WO2006118199A1 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 - Google Patents

高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 Download PDF

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WO2006118199A1
WO2006118199A1 PCT/JP2006/308850 JP2006308850W WO2006118199A1 WO 2006118199 A1 WO2006118199 A1 WO 2006118199A1 JP 2006308850 W JP2006308850 W JP 2006308850W WO 2006118199 A1 WO2006118199 A1 WO 2006118199A1
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carbon atoms
cholesterol
linear
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PCT/JP2006/308850
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Yuki Katayama
Mayumi Fujinaka
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Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cholesterol in a high-density lipoprotein in a sample, a measuring reagent, and a measuring kit.
  • HDL high density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • CM Chylomicron
  • HDL is related to the removal of cholesterol accumulated in cells because each tissue force including arterial wall also receives cholesterol, and is a risk prevention factor for various arteriosclerosis such as coronary arteriosclerosis.
  • the blood level is known to be a useful guide for predicting the onset of arteriosclerotic diseases.
  • HDL cholesterol Conventional methods for measuring cholesterol in HDL (hereinafter abbreviated as HDL cholesterol) include fractionation operations such as ultracentrifugation, immunochemical methods, electrophoresis, and precipitation, and cholesterol determination procedures. There is also a stage power. However, the fractionation operation is complicated and requires a long time, and there is a problem in terms of safety. Therefore, these measurement methods involving separation operations are extremely inefficient and unsuitable for practical use.
  • a method for measuring HDL cholesterol by reacting with the enzyme in a buffer containing a rusterase, cholesterol oxidase, a bile acid group surfactant, and a nonionic surfactant (see Patent Document 2) It has been known. In the measurement method described in Patent Document 2, first, the reaction between LDL cholesterol and the enzyme proceeds, and then the reaction between HDL cholesterol and the enzyme proceeds, whereby HDL cholesterol can be measured.
  • these measuring methods require a long time for the measurement, and are not always effective in measuring methods specific to HD L cholesterol.
  • Methods for measuring HDL cholesterol by aggregating lipoproteins other than HDL include, for example, reagents that aggregate non-HDL lipoproteins such as dextran sulfate, divalent metal salts, and chemically modified Measurement method using enzyme (see Patent Document 3), reagent that forms a complex with lipoproteins other than HDL such as polyanion, and lipoprotein such as polyoxyethylene polyoxypropylene condensate (See Patent Document 4), polyions such as dextran sulfate, divalent metal salts, specific nonionic surfactants, and albumin different from albumin derived from the sample.
  • non-HDL lipoproteins such as dextran sulfate, divalent metal salts, and chemically modified Measurement method using enzyme
  • reagent that forms a complex with lipoproteins other than HDL such as polyanion
  • lipoprotein such as polyoxyethylene polyoxypropylene condensate
  • polyions such as dextran sulfate, divalent metal
  • Examples of methods for measuring HDL cholesterol without aggregating lipoproteins other than HDL include biological samples, spleen-derived cholesterol esterase and cholesterol
  • a method for measuring HDL cholesterol in a biological sample by reacting oxidase with bile acid or a salt thereof and albumin and measuring a compound consumed or produced by the enzyme reaction see Patent Document 7
  • HDL fraction In the presence of a nonionic surfactant with an HLB value of 16 or more that has selectivity for lipase, lipoprotein lipase and Z or cholesterol esterase and cholesterol acidase that preferentially act on the HDL fraction.
  • a method of measuring HDL cholesterol in a specimen by reacting with an enzyme is known.
  • cholesterol in lipoproteins other than HDL is preferentially converted to hydrogen peroxide using the acyl polyoxyethylene sorbitan ester, and the generated peroxyhydrogen is removed.
  • a method of enzymatically measuring HDL cholesterol by addition is also known.
  • a sample is analyzed with i) cholesterol ester hydrolase and cholesterol acid enzyme, or ii) cholesterol ester hydrolase, acid type. It is characterized by reacting coenzyme and cholesterol dehydrogenase in an aqueous medium containing nonionic surfactant, polyion and albumin, and measuring the generated hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • a method for measuring HDL cholesterol in a sample (see Patent Document 10), a sample, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase, or cholesterol ester hydrolase, acid ⁇ type coenzyme and cholesterol dehydration Enzyme produced in the reaction with an aqueous medium containing a bile acid derivative.
