WO2004111235A1

WO2004111235A1 - 蛍光蛋白質及び色素蛋白質

Info

Publication number: WO2004111235A1
Application number: PCT/JP2004/008786
Authority: WO
Inventors: Atsushi Miyawaki; Hidekazu Tsutsui; Satoshi Karasawa
Original assignee: Riken; Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2004-12-23
Also published as: JPWO2004111235A1; ATE443135T1; US20110223636A1; AU2004248054A1; EP2098535A1; EP1642969A4; US8207322B2; JP4852676B2; EP2098535B1; EP1642969B1; EP1642969A1; US7956172B2; US20090170073A1; ATE527280T1; DE602004023199D1

Abstract

　本発明の目的は、新規な蛍光蛋白質及び色素蛋白質を提供することである。本発明によれば、コモンサンゴ（Montipora　sp.）、ミドリイシ（Acropora　sp.）及びウミキノコ（Lobophytum　crassum）由来の新規な蛍光蛋白質、並びにウメボシイソギンチャク（Actinia　equina）由来の新規な色素蛋白質が提供される。

Description

明細書

蛍光蛋白質及び色素蛋白質技術分野

本発明は、新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、コモンサンゴ (Montipora sp. )、ミドリイシ (Acropora sp. ) 及ぴゥミキノコ (JLobopnytwn crassum) 由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。

さらに本発明は、新規な色素蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、ウメポシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来の新規な色素蛋白質及ぴその利用に関する。背景技術

クラゲのェクオレア ·ビクトリア（Aequorea victoria) に由来する緑色蛍光蛋白質（GF P) は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法およぴ半合理的（semi- rat ional)突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいは pH感受性を改変したといった様々な G-FP変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質を GFP等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。

最もよく使用される GFP変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（YFP) が挙げられる。 YFPは、クラゲ（Aequorea) G F P変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分の YF Pの εおよび Φは、それぞれ

fe ぴ 0·6〜0·8であり（Tsien, R. Y. (1998). Ann. Rev. Biochem. 67, 509—544)、これらの値は、一般的な蛍光団（フルォレセインおょぴローダミン.など）の値に匹敵する。従って YFPの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。

また、 GFP変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質（CF P) があり、 E C F P (enhanced cyan fluorescent protein)が知られている。また、イソギンチヤク（Mscoma sp. )からは赤色蛍光蛋白質（R F P ) も単離されており、 DasRed が知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の 4種が次々と開発されスぺクトルの範囲は大幅に広がっている。

また、刺胞動物には、蛍光を発するものが存在する。刺胞動物由来の蛍光蛋白質遺伝子のクローニングが試みられているが、蛍光および生化学的な特性のレパ一トリ一を増やすためには、より多くの遺伝子のクローニングが必要である。一方、従来の蛍光蛋白質の量子収率を 0に近づけたものが色素蛋白質である。色素蛋白質は、光エネルギーを他のエネルギーに変換する分子を細胞内に導入することができる点で様々な応用が可能である。し力しながら、色素蛋白質の吸収波長特性について報告されている例は少なレ、。発明の開示、

本発明は、コモンサンゴ（Montipora sp. )、ミドリイシ（Acropora sp. )、及ぴ及ぴゥミキノコ ilobophy turn eras sum) に由来する、新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。

さらに本発明は、従来の R F P (DsRed、クロンテック社）の示す幅広い励起スぺクトルに比べ、よりシャープなスペクトルを有する蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。

さらに本発明は、ウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) に由来する、ある特定の波長の光を吸収する新規な色素蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。

上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づいて好適なプライマーを設計し、コモンサンゴ（Montipora sp. )、ミドリイシ (Acropora sp. ) 及ぴゥミキノコ Lobophytum crassum) 由来の c D N Aライブラリ一から上記プライマーを用いて新規な蛍光蛋白質をコードする遺伝子を増幅してクローユングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたコモンサンゴ (Montipora sp. )、ミドリイシ (Acropora sp. )、及ぴゥミキノコ ilobophytim crassuni) 由来の蛍光蛋白質の蛍光特性及ぴ P H感受性を解析した。また本発明者らは、既知の蛍光蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づいて好適なプライマーを設計し、赤色を呈するウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) の c DNAライブラリーから上記プライマーを用いて新規な色素蛋白質をコードする遺伝子を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来の色素蛋白質の光吸収特性及ぴ pH感受性を解析した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、以下の（1) 〜（3 5) に記載の発明が提供される。 (1) コモンサンゴ（Montipora sp.)由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

( 1 ) 励起極大波長が 50 7 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 5 1 7 nmである；

(3) 507 nmにおけるモル吸光係数が 1 040 50である；

(4) 量子収率が 0. 29である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a =約 5 · 5である：

(2) ミドリイシ（Acropora sp. ) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1) 励起極大波長が 505 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 5 1 6 nmである；

(3) 505 nmにおけるモル吸光係数が 5 3 6 00である；

(4) 量子収率が 0. 6 7である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が pKa =約 6. 4である：

(3) ミドリイシ（Acropora sp. ) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1) 励起極大波長が 472 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 49 6 nmである；

(3) 472 nmにおけるモル吸光係数が 2 7 2 5 0である；

(4) 量子収率が 0. 90である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a =約 6. 6である： (4) コモンサンゴ (Montipora sp. )由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

( 1 ) 励起極大波長が 5 5 7 n mである；

( 2 ) 蛍光極大波長が 5 74 n mである；

(3) 5 5 7 nmにおけるモル吸光係数が 4 1 750である；

(4) 量子収率が 0. 4 1である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a <約 4. 0である：

(5) ウメポシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来の下記の特性を有する色素蛋白質。

( 1 ) 吸収極大波長が 5 9 2 nmである；

(2) 5 9 2 nmにおけるモル吸光係数が 8 7000である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 10で安定である：

(6) ゥミキノコ Lobophytum crassi i) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

( 1 ) 励起極大波長が 48 2 n mである；

(2) 蛍光極大波長が 49 8 nmである；

(3) 48 2 nmにおけるモル吸光係数が 7 1 000である；

(4) 量子収率が 0. 4 1である；

( 5 ) 蛍光極大の p H感受性が p H = 4〜 1 0で安定である：

(7) 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

(8) 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

(9) 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。 ( a ) 配列番号 5又は 7に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 5又は 7に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び /又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

(10) 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

(1 1) 以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。

( a ) 配列番号 11に記載のァミノ酸配列；又は、

( ）配列番号11に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するァミノ酸配列を有し、吸光特性を有するァミノ酸配列：

(12) 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 13に記載のァミノ酸配列；又は、

(1))配列番号13に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するァミノ酸配列を有し、蛍光を有するァミノ酸配列：

(13) 請求項 1から 12の何れかに記載の蛋白質をコードする DNA。

(14) 以下の何れかの D N A。

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN

A：

(15) 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び Z又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列： (16) 以下の何れかの DNA。

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

( b ) 配列番号 3に記载のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び /又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN

A：

(17) 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 4に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 4に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び /又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：

(18) 以下の何れかの DNA。

(a) 配列番号 5又は 7に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b) 配列番号 5又は 7に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DNA：

(19) 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 6又は 8に記載の塩基配列；又は、

( b ) 配列番号 6又は 8に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列： (20) 以下の何れかの DNA。

( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

(b) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するァミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN A：

(21) 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 10に記載の塩基配列；又は、

( b ) 配列番号 10に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列： (22) 以下の何れかの DNA。

( a ) 配列番号 11に記載のァミノ酸配列をコードする D N A；又は、

( b )配列番号 11に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする DNA：

(23) 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

(a) 配列番号 12に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 12に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付カ卩を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

(24) 以下の何れかの DNA。

(a) 配列番号 13に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(1?)配列番号13に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN

A：

(25) 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

(a) 配列番号 14に記載の塩基配列；又は、 .

