  • a primer set further comprising, as a primer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 78 or 79 in addition to the primer set described in 18 or 19 above;
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 41, 45, 16, or 31.
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86, 95, 58 or 76.
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 84, 89, 62 or 75.
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 81, 91, 63 or 75.
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 81, 92, 63 or 75.
  • FIG. 3 shows the sensitivity when the GAPDH primer of the present invention was used (Experimental Example 5).
  • FIG. 4 shows the GAPDH of the present invention in a culture solution of LS180 cells and Raji cells.
  • FIG. 8 is a view showing a result (Experimental example 6) when measurement was performed using primers for use.
  • the present invention provides a primer for nucleic acid amplification applicable to a nucleic acid amplification method for a housekeeping gene, more specifically, a nucleic acid amplification method for tnRNA of a / 3-actin gene or a GAPDH gene.
  • the basic concept of the primer used in the LAMP method is as described in Patent Document 1.
  • the primer of the present invention has a chain length that enables base pairing with a complementary strand while maintaining the required specificity in a given environment in various nucleic acid synthesis reactions described below.
  • the base sequence is too long, it will be difficult to prepare it by chemical synthesis. Therefore, the above-mentioned chain length is exemplified as a desirable range.
  • type II used in the present invention means a nucleic acid on the type III side of complementary strand synthesis.
  • a complementary strand having a base sequence complementary to type I has the meaning of a strand that can hybridize to type I, but the relationship between the two is only relative. That is, a chain synthesized as a complementary chain can function as a repeat. In other words, the complementary strand can be ⁇ -shaped.
  • the F3 primer is designed to have substantially the same nucleotide sequence as the F3 region substantially complementary to the F3c region of the target DNA.
  • the RIP is designed so that the base sequence of the R2 region, which is substantially complementary to the R2c region of the target DNA, is at the 3 'end, and that the base sequence at the 5' end is substantially the same as the Rlc region of the target DNA I do.
  • RIP may have a target DNA-independent sequence interposed between the R2 and Rlc sequences.
  • the R3 primer is designed to have substantially the same base sequence as the R3 region substantially complementary to the R3 c region of the target DNA.
  • the amplification time can be reduced by using at least one or more types of loop primers in combination (WO 02/24902).
  • Norepe primer is a single-stranded portion of the loop at the 5 'end of the dampenhole structure, specifically, a sequence complementary between the R1 and R2 regions or between the F1 and F2 regions.
  • the loop primer is designed so as to hybridize to a loop region where FIP or RIP formed in the DNA synthesis process does not hybridize.
  • the region of the gene selected to construct the above primer should be based on the base composition, GC content, secondary structure, Tm value, etc., and the length of the base sequence recognizing the DNA region should be at least 5 Bases or more, preferably 10 to 30 bases, more preferably 17 to 25 bases can be selected.
  • the Tm value can generally be determined by the Nearest Neighbor method.
  • As the DNA region one having a Tm value of 55 to 65 ° C, preferably 58 to 64 ° C, and one having a GC content of 40 to 70%, preferably 50 to 65% can be selected.
  • the primer of the present invention also selects and designs a region according to the above principle.
  • the region of the 3-actin gene selected in the present invention is a region of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 at positions 240 to 1060 and Z or a region of the complementary strand thereof, preferably at positions 240 to 380 or 401 to 401. It is contained in the 1060th, more preferably the 740th to 990th region and / or its complementary strand region.
  • primers that can be used as primers are selected and designed. Further, the region of the GAPDH gene selected in the present invention is included in the region of the 110th to 450th bases of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51 and / or its complementary strand region.
  • At least two kinds are used in combination as a primer set.
  • at least four primers F3 primer, RIP, R3 primer
  • one or more loop primers can be combined and used as a primer set.
  • the reverse transcriptase activity such as BcaDNA polymerase
  • Some enzymes have both DNA polymerase activities.
  • the above reaction can be performed with one enzyme. (Measuring method)
  • the present invention relates to a primer and a primer set for nucleic acid amplification, And the nucleic acid detection method using these primers, the detection reagent used in the nucleic acid detection method, the nucleic acid detection kit, and the entire nucleic acid detection system. (Example)
  • Flc Gene region in the complementary strand of the sequence described in SEQ ID NO: 1 343-327 5'-tggccttgggttcagg-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • F2 Gene region on the sequence described in SEQ ID NO: 1
  • F3 Gene region on the sequence described in SEQ ID NO: 1
  • loop F gene region in the phase capture of the sequence described in SEQ ID NO: 1 816-801 5'-acaggactccatgccc-3' (Torigami [J number 33) loop R: Gene region on the sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • nucleic acid amplification primers for ⁇ -actin applicable to the LAMP method were obtained.
  • FIP (Linked nucleotide sequence of region Flc and nucleotide sequence of F2) AFA-1 (SEQ ID NO: 35) Linked sequences of SEQ ID NOs: 2 and 7 AFA-2 (SEQ ID NO: 36) SEQ ID NO: 3 and 8 AFA-4 (SEQ ID NO: 37) Ligation of the sequences of SEQ ID NOS: 5 and 11 AFA-4a (SEQ ID NO: 38) Ligation of the sequences of SEQ ID NOS: 5 and 12 AFA-4c (SEQ ID NO: 39) SEQ ID NO: 5 AFA-4d (SEQ ID NO: 40) Ligation of sequences of SEQ ID NOs: 4 and 9 AFA-4e (SEQ ID NO: 41) Ligation of sequences of SEQ ID NOs: 4 and 10 AFA-6 (SEQ ID NO: 42) RIP: (Linked nucleotide sequence of region Rlc and R2) ARA-1 (SEQ ID NO: 43) Linked sequences of SEQ ID NOS: 18 and 23 ARA-2 (
  • ARA-6 (SEQ ID NO: 50) Ligation of the sequences of SEQ ID NOs: 22 and 28 F3 primer: (sequence identical to the base sequence of F3 region)
  • R3 primer (sequence identical to the base sequence of R3 region)
  • AR3-2 SEQ ID NO: 30
  • AR3-4 (SEQ ID NO: 31)
  • nucleic acid amplification primers for GAPDH applicable to the LAMP method were obtained.
  • R3 (sequence identical to the base sequence of R3 region)
  • R3-7 (SEQ ID NO: 77)
  • human 3-actin type II commercially available human total RNA (derived from Raji cells, manufactured by ABI) was used.
  • AMV reverse transcriptase (Promega) 1.25U
  • Table 1 shows the time required for confirming the amplification of 0-actin when the reaction was performed using each of the primers. As a result, amplification was confirmed in each primer set at a maximum of 45 minutes, and in most cases within 30 minutes. (Experimental example 2)
  • RNA sample (containing 20 ng of human total RNA) was added to 23 ⁇ l of the reaction solution containing the above six kinds of primers, followed by heating at 65 ° C for 1 hour.
  • Samples were prepared so that the total cell number of LS180 cells and Raji cells was 8000. Of the total cell number of 8000, the number of LS180 cells was adjusted to 8000, 800, 80, 8 and 0.
  • RNA sample (containing 20 ng of human total RNA) was added to 23 ⁇ l of the reaction solution containing the above four primers, and the mixture was heated at 65 ° C for 1 hour.
  • the primer or the primer set of the present invention when used, the time required for diagnosis in cancer metastasis diagnosis using a nucleic acid amplification means is reduced, and a reliable diagnosis is made possible.

