WO2004094628A1 - イマチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株及びその使用 - Google Patents

イマチニブ耐性フィラデルフィア染色体陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株及びその使用 Download PDF

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cells
leukemia
imatinib mesylate
cell
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Yuko Sato
Hiromasa Nagao
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Yuko Sato
Hiromasa Nagao
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel imatinib mesylate spore strain established from human acute lymphoblastic leukemia cells positive for Philadelphia chromosome, and a method for screening a therapeutic drug for imatinib-resistant leukemia using this cell line.
  • a human cell ⁇ which exhibits a high level of resistance to an agent which blocks a proliferation signal of cancer cells, which is an underlying agent for chronic myeloid leukemia, is provided. This will help clarify the relationship between the resistance of the spores and the development of new drugs for the treatment of leukemia.
  • CML chronic bone marrow leukemia
  • Philadelphia chromosome h
  • BCR / ABL fusion protein produced by the L fusion gene exhibits very high tyrosine kinase activity.
  • the infinite proliferation of cells in chronic myeloid leukemia is thought to be caused by the high tyrosine kinase activity of this abnormal BCR / ABL fusion protein.
  • Imatinib mesylate a selective tyrosine kinase inhibitor (STI571, or Gripeck (3 ⁇ 4! ⁇ ⁇ ⁇ )), is Ph-positive (Ph +) '(man «Proved to be extremely medicinal in the treatment of (CML) and acute lymphocytic leukemia (ALL) (see, eg, non-patent 3 ⁇ 4IU) .
  • Imatinib mesylate is an ABL protein ATP And inhibits the proliferation of BC RZAB L fusion cells in the current cell-specific manner.
  • chronic myeloid leukemia P h ⁇ is also significantly affected in patients with acute lymphocytic leukemia.
  • resistance to imatinib mesylate is compromised, and several mechanisms are considered for this resistance to imatinib mesylate, such as BCRZAB L fusion amplification, and ⁇ or ABL protein AT binding.
  • BCRZAB L fusion amplification a mechanism for this resistance to imatinib mesylate
  • ⁇ BCR / ABL fusion tyrosine kinase due to point mutation in Thinking that it is the main cause to be of Has been.
  • the growth potential of the imatinib mesylate derived from the human cell line of ⁇ was approximately 50% inhibited by contact with 2-3 or ⁇ imatieb mesylate for 3 days. It has been reported that the growth ability of the strain is about 30% lower than that of the susceptible strain (for example, see Non-patent «2).
  • the imatinib mesylate monocellular transport in this cell line is extremely complex and complex. It is thought that it is controlled by physical factors. In other words, no human cell line has been obtained that exhibits high proliferation ability even under high-grade imatinib mesylate and stably retains the drug homogeneity. Therefore, in order to efficiently screen for a drug that is effective against an imatinib mesylate strain, it is highly desired to establish a human cell line that is resistant to the drug and has high proliferative ability.
  • the crane of the present invention examined the proliferation and biochemical characteristics of various human leukemia cells, such as cells isolated from patients with chronic paraskeletal leukemia and acute lymphocytic leukemia, in detail.
  • various human leukemia cells such as cells isolated from patients with chronic paraskeletal leukemia and acute lymphocytic leukemia
  • the present invention has been completed by clarifying the biological characteristics of this imatinib mesylate Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell line.
  • the tooth cell line is also capable of growing under 20 xM imatinib mesylate.
  • the abominable chromosome contains substantially one copy of BCRZABLBi ⁇ iti ⁇ per cell, and is a point mutation in the ATP conjugation ⁇ of the product. The point mutation in which the fifth threonine is replaced by isoloisin is referred to as fiber.
  • substantially one copy means, as specifically explained in a difficult example, not only one that is clearly recognized as one copy by an H3 ⁇ 4 detection method but also some errors. Also include those that are considered to be almost one copy.
  • a cell line TCC-Y / sr and a cell line TCC-YZwr are provided.
  • Preferably, about 100% of the BCRZABL fusion mRNA in these cells has the above point mutation.
  • a method for screening a therapeutic agent for imatinib human white spot comprising: preparing a compound; disgusting; and immortalizing the imatinib mesylate under a sickle compound.
  • the cryptic compound is a compound that targets and blocks heat shock proteins. Therefore, an agent found to inhibit the growth of the cell line by the method of the present invention is imatinib mesylate. It is suggested to be extremely [*] as the cure of * ⁇ 'raw human white «.
  • FIG. 1 is a diagram showing a point ⁇ mutation (ATC ⁇ AI, ie Thr ⁇ He) at the ATP supply
  • FIG. 2 is a graph showing the growth curves of (a) TCC—Y, (b) TCC—YZwr, and (c) TCC-Y / sr cells in the presence of various Radicicds.
  • the imatinib human leukemia cell line of the present invention comprises imatinib mesylate and SlftL purified (FBS) obtained by gradually increasing the concentration of Philadelphia chromosome ( ⁇ h) positive i-live human acute lymphoblastic leukemia cells.
  • FBS Philadelphia chromosome
  • C0 2 under at R PM I 1 6 4 ⁇ comprising, can be obtained by performing the same culture and conventional cell culture at 3 7 ° C.
  • Philadelphia chromosome (P h) j refers to 9 chromosomes and 2 chromosomes found in about 90% or more cases of chronic myeloid leukemia and about 15 to 35% of acute lymphocytic leukemia. 2 «An abnormal chromosome formed by the interplay of chromosomes. 9 ⁇ ⁇ A break named ABL ⁇ (GenBank Acc. No. M14752) The cut point is covered by a residual ⁇ ?
  • BCR Named BCR, and the cut chromosome and 22 chromosome are combined to fuse the two ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ into a new BCRZAB L
  • This BC RZAB L fusion forms a 190, 210, or 230 kD BCR / ABL fusion protein that varies in size depending on the cleavage site in the BCR.
  • imatinib mesylate (Code No .: ST I571, trade name: Dali Beck (3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ )), which was developed as a child-targeted therapeutic for the 210 kD BCR / ABL fusion protein, It has a remarkable effect on patients with chronic myeloid leukemia, and also has an effect on Ph-positive acute lymphocytic leuk Ifc, which is difficult to combat, but relapse due to the emergence of resistant strains is a problem.
  • the imatinib mesylate Ph-positive human acute lymphoblastic leukemia cell line of the present invention has a mutation in the amino acid residue of the BCRZABL fusion protein (3 ⁇ 4r315Ile), thereby preventing the imatinib mesylate from binding to ATP. Therefore, it is considered that viability was maintained even under extremely high imatinib mesylate.
  • Imatinip mesylate at night is resistant at 0-5 CM, but is preferably 3-20 M, more preferably at least about 5 M, even more preferably at least about 20 M Shows good proliferation.
  • BCR./AB L fusion ⁇ ! IS? Increase in copy number ⁇
  • transcripts increase of transcripts
  • other factors in the cell that may affect the activity of B CRZABL fusion protein are also considered.
  • it may be an intracellular reaction independent of the action of BCR / ABL fusion I.
  • imatinib mesylate according to the present invention may be a Ph-positive human acute lymphoid Leukemia cell lines may have these other causes in combination, but preferably the resistant strain is very similar to the in vivo conditions of the patient and is stable for long periods of time. Therefore, particularly preferably, the imatinib mesylate-positive human Ph-positive human acute lymphocytic leukemia cell strain of the present invention is characterized by the presence of TThr315Ile at the ATP-binding site of the ABL protein.
  • the stability of imatinip mesylate is defined as Even after long-term cultivation in a medium containing no A, the T3 ⁇ 4r315Ile point of the ABL protein Without, say the Yorekoto impaired resistance to mesylate Sani imatinib.
  • the imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute, viable lymphocytic leukemia cell line of the present invention can be used for resistance to the drug, and can be used for various purposes. Use in the screening method for human leukodystrophies described below demonstrates extremely high utility in drug development.