(b) 配列番号 14に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：

(26) (13) から（25) の何れかに記載の DNAを有する組み換えべクタ一。

(27) (13) から（25) の何れかに記載の DN A又は（26) に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。

(28) (1) から（4)、（6)、 (7) から（10) 又は（12) の何れかに記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。

(29) 他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、（28) に記載の融合蛍光蛋白質。 (30) 他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、（28)又は（2 9) に記載の融合蛍光蛋白質。

(31) (5) 又は（1 1) に記載の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質。

(32) (28) から（30) の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。

(33) (5) 又は（1 1) に記載の色素蛋白質をァクセプター蛋白質として用いて FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。

(34) (1) から（4)、（6)、 (7) から（10) 又は（12) の何れかに記載の蛍光蛋白質、（14) から（21)、（24) 又は（25) の何れかに記載の DNA、 (26) に記載の組み換えベクター、（27) に記載の形質転換体、又は（28) から（30) の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キッ

(35) (5) 又は（1 1) に記載の色素蛋白質、（22) 又は（23) に記載の DNA、（26) に記載の組み換えベクター、（27) に記載の形質転換体、又は（31) に記載の融合蛋白質を含む、吸光試薬キット。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のコモンサンゴ（Montipora sp. ) 由来の蛍光蛋白質（COG) の蛍光スぺクトル及ぴ励起スぺクトル（図 A)、蛍光蛋白質（COG) の吸収スぺクトル（図 B)、及び蛍光蛋白質（C0G) の _PH感受性（図 C) を示す。図 Cにおいて横軸は pH値を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 2は、本発明のコモンサンゴ（Montipora sp. ) 由来の蛍光蛋白質（C0G) の pH5での蛍光スぺクトル及び励起スぺクトル（図 A) 及び pH5での吸収スぺクトル（図 B) を示す。図 3は、本発明のミドリイシ（Acropora sp. ) 由来の蛍光蛋白質（MIG) の蛍光スぺクトル及ぴ励起スぺクトル（図 A)、蛍光蛋白質（MIG) の吸収スぺクトル（図 B)、及び蛍光蛋白質（MIG) の pH感受性（図 C) を示す。図 Cにおいて、横軸は pH値を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 4は、本発明のミドリイシ（Acropora sp. ) 由来の蛍光蛋白質（MICy) の蛍光スぺクトル及ぴ励起スぺクトル（図 A)、蛍光蛋白質（MICy) の吸収スぺクトル

(図 B)、及ぴ蛍光蛋白質（MICy) の _PH感受性（図 C) を示す。図 Cにおいて、横軸は pH値を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 5は、本発明の蛍光蛋白質（MiCy2) の pH感受性（図 A) 及び励起 ·蛍光スぺクトル CUB) を示す。

図 6は、本発明のコモンサンゴ (Montipora sp.) 由来の蛍光蛋白質（C0R) の蛍光スぺクトル及び励起スぺクトル（図 A)、蛍光蛋白質（C0R) の吸収スぺクトル（図 B)、及ぴ蛍光蛋白質（C0R) の pH感受性（図 C)を示す。図 Cにおいて、横軸は pH値を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 7は、本発明のウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来の色素蛋白質（Ume) の吸収スぺクトル（ρΗ7· 9) を測定した結果（図 Α)、及び色素蛋白質（Ume) の吸収極大の pH感受性（図 Β) を示す。図 Αにおいて、横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示す。図 Bにおいて、横軸は _PH値を示し、縦軸は吸光度を示す。

図 8は、本発明のゥミキノコ i obophytum crassuni) 由来の蛍光蛋白質（KnG) の蛍光スぺクトル及び励起スぺクトル（図 A) 及ぴ蛍光蛋白質（KnG) の _PH依存性（図 B)を示す。 ' 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

(1) 本発明の蛍光蛋白質及ぴ色素蛋白質

本発明の第一の蛍光蛋白質は、コモンサンゴ（Montipora sp. ) 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

(1) 励起極大波長が 5 0 7 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 5 1 7 nmである；

(3) 5 0 7 nmにおけるモル吸光係数が 1 04 0 5 0である；

(4) 量子収率が 0. 2 9である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a =約 5. 5である：

コモンサンゴ（Montipora sp. ) は、刺胞動物門花虫綱六放サンゴ亜綱イシサンゴ目ミドリイシ科に属するサンゴの 1種であり、塊状や被覆状の群体を形成することが多い。 .

本発明の第一の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が 5 0 7 nmであり、蛍光極大波長が 5 1 7 nmである。また、 5 0 7 nmにおけるモル吸光係数は 1 04 0 5 0であり、量子収率は 0. 2 9である。モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。

本発明の第一の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の第二の蛍光蛋白質は、ミドリイシ（Acropora sp. )由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

( 1 ) 励起極大波長が 5 0 5 n mである；

( 2 ) 蛍光極大波長が 5 1 6 n mである；

(3) 5 0 5 nmにおけるモル吸光係数が 5 3 6 0 0である；

(4) 量子収率が 0. 6 7である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a =約 6. 4である：ミドリイシ（Acropora sp. ) は、刺胞動物門花虫綱六放サンゴ亜綱イシサンゴ目ミドリイシ科に属するサンゴの 1種であり、枝状 ·テーブル状の群体を形成することが多い。

本発明の第二の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が 50 5nmであり、蛍光極大波長が 516 nmである。また、 505 nmにおけるモル吸光係数は 53600であり、量子収率は 0. 67である。モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。

本発明の第二の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 3に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の第三の蛍光蛋白質は、ミドリイシ（Acropora sp. )由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

(1) 励起極大波長が 472 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 496 nmである；

(3) 472 nmにおけるモル吸光係数が 27250である；

(4) 量子収率が 0. 90である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が pKa=約 6. 6である：

本発明の第三の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が 47 2nmであり、蛍光極大波長が 496 nmである。また、 472 nmにおけるモル吸光係数は 27250であり、量子収率は 0. 90である。モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。

本発明の第三の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 5又は 7に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 5又は 7に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の第四の蛍光蛋白質は、コモンサンゴ (Hontipora sp. 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

(1) 励起極大波長が 557 nmである；

( 2 ) 蛍光極大波長が 574 n mである；

(3) 557 nmにおけるモル吸光係数が 41750である；

(4) 量子収率が 0. 41である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が pKa<約 4. 0である：

本発明の第四の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が 55 7 nmであり、蛍光極大波長が 574 nmである。また、 557 nmにおけるモル吸光係数は 41750であり、量子収率は 0. 41である。モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光-として発することができるかを表した数値である。一

本発明の第四の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本発明の色素蛋白質は、ウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来のものであり、下記の特生を有することを特徴とする。

( 1 ) 吸収極大波長が 592 nmである；

(2) 592 nmにおけるモル吸光係数が 87000である； ( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 1 0で安定である：

ウメポシイソギンチヤク（Actinia equina) は、刺胞動物門（Cnidaria)の刺胞動物亜門の花虫綱（サンゴ虫類） (Anthozoa)の六放珊瑚亜綱（Hexacorallia)の磯巾着目（Actiniaria)のウメポシイソギンチヤク科（Actiniidae)に属するイソギンチヤクの 1種である。ウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) は、日本では九州以北の磯に普通に見られ、触手を広げると水中で赤い花が咲いているように見える。

なお、本書中以下の実施例では、ウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) を出発材料として上記特性を有する色素蛋白質を単離したが、ウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) 以外のイソギンチヤクから本発明の色素蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような色素蛋白質も本発明の範囲内である。本発明の色素蛋白質は、以下の実施例で示す通り、吸収極大波長が 5 9 2 n m であり、また、 5 9 2 n mにおけるモル吸光係数は 8 7 0 0 0である。

モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表す。量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。本発明の色素蛋白質の量子収率は極めて低いため、蛍光は殆ど発しない。この性質から、本発明の色素蛋白質は、（1 ) F R E Tのァクセプター分子（エネルギー受容体）として用いたり、（2 )照射した光のエネルギーを光以外のエネルギーに変換させるシステムの開発に利用したり、あるいは（3 ) 蛋白質のアミノ酸配列に変異を導入して蛍光を発するように改変することなどに用いることができる。また、本発明の色素蛋白質は、光吸収特性の； H感受性が p H 5〜 1 0で安定であることを特徴とする。即ち、本発明の色素蛋白質では、 p H 5〜1 0の範囲において吸収スぺクトルのピーク値の変動が少ない。従って、本発明の色素蛋白質は、広範囲の p H環境において同様の条件で使用することができ、.生体内での使用に際しての制約は少ない。

本発明の色素蛋白質の具体例としては、以下の何れかのァミノ酸配列を有する色素蛋白質が挙げられる。 ( a ) 配列番号 1 1に記載のァミノ酸配列；又は、

(b )配列番号 1 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴノ又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：

本発明の第五の蛍光蛋白質は、ゥミキノコ i obophytwn crasswi) 由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。

( 1 ) 励起極大波長が 48 2 n mである；

(2) 蛍光極大波長が 498 nmである；

(3) 482 におけるモル吸光係数が 7 1 000である；

(4) 量子収率が 0. 41である；

(5) 蛍光極大の pH感受性が pH=4〜l 0で安定である：

ゥミキノコ

crassimi) は、刺胞動物門花虫綱八放サンゴ亜綱に属するサンゴの 1種である。

本発明の第五の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が 48 2 nmであり、蛍光極大波長が 49 8 nmである。また、 48 2 nmにおけるモル吸光係数は 7 1 000であり、量子収率は 0. 4 1である。モル吸光係数は蛍光分子 1モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。

本発明の第五の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。

( a ) 配列番号 1 3に記載のァミノ酸配列；又は、

0)配列番号1 3に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：

本明細書で言う「 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列」における「1から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、 1から 20個、好ましくは 1から 1 0個、より好ましくは 1から 7個、さらに好ましくは 1から 5個、特に好ましくは 1から 3個程度を意味する。

本明細書で言う「蛍光を有する」および「蛍光蛋白質」とは、蛍光を発することができる全ての場合を包含し、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、 p H感受性などの諸特性は、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と比較して、変動していてもよいし、同様のままでもよい。