Description

明 細 書
(54)発明の名称：ハウスキーピング遺伝子の mRNA検出のための核酸増幅用プライマ一及び該プライマーを用いた 検査方法
ハウスキーピング遺伝子の mRNA検出のための核酸増幅用プライ マー及び該プライマーを用いた検査方法 技術分野
本発明は、ハウスキーピング遺伝子を検出するための核酸増幅 用プライマーに関する。
10 背景技術
近年の遺伝子工学及び分子生物学などの分野の進歩により、感 染症ゃ遺伝子疾患などについて、 DNA又は RNA レベルで診断する ことが可能になった。 特に、 ポリメラーゼ · チエイン ' リアクシ ョ ン法 (PCR 法、 Science, 230： 1350-1354, 1985) や NASBA 法
15 (Nucleic Acid Sequence Based Amplification 法、 Nature,
350, 91-92, 1991、 特許第 2648802号公報及び特許第 2650159号 公報記載） などの核酸増幅方法により、 従来困難であった生物検 体中の極微量核酸量の検出が可能となり、遺伝子解析が飛躍的に 容易なものとなった。
20 例えば、 癌の分野では、 リ ンパ節への癌転移診断が極めて重要
な意義を有している。 リ ンパ節への癌転移診断の 1手法と して、 癌マーカーである例えばサイ トケラチン （CK) のようなタンパク 質を検出する方法がある。 近年の遺伝子解析技術の発展により、 癌マーカータンパク質に関する mRNAの発現を検出することで、
25 効果的に癌診断が行われるよ う になった （北海道医学雑誌、
P.135- 141, Vol.66(2)， 1991)。 RT-PCRにより、 切除した組織から CKの raRNA発現の検出が可能となり、 癌転移の見落と しの問題は ある程度回避されるようになった。 腫瘍や癌の診断分野では、 こ のよ うな核酸増幅方法が実用化されている （臨床検査法提要、 第 31版、 金原出版株式会社、 1998年 9月 20 日発行）。
上記に示す以外の DNA増幅方法と して、 LAMP法が報告されて いる （特許文献 1 )。 LAMP法は、 鎖置換反応が進行すると増幅産 物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプ ライマーによる遺伝子増幅法である。 まず、 初期反応において、 2種類のインナープライマー （FIP , RIP) と 2種類のアウタープ ライマー （F3プライマー、 R3プライマー） 及び鎖置換型 DNAポ リ メラーゼにより錄型 DNA から両端に一本鎖ループ部分をもつ ダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点 構造となって、 この構造の 3 ' 末端側から自己を鐯型と して DNA の伸長 ·合成反応が進む。 増幅産物は多数の繰り返し構造からな り、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構 成する 2本の核酸の塩基配列が逆向きになった.同一鎖内の相補 性領域からなる。 LAMP法は、 鎵型 DNA の 2本鎖から 1本鎖への 熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進 行することが特徴である （非特許文献 1及び 2 )。 錶型が RNAの 場合には、铸型が DNAの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を 添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進 めることができる （RT-LAMP法）。 LAMP法では、 30分程度で検出 に十分な増幅産物が得られる。 したがって、 核酸検出に要する時 間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目 的と したリ ンパ節への癌転移の診断に適用できる。 また、 迅速に 結果が得られることから、 術中診断への適用も期待できる。 mRNAを定量する際に、 サンプル中の内部コントロールと して、 つまり組織によつて発現量に差のないと考えられるハウスキー ピング遺伝子の mRNAを用いることができる。 該ハウスキーピン グ遺伝子の mRNAを内部コントロールと して使用することにより、 標的遺伝子の mRNAの抽出効率や cDNAの合成効率を考慮しなくて も相対的な標的遺伝子の mRNAの検出が可能という利点がある。 ハウスキーピング遺伝子の例と して、細胞骨格の構成成分であ る ]3 -ァクチンの遺伝子や解糖系の主要酵素であるグリセ口アル デヒ ド— 3 _リ ン酸脱水素酵素 （以下、 「GAPDH」 という。） 遺伝 子が挙げられる。
内部コン トロールの目的で使用されるハウスキーピング遺伝 子に関し、より効果的な核酸増幅用プライマーの開発が望まれて いる。
( J3 -ァクチン遺伝子について）
ァクチンは全ての真核細胞に多量に見いだされるタンパク質 である。このタンパク質は高等生物の細胞において有糸分裂にお ける役割、 運動性や構造の完全性を含む、 多くの構造的及び調節 的機能を提供する。脊椎動物では 6つのァクチンのァイソフォー ムが同定されており、 それらの内訳は 4つの筋肉型 （骨格筋、 心 筋、 大動脈型平滑筋及び胃型平滑筋のァクチン） 及び 2つの非筋 肉型 （細胞質の -ァクチン及び T/ -ァクチン） である。 筋肉ァク チンは存在が組織特異的であり、 筋肉の収縮に関与する。 対照的 に、 細胞質ァクチンは基本的に全ての細胞に見いだされ、 多くの 細胞機能に関与する。細胞内に存在するァクチンはその多様性に もかかわらず、アミノ酸配列がァクチンの型及び真核生物の種間 において高度に保存されている。
ヒ トの細胞質 i3 -ァクチン遺伝子の配列は既に決定され、 他種 の /3 -ァクチン遺伝子と比較されている （Nakajima- Iijima, et. al. PNAS 82， p.6133-6137 (1985)、 欧州特許出願第 0174608号、 Ponte et. al. 1984. Nucleic Acids Res. 12, p. 1687 - 1696 (1984))。 ヒ ト i3 -ァクチン遺伝子の全体を増幅するためのプライ マーは、クローンテックラポラ ト リーズ (CI on tech Laboratories' Inc. ) (Palo Alto, CA) から MAPPING Ampl imer shito ベータ一 ァクチン用の名で市販されている。 また、 ヒ ト 3 -ァクチンのヌ クレオチド配列と種特異的にハイプリダイズするォリ ゴヌタ レ ォチドに関し、これらのオリ ゴヌクレオチドを核酸增幅反応にお ける内部コン ト ロールと して、また核酸増幅反応に用いる試料の 完全性の決定を行う手段と して用いることが報告されている（特 開平 7-99981)。
(GAPDH遺伝子について）
ヒ トグリセ口アルデヒ ド- 3-リ ン酸は、 生体内の解糖系、 ペン トースリン酸サイクルなどの糖代謝や、脂質合成における重要な 中間体のひとつであり、 ヒ トの生体内には広く分布している。 ま た、 この物質から脂質を合成するためには、 ヒ トグリセルアルデ ヒ ド- 3-リン酸脱水素酵素（GAPDH)が必要であるため、当該酵素も ヒ トの生体内に広く分布している。 内部コン トロールの目的で使用される β -ァクチンや GAPDHに 関し、より効果的な核酸増幅用プライマーの開発が望まれている , (特許文献 1 ) 国際公開第 W0 00/28082号パンフレッ ト
(非特許文献 1 ) Bio ベンチャー、 2001 年、 Vol. 1， No. 1， p. 109-115
(非特許文献 2 ) BIO INDUSTRY, 2001年、 Vol. 18, No.2, p. 15-29 発明の開示
本発明は、 ハウスキーピング遺伝子の mRNAを検出するための 核酸増幅用プライマー、 具体的には -ァクチン遺伝子又は GAPDH遺伝子の mRNA を増幅するための新規プライマーを提供す ることを目的とする。
(課題を解決するための手段）
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結 果、ハウスキーピング遺伝子用核酸増幅用プライマーを構築する ことができた。
即ち本発明は、
1 . LAMP 法によりハウスキーピング遺伝子及び/又はハウスキ 一ビング遺伝子に関連する mRNAを検出するための核酸増幅用プ ライマー、
2 . ハウスキーピング遺伝子が、 ]3 -ァクチン遺伝子又は GAPDH 遺伝子である前項 1に記載の核酸増幅用プライマー、
3.以下の群より選択される配列からなるオリ ゴヌク レオチドを 含む iS -ァクチン検出のための核酸増幅用プライマー ；
1 ) 配列番号 1で表される塩基配列の第 240〜380番目、 又は第 401〜1060 番目の領域及び/又はその相補鎖の領域から選択さ れ、配'列番号 1又はその相補鎖の連続する塩基を少なく とも 5以 上含むォリ ゴヌク レオチド。
2 )配列番号 2又は 4〜34のいずれかで表される塩基配列からな るオリ ゴヌク レオチド。
3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌク レオチ ドの相補鎖。 4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいずれか 1 に記載のオリ ゴヌク レオチドと ス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリ ダイズしう るオリ ゴヌク レオチ ド。
5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のオリ ゴヌク レオチドのう ち、 1 ない し数個の塩基が置換、 欠失、 揷入も しく は付加といった変異され た塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリ ゴヌク レオチ ド c
4. 配列番号 10及び 14〜17、 29〜50の配列番号に表される塩基 配列のいずれかよ り選択されるオリ ゴヌク レオチ ドからなる - ァクチン検出のための核酸増幅用プライマー、
5.以下の群よ り選択される配列からなるオリ ゴヌク レオチドを 含む GAPDH検出のための核酸増幅用プライマー ；
1 )配列番号 51で表される塩基配列の第 110〜450番目の領域及 び/又はその相補鎖の領域から選択され、配列番号 5 1又はその 相補鎖の連続する塩基を少なく と も 5以上含むオリ ゴヌ ク レオ チ ド。
2 ) 配列番号 52〜79 のいずれかで表される塩基配列からなるォ リ ゴヌク レオチ ド。
3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌク レオチ ドの相補鎖。
4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいずれか 1 に記載のオリ ゴヌク レオチドと ス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリ ダイズしう るオリ ゴヌク レオチ ド。
5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のオリ ゴヌク レオチドのうち、 1 ない し数個の塩基が置換、 欠失、 揷入もしくは付加といった変異され た塩基配列を含み、プライマー機能を有するォリ ゴヌクレオチド、
6 . 配列番号 58及び 62〜64、 73〜96の配列番号に表される塩基 配列のいずれかよ り選択されるオリ ゴヌク レオチ ドからなる GAPDH検出のための核酸増幅用プライマー、