  • the method for screening a therapeutic agent for imatinib mesylate 1H raw human white of the present invention comprises the steps of (a) preparing a candidate compound, and (b) imatinib mesylate according to the present invention under the control of a sickle compound. Culturing positive human acute lymphoblastic acute leukemia cells, and (c) determining whether the sickle compound inhibits the growth of unfavorable cells.
  • the self-Ph-positive human acute lymphocytic white Jfo ⁇ cells are any of the imatinib mesylate mesylate Phyang (cells derived from the live human acute lymphatic acute white female cell line) of the present invention.
  • the cell line used in the above screening is as similar as possible to a cell derived from a human leukemia patient, and that the resistance to imatinib mesylate is stably expressed by removing as much as possible artifacts at the stage of establishment.
  • TC CY / wr or TC C-Y / sr (wr: low MS tolerance, sr: isolation tolerance) is used.
  • Thalling compounds include, but are not limited to, proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, nucleic acids, antisense, liposomes, siRNAs, abdomers, and antibodies. Good. These compounds may be unusual compounds or compounds of the formula
  • the determination as to whether or not the unpleasant sibling is capable of inhibiting the growth of the cell line # can be made, for example, by measuring the number of surviving cells after culturing for a certain period of time.
  • the method of culturing animal cells including human beings is suitable for those skilled in the art! It is. There are various methods for measuring the number of cells; for example, the ability to discharge a stain such as trypan force! / "Is used. Alternatively, by measuring the activity of the enzyme in the intracellular protein mitochondria, etc. 3 ⁇ 4 It is also possible.
  • the compound is a compound that destabilizes human heat shock proteins.
  • Heat shock proteins refer to a group of proteins whose synthesis is rapidly induced when cells or individuals work in an environment 5 to 10 higher than normal growth temperature. It is also called a stress protein because it is induced not only by 3 ⁇ 4 but also by specific proteins. In humans, low ⁇ 3 ⁇ 4 proteins such as HSP90 (about 90,000), HSP70 and HSP60 are typical.
  • HSP90 has been described as a chaberon that affects the stability and function of many proteins involved in cell growth, differentiation and development, including the BCRZAB L fusion protein (Weisbe ⁇ eta ⁇ Blood ⁇ OOO ⁇ S ⁇ A S-SSOS Therefore, a human heat shock protein, for example, a compound that inhibits HSP90, was used as a compound of the present invention to produce imatinib mesylate-based human leukemia cells. It is extremely difficult to screen for remedies.
  • geldanamycin by binding to GA binding ⁇ stand in Amino ⁇ of HS P 9 0 protein, HS P 9 0 ⁇ 2 1 0 to be coupled to the protein B c R / ABL It is known that fusion and destabilization of Ra1 and intracellular tyrosine phosphorylated proteins.
  • Radicicol, a macrocyclic expanding fiber antibiotic, and a derivative of geldamycin 17-allylaminogeldamycin (17-AAG) are also HS P90 inhibitors that have a similar effect.
  • the compound selected from the compound library by the in silico screening method can be used as a hanging compound using the stereolabel of the kinase domain of the ABL protein having the l3 ⁇ 4r315Ee mutation and the 3 ⁇ 6del algorithm.
  • the in silico screening Engg method the target protein the feeding of protein and ⁇ sickle compound was calculated by docking studies, such as ⁇ dynamics, Thr315H e variants AB L protein likely Li one that binds to ⁇ binding pocket Although the compound is presented, its accuracy is not yet real.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound that inhibits the growth of human leukemia cells that have become resistant to imatinib mesylate. Can be used as ⁇ . At times, additive or synergistic results can be obtained when used in combination with imatinib mesylate.
  • a pharmaceutical extinct substance can be prepared by mixing the compound with a carrier that is gently acceptable to H3 ⁇ 4. There are no particular restrictions on carriers for pharmaceuticals.
  • lactose glucose, D-mannose, starch, crystalline cellulose, calcium carbonate, kaolin, gelatin, hydroxypropyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, ethanol, lipoxymethylethyl! / Cellulose , Carboxymethylcellulose sodium salt, Magnesium stearate, Talc, Acetylcellulose, Sucrose, Titanium oxide, Benzoic acid, Paraoxybenzoic acid ester, Sodium dehydroacetate, Gum arabic, Tragant, Methylcellulose, Egg yolk, Surfactant, Single syrup, There are citric acid, distilled water, glycerin, propylene glycol, macrogol, sodium monohydrogen phosphate, sodium phosphate, sodium phosphate, sodium chloride, etc.
  • Said pharmaceutical exudates comprise a shelf amount of a compound according to the invention for the treatment of human leukemia. More specifically, "appropriate for the treatment of human leukemia” means that it suppresses the proliferation of white bell cells that have become resistant to imatinib mesylate and can improve and improve various symptoms of white blood cells It is the amount of drug. Determination of such column quantities is well possible by those skilled in the art, and various trial methods have been used ⁇ 5 ⁇ .
  • a method for treating leukemia, particularly leukemia which has become resistant to imatinib mesylate, by administering a pharmaceutical composition containing the compound of the present invention by administering a pharmaceutical composition containing the compound of the present invention.
  • the preferred method of administration of the above-mentioned reversal may be oral, rectal, key scleral, puncture, intramuscular, intravenous, intravenous administration and the like. Alternatively, it can be targeted and administered to specific cells by binding to ribosomes or antibodies.
  • TCC-Y cell line established at Tochigi Cancer Center, Yasuhiko Kano et al., BLOOD, 2001, 97, 1999-2007
  • the present inventors have established a cell line in which the imatinip mesylate performance was examined, and examined various properties of the obtained cell line.
  • Difficult example 1) Establishment of imatinib mesylate cell strain
  • Imatinib mesylate was used by keeping a 1 OmM solution dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS ⁇ ) at night, and adding it to the culture night to obtain various iUtfc. DMSO termination during the culture night was 0.1% or less, confirming that there was no inhibitory effect on cell proliferation.
  • the TCC-Y cell line is composed of 10% bovine serum (FBS, IC ⁇ ), 100 U / m1 of penicillin, 0.1 mg / ml of streptomycin (RPM 1640 medium containing ICN (Sigma3 ⁇ 4)). In this medium, the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 .In this culture difficulty, the doubling time of TCC-Y cells was 31 ⁇ 1.5 hours. — In Y cells, the expression of both P210BCR / ABL fusion mRNA and P190BCR / ABL fusion mRNA has been confirmed.
  • TCC-Y fine) ⁇ strain was cultured for several months or more under ⁇ of imatinib mesylate while gradually increasing the ⁇ t of the drug (100 nM to 200 nM).
  • TCC-Sup Y cell growth of 50% inhibitory 3 ⁇ 4 "Ru imatinib mesylate flame of (IC 5 0) is 1. 37 ⁇ 0. In 6 M there were. A few months later, 1% to 5xM imatinib mesylate S showed 90% or more viability under the imatinib mesylate Strain TC CY / wr (IC 5 o 5.1 ⁇ 0.9 iM) was obtained.
  • TC CY / wr 5.1 ⁇ 0.9 iM
  • TCC-Y / sr cells continued to proliferate under 20 / M imatinib mesylate at a viable cell rate of 90-98% for more than 4 months.
  • the TCC-1 YZs r cells were deposited with the administrative corporation Sogo Ishi ⁇ at the Patent Registration Center ( ⁇ 1-1-6, Tsukuba, Higashi 1-6-1, Ibaraki 305-8566, Ibaraki Prefecture) under the accession number FERM P-19148 (December 10, 2003) and was administered on October 27, 2003 by the Kokurin Deposit Service (Accession No. FERM BP-08531 for the Descendants Deposit Service). .
  • RNA was extracted from TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr cells using Sephazol I (Nacalai Tesquene). 2 g of total RNA was replaced with a 6-base random primer. RT-PCR was performed using a standard protocol with the SuperScript II-Reverse Transcriptase (GI BCO BR L ⁇ ) and the ABL kinase domain of the BCR / ABL fusion allele.
  • GI BCO BR L ⁇ SuperScript II-Reverse Transcriptase
  • Primer BCR-F2 5 'CAGTGCCATAAGCGGCACC 3' (SEQ ID NO: 3) and reverse primer AIP-R2: 5 ' Long distance PCR was performed using CAGGCACGTCAGTGGTGTCTCTGTG 3 ′ (SEQ ID NO: 4).