本明細書で言う「吸光特性」とは、ある波長の光を吸収できる特性を意味し、例えば、本明細書に示した色素蛋白質と同様に吸収極大波長が 5 9 2 n mであつてもよいし、あるいは吸収極大波長の値がシフトしたものであってもよい。なお、光吸収特性の P H感受性は、 p H 5〜 1 0で安定であることが好ましい。

上記した通り、本発明の配列表の配列番号 1 1に記載したァミノ酸配列を有する色素蛋白質は蛍光をほとんど発しないものである。本発明においては、配列番号 1 1に記載したアミノ酸配列に対して 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び /又は付加を導入することにより、より強い蛍光を発する蛋白質を作製してもよく、このような蛋白質も本発明の範囲内に含まれる。

本発明の蛍光蛋白質及び色素蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。 … ― 組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする D N Aを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1又は 1 3に記載したアミノ酸配列並びに配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2 又は 1 4に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いてコモンサンゴ（Montipora sp. )、ミドリイシ（Acropora sp. )、ゥメホンィソギンチャク (Actinia equina;、又はウ^キノコ Lobophytum crassum) 由来の c D N Aライプラリーを铸型にして P C Rを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質又は色素蛋白質をコードする D N Aを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質又は色素蛋白質をコードする D N Aの一部の断片を上記した P C により得た場合には、作製した D N A断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質又は色素蛋白質をコードする DN Aを得ることができる。この DNAを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質又は色素蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。

(2) 本発明の DNA

本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質又は色素蛋白質をコードする遺伝子が提供される。

本発明の蛍光蛋白質をコードする DNAの具体例としては、以下の何れかの D NAが挙げられる。

(a) 配列番号 1、 3、 5， 7、 9又は 13に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9又は 13に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA。

本発明の蛍光蛋白質をコードする DNAのさらなる具体例としては、以下の何れかの DNAが挙げられる。 -

(a)配列番号 2、 4、 6、 8、 10又は 14に記載の塩基配列を有する DNA；又は、

(b) 配列番号 2、 4、 6、 8、 10又は 14に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードする DNA：

本発明の色素蛋白質をコードする DNAの具体例としては、以下の何れかの D

NAが挙げられる。

(a) 配列番号 11に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b )配列番号 1 1に記载のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする D N A：

本発明の色素蛋白質をコードする D NAの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有する D N Aが挙げられる。

( a ) 配列番号 1 2に記載の塩基配列；又は、

( b ) 配列番号 1 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

本発明の D NAは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（P C R) によって製造することもできる。本発明の D N A又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。

また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いる P C R、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有する D N Aを構築することができる。このような公知の技術は、例ば、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2^nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ΝΥ·， 1989ヽ -並び-に Current Protocols in Molecular Biology, Supplement ；!〜 38， John Wiley & Sons (1987- 1997)に記載されている。

( 3 ) 本発明の組み換えベクター

本発明の D NAは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター

(例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってあよい。

好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の D N Aは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示す D N A配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。

細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス ·ステア口テルモフィルス · マノレトシエニック · アミラーセ遺伝子 (Bac i 1 lus s t ear othermophi lus maltogenic amylase gene)、バチノレス · リケニホスレミス _α アミラーゼ遺伝子 (Bacillus licheniformis alpha— amylase gene)、ノテノレス 'ア^ロリケフアチェンス · BANア^フーセ遺伝子 (Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス .サブチ.リス ·アル力リプロテアーゼ遺伝子（Bacillus S ubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス · プミルス · キシロシダーゼ遺伝子 (Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ . ラムダの P_R若しくは P_Lプロモータ、大腸菌の lac、 trp若しくは tacプロモータなどが挙げられる。

哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、 S V 4 0プロモータ、 M T一 1 (メタ口チォネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス 2主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリへドリンプロモータ、 P 1 0プロモータ、オートグラファ ·力リホル二力 'ポリへドロシス塩基性タンパクプロモータ、パキユウ口ウィルス即時型初期遺伝子 1プ口モータ、またはパキユウロウィルス 3 9 K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、ァノレコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、 T P I 1プロモータ、 AD H2 - 4cプロモータなどが挙げられる。

糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、 AD H 3プロモータまたは t p i Aプロモータなどがある。

また、本発明の D N Aは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主については T P I 1ターミネータ若しくは AD H 3ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えべクタ一は更に、ポリアデニレーシヨンシグナル (例えば S V 4 0またはアデノウイルス 5 E 1 b領域由来のもの）、転写ェンハンサ配列（例えば S V 4 0ェンハンサ）および翻訳ェンハンサ配列（例えばアデノウイルス VA R NA をコードするもの）のような要素を有していてもよい。

本発明の組み換えべクタ一は更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にする D NA配列を具備してもよく、その一例としては S V 4 0複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。

本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよレ、。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（D H F R) またはシゾサッカロマイセス .ボンべ T P I遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフエ二コール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。

本発明の D NA、プロモータ、および所望によりターミネータおよぴまたは分泌シグナノレ配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。

( 4 ) 本発明の形質転換体

本発明の D N A又は組み換えべクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。

本発明の D N Aまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本癸明の D NA構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌おょぴ高等真核細胞等が挙げられる。

細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレブトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンビテント細胞を用いることにより行なえばよレ、。哺乳類細胞の例としては、 H E K 2 9 3細胞、 H e L a細胞、 C O S細胞、 B HK細胞、 C H L細胞または C HO細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された D NA配列を発現させる方法も公知であり、例えば、ェレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等を用いることができる。

酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス ' セレビシェ（Saccharomyces cerevislae)またはサッカロマイセス · タノレイべリ ( S accharomyces kluyveri 等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、ェレクト口ポレーシヨン法、スフエロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばァスペルギルス、ニューロスポラ、フザリゥム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、 D NA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。 D NA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよぴバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる (例ば、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual；及び力レント 'プロトコールズ'イン'モレキュラー 'バイオロジー、 Bio/Technology, 6， 47 (1988)等に記載)。

バキュロウィルスとしては、例えば、ョトウガ科昆虫に感染するウィルスであるアウトグラファ 'カリフォルニ力 ·ヌクレア一 'ポリへドロシス 'ウィルス (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用レヽ oことできる。昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperda の卵巣細胞である S f 9、 S f 2 1 「パキュロウィス .エクスプレッション 'ベクターズ、ァ 'ラボラトリー ' マニュアル、ダプリユー'ェイチ'フリーマン'アンド'カンパニー（W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク (New York)、 (1992)〕、 Trichoplusia niの卵巣細胞である H i F i v e (インビトロジェン社製)等を用いることができる。

組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフエクシヨン法等を挙げることができる。

上記の形質転換体は、導入された D N A構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。

例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破碎機等により細胞を破碎し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル (DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰ィオン交換ク口マトグラフィ一法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエニノレセファロース等のレジンを用いた疎水 '性グロマ小グラフィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法、クロマトフオーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

( 5 ) 本発明の蛍光蛋白質及ぴそれを含む融合蛍光蛋白質の利用

本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。

本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよレ、。組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする D NAを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号 1、 3、 5又は 7、 9又は 1 3に記載したァミノ酸配列及ぴ配列番号 2、 4、 6又は 8、 1 0又は 1 4に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含む D N A断片を錶型にして P C Rを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードする D N Aを構築するのに必要な D N A断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードする D NA断片も入手する。

次いで、これらの D N A断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードする D NAを得ることができる。この D NAを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。

本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。 - - 本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターグティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアブレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードする D NAが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。

また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードする D NAが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。

上記被検ァミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「pNE0」（p. Southern, and P. Berg (1982) J. M01. Appl. Genet. 1 : 327 ) 、「 pCAGGS 」（ H. Mwa， K. Yamamura, and J. Miyazaki. Gene 108, 193-200 (1991) )、「pRc/CMV」（インビトロゲン社製）、「pCDM8」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「pRS303」， r_pRS304j,「pRS305」，「pRS306」，「pRS313」 , 「pRS314」 , 「pRS315」， [pRS316] (R. S. Sikorski and P. Hieter (1989) Genetics 122 : 19—27 ) 、「 pRS423」，「 pRS424」，「 pRS425」，「 pRS426」 (T. W. Christianson, R. S. Sikorski, M. Dante, J. H. Shero, and P. Hieter (1992) Gene 110: 119-122) などが好適に用いられる。

また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、 L 細胞、 BalbC 3T3細胞、 NIH3T3細胞、 CHO (Chinese hamster ovary)細胞、 HeLa細胞、 NRK (normal rat kidney)細胞、「Saccharomyces cerevisiaej などの酵母細胞や大腸菌（E. coli) 細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクト口ポレーシヨン法などの常法により行うことができる。

上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質 Xとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質 Xの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードする D NAで形質転換またはトランスフェタトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質 Xの局在や動態を可視化して分析することができる。

