WO2006111641A2 - Dispositif et procede d'analyse multiparametrique d'elements microscopiques - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to the field of the analysis of microscopic elements, and more particularly the devices dedicated to the characterization and counting of microscopic elements by means of a light.
  • microscopic elements is understood to mean any element of microscopic dimensions, and in particular particles or biological cells (prokaryotes and eukaryotes).
  • diffusion which include transmission, diffraction, reflection and refraction, and those called photoluminescence that combine fluorescence and phosphorescence. They allow separately or in combination to obtain particular information on shape, volume, size, color, density, structure, biochemical nature, or granularity.
  • Characterizations of biological elements mainly blood cells, obtained with current flow cytometry techniques, are nevertheless based on a limited number of variables and possibilities of cell discrimination.
  • This detection mode is for example described in US Pat. No. 4,735,504 by TECHNICON Instruments Corp.
  • the optical system described in this patent uses diffracted light measurements in two different angle ranges, which makes it possible to separate the volume and refractive index values of the elements by comparing their optical responses with those of calibrated elements in volume and refractive index.
  • the processing of these data is based on the theory of light scattering by a spherical particle developed by Gustav MIE, and described in particular at the Internet address "http://en.wikipedia.org/wiki/Mie scattering".
  • fluorescence is a phenomenon induced during the return to the ground state of a molecule excitable and excited by a light energy at a wavelength of its own.
  • the emission of fluorescence light is always at a frequency lower than that of excitation.
  • the fluorescence emission is substantially isotropic.
  • the measurement is generally carried out outside the axis of excitation of the incident light and through an optical filter transmitting only the spectral band of interest to the detector.
  • Molecular probes used in fluorescence may be vital or supravital dyes having intrinsic affinity for a particular type of molecule.
  • intercalating dyes of nucleic acids such as orange thiazole, auramine O, pyronine Y or the like can be thought of, or to immunological probes composed of an antibody on which is hung a dye marker, usually a fluorochrome alone or in tandem or sometimes a nano crystal.
  • a correction method called “compensation” generally consists of reducing the fluorescence signal of the microscopic element analyzed by the proportional part of spectral overlap ( s) microscopic element (s), as indicated in the document "Spectral Compensation for Flow Cytometry: Visualization Artifacts, Limitations and Caveats, "Mario Roederer 2001, Cytometry 45, pp. 194-205.
  • excitation wavelengths make it possible to open a wider choice of dyes and makes it easier to separate the emission spectra.
  • the different excitation wavelengths are frequently spatially separated in the measuring vessel, which in this case offers the advantage of several independent measurements as described in the article by J. Steinkamp. Improved multilaser / multiparameter for cytometer for analysis and sorting John A. Steinkamp, Robert C. Habbersett, and Richard D. Hiebert; Review of Scientific Instruments Vol 62 (11) pp. 2751-2764, November 1991.
  • the problem of this method lies in the fact that the spatial shift induces a temporal phase shift of the responses and that the registration of the information must be done downstream, either by delaying the information analogically or by recalibrating measurements using software.
  • excitation wavelengths in particular laser sources
  • fluorescence measurements and other optical parameters brings a technological complexity and an important implementation difficulty, as for example described in FIG. article entitled “Nine Color Eleven Parameter Immunophenotyping Using Three Laser Flow Cytometry", Martin Bigos 1999, Cytometry 36, pp. 36-45.
  • the level of risk of error in the interpretation of results increases with the number of parameters and the use of these devices is reserved for highly specialized technicians at the risk of obtaining unsuitable and false results, and therefore potentially dangerous.
  • a limitation of compensation whose level of criticality increases with the number of fluorochromes, concerns the propagation and the amplification of the noise of the fluorescence measurements and their linear combinations which serve to correct the raw measurements.
  • the object of the invention is therefore to improve the situation.
  • the invention is intended to overcome the compensation problems generally encountered in the prior art.
  • the invention proposes a device for analyzing microscopic elements, comprising:
  • a first part a measurement space for microscopic elements to be analyzed
  • a second part at least one source delivering radiation having at least two different analysis wavelengths and intended to interact with the microscopic elements in the measurement space to form interaction radiation
  • interaction radiation the radiation resulting from the interaction between the analysis beam and the microscopic elements analyzed.
  • interaction radiations can be in particular diffusion radiations (refraction, reflection, diffraction) and / or photoluminescence (fluorescence, phosphorescence).
  • radiation here means a light of wavelength between the ultraviolet and the infrared, that is to say between about 100 nm (0.1 ⁇ m) and about 5000 nm ( 5 ⁇ m).
  • its coded radiations are conjugated at the level of the measurement space, it comprises i) coding means responsible for coding the radiation upstream of the measurement space with different codes, and ii) optical filtering means for selectively filtering the fluorescence interaction radiation and / or of diffusion according to their wavelength, upstream of the detection means, and - that its analysis means comprise decoding means responsible for decoding the electrical signals so that they are analyzed according to their coding code. 'origin.
  • coding the action of applying a code ( ⁇ i) to an analysis radiation (Ri) before its interaction with the microscopic elements, in order to generate the interaction radiation which itself comprises the original code.
  • the codes ( ⁇ i) may be chosen so as to apply a pulse modulation to each analysis radiation.
  • pulses can be synchronous or asynchronous.
  • all the wavelengths interact simultaneously with the microscopic elements analyzed.
  • the wavelengths interact sequentially with the microscopic elements to be analyzed.
  • the optical filtering means are arranged, for a given family of fluorochromes and for a given type of coding, so as to avoid that compensations are made.
  • the device according to the invention may comprise additional characteristics that can be taken separately or in combination, and in particular:
  • optical filtering means can be charged with selectively filtering the fluorescence-type interaction radiation whose wavelengths belong to fluorescence analysis bands interposed between two analysis wavelengths and placed respectively. ) beyond the largest analysis wavelength;
  • Its coding means may be responsible for periodically and / or sinusoidally encoding the analysis radiations
  • At least part of its coding means can act at the source upstream of a radiation distribution output. This part can be integrated into the source; At least part of its coding means can act on the radiation downstream of the source in order to constitute the analysis radiations; Its coding means can modulate in intensity the radiation delivered by the source, for example by means of an acousto-optic modulator, in order to constitute the analysis radiations;
  • the source may comprise at least two coupled lasers, possibly of the monochrome type, and / or at least one light-emitting diode, whose analysis radiations are conjugated at the level of the measurement space.
  • the source may comprise a substantially continuous polychromatic light source, such as a polychromatic laser, an incandescent lamp, or an arc lamp;
  • the source can deliver the analysis radiation in a continuous mode and / or a pulse mode
  • the intensity of each analysis radiation delivered by the source can be parameterizable
  • Its detection means may comprise a multiplicity of photosensitive sensors dedicated to the detection of interaction radiation (representative of diffusion (s) and of fluorescence (s)) induced by the analysis radiations on the microscopic elements to be analyzed.
  • the detection means may comprise a multiplicity of photosensitive sensors dedicated to the detection of interaction radiations representative of difrusion (s) and implanted in a location defined by an axis intercepting the general direction of propagation of the analysis radiations.
  • Its analysis means can make it possible to deduce the refractive index of a type of microscopic elements analyzed from the signals resulting from the transformation of the interaction radiations representative of a diffusion.
  • the means of analysis may make it possible, in particular, to determine the intra-erythrocyte hemoglobin content or the mtracytoplasmic protein content of the leucocytes;
  • Its analysis means can make it possible to deduce signals resulting from the interaction between the analysis radiations and two photoluminescent agents (or fluorochromes) at different wavelengths, a degree of coupling representative of the transfer of energy between both photoluminescent agents.
  • the invention also proposes a method for analyzing microscopic elements, comprising: A first step in which microscopic elements placed at a measurement space are illuminated by means of conjugated analysis radiations at the measurement space and having at least two different analysis wavelengths and encodings according to different codes chosen, so as to form interaction radiation, • a second step in which at least a portion of the interaction radiation is collected, then separated and filtered according to their wavelength ,
  • the method according to the invention may comprise additional characteristics that can be taken separately or in combination, and in particular: in the first step, the analysis radiations can be applied sequentially or simultaneously to the microscopic elements to be analyzed;
  • the first step it is also possible to perform a sinusoidal modulation of the intensity of the analysis radiations
  • the fluorescence-type interaction radiation whose wavelengths belong to fluorescence analysis bands interposed between two analysis wavelengths and placed on the other side can be filtered selectively. beyond the largest analysis wavelength;
  • the fourth step it is possible to deduce the refractive index of a type of microscopic elements analyzed, the signals resulting from the transformation of the interaction radiations representative of a diffusion.
  • the microscopic elements belong to a blood sample, it is possible to determine, in particular, the intra-erythrocyte hemoglobin content or the intracytoplasmic protein content of the leucocytes;
  • the fourth step it is possible to deduce from the signals resulting from the interaction between the analysis radiations and two photoluminescent agents (fluorochromes) at different wavelengths, a degree of coupling representative of the energy transfer between the two agents photoluminescent.
  • the invention is particularly well suited, although in a non-limiting manner, to the field of in vitro diagnostics (especially flow cytometry), and to the analysis of any microscopic element in a fluid. It applies in particular to biological, biochemical, chemical, particulate, morphological analysis, and in particular multiparametric flow cytometry, the analysis of charged particles in a liquid or gaseous fluid, and particle size.
  • FIG. 1A schematically and functionally illustrates a first exemplary embodiment of an optical analysis device according to the invention
  • FIG. 1B schematically and functionally illustrates a second embodiment of an analysis device.
  • optical device according to the invention in which several sources are capable of generating radiation intended to be conjugated at the level of the measurement space (CM),
  • FIG. 2A illustrates an example of sinusoidal coding, with simultaneous lighting, which can be applied to light radiation
  • FIG. 2B illustrates an example of sequential binary coding
  • FIG. 2C shows the appearance of the signals of the binary coding of FIG. 2B, repeated periodically
  • FIG. 3 is a diagram illustrating three absorption spectra of fluorochromes (SA1 to SA3) corresponding to three analysis wavelengths ( ⁇ 1 to ⁇ 3), and three fluorescence spectra of these same fluorochromes (SF1 to SF3). ,
  • FIG. 4 schematically illustrates an exemplary embodiment of the part of the analysis device situated upstream of the measuring vessel, in which the modulator is of the acousto-optical type
  • FIG. 5 schematically illustrates an exemplary embodiment of the part of the analysis device situated downstream of the measurement vessel and dedicated to the detection and analysis of the fluorescence
  • FIG. 6 is a diagram of isovolume and isoconcentration curves making it possible to determine the volume and the concentration of corpuscular hemoglobin as a function of scattering cross sections C ext at the analysis wavelengths of 488 nm and 976 nm.
  • FIGS. 1A and 1B describe two exemplary embodiments of optical analysis device DA, according to the invention.
  • the device DA is dedicated to the characterization and counting in flow cytometry of the microscopic elements in a blood sample.
  • the invention is limited neither to this type of sample nor to flow cytometry. It concerns in fact any type of sample comprising microscopic elements to be analyzed optically by fluorescence and / or by light scattering, and in particular particles in a fluid or biological samples.
  • an analysis device DA comprises at least:
  • CM a measurement space CM, sometimes called a measurement vessel (or measuring zone, or measuring window) at which the microscopic elements of the sample to be analyzed are located (or pass),
  • Optical filtering means FO for selectively filtering the interaction radiation coming from the measurement space CM, after possibly interacting with the microscopic elements, and whose wavelengths preferably belong to bands of fluorescence analysis Bi which are each interspersed between two wavelengths of analysis ⁇ i and ⁇ i + 1, with the exception of the last one (which has the longest wavelengths) which is placed beyond the length sn analysis wave which is the largest,
  • Detection means DF and / or DE comprising photosensitive sensors (or photosensors) responsible for converting into electrical signals at least part of the fluorescence interaction and / or scattering radiation coming from the measurement space after having possibly interacted with the microscopic elements
  • MA analysis means comprising at least DRF and / or DRE decoding means responsible for decoding the electrical signals transmitted to it by the detection means DF and / or DE, so that they are analyzed according to their code ⁇ i so as to allow the determination of the representative data of the microscopic elements analyzed.