  • the PCR cycle conditions were as follows: treatment at 94 ° C. for 1 minute, heat denaturation at 94 and 45 seconds, annealing at 68 ° C. for 3 minutes, and extension reaction at 72 ° C. for 10 minutes were repeated 30 cycles.
  • the following two primer sets were used to amplify the 657th to 1621st of the coding region of ABL.
  • AIP-F1 5 'GCGCAACAAGCCCACTGTCTATGG 3' (system U number 5)
  • ATP-R1 5 'CCAGGCTCTCGGGTGCAGTCC 3' (Rooster column number 6)
  • AIP-F2 5 'GGACTGCACCCGAGAGCCTGG 3' (S3 column number 7)
  • ATP-R2 5 'CAGGCACGTCAGTGGTGTCTCTGTG 3' (E column number 4)
  • the PCR was performed according to the method described in Gorre, ME et al., Science 2001; 293: 876-880.
  • the amplified DNA fragment was purified using the QI AQU ck gel extraction kit (QIAGENE: 1 ⁇ ), and the salt of both strands was converted using an automatic sequencer (ABIPR I SM310, PE Applied Biosystems ⁇ ). Determined columns.
  • TCC-Y / sr cells As a result, in the TCC-Y / sr cells, the 944th base, cytosine (C), was replaced with thymine (T) by one base, and the 315th threonine (T hr) was replaced with isoleucine (I 1 e) was found to be replaced (see Figure 1). No base mutation was detected in TCC-YZwr cells.
  • Example 1 be 1 / ab 1 extra signal (ES) double-stained translocation probe (Vysis II)
  • ES extra signal
  • TCC-Y / sr cells the two types of imatinib mesylate cells obtained in Example 1
  • Metaphase cells obtained from Y / wr cells and TCC-Y / sr cells) and TCC-Y cells were subjected to fluorescence in situ hybridization (FISH).
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • the probe was hybridized to metaphase cells according to the protocol of ⁇ .
  • the obtained metaphase cell image was analyzed with Mac type ver.5.5.3 software.
  • BCR / AB L fusion signal was always 1 cell / cell in metaphase and phase cells obtained from TCC-Y'TCC-Y / wr and TCC-Y / sr cells.
  • the mRNA level of the gene was then examined by quantitative PCR. Using the 7700 salt ssa ⁇ extraction system (Applied Biosystems; fc), the amount of BCRZABL fusion! MRNA was measured by the Taqman method (Applied Biosystems ⁇ ).
  • the main primers and probes for detecting BCR / ABL fusion gene mRNA are as follows.
  • BCR-F 5 'GATGCTGACCAACTCGTGTGTG 3' (SEQ ID NO: 8)
  • ABL-R 5 'TGGCCACAAAATCATACAGTGC 3' (SEQ ID NO: 9)
  • ABL-P 5 'CCrrCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTnT 3' (system number 10)
  • the primers for the GAP gene mRNA amount measurement and the probing probe as controls were as shown below.
  • GAP-F 5 'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3' (SEQ ID NO: 11)
  • GAP-R 5 'GAAGATGGTGATGGGAnTC 3' (12 column number 12)
  • GAP-P 5 'CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 3' (SEQ ID NO: 13)
  • the ratios of BC RZABL fusion t153 ⁇ 4iRNA amount and GAP residue f3 ⁇ 43 ⁇ 4iRNA amount in the Itoyoshika, TCC-Y, TCC-Y / wr, and TCC-Y / sr fine)) packets are 0.130 and 0.1603, respectively. , And 0.0870.
  • the amount was increased in the TCC-YZwr cells with respect to the parent strain TCC-Y cells, but decreased slightly in the TCC-Y / sr cells.
  • the two types of imatinib mesylate-positive cell citric cell (TC CY / wr fiber and TCC-YZr cell) and TCC-Y cell obtained in Example 1 were each subjected to 2 OmM Tris rust ⁇ 7.4, 15 OmM NaC. 1, 10% glycerin, 1% Nonidet ⁇ 0, ImM PMSF (Henylmelhylsulphonyl fluoride), 20 U / m 1 Apurochinin, 1 OmM EDTA, 10 11 g / m 1 Roipe angiopeptin, 10 OmM NaF, 2mM Na 3 V0 4, and 0.05%
  • ⁇ -glycoprotein ⁇ -glycoprotein
  • This PG is a transport protein that excretes the drug through the cell membrane. Therefore, the sensitivity to imatinib mesylate and the amount of PGP expressed in the cell membrane of the cells were also measured by flow cytometry.
  • FITC-conjugated mouse anti-human GPG monoclonal antibody was used to detect the expression of MDR1 in each cell line. Each cell was washed three times with PBS. Pia 2 ⁇ 10 6 cells were washed in PBS 501 containing 1% bovine && L (FBS).
  • the cells were stained with 501 of anti-MDR1, and then incubated at 4 ° C. for 30 minutes. After washing the cells twice with 1 ml of PBS containing 1% FBS, the cells were suspended in 1 ml of PBS. Cells stained in this way were harvested by FACS scanning using Ce 11 Request software.
  • Radicicol was purchased from Sigma-Aldrich. This was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS 0) and stored as 1 OmM® night. TCC- Y, TCC-Y / wr , and the TCC-Y / sr cells, respectively ⁇ 1® ⁇ of ⁇ together with Radicicol of 1. 5 ⁇ 2xl 0 5 fine The cells were cultured in 3 ml plates with the cells Zm1. The cell number and the viable cell rate were measured every 24 hours after the plowing of cicol by the ability to discharge trypanpuri "colored solution.
  • DMS 0 dimethyl sulfoxide
  • TCC-Y and TCC-Y at 24, 48 and 72 hours after culture initiation 2 (a) to 2 (c) show the cell count and viable cell rate of the TCC / wr, and TCC-Y / sr cell lines, respectively. (The results showed that there was no significant difference between the above three types of cell lines. The results are summarized in Table 1 below.
  • Example 2 In order to examine the stability of the TCC-Y / sr cell line obtained in Example 1, 10% bovine whey (FBS, ICN3 ⁇ 4), 100 U / m1 without imatinib mesylate was used. After passage for at least 3 months in RPMI 1640 medium (Sigmane: fc) containing nicillin and 0.1 mgZml of streptomycin (ICN3 ⁇ 4), some cells were sampled at passages 26, 60 and 90. From these cells, the ATP-binding domain of the BCR / ABL fusion allele was specifically amplified by the same method as in Difficult Example 4 to determine the salt sequence.
  • FBS fetal bovine whey
  • the imatinib mesylate-resistant Ph-positive human acute lymphocytic leukemia cell line of the present invention can stably regulate it even under high imatinib mesylate. Therefore, These cell lines are extremely useful for elucidating the mechanism of resistance of imatinib mesylate ⁇ screening for imatinib mesylate W therapeutic human leukemia.