  • Measurement method (patent documents HDL cholesterol, which comprises measuring the hydrogen or - reducing coenzyme
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 62-69999
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 63-126498
  • Patent Document 3 JP-A-8-131197
  • Patent Document 4 JP-A-8-201393
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 9-285298
  • Patent Document 6 JP-A-8-116996
  • Patent Document 7 International Publication No. 97Z40376 Pamphlet
  • Patent Document 8 International Publication No. 00Z52480 Pamphlet
  • Patent Document 9 JP-A-9 299
  • Patent Document 10 International Publication No. 2004Z035816 Pamphlet
  • Patent Document 11 Pamphlet of International Publication No. 2004Z035817
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring HDL cholesterol, a measuring reagent, and a measuring kit, which can be measured easily and accurately.
  • the inventor of the present invention diligently studied to solve the above-mentioned problems, and cholesterol ester hydrolysis was carried out in the presence of a specific nitrogen-containing surfactant having a structure of an amine or an ammonium salt and a polyone.
  • the inventors have found that a degrading enzyme and cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase specifically act on HDL, and have completed the present invention. That is, the present invention relates to the following (1) to (13).
  • Specimen and i) cholesterol ester hydrolase and cholesterol acid fermentase, or ii) cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase are represented by the general formula (I)
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 2 represents a linear or branched carbon group having 1 to 30 carbon atoms.
  • X represents an anion
  • R 5 represents a linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms or a alkenyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom
  • a linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms or a alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms and at least one substance selected from the group consisting of substance forces, and polyion
  • a method for measuring cholesterol in a high-density lipoprotein in a specimen which comprises reacting in a water-containing aqueous medium and measuring the produced hydrogen peroxide or reduced coenzyme.
  • aqueous medium further contains at least one substance selected from the group consisting of albumin, polyoxyethylene alkylamine, and polyoxyethylene alkenylamine.
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 2 represents a linear or branched carbon group having 1 to 30 carbon atoms.
  • X represents an anion
  • R 5 represents a linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms or an alkenyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 2 represents a linear or branched carbon group having 1 to 30 carbon atoms.
  • R 5 represents a linear or branched alkyl group or alkyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein comprising a first reagent and a second reagent, having the general formula (I)
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms or a alkenyl group
  • R 2 represents a linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms.
  • R 3 and R 4 are the same or different and are each linear or A branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and X represents an anion
  • X represents an anion
  • R 5 represents a linear or branched alkyl group or alkyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom
  • a linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms or a alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms and at least one substance selected from the group consisting of material forces, and polyion Is contained in the first reagent
  • cholesterol oxidase is contained in the second reagent
  • the hydrogen peroxide measurement reagent is contained in either the first reagent, the second reagent, or both
  • the cholesterol ester hydrolase is contained in the first reagent.
  • a kit for measuring cholesterol in high-density lipoprotein comprising a first reagent and a second reagent, having the general formula (I)
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms or a alkenyl group
  • R 2 represents a linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms.
  • an alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms, and R 3 and R 4 are the same or different and each represents a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms.
  • R 5 represents a linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms or alkenyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom
  • a linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms or a alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms and at least one substance selected from the group consisting of material forces, and polyion Is contained in the first reagent
  • cholesterol dehydrogenase is contained in the second reagent
  • oxidized coenzyme is contained in either the first reagent, the second reagent, or both
  • the cholesterol esterase hydrolyzing enzyme is contained in the first reagent.
  • At least one substance selected from the group consisting of albumin, polyoxyethylene alkylamine, and polyoxyethylene alkylamine is contained in either or both of the first reagent, the second reagent, and cholesterol ester hydrolysate.
  • the present invention provides a simple and accurate method for measuring HDL cholesterol, a reagent for measurement, and a kit for measurement.
