WO2005056641A1

WO2005056641A1 - ジアミノシクロヘキサン白金(ii)とポリ(カルボン酸)セグメント含有ブロック共重合体との配位錯体、その抗腫瘍剤

Info

Publication number: WO2005056641A1
Application number: PCT/JP2004/018679
Authority: WO
Inventors: Kazunori Kataoka; Nobuhiro Nishiyama; Horacio Cabral; Soichiro Okazaki
Original assignee: Toudai Tlo, Ltd.
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-12-08
Publication date: 2005-06-23
Also published as: JPWO2005056641A1; ES2337904T3; US20070148125A1; SI1695991T1; CY1110233T1; RU2335512C2; KR20060123299A; DK1695991T3; AU2004297126B2; EP1695991B1; PL1695991T3; US8012463B2; CA2548457A1; EP1695991A1; CN100457185C; DE602004025612D1; EP1695991A4; KR100982933B1; PT1695991E; ATE458022T1

Abstract

ポリ(エチレングリコール)セグメントとポリ(カルボン酸)セグメントからなるブロック共重合体とジアミノシクロヘキサン白金(II)の配位錯体が提供される。該錯体は、腫瘍、特に悪性腫瘍の治療に効果的に使用できる。

Description

明細書ジァミノシク口へキサン白金（II)とポリ（カルボン酸）セグメント含有プロック共重合体との配位錯体、その抗腫瘍剤

技術分野

本発明は、ジァミノシク口へキサン白金 (Π)とポリ（エチレングリコール）ーポリ（カルボン酸）プロック共重合体との配位錯体、ならびに該配位錯体の製造方法および該配位錯体を有効成分として含んでなる抗腫瘍剤に関する。

背景技術

白金化合物であるシスブラチンやその類似体であるカルポプラチン（シスプラチンの離脱基であるジク口ライドが 1，1-シクロブタンジカルボキシレートで置換された化合物に相当する）は、特に生殖器官の癌に有効であるとして、早くより臨床使用されている。他方、シスブラチンの離脱基である二つのアミン基（またはアミノ配位子）のジアミノシク口へキサン（以下、 DACH ともいう。）による置換誘導体〔ジクロロジアミノシクロへキサンプラチン (Dichloro DACH platin)〕が良好な抗腫瘍活性を有し、かつ、安定な錯体であることは知られている。しかし、かような DACH 白金錯体は水に実質的に不溶性であることから、水溶性を改善すべく、該錯体のクロライド離脱基（または配位子）を多種多様なァニオン、性配位子で置換した誘導体が提案されてきた。このような誘導体のあるものは、例えば、シスプラチン耐性 L- 1210 白血病細胞に対して活性を示すことからさらに興味が持たれてきた。殊に、ォキザレート置換 DACH 白金錯体は、良好な水溶性を示すと同時に、高い治療係数 (therapeutic index)を有し、第三世代の抗腫瘍性白金化合物として臨床試験に供された（下記の非特許文献 1、 2および 3参照）。

他方、上記誘導体の中には、ォキザレートとは逆に、脂溶性を高めるために、 2分子の高級脂肪酸によるカルボキシレート置換 D A C H白金錯体を合成し、それらを安定にリポソーム内に封入したリポソーム複合体も提案されている（下記の非特許文献 4参照）。上記のォキザレート置換 DACH 白金錯体〔Pt(oxalato)- (dach)とも称する〕は、具体的には、非特許文献 1の 1856頁左欄で言及されているように、幾何異性体として、 transおよび cis異性体が、さらに trans異性体は 2つの光学異性体として、 trans- 1および trans_d異性体も単離されている。これらのうち Pt(oxalato)— (trans- 1-dach)または cis— [(1R2R)— 1,2 - シクロへキサンジァミン一 Ν,Ν' ]ォキザラト（2- )-0,0-白金 (II) (ォキザリブラチン (oxaliplatin)とも称されている）は、水溶性が高く 7.5mg/mL(37°C における 1.0 M KC1水溶液中）の溶解性を示す。また、 Pt(oxalato)-(dach) は、腹水肉腫ザルコーマー 180を移植した実験動物にたいして優れた ED₉₀ を示す。かようなォキザリブラチン（oxaliplatin)に対し、ォキザレートと同様にジカルボン酸であるが、 2つのカルボキシル基の間にメチレン基が 1 個加入されていることで異なるマロネートを配位子とする Pt(malonato)— (dach)は、 Pt(oxalato)- (dach)に比べて、 ED₉o値を示すための薬物用量が約 5倍以上になり（すなわち、薬効が五分の一以下になる）、治療係数が Pt(oxalato)- (cis - dach)に比べて半分以下になることが報告されている（例えば、下記の非特許文献 5参照）。

上記の様な Dichloro DACH platinの、所謂、低分子プロドラッグの他に、ポリマーを用いる高分子プロドラッグも提案されている（下記の非特許文献 6 参照）。非特許文献 6には、かような高分子プロドラッグ系で用いることのできるポリマーの例として、ポリ [ N-(2-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド] (HPMA)、ポリ（L-グルタミン酸）、ポリ（エチレングリコール）一block—ポリ（ァスパラギン酸）、酸化デキストラン（OX-Dex) 等が挙げられているが、具体的には、酸化デキストランまたはカルボキシメチルーデキストラン（CM-Dex)を用いて作製した DACH白金錯体のポリマー複合体が提供されているだけである。さらに、非特許文献 6には、 OX-Dex複合体が CM-Dex複合体に比べて、血清含有媒体中での実験腫瘍細胞に対する残存細胞毒性活性がより長期にわたり存在し、かつ、より高い細胞毒性を示すことも記載されている。そしてこのような OX-Dex複合体の優位性は、 OX-Dexの方が、 CM-Dexに比べて、 DACH白金錯体とのより強い配位結合を形成し、かつ、担持ポリマーの立体障害がより大きいことによる旨の示唆もある。