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Abstract

　少なくとも５μＭの濃度においてメシル酸イマチニブに耐性であることを特徴とするフィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株を提供する。好ましい実施形態において、前記染色体はＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を含み、当該遺伝子産物のＡＴＰ結合部位の点突然変異であって、配列番号２のアミノ酸配列において３１５番目のトレオニンがイソロイシンに置換された点突然変異を有することを特徴とする。本発明の特に好ましい実施形態において、細胞株ＴＣＣ−Ｙ／ｓｒが提供される。本発明のメシル酸イマチニブ耐性細胞の増殖を阻害する薬剤をスクリーニングすることにより、メシル酸イマチニブ耐性ヒト白血病に有効な治療薬が提供される。

Description

明 細 書 ィマチニブ谢性フィラデルフィァ染色体陽性ヒト急性リンパ性白雌細胞株 及びその翻
猜分野
本発明は、 フィラデルフィァ染色体陽性のヒ卜急性リンパ性白血病細胞から樹立され た新規なメシル酸イマチニフ 田胞株、 及びこの細胞株を用いるメシル酸イマチニブ 耐性白血病治療薬のスクリーニング方法に関する。 本発明によれば、 慢性骨髄性白血病 に ί敷的ながん細胞の増殖シグナルを遮断する薬剤に強レ «性を示すヒ卜細胞^^提供 されるので、 このシグナル錢阻豁 (Jとこれに対するが 田胞の耐性漏との関連性を 明らかにして、 新たな白血病治療薬の開発に貢献することが きる。 背景擴
慢性骨 ¾性白血病 (CML)患者のほとんどには、フィラデルフィァ染色体（以下 ΓΡ h」と ¾τΤる。） と呼ばれる異常染色体が全ての白血病細胞に見出され，この異常染色体 上の B C R/AB L融合遺伝子によって生成される B C R/AB L融合蛋白質は非常に 高いチロシンキナーゼ活性を示す。慢性骨髄性白血病における細胞の無限増殖は、 この 異常な B CR/AB L融合蛋白質の持つ高チロシンキナーゼ活性によって引き起こされ ると考えられている。
選択的なチロシンキナ一ゼ阻害剤であるメシル酸イマチニブ（S T I 5 7 1、 又はグ リペツク （¾!录商^)) は、 P h陽性 (P h +) '(曼性骨 ϋ('生白 « (CML)及び急性リ ンパ性白血病 (AL L) の治療において極めて械であることが証明されている （例え ば、非特許 ¾IU参照)。メシル酸イマチニブは、 ABL蛋白質 AT P結^頁域において AT Pの競合阻割！)として作用し、 B C RZAB L融^ ¾現細胞特異的に増殖を阻 る。 しかしながら、 慢性骨髄性白雌患 P h隞も急性リンパ性白血病患者において はかなりの割合でメシル酸ィマチニブに対する耐性が雀膝される。 このメシル酸ィマチ ニブ耐性については、 いくつかの機構が考えられている。 例えば、 B CRZAB L融合 遺 増幅、 及び Ζ又は AB L蛋白質 AT Ρ結^ 域における点突然変異によって、 B C R/AB L融合チロシンキナーゼが 舌性化されることが主な原因ではないかと考え られている。 Πのヒト細胞株から^ Μされたメシル酸イマチニフ ¾性株の生育能は 2 〜3 ,' Μのメシル酸ィマチエブに 3日間接触させることによって約 5 0 %阻害され、 し かも、 これらの耐性株の増殖能は、 感受性株に比べて約 3 0 %低いことが 告されてい る （例えば、 非特許 «2参照)。
更に、 CML患者由来の細胞から得られた、 より高離のメシル酸イマチニブに対し て耐性となった細胞株が報告されている (例えば、細午文献 3参照)。しかしながら、 上記纖こ記載されたメシル酸ィマチニフ 性株 KBM5-STT571R1-°では、 B C R/A B L融^ t ^のコピー数が 2〜 8個 Z細^^出され、 B C RZA B L融^ mRN Aの約 2 0 %が AT P結^ 域における点突然変異を るのみである。 そして、 その細胞を メシル酸ィマチ二ブ啦下で培養することによってメシル酸ィマチニブに対する耐性 カ培盼的に戻ることから、 この細胞株におけるメシル酸イマチニブ 1ί性搬冓は極めて複 雑であり、 複合的な因子によって制御されていると考えられる。 つまり、 高 «のメシ ル酸ィマチニプ雜下においても高い増殖能を示すと共に、 この薬斉麵 ί性を安定して保 持するヒト細胞株妹だ得られていない。 そこで、 メシル酸イマチニフ 性株に効果の ある薬剤を効率よくスクリーニングするためには、 当該薬剤に対する耐性が し、 且 つ高い増殖能を有するヒト細胞株の樹立が く望まれている。
[非特許鍾 1 ]
ビ一 ·ジエイ ·ドゥルカー (B. J. Druker)外 7名、 「ニュー 'イングランド ·ジャーナ ル·ォブ·メディシン(NEnglJMed)」、 2001年、 第 344巻、 p.1038-1042
[非特許鍾 2]
フランソワ.ザビエル ·マホーン (Francois Xavier Mahon)外 6名「ブラッド (BLOOD)」 2000年、 第 96巻、 p.1070-1079
[非特許文献 3]
クララ .リツチ (Clara Ricci)外 7名 「キャンサ一 .リサーチ (Cancer Research)」 2002 年、 第 62巻， p.5995-5998 発明の開示
本発明は、 か力ゝる纏を解夬するためになされたものであって、 高' mのメシル酸ィ マチニブに対する耐性を示し、 且つ安定したヒト細胞株を樹立することを目的とする。 また、 カゝかるヒト細胞株を用いて、 メシル酸イマチニフ ¾f性ヒト白血病治藤のスクリ 一二ング方法を提供することを目的とする。
本発明鶴は、 種々のヒト白血病細胞、 例えば、 慢性骨随性白血病や急性リンパ性白 患者から分離した細胞の増殖倉^生化学的特性を詳細に調べた。 その結果、 急性リ ンパ性白血病患者から分離された細胞株 TC C一 Yを、 メシル酸イマチニプの 下、 当該薬剤の藤を徐々に増加させて数ケ月以上にわたり培養を続けたところ、 高 tの メシル酸ィマチニブ存在下においても極めて生存能力カ犒く、 かつ安定して増 »る事 を見出した。 このメシル酸イマチニフ 性 P h陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株の生 物学的な特性を明らかにすることによって本発明を完成した。
すなわち、 本発明の第一の視点において、 少なくとも 5 xMの？ ¾においてメシル酸 イマチニブに耐性であることを難とするフィラデルフィア染色体 (P h) 陽 I生ヒト急 性リンパ性白血病細胞勸 是供される。 好ましい難形態において、 齒己細胞株は 2 0 xMのメシル酸イマチニブの被下においても増殖可能である。 また、 嫌己染色体は、 細胞当たり実質的に 1コピーの B CRZABLBi^iti^を含み、 当該遺 産物の A TP結 ^^立の点突然変異であって、 配列番号 2のアミノ酸配列において 3 1 5番目の 卜レオニンがィソロイシンに置換された点 変異を ¾ ることを纖とする。ここで、 「実質的に 1コピー」 とは、 る難例において具体的に説明するように、 H¾的 な検出方法によって明らかに 1コピーであると認められるものはもちろん、 多少の誤差 はあってもほぼ 1コピーであると認められるものを含む。 本発明の特に好ましレ ¾1形 態にぉレて、 細胞株 TCC一 Y/ s r、 及び細胞株 TC C—YZw rが提供される。 こ れらの細胞内に る B CRZABL融^ mRNAのほぼ 1 0 0 %が上記点突然変異 を Tることが好ましい。
本発明の他の視点〖こおいて、 メシル酸イマチニブ 性ヒト白細の治療薬をスクリー ニングする方法であって、 ί謹化合物を用意し、 嫌己 ί鎌化合物の被下で上記メシル 酸イマチニフ ¾Η'生ヒト白 «細胞株を培養し、 嫌 3ί鎌化合物が嫌 田胞株の増殖を阻 ¾Τる力 かを判 ることを樹敫とする、 メシル酸ィマチニフ碰ヒト白血病治療薬 のスクリーニング方法が提供される。 本発明の好ましい 1つの魏形態として、 嫌 3候 補化合物は熱ショック蛋白質を標的にしてこれを阻針る化合物である。従って、 本発 明の方法により前記細胞株の増殖を阻害することが見出された薬剤はメシル酸ィマチ二 ブ *Η'生ヒト白 «の治 «として極めて [であることが示唆される。 図面の簡単な説明
図 1は T C C一 YZ s r細胞株で見出された AB L遺^の AT P給咅 |5f立における 点^ ^変異 （ATC→AI つまり、 Thr→He) を示した図である。