  • optical optical filtering means FO associated with the detection means dedicated to the fluorescence DF with the associated means of decoding DRF, but no detection means dedicated to the diffusion DE and the associated decoding means DRE; optical filter FO, associated with the detection means dedicated to the fluorescence DF with the associated means of decoding DRF, and optical filtering means FO, associated with the detection means dedicated to the diffusion DE and the associated decoding means DRE,
  • the analysis device DA When the analysis device DA is dedicated to flow cytometry or counting, its measurement vessel CM (or measuring space) may be of the type called "flux-capped", such as that described in the patent document. FR 2653885.
  • the source S is responsible for generating a single light beam consisting of the superposition of n rays Ri of respective wavelengths ⁇ 1 to ⁇ n, with n> 2.
  • each of the three sources S is responsible for generating a single light beam consisting of a radiation R 1 (R 1, R 2 or R 3) of wavelength ⁇ i ( ⁇ 1 ⁇ 2 or ⁇ 3).
  • the intensity of each radiation, noted Ij can be adjusted to a predetermined value. This allows, for example, to place at a predetermined level the fluorescence intensity of a family of fluorochromes (or fluorescent compounds) excited by the analysis radiation Ri of wavelength ⁇ i and intensity Ij.
  • fluorochromes for which the quantum yield of fluorescence is very high (this is for example the case of certain molecular probes such as orange thiazole).
  • fluorochromes of identical quantum yields are simultaneously used to label antigens expressed differently on the same cell, the fluorescence levels emitted by the various fluorochromes can be approximately equalized by varying the intensities of their respective analysis radiations.
  • the source S is also called optical "synthesizer-equalizer”.
  • Each of the n radiations Ri of intensity I can also be encoded periodically and / or sinusoidally intensity by the coding means to which we will return later.
  • This coding which is for example of the type illustrated in FIGS. 2A to 2C, is decisive because it allows, thanks to the DRF and / or DRE decoding means, the demultiplexing of the radiation resulting from the interaction with the microscopic elements analyzed. (in particular fluorescence and / or diffusion mechanisms).
  • the coding can be performed by acting on the injection current, the modulator M then being an electrical generator capable of delivering currents. electrical images of the codes applied to each of the radiations.
  • the coding is of sinusoidal type, the coding consists in particular of setting modulation frequencies ⁇ i which are a function of various experimental considerations which will be specified below.
  • n rays Ri of wavelengths ⁇ i selected and intensity I j possibly chosen and conjugated in the measurement space there are n rays Ri of wavelengths ⁇ i selected and intensity I j possibly chosen and conjugated in the measurement space.
  • the expression of the luminous intensity Ij (in W / m 2 ) is given by the relation Al of the appendix.
  • the beam or beams of n rays is (are) focused (s) by unrepresented optical means, inside the measurement (or counting) space where they interact with the microscopic element (here a cell biological) previously marked and / or colored according to any technique known to those skilled in the art.
  • FIG. 3 shows three absorption spectra SA1 to SA3 of three fictitious fluorochromes corresponding to three analysis wavelengths ⁇ 1 to ⁇ 3, and the three SF1 to SF3 fluorescence spectra of the same three fluorochromes that are detected. by the DF fluorescence detection means.
  • the references B1 to B3 denote the three wavelength bands that the optical filtering means FO pass through.
  • fluorochromes of different types is here limited to three in order to facilitate the description. But, the invention is not limited to this number. It concerns indeed any number of fluorochromes.
  • the band B1 which corresponds to the maximum of the fluorescence spectrum SF1 of the first fluorochrome, is interposed between the analysis wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2, the band B2, which corresponds to the maximum of the fluorescence spectrum SF2 of the second fluorochrome, is interposed between the analysis wavelengths ⁇ 2 and ⁇ 3, and the band B3, which corresponds to the maximum of the fluorescence spectrum SF3 of the third fluorochrome, is placed beyond the analysis wavelength ⁇ 3 (which is the larger of the three).
  • each band Bi corresponds to a fluorescence detector DFi.
  • [C], [D] and [E] are here the transfer matrices for calculating the fluorescence lights.
  • This characteristic may for example be the peak amplitude or the effective value of the signal over a time interval limited by the duration of the analysis light pulse or a temporal characteristic of the signal such as the decay time of a signal. fluorescence light.
  • the direct determination of the molar concentrations Qi of the fluorochromes, without going through a linear combination of the measurements, increases the precision of the results and thus the precision of the diagnosis.
  • the invention can also make it possible to determine the degree of coupling between two fluorochromes (or fluorescent compounds) which corresponds to the energy transfer (by fluorescence) between a "donor" fluorochrome and an "acceptor” fluorochrome. This determination of the coupling between two fluorochromes can make it possible for example to measure the distance between epitopes or their physical association.
  • the molar concentration Q1 in the presence of a transfer of energy between the two first fluorochromes can then be reformulated as indicated by the relation Al 8 of the appendix.
  • the molar concentrations Q2 and Q3 in the presence of a transfer of energy between the two first fluorochromes are then given by the relations A6 and A7 of the appendix.
  • FIG. 4 shows an upstream part of an analysis device DA according to the invention, in which the source S supplies light (radiations) with a wide spectrum, a modulator M ensuring both the selection of the lengths of analysis wave and the intensity coding of the corresponding radiations.
  • Wide-spectrum light (or white light, or polychrome light) is here obtained using a pulsed laser L injected into a micro structured FO optical fiber.
  • This type of source S is for example described by the Applicant, in the article entitled "White-light supercontinuum generation in normally dispersive optical film using original multi-wavelength pumping system", Optics Express, vol. 12, No. 19, September 2004.
  • the laser L serving as a pump for the micro-structured optical fiber OF may for example be replaced by a Neodymium or Ytterbium-doped optical fiber laser operating in a blocked mode mode (for example with a pulse repetition rate of 50 MHz), followed by an optical amplifier capable of delivering a flux compatible with an excitation in a nonlinear interaction regime of the micro structured optical fiber OF.
  • the polychromatic light that is delivered by this type of source S differs from that delivered by an incandescent lamp because its spatial coherence is extremely high (all the photons of the continuum are emitted in the same spatial mode).
  • the source may comprise at least two coupled lasers, possibly of the monochrome type, and / or at least one light emitting diode. It may also include other types of substantially continuous polychromatic light source, such as an incandescent lamp or an arc lamp.
  • the light beam coming from the micro-structured optical fiber OF is shaped using a focusing optic Ol, corrected chromaticism or zero chromaticity thanks, for example, to an optical combination of the catadioptric type (mirrors). .
  • This light beam is focused at the level of the modulator M, which is here produced in the form of an acousto-optical cell, whose angular chromatism is preferentially corrected by spatial superposition of diffraction gratings adapted to diffraction at the incidence of Bragg.
  • Such an acousto-optical modulator M is for example that marketed by the company A-A Opto-Electronic.
  • the acousto-optic modulator M is here controlled by means of a control electronics SF capable of simultaneously generating (at least) 3 acoustic frequencies (f1, f2, f3), and itself controlled by the control module MC (which can be part of a system computer having a control software interface).
  • the acoustic frequency band is for example between 80 MHz and 150 MHz.
  • the frequencies are chosen so as to allow selection, within the light continuum of the beam, of three (in the example described) quasi-monochromatic radiations, for example of wavelengths equal to 488 nm (blue), 570 nm (yellow) and 976 nm (infrared).
  • the equalization of the three radiations is obtained by varying the intensity of the acoustic signal.
  • the higher the acoustic intensity the higher the diffraction efficiency in the acousto-optic modulator M.
  • quasi-monochromatic radiation is meant here a light emitted in a spectral band between 1 and 50 nm wide.
  • all the parameters of the source S and the modulator M can be parameterized remotely using the control module MC (for example of the computer type).
  • the control module MC for example of the computer type.
  • all the parameters of the source S such as the different analysis wavelengths and the respective intensities of the analysis and other radiations, can be chosen by means of a software interface. 'operator.
  • the analysis radiations Ri, delivered at the output of the modulator M, are for example shaped by an optic O2 in order to be focused at the level of the measurement vessel (or space) CM.
  • the modulation frequencies ⁇ i are chosen according to various parameters, such as, for example, the rate of passage of the biological cell at the level of the measurement space CM, the dilution, the size of the optical window of the measurement space CM , the bandwidth of the acquisition part (optical filtering means FO, detectors DE and / or DF) of the analysis device DA.
  • the biological cell to be analyzed passes through a beam of analysis radiation having a Gaussian profile at a speed of about 1 m / s, with a width at mid-height of about 30 ⁇ m, it will generate a radiation pulse. interaction (fluorescence or diffusion (extinction)) substantially Gaussian form and duration substantially equal to 30 microseconds.
  • the frequency spectrum is then Gaussian and its mid-height is substantially 0.3 / 30 ⁇ s, or about 10 kHz.
  • modulator M may be at least partially integrated in the source S or be at least partly downstream thereof.
  • the modulator M may also be placed at least partly upstream of the source M, for example so as to control its supply current.
  • the part of the analysis device DA situated upstream of the measurement vessel CM and described above with reference to FIG. 4, can be coupled to a downstream part of the type of that illustrated in FIG. 1A or 1B. In this case, a part of the interaction radiation resulting from the scattering reaches the detector DE where it is converted into electrical signals processed by the analysis module MA.
  • the detector DE is, by way of example, oriented in an average direction at approximately 45 ° to the general direction of propagation of the analysis radiations at the measurement space CM.
  • the angle of this average direction can take any value between 0 ° and 360 ° depending on the type of information desired.
  • the detector DE transmits these photoelectric signals to the decoder (or demodulator) DRE of the analysis module MA, so that it decodes them.
  • This demodulator DRE is for example arranged in the form of filtering stages (decoding), for example of analog type.
  • the photoelectric signals could be digitized and the filtering (decoding) operation could be performed digitally, in real time or delayed (after recording).
  • the values of the diffusion signals SE (488 nm) and SE (976 nm) make it possible to determine the scattering cross sections C ext (488 nm) and C ext (976 nm) which are necessary for the determination of the refractive indices and the volumes of the red blood cells.
  • the conversion of the scattering signals into cross sections is, for example, carried out by a calibration method using microbeads calibrated in terms of refractive index and volume. These microbeads may for example be made of latex or come from emulsions.
  • the portion of the interaction radiation resulting from the fluorescence passes through a shaping optics before reaching the level of the optical filtering means FO.
  • the DF fluorescence detection means are all grouped together in one and the same place.
  • the optical filtering means FO constitute a multi-band filter.
  • separation means LS may be used to spectrally separate the fluorescence interaction radiation into at least two parts.
  • a separating plate LS possibly of the dichroic type.
  • At least two fluorescence detection and analysis channels are thus defined, making it possible to obtain on one channel the fluorescence signals of a first type of fluorescent fluorochrome in the first optical filter band B1 of the optical filter FOI. and on a second channel the fluorescence signals of a second type of fluorescent fluorochromes in the second optical filter band B2 of the FO2 optical filter.
  • the device of FIG. 5 can for example be used for the quantification of nucleic acids (RNA + DNA) and the detection of a membrane antigen.