文献リスト

非特言午文献 1 ： Olivier Rixe et al., Biochemical Pharmacology,

Vol.52,pp l855- 1865, 1996、特に、 1855頁の要約部および 1856頁左欄、典型的な誘導体については 1862頁

非特許文献 2： Jean Louis Misset et al. ' Critical Reviews in

Oncology/Hematology 35(2000) 75-93

非特許文献 3： Eric Raymond et al., Molecular Cancer Theapeutics Vol.1, 227-235， 2002 Polymer Preprints, Japan Vol.51, No.5 (2002) 非特許文献 4： Roman Perez-Soler et al., Cancer Chemotherapy and Pharmacology 33(1994) 378-384

非特許文献 5： Yoshmori Kidani et al., American Chemical Society, vol.21, 1315- 1318, 1978特に、 1317頁表 IIIおよび IV

非特許文献 6 ： Y.O ya et al., J. Biomater. Sci. Polymer Edn. Vol. 7, No.12, pp.1085- 1096 (1996)

発明の開示

抗腫瘍性白金化合物として、ォキザリブラチン (oxaliplatin)は、 DicMoro DACH platinに比べて、水溶性が著しく向上し、効能が高く、しかも治療係数が高く安全に使用できる抗腫瘍性化合物であることが示唆されている。しかし、もし可能であるなら、ォキザリブラチンよりもさらに安全に使用できる抗腫瘍性白金化合物が提供できれば、癌化学療法の進歩に貢献できるであろう。

本発明者等の幾人かは、先に、シスプラチンとポリ（エチレングリコール）鎖のセグメントとポリ（グルタミン酸）鎖のセグメントを有するプロック共重合体との配位錯体（「シスプラチン内包ポリマーミセル」ともいう。）が、シスブラチンそれ自体に比べ、シスブラチンの体外排泄を有意に遅延させ (または薬剤の血中半減期の上昇をもたらし）、しかも、優れた抗腫瘍活性を示し、低減した毒性も示すことを見出し特許出願した（国際公開番号: WO02/26241A1参照）。

他方、上述したとおり DACH 白金錯体では、ァニオン性離脱基または配位子として、ォキザレートとを担持する Pt(oxalato) - (dach)錯体よりも、カルボキシル基間が一個のメチレン基により離れているマロネートとを担持する Pt(malonato)- (dach)錯体の方が抗腫瘍剤としての薬効が劣り、しかも治療係数も劣ることが知られている。なお、かかるポリマー複合体が臨床試験に供されていることを示唆する文献の存在を本発明者は知らない。、

かような背景が存在するにも拘らず、本発明者等は DACH 白金錯体とポリ（エチレンダリコール）鎖のセグメントとポリ（ダルタミン酸）鎖またはポリ（ァスパラギン酸）鎖のセグメントを有するブロック共重合体との配位錯体（「DACH白金錯体内包ミセル」ともいう。）の合成を試みてみた。

その結果、意外にも DACH 白金錯体内包ミセルは、その配位子（該共重合体）中のァニオン性離脱基としての 2個のカルボキシレート（またはカルボキシルァニオン）基の間が、ォキザレートに比べて遥かに離れている力、、または無秩序であるにも拘らず、高い抗腫瘍効果を有し、血中半減期もォキザリブラチン（oxaliplatin)とは比較にならないほど上昇し、しかもシスプラチン内包ポリマーミセルに比べて、生理的条件を模した、 10mMのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS)中で著しく長期にわたり安定なポリマーミセル構造を維持することが確認された。また、薬剤に結腸癌 C-26細胞を長期間（48時間、 72時間）さらした場合の増殖阻害活性 (IC₅₀)は、シスプラチン内包ポリマーミセルに比べ DACH 白金錯体内包ミセルの方が著しく高いことも確認できた。またさらに、カルボキシル基を側鎖に有する繰り返し単位がグルタミン酸以外のプロック共重合体であっても、場合によっては、 DACH白金錯体内包ミセルに匹敵しうる作用効果を示すものがあることも見出した。

さらにまた、かような DACH 白金錯体内包ミセルとシスブラチン内包ポリマーミセルの組み合わせ使用は、相加ないし相乗的な抗腫瘍作用を示すことも確認された。

こうして、本発明は、ジアミノシクロへキサン白金 (II)と、一般式 (A) :

PEG- block-ポリ（carbo) (A)

(式中、 PEGはポリ（エチレングリコール）セグメントを表し、そして carbo は側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す）

で示される構造を含んでなるプロック共重合体との配位錯体であって、 carbo のカルボキシル基と白金との結合を介してジァミノシク口へキサン白金 (II)が該ブロック共重合体に固定化されている配位錯体を、提供する。また、かような配位錯体の製造方法、該配位錯体の抗腫瘍有効量と製薬学的に許容されるキヤリヤーを含んでなる抗腫瘍性組成物も提供される。また、かようなジァミノシクロへキサン白金 (II)の錯体の抗腫瘍有効量を、それを必要とする患者（哺乳動物、特にヒト）に投与することを含んでなる腫瘍の治療方法も本発明の一態様として提供される。前記抗腫瘍性組成物および腫瘍の治療方法では、上述した WO02/26241A1に記載されたシスプラチン内包ポリマーミセル（または共重合体とシスブラチンの錯体）を、さらに組み合わせて使用する態様の発明も提供される。