例えば、蛋白質 Xとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルォキソームなどの分布や動きを観察できる。

また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。

本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社アキシォフォトフィルターセット 09) や画像解析装置（ATT0デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。

顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーシヨンを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。

フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の第一及ぴ第二の蛍光蛋白質の場合、励起光 490〜51 Onm、蛍光 5 10〜530 rtm程度のフィルターを使用することが好ましい。本発明の第三の蛍光蛋白質の場合、励起光 460〜480 nm、蛍光 480〜510 nm程度のフィルターを使用することが好ましい。本発明の第四の蛍光蛋白質の場合、励起光 550〜565 nm、蛍光 570〜580 n m程度のフィルターを使用することが好ましい。本発明の第五の蛍光蛋白質の場合、励起光 470〜490 nm、蛍光 490〜510 nm程度のフィルターを使用することが好ましい。

また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却 CCDカメラを使用する。冷却 CCDカメラは、 C CDを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。 (6) 本発明の色素蛋白質及ぴそれを含む融合蛋白質の利用

本発明の色素蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質を構築することができる。本発明の色素蛋白質に融合させる他の蛋白質の種類は特に限定されなレ、が、他の分子と相互作用する蛋白質であることが好ましく、例えば、受容体蛋白質又はそのリガンド、あるいは抗原又は抗体などが挙げられる。

本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質であよい。

組み換え融合蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードする DNA を入手することが必要である。本発明の色素蛋白質をコードする D N Aおよぴそれに融合すべき他の蛋白質をコードする DNAは、本明細書中上記した方法またはそれに準じてそれぞれ入手することができる。次いで、これらの DNA断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛋白質をコードする D N Aを得ることができる。この D N Aを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を産生することができる。

分子間の相互作用を分析する手法の一つとして、 FRET (蛍光共鳴エネルギ転移）が知られている。 FRETでは、例えば、第一の蛍光蛋白質としてのシアン蛍光蛋白質（CFP) で標識した第一の分子と、第二の蛍光蛋白質としての黄色蛍光蛋白質（YFP) で標識した第二の分子とを共存させることにより、黄色蛍光蛋白質（YFP) をァクセプター分子として作用させ、シアン蛍光蛋白質

(CFP) をドナー分子として作用させ、両者の間で FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）を生じさせることにより、第一の分子と第二の分子との間の相互作用を可視化することができる。即ち、 FRETでは 2種類の分子にそれぞれ異なる色素を導入し、エネルギーレベルの高い方の色素（ドナー分子）を選択的に励起し、その色素の蛍光を測定し、もう一方の色素（ァクセプター分子）からの長波長蛍光も測定して、それらの蛍光変化量によって分子間の相互作用を可視化する。両方の色素が、 2種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少とァクセプター分子の蛍光の増加が 1波長励起 2波長測光法により観測される。し力し、ァクセプター分子に色素蛋白質を用いた場合は、両方の色素が、 2種類の分子の相互作用によって近接したときのみドナー分子の蛍光の減少を生じ 1波長励起 1波長測光法により観測することができる。即ち、測定機器の簡易化が可能となる。

本発明の色素蛋白質は、特に、 F R E T (蛍光共鳴エネルギー転移）におけるァクセプター分子としての利用価値が高い。即ち、本発明の色素蛋白質と被験物質との融合体（第一の融合体）を作製する。次いで、該被験物質と相互作用する別の被験物質と別の蛍光蛋白質との融合体（第 2の融合体）を作製する。そして、第一の融合体と第 2の融合体とを相互作用させ、発する蛍光を分析することにより、上記 2種類の被験物質間の相互作用を分析することができる。なお、本発明の色素蛋白質を用いた F R E T (蛍光共鳴エネルギー転移）は、試験管内で行つてもよいし、細胞内で行ってもよい。

( 7 ) 本発明のキット

本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、 D NA、組み換えべクタ^-又は形質転換体から選択される少なくとも 1種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び/又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及ぴ手法で調製することができる。

さらに本発明によれば、本明細書に記載した色素蛋白質、融合蛋白質、 D NA、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも 1種以上を含むことを特徴とする、吸光試薬キットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。

蛍光蛋白質、色素蛋白質又は D NAなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。実施例

実施例 1：イシサンゴからの新規蛍光蛋白遺伝子 (COG)の単離、並びに蛍光特性の解析

( 1 ) total RNAの抽出

珊瑚より蛍光蛋白質遺伝子の単離を行った。材料にはコモンサンゴ（Montipora sp. )を用いた。凍結したコモンサンゴを乳鉢で枠き、湿重量 2グラムに" TRIzol"

(GIBCO BRL) を 7. 5 ml加えてホモジナイズし、 1500 X gで 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 1. 5 mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500 X g で 15分間遠心した。上清にィソプロパノール 3. 75 mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 10分間静置した。 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノールを 6 ml加えて 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1 で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D. 260と 0. D. 280 の値を測定して RNA濃度を測った。 22 _μ gの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 4 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット，， Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA (33 μ 1)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA (33 μ 1)のうち 3 μ 1を铸型として PCRを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5 ' -GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY-3 ' (primer 1) (配列番号 1 5 )

5， -ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT-3 ' (primer 2) (配列番号 1 6 )

1=イノシン、 R=A又は G、 Y=C又は T、 V=A, C又は G、 D=A, G又は T S=C又は G、 H=A又は T又は C

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA)

X10 taqバッファー 5 μ 1

2. 5 mM dNTPs 4 1

100 primer 1 1 μ ΐ

100 μ M primer2 1 μ 1

ミリ Q 35 / 1

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 35サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物 1 μ 1をテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で、 350 bpを切り出し、精製した。

( 4 ) サブクローユング及び塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7_blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5 ' -RACE法および 3， -RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。

( 5 ) 5， -RACE法

Degenerated PCR で得られた DNA断片の 5' 側の塩基配列を決定するために 5， -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBCO BRL) を用いて、 5' - RACE法を行った。铸型として（1 ) で調製した total RNAを 5 z g 使用した。

dC - tailed cDNAの一回目の増幅には

5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGI IGGGI IG-3 ' (primer 3) (配列番号 1 7 )

5' -CCATCTTCAAAGAGAAAAGACCTTT-3' (primer 4) (配列番号 1 8 )

のプライマーを用いた。

1=イノシン

二回目の増幅には

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 ' (primer 5) (配列番号 1 9 )

5' -CATGAGTTCTTGAAATAGTCAAC-3' (primer 6) (配列番号 2 0 )

のプライマーを用いた。 PCR反応条件等はキットのプロトコールに準じた。

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 350 bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株 (TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

( 6 ) 3， -RACE法

Degenerated PCRで得られた DM断片の 3，側部分は、（4 ) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（2 ) で調製した first strand cDNAを 3 μ 1使用した。 ·

作成したプライマーは

5' -ATGGCTCTTTCAMGCGAGGTG-3 ' (primer 7) (配列番号 2 1 )

PCR反応液組成テンプレート（first strand cDNA) 3/z 1

X10 taqバッファー 5^1

2.5 mM dNTPs 4^1

20 μΜ primer 7 Ιμΐ

10 μ M オリゴ dTprimer lju 1

ζ ]； Q 35 μΐ

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min(PAD) .

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (錶型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された約 1000 bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- bluevector(Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 2に示し、全長のァミノ酸配列を配列表の配列番号 1に示す。このクローンを C0Gと命名した。

(7) 大腸菌での蛋白発現

得られた全長の塩基配列より、蛋白の N末端に相当する部分でプライマーを作製し、 C末端側はオリゴ dTプライマーを使用して、（2)で調製した First strand cDNAを铸型として PCRを行つた。

使用プライマー 5 ' -GGGGGATCCGACCATGGCTCTTTCAAAGCGAGGTG-3 ' (primer 8) (配列番号 2 2) PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3μ1

X10 pyrobest / ッファー 5 μ丄

2.5 mM dNTPs 4μΙ

100 μ Μ primer 8 1 μ丄

100/ζΜオリゴ dTプライマー Ιμΐ

ミリ Q 35^1

pyrobest polymerase (a U/ μ 1) 丄 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min(PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行った。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された約 1000 bpのパンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invitrogen)の BamHI、EcoR I部位にサブクローユングして、大腸菌株（JM109- DE3) で発現させた。発現蛋白は N末端に His- tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白は Ni- Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。

(8) 蛍光特性の解析

20 M蛍光蛋白（C0G)、 150 mM KC1, 50 rail HEPES pH 7.5溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した（図 1 B)。このスペクトルのピーク（507 nm) の値よりモル吸光係数を計算した。 450 nmの吸収が 0.002となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈し、 450 nmで励起した時の蛍光スぺクトルと 550 nmの蛍光による励起スぺクトルを測定した（図 1 A)。 EGFP (CL0NTECH)を同様に 450 nm の吸収が 0. 002となるようにして蛍光スぺクトルを測定し、 EGFPの量子収率を 0. 6として今回クローニングされた蛍光蛋白の量子収率を求めた。測定結果を表 1に示す。表 1