図 2は種々の «の Radicicd存在下における (a) TC C— Y、 (b) TC C— YZ w r、 及び（ c ) TC C-Y/s r細胞の増殖曲線を示したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
(メシル酸ィマチニプ If性ヒ
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本発明のメシル酸ィマチニフ 性ヒト白血病細胞株は、 フィラデルフィァ染色体 (Ρ h) 陽 i生ヒト急性リンパ性白血病細胞を段階的に濃度を上げたメシル酸イマチニブおよ 胎 SlftL清 (F B S) を含む R PM I 1 6 4 Οί咅地で C02 下、 3 7°Cで通常の 細胞培養と同様に培養を行うことによって得ることができる。
3〜4日間ごとに培衝夜を 奐しながら数ケ月間細胞培養を行い、 増殖してきた細胞 を限界 ¾尺法により 9 6ウェルマィクロプレートでクローニングする。 種々の？ のメ シル酸イマチニブを添加して、 さらに限 尺法によりクローニングを行い、 得られた クローンについて増歹 βίΐ^と 5 0 %増殖阻害に必要なメシル酸ィマチニブ ( I c 5 0 ) 等を測^ τることによって高 のメシル酸イマチニブ 下において増殖能の優 れた細胞株を得ることが きる。
ここで、 「フィラデルフィア染色体 (P h)j とは、 慢性骨髄性白血病の 9 0 %以上、 急性リンパ性白翻 ¾の 1 5〜 3 5 %程度の症例において認められる、 9養染色体と 2 2 «色体の相互 によって形成される異常染色体のことをいう。 9 ¾色体の 切 断点には AB Lという名の遺 ^^(GenBank Acc.No. M14752)が、 2 2 色体の 切 断点には B CRという名の遺 β?が被し、 切断された 9 色体と 2 2養色体が結 合することによって、 この 2つの遗 ί¾ίが融合し、 新たに B CRZAB L融合という融 が形成される。 この B C RZAB L融^ ¾ί¾ΐは B C R遺 の切断部位によ つて大きさの異なる 1 9 0、 2 1 0、 又は 2 3 0 kDの B CR/AB L融合蛋白質をコ 一ドしている （Melo, J.Y Blood 1996, 88, 2375-2384)。 これらすベての融合蛋白質に共通 の性質は、 高いチロシンキナーゼ活性であり、 インビトロ実験や動物雞で高い 能を示す。
このような背景のもと、 210 kDの BCR/ABL融合蛋白質に対する 子標的治 療薬として開発されたメシル酸イマチニブ（コード番号： ST I 571、 商品名：ダリ ベック （ ¾商徵）は、多くの慢性骨髄性白血病患者に顕著な効果を示し、 さらに抗が が ¾|きにくい P h陽 急性リンパ性白 Ifc でも効果が認められたが、 耐性株の出現 による再発が問題となっている。 これまで、 メシル酸イマチニプに対する耐性を示した 患者の B C R/AB L融合蛋白質の AT P結 啦におレて、 くの突然変異（例え ば、 M244W, G250E, Q252M, Y253H, Y253F, E255K, E 255V, F311L， T315 I, F317L, M351T, E355G, H396 P及び F 486 S、 なお、 アミノ酸歹雄の位置は配列番号 2に示したヒト c— AB L蛋 白質のアミノ酸配列に基づく）が報告されているが、最も頻繁に見つ力、る変異の一つは、 配列番号 1に示したヒト c一 AB L遺 の 944番目のシトシンがチミンに置換 ( 9 44C>T) されることによって、 配列番号 2に示したアミノ«列の 315番目のト レオニンがイソロイシンに置換を引き起こす変異（T¾r315He) である。 この 315番目 のトレオニン残基は、 メシル酸イマチニブの類似化合物と ABL蛋白質との複合体の立 ί材 itから、 ATP結合能という点で も重要なアミノ酸藤であることが知られて レる (Schindkr T. et al., Science, 2000, 289, 1938-1942)。 メシル酸ィマチニブの類似化合物と 複合体を形成した ABL蛋白質キナ一ゼドメインの結晶構翻晰の結果、 315番目の トレオニン藤の側鎖に る酸素原子がメシル酸ィマチ二ブの第 2級アミノ基と水 素結合を形成しており、 変異型 （He315)では、 この水素結合が消失すると共に、 イソ口 ィシン側鎖のメチル基がメシル酸ィマチニブとの結合の立体障害になることが維則され ている (Gorre, ME. et al. Science, 2001, 293, 876-880)。
従って、本発明のメシル酸イマチニプ 性 P h陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、 BCRZABL融合蛋白質のアミノ酸残基に突然変異 (¾r315Ile) を することによつ て、 メシル酸イマチニブの ATP結合阻織果が抑制されるため、 極めて高«のメシ ル酸ィマチニブ 下においても生 ^能となつたものと考えられる。 夜中のメシ ル酸イマチニプ ¾tとしては、 0〜 5 C Mにおいて耐性であるが、 好ましくは、 3〜 20 M、 より好ましくは少なくとも約 5 Μ, 更に好ましくは少なくとも約 20 M において良好な増殖性を示す。
メシル酸ィマチニブに対する耐性機構としては、 上記 B C R/AB L融合蛋白質にお けるアミノ酸置換のほかにも種々の原因が考えられる。 例えば、 B CR./AB L融^! iS?の増幅 (コピー数の増力 Π)や転写産物の増加、 その他、 B CRZABL融合蛋白質の 活性に影響を与えるような細胞内の因子の雜も考えられる。 あるいは、 B CR/AB L融^ I の作用跡に非依存的な細胞内の反応である可能 I生も ϊ£ "る。従って、 本発明のメシル酸ィマチニブ丽性 P h陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株は、 これらの 他の原因を併せて有してもょレが、 好ましくはこの耐性キ爵冓は白 «患者の生体内の条 件ときわめて類似のものであり、 且つ長時間安定して麟されるものである。 従って、 特に好ましくは、 本発明のメシル酸イマチニフ ¾性 P h陽性ヒト急性リンパ性白血 田 胞株は、 AB L蛋白質 ATP結 頁域にぉレ TThr315Ileの点突然変異を有し、且つ B C R/AB L融^ ¾ の増幅や転 舌性の増加を示さなレ劇胞株である。 本発明におい て、 メシル酸ィマチニプ而 '生の安定性とは、 当該薬剤を含まなレ培地中で長期間培養し ても、上記 ABL蛋白質 ΑΤΡ結 頁域の T¾r315Ile点 «変異が復帰せず、メシル酸ィ マチニブへの耐性が損なわ ょレことをいう。
本発明のメシル酸ィマチニブ耐性 P h陽性ヒト急、†生リンパ性白 病細胞株は、 当該薬 剤の耐性漏の職に用いることが きるほか、 種々の用¾^¾¾1"るが、 例えば、 次 に述べるヒト白細治療薬のスクリーニング方法に用いることによって、 医薬品開発に おける極めて高レ有用性が示される。
(メシル酸ィマチニブ耐性ヒト白 ώ滴治療薬のスクリ一二ング方法）
本発明のメシル酸イマチニプ 1H生ヒト白 «治療薬のスクリーニング方法は、 （a)候 補化合物を用意し、 （b)嫌己 ί鎌化合物の被下で本発明に係るメシル酸イマチニブ 性 P h陽性ヒト急性リンパ急性白血病細胞を培養し、 （c )編己 ί鎌化合物が嫌細胞の 増殖を阻 るか否かを判定することを含む。 Ιίίϊ己 P h陽性ヒト急性リンパ性白 Jfo ^細 胞は、 本発明に係るメシル酸イマチニプ 性 P h陽 (生ヒト急性リンパ急性白雌細胞株 に由来する細胞であれば、 どのような細胞でも使用し得るが、 好ましくは、 スクリー二 ンク ¾験の再現性や細胞培養の操作性を考 ると試 , 内で増殖が容易な株化細胞を 用いる。 白血病細胞がメシル酸イマチニブ耐性を獲得する賴 1 1=、 その耐性の度合いは 個々の白血病患者によって異なり、 例えば、 B C RZAB L融合遺伝子の突然変異 (Thr315Ile)や当該変異遺伝子の細胞内でのコピー数の違い、 あるいは当該変異遺伝子の 染色体中での安定性などによって異なると考えられる。 従って、 上記スクリーニングに 用いる細胞株は、 株化段階における人為的産物をできるだけ取り除き、 ヒト白血病患者 に由来する細胞に類似しており、 且つメシル酸イマチニブに対する耐性が安定して発現 されることが好ましい。 本発明のこのような 1つの実施形態として、 TC C-Y/w r 又は TC C一 Y/ s r (w r：低 MS耐性、 s r：髙離耐性） 力 if共される。
嫌己鍾化合物としては、 蛋白質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物、 核酸、 アンチセンス、 リポザィム、 s i RNA、 アブ夕マー、 抗体などが挙 げられるが、 これらに制限さ よい。 これら化合物 «¾f規な化合物であってもよいし、 の化合物であってもよい。