このような本発明に従う、配位錯体は、 DACH白金錯体の誘導体の中でも最も優れた抗腫瘍剤といわれているォキザリブラチン（oxaliplatin)よりも有意に優れた特性を有するだけでなく、例えば、先に本発明者等の幾人かが開発したシスブラチン内包ポリマーミセルの生理学的環境下（体液中等）での安定性からも予期できない程のはるかに優れた安定性を示す一方で、有意に優れた抗腫瘍活性も示す。さらに、肝臓への滞積性は遊離のシスプラチン（またはシスブラチンそれ自体）とほぼ同等であるにも拘らず、腫瘍への集積性は遊離のシスブラチンとは比較できないほど高い値を示す。したがって、本発明によれば既知の、通常毒性の高いことが知られている、抗腫瘍性白金化合物に比べ、例えば、極めて安全に使用でき、かつ、抗腫瘍として効能の高い、特異なタイプの DACH 白金錯体の誘導体が提供できる。

本発明の具体的な記述

本発明に従う配位錯体は、 Dichloro DACH platinにおける離脱基（または配位子）クロライドがブロック共重合体の側鎖にカルボキシル基を有する 1または 2以上の繰り返し単位のカルボキシレートの少なくとも 1個により置換されており、残りの離脱基はアクア化 (水分子がその酸素原子の孤立電子対で白金イオンに配位している状態をいう）されていてもょレ、。そして、上記のク口ライドの 2個が 2個のカルボキシレートにより置換されている場合、該 2個のカルボキシレートは単一のポリマー分子の隣接もしくは相当隔離したものに由来するか、または複数のポリマー分子に由来することができる。限定されるものでないが、該配位錯体の構造式およびそれらが水性媒体溶媒中で形成するとみなせる DACH 白金錯体内包ミセルの概念図を図 1に示す。

DACH白金錯体部分は、非特許文献 1または 4に.記載されているとおり各種の異性体でありうるが、本発明の目的に従う限り、いずれか一種の異性体または各種異性体の混合物であることができる。

他方、上記の離脱基を置換するのに用いられるプロック共重合体は、親水性ポリマーセグメントとポリ（カルボン酸）セグメントを含んでなり、かつ、水性溶媒中でポリ（カルボン酸）セグメントのカルボキシレート（またはカルボキシルァニオン）が DACH 白金錯体の白金（または白金イオン）と結合（所謂 ·配位結合）を形成できるものであれば、理論上いかなるブロック共重合体であってもよいが、好ましくは後述するものである。さらに、かかる共重合体は、水性溶媒中で親水性ポリマーセグメントからなる外層を形成するシヱルと DACH白金錯体を固定したポリ（カルボン酸）セグメントからなる内部または中心層を形成するコアとのポリマーミセルを形成できるものが好ましい。

しかし、具体的には、親水性ポリマーセグメントとしてポリ（エチレングリコール)鎖またはポリ（エチレンォキシド）鎖セグメントを含んでなり、下記の一般式 (A)で示されるプロック共重合体を挙げることができる。

PEG— block—ポリ（carbo) (A)

上式中、 PEG はポリ（エチレングリコール）セグメントを表し、そして carbo は側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す。該ポリ (carbo)は、ポリ（ダルタミン酸）、ポリ（ァスパラギン酸）、ポリ（アタリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、からなる群より選ばれるポリマー鎖由来であることができる。

本発明の目的上より好ましいプロック共重合体としては、下記の一般式 (1)または（2)で示されるものまたはその塩を挙げることができる。

I

OR⁵

R 0- CH₂CH₂Oi— L- 弋

上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci-12アルキル基を表し、 Ι L²は連結基を表し、； R²はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、竦水性基または重合性基を表し、 R⁴ はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子もしくはアル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20，000の整数であり、 nは 2〜5，000の整数であり、伹し、 Xは 0〜5,000の整数である力 S、xは nより大きくなく、そして ii-xおよび X個の R⁵中、水素原子もしくはアル力リ金属のイオンが 50%以上、好ましくは 85%以上、より好ましくは 95%以上、特に好ましくは実質的に 100%を占める。

本発明の目的上より一層好ましいプロック共重合体としては、下記の一般式（1-a)または (2-a)で示されるものまたはその塩を挙げることができる。

R¹O-( CH₂CH₂O-)zrl-¹- "t COCHNH卞 (CH₂)₂

(1-a)

I

OR⁵ R¹0-( CH₂CH₂O-)^-L²— t NHCHCO-)^- R³

(CH₂)₂

I (2-a)

C二 O 、ノ

I

OR⁵

上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の d-₁₂アルキル基を表し、 Ι L²は連結基を表し、 R³は水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、： ⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子もしくはアル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20,000の整数であり、 nは 2〜5，000の整数であり、但し、 n個の R5中、水素原子もしくはアル力リ金属のイオンが 50%以上、好ましくは 85%以上、より好ましくは 95%以上、特に好ましく実質的に 100%を占める。

上記の一般式中の各基または部分の定義は、当業者が通常認識している意味または内容を有するものとして解釈されねばならない。限定されるものでないが、以下に、具体例を挙げる。

R¹についていう、未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の d- 12 アルキル基としては、メチル、ェチル、 n-プロピル、 iso-プロピル、 n-ブチノレ、 sec—プチノレ、 tert—プチノレ、 n—ペンチノレ、 n—へキシノレ、デシノレ、ゥンデシル等が挙げられる。また置換された場合の置換基としてはァセタール化ホルミル基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、 Cl-6 アルコキシカルボニル基、 C₂- 7ァシルアミド基、同一もしくは異なるトリ -d-6アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が拳げられる。置換基がァセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基 (- CHO:またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、または上記のカルボキシル基もしくはァミノ基は、例えば、本発明に従う配位錯体を形成した後に対応する保護された形態の基または部分から脱保護もしくは転換して生ぜしめ、次いで必要に応じ、適当な抗体もしくはその特異結合性を有する断片（F(ab7)2、 F(ab)、または葉酸、等）を共有結合し、そして該配位錯体に標的指向性を付与しるために利用できる。このような官能基を片末端に有する PEGセグメントは、例えば、 W096/32434、 W096/33233, WO97/06202 に記載のプロック共重合体の PEGセグメント部の製造法によって、都合よく形成できる。