7 . 核酸増幅の手段が LAMP法である前項 3 ~ 6のいずれか 1に 記載の核酸増幅用プライマー、
8 .以下の群より選択される配列からなるオリ ゴヌクレオチドを 含む核酸増幅用プライマーから少なく とも 2種を選択すること を特徴とする ]3 -ァクチン検出のための核酸増幅用プライマーセ ッ 卜 ；
1 )配列番号 1で表される塩基配列の第 240〜 1060番目の領域及 び Z又はその相補鎖から選択され、配列番号 1又はその相補鎖の 連続する塩基を少なく とも 5以上含むォリ ゴヌク レオチ ド。
2 )配列番号 2〜34で表される塩基配列からなるオリ ゴヌクレオ チ ド。
3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌク レオチ ドの相補鎖。 4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいずれか 1に記載のオリ ゴヌクレオチドと ス トリ ンジェントな条件下でハイブリダィズしう るオリ ゴヌク レオチ ド。
5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のオリ ゴヌクレオチドのうち、 1ない し数個の塩基が置換、 欠失、 揷入もしくは付加といった変異され た塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリ ゴヌク レオチド、 9 .前項 8に記載のオリ ゴヌク レオチドを含む核酸増幅用プライ マーから少なく とも 4種を選択することを特徴とする ]3 -ァクチ ン検出のための核酸増幅用プライマーセッ ト、 1 0 .前記プライマーセ ッ トに含まれるプライマーの うち少なく とも 2種が、配列番号 1で表される塩基配列及び/又はその相補 鎖の各々 2箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする前項 8又は 9に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト、
1 1 . 前記プライマーセッ トに含まれるプライマーが、 配列番号 1で表される塩基配列及び/又はその相補鎖の少なく と も 6つ の遺伝子領域を認識することを特徴とする前項 9又は 1 0に記 載の核酸増幅用プライマーセッ ト、
1 2 . 配列番号 10及び 14~ 17、 29— 32 , 35〜 42及び 43〜 50に 表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチドからなる -ァクチン検 出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ a ) FIP :配列番 号 35〜42、 ( b ) RIP： 配歹 (J番号 43〜50、 ( c ) F3： 配列番号 10 及び 14〜； 17、及ぴ（ d ) R3：配列番号 29〜32に分類した場合の、 各分類から 1のプライマーを選択し、組合せてなるプライマーセ ッ ト、
1 3 . 前項 1 2に記載のプライマーセッ トにさらに配列番号 33 及び 34で表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチドをプライマー と して含むプライマーセッ ト、
1 4 .前項 5に記載のオリ ゴヌクレオチドを含む核酸增幅用ブラ イ マ一から少なく とも 2種を選択することを特徴とする GAPDH 検出のための核酸増幅用プライマーセッ ト、
1 5 .前項 5に記載のオリ ゴヌクレオチドを含む核酸増幅用ブラ イマ一から少なく とも 4種を選択することを特徴とする GAPDH 検出のための核酸増幅用プライマーセッ ト、
1 6 .前記プライマーセッ トに含まれるプライマーの うち少なく とも 2種が、 配列番号 51 で表される塩基配列及び Z又はその相 補鎖の各々 2箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする前 項 1 4又は 1 5に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト、
1 7 . 前記プライマーセッ トに含まれるプライマーが、 配列番号 51 で表される塩基配列及び Z又はその相捕鎖の少なく とも 6つ の遺伝子領域を認識することを特徴とする前項 1 4〜 1 6のい ずれか 1に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト、
1 8 . 配列番号 80〜96 に表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチ ドからなる GAPDH検出のための核酸増幅用プライマーであって、
( a ) FIP： 配列番号 80 ~ 87、 ( b ) RIP： 配列番号 88〜96 に分 類した場合の、各分類から 1のプライマーを選択した組合せを含 むことを特徴とするプライマーセッ ト、
1 9 . 前項 1 8に記載の選択された各プライマーの組合せに、 さ らに配列番号 58又は配列番号 62〜 64で表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチドのいずれか 1及び配列番号 73〜77で表される塩 基配列のオリ ゴヌク レオチドのいずれか 1 をプライマーと して 含むプライマーセッ ト、
2 0 .前項 1 8又は 1 9に記載のプライマーセッ トにさらに配列 番号 78及び 79で表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチドをプラ イマ一と して含むプライマーセッ ト、
2 1 . 核酸増幅の手段が LAMP法である前項 8 ~ 2 0の何れか 1 に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト、
2 2 . 次に示す 1 ) 〜 1 2 ) のいずれかからなる i3 -ァクチン検 出のための核酸増幅用プライマーセッ ト ；
1 ) 配列番号 35、 43、 14及び 29で表される塩基配列のォリ ゴヌ クレオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 ) 配列番号 36、 44、 15及び 30で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
3 ) 配列番号 37、 45、 10及び 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
4 ) 配列番号 41、 50、 17及び 32で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
5 ) 配列番号 38、 45、 10及び 31で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマ一と して含むプライマーセッ ト。
6 ) 配列番号 39、 45、 10及び 31 で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
7 ) 配列番号 40、 45、 16及び 31で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと じて含むプライマーセッ ト。
8 ) 配列番号 41、 45、 16及び 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
9 ) 配列番号 37、 46、 16及び 31で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
10) 配列番号 37、 47、 16及ぴ 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
11 ) 配列番号 37、 48、 16及び 31 で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
12) 配列番号 37、 49、 16及び 31で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト、
2 3 . 次に示す 1 ) 〜 1 6 )のいずれかからなる GAPDH検出のた めの核酸増幅用プライマーセッ ト ；
1 ) 配列番号 80、 88、 62及び 73で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 ) 配列番号 81、 89、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
3 ) 配列番号 86、 95、 58及び 76で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
4 ) 配列番号 87、 96、 64及び 77で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
5 ) 配列番号 81、 89、 62及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ. ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマ一セッ ト。
6 ) 配列番号 82、 89、 62及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
7 ) 配列番号 83、 89、 63及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
8 ) 配列番号 83、 89、 62及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
9 ) 配列番号 84、 89、 62及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 0 )配列番号 85、 89、 62及び 75で表される塩基配列のオリ ゴ ヌク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 2 )配列番号 81、 90、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴ ヌク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 3 )配列番号 81、 91、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴ ヌク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 4 )配列番号 81、 92、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴ ヌク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 5 )配列番号 81、 93、 63及ぴ 75で表される塩基配列のオリ ゴ ヌク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 6 )配列番号 81、 94、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴ ヌクレオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト、
2 4 .前項 1 〜 7のいずれかに記載のプライマーを少なく とも 1 つ使用して行う核酸検出方法、