嫌 si醒匕合物が編己細胞株の増殖を阻 # る力、否かの判定は、 例えば、 一定時間培 難に生存細胞数を測 ることにより行うことができる。 ヒトを始めとする動物細胞 の培養方法は当業者にとって 载的 ί¾！である。 生; 細胞数の測定は種々の方法がある が、 例えば、 トリパン力!/"等の染色液の排出能を禾リ用する。 あるいは、 細胞内の蛋白 質 ミトコンドリアにおける ¾酵素の活性測定などにより ¾ することも可能であ る。
好ましい実施形態において、 揚己«化合物は、 ヒト熱ショック蛋白質を不安定化す る化合物である。 熱ショック蛋白質は細胞や個体が通常の生育温度よりも 5〜1 0 高 レ環境にお力ゝれると急激に合成が誘導される一群の蛋白質のことをいう。 ¾のみなら ず,特定の化^ 1質などによっても誘導を受けるためストレス蛋白質とも呼ばれている。 ヒ卜では HS P 9 0 約 9万)、 HS P 7 0及び HS P 6 0等の低 ^¾の蛋白質 が代表的である。 例えば、 HS P 9 0は、 B CRZAB L融合蛋白質を初めとする細胞 増殖 .分化 .発生に関与する多くの蛋白質の安定性と機能に影響を与える シャベロ ンであることカ ロられている (Weisbe^^eta^ Blood^OOO^S^A S-SSOS 従って、 ヒト 熱ショック蛋白質、 例えば HS P 9 0を阻 ¾ ^るような化合物を として本発明の方 法によりメシル酸ィマチニフ ¾性ヒト白血病細胞の治療薬をスクリ一二ングすることが 極めて鵷である。
例えば、ゲルダマイシン (geldamycin)は、 HS P 9 0蛋白質のァミノ 耑部にある GA 結^ 立に結合することにより、 HS P 9 0蛋白に結合すべき ρ 2 1 0 B c R / A B L 融合や R a ί 1及び細胞内のチロシンリン酸化蛋白質を不安定化させることが知られて いる。 その他、 大環状の擴纖抗生物質である Radicicolやゲルダマイシンの誘導体 17-allylaminogeldamycin(17- AAG)も同様な作用を有する HS P 9 0阻 ^ίίである。
あるいは、 l¾r315Eeの変異を有する AB L蛋白質のキナーゼドメインの立体 標 と、 三^^ 6デルアルゴリズムとを用いて、 インシリコスクリーニング方法により 化合物ライブラリ—より選択された化合物を垂化合物とすることができる。 このイン シリコスクリーエング方法は、 標的蛋白質と ί鎌化合物の給を ^^動力学計算などの ドッキングスタディにより計算し、 Thr315He変異体 AB L蛋白質の ΑΤΡ結合ポケット に結合する可能性の高いリ一ド化合物を提示するものであるが、 その精度は未だ 実と はいえない。従って、 このような方法によって大量の化合物ライブラリーから 1 ク リ一ニングされた比較的少数の «化合物を、 本発明の細胞株を用 て実際にメシル酸 ィマチニフ ¾H生ヒト白血病細胞の増殖を阻 る力 ^否かを検 κετることは極めて重要で ある。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物 （以下、 「本発明に係る化合物」 という。）は、メシル酸イマチニブに耐性となったヒト白血病細胞の増殖を阻 る化合 物であり、 ヒ卜白血病の治 βとして用いることができる。 時には、 メシル酸ィマチ二 ブと併用して用いることで相加的、 或いは相乗的治 果を得ることが出来る。 この化 合物をメシル酸イマチニフ ¾f性ヒ卜白細治療薬として用いる場合には、 H¾に謹的 に許容される担体と混合することによって、 医薬糸滅物を調製することができる。 医薬 誠物用担体としては、 特に制限はなぐ 例えば， 乳糖、 ブドウ糖、 D—マンノース、 澱粉、 結晶セルロース、 炭酸カルシウム、 カオリン、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルァ ルコール、 ポリビエルピロリドン、 エタノール、 力ルポキシメチリ!/セルロース、 カルボ キシメチルセルロースナトリウム塩、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク、 ァセチルセ ルロース、 白糖， 酸化チタン、 安息香酸、 パラォキシ安息香酸ェアステル、 デヒドロ酢 酸ナトリウム、 アラビアゴム、 トラガント、 メチルセルロース, 卵黄、 界面活性剤、 単 シロップ、 クェン酸、 蒸留水、 グリセリン、 プロピレングリコール、 マクロゴール、 リ ン酸一水素ナトリウム、 リン酸 素ナトリウム、 リン酸ナトリウム、 塩化ナトリウム 等があり、 目的とする觀 ϋ、 例えば、 ¾M薬や猫嘮の形態に応じて、 本発明に係る化 合物と昆合して使用される。 上記医薬糸滅物は、 ヒト白血病治療に棚量の本発明に係る化合物を含 る。 より 具体的には、 「ヒト白血病治療に機量の」とは、メシル酸イマチニブに耐性となった白 鐘細胞の増殖を抑制し、 白 «の種々の症状を織口、 改善することが きる薬剤量で ある。 このような欄量の決定は、 当業者において十分に可能であり、 種々の試 ^^法 が ϋ5Ϊされている。 従って、 本発明に係る化合物を含 る医薬糸滅物を投与すること により、 白血病、 特にメシル酸イマチニブに耐性となった白血病の治療方法が提供され る。 上記阻翻の好ましい投与方法は、 経口、 経直腸、 鍵占膜、 徹、 筋肉内の、 経静 脈、 ¾内投与等でありうる。 あるいは、 リボソームや抗体等と結合させることにより 特定の細胞に標的化して投与することもできる。
醜例]
本発明 下の鍾例において、 より具体的に説明される。 実施例は、 PhP劚 急性 リンパ性白血病患者の骨髄細胞から樹立された TCC一 Y細胞株 (栃木ガンセンタ一に て樹立、 Yasuhiko Kano et al., BLOOD, 2001, 97, 1999-2007 ) を用いて、 本発明者らが メシル酸ィマチニプ ϊί性能を衝尋した細胞株を樹立し、 得られた細胞株の種々の性質を 調べたものである。 難例 1) メシル酸イマチニフ 删胞株の樹立
メシル酸イマチニブはジメチルスルフォキシド (DMS Ο)に溶解した 1 OmM溶液を 保 夜とし、 これを種々の iUtfcなるように培 ¾ί夜に添加して用いた。 培截夜中の DM SO終 は 0. 1%以下であり、 細胞増殖に対する阻害作用はないことを確認した。 TCC- Y細胞株は、 10 %牛胎 Εώΐ清 （F B S、 I C Ν¾) と、 100 U/m 1のべ ニシリン、 0. lmg/mlのストレプトマイシン （ICN社 を含む RPMI 16 40培地 （シグマ ¾ )中で、 5%C02 ¾下、 37°Cで培養した。 この培難件に おいて、 TCC— Y細胞の 2倍増殖時間 (doublingtime)は 31±1. 5時間であった。 T CC— Y細胞では、 P210BCR/ABL融合 mRNAと、 P 190BCR/ABL 融合 mRNAの両方の発現力 雀認されている。
TCC— Y細) ^株を、 メシル酸イマチニブの δ下、 当該薬剤の ¾t を徐々に増加さ せて（100 nM〜200 nM)、数ケ月以上にわたり培養を続けた。 TCC— Y細胞の 増殖を 50%阻 ¾ "るメシル酸イマチニブ難 （I C5 0 ) は 1. 37±0. 6 Mで あった。 数ケ月後、 1〜 5 xMのメシル酸ィマチニブ S下におレて 90 %以上の生存 能力を示 田胞株 T C C-Y/w r (I C5 o =5. 1±0. 9 iM) が 得できた。 この T C C一 YZw r細胞を 3 zMのメシル酸イマチニブ中で培養したときの倍加時間 は 33 ±4. 5時間であった。更に、 この T CC- Y/w r細胞株をメシル酸ィマチ二 ブ を徐々に増加して培養を続けたところ、 更に高? ISのメシル酸イマチニブ被下 においても生 能な一つのサブクローン TCC一 Y/s r (IC5。 =22. 1±0. 9 M) が得られた。 この TCC— Y/s r細胞の 20 xMのメシル酸イマチニブ中で 培養したときの倍加時間 (doublingtime)は 34±4時間であった。 TCC-Y/s r細胞 は 20 /Mのメシル酸イマチニブ 下において、 90-98 %の生細胞率で 4ヶ月以 上も増殖を続けた。 この TCC一 YZs r細胞は、 行政法人 総合石^、 特許生 託センター （〒305— 8566茨¾¾つくば市東 1— 1— 1中^ 6) に 受託番号 FERM P-19148 (原寄託曰は平成 14年 12月 10曰） として寄託 され 平成 15年 10月 27日に国麟託^^管された （国裔託についての受託番号 FERM BP - 08531)。.