  • the method for measuring HDL cholesterol according to the present invention is a method for measuring HDL cholesterol without eliminating cholesterol in lipoproteins other than HDL and without aggregating cholesterol in lipoproteins other than HDL. It is.
  • force plasma and serum including whole blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, spleen and the like are preferable.
  • the cholesterol esterase-degrading enzyme in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to hydrolyze cholesterol ester.
  • cholesterol esterase and lipoprotein lipase produced by genetic engineering techniques can be used.
  • cholesterol ester water-degrading enzyme unmodified cholesterol ester hydrolase or chemically modified cholesterol ester hydrolase can be used.
  • cholesterol esterase hydrolyzing enzymes include cholesterol esterase “Amano” 2 (CHE2; manufactured by Amano Enzyme), cholesterol esterase “Amano” 3 (CHE3; manufactured by Amano Enzym), lipoprotein lipase.
  • LPL311 manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • lipoprotein lipase "Amano” 3 LPL3; manufactured by Amano Enzym
  • 43kDa esterase manufactured by Amano Enzym
  • 40kDa esterase manufactured by Amano Enzym
  • ES T “Amano” 2 (Manufactured by Amano Enzyme)
  • COE313 chemically modified cholesterol esterase
  • Examples of the (chemically modifying group) include a group having polyethylene glycol as a main component, a group having polypropylene glycol as a main component, a group having a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol, a group containing a water-soluble polysaccharide, Forces such as sulfopropyl group, sulfobutyl group, polyurethane group, group having chelate function, etc. Groups based on coal are preferred.
  • Examples of the water-soluble polysaccharide include dextran, pullulan, and soluble starch.
  • a functional group capable of reacting with the above-mentioned chemical modification group and the amino group, carboxyl group, sulfhydryl group, etc. of the enzyme examples thereof include compounds having both a group and a structure.
  • Examples of functional groups or structures that can react with amino groups in the enzyme include carboxyl groups, active ester groups (N-hydroxysuccinimide groups, etc.), acid anhydrides, acid chlorides, aldehydes, epoxide groups, 1, 3 Examples include propane sultone and 1,4 butane sultone.
  • the functional group or structure capable of reacting with a carboxyl group in the enzyme include an amino group.
  • groups or structures reactive with sulfhydryl groups in enzymes include maleimide groups
  • Chemical modifiers include Sunbright VFM—4101, Sunbright ME—050AS, and Sunbright DE—030 AS (both containing polyethylene glycol as the main component and N-hydroxysuccinimide group) Manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., Sunbright AKM series (for example, Sunbright AKM-1510, etc.) having a group mainly composed of polyalkylene glycol and an acid anhydride structure, Sunbright ADM series, Sunbright ACM series (all Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), EPOX-3400 with polyethylene glycol as the main component and epoxide group, M-EPOX-5000 (also from Sheawater Polymers), group with chelate function and acid anhydride structure Diethylenetriamine-N, N, ⁇ ', ⁇ ", ⁇ " pentahydrodiacetic anhydride (DTPA anhydride; manufactured by
  • the chemical modification of cholesterol esterase is not limited to this method, for example, by the following method.
  • a pH 8.0 or higher buffer solution for example, HEPES buffer solution
  • 0 to 1 to 500 times the molar amount of a chemical modifier is added at 0 to 55 ° C. Stir for minutes to 5 hours.
  • a chemically modified cholesterol ester hydrolase not only the reaction solution itself, but also unreacted chemical modifiers, etc. were removed by ultrafiltration membranes, etc. as necessary. Can be used as well.
  • the concentration of the cholesterol ester hydrolase used in the method of this reaction is not particularly limited as long as it enables the measurement of HDL cholesterol of the present invention, but is 0.01 to 400 UZmL in the reaction solution. A concentration of 0.02 to 200 U / mL is more preferable.
  • the cholesterol oxidase enzyme in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to oxidize cholesterol to produce hydrogen peroxide, for example, an animal, plant or microorganism-derived cholesterol oxidase.
  • cholesterol oxidase produced by genetic engineering techniques can also be used, such as cholesterol oxidase “Amano” l (CHOD1; Amano Enzyme), cholesterol oxidase (CH OPE; Kikkoman).