( 9 ) pH感受性の測定

蛍光蛋白を各緩衝液で同濃度に希釈し、 507 nmの吸収の値をとり pH感受性を測定した（図 1 C )。各 pHの緩衝液は次の通り、

pH 4、 5 ：酢酸ノッファー

pH 6、 11 ：リン酸バッファー

pH 7、 8 ： HEPESバッファー

pH 9、 10 ：グリシンバッファー

pH 5では p H 6〜： 10と較べて吸収のピークが 507 nmから 493 nmへ、蛍光のピークが 517 nmから 508 nmへと共に短波長側にシフトするという特性を持つてレヽた。測定結果を図 2 A及ぴ Bに示す。実施例 2 ：珊瑚からの新規蛍光蛋白遺伝子 (MIG)の単離

( 1 ) total RNAの抽出

蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはミドリイシ (Acropora sp. ) を用いた。ミドリイシをハンマーで碎き、砕いたサンゴ 5グラムに" TRIzol" (GIBC0 BRL) を 15 ml加えて攪拌し、 1500 X gで 10分間遠心した。上清にク口口ホルム 3 mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500 X gで 15分間遠心した。上清にィソプロパノール 7. 5 mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 10分間静置した。 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノ一ルを 6 ml加えて 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D. 260と 0. D. 280 の値を測定して RNA濃度を測った。 220 μ gの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 5 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット，， Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA(33 /i 1)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA(33 1)のうち 3 μ 1を铸型として PCRを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5， -GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY-3 ' (primer 1) (配列番号 1 5 )

5' -ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT-3' (primer 2) (配列番号 1 6 )

R=A又は G、 Y=C又は T、 V=A，C又は G、 D=A，G又は T

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X10 taqバッファー

2. 5 mM dNTPs

100 μ M primer 1

100 μ Μ primer2

ミリ Q

taq polymerase (5 U/ μ 1)

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (鎵型へのプライマーのアニーリング)

72°C 1 min (プライマー伸長）上記 3ステップを 30サイクル行い、ァニーリング温度を 1サイクルごとに 0. 3°C 下げた。 30サイクル時の温度は 43°C。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物 1 1をテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCR を行った。ァガロースゲル電気泳動で予想された大きさの 350 bp のパンドを切り出し、精製した。

( 4 ) サブクローニング及び塩基配列の決定

精製した賺断片を _PT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DM塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5' - RACE法およぴ 3' -RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。

( 5 ) 5' - RACE法

Degenerated PCR で得られた DNA 断片の 5' 側の塩基配列を決定するために 5' -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBC0 BRL) を用いて、 5， -RACE法を行った。铸型として（1 ) で調製した total RNAを 3 g 使用した。 DC- tailed cDNAの一回目の増幅には、

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' (primer 3) (配列番号 1 7 )

5， - TAGAAATGACCTTTCATATGACATTC - 3， (primer 4) (配列番号 2 3 )

のプライマーを用いた。

1=イノシン

二回目の増幅には

5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (primer 5) (配列番号 1 9 )

5， - TCTGTTTCCATATTGAAAGGCTG -3， (primer 6) (配列番号 2 4 ) のプライマーを用いた。 PCR反応条件等はキットのプロトコールに準じた。

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 500 bpのパンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株

(TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

(6) 3， - RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 3' 側部分は、（4) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（ 2 ) で調製した first strand cDNAを 3 μ 1使用した。

作成したプライマーは 5, -ATGGTGTCTTATTCAAAGCAAGGCATCGCACA-3' (primer 7)

(配列番号 2 5)

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) Ζμ Ι

X10 taqバッファー 5 μ 1

2.5 mM dNTPs 4μ1

20 μΜ primer 7 ■ 1 μ 1

10ju Μ oligo dT primer 1 /z 1

5 y Q 35μ 1

taq polymerase (5 U/μ 1) 1μ丄

PCR反応条件

94°C 1 min(PAD)

94°C 30 sec (変性）

55°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング)

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長） 4°C 保持

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 900 bpのパンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株 (TG1)にトランスフォーメーションしてプ^/一ホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 4に示し、全長のァミノ酸配列を配列表の配列番号 3に示す。このクローンを MIGと命名した。

( 7 ) 大腸菌での蛋白発現

得られた全長の塩基配列より、蛋白の N末端相当する部分で作製したプライマ一とオリゴ dTプライマーを用い、（2 ) で調製した First strand cDNAを铸型として PCRを行った。

使用プライマー

5， -CGGGATCCGACCATGGTGTCTTATTCAAAGCAAGGCATCGCACA -3 ' (primer 8) (配列番号 2 6 )

PCR反応液組成

テンプレ^ "ト（first strand cDNA) 3 ^ 1

X10 pyrobest バッファー 5 /· (丄

2. 5 IDM dNTPs 4 μ 1

20 μ M primer8 1 1

20 μ Μ oligo dT primer Ι μ Ι

Q 35 ^ 1

pyrobest polymerase (5 U/ul) Ι μ ΐ

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

55°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング) 72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された 900 bpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invi trogen)の BamH I、 EcoR I部位にサブクローニングして、大腸菌株（JM109- DE3) で発現させた。 N末端に His - tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白は Ni - Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。

( 8 ) 蛍光特性の解析

20 μ Μ蛍光蛋白（MIG)、 150 mM KC1、 50 mM HEPES pH 7. 4溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した（図 3 B )。このスペクトルのピーク（505 nm) の値よりモル吸光係数を計算した。 440 nmの吸収が 0. 001となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈し、 440 nmで励起した時の蛍光スぺクトルと 540 nmの蛍光による励起スぺクトルを測定した（図 3 A)。 EGFP (CL0NTECH)を同様に 440 nm の吸収が 0. 001となるようにして蛍光スぺクトルを測定し、 EGFPの量子収率を 0. 6として今回クローニングされた蛍光蛋白の量子収率を求めた。測定結果は表 2に示す。表 2

( 9 ) pH感受性の測定

蛍光蛋白を各緩衝液で希釈し、 505 nmの吸収の値をとり p H感受性を測定した。各 pHの緩衝液は次の通り、

pH 4、 5 ：酢酸バッファー

pH 6、 11 ：リン酸バッファー

pH 7、 8 ： HEPESバッファー pH 9、 10 ：グリシンパッファー

測定結果を図 3 Cに示す。実施例 3 ：珊瑚からの新規蛍光蛋白遺伝子 (MICy)の単離

( 1 ) total RNAの抽出

蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはミドリイシ (Acropora sp. ) を用いた。ミドリイシをハンマーで碎き、枠いたサンゴ 5グラムに" TRIzol" (GIBCO BRL) を 15 ml加えて攪拌し、 1500 X gで 10分間遠心した。上清にク口口ホルム 3 mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500 X gで 15分間遠心した。上清にィソプロパノール 7. 5 mlをくわえ、 15秒間撩拌した後 10分間静置した。 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノ一ルを 6 1!11加ぇて17000 で 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D. 260と 0. D. 280 の値を測定して RNA濃度を測った。 220 ;z gの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 5 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット" Ready To Go" (Amer sham Pharmacia)により cDNA (33 μ ΐ)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA (33 μ 1)のうち 3 μ 1を铸型として PCRを行つた。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5' -GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY-3 ' (primer 1) (配列番号 1 5 )

5' -ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT-3' (primer 2) (配列番号 1 6 )

R=A又は G、 Y=C又は T、 V=A，C又は G、 D=A, G又は T

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1 X10 taqバッファー 5 μ 1

2. 5 mM dNTPs 4 μ 1

100 μ M priraerl Ι μ ΐ

100 μ M primer 2 1 μ 1

^ 1； Q 35 μ ΐ

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行い、ァニーリング温度を 1サイクルごとに 0. 3°C 下げた。 30サイクル時の温度は 43°C。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物 Ι μ ΐをテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で予想された大きさの 350 bp のバンドを切り出し、精製した。

( 4 ) サブクローニング及ぴ塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5 ' -RACE法および 3， - RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。

( 5 ) 5， -RACE法 Degenerated PCR で得られた DNA断片の 5，側の塩基配列を決定するために 5' -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBCO BRL) を用いて、 5， - RACE法を行った。铸型として（1 ) で調製した total RNAを³ ju g 使用した。 DC- tailed cDNAの一回目の増幅には

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGIIGGGI IG-3 ' (primer 3) (配列番号 1 7 )

5， - TAGAAATGACCTTTCATATGACATTC - 3 ' (primer 4) (配列番号 2 7 )

のプライマーを用いた。

1=ィノシン

二回目の増幅には .