こうして形成される PEGセグメント部分とポリ（carbo)セグメント部分とは、一般式 (A)、（1)、（2)、（1-a)または（2-a)で示されるブロック共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。製造方法は特に限定されるものではないが、一般式（1)、（2)、（1-a)または（2-a)の錯体を製造する場合の一方法として、末端にアミノ基を有する PEG誘導体を用いて、そのアミノ末端から、例えば、 —べンジルー Lーァスパルテートおよび/または γ一べンジルー Lーグルタメートの Ν—力ルボン酸無水物 (NCA)を重合させてプロック共重合体を合成し、その後側鎖ベンジル基を他のエステル基に変換するか、または部分もしくは完全加水分解することにより目的のプロック共重合体を得る方法が挙げられる。この場合共重合体の構造は一般式（1)または（1-a)となり、連結基 Liは用いた PEGセグメントの末端構造に由来する構造となるが、好ましくは - (CH₂)b-NH -表す (ここで、 bは 1〜5の整数である。）。

また、ポリ（カルボン酸）またはポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分を合成してから、予め用意した PEGセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式 (2)または (2-a)に対応する構造となることもあり、連結基 L²は特に限定されるものではないが、好ましくは- (CH₂)，- CO-を表す（ここで、 cは 1〜5 の整数である。 )。

一般式（1)、（2)、（1-a)または（2-a)中の R⁵は、それぞれ独立して水素原子またはカルボキシル基の保護基であることができる。カルボキシル基の保護基としては、限定されるものでないが、ベンジル、ベンズヒドリルまたは Ci.6アルキル基が挙げられ、アルキル基の具体的なものとしては、メチノレ、ェチル、 n—プロピル、 iso—プロピル、 n-ブチル、 sec-プチル、 tert - ブチル、 n -ペンチルおよび n -へキシルを挙げることができる。

R3はそれぞれ独立して水素原子またはァミノ基の保護基、例えばベンジルォキシカノレボニノレ、 t一ブチルォキシカノレポニル、ァセチルまたはトリフルォロアセチル基等であることができ、また、ベンジルカルボニルまたはべンズヒドリルカルボ-ル基等の疎水性基であることができ、また、アタリロイルまたはメタクリルロイル基等の重合性基であることもできる。

R⁴はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基またはカルボキシル基の保護基、例えばベンジルォキシ、 t -ブチルォキシまたはメトキシ基等であることができ、また、ベンジルォキシまたはべンズヒドリルォキシ基等の疎水性基であることができ、また、ァリルォキシまたはビュルフエニルメトキシ基等の重合性基であることもできる。かような重合性基は、本発明に従う、配位錯体からなるポリマーミセルを形成した後、重合させることによりポリマーミセルの構造をより堅牢にすることができる。しかし、本発明の薬物内包ポリマーミセルは、生理学的環境下で、通常、薬物をミセル外に放出する間はミセル構造を維持している場合が多いいので、かような重合反応に付する必要がないことが多い。

mおよび nは、それぞれ 5〜20,000の整数、好ましくは 10〜5,000、特に好ましくは 40〜500、および 2〜5，000、より好ましくは 5〜： 1,000、特に好ましくは 10〜200である。したがって、本明細書では便宜上、ポリ (エチレングリコール）、ポリ（カルボン酸)等と称しているが、「ポリ」の語には、所謂、「オリゴ」の範疇に入るものも包合される概念として用いている。

またポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント、特に、ポリ（ァスパラギン酸）の場合に存在しうる 2種の繰り返し単位の構成割合を規定する、 X は、 0〜5，000の整数（ただし nより大きくない）であることができる。この場合、各繰り返し単位はランダムに分布していることも、ブロック状に分布していることもできる。

本発明の配位錯体は、好ましくは、ジアミノシクロへキサン白金 (II)の白金（Pt)対該プロック共重合体のカルボキシル基（カルボキシルァニオン）の当量比（Pt/COO -)が 0.05以上より好ましくは 0.1以上、特に好ましくは、 0.3〜： 1.0または 1.2である。該当量比の上限は、配位錯体としては、理論上 2.0であることができるが、抗腫瘍剤とするときには本発明の目的に沿う限度において、ジァクオジァミノシクロへキサン白金 (II)錯体を該共重合と配位錯体を形成しているジァミノシク口へキサン白金 (II)錯体の他に、含んでいてもよい。本発明に従う、配位錯体は、例えば、図 1に示されるように、ジァクオジアミノシク口へキサン白金（II)錯体（Diaquo DACH Platin)と、一般式 (A) :

PEG- block-ポリ（carbo) (A)

(式中、 PEGはポリ（エチレンダリコール）セグメントを表し、そして carbo は側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す。）

で示される構造を含んでなるプロック共重合体を、水性溶媒中で、 Diaquo DACH Platin(II)の白金 (Pt)と該ブロック共重合体のカルボキシルァニォンとの結合を形成することのできる、 Pt とカルボキシル基の当量比おょぴ条件下で反応させ、こうして得られるジアミノシク口へキサン白金 (Π)と該共重合体との配位錯体を回収することにより都合よく製造することができる。そして、 Diaquo DACH Platinは、水性溶媒中で、ジクロロ（1, 2— ジァミノシク口へキサン）白金 (Π)と硝酸銀とを反応させ、副生成物である塩化銀を除去して得られる水溶液中に存在する状態のまま、上記の錯体形成反応に付すことができる。ジクロロ（1 ,2-ジァミノシクロへキサン）白金 (II)および Diaquo DACH Platinは既知の化合物である（例えば、非特許文献 5または 2参照）。