2 5 .前項 8 〜 2 3項のいずれか 1に記載のプライマーセッ トを 使用して行う核酸検出方法、
2 6 .前項 2 4又は 2 5に記載の核酸検出方法に使用する試薬及 ぴノ又は試薬キッ ト、
2 7 .前項 2 4又は 2 5に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出 システム、 からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は、本発明の ーァクチン用プライマーを用いたときの 感度を示す図であり （実験例 2 )、第 2図は、 LS 180細胞及び Raj i 細胞の培養液中で、本発明の ]3—ァクチン用プライマーを用いて 測定したときの結果 （実験例 3 ) を示す図である。
第 3図は、本発明の GAPDH用プライマーを用いたときの感度を 示す図であり （実験例 5 )、 第 4図は、 LS 180細胞及び Ra j i細胞 の培養液中で、本発明の GAPDH用プライマーを用いて測定したと きの結果 （実験例 6 ) を示す図である。 発明を実施実施するための最良の形態
(プライマーの設計）
本発明は、 ハウスキーピング遺伝子の核酸増幅法、 より具体的 には /3 -ァクチン遺伝子又は GAPDH遺伝子の tnRNAに関する核酸増 幅法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものであ る。 LAMP 法で用いるプライマーの基本的な考え方は、 特許文献 1 に記載の通りである。
具体的には、増幅すべき標的 DNAの、 3 ' 末端側から順に F3c、 F2c、 Fl c という領域を、 5 ' 末端側から順に R3、 R2、 R1 という 領域を規定し、 少なく ともこの 6つの領域に対し、 実質的に同一 な塩基配列、又は実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌタ レ ォチド鎖を選択し、 少なく とも 4種のプライマーを設計する。 実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、 ある塩基配列を铸型と して合成された相補鎖が、 目的の塩基配列 に対してハイブリダィズし、 相補鎖合成の起点を与えるとき、 こ の配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。 例えば、 F2 に対して実質的に同一な塩基配列とは、 F2 と全く同一な塩基 配列に加えて、 F2 にハイブリダィズして相補鎮合成の起点とな り うる塩基配列を与える铸型と して機能する塩基配列を含む。 本発明に基づくオリ ゴヌク レオチドを構成する塩基配列の特 徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はい ずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない ( すなわち、 ある配列と同一とは、 ある配列に対してハイブリダイ ズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むこ とができる。 他方、 相補的とは、 ス ト リ ンジェン トな条件下でハ イブリダィズすることができ、 相補鎖合成の起点となる 3 ' 末端 を提供することができる配列を意味する。
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応にお いて与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補 鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的 には 5〜200塩基、 より望ましくは 10〜50塩基対とする。 配列依 存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリ メ ラーゼが認識する プライマーの鎖長は最低 5塩基前後であることから、ハイブリダ ィズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。 加えて、 塩基 配列と しての特異性を維持するためには、 10 塩基以上の長さを 維持するのが望ましい。 一方、 あまりにも長い塩基配列は化学合 成によつて調製することが困難となることから、前記のような鎖 長が望ましい範囲と して例示される。
本発明において用いられる铸型という用語は、相補鎖合成の鍩 型となる側の核酸を意味する。铸型に相補的な塩基配列を持つ相 捕鎖は、 鎵型にハイプリダイズしうる鎖と しての意味を持つが、 両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。 すなわち、 相 補鎖と して合成された鎖は、再ぴ鎳型と して機能することができ る。 つまり、 相補鎖は鎊型になることができる。
本発明において、標的 DNAの塩基配列から選択されるプライマ 一は、 各々 FIP ( forward inner primer) N F3プフィマー ( forward outer primer)、 RIP (. revers e inner pr imer) 及ひ R3 プフ マ 一 ( revers e out er primer) の ヽずれ力 を構成する。
FIPは、 標的 DNAの F2c領域と実質的に相補的な F 2領域の塩 基配列を 3 ' 末端にもち、 5 ' 末端に標的 DNA の F lc領域と実質 的に同じ塩基配列をもつように設計する。 この場合において、 F2 及び Fl cの配列間に標的 DNAに依存しない配列が介在していても 良い。 この標的 DNAに依存しない配列の長さは 0〜50塩基、 好ま しくは 0〜40塩基であれば許容しうる。
F3プライマ一は、 標的 DNAの F3c領域と実質的に相補的な F3 領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。 RIP は、 標的 DNAの R2c領域と実質的に相補的な R2領域の塩 基配列を 3 ' 末端にもち、 5 ' 末端に標的 DNA の R l c領域と実質 的に同じ塩基配列をもつように設計する。 RIP も FIP と同様に、 R2及ぴ Rl c の配列の間に標的 DNAに依存しない配列が介在して いても良い。
R3プライマーは、 標的 DNAの R3 c領域と実質的に相補的な R3 領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
また、 LAMP 法では、 少なく とも 1種以上のループプライマー を併用することで増幅時間を短縮することができる （国際公開 W0 02/24902号公報）。ノレーププライマ一とは、ダンべノレ構造の 5 ' 末端側のループの 1本鎖部分、 具体的には例えば R1 領域と R2 領域の間、あるいは F1領域と F2領域の間に相補的な配列をもつ プライマーをいう。 ループプライマーを用いることにより DNA 合成の起点を増やすことが可能となる。このル ププライマーは、 DNA合成過程でできた FIP又は RIPがハイブリダイズしないルー プ領域にハイプリダイズするように設計する。 上記プライマーを構築するために選択される遺伝子の領域は、 塩基組成、 GC含量、 二次構造、 Tm値などに注意し、 DNA領域を 認識する塩基配列の長さは、 塩基数が少なく とも 5塩基以上、 好 ましくは 10〜30塩基、より好ましくは 17〜 25塩基のものを選択 することができる。 Tm値は、 一般的に Neare st Ne i ghbor法で求 めることができる。 DNA領域は、 Tm値が 55 ~ 65°C、 好ましくは 58〜64°Cのものを選択し、 GC含量が 40〜70 %、 好ましくは 50〜 65 %のものを選択することができる。 本発明のプライマーも、 上記の原理に従った領域を選択し、 設 計する。
本発明で選択される ]3 -ァクチン遺伝子の領域は、 配列番号 1 で表される塩基配列の第 240〜 1060 番目及び Z又はその相補鎖 の領域、好ましく は第 240〜380番目若しくは第 401〜 1060番目、 より好ましくは第 740〜990番目の領域及び/又はその相補鎖の 領域に含まれる。
本発明における 3 -ァクチン検出用のプライマーは、 1 ) 配列 番号 1で表される塩基配列の第 240〜 1060 番目、 好ましく は第 240〜380番目若しくは第 401〜 1060番目、より好ましくは第 740 〜 990番目の領域及び/又はその相補鎖の領域に含まれ、 塩基数 が少なく とも 5以上のオリ ゴヌクレオチド、 2 ) 配列番号 2 ~ 50 で表される塩基配列からなるオリ ゴヌクレオチド、 3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌクレオチドの相補鎖、 4 ) 前記 1 ) ~ 3 )のいずれか 1 に記載のオリ ゴヌク レオチドとス ト リ ンジェン トな条件下でハイプリダィズしうるオリ ゴヌクレオチド、 又は、 5 ) 前記 1 ) ~ 4 ) に記載のオリ ゴヌクレオチドのうち、 1ない し数個の塩基が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異され た塩基配列を含むオリ ゴヌクレオチドであって、プライマーと し て使用可能なものが選択され、 設計される。 また、 本発明で選択される GAPDH遺伝子の領域は、 配列番号 5 1で表される塩基配列の第 110〜450番目の領域及び/又はその 相補鎖の領域に含まれる。
本発明における GAPDHのプライマーは、 1 ) 配列番号 51で表 される塩基配列の第 110番目〜第 450番目の領域及び/又はその 相補鎖に含まれ、塩基数が少なく とも 5以上のオリ ゴヌク レオチ ド、 2 ) 配列番号 52〜 96で表される塩基配列からなるオリ ゴヌ クレオチド、 3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌクレオチド の相補鎖、 4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいずれか 1に記載のオリ ゴヌク レオチドとス ト リ ンジ工ン トな条件下でハイブリ ダィズしうる オリ ゴヌクレオチド、 又は、 5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のオリ ゴ ヌクレオチドのうち、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、 挿入も しくは付加といった変異された塩基配列を含むォリ ゴヌクレオ チドであって、 プライマーと して使用可能なものが選択され、 設 計される。 ォリ ゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することが でき、 例えば化学的に合成することができる。 あるいは、 天然の 核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構 成されるように改変し、 あるいは連結することも可能である。 具 体的には、 オリ ゴヌクレオチド合成装置 （アプライ ドバイオシス テムズ社製 Expedi te Mode l 8909 DNA合成機） 等を用いて合成 することができる。 また、 1ないし数個の塩基が置換、 欠失、 揷 入もしく は付加といつた変異させたオリ ゴヌク レオチドの合成 法も、 自体公知の製法を使用することができる。 例えば、 部位特 異的変異導入法、 遺伝子相同組換え法、 プライマー伸長法又は PCR 法を単独又は適宜組合せて、 例えば、 Mol ecular Cl oning J A Laboratory Manual N 2版、 Sambrook ら編、 コーノレド ' スプリ ン グ 'ハーバー . ラボラ トリー . プレス、 コールド . スプリ ング . ハーバー、ェユ ーヨーク、 1989年； [ラボマ二ュアル遺伝子工学]、 村松正實編、 丸善株式会社、 1988 年 ； [ PCR テクノ ロジー、 DNA 増幅の原理と応用]、 Ehrlich, HE.編、 ス トツク トンプレス、 1989 年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実 施することができ、例えば Ulmerの技術（Science (1983) 219： 666) を利用することができる。