(実施例 2) BC R/AB LS虫^！ 産物の AT P結合ドメインの塩細列の決定 これまでメシル酸ィマチニブ耐 '1 患者の B C R/AB L鬲虫 産物の AT P結合 領域に くの突然変異力食出されていることから、 TCC一 Y, TCC-Y/wr, 及び T CC-Y/s r細胞における B C R/AB L融^! ¾^産物の AT P結 頁域部 分のうち AT P結合ドメインから活性化ループにわたる 989塩基対の配列を決定した。 ァレノレ持異的ポリメラ一ゼ、連鎖及応 （以下「AS— PCR」 という） により、 BCR/ ABL融合アレル （ iZ¾ ) の ATP結合ドメインを特異的に増幅して:^ SIH列を 決定した。
すなわち、 TCC—Y, TCC-Y/wr,及び TCC一 Y/s r細胞から、 Sephazol I (ナカライテスクネ働 を用いて全 RNAを抽出した。 l 2gの全RNAを、 6塩基の ランダムプライマ一と Super Script Π-Reverse Transcriptase (GI BCO BR L^ ) を 用 て標準的なプロ卜コルにより、 R T— P C Rを行つた。 B C R/A B L融合ァレル の ABLキナーゼドメインを増幅するために、 正方向のプライマ一 BCR-F2: 5' CAGTGCCATAAGCGGCACC 3' (配列番号 3 ) と、 逆方向プライマ一 AIP-R2: 5' CAGGCACGTCAGTGGTGTCTCTGTG 3' (配列番号 4 )を用レて長距離 P C Rを行つた。 PCRサイクル条件は、 94°Cで 1分間処理した後、 94 、 45秒間の熱変性、 68°C 3分間のアニーリング、 及び 72°C10分間の伸長反応を 30サイクル繰り返した。 A BL遺^のコード領域の 657〜1621番目の を増幅するために、 以下の 2つのプライマ一セットを用いた。
1) AIP-F1: 5' GCGCAACAAGCCCACTGTCTATGG 3' (配歹 U番号 5)
ATP-R1: 5' CCAGGCTCTCGGGTGCAGTCC 3' (酉己列番号 6 )
2) AIP-F2: 5' GGACTGCACCCGAGAGCCTGG 3' (S3列番号 7)
ATP-R2: 5' CAGGCACGTCAGTGGTGTCTCTGTG 3' (E列番号 4 )
PCRの条件は、 Gorre, ME etal., Science 2001; 293:876-880に記載された方法に従って 行った。 増幅した DNA断片は、 QI AQU i ckゲル抽出キット （キアゲンネ: 1^) を 用いて精製し、 自動シ一ケンサ (AB I PR I SM310、 PEアプライドバイオシ ステムネ ±) により両方の鎖の塩翻列を決定した。
その結果、 TCC-Y/s r細胞においては、 944番目の塩基であるシトシン（C) がチミン （T) に一塩基置換することにより、 315番目の卜レオニン （T h r ) がィ ソロイシン（ I 1 e )に置き換わっていることが、判った（図 1参照)。 T C C一 YZw r 細胞には塩基の変異は検出されなかった。
(実施例 3) 蛍光 in situハイブリダィゼーシヨン （F I SH) による BCRZABL融 コピー数の難
LS I be 1/ab 1ェクストラシグナル （E S) 二重染色転座プロ一ブ (Vysis ¾) を用いて、 例 1で得られた 2種類のメシル酸イマチニブ 細胞櫞田胞 (TC C一 Y/wr細胞と TCC一 Y/s r細胞） と TCC— Y細胞から得られた分裂中期 (metaphase)細胞の蛍光 in situハイブリダィゼーシヨン （FI SH) を行った。 当該プロ ーブを ^^者のプロトコルに従って metaphase細胞にハイブリダイズさせた。 得られ た metaphase細 ぴ词期細胞画像をマックタイプ ver.5.5.3ソフトウェアで解析した。 その結果、 TCC一 Y'TCC— Y/w r，及び T CC-Y/s r細胞から得た metaphase 細胞及ぴ閒期細胞にぉレて、 B C R/AB L融^ t シグナリ は常に 1個/細胞で あり、 そのシグナルの大きさには差がなく、 BCRZABL融^ tfg^のコピー数はこ れら 3種類の細胞株で変化しないことが分かった。従って、 メシル酸イマチニブに対す る而ォ性は B C RZAB L融^ Ιβ^の増幅や B C RZAB L融合蛋白質の発現量が増加 したためではないことが判った。 (実施例 4) 定量的 PCR法による mRNA量の検出
T C C-Y/w r及び T CC-Y/s r細胞株において B C RZABL融^!伝子の 増幅が認めら lよかったことから、 次に、 当該遺 の mRNA量を定量的 PC Rによ つて調べた。 7700塩 ssa胺出システム （アプライドバイォシステムズネ； fc) を用い て、 T a qm a n法 （アプライドバイォシステムズネ ±) により B C RZAB L融^!伝 子 mRNA量の測定を行った。 BCR/ABL融合遺伝子 mRNA検出のための主要 なプライマー及びプローブは、 それぞれ以下のとおりである。
BCR-F: 5' GATGCTGACCAACTCGTGTGTG 3' (配列番号 8 )
ABL-R: 5' TGGCCACAAAATCATACAGTGC 3' (配列番号 9 )
ABL-P: 5' CCrrCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTnT 3' (配歹噃号 10)
一方、 対照とした GAP遺伝子 mRNA量測定 ώためのプライマ一及び険出用プロ一 ブは、 それぞ ^¾下のとおりである。
GAP-F: 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3' (配列番号 11)
GAP-R: 5' GAAGATGGTGATGGGAnTC 3' (12列番号 12)
GAP-P: 5' CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 3' (配列番号 13)
その糸吉果、 TCC-Y, TCC-Y/wr, 及び TCC— Y/s r細)]包における BC RZABL融^ t15¾iRNA量と GAP遺 f¾¾iRNA量の比は、 それぞれ 0. 13 30、 0. 1603、 及び 0. 0870であった。
Figure imgf000013_0001
量は、 親株である T CC- Y細月包に対して、 TCC- YZw r細胞で【培干増加してレ たが、 T CC-Y/s r細胞で〖纖に少し減少していた。
(実施例 5) ウエスタンプロット法による蛋白質量の検査
実施例 1で得られた 2種類のメシル酸イマチニブ谢性細胞櫞田胞 (T C C-Y/w r 繊と TCC一 YZs r細胞）と T C C一 Y細胞をそれぞれ 2 OmMトリス膽 ρΗ7· 4、 15 OmM NaC 1、 10%グリセリン、 1 %Nonidet Ρ· 0、 ImM PMSF ( henylmelhylsulphonyl fluoride), 20 U/m 1ァプロチニン、 1 OmM EDTA、 10 11 g/m 1ロイぺプチン、 10 OmM NaF、 2mM Na3 V04、及び 0. 05%