5 ' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 ' (primer 5) (配列番号 1 9 )

5， - TCTGTTTCCATATTGAAAGGCTG -3， (primer 6) (配列番号 2 8 )

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 500 bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7_blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株

( 6 ) 3， -RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 3 ' 側部分は、（4 ) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（ 2 ) で調製した first strand cDNAを 3 μ 1使用した。

(配列番号 2 9 )

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X10 taqバッファー 5 1

2. 5 mM dNTPs 4 μ Ι 20 μ M primer 7 1 μ 1

10 μ M oligo dT primer Ι μ Ι

Q 35 / l

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

55°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 900 bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株 (TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より pl_asmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 6に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号 5に示す。このクローンを MICyと命名した。

( 7 ) 大腸菌での蛋白発現

使用プライマー

5' -CGGGATCCGACCATGGTGTCTTATTCAAAGCAAGGCATCGCACA -3 ' (primer 8) (配列番号 3 0 )

PCR反応液組成テンプレート（first strand cDNA) 3^1

X10 pyrobest バッファー 5μ 1

2.5 mM dNTPs 4 μ 1

20 μ M primer8 1 μΐ

20 x M oligo dT primer 1μ丄

ミリ Q 35//1

pyrobest polymerase (5 U/ μ 1) 1^1

PCR反応条件

94°C 1 min(PAD) .

94°C 30 sec (変性）

55°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された 900 bpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invitrogen)の BamH I、 EcoR I部位にサブクローニングして,、大腸菌株（JM109- DE3) で発現させた。 N末端に His- tagが付くようにコンストラタトしたので発現蛋白は Ni- Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。

(8) 蛍光特性の解析

20μΜ蛍光蛋白（MICy)、 150 mM KC1、 50 mM HEPES pH7.4溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した（図 4 B)。このスペクトルのピーク（472ηιη) の値よりモル吸光係数を計算した。 440 nmの吸収が 0· 001となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈し、 440 nmで励起した時の蛍光スぺクトルと 540 nmの蛍光による励起スぺクトルを測定した（図 4A)。 EGFP (CL0NTECH)を同様に 440 nm の吸収が 0.001となるようにして蛍光スぺクトルを測定し、 EGFPの量子収率を 0.6としてングされた蛍光蛋白の量子収率を求めた。測定結果を表 3に示す。

(9) pH感受性の測定

蛍光蛋白を各緩衝液で希釈し、 472 nmの吸収の値をとり pH感受性を測定した。各 pHの緩衝液は次の通り、

pH 4、 5 ：酢酸パッファー

pH 6、 11 ：リン酸バッファー

pH 7、 8 ： HEPESバッファ一，

pH 9、 10 ：グリシンバッファー

測定結果を図 4 Cに示す。

(10) MiCyの p H而性変異体 MiCy2の作製

MiCyの 166番目のグルタミン（Q)をヒスチジン（H)に置換することにより MiCy に比べて酸性側での蛍光強度が強い MiCy2となった（ァミノ酸配列を配列番号 7 に示し、塩基配列を配列番号 8に示す)。具体的には pKa=6.6から pKa=5.6に下がり、蛍光のピークは 493nra、励起のピークは 462nmとなった（図 5の A及び B )。実施例 4：イシサンゴからの新規蛍光蛋白遺伝子 (C0R)の単離、並びに蛍光特性の解析

(1) total RNAの抽出

珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはコモンサンゴ (Montipora .）を用いた。凍結したコモンサンゴを乳鉢で碎き、湿重量 2グラムに" TRIzol" (GIBCO BRL) を 7.5 ml加えてホモジナイズし、 1500Xgで 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 1. 5 mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500 X g で 15分間遠心した。上清にィソプロパノール 3. 75 mlをくわえ、 15秒、間攪拌した後 10分間静置した。 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノールを 6 ml加えて 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1 で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D. 260と 0. D. 280 の値を測定して RNA濃度を測った。 22 μ gの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 4 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット" Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により CDNA (33 1)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA (33 1)のうち 3 ^ 1を铸型として PCRを行つた。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5 ' -GAAGGRTGYGTCAAYGGRCAY-3 ' (primer 1) (配列番号 1 5 )

5， -ACVGGDCCATYDGVAAGAAARTT-3 ' (primer 2) (配列番号 1 6 )

1=ィノシン、 R=A又は G -、 Y=C又は T、 V=A, C又は G、 D=A, G又は T S=C又は G、 H=A又は T又は C

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 z 1

X10 taqバッファー 5 μ 1

2. 5 mM dNTPs 4 μ Ι

100 μ M primer 1 1 μ ΐ

100 μ M priraer2 l μ ΐ

^ !J Q 35 μ ΐ

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件 94°C 1 min(PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 35サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物 1 ulをテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で、 350 bpを切り出し、精製した。

( 4 ) サブクローニング及ぴ塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーションした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてプルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5' - RACE法およぴ 3， - RACE法による遺伝子全長のクローユングを行った。

( 5 ) 5' - RACE法

Degenerated PCR で得られた DNA断片の 5' 側の塩基配列を決定するために 5' -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBC0 BRL)を用いて、 5' -RACE法を行った。铸型として（1 ) で調製した total RNAを 5 g使用した。

dC - tailed cDNAの一回目の増幅には

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGI IGGGI IG-3 ' (primer 3) (配列番号 1 7 ) 5' -CCATCTTCAAAGAGAAAAGACCTTT-3' (primer 4) (配列番号 1 8 )

のプライマーを用いた。 1=ィノシン

二回目の増幅には

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 ' (primer 5) (配列番号 1 9)

5' -CATGAGTTCTTGAAATAGTCAAC-3' (primer 6) (配列番号 20)

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 350bpのパンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株

(TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白ぃコロエーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

(6) 3' - RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 3' 側部分は、（4) の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴ dTプライマーの PCRで得た。铸型として（2) で調製した first strand cDNAを 3 _μ 1使用した。

作成したプライマーは

5， -ATGGCTCTTTCAAAGCACGGTC-3 ' (primer 7) (配列番号 3 1)

PCR反応液組成

テンプレート (first strand cDNA) 3μ1

X10 taqノッファー 5^1

2.5 mM dNTPs 4μ1

20 /zM primer 7 1 μ丄

10 μΜ オリゴ dTprimer 1 μ 1

5： U Q 35/ l

taq polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min(PAD)

94°C 30 sec (変性） 52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 rain (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された約 lOOObp のパンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- bluevector(Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロ二の大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。

得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 1 0に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号 9に示す。このクローンを C0Rと命名した。

(7) 大腸菌での蛋白発現

得られた全長の塩基配列より、蛋白の N末端に相当する部分でプライマーを作製し、 C末端側はオリゴ dTプライマーを使用して、（ ² )で調製した First strand cDNAを铸型として PCRを行つた。

使甩プライマー

5' -GGGGGATCCGACCATGGCTCTTTCAAAGCACGGTC-3' (primer 8) (配列番号 3 2) PCR反応液組成

テンプレート (first strand cDNA) 3μ 1

X10 pyrobest バッファー ομ ΐ

2.5 niM dNTPs 4 1

100 μ Μ primer8 1 μ 1

100/iMオリゴ dTプライマー Ιμ ΐ

Sジ Q 35 μ ΐ

pyrobest polymerase (5 U/ μ 1) 1 μ丄

PCR反応条件 94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (鏡型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 30サイクル行った。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された約 1000 bpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invitrogen)の Ba M I ^EcoR I部位にサブクローニングして、大腸菌株（JM109 - DE3) で発現させた。発現蛋白は N末端に Hi s- tagが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白は Ni- Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。

( 8 ) 蛍光特性の解析

20 μ Μ蛍光蛋白（C0R)、 150 mM KC1, 50 mM HEPES pH 7. 5溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した（図 6 B )。このスペクトルのピーク（557 nm) の値よりモル吸光係数を計算した。 520 nmの吸収が 0. 002となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈し、 520 nmで励起した時の蛍光スぺクトルと 600 nmの蛍光による励起スぺクトルを測定した（図 6 A)。 DsRed2 (CL0NTECH)を同様に 520 nmの吸収が 0. 002となるようにして蛍光スぺクトルを測定し、 DsRed2の量子収率を 0. 55として今回クローニングされた蛍光蛋白の量子収率を求めた。測定結果を表 4に示す。表 4

モル吸光

励起極大蛍光極大係数量子収率 pH感受性 . アミノ酸数

41750

COR 557nm 574nm (557nm) 0.41 pKa<4.0 232 (9) pH感受性の測定

蛍光蛋白を各緩衝液で同濃度に希釈し、 557 nmの吸収の値をとり pH感受性を測定した。各 pHの緩衝液は次の通り、

pH 4、 5 ：酢酸バッファー

pH 6、 11 ：リン酸バッファー

pH 7、 8 ： HEPESバッファー

pH 9、 10 ：グリシンバッファー

測定結果を図 6 Cに示す。実施例 5 ：イソギンチヤクからの新規色素蛋白遺伝子の単離、並びに光吸収特性の解析

(1) total RNAの抽出

イソギンチヤクより色素蛋白遺伝子の単離を行った。材料には赤色を呈する 1 個体のウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) を用いた。凍結したウメボシイソギンチヤクを乳鉢で碎き、湿重量 1グラムに" TRIzol" (GIBC0BRL) を 7· 5 m 1加えてホモジナイズし、 1500Xg で 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 1.5mlをくわえ、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500Xgで 15分間遠心した。上清にイソプロパノール 3.75 m lをくわえ、 15秒間攪拌した後 10分間静置した。 17000Xgで 10分間遠心した。上清を捨て 70%エタノールを 6 ml加えて 17000 X gで 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC水 200 μ 1で溶解した。 DEPC 水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D.260と 0. D.280の値を測定して RNA濃度を測った。 1.2 mgの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット" Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA(33 μ 1)を合成した。