ス ト リ ンジェントなハイプリダイゼーシヨ ン条件は一般に知 られたものを選択することができる。 その一例と しては、 50%ホ /レムアミ ド、 5XSSC (150mM NaCl、 15mM クェン酸三ナト リ ウム）、 50mM リ ン酸ナト リ ウム、 pH7.6、 5Xデンハーツ溶液、 10%デキ ス トラン硫酸、 及び 20 μ g /mlの DNAを含む溶液中、 42°Cで一晚 ハイプリダイゼーションした後、 室温で 2XSSC · 0.1%SDS 中で —次洗浄し、 次いで、 約 65°Cにおいて 0.1XSSC . 0.1%SDSで二 次洗浄といった条件があげられる。
本発明において増幅されるべき核酸の铸型はハウスキーピン グ遺伝子の mRNAであるから、 使用するプライマーが、 検体中に 含まれるゲノム DNA を増幅しないよ うに設計することが必要と される。 具体的には、 本発明のプライマーセッ トに含まれるブラ イマ一の少なく とも 1つは、 例えば ]3 -ァクチン又は GAPDHの遺 伝子において複数のエタソンにまたがる領域を含むものである ことが望ましい。 このよ うな工夫を行う ことによって、 ゲノム DNA由来の配列の増幅が排除され、 /3 -ァクチン又は GAPDHの mRNA 由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
(プライマーセッ ト）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なく と も 2種を組合せてプライマーセッ ト と して使用する。 LAMP 法で は、 少なく とも 4種のプライマー （FIP、 F3 プライマー、 RIP、 R3 プライマー） を組合せてプライマーセッ トと して使用する。 さ らに、 1種以上のループプライマーを組合せて、 プライマーセ ッ トと して使用することもできる。 ( RT - LAMP法）
RT-LAMP法は、 RNAを铸型とする LAMP法であり、 LAMP法の基 本的な考え方は特許文献 1に記載の通りである。 RT- LAMP法では 一つの溶液中で、 铸型 RNA力、ら cDNAを合成しながら、 LAMP法の 起点構造が合成される。具体的には次の 1 )のステップを経た後、 2 )〜 5 )ステップの繰り返しにより、 DNAの伸長が繰り返され、 標的 DNAの増幅が行われる。
1 ) 铸型 RNA鎖に FIPが結合し、 鐯型 RNA鎖に相補的な DNA鎖が 伸長する。 この反応は逆転写酵素、 例えば AMV由来の逆転写酵素 等を用いる。
2 ) 上記 1 ) で合成した FIPからの DNA鎖を、 F3プライマーが 铸型 RNAから剥がしながら、铸型 RNA鎖に相補的な DNA鎖が伸長 する。 以降 DNA鎖の伸長は DNAポリメラーゼによる。
3 ) 上記 2 ) で剥がされた DNA鎖に、 RIPが結合して DNA鎖が伸 長する。
4 ) 上記 3 ) で伸長した RIPからの DNA鎖を R3プライマーが剥 力ましながら、 FIPからの DNA鎖に相捕的な DNA鎖が伸長し、 LAMP 法の起点構造が合成される。
5 ) 上記 4 ) で剥がされた DNA鎖の両端の配列は、 同じ DNA鎖の 配列中に相補的な配列を有するので、 各々ハイブリダイズし、 両 端にループ構造を持つ。
なお、 例えば BcaDNA po lymeraseのよ うに、 逆転写酵素活性と DNAポリ メラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、 このような 酵素を使用する場合は、上記の反応は 1つの酵素で実施すること ができる。 (測定方法）
LAMP 法では、 合成された DNA鎖は自己の配列に対して相補的 な配列をもつので、 その大部分が塩基対結合を形成している。 こ の特徴を利用して、 増幅生成物の検出が可能である。 ェチジゥム ブロマイ ド、 SYBER GREEN I、 あるいは P i co Greenのような 2本 鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプ ライマ一を用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って 蛍光強度の増大が観察される。 これをモニターすれば、 閉鎖系で DNAの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である （臨床検査法提 要、 31版 1318頁 ； 特開 2001 - 242169号公報参照。 以下単に 「リ アルタイム法」 という。）。
(試薬、 試薬キッ ト、 その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各 種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキッ ト化すること ができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーと して、 あるいは置換用のプライマーと して必要な各種のオリ ゴヌタ レ ォチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となる dNTP、 鎖置換型の相補鎖合成を行う DNAポリメラーゼ、酵素反応に好適 な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出の ために必要な試薬類がキッ トと して提供される。
本発明は、 核酸増幅用プライマー及びプライマーセッ ト、 なら びにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に 使用される検出試薬、核酸検出キッ トならびに核酸検出システム 全体に及ぶ。 (実施例）
以下、 本発明を実施例により さらに具体的に説明するが、 本発 明はこれら実施例に限定されるものではない。
(実施例 1 ) i3 -ァクチン遺伝子領域の選択
配列番号 1 に記載する塩基配列から、プローブ設計ソフ トを用 いて、 LAMP法に適切な β -ァクチンの遺伝子領域の位置を検討し た。遺伝子領域の選択は、 Flc及ぴ Rlcは Tm値力 S 58.5〜63.5°C、 F2及ぴ R2 Tm値力 S 61.5— 62.5。C、 F3及び R3 Tmィ直カ S 58.5 ~62.5°Cにより遺伝子領域を選択した結果、 次に示す配列番号 1 に記載する塩基配列上の第 240~1060 番目の領域及びその相補 鎖の領域に含まれる配列が選択された。
Flc： 配列番号 1に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域 343-327 5' -tggccttgggttcagg-3' (配列番号 2)
400-381 5' -cgtacatggctggggtgttg-3' (配歹 (J番号 3) 822-803 5' -gatgccacaggactccatgc-3' (配歹' J番号 4) 838-817 5' -tgaaggtagtttcgtggatgcc-3' (配列番号 5) 922-904 5' -cagggtacatggtggtgcc-3' (配歹 U番号 6)
F2 ： 配列番号 1に記載する配列上の遺伝子領域
265-284 5' -accttctacaatgagctgcg-3' (配歹' J番号 7) 341-357 5' -ccaaccgcgagaagatg-3' (配歹 (J番号 8)
748-766 5' -attggcaatgagcggttcc-3' (配列番号 9) 750-766 5' -tggcaatgagcggt cc-3' (配列番号 10
774-790 5' -tgaggcactcttccagc-3' (配列番号 11
782-799 5' -tcttccagccttccttcc-3' (配列番号 12
851-868 5' -agtgtgacgtggacatcc-3' (配列番号 13)
F3 ： 配列番号 1に記載する配列上の遺伝子領域
240-259 5' -cgacatggagaaaatctggc-3' (配歹 (J番号 14 274-290 5 -aatgagctgcgtgtggc-3 (配列番号 15 718-734 5 -tacgagctgcctgacgg-3 (配列番号 16 750-766 5 -tggcaatgagcggttcc-3 (配列番号 10 818-837 5 -gcatccacgaaactaccttc-3 (配列番号 17
Rlc：配列番号 1に記載する配列上の遺伝子領域
346-366 5 -cgcgagaagatgacccagatc-3 (配列番号 18
402-423 5 -tgctatccaggctgtgctatcc-3' (配列番号 19
848-868 5 -tgaagtgt acgtggacatcc-3' (配列番号 20
857-876 5 -acgtggacatccgcaaagac-3 (配列番号 21
925-945 5 -attgccgacaggatgcagaag-3 (配列番号 22 R2 ： 配列番号 1に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
414-396 5' -agcctggatagcaacgtac-3' (配歹 !J番号 23
461-444 5 -tccatcacgatgccagtg-3 (配列番号 24
921-905 5' -agggtacatggtggtgc-3' (配列番号 25
925-909 5 -tgccagggtacatggtg-3 (配列番号 26
929-911 5 -gcaatgccagggtacatgg-3 (配列番号 27
1011-994 5 -gtacttgcgctcaggagg-3 (配列番号 28 R3 ： 配列番号 1に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
454-438 5' -cgatgccagtggtacgg-3' (配列番号 29
497-480 5' -tagatgggcacagtgtgg-3' (配歹 tJ番号 30 947-930 5' -t ccttctgcatcctgt cg-3 ' (配列番号 31 )
1059- 1043 5' -ct ggaaggtggacagcg-3' (配列番号 32) loop F：配列番号 1 に記載する配列の相捕鎖における遺伝子領域 816-801 5' -acaggactccatgccc-3' (酉己歹【J番号 33 ) loop R： 配列番号 1に記載する配列上の遺伝子領域
878-895 5' -t gtacgccaacacagtgc-3' (配列番号 34)
(実施例 2 ) ァクチン用プライマーの設計
選択された領域の配列から、 LAMP法に適用される β -ァクチン 用の次の核酸増幅用プライマーが得られた。