  • Commercially available products such as cholesterol oxidase (C00321; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), cholesterol oxidase Kyowa (manufactured by Kyowa Hakko), etc.
  • the cholesterol acid enzyme may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • the chemically modified cholesterol oxidase enzyme can be prepared by the above-described chemical modification method using, for example, the above-described chemical modifier.
  • the concentration of cholesterol acid enzyme used in the reaction method is not particularly limited as long as it is a concentration that enables measurement of HDL cholesterol of the present invention, but is 0.01 to 400 UZmL in the reaction solution.
  • the concentration is preferably 0.02 to 200 UZmL.
  • the cholesterol dehydrogenase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to oxidize cholesterol in the presence of an oxidized coenzyme to produce a reduced coenzyme.
  • cholesterol dehydrogenase produced by genetic engineering techniques and the like can also be used.
  • Commercial products such as cholesterol dehydrogenase “Amano” 5 (CHDH5; manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) can also be used.
  • two or more kinds of cholesterol dehydrogenase can be used in combination.
  • Cholesterol dehydrogenase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme. scientific Cholesterol dehydrogenase modified in the above manner can be prepared by the above-described chemical modification method using, for example, the above-described chemical modifier.
  • the concentration of cholesterol dehydrogenase used in the method of the present reaction is not particularly limited as long as it is a concentration that enables measurement of HDL cholesterol of the present invention.
  • a concentration of 400 UZmL is preferred.
  • a concentration of 0.02 to 200 UZmL is more preferred.
  • oxidized coenzyme In the measurement method using cholesterol dehydrogenase of the present invention, oxidized coenzyme is used.
  • the oxidized coenzyme include NAD, NADP, thio-NAD, thio-NADP and the like.
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 2 represents a linear or branched carbon group having 1 to 30 carbon atoms.
  • R 5 represents a linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms or an alkenyl group.
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms, or a alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms.
  • Substance to be used [hereinafter referred to as compound ( ⁇ )] is used.
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms in compound (I) and compound ( ⁇ ⁇ ⁇ ) include hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), Tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl, henicosyl, docosyl (beher), tricosyl, tetracosyl, pentacosyl, hexacosyl, heptacosyl, octacosyl , Nonacosyl, triaconsil, and the like, and an alkyl group having 8 to 24 carbon atoms is preferred, and an alkyl group having 10
  • Examples of the straight chain or branched alkenyl group having 6 to 30 carbon atoms in the compound (I) and the compound ( ⁇ ) include hexyl, heptul, otatur, nonel, dece- , Citronellyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadesel, heptadecyl, oleil, nonadecele, eicosole, hen eicosenore, dococennole, Examples include tricoseninoles, tetracoseninoles, pentacoceninoles, hexacosels, heptacoses, octacoses, nonacoses, triacontails, etc., preferably alkenyl groups having 8 to 24 carbon atoms. More preferably, it is an alkenyl group having 10 to 18 carbon atom
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms in the compound (I) and the compound ( ⁇ ) include, for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl.
  • the group include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and the like, and it is more preferably a methyl group that is preferably a methyl, ethyl, or propyl group.
  • Examples of the straight chain or branched alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms in the compound (I) and the compound ( ⁇ ) include, for example, bur, probe, allyl, butenyl, pentyl, hexyl. , Heptul, otatur, nonel, deseal, citronellyl, undecyl, dodecyl, tridecenyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, oleil, nonadece -E.g., eicosel, henecosyl, docosel, tricocennenole, tetracoseninole, pentacosennenole, hexacoseninole, heptacoceinole, octacocele, nonacoseol, triaconte, etc.
  • Examples of the straight-chain or branched alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms in the compound (I) and the compound ( ⁇ ⁇ ⁇ ) include, for example, bur, probe, allyl, butyl, pentale, and the like.
  • Xenyl and the like can be mentioned, and it is more preferable that it is a vinyl group, which is preferably either a bull or a probe group.
  • Examples of the anion in compound (I) include a hydroxide ion, a halogen ion, an anion derived from an inorganic acid, an anion derived from an organic acid, and the like.