反応条件としては、目的の配位錯体が得られる限りいかなる条件を設定してもよいが、 Pt 対カルボキシル基の当量比が、 0.1 以上、好ましくは、 0.3以上となり、そして最大で 1 となるように Diaquo DACH Platinとブ口ック共重合体の使用量を選び、そして両反応体が溶解または一部懸濁している濃度、反応温度 5〜60°Cを選ぶのがよい。上記に言う、水性溶媒とは、水（特に、脱イオン水）または各種無機もしくは有機緩衝剤、ァセトニトリル、ジメチルホルムアミド、エタノール等の水混和有機溶媒を、上記の錯体形成反応に悪影響を及ぼさない範囲で含んでいてもよい溶媒を意味する。生成した配位錯体は、通常、水性溶媒中で可溶化したポリマーミセル (通常、 20ηη！〜 500nmの平均粒径を有する。動的光散乱法により測定した場合）であるので、ポリマーミセルを単離、精製する常法により、反応混合物から回収することができる。この方法の典型的なものとしては、限外濾過法、ダイァフィルトレーシヨン、透析方法が挙げられる。

こうして単離、精製された DACH Platin内包ポリマーミセル溶液は、そのまま滅菌処理、必要により、注射剤として適するそれ自体既知の助剤を添加して、注射剤としてもよく、また、ポリマーミセル溶液を濃縮後、例えば、凍結乾燥して、固体状の微小粉体としてもよい。該微小粉体は、再度、注射可能な溶液中にかなり高濃度で溶解でき、しかも、本発明に従う DACH Platin 内包ポリマーミセルは、例えば、ォキザリブラチン (oxaliplatin)に比べても、極めて安全性が高く、ボーラス注入するための医薬製剤とすることもできる。前記微小粉体は、製薬学的に許容される、状されているキヤリヤーと配合して、各種の投与形式に適合する剤形に加ェすることができる。かようなキヤリヤーの代表例は、脱イオン水、一定の p Hに緩衝化された水溶液、オリゴもしくはポリエチレンダリコール、単糖もしくはオリゴ糖、糖アルコール、等であることができる。しかし、好ましくは、非経口的投与、特に静脈内もしくは皮下投与に適する剤形の組成物として提供する。

例えば静脈内投与をする場合の用量は、実験動物またはボランティァによる小実験を行い、それらの結果を考慮して、さらには患者の状態を考慮して専門医が決定するのが好ましい。しかし、限定されるものでないが、一般に、 1 日 1回 1 . 0〜 1 0 0 0 m g / m ² (患者の体表面積）であることができ、また、 1 0〜 2 0 0 m g Z m ² (患者の体表面積）を 1 日 1回数日間連続投与し、一定期間休薬するか、または、 5 0〜 5 0 0 m g Z m ² (患者の体表面積）を 1 日 1 回投与した後、数日間休薬する等、投与スケジュールにより、適当な用量を選ぶことができる。

本発明の配位錯体は、ジクロロ（1,2 -ジァミノシク口へキサン）白金（11)、 Diaquo DACH Platinまたはォキザリブラチン（oxaliplatin)と同様の抗腫瘍活性スぺクトルを有する。こうして、本発明は、上記の配位錯体を有効成分とする坑腫瘍剤も提供する。

本発明によれば、本発明に従う、 DACH Platin内包ポリマーミセルまたは DACH Platin と共重合体の錯体が有効である限り限定されないが、例えば、抗癌腫瘍、膀胱癌、腎孟 ·尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、胞肺癌、食道癌、子宮頸癌、神経芽細胞腫、胃癌、および直腸癌を挙げることができる。

本発明に従う DACH Platin内包ポリマーミセルまたは錯体は、他の抗腫瘍剤または抗癌剤と組み合わせて使用できる。これらの杭腫瘍剤としては、組み合わせ使用により悪影響が生じないものであるなら、如何なる薬剤であってもよいが、例えば、シタラビン、 5— F U、ドキソルビシン、タキソール、カルポプラチン、シスプラチン等であることができる。しかし、特に好ましいのは、上述した、 WO02/26241A1に記載されたシスプラチン内包ポリマーミセル（または共重合体とシスブラチンの錯体）、具体的には、抗腫瘍有効成分として、シスブラチンと、一般式（1-a)または (2-a) ：

R¹O- CH CH₂O — L -f

R¹0~ CH₂CH。O L²— NHCHCO^ R (CH₂)₂

(2-a)

c=o

I

OR⁵

(上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci- 12アルキル基を表し、 Li、 L²は連結基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20,000の整数であり、 nは 2〜5，000の整数であり、伹し、 n個の R5中、アルカリ金属のィオンが 5 0 %以上を占める）

で示されるブロック共重合体とのシスブラチンの配位錯体またはその薬剤内包ポリマーミセルを、上記の DACH Platin内包ポリマーミセルまたは DACH Platinと共重合体の錯体と組み合わせて使用するものが挙げられる。これらの組み合わせ比は、限定されないが、好ましくは、 DACH Platin 内包ポリマーミセル（またはジァミノシクロへキサン白金 (II)の配位錯体）と該シスブラチンの配位錯体の比が、白金の重量を基準にして、 1 Z 3〜 3ノ 1である力、特に、 1 ：！〜 3 1が好ましい。

これらの組み合わせは、組み合わされる 2種以上の薬剤を同時もしくは時間を異にして、同一もしくは異なる投与経路にて患者に投与することができる。上記の DACH Platin内包ポリマーミセルと該シスブラチンの配位錯体の組み合わせは、一の製剤に組み合わせて都合よく、そして効果的に使用することができる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明に従う、配位錯体およびそのポリマーミセルの概念図である。