FIP： (領域 Fl cの塩基配列と F2の塩基配列を連結したもの） AFA- 1 (配列番号 35) 配列番号 2及び 7の配列を連結 AFA-2 (配列番号 36) 配列番号 3及び 8の配列を連結 AFA-4 (配列番号 37) 配列番号 5及び 1 1 の配列を連結 AFA-4a (配列番号 38) 配列番号 5及ぴ 12の配列を連結 AFA-4c (配列番号 39) 配列番号 5及び 10の配列を連結 AFA-4d (配列番号 40) 配列番号 4及ぴ 9の配列を連結 AFA-4e (配列番号 41 ) 配列番号 4及ぴ 10の配列を連結 AFA-6 (配列番号 42) 配列番号 6及び 13の配列を連結 RIP： (領域 R l cの塩基配列と R2の塩基配列を連結したもの） ARA- 1 (配列番号 43) 配列番号 18及び 23の配列を連結 ARA-2 (配列番号 44) 配列番号 19及び 24の配列を連結 ARA-4 (配列番号 45) 配列番号 20及び 25の配列を連結 ARA-4a (配列番号 46) 配列番号 20及び 27の配列を連結 ARA-4b (配列番号 47) 配列番号 20及ぴ 26の配列を連結 ARA-4d (配列番号 48) 配列番号 21及び 27の配列を連結 ARA-4e (配列番号 49) 配列番号 21及び 26の配列を連結
ARA-6 (配列番号 50) 配列番号 22及び 28の配列を連結 F3プライマー ： （F3領域の塩基配列と同一の配列）
AF3- 1 (配列番号 14)
AF3-2 (配列番号 15)
AF3-4 (配列番号 10)
AF3-6 (配列番号 17)
AF3-9 (配列番号 16)
R3プライマー ： （R3領域の塩基配列と同一の配列）
AR3- 1 (配列番号 29)
AR3-2 (配列番号 30)
AR3-4 (配列番号 31 )
AR3-6 (配列番号 32)
ループルライマー ：
( loop F又は l oop R領域の塩基配列と同一の配列）
AD-LPF 1 (配列番号 33)
AD-LPR1 (配列番号 34)
(実施例 3 ) GAPDHの遺伝子領域の選択
配列番号 51 に記載する塩基配列から、 プローブ設計ソフ トを 用いて、 LAMP法に適切な GAPDHの遺伝子領域の位置を検討した。 遺伝子領域の選択は、 Fl c及び R1Cは Tm値が 58. 5〜63. 5°C、 F2 及び R2 は Tm値力 S 61. 5〜62. 5°C、 F3及び R3 は Tm値が 58. 5 ~ 62. 5°Cにより遺伝子領域を選択した結果、 次に示す配列番号 51 に記載する塩基配列上の第 110 ~ 450番目の領域に含まれる配列 が選択された。 Flc： 配列番号 51 に記载する配列の相補鎖における遺伝子領域
213 - 192 5' -tccat gatgacaagcttcccg-3 (配列番号 52 236-217 5 -tcctggaagatggtgatggg-3' (配列番号 53 246-228 5 -gggatctcgctcctggaag-3 (配列番号 54 284-265 5 -acgtactcagcgccagcatc-3 (配列番号 55 335-316 5 -aaatgagccccagccttctc-3 (配列番号 56 F2 ： 配列番号 51に記載する配列上の遺伝子領域
152-169 5 -ccacccatggcaaattcc-3 (配列番号 57 163 - 180 5 -aaattccatggcaccgtc-3 (配列番号 58 179-195 5 -tcaaggct agaacggg-3 (配列番号 59) 217-235 5 -cccatcaccatcttccagg-cs (配列番号 60 276-293 5' -tgagtacgtcgtggagtc-3' (配列番号 61
F3 ： 配列番号 51 に記載する配列上の遺伝子領域
103-120 5' -gaccccttcattgacctc-3' (酉己歹 [J番号 62 159-176 5' -tggcaaattccatggcac-3' (酉己歹 U番号 63 163-180 5' -aaattccatggcaccgtc-3' (酉己歹 (1番号 58 227-244 5' -tcttccaggagcgagatc-3' (配歹 (1番号 64
Rlc ： 配列番号 51 に記載する配列上の遺伝子領域
216-235 5 -tcccatcaccatcttccagg-3 (配列番号 65
248-268 b -ccaaaatcaagtggggcgatg-3 (配列番号 66 254-271 5 -tcaagtggggcgatgctg-3 (配列番号 67
305-323 5 -tcaccaccatggagaaggc-ύ' (配列番号 68
338-354 5， -aggggggagccaaaagg-3' (配列番号 69 R2 ： 配列番号 51 に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
295-279 5' -tggactccacgacgtac-3' (配歹 (I番号 70) 305-289 ΰ -aagacgccagtggactc-3 (配列番号 71)
310-294 5 -tggtgaagacgccagtg-3 (配列番号 72)
324-308 5' -agccttctccatggtgg-3' (配列番号 73)
327-311 5' -cccagccttctccatgg-3' (配列番号 74)
365-346 5' -gagatgatgacccttttggc-3' (配列番号 75)
399-383 5， -catgacgaacatggggg-3' (配列番号 76) R3 ： 配列番号 51 に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
324-308 5' -agccttctccatggtgg-3' (配歹 (J番号 73)
365-346 5' -gagatgatgacccttttggc-3' (配歹 IJ番号 75)
399-383 5' -catgacgaacatggggg-3' (配歹' J番号 76)
445-426 5' -tgctgatgatcttgaggctg-3' (配列番号 77) loop F： 配列番号 51に記載の配列の相補鎖における遺伝子領域
227-212 5' -atggtgatgggatttc-3' (配列番号 78) loop R： 配列番号 51に記載の配列上の遺伝子領域
275-293 5' -ctgagtacgtcgtggagtc-3' (配列番号 79)
(実施例 4 ) GAPDHプライマーの設計
選択された領域の配列から、 LAMP 法に適用される GAPDH用の 次の核酸増幅用プライマーが得られた。
FIP： (領域 Flcの塩基配列と F2の塩基配列を連結したもの） FA-2 (配列番号 80) 配列番号 52及び 57の配列を連結 FA-3 (配列番号 81) 配列番号 54及び 59の配列を連結 FA-3b (配列番号 82) 配列番号 54及ぴ 58の配列を連結 FA - 3d (配列番号 83) 配列番号 53及び 59の配列を連結 FA-3e (配列番号 84) 配列番号 53及び 58の配列を連結 FA-3g (配列番号 85) 配列番号 53及ぴ 57の配列を連結 FA-5 (配列番号 86) 配列番号 55及び 60の配列を連結 FA-7 (配列番号 87) 配列番号 56及び 61 の配列を連結 RIP： (領域 Rlcの塩基配列と R2の塩基配列を連結したもの） RA-2 (配列番号 88) 配列番号 65及び 80の配列を連結 RA-3 (配列番号 89) 配列番号 67及び 83 の配列を連結 RA-3a (配列番号 90) 配列番号 67及び 84の配列を連結 RA-3b (配列番号 91) 配列番号 67及び 82の配列を連結 RA-3c (配列番号 92) 配列番号 67及ぴ 81 の配列を連結 RA - 3d (配列番号 93) 配列番号 66及び 83 の配列を連結 RA- 3e (配列番号 94) 配列番号 66及び 84の配列を連結 RA-5 (配列番号 95) 配列番号 68及び 75の配列を連結 RA-7 (配列番号 96) 配列番号 69及び 76の配列を連結 F3 ： (F3領域の塩基配列と同一の配列）
F3 - 3 (配列番号 63)
F3-4 (配列番号 68)
F3-6 (配列番号 64)
F3-8 (配列番号 62)
R3 ： (R3領域の塩基配列と同一の配列）
R3-2 (配列番号 73)
R3-3 (配列番号 75)
R3-5 (配列番号 76)
R3-7 (配列番号 77)
ループプライマー ：
(loop F又は loop R領域の塩基配列と同一の配列）
GC-LPF1 (配列番号 78)
GC-LPR1 (配列番号 79) (実験例 1 )
実施例 2に記載する /3 -ァクチン用プライマーを、 表 1 に記載 する各組合せで用いた場合の、 RT-LAMP法による反応開始後増幅 の確認までに要する時間を調べた。
1 ) ヒ ト -ァクチンの mRNA試料
ヒ ト ]3 -ァクチンの錶型と して、市販のヒ ト トータル RNA(Raji 細胞由来、 ABI社製） を使用した。
2 ) β -ァクチン用プライマー
各プライマーは （表 1 ) の組合せで使用した。
(表 1 ) プライマーセッ ト及ぴ増幅確認時間
FIP RIP F3プライマー R3プライマ一 増幅確認時間
(分）
AFA-1 ARA-1 AF3-1 AR3-1 35
AFA-2 ARA-2 AF3-2 AR3-2 34
AFA-4 ARA-4 AF3-4 AR3-4 25
AFA-6 ARA-6 AF3-6 AR3-6 45
AFA-4a ARA-4 AF3-4 AR3-4 37
AFA-4c ARA-4 AF3-9 AR3-4 33
AFA-4d ARA-4 AF3-9 AR3-4 28
AFA-4e ARA-4 AF3-9 AR3-4 28
AFA-4 ARA-4a AF3-4 AR3-4 40
AFA-4 ARA-4b AF3-4 AR3-4 26
AFA-4 ARA - 4d AF3-4 AR3-4 40
AFA-4 ARA-4e AF3-4 AR3-4 31 3 ) 反応液組成
dNTPs (GIBC0社製） 0.4 mM MgS04 2 mM ジチ才 卜 レ才 卜一 dithiothreitol) 5 mM ベタイン (betaine) (Sigma社製） 640 mM
Thermopol buffer (New England BioLabs社製）
AMV 逆転写酵素（Promega社製） 1.25U
Bst DNA ポリメラーゼ (New England BioLabs社製） 16U ェチジゥムブロマィ ド (ethidium bromide) 0.125mg/ml 各プライ
FIP 40pmol RIP 40pmol
F3プライ 5pmol R3プライ 5pmol
4 ) RT-LAMP法
上記 4種のプライ を含む反応液 23 μ 1に、 RNA試料を 2 β 1 ( 20ng のヒ ト トータル RNA を含む） 添加し、 65°Cで 1時間加温 して行った。
5 ) 増幅の確認
増幅産物は 2本鎖構造をもつので、ェチジゥムプロマイ ドがィ ンタ一力レートして蛍光を発する。 その蛍光強度の増加を、 ABI 社製 PRISM7700を用いてリ アルタイム法により測定した。
6 ) 結果
各プライ セッ トを用いて反応させた場合の 0 -ァクチンの 増幅確認までの時間を表 1に示した。 その結果、 増幅は各プライ マーセッ トにおいて最大 45分で確認され、殆どの場合に 30分以 内に確認された。 (実験例 2 )
実験例 1で検討した ]3 -ァクチン用プライマーセッ トのうち、 最も短時間で増幅が確認されたプライマーセッ トを選択し、さら にループプライマーを組合せたプライマーセ ッ ト を用いて RT-LAMP法で測定した場合の感度を調べた。 .