  • Two analysis radiations R1 ( ⁇ 1) and R2 ( ⁇ 2) having wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 respectively equal to 488 nm and 560 nm are used here, in order to detect the fluorescences of the two fluorochromes (thiazole orange and PE) allowing to respectively mark the nucleic acids and the membrane antigen of the leucocytes.
  • the two radiations Rl ( ⁇ l) and R2 ( ⁇ 2) are obtained using the device described above with reference to FIG.
  • the first detection band B1 is centered on ⁇ 3 (530 nm) and has, for example, a spectral width of 30 nm
  • the second detection band B2 is centered on XA (670 nm) and has, for example, a spectral width of 40 nm.
  • ⁇ 3 is between ⁇ 1 and X2, and ⁇ 4 is larger than ⁇ 2.
  • the interaction radiation filtered by the first optical filter FOI reaches a first fluorescence detector DF1 where they are converted by photodetectors into electrical signals transmitted to a first fluorescence decoder (or demodulator) DRF1 of the analysis module.
  • MA responsible for demodulating them according to the first modulation frequency ⁇ l in order to deliver the signal PM 1 ( ⁇ 1).
  • the interaction radiation filtered by the second optical filter FO2 reaches a second fluorescence detector DF2 where they are converted by photodetectors into electrical signals transmitted to a second fluorescence decoder (or demodulator) DRF2 of the analysis module.
  • MA responsible for demodulating them according to the first and second modulation frequencies ⁇ l and ⁇ 2, in order to deliver the signal PM2 ( ⁇ l) and the signal PM2 ( ⁇ 2).
  • the fluorescence demodulators DRF1 and DRF2 are, for example, arranged in the form of analog filtering stages, of the "butterworth bandpass" type, centered on the modulation frequencies.
  • the amounts of fluorochromes (or molar concentrations) Q1 and Q2 are calculated by means of the relations A5 and A6, whose coefficients eu and an are defined by A2 and A3.
  • the molar concentration Q2 can be extracted from the PM2 fluorescence signal, delivered by the second fluorescence detector DF2, by the second demodulator DRF2 by means of a bandpass type filter centered on the frequency ⁇ 2.
  • PM2 comprises two frequency components, PM2 ( ⁇ 2), which corresponds to the rms value or the peak-to-peak value of the electric pulse filtered around the frequency ⁇ l , and PM2 ( ⁇ l), which corresponds to optical crosstalk.
  • These frequency components PM2 ( ⁇ l) and PM2 ( ⁇ 2) which are defined by the relations Al 5 and Al 6 of the appendix, can be separated by means of a simple bandpass filter centered on the frequency ⁇ 2.
  • the molar concentration Q1 can be extracted directly from the PM1 fluorescence signal which is equal to PM1 ( ⁇ 1).
  • the signals delivered by the single PM fluorescence detector are given by the relation A19 which can be reformulated under the form of relationship A20 of the Annex.
  • the PM ( ⁇ l) and PM ( ⁇ 2) signals which are given by the relations A21 and A22 of the appendix can be extracted from the PM signal.
  • the relation A21 makes it possible to calculate Q2, and the transfer of Q2 in the relation A22 makes it possible to determine Ql.
  • the analysis device DA makes it possible to measure the refractive index of the cells contained in a whole blood sample.
  • this refractive index is recognized as being representative of the concentration of corpuscular hemoglobin.
  • the red blood cell consists of a membrane "lipid bilayer" of about 7 nm thick and refractive index close to 1.46.
  • the intracellular content contains several solid compounds dissolved in aqueous phase including hemoglobin ( ⁇ 34g / dl), salts ( ⁇ 0.7 g / dl) and a minority of organic compounds ( ⁇ 0.2 g / dl).
  • the index of refraction can be written in the form given by the relation A23.
  • M 66,500 g / mol.
  • the average mass of hemoglobin dissolved in the red blood cell is 12 pg. Either an average concentration of 33 g / dl or 5 mmol / l.
  • the hemoglobin measurement should be corrected for the hematocrit factor which is between about 40% and 55% in the man, and about 35% and 45% in the woman.
  • This hematocrit factor is here taken as 0.42 (average value); for example, an average concentration of corpuscular hemoglobin of 5 mmol / l gives a total mean hemoglobin concentration of 2.1 mmol / l for a measurement carried out on whole blood.
  • the concentration of corpuscular hemoglobin can be determined from the measurement of the extinction coefficient at two wavelengths. To do this, we can start from the geometric approach, developed by AG Borovoi, which makes it possible to calculate the diffusion cross section C ex t of a spherical red blood cell whose expression is given by the relation A24 of the appendix .
  • a diagram of the isovolume and isoconcentration curves can be constructed to determine the volume and concentration of corpuscular hemoglobin as a function of the diffusion cross sections C ext at the lengths of. analysis wave (here 488 nm and 976 nm).
  • C ext (488 nm) and C ext (976 nm) corresponds on this diagram a single sphere of hemoglobin concentration and volume given.
  • Obtaining hemoglobin content and monitoring may be particularly useful. This is particularly the case for monitoring anemia and iron deficiency.
  • the average corpuscular hemoglobin load is indeed particularly useful to follow during the strong marrow demands that are induced by the growth hormone treatments ("r-Hu EPO therapy").
  • Tracking reticulocytes and their hemoglobin content in cell therapy may also be useful, as discussed in Carlo Brugnara's “Iron Defectiveness and Erythropoiesis: New Diagnostic Approaches," Clinical Chemistry 49: 10, 2003, pp. 1573-1578.
  • the hemoglobin content may advantageously be supplemented by a fluorescence measurement of the intra erythrocyte RNA making it possible to isolate the young erythrocytes, or reticulocytes, from the mature elements.
  • One or more fluorescence wavelengths may be simultaneously used for additional markings allowing other potentially useful specific identifications, such as identification or detection of: • red blood cells containing fetal hemoglobin (HbF), or
  • glycophorin A (CD235a), as described in particular in the article by Hans J. Tanke "Reticulocytes and Mature Erythrocytes", Flow Cytometry in Hematology, ISBN 0-12-432940-3.
  • the applications of the invention are numerous as well on the nucleated cells (leucocytes and others) as on the erythroid line or the thrombocyte elements (labeling activation or platelet immaturity).
  • the invention is not only useful in the case of figured elements of blood or bone marrow but can also be adapted to any biological cell suspension, whether eukaryotic or prokaryotic.
  • the invention has mainly been described in the form of an analysis device.
  • the invention can also be considered in the form of an analysis method that can be implemented by the analysis device described, as well as by its variants.
  • this method can be adapted to a device performing the scanning of a cellular mat (smears, tissue sections, in particular), or a cell suspension.
  • Ij 0 1 to n
  • Mj the depth (or amplitude) of modulation (generally between 0 to 1)
  • ⁇ i the frequency of the modulation applied to the radiation Ri
  • t the time.
  • Ci 3 O (A2)
  • C 23 O
  • ⁇ y is the molar absorption coefficient of the compound i at the wavelength ⁇ j
  • ⁇ y is the fluorescence yield of the compound i in the detection band Bj
  • Fy is the weighting factor between 0 and 1 and reflecting the only part of the fluorescence spectrum of the compound i is filtered in the detection band Bj.
  • Ky is a constant phenomenological coupling coefficient, between 0 and 1, and representing the energy transfer from a fluorochrome i to a fluorochrome j
  • py is a coefficient representing the quantum yield with which the transferred light, resulting from fluorochrome i, is converted to fluorescence light by fluorochrome j.
  • n (Hb, ⁇ ) no ( ⁇ ) + ⁇ ( ⁇ ) * Hb is the real part of the refractive index
  • n 0 ( ⁇ ) the refractive index of the pure solvent, depending on the length of d wave
  • ⁇ ( ⁇ ) the incremental coefficient of refractive index specific to hemoglobin and function of the wavelength
  • ⁇ (Hb, ⁇ ) ⁇ ( ⁇ ) * Hb is the imaginary part of the refractive index
  • ⁇ ( ⁇ ) is the molar absorption coefficient.
  • n-ik complex refractive index of the red blood cell
  • p ⁇ 2x (nl) parameter giving the phase difference
  • x 2 ⁇ a / ⁇
  • a radius of the sphere
  • tan ⁇ ⁇ / (nl ).

Abstract

Un dispositif (DA) d'analyse d'éléments microscopiques, comprend, d'une première part, un espace de mesure (CM) pour des éléments microscopiques à analyser, d'une deuxième part, au moins une source (S) délivrant des rayonnements conjugués au niveau de l'espace de mesure (CM), présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et destinés à interagir avec les éléments microscopiques dans l'espace de mesure (CM) pour former des rayonnements d'interaction, d'une troisième part, des moyens de codage (M) chargés de coder les rayonnements en amont de l'espace de mesure (CM) avec des codes différents, d'une quatrième part, des moyens de filtrage optique (FO) chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion en fonction de leur longueur d'onde, d'une cinquième part, des moyens de détection (DE, DF) chargés de transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction provenant de l'espace de mesure (CM), et d'une sixième part, des moyens d'analyse (MA) comprenant des moyens de décodage (DRE, DRF) chargés de décoder les signaux électriques afin de permettre la détermination de données représentatives des éléments microscopiques analysés.

Description

DISPOSITIF ET PROCÉDÉ D'ANALYSE MULTIPARAMÉTRIQUE D'ÉLÉMENTS MICROSCOPIQUES
L'invention concerne le domaine de l'analyse d'éléments microscopiques, et plus particulièrement les dispositifs dédiés à la caractérisation et au comptage d'éléments microscopiques au moyen d'une lumière.
On entend ici par "éléments microscopiques" tout élément de dimensions microscopiques, et notamment des particules ou des cellules biologiques (procaryotes et eucaryotes).
Dans le domaine du diagnostic in vitro (notamment le comptage hématologique ou la cytométrie de flux), il est classique d'utiliser des dispositifs de caractérisation et de comptage, reposant sur l'interaction entre une lumière et les différents éléments microscopiques qui constituent un échantillon, afin d'obtenir des informations qualitatives et quantitatives sur ces éléments microscopiques.
Parmi les techniques qui sont couramment utilisées, on peut notamment citer celles dites de diffusion, qui regroupent la transmission, la diffraction, la réflexion et la réfraction, et celles dites de photoluminescence qui regroupent la fluorescence et la phosphorescence. Elles permettent séparément ou en combinaison d'obtenir notamment des informations sur la forme, le volume, la taille, la couleur, la densité, la structure, la nature biochimique, ou la granularité.
Les caractérisations des éléments biologiques, et principalement des cellules sanguines, obtenues avec les techniques courantes de cytométrie de flux, sont néanmoins basées sur un nombre limité de variables et de possibilités de discrimination cellulaire.
Chaque principe de mesure est une méthode physique relativement simple mais la multiplication de ces mesures de façon simultanée induit des interactions qui peuvent perturber ces dernières au point de les rendre inutilisables. Ainsi la mise œuvre de mesures multiples est limitée par l'aptitude à éviter ces interactions. Dans les analyseurs d'hématologie et les cytomètres de flux présents sur le marché, les éléments sont généralement détectés soit électroniquement par la méthode d'impédancemétrie dite de Wallace Coulter, soit par une méthode optique (diffusion, photoluminescence).
Par exemple, on peut déduire un volume et un indice de réfraction des résultats d'une analyse de diffusion selon une seule longueur d'onde et deux angles d'observation différents. Ce mode de détection est par exemple décrit dans le brevet US 4,735,504 de la société TECHNICON Instruments Corp. Le système optique décrit dans ce brevet, utilise les mesures de lumière diffractée selon deux gammes d'angles différents, ce qui permet de séparer les valeurs de volume et d'indice de réfraction des éléments par une comparaison de leurs réponses optiques à celles d'éléments calibrés en volume et indice de réfraction. Le traitement de ces données repose sur la théorie de diffusion de la lumière par une particule sphérique développée par Gustav MIE, et décrite notamment à l'adresse Internet « http://en.wikipedia.org/wiki/Mie scattering ».