  • Examples of the halogen ion include fluorine ion, chlorine ion, bromine ion and iodine ion.
  • Examples of the anion derived from an inorganic acid include nitrate ion, sulfate ion, phosphate ion, carbonate ion and the like.
  • Examples of the anions derived from organic acids include formate ions, acetate ions, lactate ions, citrate ions, carboxylate ions such as glutamate ions, and the like.
  • R 1 represents a linear or branched alkyl group or alkyl group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 2 represents a linear or branched group.
  • Preferred is a compound which represents a branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms or an alkenyl group having 2 to 30 carbon atoms
  • R 3 and R 4 both represent methyl
  • X represents an anion.
  • Specific examples (products) of compound (I) include cation AB, cation BB, cation 2 ABT, cation 2DB-500E, cation 2-OLR (all manufactured by NOF Corporation) and the like.
  • Specific examples (products) of compound ( ⁇ ) include Ammin BB, Ammin AB, Ammin 2 — OLR, Grade 3 Ammin BB, Grade 3 Amine FB (all manufactured by NOF Corporation).
  • the concentration of the compound (I) or the compound ( ⁇ ⁇ ) is not particularly limited as long as the concentration of the HDL cholesterol of the present invention can be measured, but the concentration in the reaction solution is 0.0001 to 1%. It is preferable that 0.001 to 0.1% is more preferable.
  • the polyion used in the present invention is not particularly limited as long as it is a polyion capable of measuring the HDL cholesterol of the present invention.
  • dextran sulfate or a salt thereof henone or a salt thereof, phosphorus Tungstic acid or its salt, sulfated cyclodextrin or its salt, sulfated oligosaccharide or its salt, and the like.
  • Dextrane sulfuric acid or its salt is preferable.
  • Examples of dextran sulfate include dextran sulfate having a molecular weight of 40,000, 80,000, 200,000, 500,000, 1 million, 2 million, and the like.
  • sulfated oligosaccharides include diagarose sulfate, sulfated trehalose, and chondroitin sulfate.
  • the salt include sodium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt, magnesium salt and the like.
  • two or more polyones may be used.
  • the polyaion concentration in the measurement of HDL cholesterol of the present invention is not particularly limited as long as it can measure the HDL cholesterol of the present invention, but the concentration in the reaction solution is 0.001 to 10. % Is preferred. 0.01-1% is more preferred.
  • the albumin used in the present invention is not particularly limited as long as it is an albumin capable of measuring the HDL cholesterol of the present invention, such as ushi, horse, hidge, human-derived albumin and the like. Forced serum albumin (BSA) is preferred.
  • BSA Forced serum albumin
  • albumin produced by genetic engineering techniques can also be used.
  • two or more types of albumin can be used in combination.
  • the concentration of albumin in the measurement of HDL cholesterol of the present invention is not particularly limited as long as it enables the measurement of HDL cholesterol of the present invention, but the concentration in the reaction solution is 0.001 to 10%. Preferably, 0.01 to 1% is more preferable.
  • polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylenealkylamine used in the present invention is, for example, represented by the general formula (III)
  • R 8 represents a linear or branched alkyl group or a alkenyl group
  • R 9 represents a hydrogen atom or (CH 2 CH 2 O) H
  • m and n are the same or different, 1 to 100
  • M + n is an integer of 2 to 200] [hereinafter referred to as compound (III)].
  • alkyl group and alkenyl group in the compound ( ⁇ ) include, for example, the above-described linear or branched alkyl group having 6 to 30 carbon atoms, and the above-described linear or branched carbon group having 6 to 6 carbon atoms. 30 alkyl groups and the like, and preferably an alkyl group having 8 to 24 carbon atoms or an alkyl group, preferably an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms or an alkenyl group. I like it!