SDSを含む溶解バッファ一中で溶角? f菱、 SDS— PAGEを行い、 細胞内の BCR/ AB L融合蛋白質及びァクチン蛋白質をそれぞれモノクローナル抗体 A b-3 (オンコ ジェン社 又はゥサギ抗ァクチン坊 清を用いて検出し、 ヮサピペルォキシダーゼ結 合抗マウス又は抗ゥサギ I g Gを 2次抗体として用いて可視化した。 その結果、 TCC —Y細胞と比較して、 TCC-Y/wr, 及び TCC— YZs r細胞中の BCRZAB LB虫合蛋白質の発現量は同等であった。 (鎌例 6) MDR1遺 β?の発現
Ρ—糖蛋白質 (PGP) をコードする MDR1遺 の発現がガン細胞における薬剤 耐性樹冓の一つとして知られている。 この P G Ρは細胞膜を介して薬剤を細^^に排出 するトランスポー夕一蛋白質である。 そこで、 フローサイトメトリーにより、 メシル酸 イマチニブ感受性及び ¾Ηも細胞の細胞膜に PGPが発現しているかどうカゝ測定した。 それぞれの細胞株における MD R 1遺5?の発現を検出するために F I T C結合マウ ス抗ヒト G P Gモノク口一ナル抗体を用いた。 それぞれの細胞を P B Sで 3回洗浄した ίあ 2 X 106個の細胞を 1 %の牛胎 &&L清 (FBS) を含む P B S 50 1に i蜀し た。 この細胞を 50 1の抗 MD R 1で染色後、 喑所で 4°C、 30分間ィンキュベート した。 1%FBSを含む P B S 1 m 1で細胞を 2回洗浄した後、 1 m 1の P B Sに翻 濁した。 このようにして染色した細胞を FACSスキャンにより Ce 1 1 Reque s tソフトウェアを用いて科斤した。
その結果、 メシル酸イマチニブ感受性の TCC—Y細胞に比べて、 耐生ネ朱である TC C- Y/wr、及び TCC—Y/ s rの何れの細胞にも、その;^ *に大きな違いは無か つた。
7 ) Radicicolによる細胞増殖阻害
Radicicolはシグマ一アルドリツチ社から購入した。これをジメチルスルフォキシド (D MS 0)に溶解し、 1 OmM®夜として保存した。 TCC— Y、 TCC-Y/wr,及び TCC-Y/s r細胞を、それぞ^ 1®々の^ の Radicicolと共に 1. 5〜2xl 05細 胞 Zm 1の? で 3 m 1プレートで培養した。 細胞数と生細胞率は、 トリパンプリ "染 色液の排出能により、 cicolの鋤卩後 24時間毎に測定した。 培養開媪ぁ 24, 4 8及び 72時間後の TCC一 Y、 TCC-Y/wr, 及び TCC— Y/s r細胞株の細 胞数と生細胞率を図 2 (a)〜（c)にそれぞ した。図 2に示された結果より、 Radicicol による糸田月包増殖阻 (果は、 上記 3種類の細胞株において有意差はないことが、判った。 これらの結果をまとめると以下の表 1のようになる。
Figure imgf000015_0001
表 1に表示した Sは 3回の実験の結 等られた I C 50の平均値と標 差を表す。 この結果より、全ての糸田月 ま Radicicolに対して感受性であり、 メシル酸ィマチニブ感受 f 細胞株と菌も細胞株とで差は認められなかつた。
(実施例 8) メシル酸イマチニフ ¾f性株の安定性
実施例 1で得られた TCC一 Y/s r細胞株の安定性を調べるために、 メシル酸イマ チニブを含まず、 10 %牛胎 »清（F B S、 I CN¾)、 100 U/m 1のべニシリン および 0. lmgZmlのストレプトマイシン （ICN¾) を含む RPMI 1640培 地 （シグマネ: fc) で 3ヶ月以上継ィ 議し、 26継代目、 60継代目及び 90継代目で一 部の細胞をサンプリングした。 この細胞から、 難例 4と同様の方法により B C R/A B L融合アレルの AT P結合ドメインを特異的に増幅して塩翻己列を決定した。 その結 果、 ABLの 315番目のアミノ酸に ¾^るコドンは ATT (イソロイシン） のまま であり、 TCC—Y/s r細胞株において検出された一塩基置艘異が保存されている ことが判った。 また、 これらの細胞を用いて、 メシル酸イマチニブに対する耐性 sを 測定したところ、 Tcc—Y/s r細胞の保存株との間で差は認めら ¾かった。 難上の利用可能性
本発明のメシル酸イマチニブ耐性 P h陽性ヒ卜急性リンパ性白血病細胞株は、 高 のメシル酸ィマチニブ雜下においても安定して增歹 itTることが きる。 したがって、 これらの細胞株は、 メシル酸ィマチニブの耐性機構の解明ゃメシル酸ィマチニブ W性ヒ ト白血病治療薬のスクリ一ニングを行うために極めて有用である。

Claims

1. 少なくとも 5 Mの濃度においてメシル酸ィマチニブに耐性であることを特 徵とするフィラデルフィァ染色体 (Ph) 陽性ヒト急性リンパ性白血病細胞株。 ヨ一ロ
2. 20 のメシル酸イマチニブの存在下で増殖可能である請求項 1に記載の 細胞株。
3.前記染色体が BCR/ABL融合遺伝子を含むこと、及び当該遺伝子産物が、 その AT Ρ結合部位の点突然変異であって配列番囲号 2のアミノ酸配列において 3 15番目のトレオニンがィソロイシンに置換された点突然変異を有することを特 徴とする請求項 1又は 2に記載の細胞株。
4. 前記白血病細胞内の BCR/ABL融合遺伝子が、 実質的に 1コピーノ細胞 含まれることを特徴とする請求項 JJこ記載の細胞株。
5. 前記白血病細胞内に存在する BCR/ABL融合 mRNAのほぼ 100 %が 前記点突然変異を有することを特徴とする請求項 3又は 4に記載の細胞株。
6. 細胞株 TCC一 YZs r (FERM B P— 08531 ) である請求項 1に 記載の細胞株。
7. 細胞株 T C C-Y/w rである請求項 1に記載の細胞株。
8. 候補化合物を用意し、
前記候補化合物の存在下で請求項 1〜 7何れか一項に記載の細胞株を培養し、 前記候補化合物が前記細胞の増殖を阻害するか否かを判定することを含む、 メ シル酸イマチニブ耐性ヒ卜白血病治療薬のスクリーニング方法。
9 . 前記候補化合物が、 熱ショック蛋白質を阻害する化合物である請求項 8に 記載の方法。
1 0 . 白血病患者にメシル酸イマチニプ耐性白血病細胞の増殖阻害剤を投与する ことによるヒト白血病の治療方法であって、 前記阻害剤が、
( a) 候補化合物を用意し、
( b ) 前記候補化合物の存在下で請求項 1〜 7何れか一項に記載の細胞株を培養 し、 そして
( c ) 前記候補化合物が前記細胞の増殖を阻害するか否かを判定する
ことを含む方法によりスクリーニングされることを特徴とする治療方法。
1 1 . ヒ卜白血病の治療薬を製造するためのメシル酸イマチニブ耐性白血病細胞 の増殖阻害剤の使用であって、 前記阻害剤が、
( a ) 候補化合物を用意し、
( b ) 前記候補化合物の存在下で請求項 1〜 7何れか一項に記載の細胞株を培養 し、 そして
( c ) 前記候補化合物が前記細胞の増殖を阻害するか否かを判定する
ことを含む方法によりスクリーニングされることを特徴とする使用。
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