En cytométrie de flux, il est communément admis que la mesure de la diffraction selon une gamme d'angles proches de l'axe optique (FSC (pour « forward scatter ») ou diffraction dans l'axe) donne une indication sur le volume des éléments microscopiques analysés. Par ailleurs, la lumière diffusée de manière orthogonale par rapport à l'axe optique (ou « side scatter », ou encore diffusion à 90°) est décrite comme étant représentative de la structure interne des éléments. Ces caractéristiques sont étroitement liées aux angles et longueurs d'onde auxquels les mesures sont faites.
Il est rappelé que la fluorescence est un phénomène induit lors du retour à l'état fondamental d'une molécule excitable et excitée par une énergie lumineuse à une longueur d'onde qui lui est propre. L'émission de lumière de fluorescence se fait toujours à une fréquence inférieure à celle d'excitation. L'émission de fluorescence est sensiblement isotrope. La mesure s'effectue généralement en dehors de l'axe d'excitation de la lumière incidente et au travers d'un filtre optique ne transmettant au détecteur que la bande spectrale d'intérêt.
Les sondes moléculaires utilisées en fluorescence peuvent être des colorants vitaux ou supravitaux ayant une affinité intrinsèque pour un type particulier de molécules. On peut notamment penser aux colorants intercalants des acides nucléiques comme le thiazole orange, l'auramine O, la pyronine Y ou autres, ou à des sondes immunologiques composées d'un anticorps sur lequel est accroché un marqueur colorant, généralement un fluorochrome seul ou en tandem ou parfois un nano cristal.
Ce mode de marquage par la mise en œuvre de sondes immunologiques s'est largement répandu pour l'identification cytologique et notamment selon les techniques de cytométrie en flux décrites précédemment. Le brevet EP 0 022 670 de la société Ortho Diagnostics Inc. décrit l'identification de différentes cellules en cytométrie de flux par leurs déterminants antigéniques. La technique décrite dans ce brevet a ouvert la porte au très large développement de l'immunophénotypage qui est maintenant reconnu comme une technique d'identification cellulaire sûre et performante.
L'analyse cytologique multiparamétrique peut néanmoins se faire sans avoir recours à l'identification antigénique. Ainsi, Howard M. Shapiro a décrit dans le document « Combined Blood CeIl Counting and Classification with Fluorochrome Stains and Flow Instrumentation » J. of Histochem. & Cytochem Vol24. No. 1, pp. 396-411, 1976, une classification générale des cellules du sang au moyen d'un cytomètre multiparamétrique effectuant des mesures d'absorption, de diffraction et de fluorescence, et dans lequel les éléments sont mis en contact avec un mélange de colorants fluorescents spécifiques des acides nucléiques et de protéines.
Parallèlement, la multiplication des longueurs d'onde de mesure de fluorescence dans les analyseurs a autorisé l'utilisation d'un nombre croissant de marqueurs et donc d'anticorps, comme indiqué dans le document de John A. Steinkamp « A Modular Detector for Flow Cytométrie Multicolor Fluorescence Measurements », 1987, Cytometry 8: pp. 353-365, mais a aussi très sérieusement complexifié les appareils et leur mise en œuvre.
L'utilisation conjointe de colorants excités par une seule longueur d'onde présente rapidement des limitations de par les zones de recouvrement spectral de leurs excitations et/ou de leurs émissions de fluorescence.
Pour s'affranchir de ces problèmes de recouvrement spectral, on a généralement recours à une méthode de correction appelée « compensation » qui consiste globalement à réduire le signal de fluorescence de l'élément microscopique analysé de la part proportionnelle de recouvrement spectral d'autre(s) élément(s) microscopique(s), comme indiqué dans le document « Spectral Compensation for Flow Cytometry : Visualization Artifacts, Limitations and Caveats », Mario Roederer 2001, Cytometry 45, pp. 194-205.
Un problème induit par les compensations réside dans le fait qu'elles sont calculées en valeur moyenne, et que pour une famille donnée de fluorochromes, il n'est pas possible de fixer leurs valeurs une fois pour toutes. Il existe en effet des variations importantes des propriétés physiques des fluorochromes d'une même famille notamment en fonction de l'origine de l'approvisionnement. Un même produit issu de manufacturiers différents peut ainsi conduire à des jeux de compensations différents. Ceci est particulièrement gênant dans le domaine du diagnostic car des sources d'approvisionnement non maîtrisées pourraient conduire à des mesures erronées et donc potentiellement dangereuses. Par exemple, le rendement du transfert PE-TR et la nature de l'anticorps utilisé ne sont pas suffisamment stables pour accepter une compensation logicielle définitive comme cela est notamment expliqué dans l'article de Carleton C. Steward and Sigrid J. Stewart « Four color compensation », Cytometry, Vol. 38, pp. 161-175, 1999.
L'usage de plusieurs longueurs d'onde d'excitation permet d'ouvrir un plus grand choix de colorants et permet de séparer plus facilement les spectres d'émission. Les différentes longueurs d'onde d'excitation sont fréquemment séparées spatialement dans la cuve de mesure offrant en ce cas l'avantage de plusieurs mesures indépendantes comme décrit dans l'article de J. Steinkamp « Improved multilaser/multiparameter flow cytometer for analysis and sorting of cells and particles » John A. Steinkamp, Robert C. Habbersett, and Richard D. Hiebert ; Review of Scientific Instruments Vol 62(11) pp. 2751-2764, November 1991. Le problème de cette méthode réside dans le fait que le décalage spatial induit un déphasage temporel des réponses et que le recalage des informations doit être fait en aval, soit en retardant les informations de manière analogique, soit en recalant les mesures au moyen d'un logiciel.
La multiplication des longueurs d'onde d'excitation (notamment des sources laser), ainsi que des mesures de fluorescence et d'autres paramètres optiques, apporte une complexité technologique et une difficulté de mise en œuvre importante comme cela est par exemple décrit dans l'article intitulé « Nine Color Eleven Parameter Immunophenotyping Using Three Laser Flow Cytometry », Martin Bigos 1999, Cytometry 36, pp. 36-45. Le niveau de risque d'erreur dans l'interprétation des résultats croît avec le nombre de paramètres et l'utilisation de ces appareils est réservée à des techniciens très spécialisés au risque d'obtenir des résultats inadaptés et faux, et donc potentiellement dangereux.
Une limitation des compensations, dont le niveau de criticité augmente avec le nombre de fluorochromes, concerne la propagation et l'amplification du bruit des mesures de fluorescence et de leurs combinaisons linéaires qui servent à corriger les mesures brutes.
Aucun dispositif d'analyse connu n'étant entièrement satisfaisant, l'invention a donc pour but d'améliorer la situation. En particulier, l'invention est destinée à s'affranchir des problèmes de compensation généralement rencontrés dans l'art antérieur.
L'invention propose à cet effet un dispositif d'analyse d'éléments microscopiques, comprenant :
• d'une première part, un espace de mesure pour des éléments microscopiques à analyser, • d'une deuxième part, au moins une source délivrant des rayonnements présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et destinés à interagir avec les éléments microscopiques dans l'espace de mesure pour former des rayonnements d'interaction,
• d'une troisième part, des moyens de détection chargés de transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction provenant de l'espace de mesure, et • d'une quatrième part, des moyens d'analyse chargés d'analyser les signaux électriques afin de permettre la détermination de données représentatives des éléments microscopiques analysés.
On appelle ici « rayonnements d'interaction », les rayonnements issus de l'interaction entre le faisceau d'analyse et les éléments microscopiques analysés. Ces rayonnements d'interaction peuvent être notamment des rayonnements de diffusion (réfraction, réflexion, diffraction) et/ou de photoluminescence (fluorescence, phosphorescence).
Par ailleurs, on entend ici par « rayonnement », une lumière de longueur d'onde comprise entre l'ultraviolet et l'infrarouge, c'est-à-dire entre environ 100 nm (0,1 μm) et environ 5000 nm (5 μm).
Le dispositif selon l'invention se caractérise par le fait :
- que ses rayonnements codés sont conjugués au niveau de l'espace de mesure, - qu'il comprend i) des moyens de codage chargés de coder les rayonnements en amont de l'espace de mesure avec des codes différents, et ii) des moyens de filtrage optique chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion en fonction de leur longueur d'onde, en amont des moyens de détection, et - que ses moyens d'analyse comprennent des moyens de décodage chargés de décoder les signaux électriques afin qu'ils soient analysés en fonction de leur code d'origine.
On appelle ici « codage », l'action d'appliquer un code (ωi) à un rayonnement d'analyse (Ri) avant son interaction avec les éléments microscopiques, en vue de générer le rayonnement d'interaction qui comporte lui-même le code d'origine. En particulier les codes (ωi) peuvent être choisis de manière à appliquer une modulation d'impulsions à chaque rayonnement d'analyse.
Ces impulsions peuvent être synchrones ou asynchrones. Dans le cas d'impulsions synchrones, toutes les longueurs d'onde interagissent simultanément avec les éléments microscopiques analysés. Dans le cas d'impulsions asynchrones, les longueurs d'onde interagissent séquentiellement avec les éléments microscopiques à analyser. Les moyens de filtrage optique sont agencés, pour une famille de fluorochromes donnée et pour un type de codage donné, de manière à éviter que des compensations soient effectuées.
Le dispositif selon l'invention peut comporter des caractéristiques complémentaires qui peuvent être prises séparément ou en combinaison, et notamment :
• ses moyens de filtrage optique peuvent être chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande ;
• ses moyens de codage peuvent être chargés de coder périodiquement et/ou sinusoïdalement en intensité les rayonnements d'analyse ;
• une partie au moins de ses moyens de codage peut agir au niveau de la source en amont d'une sortie de distribution des rayonnements. Cette partie peut être intégrée dans la source ; • une partie au moins de ses moyens de codage peut agir sur les rayonnements en aval de la source afin de constituer les rayonnements d'analyse ; • ses moyens de codage peuvent moduler en intensité les rayonnements délivrés par la source, par exemple au moyen d'un modulateur acousto-optique, afin de constituer les rayonnements d'analyse ;
• la source peut comprendre au moins deux lasers couplés, éventuellement de type monochrome, et/ou au moins une diode électroluminescente, dont les rayonnements d'analyse sont conjugués au niveau de l'espace de mesure. En variante, la source peut comprendre une source de lumière polychromatique sensiblement continue, comme par exemple un laser polychromatique, une lampe à incandescence, ou une lampe à arc ;
• la source peut délivrer les rayonnements d'analyse selon un mode continu et/ou un mode impulsionnel ;
• l'intensité de chaque rayonnement d'analyse délivré par la source peut être paramétrable ;
• ses moyens de détection peuvent comporter une multiplicité de capteurs photosensibles dédiés à la détection de rayonnements d'interaction (représentatifs de diffusion(s) et de fluorescence(s)) induits par les rayonnements d'analyse sur les éléments microscopiques à analyser. En variante, les moyens de détection peuvent comporter une multiplicité de capteurs photosensibles dédiés à la détection de rayonnements d'interaction représentatifs de difrusion(s) et implantés dans un endroit défini par un axe interceptant la direction générale de propagation des rayonnements d'analyse au niveau de l'espace de mesure, cet axe étant orienté par rapport à la direction générale d'un angle compris entre 0° et 360° ; • ses moyens d'analyse peuvent permettre de déduire l'indice de réfraction d'un type d'éléments microscopiques analysés à partir des signaux résultant de la transformation des rayonnements d'interaction représentatifs d'une diffusion. En particulier, lorsque les éléments microscopiques appartiennent à un échantillon de sang, les moyens d'analyse peuvent permettre, notamment, de déterminer le contenu intra-érythrocytaire en hémoglobine ou le contenu protéique mtracytoplasmique des leucocytes ;
• ses moyens d'analyse peuvent permettre de déduire des signaux résultant de l'interaction entre les rayonnements d'analyse et deux agents photoluminescents (ou fluorochromes) à des longueurs d'onde différentes, un degré de couplage représentatif du transfert d'énergie entre les deux agents photoluminescents.