図 2は、 DACHPtミセル（黒塗り四角）と CDDP ミセル（三角）の相対的散乱光強度変化を示すグラフである。

図 3は、 10mMPBS(pH7.4)に 150mMNaCl添加した溶液中の DACHPt ミセル（黒塗り四角）および CDDP ミセル（三角）からの白金の放出挙動を示すグラフである。

図 4は、血漿 (a)、各種器官（具体的には、腫瘍 (b)、腎臓 (c)および肝臓

(d)) への薬物、 DACHPtミセル（黒塗り四角）およびフリ一の CDDP (白抜き四角）の集積性を表すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を、特定の例によりさらに具体的に説明するが、本発明をこれらに限定することを意図するものでない。実施例 1：ポリマーミセルの生成

本実施例で使用するプロック共重合体の構造式は次のとおりである。

CH₃O-f CH₂CH₂O ^-CH₂CH₂NH— ( COCHNH-^-H

(CH₂)₂

COOH

(l.a.) 19mg のジクロ口（1，2—ジアミノシク口へキサン）白金 (II)(dichloro-DACHPt)を 10mlの蒸留水に懸濁し、 12.3mgの硝酸銀と混合した（[AgNO₃]/[dichloro-DACHPt]のモル比 = 1.5)。混合液を、暗所で 24 時間、 25°Cに保持した。反応後に塩化銀の沈殿が析出した。次いで、反応混合物を 3000rpmで 5分間遠心して塩化銀の沈殿を除去した。こうして得られる Diaquo DACH Pt含有上澄液を、 0.22μπιのフィルターを通して精製した。

(l.b.) ポリ（エチレングリコール）セグメントの分子量が約 12,000 になるような m値を有し nが約 35である上記の構造式で表されるブロック共重合体（以下、 PEG-P(Glu) 12-35 という） 24.4mg を、上記の（l.a.)で得られた精製上澄液 10mlに加えた（「Diaquo-DACHPt」 Z [Glu]のモル比: =1)。こうして得られた溶液を、 37°Cで 120時間撹搾した。溶液を透析バッグ〔分子量カツトオフ（MWCO)二 1000〕に入れ、蒸留水に対して 24時間透析した。透析バッグ (膜)外の水は、透析開始後、 30 分、 1 時間、 2 時間、 3 時間、 4時間、 6時間および 12時間目に交換した。透析された溶液を、フィルター（MWCO=100,000)を用いて限外ろ過した。

実施例 2:ポリマーミセルの特性

(2. a.) 10mM PBS 中での安定性

実施例 1 に従って得られたポリマーミセル（以下、 DACHPt ミセルという）の安定性を、上記に用いたのと同一のプロック共重合体を用いて、上記の WO02/26241A1の実施例 1に記載のとおりに生成したシスプラチン内包ポリマーミセル（以下、 CDDPミセルとレ、う。）の安定性と比較した。

CDDPミセルは、要約すると、次のように調製した：

水中にシスプラチン（C D D P ) を溶解させた（S m niolZ l この溶液に上記の実施例 1 で用いたのと同じプロック共重合体を溶解させ（[ C D D P ] / [共重合体の G 1 u ] = 1 . 0 )。 3 7 °Cで 73時間反応させた。得られた溶液を限外濾過（MWCO=100,000) を繰り返して精製した。動的光散乱. ( D L S ) の測定によりポリマーミセルが形成されていることを確認した。

まず、特定体積のミセル溶液を凍結乾燥し、次いで残渣を秤量することによりミセル濃度を決定した。 DACHPt ミセル溶液および CDDP ミセル溶液を、それぞれ 10mM PBS(pH7.4)に 150mM NaCl添加した溶液と混合し、 1 . 5mg/mlのミセル濃厚液を得た。これらの液を、暗所で 37°Cにて保持した。両液を，それぞれサンプリングし、次いで、動的光散乱 (SLS)法で測定した。測定を 25°Cで行い、 90°の角度の検出を行った。これらの液は、 0.45μιηのフィルターを通して精製した。

安定性ァッセィの結果：

相対的散乱光強度変化、即ち、初期の散乱光強度から特定時点での散乱光強度を図 2に示す。図 2から、 CDDP ミセルは約 50時間以内に解離するのに対し、 DACHPtミセルは 250時間まで安定であることが分かる。

(2.b.) ミセルからの白金の放出

異なる温度における、 10mM PBS(pH7.4)に 150mM NaCl添加した溶液中の DACHPtミセルおよび CDDPミセルからの白金の放出を透析法 (膜の MWCO = 1，000)により評価した。硝酸銀を用いる dichloro-DACHPtの予備処理をジメチルホルムアミド (DMF)中および水中の両方で行い、上記の (l.b.) の方法に従い、 2種の DACHPtミセルを調製した。透析バッグの外液を特定の時間間隔でサンプリングし、白金の濃度を誘導プラズマ質量分析装置 (ICP-MS)で測定した。

結果:

放出の結果を図 3に示す。放出された白金は、 CDDP ミセルと DMF中で予備処理した場合の DACHPt ミセルとは同様であった。水中で予備処理された場合の DACHPtミセルは僅かに高い白金の放出を示した。また、 DACHPtミセルは CDDPミセルと比較して 1 5 0 mM NaCl中で高い安定性を有するにも拘らず、 CDDPミセルと同様な白金リリース速度を示した。 (2.c.) in vitroの細胞毒性