  • polyoxyethylene alkylamine or polyoxyethylene alkylamine include, for example, Niimine L201 (oxyethylene dodecylamine; manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), Naimine L207 (Polyoxyethylene dodecyl) Nymeen S204, Nymeen S210 (Polyoxyethylene Octadecylamine; produced by Nihon Yushi Co., Ltd.), New Coal OD420 (Polyoxyethylene Octadecylamine; Nippon Milky Co., Ltd.) ), Bionine D3104 (polyoxyethylene laurylamine; manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.), Bionine D3110 (polyoxyethylene laurylamine; manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.), Nyonin D3605 [Polyoxyethylene alkyl (soy) Amamine; Takemoto Yushi Co., Ltd.) Bionin D3615T [Polyoxyethylene alkyl (beef
  • the degree of polymerization of the oxyethylene chain in the polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkyleneamine is preferably 1 to 100, more preferably 1 to 60.
  • two or more types of polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkylamine may be used.
  • the concentration of the oxyethylene alkyleneamine is not particularly limited as long as it enables the measurement of HDL cholesterol of the present invention, but the concentration in the reaction solution is preferably 0.0001 to 1%. Mashi 0. 001-0. 1% is more preferable.
  • the aqueous medium used in the HDL cholesterol measurement method of the present invention is preferably a force buffer solution such as deionized water, distilled water, or buffer solution.
  • a force buffer solution such as deionized water, distilled water, or buffer solution.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
  • Good buffering agents include, for example, 2 morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminonic acid (ADA), piperazine 1 N, N, 1 bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPE S), N— (2 acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino 1 2-hydroxypropanesulfone Acid (MOPSO), N, N bis (2-hydroxyethyl) 2 aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] 2 aminoethanesulfonic acid (TES), 2- [4- (2-Hydroxyethyl) 1-piperadyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 3- [N, N bis
  • TAPS N cyclohexyl 2 Aminoethanesulfonic acid
  • CHES N-cyclohexyl 3 Amino 2 hydroxypropane sulfonic acid
  • CAPSO propanesulfonic acid
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is suitable for the measurement, but is preferably 0.001 to 2. Omol /! L force, more preferably 0.005 to 1.0 mol /: L force ⁇ ! / ⁇ .
  • Examples of the method for measuring HDL cholesterol of the present invention include the methods of the following aspects.
  • HDL cholesterol in a sample can be measured by calculating the HDL cholesterol concentration in the sample from the value measured in (2) and a calibration curve prepared in advance.
  • the reaction of (1) is performed, for example, at 10 to 50 ° C, preferably at 20 to 40 ° C, for 1 to 60 minutes, preferably 2 to 30 minutes.
  • the amount of hydrogen peroxide generated can be measured, for example, with a reagent for measuring hydrogen peroxide, which can be directly measured with a hydrogen peroxide electrode.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for converting the produced hydrogen peroxide to a detectable substance.
  • the detectable substance include a dye and luminescence, and a dye is preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide contains an oxidative coloring type chromogen and a peroxidase active substance such as peroxidase.
  • the oxidative coloring type chromogen include the following oxidative coloring type chromogen.
  • the reagent for hydrogen peroxide measurement contains a chemiluminescent substance.
  • the chemiluminescent substance include luminol, isoluminol, lucigenin, and atalydium ester.
  • a reagent containing a peroxide active substance such as an oxidative coloring type chromogen and peroxidase
  • hydrogen peroxide is oxidized in the presence of the peroxide active substance. Reacts with chromogenic chromogen to produce dye, and quantifies the dye produced
  • peroxyhydrogen can be quantified.
  • hydrogen peroxide measuring reagent containing a chemiluminescent substance hydrogen peroxide peroxygen reacts with the chemiluminescent substance to generate photon, and the generated photon is quantified. Acidic hydrogen can be quantified.
  • Examples of the oxidative coloring chromogen include a leuco chromogen and an oxidative coupling coloring chromogen.
  • Leuco-type chromogens are substances that are converted to pigments alone in the presence of peroxide active substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • peroxide active substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) -10H phenothiazine
  • M CDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) -10H phenothiazine
  • Oxidative coupling chromogenic chromogen is a substance that produces a dye by acid coupling of two compounds in the presence of a peroxidation active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • Examples of the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an arylene, a combination of a coupler and a phenol.
  • Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • the concentration of the peracid active substance is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for the measurement, but peroxidase is used as the peracid active substance. When used, 1 to: LOOkUZL is preferable.
  • the concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 gZL.
  • Examples of the method for measuring reduced coenzyme include a method of measuring the absorbance of the produced reduced coenzyme, a method using a reagent for measuring reduced coenzyme, and the like.
  • the absorbance in the method for measuring the absorbance of the reduced coenzyme is preferably 300 to 500 nm, more preferably 330 to 400 nm, and particularly preferably around 340 nm.
  • the reagent for measuring reduced coenzyme is a reagent for converting the produced reduced coenzyme into a detectable substance. Examples of the detectable substance include a dye.
  • Examples of the reagent for reducing coenzyme when the detectable substance is a dye include a reagent containing diaphorase, an electron carrier, and a reduced color developing chromogen.
  • Examples of the electron carrier include 1-methoxy 5-methylphenmethyl methyl sulfate and the like.
  • Examples of reducing chromogens include 3- (4,5 dimethyl-2-thiazolyl) 2,5-diphenyl-1,2H-tetrazolium bromide (MTT) ⁇ 2- (4-iodophenol). ) 3— (4-Trophele) 5— (2, 4 Disulfophenol) 2H— Tetrazolium mononatri UM salt (WST— 1), 2— (4—Edophenol) —3— (2, 4-Dinitrophenol) — 5— (2, 4-Disulfophenol) — 2H—Tetrazolium monosodium Examples include salt (WST-3).
  • the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention comprises at least one substance selected from the group consisting of compound (I) and compound (i), polyion, cholesterol ester hydrolase, cholesterol acid enzyme and peracid acid.
  • the reagent for measurement includes at least one substance selected from the group consisting of compound (I) and compound ( ⁇ ), polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkylamine-group.
  • a reagent containing at least one substance, polyan-one, cholesterol esterase, cholesterol acid enzyme and peracid hydrogen measuring reagent, compound (I) and compound ( ⁇ ) A reagent containing at least one substance selected from the group consisting of polyanone, albumin, cholesterol ester-hydrolyzing enzyme, cholesterol acid enzyme and peracid hydrogen measuring reagent is preferred.
  • the measurement reagent at least one substance selected from the group consisting of the compound (I) and the compound ( ⁇ ) force, polyoxyethylene alkylamine and a group force including the polyoxyethylene alkylamine force are also selected.
  • the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention comprises at least one substance selected from the group consisting of compound (I) and compound (v), polyion, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, and oxidation. Containing a coenzyme, and, if necessary, containing at least one substance selected as a reduced coenzyme measuring reagent, albumin, polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkylamine as well as group power .
  • the measurement reagent is a compound selected from the group consisting of Compound (I) and Compound (I). At least one substance, polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkylkeamine, which are also selected for their group strength, polyone, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme And a reagent containing a reagent for measuring reduced coenzyme, at least one substance selected from the group consisting of compound (I) and compound (II), polyone, albumin, cholesterol ester carohydrolyzing enzyme, cholesterol dehydrogenation Reagents containing enzymes, oxidized coenzymes and reduced coenzyme measuring reagents are preferred.
  • the reagent for measurement at least one substance selected from the group consisting of compound (I) and compound ( ⁇ ) force, polyoxyethylene alkylamine and group force consisting of polyoxyethylene alkylamine force are also selected. Particularly preferred are those containing at least one substance, polyone, albumin, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, acid coenzyme, and reduced coenzyme measuring reagent.
  • Examples of the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention include the reagents of the following embodiments, but these do not limit the scope of the present invention.
  • at least one substance selected from compound (I) and compound ( ⁇ ) group power is hereinafter referred to as “compound A”, and albumin, polyoxyethylene alkylamine, and polyoxyethylene alkylamine strength.
  • the group power of at least one selected substance is hereinafter referred to as “Compound B”.
  • one or more compounds A can be used, and one or more compounds B can be used.