L'invention propose également un procédé d'analyse d'éléments microscopiques, comprenant : • une première étape dans laquelle on illumine des éléments microscopiques placés au niveau d'un espace de mesure au moyen de rayonnements d'analyse conjugués au niveau de l'espace de mesure et présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et des codages selon des codes différents choisis, de manière à former des rayonnements d'interaction, • une deuxième étape dans laquelle on collecte une partie au moins des rayonnements d'interaction, puis on les sépare et filtre en fonction de leur longueur d'onde,
• une troisième étape dans laquelle on détecte les rayonnements d'interaction filtrés, puis on les transforme en signaux électriques, et
• une quatrième étape dans laquelle on décode les signaux détectés en fonction de leur code d'origine de manière à permettre la détermination de données représentatives des éléments microscopiques analysés.
Le procédé selon l'invention peut comporter des caractéristiques complémentaires qui peuvent être prises séparément ou en combinaison, et notamment : • dans la première étape on peut appliquer séquentiellement ou simultanément les rayonnements d'analyse aux éléments microscopiques à analyser ;
• dans la première étape on peut également procéder à une modulation sinusoïdale de l'intensité des rayonnements d'analyse ;
• dans la deuxième étape on peut filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande ;
• dans la quatrième étape, on peut déduire l'indice de réfraction d'un type d'éléments microscopiques analysés, des signaux résultant de la transformation des rayonnements d'interaction représentatifs d'une diffusion. En particulier, lorsque les éléments microscopiques appartiennent à un échantillon de sang, on peut déterminer, notamment, le contenu intra-érythrocytaire en hémoglobine ou le contenu protéique intracytoplasmique des leucocytes ;
• dans la quatrième étape on peut déduire de signaux résultant de l'interaction entre les rayonnements d'analyse et deux agents photoluminescents (fluorochromes) à des longueurs d'onde différentes, un degré de couplage représentatif du transfert d'énergie entre les deux agents photoluminescents. L'invention est particulièrement bien adaptée, bien que de façon non limitative, au domaine du diagnostic in vitro (notamment cytométrie de flux), et à l'analyse de tout élément microscopique dans un fluide. Elle s'applique notamment à l'analyse biologique, biochimique, chimique, particulaire, morphologique, et en particulier la cytométrie de flux multiparamétrique, l'analyse de particules chargées dans un fluide liquide ou gazeux, et la granulométrie.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à l'examen de la description détaillée ci-après, et des dessins annexés, sur lesquels :
• la figure IA illustre de façon schématique et fonctionnelle un premier exemple de réalisation d'un dispositif d'analyse optique selon l'invention, et la figure IB illustre de façon schématique et fonctionnelle un second exemple de réalisation d'un dispositif d'analyse optique selon l'invention dans lequel plusieurs sources sont capables de générer des rayonnements destinés à être conjugués au niveau de l'espace de mesure (CM),
• la figure 2A illustre un exemple de codage sinusoïdal, avec éclairages simultanés, pouvant être appliqué aux rayonnements lumineux, la figure 2B illustre un exemple de codage binaire séquentiel, et la figure 2C présente les allures des signaux du codage binaire de la figure 2B, répétés périodiquement,
• la figure 3 est un diagramme illustrant trois spectres d'absorption de fluorochromes (SAl à SA3) correspondant à trois longueurs d'onde d'analyse (λl à λ3), et trois spectres de fluorescence de ces mêmes fluorochromes (SFl à SF3),
• la figure 4 illustre de façon schématique un exemple de réalisation de la partie du dispositif d'analyse située en amont de la cuve de mesure, dans lequel le modulateur est de type acousto- optique,
• la figure 5 illustre de façon schématique un exemple de réalisation de la partie du dispositif d'analyse située en aval de la cuve de mesure et dédiée à la détection et l'analyse de la fluorescence, et
• la figure 6 est un diagramme de courbes d'isovolumes et d' isoconcentrations permettant de déterminer le volume et la concentration d'hémoglobine corpusculaire en fonction de sections efficaces de diffusion Cext aux longueurs d'onde d'analyse égales à 488 nm et 976 nm.
Les dessins annexés pourront non seulement servir à compléter l'invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant. On se réfère tout d'abord aux figures IA et IB pour décrire deux exemples de réalisation de dispositif d'analyse optique DA, selon l'invention.
On considère dans ce qui suit que le dispositif DA est dédié à la caractérisation et au comptage en cytométrie de flux des éléments microscopiques dans un échantillon de sang. Mais, l'invention n'est limitée ni à ce type d'échantillon, ni à la cytométrie de flux. Elle concerne en effet tout type d'échantillon comportant des éléments microscopiques à analyser optiquement par fluorescence et/ou par diffusion lumineuse, et notamment des particules dans un fluide ou des échantillons biologiques.
Comme cela est schématiquement et fonctionnellement illustré sur les figures IA et IB, un dispositif d'analyse DA, selon l'invention, comporte au moins :
• un espace de mesure CM, parfois appelé cuve de mesure (ou zone de mesure, ou encore fenêtre de mesure) au niveau duquel se trouvent (ou passent) les éléments microscopiques de l' échantillon à analyser,
• une (ou plusieurs) source(s) S chargée(s) de délivrer des rayonnements Ri présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes λl à λn, conjugués au niveau de l'espace de mesure (CM), [dans le cas de la figure IA une seule source S est utilisée pour délivrer plusieurs longueurs d'onde, tandis que dans le cas de la figure IB trois sources S sont utilisées pour délivrer chacune une longueur d'onde — par définition, on considère ici que les différentes sources de la figure IB constituent des sous-parties d'une source de rayonnements]
• des moyens de codage M au moins chargés de coder (moduler) chaque rayonnement lumineux Ri de longueur d'onde λi avec un code spécifique ωi (ici i = 1 à n, par exemple n = 2 ou 3), et éventuellement piloté par un module de contrôle MC, le codage est par exemple du type de celui présenté sur les figures 2A à 2C,
• des moyens de filtrage optique FO chargés de filtrer sélectivement les rayonnements d'interaction qui proviennent de l'espace de mesure CM, après avoir éventuellement interagi avec les éléments microscopiques, et dont les longueurs d'onde appartiennent de préférence à des bandes d'analyse de fluorescence Bi qui sont chacune intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse λi et λi+1, à l'exception de la dernière (qui possède les plus grandes longueurs d'onde) qui est placée au-delà de la longueur d'onde d'analyse sn qui est la plus grande, • des moyens de détection DF et/ou DE comportant des capteurs photosensibles (ou photocapteurs) chargés de transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion qui proviennent de l'espace de mesure après avoir éventuellement interagi avec les éléments microscopiques, et • des moyens d'analyse MA comprenant au moins des moyens de décodage DRF et/ou DRE chargés de décoder les signaux électriques qui lui sont transmis par les moyens de détection DF et/ou DE, afin qu'ils soient analysés en fonction de leur code ωi de manière à permettre la détermination des données représentatives des éléments microscopiques analysés.
H est important de noter que le dispositif d'analyse DA peut effectuer des analyses de fluorescence et/ou de diffusion. Par conséquent, selon les variantes il possède :
• soit des moyens de filtrage optique FO, associés aux moyens de détection dédiés à la fluorescence DF avec les moyens associés de décodage DRF, mais pas de moyens de détection dédiés à la diffusion DE et les moyens associés de décodage DRE, • soit des moyens de filtrage optique FO, associés aux moyens de détection dédiés à la fluorescence DF avec les moyens associés de décodage DRF, et des moyens de filtrage optique FO, associés aux moyens de détection dédiés à la diffusion DE et les moyens associés de décodage DRE,
• soit encore des moyens de détection dédiés à la diffusion DE et les moyens associés de décodage DRE mais pas de moyens de filtrage optique FO ni de moyens de détection dédiés à la fluorescence DF avec les moyens associés de décodage DRF.
Lorsque le dispositif d'analyse DA est dédié à la cytométrie de flux ou au comptage, sa cuve de mesure CM (ou espace de mesure) peut être du type dit "à manchonnage de flux", comme par exemple celle décrite dans le document brevet FR 2653885.
Dans l'exemple de la figure IA, la source S est chargée de générer un faisceau de lumière unique constitué de la superposition de n rayonnements Ri de longueurs d'onde respectives λl à λn, avec n > 2. Dans l'exemple de Ia figure IB, chacune des trois sources S est chargée de générer un faisceau de lumière unique constitué d'un rayonnement Ri (Rl, R2 ou R3) de longueur d'onde λi (λl5 λ2 ou λ3). L'intensité de chaque radiation, notée Ij, peut être ajustée à une valeur prédéterminée. Cela permet, par exemple, de placer à un niveau prédéterminé l'intensité de fluorescence d'une famille de fluorochromes (ou composés fluorescents) excités par Ie rayonnement d'analyse Ri de longueur d'onde λi et d'intensité Ij. On peut également exciter avec une faible intensité une famille de fluorochromes pour laquelle le rendement quantique de fluorescence est très élevé (c'est par exemple le cas de certaines sondes moléculaires comme le thiazole orange). Inversement, lorsque des fluorochromes de rendements quantiques identiques sont simultanément utilisés pour marquer des antigènes exprimés différemment sur une même cellule, on peut égaliser approximativement les niveaux de fluorescence émis par les divers fluorochromes en jouant sur les intensités de leurs rayonnements d'analyse respectifs.
En raison de cette possibilité de contrôle des niveaux de fluorescence des éléments microscopiques, la source S est également appelée "synthétiseur-égaliseur" optique.
Chacun des n rayonnements Ri d'intensité I; peut aussi être codé en intensité périodiquement et/ou sinusoïdalement par les moyens de codage sur lesquels on reviendra plus loin. Ce codage, qui est par exemple du type de celui illustré sur les figures 2A à 2C, est déterminant car il permet, grâce aux moyens de décodage DRF et/ou DRE, le démultiplexage des rayonnements résultant de l'interaction avec les éléments microscopiques analysés (notamment des mécanismes de fluorescence et/ou de diffusion).
Lorsque la source S comprend des lasers, comme par exemple des lasers à semi-conducteurs, ou des diodes électroluminescentes, le codage peut être réalisé en jouant sur le courant d'injection, le modulateur M étant alors un générateur électrique capable de délivrer des courants électriques images des codes appliqués à chacun des rayonnements. Lorsque le codage est de type sinusoïdal, Ie codage consiste notamment à fixer des fréquences de modulation ωi qui sont fonction de diverses considérations expérimentales qui seront précisées plus loin.
A la sortie du modulateur M on dispose de n rayonnements Ri de longueurs d'ondes λi choisies et d'intensité Ij éventuellement choisies et conjugués dans l'espace de mesure. Dans le cas d'un codage sinusoïdal, l'expression de l'intensité lumineuse Ij (en W/m2) est donnée par la relation Al de l'annexe. Le ou les faisceaux de n rayonnements Ri est (sont) focalisé(s) par des moyens optiques non représentés, à l'intérieur de l'espace de mesure (ou de comptage) où ils interagissent avec l'élément microscopique (ici une cellule biologique) préalablement marqué et/ou coloré selon toute technique connue de l'homme de l'art.