1 ) ヒ ト ]3 -ァクチンの mRNA試料
実験例 1 と同様にした。
2 ) プライマーセッ ト
(表 2 ) プライマーセッ ト
Figure imgf000032_0001
3 ) 反応液組成
実験例 1 と同様の組成に、 さらに F3ループプライマー及び R3 ループプライマーを各々 5pmo l となるように加えた。
4 ) RT-LAMP法
実験例 1 と同様に行った。上記 6種のプライマーを含む反応液 23 μ 1 に、 RNA試料 2 μ 1 ( 20ngのヒ ト トータル RNAを含む） 添加 し、 65°Cで 1時間加温して行った。
5 ) 増幅の確認
実験例 1 と同様に行った。
6 ) 結果
その結果を第 1図に示した。 その結果、 3 -ァクチン遺伝子の mRNA 铸型量が多いほうが、 短時間で増幅の確認ができた。 増幅 は、 錄型量が 0. 02ngの場合でも 30分以内に確認され、 鍀型量が 20ng場合では 15分程度で確認された。 (実験例 3 )
LS 180 細胞 （大腸癌細胞株） 及ぴ Raj i 細胞 （バーキッ トリ ン パ腫細胞株）の培養細胞中における ]3 -ァクチンの増幅を調べた。
つまり、 サイ トケラチンが陽性の LS 180細胞溶液を、 サイ トケ ラチンが陰性の Raj i細胞溶液で稀釈した場合の、各濃度の LS 180 細胞溶液試料での -ァクチンの増幅について調べ、 サイ トケラ チンの腫瘍マーカーを測定する場合に、 -ァクチンがデータ補 正のコントロールと して使用可能か否かを検討した。
1 ) 試料
LS 180細胞及ぴ Raj i細胞の総細胞数が 8000 となるように試料 を調製した。 総細胞数 8000のうち、 LS 180細胞数が 8000、 800、 80、 8及び 0 となるよ うにした。
2 ) /3 -ァクチン用プライマー
実験例 2 と同様のプライマーを選択した。
3 ) 反応液組成
実験例 2 と同様の組成の反応液を使用した。
4 ) RT-LAMP '法
実験例 2 と同様に行った。
5 ) 核酸の検出
実験例 2 と同様の 6種のプライマーを含む反応液 23 / 1 に、細 胞の懸濁液を 2 μ 1添加し、 65°Cで 1時間加温して行った。
6 ) 結果
その結果を第 2図に示した。 その結果、 LS 180 細胞及び Raj i 細胞の比率が異なる場合でも、 β -ァクチンは 15分程度で増幅が 確認された。 このことより、 腫瘍マーカーの有無にかかわらず、 ヒ ト細胞中には j3 -ァクチンが構成的に発現していることが確認 され、 β -ァクチンが LAMP法におけるデータ補正のコ ン ト ロール と して使用可能であることが示された。
(実験例 4 )
実施例 4に記載する GAPDH用プライマーを、表 3に記載の各組 合せで用いた場合の、 RT- LAMP法による反応開始後増幅の確認ま でに要する時間を調べた。
1 ) GAPDHの mRNA試料
GAPDHの錄型として、市販のヒ ト トータル RNA ( Raj i細胞由来、 ABI社製） を使用した。
2 ) GAPDH用プライマー
各プライマーは （表 3 ) の組合せのものを用いた。
(表 3 ) プライマーセッ ト及び増幅確認時間
FIP RI P F3プライマー R3プライマー 増幅確認時間
(分）
FA-2 RA-2 F3-8 R3-2 40
FA-3 RA-3 F3-3 R3-3 20
FA-5 RA-5 F3-4 R3-5 50
FA-7 RA-7 F3-6 R3-7 45
FA-3 RA-3 F3-8 R3-3 18
FA-3b RA-3 F3-8 R3-3 21
FA - 3 d RA-3 F3-3 R3-3 10
FA - 3 d RA-3 F3-8 R3-3 10
FA-3 e RA-3 F3-8 R3-3 42 FA-3 g RA-3 R3-3 32
FA - 3 RA-3 a F3-3 R3-3 27
FA - 3 RA-3b F3-3 R3-3 21
FA - 3 RA-3 c F3-3 R3-3 28
FA - 3 RA- 3 d F3-3 R3-3 22
FA - 3 RA-3 e F3-3 R3-3 33
3 ) 反応液組成 O
実験例 1 と同様の組成の反応液を使用した。
4 ) RT-LAMP法
実験例 1 と同様に行った。上記 4種のプライマーを含む反応液 23 μ 1 に、 RNA試料 2 μ 1 ( 20ng のヒ ト トータル RNA を含む） 添加 し、 65 °Cで 1時間加温して行った。
5 ) 増幅の確認
実験例 1 と同様に行った。
6 ) 結果
各プライマーセッ トを用いて反応させた場合の GAPDH の増幅 確認までの時間を表 3に示した。 その結果、 増幅は各プライマー セッ トにおいて最大 45分で確認され、殆どの場合に 30分以内に 確認された。 (実験例 5 )
実験例 4で検討した GAPDH用プライマーセッ トのうち、最も短 時間で増幅が確認されたプライマーセッ トを選択し、さらにルー ププライマーを組合せたプライマーセッ トを用いて RT- LAMP 法 で測定した場合の感度を調べた。
1 ) ヒ ト GAPDHの mRNA試料 GAPDHの铸型と して、市販のヒ ト トータル RNA(Raji細胞由来. ABI社製） を使用した。
2 ) プライマーセッ ト
(表 4 ) プライマーセッ ト
Figure imgf000036_0001
3 ) 反応液組成
実験例 2 と同様の組成の反応液を使用した。
4 ) RT-LAMP法
実験例 2 と同様に行った。
5 ) 核酸の検出
実験例 2 と同様に行った。
6 ) 結果
その結果を第 3図に示した。 その結果、 GAPDH の mRNA の鎊型 量が多いほうが、 短時間で増幅が確認された。 しかし铸型量が 0.02ng の場合でも 30 分以内に増幅が確認され、 铸型量が 20ng 場合に 10分程度で増幅が確認された。
(実験例 6 )
LS180 細胞 （大腸癌細胞株） 及び Raji 細胞 （パーキッ ト リ ン パ腫細胞株） の培養細胞中における GAPDHの増幅を調べた。
つまり、 サイ トケラチンが陽性の LS180細胞溶液を、 サイ トケラ チンが陰性の Raji 細胞溶液で稀釈した場合の、 各濃度の LS180 細胞溶液試料での GAPDHの増幅について調べ、サイ トケラチンの 腫瘍マーカーを測定する場合に、 GAPDHがデータ補正のコン ト口 ールと して使用可能か否かを検討した。 1 ) 試料
LS 180細胞及ぴ Raj i細胞の総細胞数が 8000 となるように試料 を調製した。 総細胞数 8000のうち、 LS 180細胞数が 8000、 800、 0、 8及び 0 となるようにした。
2 ) GAPDH用プライマーセッ ト
実験例 5 と同様のプライマーセッ トを選択した。
3 ) 反応液組成
実験例 2 と同様の組成の反応液を使用した。
4 ) RT-LAMP法
実験例 2 と同様に行った。実験例 5 と同様の 6種のプライマー を含む反応液 23 μ 1 に、 細胞の懸濁液を 2 μ 1添加し、 65°Cで 1 時間加温して行った。
5 ) 核酸の検出
実験例 2 と同様に行った。
6 ) 結果
その結果を第 4図に示した。 その結果、 LS 180 細胞及び Raj i 細胞の比率が異なる場合でも、 GAPDH は 10 分程度で増幅が確認 された。 このことより、 腫瘍マーカーの有無にかかわらず、 ヒ ト 細胞中には GAPDH が構成的に発現していることが確認され、 GAPDH が LAMP 法におけるデータ補正のコントロールと して使用 可能であることが示された。 産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明のプライマー又はプライマーセッ トを用いて LAMP法を行う と、 速い場合で 15分以内に ]3 -ァクチ ン又は GAPDHの増幅が確認される。 また、サイ トケラチンのよ うな腫瘍マーカーの有無にかかわら ず、 ヒ ト細胞カゝら 3 -ァクチンや GAPDH の存在が認められること により、 これらカ LAMP法においてデータ補正のコン トロールと して使用可能であることがわかった。
このことから、 本発明のプライマー、 又はプライマーセッ トを 用いる と、 核酸増幅手段を用いた癌転移診断に際し、 診断に要す る時間が短縮され、 信頼性のある診断が可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . LAMP 法によ りハウスキーピング遺伝子及び/又はハウスキ 一ビング遺伝子に関連する mRNA を検出するための核酸増幅用プ ライマー。
2 . ハウスキーピング遺伝子が、 ]3 -ァクチン遺伝子又は GAPDH 遺伝子である請求の範囲第 1項に記載の核酸増幅用プライマー。
3 .以下の群よ り選択される配列からなるオリ ゴヌク レオチ ドを 含む |3 -ァクチン検出のための核酸増幅用プライマー ；
1 ) 配列番号 1 で表される塩基配列の第 240〜380番目、 又は第 401〜 1060 番目の領域及び Z又はその相補鎖の領域から選択さ れ、配列番号 1又はその相捕鎖の連続する塩基を少なく と も 5以 上含むオリ ゴヌク レオチド。
2 )配列番号 2又は 4〜34のいずれかで表される塩基配列からな るオリ ゴヌク レオチ ド。
3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌク レオチ ドの相補鎖。
4 ) 前記 1 ) ~ 3 ) のいずれか 1 に記載のオリ ゴヌク レオチドと ス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリ ダィズしう るオリ ゴヌク レオチ ド。
5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のォリ ゴヌク レオチドのうち、 1 ない し数個の塩基が置換、 欠失、 揷入も しく は付加といった変異され た塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリ ゴヌク レオチド,
4 . 配列番号 10及ぴ 14〜17、 29〜50の配列番号に表される塩基 配列のいずれかより選択されるオリ ゴヌクレオチドからなる _ ァクチン検出のための核酸増幅用プライマー。
5 .以下の群より選択される配列からなるオリ ゴヌク レオチドを 含む GAPDH検出のための核酸増幅用プライマー ；
1 )配列番号 51で表される塩基配列の第 1 10 ~ 450番目の領域及 び Z又はその相補鎖の領域から選択され、 配列番号 51又はその 相補鎖の連続する塩基を少なく とも 5以上含むォリ ゴヌクレオ チ ド。
2 ) 配列番号 52〜79のいずれかで表される塩基配列からなるォ リ ゴヌク レオチ ド。
3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌク レオチ ドの相補鎖。
4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいずれか 1に記載のオリ ゴヌク レオチドと ス ト リ ンジェントな条件下でハイプリ ダイズしう るオリ ゴヌク レオチ ド。
5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のオリ ゴヌクレオチドのうち、 1ない し数個の塩基が置換、 欠失、 揷入もしくは付加といった変異され た塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリ ゴヌク レオチ ド,