(3) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA(33 μΐ)のうち 3μ1を錄型として PCRを行つた。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5， - GGI WSB GTI AAY GGV CAY DAN TT -3，（primer 1) (配列番号 3 3 )

5， - GTC ITC TTY TGC ACI ACI GGI CCA TYD GVA GGA AA -3， (primer2) (配列番号 3 4 )

₁₌イノシン、 R=A又は G、 Y=C又は T、 V=A, C又は G、 D=A, G又は T S=C又は G、 H=A又は T又は C

PCR反応液組成 - テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X10 taqバッファー 5 μ 1

2. 5mM dNTPs 4 μ 1

100 μ Μ primer 1 Ι μ ΐ

100 μ Μ primer2 1 μ 1

5： y Q 35 μ ΐ

taq polymerase (5U/ μ 1) 1 μ 1

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (denaturation)

58°C 30 sec (annealing of primers to temp丄 ate)

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステップを 35サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物 Ι μ ΐをテンプレートとして、もう一度同じ条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動で、 350 bpを切り出し、精製した。 ( 4 ) サブクローユング及ぴ塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコ口-一の大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5， -RACE法および 3， -RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。

( 5 ) 5， -RACE法.

Degenerated PCR で得られた DNA断片の 5' 側の塩基配列を決定するために 5' -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBCO BRL) を用いて、 5' -RACE法を行った。铸型として（1 ) で調製した total R を 4 ju g 使用した。

赤色の個体由来の DC-tailed cDNAの一回目の増幅には

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGI IGGGI IG-3 ' (primer3) (配列番号 1 7 ) 5， - CCT TGA AAA TAA AGC TAT CT- 3， (primer4) (配列番号 3 5 )

のプライマーを用いた。

1=イノシン

二回目の増幅には

5， - GGCCACGCGTCGACTAGTAC- 3' (primer5) (配列番号 1 9 )

5， - CCC TGT ATG CTT GTG TCC TG- 3， (primer6) (配列番号 3 6 )

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 200 bpのパンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7- blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株 (TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。 ( 6 ) 全塩基配列の決定、及び大腸菌での蛋白発現

( 5 ) により得られた蛋白の N末端に相当する部分でプライマーを作製し、 C 末端側はオリゴ d Tプライマーを使用して、（2 ) で調製した First strand cDNA を铸型として PCRを行った。

使用プライマー

5， - CCC GGA TCC GAC CAT GGT GTC TTC ATT GGT TAA GAA -3，（primer- 7) (配列番号 3 7 )

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3 μ 1

X10 pyrobest ハツファー

2. 5 mM dNTPs

100 μ M primer8

100 μ Μオリゴ d Tプライマー

ミリ Q

pyrobest polymerase (5U/ μ 1)

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された約 900 bpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invitrogen)の BaraH I、 EcoR I部位にサブクローニングして、大腸菌株（JM109 - DE3) で発現させた。またプラスミドを回収し、挿入された全塩基配列を決定した。クローン名は Umeとした。全塩基配列およぴ全ァミノ酸配列を配列表の配列番号 1 2及ぴ配列番号 1 1に示す。発現蛋白は N末端に His-tag が付くようにコンストラクトしたので発現蛋白は Ni- Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解祈した。

(7) 光吸収特性の解析

10 μΜ色素蛋白（Ume；)、 50 mM HEPES pH7.9溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。赤色の個体由来色素蛋白（Ume) では 592 nmに吸収のピークが認められた（図 7A)。測定結果は表 5に示す。 ·

表 5

(9) pH感受性の測定

50 mMの下記の緩衝液中で蛋白質の吸収スぺクトルを測定した（図 7B)。各 pHの緩衝液は次の通り、

pH4、 5 ：酢酸バッファー

pH6 ：リン酸パッファー

pH7、 8 ： HEPESバッファー

pH9、 10 ：グリシンバッファー

pH5〜； L0でピークの値は安定していた。実施例 6 ：珊瑚（ゥミキノコ）からの新規蛍光蛋白遺伝子の単離

(1) total RNAの抽出

蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはゥミキノコ {Lobophytum crassum) を用いた。珊瑚をハンマーで砕き、湿重量 4グラムに" TRIzol" (GIBCO BRL) を 7.5 m l加えて攪拌し、 1500Xgで 10分間遠心した。上清にクロ口ホルム 1.5 m lをくわえ、 15秒間攪拌した後 3分間静置した。 7500 Xgで 15分間遠心した。上清にィソプロパノール 3.75 m lをくわえ、 15 秒間攪拌した後 10分間静置した。 17000Xgで 10分間遠心した。上清を捨て 70% ェタノールを 6 ml加えて 17000 Xgで 10分間遠心した。上清を捨て沈殿を DEPC 水 200 _β 1で溶解した。 DEPC水で溶解した total RNAを 100倍に希釈して 0. D.260 と O.D.280の値を測定して RNA濃度を測った。 390/z gの total RNAを得た。

( 2 ) First strand cDNAの合成

total RNA 3 μ g を使用し、 First strand cDNA の合成キット，， Ready To Go" (Amersham Pharmacia)により cDNA(33 ul)を合成した。

( 3 ) Degenerated PCR

合成した First strand cDNA(33 μ 1)のうち 3 μ 1を铸型として PCRを行つた。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。

使用プライマー

5， - GRR AGG IWS BGT HAA YGG VCA -3，（Primer 1) (配列番号 3 8)

5' - AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA -3' (Primer2) (配列番号 3 9)

R=A又は G、 Y=C又は T、 V=A,C又は G、 D=A，G又は T

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3μ1

X10 taqバッファー 5 μ 1

2.5 mM dNTPs μ1

100 μ Μ primer 1 1 μ丄

100 μ Μ primer2 ΙμΙ

ミリ Q 35

taq polymerase (5U/ μ 1) Ιμΐ

PCR反応条件

94°C 1 min(PAD) 94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (铸型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

一回目の PCR反応で得られた増幅産物をテンプレートとして、もう—度同じ温度条件で PCRを行った。ただし、使用プライマーは、

5， - GRR AGG IWS BGT HAA YGG VCA- 3' (Primer 1) (配列番号 3 8 )

5， - GTC ITC TTY TGC ACI ACI GGI CCA TYD GVA GGA AA -3， (Primer3) (配列番号 4 0 )

ァガロースゲル電気泳動で、予想された大きさの 350 b のパンドを切り出し、精製した。

( 4 ) サブクローニング及ぴ塩基配列の決定

精製した DNA断片を pT7-blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株（TG1) にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、揷入された DNA断片の塩基配列を DNAシークェンサ一により決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してその DNA塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、 5' - RACE法および 3， -RACE法による遺伝子全長のクローニングを行った。

( 5 ) 5， - RACE法

Degenerated PCRで得られた DNA断片の 5' 側の塩基配列を決定するために 5， -RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2. 0 (GIBC0 BRL) を用いて、 5， -RACE法を行った。铸型として 1 ) で調整した total RNAを 3ug使用し /し。

DC-tailed cDNAの一回目の増幅には

5， -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGI IGGGI IG-3 ' (Primer4) (配列番号 1 7 ) ₅，— _{TCA AGA} TAT cGA AAG CGA ACG GCA GAG -3， (Primer5) (配列番号 4 1)

のプライマーを用いた。

1=イノシン

二回目の増幅には

5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (Primer6) (配列番号 42)

5， - CTT CTC ACG TTG CM ATG GC- 3， (Primer7) (配列番号 43)

ァガロースゲル電気泳動で、増幅された 600 bpのバンドを切り出し、精製した。精製した DNA断片を pT7 - blue vector (Novagen)にライゲーシヨンした。大腸菌株

(TG1)にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌より plasmid DNAを精製して、挿入された DNA断片の塩基配列を DNAシータエンサ一により決定した。

(6) 全塩基配列の決定、及び大腸菌での蛋白発現

(5) により得られた蛋白の N末端に相当する部分でプライマーを作製し、 C 末端側はオリゴ dT プライマーを使用して、 2 ) で調整した First strand cDNA を铸型として PCRを行った。

使用プライマー

5' - CCC GGA TCC GAT GAG TGT GAT TAC AWC AGA AAT GAA GAT GGA GC -3， (Primer8)

(配列番号 44)