Sur la figure 3 se trouvent représentés trois spectres d'absorption SAl à SA3 de trois fluorochromes fictifs correspondant à trois longueurs d'onde d'analyse λl à λ3, et les trois spectres de fluorescence SFl à SF3 de ces trois mêmes fluorochromes qui sont détectés par les moyens de détection de fluorescence DF. Les références Bl à B3 désignent les trois bandes de longueurs d'onde que les moyens de filtrage optique FO laissent passer.
Le nombre de fluorochromes de types différents est ici limité à trois afin de faciliter Ia description. Mais, l'invention n'est pas limitée à ce nombre. Elle concerne en effet n'importe quel nombre de fluorochromes.
Conformément à l'invention et comme on peut l'observer sur la figure 3, la bande Bl, qui correspond au maximum du spectre de fluorescence SFl du premier fluorochrome, est intercalée entre les longueurs d'onde d'analyse λl et λ2, la bande B2, qui correspond au maximum du spectre de fluorescence SF2 du deuxième fluorochrome, est intercalée entre les longueurs d'onde d'analyse λ2 et λ3, et la bande B3, qui correspond au maximum du spectre de fluorescence SF3 du troisième fluorochrome, est placée au-delà de la longueur d'onde d'analyse λ3 (qui est la plus grande des trois).
Préférentiellement, à chaque bande Bi correspond un détecteur de fluorescence DFi.
L'analyse des spectres d'absorption SAi et de fluorescence SFi permet d'écrire une relation matricielle entre les signaux (photoélectriques) délivrés par les (n=3) détecteurs et les quantités de fluorochromes : [PMo] = It[C] [Q] + 12 [D] [Q] + 13 [E] [Q].
[PMo] est ici la matrice des signaux photoélectriques délivrés par les (n=3) détecteurs de fluorescence DFi, l'indice o signalant un signal de fluorescence en l'absence de transfert d'énergie. [C], [D] et [E] sont ici les matrices de transfert permettant le calcul des lumières de fluorescence. [Q] est ici la matrice des quantités Ql à Q3 des (n=3) fluorochromes, exprimées en nombre de moles.
Les coefficients Cy9 dy et ey des matrices de transfert [C], [D] et [E] sont respectivement données par les relations A2, A3 et A4 de l'annexe.
L'examen de la décomposition de la matrice [PMo] et des coefficients associés montre qu'il est possible de déterminer chaque concentration molaire Qi sans combinaison linéaire des signaux de mesure. Avec les conventions d'écriture précitées, les concentrations molaires Qi sont données par les relations A5 à A7 de l'annexe. Dans ces trois relations A5 à A7 les termes PMi(ωi) représentent une caractéristique de code ωi.
Cette caractéristique peut par exemple être l'amplitude crête ou encore la valeur efficace du signal sur un intervalle de temps limité par la durée de l'impulsion lumineuse d'analyse ou encore une caractéristique temporelle du signal telle que le temps de déclin d'une lumière de fluorescence. La détermination directe des concentrations molaires Qi des fluorochromes, sans passer par une combinaison linéaire des mesures, augmente la précision des résultats et donc la précision du diagnostic.
On évite donc ainsi l'utilisation de compensations (de combinaison linéaire de différents signaux) pour déterminer la concentration molaire d'un fluorochrome donné. La robustesse de l'invention permet d'éviter les interférences, donc les compensations, elle est donc plus fiable et plus robuste que les méthodes traditionnellement utilisées jusqu'à ce jour.
L'invention peut aussi permettre de déterminer le degré de couplage entre deux fluorochromes (ou composés fluorescents) qui correspond au transfert d'énergie (par fluorescence) entre un fluorochrome "donneur" et un fluorochrome "accepteur". Cette détermination du couplage entre deux fluorochromes peut permettre par exemple de mesurer la distance entre épitopes ou encore leur association physique.
Compte tenu des conventions d'écritures données ci-avant, les expressions des différents signaux de fluorescence en présence d'un transfert d'énergie sont données par les relations A8 à AlO de l'annexe. Le cas du transfert d'énergie entre les deux premiers fluorochromes va être décrit ci-après de façon analytique. Dans ce cas, les expressions des différents signaux photoélectriques données par les relations A8 à AlO de l'annexe peuvent se réécrire sous la forme des relations AI l à A13 de l'annexe. Cela résulte du fait que seuls les coefficients K12 et pι2 doivent être pris en compte, les autres coefficients Ky et pij étant pris égaux à 1.
Compte tenu des expressions des relations A2 à A7, on peut alors tirer des relations Al 1 et Al 2 de l'annexe les trois relations Al 4 à Al 6 de l'annexe. Puis, en éliminant des relations Al 4 à Al 6 les concentrations molaires Ql à Q3 on peut déterminer le paramètre de transfert d'énergie K12 entre les deux premiers fluorochromes. La formule de ce paramètre de transfert d'énergie Kj2 est donnée par la relation Al 7 de l'annexe.
La concentration molaire Ql en présence d'un transfert d'énergie entre les deux premiers fluorochromes peut alors être reformulée comme indiqué par la relation Al 8 de l'annexe. Les concentrations molaires Q2 et Q3 en présence d'un transfert d'énergie entre les deux premiers fluorochromes sont alors données par les relations A6 et A7 de l'annexe.
Il est important de noter que les relations données ci-avant et dans l'annexe peuvent être étendues au cas où l'on prend également en compte un transfert d'énergie entre les premier et troisième fluorochromes et/ou entre les deuxième et troisième fluorochromes.
On a représenté sur la figure 4 une partie amont d'un dispositif d'analyse DA selon l'invention, dans laquelle la source S alimente en lumière (rayonnements) à spectre large, un modulateur M assurant à Ia fois la sélection des longueurs d'onde d'analyse et le codage en intensité des rayonnements correspondants.
La lumière à spectre large (ou lumière blanche, ou lumière polychrome) est ici obtenue à l'aide d'un laser impulsionnel L injecté dans une fibre optique OF micro structurée. Ce type de source S est par exemple décrit par la Demanderesse, dans l'article intitulé "White-light supercontinuum génération in normally dispersive optical fïber using original multi-wavelength pumping system", Optics Express, vol. 12, No. 19, september 2004. Le laser L servant de pompe pour la fibre optique micro structurée OF peut par exemple être remplacé par un laser à fibre optique dopée Néodyme ou Ytterbium fonctionnant en régime de modes bloqués (par exemple avec un taux de répétition des impulsions de 50 MHz), suivi d'un amplificateur optique capable de délivrer un flux compatible avec une excitation en régime d'interaction non linéaire de la fibre optique micro structurée OF.
La lumière polychrome qui est délivrée par ce type de source S se distingue de celle délivrée par une lampe à incandescence du fait que sa cohérence spatiale est extrêmement élevée (tous les photons du continuum sont émis dans le même mode spatial).
Bien entendu, d'autres types de source S peuvent être envisagés. Ainsi, la source peut comprendre au moins deux lasers couplés, éventuellement de type monochrome, et/ou au moins une diode électroluminescente. Elle peut également comprendre d'autres types de source de lumière polychromatique sensiblement continue, comme par exemple une lampe à incandescence ou une lampe à arc.
Le faisceau de lumière issu de la fibre optique micro structurée OF est mis en forme à l'aide d'une optique de focalisation Ol, de chromatisme corrigé ou de chromatisme nul grâce, par exemple, à une combinaison optique de type catadioptrique (miroirs). Ce faisceau de lumière est focalisé au niveau du modulateur M, qui est ici réalisé sous la forme d'une cellule acousto-optique, dont le chromatisme angulaire est préférentiellement corrigé par superposition spatiale de réseaux de diffraction de pas adapté à la diffraction sous incidence de Bragg.
Ces réseaux de diffraction sont créés par la superposition d'ondes acoustiques entretenues par un élément vibrant de type piézoélectrique alimenté par un signal électrique capable d'entretenir n signaux de modulation mj(t) = Mi cos2πωjt qui participent à la relation Al de l'annexe donnant l'intensité modulée Ij(t).
Un tel modulateur acousto-optique M est par exemple celui qui est commercialisé par la société A-A Opto-Electronic.
Le modulateur acousto-optique M est ici piloté par l'intermédiaire d'une électronique de commande SF capable de générer simultanément (au moins) 3 fréquences acoustiques (fl, f2, f3), et elle même contrôlée par le module de commande MC (qui peut faire partie d'un système informatique comportant une interface logicielle de contrôle). La bande des fréquences acoustiques est par exemple comprise entre 80 MHz et 150 MHz. Les fréquences sont choisies de manière à permettre la sélection, au sein du continuum de lumière du faisceau, de trois (dans l'exemple décrit) rayonnements quasi-monochromatiques, par exemple de longueurs d'onde égales à 488 nm (bleu), 570 nm (jaune) et 976 nm (infrarouge). L'égalisation des trois rayonnements est obtenue en jouant sur l'intensité du signal acoustique. Plus l'intensité acoustique est importante plus le rendement de diffraction est élevé au sein du modulateur acousto-optique M. En d'autres termes, on peut doser (en jouant sur l'intensité du signal acoustique) la quantité de lumière qui peut passer de l'ordre 0 à l'ordre de diffraction +1.
Par rayonnement quasi-monochromatique on entend ici une lumière émise dans une bande spectrale comprise entre 1 et 50 nm de large.
Il est important de noter que l'ensemble des paramètres de la source S et du modulateur M peut être paramétrable à distance à l'aide du module de contrôle MC (par exemple de type ordinateur). Ainsi, par l'intermédiaire d'une interface logicielle, l'ensemble des paramètres de la source S, tels que les différentes longueurs d'onde d'analyse et les intensités respectives des rayonnements d'analyse et autres, peuvent être choisis par l'opérateur.
Les rayonnements d'analyse Ri, délivrés en sortie du modulateur M, sont par exemple mis en forme par une optique O2 afin d'être focalisés au niveau de la cuve (ou espace) de mesure CM.
Les fréquences de modulation ωi sont choisies en fonction de divers paramètres, comme par exemple la vitesse de passage de la cellule biologique au niveau de l'espace de mesure CM, la dilution, la taille de la fenêtre optique de l'espace de mesure CM, la bande passante de la partie d'acquisition (moyens de filtrage optique FO, détecteurs DE et/ou DF) du dispositif d'analyse DA.
Par exemple, si la cellule biologique à analyser traverse à la vitesse d'environ 1 m/s un faisceau de rayonnement d'analyse possédant un profil gaussien, de largeur à mi hauteur d'environ 30 μm, elle va générer une impulsion de rayonnement d'interaction (fluorescence ou diffusion (extinction)) de forme sensiblement gaussienne et de durée sensiblement égale à 30 μs. Le spectre en fréquence est alors de forme gaussienne et sa hauteur à mi hauteur est sensiblement de 0,3/30 μs, soit environ 10 kHz. Afin d'éviter les phénomènes de diaphonie électronique, il est préférable de choisir un écart minimum de 100 kHz entre deux fréquences de modulation consécutives ωi et ωi+1. On peut par exemple choisir col égale à 100 kHz, ω2 égale à 200 kHz et ω3 égale à 300 kHz.
Si la durée de passage est d'environ 5 μs au lieu de 30 μs, chaque impulsion de rayonnement d'interaction occupe une bande de fréquence d'environ 200 kHz et donc les fréquences de modulation doivent être au moins séparées de cette fréquence caractéristique : par exemple ωl = 1 MHz et ω2 = 1,5 MHz.
II est important de noter que d'autres types de modulateur M peuvent être envisagés. Notamment, le modulateur M peut être au moins en partie intégré dans la source S ou bien être au moins en partie en aval de celle-ci. Le modulateur M peut également être placé au moins en partie en amont de la source M, par exemple de manière à contrôler son courant d'alimentation.