6 . 配列番号 58及び 62〜64、 73〜96の配列番号に表される塩基 配列のいずれかよ り選択されるオリ ゴヌ ク レオチ ドからなる GAPDH検出のための核酸増幅用プライマー。
7 . 核酸增幅の手段が LAMP法である請求の範囲第 3 〜 6項のい ずれか 1に記載の核酸増幅用プライマー。
8 .以下の群より選択される配列からなるオリ ゴヌクレオチドを 含む核酸増幅用プライマーから少なく とも 2種を選択すること を特徴とする iS -ァクチン検出のための核酸増幅用プライマーセ ッ 卜 ；
1 )配列番号 1で表される塩基配列の第 240〜 1060番目の領域及 び Z又はその相補鎖から選択され、配列番号 1又はその相補鎖の 連続する塩基を少なく とも 5以上含むォリ ゴヌクレオチド。
2 )配列番号 2〜34で表される塩基配列からなるオリ ゴヌク レオ チド。
3 ) 前記 1 ) 又は 2 ) に記載のオリ ゴヌク レオチドの相補鎖。
4 ) 前記 1 ) 〜 3 ) のいずれか 1に記載のォリ ゴヌク レオチドと ス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリ ダィズしう るオリ ゴヌク レオチド。
5 ) 前記 1 ) 〜 4 ) に記載のォリ ゴヌク レオチドのうち、 1ない し数個の塩基が置換、 欠失、 揷入もしく は付加といった変異され た塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリ ゴヌクレオチド c
9 .前記請求の範囲第 8項に記載のオリ ゴヌクレオチドを含む核 酸増幅用プライマーから少なく とも 4種を選択することを特徴 とする 3 -ァクチン検出のための核酸増幅用プライマーセッ ト。
1 0 .前記プライマーセッ トに含まれるプライマーのうち少なく とも 2種が、配列番号 1で表される塩基配列及び/又はその相補 鎖の各々 2箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする請求 の範囲第 8又は 9項に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト。
1 1 . 前記プライマーセッ トに含まれるプライマーが、 配列番号 1で表される塩基配列及ぴ Z又はその相補鎖の少なく とも 6つ の遺伝子領域を認識することを特徴とする請求の範囲第 9又は 1 0に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト。
1 2 . 配列番号 10及ぴ 14~ 17、 29〜32、 35〜42及び 43〜 50に 表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる 3 -ァクチン検 出のための核酸増幅用プライマーであって、 （a) FIP : 配列番号 35〜42、 （b) RIP： 配列番号 43〜50、 （c) F3： 配列番号 10及び 14 〜 17、 及び（d) R3：配列番号 29〜32に分類した場合の、 各分類か ら 1のプライマーを選択し、 組合せてなるプライマーセッ ト。
1 3 .請求の範囲第 1 2項に記載のプライマーセッ トにさらに配 列番号 33及び 34で表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチドをプ ライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 4 .請求の範囲第 5項に記載のオリ ゴヌクレオチドを含む核酸 増幅用プライマーから少なく とも 2種を選択することを特徴と する GAPDH検出のための核酸増幅用プライマーセッ ト。
1 5 .請求の範囲第 5項に記載のオリ ゴヌクレオチドを含む核酸 増幅用プライマーから少なく とも 4種を選択することを特徴と する GAPDH検出のための核酸増幅用プライマーセッ ト。
1 6 .前記プライマーセ ッ トに含まれるプライマーの うち少なく とも 2種が、 配列番号 51 で表される塩基配列及び/又はその相 捕鎖の各々 2箇所の遺伝子領域を認識することを特徴とする請 求の範囲第第 1 4又は 1 5項に記載の核酸增幅用プライマーセ ッ 卜。
1 7 . 前記プライマーセッ トに含まれるプライマーが、 配列番号 51 で表される塩基配列及び/又はその相補鎖の少なく とも 6つ の遺伝子領域を認識することを特徴とする請求の範囲第 1 4 〜 1 6項のいずれか 1に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト。
1 8 . 配列番号 80〜96 に表される塩基配列のオリ ゴヌクレオチ ドからなる GAPDH検出のための核酸増幅用プライマーであって、 (a) FIP：配列番号 80〜87、 (b) RIP：配列番号 88 ~ 96に分類した 場合の、各分類から 1のプライマーを選択した組合せを含むこと を特徴とするプライマーセッ ト。
1 9 .請求の範囲第 1 8項に記載の選択された各プライマーの組 合せに、さらに配列番号 58又は配列番号 62〜64で表される塩基 配列のオリ ゴヌク レオチ ドのいずれか 1及び配列番号 73〜77で 表される塩基配列のォリ ゴヌクレオチドのいずれか 1をプライ マーとして含むプライマーセッ ト。
2 0 .請求の範囲第 1 8又は 1 9項に記載のプライマーセッ トに さらに配列番号 78及び 79で表される塩基配列のオリ ゴヌクレオ チドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 1 . 核酸増幅の手段が LAMP法である請求の範囲第 8 〜 2 0項 の何れか 1に記載の核酸増幅用プライマーセッ ト。
2 2 . 次に示す 1 ) 〜 1 2 )のいずれかからなる ]3 -ァクチン検出 のための核酸増幅用プライマーセッ ト ；
1 ) 配列番号 35、 43、 14及び 29で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 ) 配列番号 36、 44、 15及び 30で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
3 ) 配列番号 37、 45、 10及び 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
4 ) 配列番号 41、 50、 17及び 32で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
5 ) 配列番号 38、 45、 10及び 31 で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
6 ) 配列番号 39、 45、 10及び 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
7 ) 配列番号 40、 45、 16及び 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
8 ) 配列番号 41、 45、 16及び 31で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
9 ) 配列番号 37、 46、 16及び 31で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
10) 配列番号 37、 47、 16及び 31 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
1 1 ) 配列番号 37、 48、 16及ぴ 31で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
12) 配列番号 37、 49、 16及び 31で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 3 . 次に示す 1 ) 〜 1 6 ) のいずれかからなる GAPDH検出のた めの核酸増幅用プライマーセッ ト ；
1 ) 配列番号 80、 88、 62及び 73で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 ) 配列番号 81、 89、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
3 ) 配列番号 86、 95、 58及び 76で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
4 ) 配列番号 87、 96、 64及び 77で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
5 ) 配列番号 81、 89、 62及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
6 ) 配列番号 82、 89、 62及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
7 ) 配列番号 83、 89、 63及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
8 ) 配列番号 83、 89、 62及び 75 で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
9 ) 配列番号 84、 89、 62及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
10) 配列番号 85、 89、 62及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
12 ) 配列番号 81、 90、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
13) 配列番号 81、 91、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ ク レオチ ドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。 14) 配列番号 81、 92、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ クレオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
15 ) 配列番号 81、 93、 63及び 75で表される塩基配列のオリ ゴヌ クレオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
16 ) 配列番号 81、 94、 63及び 75で表される塩基配列のォリ ゴヌ クレオチドをプライマーと して含むプライマーセッ ト。
2 4 ·請求の範囲第 1〜 7項のいずれかに記載のプライマーを少 なく とも 1つ使用して行う核酸検出方法。
2 5 .請求の範囲第 8〜 2 3項のいずれか 1に記載のプライマー セッ トを使用して行う核酸検出方法。
2 6 .請求の範囲第 2 4又は 2 5項に記載の核酸検出方法に使用 する試薬及び/又は試薬キッ ト。
2 7 .請求の範囲第 2 4又は 2 5項に記載の核酸検出方法を用い た核酸検出システム。
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