マウス結腸 26(C-26)細胞株に対する、遊離の CDDP、 CDDP ミセル、 DACHPt ミセル、異なる混合割合（1 " 3、 1/ 1 および 3/ 1)における DACHPt ミセルと CDDP ミセルの増殖阻害活性を、 MTT法で評価した。 5000個の細胞を、 96穴のマルチプレート中の 10%ゥシ胎仔血清含有 RPMI 1640培地 50 μ 1において培養した。 48時間および 72時間薬剤に細胞をさらした。 ΜΤΤ溶液を加え、 6時間後に 0.01M HC1を添加した 10重量％ドデシル硫酸ナトリゥム（SDS)含有溶液 150 μ 1 を加えた。次いで、 24時間後の 570nm における生成されたホルマザンの吸光度により細胞の生存度を測定した。これらの結果から、 50%阻害濃度 (IC₅₀)を決定した結果を表 1.にまとめる。表 1

表より、 DACHPt ミセルは CDDP ミセルより約 10倍高い細胞毒性 (抗腫瘍性）を示すことが分かる。また、ミセルの組み合わせは、細胞毒性を増大させる。

(2.d.) 生体内分布

Balb/cマウス（n=3、雌、 6週令、 20'25g)に、右側腹部から C-26細胞（1 X 10⁶)を皮下接種した。遊離の CDDPおよび DACHPt ミセノレ (各薬物 100 μ g)を尻尾の静脈から注入した。腫瘍接種後 21 目目にマウスを犠牲にした。 1、 4、 24 時間目に、腫瘍、肝臓、腎臓、を切除し、そして同時に血液を集め、へパリン化した。遠心で血液から血漿を分離し、温硝酸に溶解した。器官を秤量し，温硝酸に溶解した。溶液を乾燥した。塩酸を加えた直後に ICP-MSで白金の量を測定した。結果を図 4に示す。得られた結果から、 DACHPt ミセルは血流中を長期滞留し、正常組織に特異な集積を示すことなく、固形がんに効果的に集積することが分かる。

産業上の利用可能性

本発明の配位錯体は、ヒトの腫瘍の化学療法において安全に使用でき、しかも高い抗腫瘍活性を有するので、医療業、医薬製造業等で利用できる。

Claims

請求の範囲

1 . ジアミノシクロへキサン白金 (II)と、一般式 (A) :

PEG- block—ポリ（carbo) (A)

で示される構造を含んでなるプロック共重合体との配位錯体であって、 carbo のカルボキシルァユオンと白金との結合を介してジァミノシク口へキサン白金 (II)が該ブロック共重合体に固定化されている配位錯体。

2 . ポリ（carbo)が、ポリ（ダルタミン酸）、ポリ（ァスパラギン酸）、ポリ（ァクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）からなる群より選ばれるポリマー鎖由来である請求項 1に記載の配位錯体。

3 . ブロック共重合体が、下記一般式（1)または（2)またはそれらの塩である請求項 1記載の配位錯体：

上式中、 R¹は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci- i2アルキル基を表し、 Ι L²は連結基を表し、 R²はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20,000の整数であり、 nは 2〜5，000の整数であり、但し、 Xは 0〜5,000の整数であるが、 Xは nより大きくなく、そして n-xおよび X個の R⁵中、水素原子またはアル力リ金属のイオンが 50% 以上を占める。

4 . プロック共重合体の構造が、下記一般式（1-a)または（2-a)で表される請求項 1記載の配位錯体：

R¹O- CH₂CH₂Oi— L¹ -f COCHNH-^ R^

(CH₂)₂

(1-a)

C=O

I

OR⁵

RiO-( C^C^O^L²— ( NHCHCOf

(CH₂)₂

(2-a)

c=o

I

OR⁵ 上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の d- アルキル基を表し、 L L²は連結基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20,000の整数であり、 nは 2〜5,000の整数であり、但し、 n個の R5中、アルカリ金属のィオンが 5 0 %以上を占める。

5 . —般式（1-a)または（2-a)における R⁵の全てが水素原子又はアルカリ金属イオンを表す請求項 4に記載の配位錯体。

6 . Liがー (CH₂)_b- NH -であり、 b 力 S 1〜5 の整数であり、そして L2が - (CH₂) CO-であり、 cが 1〜5の整数である、請求項 5に記載の配位錯体。

7 . 錯体が、ポリ（エチレングリコール）セグメントをシェルとし、側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位からなるセグメントをコアとするナノ粒子にジァミノシク口へキサン白金（II)が内包された形態にある、請求項 1に記載の配位錯体。 .

8 .ジァミノシク口へキサン白金（II)の白金（Pt)対該プロック共重合体のカルボキシル基の当量比（Pt/COO -）が 0.3〜 1である請求項 1 に記載の配位錯体。

9 . ジアミノシクロへキサン白金 (II)と、一般式（1-a)または（2-a):

(1-a)

R¹O~( CH₂CH₂O L²— f NHCHCO-¾— (CH₂)₂

(2-a)

c=o

I

OR⁵

(上式中、 R¹は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci-₁₂アルキル基を表し、 Li、 L²は連結基を表し、 R³は水素原子'、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20，000の整数であり、 ηは 2〜5,000の整数であり、但し、 η個の R5中、アルカリ金属のィオンが 5 0 %以上を占める）で示される構造を含んでなるプロック共重合体との配位錯体であって、 carbo のカルボキシルァニオンと白金との結合を介してジァミノシクロへキサン白金（II)が該プロック共重合体に固定化されており、ジァミノシク口へキサン白金（II)の白金（Pt)対該ブロック共重合体のカルボキシル基の当量比（Pt/COO-)が 0.3〜 1である配位錯体。

1 0 . ジァクオジァミノシクロへキサン白金（II)錯体（Diaquo DACH Platin)と、一般式 (A):

PEG— block—ポリ（carbo) (A)

(式中、 PEGはポリ（エチレンダリコール)セグメントを表し、そして carbo は側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す。）