La partie du dispositif d'analyse DA, située en amont de la cuve de mesure CM et décrite ci-avant en référence à la figure 4, peut être couplée à une partie aval du type de celle illustrée sur la figure IA ou IB. Dans ce cas, une partie des rayonnements d'interaction résultant de la diffusion parvient au niveau du détecteur DE où elle est convertie en signaux électriques traités par le module d'analyse MA.
Sur la figure IA, le détecteur DE est, à titre d'exemple, orienté selon une direction moyenne à environ 45° de la direction générale de propagation des rayonnements d'analyse au niveau de l'espace de mesure CM. Mais, l'angle de cette direction moyenne peut prendre n'importe quelle valeur comprise entre 0° et 360° en fonction du type d'information désiré.
Le détecteur DE transmet ces signaux photoélectriques au décodeur (ou démodulateur) DRE du module d'analyse MA, afin qu'il les décode. Ce démodulateur DRE est par exemple agencé sous la forme d'étages de filtrage (décodage), par exemple de type analogique. En variante, les signaux photoélectriques pourraient être numérisés et l'opération de filtrage (décodage) pourrait être réalisée de façon numérique, en temps réel ou en différé (après enregistrement).
A la sortie du démodulateur DRE on dispose des trois signaux de diffusion SE(λl=488 nm), SE(λ2=570 nm) et SE(λ3=976 nm). Les valeurs des signaux de diffusion SE(488 nm) et SE(976 nm) permettent de déterminer les sections efficaces de diffusion Cext(488 nm) et Cext(976 nm) qui sont nécessaires à la détermination des indices de réfraction et des volumes des globules rouges.
La conversion des signaux de diffusion en sections efficaces est par exemple réalisée par un procédé d'étalonnage utilisant des microbilles calibrées en indice de réfraction et volume. Ces microbilles peuvent par exemple être en latex ou provenir d'émulsions.
La partie des rayonnements d'interaction résultant de la fluorescence traverse une optique de mise en forme avant de parvenir au niveau des moyens de filtrage optique FO. Les rayonnements d'interaction sont alors filtrés en longueurs d'onde afin que ne soient conservés que ceux dont les longueurs d'onde appartiennent aux n (ici n=3) bandes de détection Bi.
Sur la figure IA les moyens de détection de fluorescence DF sont tous regroupés au niveau d'un même endroit. Dans ce cas, les moyens de filtrage optique FO constituent un filtre multi-bandes.
Comme illustré sur la figure 5, on peut utiliser des moyens de séparation LS afin de séparer spectralement les rayonnements d'interaction de fluorescence en au moins deux parties. Pour ce faire, on peut par exemple utiliser une lame séparatrice LS, éventuellement de type dichroïque. On définit ainsi (au moins) deux voies de détection et d'analyse de fluorescence, permettant d'obtenir sur une voie les signaux de fluorescence d'un premier type de fluorochromes fluorescent dans la première bande de filtrage optique Bl du filtre optique FOI, et sur une seconde voie les signaux de fluorescence d'un second type de fluorochromes fluorescent dans la seconde bande de filtrage optique B2 du filtre optique FO2.
Le dispositif de la figure 5 peut par exemple être utilisé pour la quantification des acides nucléiques (ARN+ADN) et la détection d'un antigène membranaire.
On utilise ici deux rayonnements d'analyse Rl (ωl) et R2(ω2) présentant des longueurs d'onde λl et λ2 respectivement égales à 488 nm et 560 nm, afin de détecter les fluorescences des deux fluorochromes (thiazole orange et PE) permettant de marquer respectivement les acides nucléiques et l'antigène membranaire des leucocytes. Les deux rayonnements Rl(ωl) et R2(ω2) sont obtenus à l'aide du dispositif décrit précédemment en référence à la figure 4. La première bande de détection Bl est centrée sur λ3 (530 nm) et dispose par exemple d'une largeur spectrale de 30 nm, tandis que la seconde bande de détection B2 est centrée sur XA (670 nm) et dispose par exemple d'une largeur spectrale de 40 nm. Conformément à l'invention, λ3 est comprise entre λl et X2, et λ4 est plus grande que λ2.
Les rayonnements d'interaction filtrés par le premier filtre optique FOI parviennent au niveau d'un premier détecteur de fluorescence DFl où ils sont convertis par des photodétecteurs en signaux électriques transmis à un premier décodeur (ou démodulateur) de fluorescence DRFl du module d'analyse MA, chargé de les démoduler selon la première fréquence de modulation ωl afin de délivrer le signal PM 1 (ω 1 ).
Les rayonnements d'interaction filtrés par le second filtre optique FO2 parviennent au niveau d'un second détecteur de fluorescence DF2 où ils sont convertis par des photodétecteurs en signaux électriques transmis à un second décodeur (ou démodulateur) de fluorescence DRF2 du module d'analyse MA, chargé de les démoduler selon la première et la seconde fréquences de modulation ωl et ω2, afin de délivrer le signal PM2(ωl) et le signal PM2(ω2).
Les démodulateurs de fluorescence DRFl et DRF2 sont par exemple agencés sous la forme d'étages de filtrage analogique, de type « passe-bande butterworth » centrés sur les fréquences de modulation.
Dans les conditions d'excitation précitées, les quantités de fluorochromes (ou concentrations molaires) Ql et Q2 se calculent au moyen des relations A5 et A6, dont les coefficients eu et an sont définis par A2 et A3.
La concentration molaire Q2 peut être extraite du signal de fluorescence PM2, délivré par le second détecteur de fluorescence DF2, par le second démodulateur DRF2 au moyen d'un filtre de type passe bande centré sur la fréquence ω2. En effet, comme indiqué précédemment, en raison de la diaphonie optique entre fluorochromes, PM2 comprend deux composantes fréquentielles, PM2(ω2), qui correspond à la valeur efficace ou la valeur crête à crête de l'impulsion électrique filtrée autour de la fréquence ωl, et PM2(ωl), qui correspond à la diaphonie optique. On a donc PM2 ≈ PM2(ωl) + PM2(ω2). Ces composantes fréquentielles PM2(ωl) et PM2(ω2), qui sont définies par les relations Al 5 et Al 6 de l'annexe, peuvent être séparées au moyen d'un simple filtre passe bande centré sur la fréquence ω2.
La concentration molaire Ql peut être extraite directement du signal de fluorescence PMl qui est égal à PMl(ωl).
Dans une configuration qui ne comporte pas de moyen de séparation LS, et qui correspond aux situations dans lesquelles K^ - 1, les signaux délivrés par l'unique détecteur PM de fluorescence sont donnés par la relation A19 que l'on peut reformuler sous la forme de la relation A20 de l'annexe. Par démodulation, on peut extraire du signal PM les signaux PM(ωl) et PM(ω2) qui sont donnés par les relations A21 et A22 de l'annexe.
La relation A21 permet de calculer Q2, et le report de Q2 dans la relation A22 permet de déterminer Ql.
L'exemple décrit ci-avant peut être étendu à n'importe quel nombre de fluorochromes avec un niveau plus ou moins complexe de diaphonie optique.
Dans un deuxième exemple d'application, le dispositif d'analyse DA, selon l'invention, permet de mesurer l'indice de réfraction des cellules contenues dans un échantillon de sang total. Dans le cas des cellules de la lignée érythrocytaire, cet indice de réfraction est reconnu comme étant représentatif de la concentration en hémoglobine corpusculaire.
En effet, d'un point de vue optique, le globule rouge est constitué d'une membrane "bicouche lipidique" d'environ 7 nm d'épaisseur et d'indice de réfraction voisin de 1,46. Le contenu intracellulaire contient plusieurs composés solides dissous en phase aqueuse dont l'hémoglobine (~ 34g/dl), les sels (~ 0.7 g/dl) et une minorité de composés organiques (~ 0,2 g/dl).
L'indice de réfaction peut s'écrire sous la forme donnée par la relation A23.
La concentration (en mmol/dl) peut être ramenée à une concentration massique (g/dl) connaissant la masse molaire de l'hémoglobine (M= 66 500 g/mol). La masse moyenne d'hémoglobine dissoute dans le globule rouge est de 12 pg. Soit une concentration moyenne de 33 g/dl ou encore 5 mmol/1.
Sur sang total la mesure d'hémoglobine doit être corrigée du facteur d'hématocrite qui se situe entre environ 40% et 55% chez l'homme, et environ 35% et 45% chez la femme. Ce facteur d'hématocrite est ici pris égal à 0,42 (valeur moyenne) ; par exemple, une concentration moyenne d'hémoglobine corpusculaire de 5 mmol/1 donne une concentration moyenne d'hémoglobine totale de 2,1 mmol/1 pour une mesure réalisée sur sang total.
Compte tenu de ce qui précède et de la relation A23, l'indice de réfraction d'un globule rouge peut s'écrire : n(980 nm) = 1,34+ 0,0019 * Hb (concentration corpusculaire g/dl), pour une longueur d'onde d'analyse de 980 nm, et n(488 nm) = 1.35 + 0,0016 * Hb (concentration corpusculaire g/dl), pour une longueur d'onde d'analyse de 488 nm.
Le domaine de validité de ces formules sera pris pour une concentration corpusculaire en hémoglobine (en g/dl) variant de 25 à 50 g/dl.
La partie imaginaire de l'indice de réfraction aux longueurs d'onde d'analyse égales à 980 nm et 488 nm peut être déterminée numériquement au moyen des relations suivantes : κ(980 nm) = 1,47 *10 -5 *Hb, et κ(488 nm) = 3,7.10 "5 * Hb.
La concentration d'hémoglobine corpusculaire peut être déterminée à partir de la mesure du coefficient d'extinction à deux longueurs d'onde. Pour ce faire, on peut partir de l'approche géométrique, développée par A.G. Borovoi, qui permet de calculer la section efficace de diffusion Cext d'un globule rouge sphérisé dont l'expression est donnée par la relation A24 de l'annexe.
On peut construire un diagramme des courbes d'isovolumes et d' isoconcentrations, du type de celui illustré sur la figure 6, permettant de déterminer le volume et la concentration d'hémoglobine corpusculaire en fonction des sections efficaces de diffusion Cext aux longueurs d'onde d'analyse (ici 488 nm et 976 nm). A un couple de mesure Cext(488 nm) et Cext(976 nm) correspond sur ce diagramme une sphère unique de concentration en hémoglobine et de volume donnés. L'obtention du contenu en hémoglobine et son suivi peuvent s'avérer particulièrement utiles. C'est notamment le cas pour le suivi d'anémies et de carences en fer. La charge en hémoglobine corpusculaire moyenne est en effet particulièrement utile à suivre lors des fortes demandes médullaires qui sont induites par les traitements aux hormones de croissance ("r-Hu EPO therapy"). Le suivi des réticulocytes et de leur contenu en hémoglobine en thérapie cellulaire peut s'avérer également utile, comme indiqué dans le document de Carlo Brugnara « Iron Defïciency and Erythropoiesis : New Diagnostic Approaches », Clinical Chemistry 49 : 10, 2003, pp. 1573- 1578.
Grâce à l'invention, il est désormais possible d'effectuer des mesures simultanées de contenu en hémoglobine (via les mesures de diffusion) et d'autres mesures (via les mesures de fluorescence), sans interférence entre elles, et avec un risque d'erreur réduit en raison du mode de traitement.
Dans ce cas, le contenu en hémoglobine peut être avantageusement complété par une mesure de fluorescence de l'ARN intra érythrocytaire permettant d'isoler les érythrocytes jeunes, ou réticulocytes, des éléments matures. Une ou plusieurs longueurs d'onde de fluorescence peuvent être simultanément utilisées pour des marquages additionnels permettant d'autres identifications spécifiques potentiellement utiles, telles que l'identification ou la mise en évidence : • des hématies contenant de l'hémoglobine fœtale (HbF), ou
• des hématies infestées par un parasite de la malaria, ou
• des récepteurs de la transférine (CD71 ), ou
• de l'expression de la glycophorine A (CD235a), comme cela est notamment décrit dans l'article de Hans J. Tanke " Réticulocytes and Mature Erythrocytes ", Flow Cytometry in Hematology, ISBN 0- 12-432940-3.