PCR反応液組成

テンプレート（first strand cDNA) 3μ1

X10 pyrobest バッファー 5μ1

2.5 iuM dNTPs 4/il

100 μ M primer8 Ιμΐ

ΙΟΟμΜオリゴ dTプライマー ΙμΙ

^ y Q 35 μΐ 6 pyrobest polymerase (5U/ μ 1) Ι μ ΐ

PCR反応条件

94°C 1 min (PAD)

94°C 30 sec (変性）

52°C 30 sec (錶型へのプライマーのアニーリング）

72°C 1 min (プライマー伸長）

上記 3ステツプを 30サイクル行つた。

72°C 7 min (最後の伸長）

4°C 保持

ァガロースゲルの電気泳動で、増幅された約 900bpのバンドを切り出し、精製して pRSET vector (Invitrogen)の a l I、 EcoR I部位にサブクローニングして、大腸菌株（JM109- DE3) で発現させた。またプラスミドを回収し、揷入された全塩基配列を決定した。クローン名を KnGとした。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号 1 4に示し、全長のァミノ酸配列を配列表の配列番号 1 3に示す。発現蛋白は N末端に His-tagが付くようにコンストラタトしたので発現蛋白は Ni- Agarose gel (QIAGEN)で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。，

( 7 ) 蛍光特性の解析

10 μ Μ蛍光蛋白（KnG)、 50 mM HEPES (pH7. 9) 溶液を用いて吸収スペクトルを測定した（図 8 A)。このスぺクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。 482 nmに吸収のピークが認められ、 450 nmにおける吸収が 0. 005となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈して、 450 nmで励起した時の蛍光スぺクトルを測定した (図 8 A)。 EGFP (CLONTECH)を同様に 450 nmにおける吸収が 0. 005となるようにして蛍光スぺクトルを測定し、 EGFPの量子収率を 0. 6として新規蛋白質の量子収率を求めた。結果を表 6に示す。 786 表 6

( 8 ) _PH感受性の測定

下記の緩衝液で希釈して蛍光スペクトルを測定した。

各 pHの緩衝液は次の通り、

pH4、 5 酢酸ノ

pH6 MESバッファ一

pH7 MOPSバッファ一

pH8 HEPESバッファー

pH9、 10 ダリ

pHll リン酸ノ

結果を図 8 Bに示す。産業上の利用可能性

本発明により、コモンサンゴ（Montipora sp. )、ミドリイシ（Acropora sp - )、及ぴゥミキノコ ilobophytim crassum) 由来の新規な蛍光蛋白質が提供されることになった。本発明の蛍光蛋白質は、従来の蛍光蛋白質とは一次構造が異なる新規な蛋白質である。本発明の蛍光蛋白質は、所定の蛍光特性を有し、分子生物学的分析において有用である。即ち、本発明の蛍光蛋白質を用いることにより哺乳類細胞で毒性を発揮することなく蛍光ラベルができるようになった。また、本発明の蛍光蛋白質に変異を導入することにより、より新しい蛍光特性を生み出すことができる。

また、本発明の蛍光蛋白質（C0R) は、従来の R F P (DsRed、クロンテック社）の示す幅広い励起スぺクトルに比べ、よりシャープなスぺクトルを有している。また、本発明の蛍光蛋白質に変異を導入することにより、赤色領域の蛍光特性をより多様化させることができる。

さらに本発明により、ウメボシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来の新規な色素蛋白質が提供されることになった。本発明の色素蛋白質は赤の領域に吸収を示すものであり、また p H感受性が低いことから、分子生物学的分析において有用である。また、本発明の色素蛋白質の吸収度（モル吸光係数）は著しく大きいため、光エネルギーの高効率な変換が可能である。また、遺伝子改変技術によつて本発明の色素蛋白質の量子収率を 1に近づけることも可能であり、その場合、新規な蛍光蛋白質を作製することができる。

Claims

請求の範囲

1. コモンサンゴ（Montipora sp. ) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1) 励起極大波長が 50 7 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 5 1 7 nmである；

(3) 50 7 nmにおけるモル吸光係数が 1 040 50である；

(4) 量子収率が 0. 2 9である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a =約 5. 5である：

2. ミドリイシ（Acropora sp，）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1) 励起極大波長が 50 5 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 5 1 6 nmである；

(3) 505 nmにおけるモル吸光係数が 536 00である；

(4) 量子収率が 0. 6 7である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が pKa =約 6. 4である：

3. ミドリイシ（Acropora sp. ) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1) 励起極大波長が 4 72 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 49 6 nmである；

(3) 4 72 nmにおけるモル吸光係数が 27250である；

(4) 量子収率が 0. 90である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a =約 6. 6である：

4. コモンサンゴ Montipora sp.) 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

( 1 ) 励起極大波長が 5 5 7 n mである；

(2) 蛍光極大波長が 5 74 nmである；

(3) 5 57 nmにおけるモル吸光係数が 4 1 7 50である；

(4) 量子収率が 0. 4 1である；

( 5 ) 光吸収特性の p H感受性が p K a <約 4 · 0である：

5. ウメポシイソギンチヤク（Actinia equina) 由来の下記の特性を有する色素蛋白質。

( 1 ) 吸収極大波長が 592 n mである；

(2) 592 nmにおけるモル吸光係数が 87000である；

( 3 ) 光吸収特性の p H感受性が p H 5〜 10で安定である：

6. ゥミキノコ ( obophytum crassim 由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。

(1) 励起極大波長が 482 nmである；

(2) 蛍光極大波長が 498 nmである；

(3) 482 nmにおけるモル吸光係数が 71000である；

(4) 量子収率が 0. 41である；

(5) 蛍光極大の pH感受性が pH=4〜l 0で安定である：

7. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 1に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

8. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 3に記载のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

9. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 5又は 7に記載のァミノ酸配列；又は、

( b ) 配列番号 5又は 7に記載のァミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

10. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列；又は、

(b) 配列番号 9に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するァミノ酸配列を有し、蛍光を有するァミノ酸配列：

1 1. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する色素蛋白質。

( a ) 配列番号 1 1に記載のァミノ酸配列；又は、

(13)配列番号1 1に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ又は付加を有するァミノ酸配列を有し、吸光特性を有するアミノ酸配列：

1 2. 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。

( a ) 配列番号 1 3に記載のァミノ酸配列；又は、

(b )配列番号 13に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：

1 3. 請求項 1から 12の何れかに記載の蛋白質をコードする DNA。

14. 以下の何れかの DNA。

(b) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、' 蛍光蛋白質をコードする DN

A：

15. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 2に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 2に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び Z又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：

16. 以下の何れかの DNA。

(a) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及ぴ又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN A：

1 7. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 4に記載の塩基配列；又は、 (b) 配列番号 4に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ

Z又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：

18. 以下の何れかの DNA。

( b ) 配列番号 5又は 7に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DNA：

19. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 6又は 8に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 6又は 8に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：

20. 以下の何れかの D N A。

(a) 配列番号 9に記載のアミノ酸配列をコードする DNA；又は、

(b) 配列番号 9に記載のアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN A：

21. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。 ―

( a ) 配列番号 10に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 10に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列： 22. 以下の何れかの DNA。

( b )配列番号 11に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び又は付カ卩を有するアミノ酸配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコ一ドする DNA：

23. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 12に記載の塩基配列；又は、 (b) 配列番号 12に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及ぴ Z又は付加を有する塩基配列を有し、吸光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：

24. 以下の何れかの DNA。

( b )配列番号 13に記載のァミノ酸配列において 1から数個のァミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードする DN A：

25. 以下の何れかの塩基配列を有する DNA。

( a ) 配列番号 14に記載の塩基配列；又は、

(b) 配列番号 14に記載の塩基配列において 1から数個の塩基の欠失、置換及び Z又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列： 26. 請求項 13から 25の何れかに記載の DNAを有する組み換えべクタ

27. 請求項 1 3から 25の何れかに記載の DN A又は請求項 26に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。

28. 請求項 1から 4、 6、 7から 10又は 12の何れかに記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。

29. 他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項 28に記載の融合蛍光蛋白質。

30. 他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項 28又は 29に記載の融合蛍光蛋白質。

31. 請求項 5又は 1 1に記載の色素蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛋白質。

32. 請求項 28から 30の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。

33. 請求項 5又は 1 1に記載の色素蛋白質をァクセプター蛋白質として用いて FRET (蛍光共鳴エネルギー転移）法を行うことを特徴とする、生理活性物質の分析方法。

34. 1から 4、 6、 7から 10又は 12の何れかに記載の蛍光蛋白質、請求項 14から 21、 24又は 25の何れかに記載の DNA、請求項 26に記載の組み換えベクター、請求項 27に記載の形質転換体、又は請求項 28から 30の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キット。

35. 請求項 5又は 11に記載の色素蛋白質、請求項 22又は 23に記載の DNA、請求項 26に記載の組み換えベクター、請求項 27に記載の形質転換体、又は請求項 31に記載の融合蛋白質を含む、吸光試薬キット。