で示される構造を含んでなるプロック共重合体を、水性溶媒中で、 Diaquo DACH Platin(II)の白金 (Pt)と該ブロック共重合体のカルボキシルァニォンとの結合形成することのできる、該 Pt 対該カルボキシル基の当量比及ぴ条件下で反応させ、こうして得られるジアミノシク口へキサン白金 (II) と該共重合体との配位錯体を回収することを特徴とする請求項 1に記載の配位錯体の製造方法。

1 1 . Diaquo DACH Platinが、水性溶媒中で、ジクロロ（1,2—ジァミノシク口へキサン）白金 (II)と硝酸銀とを反応させ、副生成物である塩化銀を除去して得られる水溶液中に存在するものである、請求項 9に記載の製造方法。

1 2 . Ptとカルボキシル基の当量比が、 0. 1以上であり、そして反応温度 5〜60°Cである、請求項 1 0に記載の製造方法。

1 3 . プロック共重合体の構造が、下記一般式（1-a)または（2-a)で表される請求項 1 0に記載の製造方法：

R 0- CH₂CH₂〇t丄¹ t COCHNH — ' (CH₂)₂

(1-a)

c=o

I

OR⁵

上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci-i₂アルキル基を表し、 Li、 L²は連結基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20,000の整数であり、 nは 2〜5,000の整数であり、但し、 n個の R5中、アルカリ金属のィオンが 5 0。/。以上を占める。

1 4 . ジアミノシクロへキサン白金 (II)と、一般式 (A):

PEG- block-ポリ（carbo) (A)

(式中、 PEGはポリ（エチレングリコール）セグメントを表し、そして carbo は側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位を表す。）

で示される構造を含んでなるプロック共重合体との配位錯体であって、 carbo のカルボキシルァニオンと白金との結合を介してジァミノシク口へキサン白金 (II)が該ブロック共重合体に固定化されている配位錯体の抗腫瘍有効量と製薬学的に許容されるキヤリヤーを含んでなる坑腫瘍性組成物。

1 5 . プロック共重合体が、下記一般式（1)または（2)またはそれらの塩である請求項 1 4記載の抗腫瘍性組成物：

上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci-i₂アルキル基を表し、 Ι L²は連結基を表し、 R²はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アル力リ金属のイオンまたは力ルポキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20,000 の整数であり、 nは 2〜5，000 の整数であり、伹し、 Xは 0〜5,000の整数であるが、 Xは nより大きくなく、そして n-xおよび X個の R⁵中、水素原子またはアル力リ金属のイオンが 50% 以上を占める。

1 6 . さらに、抗腫瘍有効成分として、シスブラチンと、一般式（1-a) または（2-a) ：

R¹0-f CH₂CH₂0 — L¹ COCHNH^—

(CH₂)₂

(1-a)

C=O

i

OR⁵

R¹0-( CH₂CH₂0 ^L²— ( NHCHCO^-

(CH₂)₂

(2-a)

C=O

I

OR⁵

(上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci-i₂アルキル基を表し、 Ι L²は連結基を表し、 ' R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵はそれぞれ独立して水素原子、アルカリ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20，000の整数であり、 nは 2〜5, 000の整数であり、伹し、 n個の： R5中、アルカリ金属のィオンが 5 0 %以上を占める）

で示されるプロック共重合体とのシスブラチンの配位錯体が組み合わされた、請求項 1 4に記載の抗腫瘍性組成物。

1 7 . ジアミノシクロへキサン白金 (II)の配位錯体とシスプラチンの配位錯体の比が、白金の重量を基準にして、 1 / 3〜 3 Z 1で組み合わされる請求項 1 6に記載の抗腫瘍性組成物。

1 8 . ジアミノシクロへキサン白金 (II)と、一般式（1)または（2)：

(上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝の Ci- 12アルキル基を表し、 Li、 L²は連結基を表し、 R²はメチレン基またはエチレン基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、 R⁵ はそれぞれ独立して水素原子、アル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20，000の整数であり、 nは 2〜5,000の整数であり、但し、 Xは 0〜5, 000の整数であるが、 Xは nより大きくなく、そして n-xおよび X個の R⁵中、水素原子またはアル力リ金属のイオンが 50% 以上を占める）

で示されるプロック共重合体とのジァミノシク口へキサン白金（II)の配位錯体とシスブラチンおよび一般式（1-a) または（2-a)

R¹0-( CH H₂0 — L¹ COCHNH" (CH₂)₂

(1-a)

c=o

I

OR⁵

R¹O~( CH₂CH₂0¾ ~L²~t NHCHCO ~

(CH₂)₂

(2-a)

c=o

I

OR⁵

(上式中、 Riは水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のアルキル基を表し、 Li、 L²は連結基を表し、 R³は水素原子、ァミノ基の保護基、疎水性基または重合性基を表し、 R⁴はヒドロキシル基または開始剤残基を表し、はそれぞれ独立して水素原子、 'アル力リ金属のイオンまたはカルボキシル基の保護基を表し、 mは 5〜20，000の整数であり、 nは 2〜5,000の整数であり、但し、 n個の R5中、アルカリ金属のィオンが 5 0 %以上を占める）

で示されるブロック共重合体のシスプラチンの配位錯体の組み合わせの抗腫瘍有効量を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、腫瘍の治療方法。

1 9 . ジアミノシク口へキサン白金（II)の配位錯体とシスプラチンの配位錯体の投与比率が、白金の重量を基準にして、 1 / 3〜 3ノ 1の範囲内にある請求項 1 8に記載の治療方法。

2 0 . 腫瘍が、抗癌腫瘍、膀胱癌、腎孟 ·尿管腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、胞肺癌、食道癌、子宮頸癌、神経芽細胞腫、胃癌、および直腸癌からなる群より選ばれる請求項 1 8に記載の腫瘍の治療方法。