Les applications de l'invention sont nombreuses aussi bien sur les cellules nucléées (leucocytes et autres) que sur la lignée érythroïde ou les éléments thrombocytaires (marquage de l'activation ou de l'immaturité plaquettaire).
Par ailleurs, l'invention n'est pas seulement utile dans le cas d'éléments figurés du sang ou de la moelle osseuse mais peut également être adaptée à toute suspension cellulaire biologique, qu'elle soit eucaryote ou procaryote. Dans ce qui précède on a principalement décrit l'invention sous la forme d'un dispositif d'analyse. Mais, l'invention peut être également considérée sous la forme d'un procédé d'analyse pouvant être mis en œuvre par le dispositif d'analyse décrit, ainsi que par ses variantes.
Des applications du procédé, autres que la cytométrie en flux, peuvent être envisagées pour des utilisations in vivo ou in vitro. Par exemple, on peut adapter ce procédé à un dispositif réalisant le balayage d'un tapis cellulaire (frottis, coupes de tissus, notamment), ou d'une suspension cellulaire.
L'invention ne se limite pas aux modes de réalisation de dispositif et de procédé d'analyse optique décrits ci-avant, seulement à titre d'exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l'homme de l'art dans le cadre des revendications ci-après.
ANNEXE
Figure imgf000027_0001
où i = 1 à n, Ij0 est l'intensité maximale du rayonnement Ri, Mj est la profondeur (ou l'amplitude) de modulation (généralement comprise entre 0 à 1), ωi est la fréquence de la modulation appliquée au rayonnement Ri, et t est le temps.
* cii = απηuFπ Ci2 = O Ci3 = O (A2) C2i = απηπFi2 c22= α2iη2iF22 C23 = O
C31 = αuηuFi3 C32 = 0121"21F32 C33 = α3iη3iI3F33
dn = 0 d12 = 0 d13 = 0 (A3) d21 = 0 d22 = Ct22T|22F22 d23 = 0 d3i = 0 d32 = α22η22F32 d33 = α32η32F33
eπ = 0 ei2 = O e,3 = 0 (A4) β2i = 0 e22= 0 e23 = 0 β3i = 0 e32 = 0 e33 = α33η33F33
où αy est le coefficient d'absorption molaire du composé i à la longueur d'onde λj, ηy est le rendement de fluorescence du composé i dans la bande de détection Bj, Fy est le facteur de pondération compris entre 0 et 1 et traduisant le fait que seule une partie du spectre de fluorescence du composé i est filtrée dans la bande de détection Bj.
Figure imgf000027_0002
Q3 = e33 PM3 (CO3) (A7) * PMl= K12 * K13 * PM10 (A8) PM2 = K23 *PM20 + Pi2(I-Ki2)Ki3 PM)0 (A9) PM3 =PM30+ Pi3(I-K13) K13 PM10 + p23 (1-K23)PM10 (AlO)
où Ky est un coefficient de couplage phénoménologique constant, compris entre 0 et 1, et représentant le transfert d'énergie d'un fluorochrome i vers un fluorochrome j, et py est un coefficient représentant le rendement quantique avec lequel la lumière transférée, issue du fluorochrome i, est convertie en lumière de fluorescence par le fluorochrome j.
* PMl = K12 * PM10 (AI l)
PM2 = PM20 + Pi2(I-K12) PM10 (A12) PM3 = PM3O (Al 3)
* PMl(ωl) = κ12 α,iη,,I,F,,Q, (A 14) PM2(ω2) = Ct22T]22I2F22Q2 (Al 5)
PM2(ωl) = α21η2i!iF22Q2 + αnηnliFuQi + pi2(l-κi2)αnηuIiFπQι (Al 6)
Figure imgf000028_0001
* Q1 = (1/K12Cj1I1)PMl(O)I) (Al 8)
Figure imgf000028_0002
* PM = (a, ^a21)Q1 + a22Q2 (A20)
* PM(ω2) = α22η22I2F22 Q2 (A21)
* PM(ωi) ≈ α2iη2iIiF22Q2 + απη iιIi(Fπ+FI2)Qι (A22) * m(Hb,λ) = n(Hb,λ) - i κ(Hb,λ) (A23)
où n(Hb,λ) = n o (λ) + α(λ)*Hb est la partie réelle de l'indice de réfraction, n 0 (λ) est l'indice de réfraction du solvant pur, fonction de la longueur d'onde, α(λ) est le coefficient incrémental de l'indice de réfraction propre à l'hémoglobine et fonction de la longueur d'onde, κ(Hb,λ) = β(λ)*Hb est la partie imaginaire de l'indice de réfraction, et β(λ) est le coefficient d'absorption molaire.
* Cext = πa2Qext (A24)
avec:
Figure imgf000029_0001
m = n-ik : indice de réfraction complexe du globule rouge, p ≈ 2x(n-l) : paramètre donnant l'écart de phase, x =2πa/λ, a : rayon de la sphère, et tan β = κ/(n-l).

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif (DA) d'analyse d'éléments microscopiques, comprenant un espace de mesure (CM) pour des éléments microscopiques à analyser, au moins une source (S) propre à délivrer des rayonnements présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et destinés à interagir avec lesdits éléments microscopiques dans ledit espace de mesure (CM) pour former des rayonnements d'interaction, des moyens de détection (DE, DF) agencés pour transformer en signaux électriques une partie au moins des rayonnements d'interaction provenant dudit espace de mesure (CM), et des moyens d'analyse (MA) agencés pour analyser lesdits signaux électriques de manière à permettre la détermination de données représentatives desdits éléments microscopiques analysés, caractérisé :
- en ce que lesdits rayonnements codés sont conjugués au niveau dudit espace de mesure
(CM),
- en ce qu'il comprend i) des moyens de codage (M) agencés pour coder lesdits rayonnements en amont dudit espace de mesure (CM) avec des codes différents (ωi), et ii) des moyens de filtrage optique (FO, LS) agencés pour filtrer sélectivement lesdits rayonnements d'interaction de fluorescence et/ou de diffusion en fonction de leur longueur d'onde, en amont desdits moyens de détection (DE5DF), et
- en ce que lesdits moyens d'analyse (MA) comprennent des moyens de décodage (DRE, DRF) agencés pour décoder lesdits signaux électriques afin qu'ils soient analysés en fonction de leur code d'origine.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits rayonnements d'analyse (Ri) délivrés par ladite source (S) sont appliqués séquentiellement auxdits éléments microscopiques à analyser.
3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits rayonnements d'analyse (Ri) délivrés par ladite source (S) sont appliqués simultanément auxdits éléments microscopiques à analyser.
4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits moyens de filtrage optique (FO, LS) sont agencés pour filtrer sélectivement lesdits rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au- delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande. 5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite source (S) comprend au moins deux lasers propres à délivrer des rayonnements conjugués au niveau dudit espace de mesure (CM).
6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits lasers sont de type 5 monochrome.
7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite source (S) comprend au moins une diode électroluminescente.
8. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite source (S) comprend une source de rayonnement polychromatique.
10 9.Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite source de rayonnement polychromatique (S) est choisie dans un groupe comprenant au moins un laser polychromatique à spectre sensiblement continu, une lampe à incandescence, une lampe à arc.
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite source (S) est agencée pour délivrer lesdits rayonnements d'analyse selon un mode continu et/ou un mode 15 impulsionnel.
11.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'intensité (Ii) de chaque rayonnement d'analyse (Ri) délivré par ladite source (S) est paramétrable.
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que lesdits moyens de codage (M) sont agencés pour moduler en intensité lesdits rayonnements d'analyse.
20 13.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'une partie au moins desdits moyens de codage (M) est agencée pour agir sur les rayonnements en aval de ladite source (S) de manière à constituer lesdits rayonnements d'analyse.
H.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'une partie au moins desdits moyens de codage (M) est agencée pour agir au niveau de ladite source (S) en amont 25 d'une sortie de distribution des rayonnements d'analyse.
15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite partie des moyens de codage (M) est intégrée dans ladite source (S). lθ.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que lesdits moyens de codage (M) comprennent un modulateur acousto-optique propre à moduler lesdits rayonnements délivrés par ladite source (S) de manière à constituer lesdits rayonnements d'analyse.
17.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que lesdits moyens de 5 détection (DE5DF) comportent une multiplicité de capteurs photosensibles adaptés à la détection de rayonnements d'interaction.
lδ.Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que lesdits moyens de détection (DE5DF) comportent une multiplicité de capteurs photosensibles adaptés à la détection de rayonnements d'interaction et implantés dans un endroit défini par un axe 10 interceptant la direction générale de propagation des rayonnements d'analyse au niveau du passage obligé, cet axe étant orienté par rapport à la direction générale d'un angle compris entre 0° et 360°.
19.Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un système informatique (MC) comportant une interface logicielle de contrôle.
15 20.Procédé d'analyse d'éléments microscopiques, caractérisé en ce qu'il comprend : i) une première étape dans laquelle on illumine des éléments microscopiques au niveau d'un espace de mesure (CM) au moyen de rayonnements d'analyse conjugués au niveau dudit espace de mesure (CM) et présentant au moins deux longueurs d'onde d'analyse différentes et des codages selon des codes différents choisis, de manière à former des rayonnements
20 d'interaction, ii) une deuxième étape dans laquelle on collecte une partie au moins desdits rayonnements d'interaction, puis on les sépare et filtre en fonction de leur longueur d'onde, iii) une troisième étape dans laquelle on détecte lesdits rayonnements d'interaction filtrés, puis on les transforme en signaux électriques, et
25 iv) une quatrième étape dans laquelle on décode lesdits signaux détectés en fonction de leur code d'origine de manière à permettre la détermination de données représentatives desdits éléments microscopiques analysés.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que dans la première étape on applique séquentiellement lesdits rayonnements d'analyse (Ri) auxdits éléments microscopiques à 30 analyser. 22.Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que dans la première étape on applique simultanément lesdits rayonnements d'analyse (Ri) auxdits éléments microscopiques à analyser.
23.Dispositif selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que dans la deuxième étape on filtre sélectivement lesdits rayonnements d'interaction de type fluorescence dont les longueurs d'onde appartiennent à des bandes d'analyse de fluorescence respectivement intercalées entre deux longueurs d'onde d'analyse et placée(s) au-delà de la longueur d'onde d'analyse la plus grande.
24.Procédé selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que dans la quatrième étape on déduit des signaux résultant de la transformation des rayonnements d'interaction représentatifs d'une diffusion, l'indice de réfraction d'un type d'éléments microscopiques analysés.
25.Procédé selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisé en ce que dans la quatrième étape, en présence d'un échantillon de sang total, on détermine la concentration en hémoglobine corpusculaire des cellules de la lignée érythrocytaire à partir dudit indice de réfraction.
26.Procédé selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en ce que dans la quatrième étape on déduit de signaux résultant de l'interaction entre lesdits rayonnements d'analyse et deux fluorochromes différents, spatialement proches, un degré de couplage représentatif du transfert d'énergie entre lesdits fluorochromes.
27.Utilisation du dispositif et du procédé d'analyse selon l'une des revendications précédentes dans un domaine choisi dans un groupe comprenant l'analyse biologique, biochimique, chimique, particulaire, morphologique, et en particulier la cytométrie de flux multiparamétrique, l'analyse de particules chargées dans un fluide liquide ou gazeux, et la granulométrie.
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