  • a reagent containing Compound A, polyone, cholesterol ester-hydrolyzing enzyme, cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing Compound A, Polyone, Compound B, cholesterol esterase, cholesterol acid enzyme and peracid hydrogen reagent is a reagent containing Compound A, Polyone, Compound B, cholesterol esterase, cholesterol acid enzyme and peracid hydrogen reagent.
  • a reagent containing Compound A, Polyone, Compound B, cholesterol esterase, acid coenzyme and cholesterol dehydrogenase is provided.
  • a reagent containing Compound A, polyion, cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase and a reagent for measuring reduced coenzyme is provided.
  • a reagent containing Compound A, Polyone, Compound B, cholesterol esterase, acid coenzyme, cholesterol dehydrogenase enzyme, and reduced coenzyme measurement reagent is provided.
  • the reagent for measuring HDL cholesterol of the present invention may be stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the form of the kit is not particularly limited, and may be a two-reagent system or a three-reagent system, but a two-reagent system is preferred.
  • the cholesterol esterase-hydrolyzing enzyme and the cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase include the first reagent and the second reagent. It may be contained separately in the reagent or together in the second reagent, but when it is contained separately in the first reagent and the second reagent, cholesterol esterase is added to the first reagent.
  • An embodiment in which cholesterol acid zyme enzyme or cholesterol dehydrogenase is contained in the second reagent is preferred.
  • the acid type coenzyme used in the measurement method using cholesterol dehydrogenase may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • the compound (I) and the compound (v) force group power At least one substance selected (compound A) may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent. It is preferably contained in the reagent. Polyone may be contained in either the first reagent, the second reagent, or both, but is preferably contained in the first reagent.
  • the group power of albumin, polyoxyethylene alkylamine and polyoxyethylene alkenyl amine is selected from the group consisting of a first reagent, a second reagent, and a second reagent. May be contained in either or both of the reagents.
  • the hydrogen peroxide measurement reagent may be contained in one or both of the first reagent and the second reagent.
  • the reagent contains an oxidatively coupled chromogen
  • the reducing coenzyme measuring reagent may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but is preferably contained in both the first reagent and the second reagent.
  • kits for measuring HDL cholesterol of the present invention include the following kits, but these do not limit the scope of the present invention.
  • Compound A polyone, hydrogen peroxide measuring reagent, cholesterol ester hydrolase
  • Compound B reagent for measuring hydrogen peroxide, cholesterol acid enzyme
  • Compound B reagent for measuring hydrogen peroxide, cholesterol esterase, cholesterol esterase
  • Ki, t9 First reagent
  • Compound A polyanion, oxidized coenzyme, reagent for measuring reduced coenzyme, cholesterol esterase
  • Reductive coenzyme measurement reagent cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase
  • Reductive coenzyme measurement reagent cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase
  • Compound A polyanion, oxidized coenzyme, reagent for measuring reduced coenzyme, cholesterol ester hydrolase second reagent
  • Compound B reagent for measuring reduced coenzyme, cholesterol dehydrogenase
  • Compound B reagent for measuring reduced coenzyme, cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase
  • the above-mentioned present invention is provided.
  • Compound (I), Compound ( ⁇ ), Polyanion, Albumin, Polyoxyethylene alkylamine, Polyoxyethylene alkylamine, Cholesterol ester-hydrolyzing enzyme mentioned in the method for measuring HDL cholesterol Cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, oxidized coenzyme, hydrogen peroxide measuring reagent, and reduced coenzyme measuring reagent can be used.
  • the reagent for measuring HDL cholesterol and the kit for measurement of the present invention may contain an aqueous medium, a stabilizer, a preservative, an influential substance erasing agent, a reaction accelerator and the like, if necessary.
  • an aqueous medium the above-mentioned aqueous medium etc. are mentioned, for example.
  • the stabilizer include ethylene diamine amine acetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride and the like.
  • antiseptics include sodium azide and antibiotics.
  • Examples of the influence substance elimination agent include ascorbate oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid.
  • the reaction accelerator include enzymes such as colipase and phospholipase, and salts such as sodium sulfate and sodium chloride.
  • the HDL cholesterol measurement reagent and measurement kit of the present invention may be either lyophilized or dissolved in an aqueous medium.
  • the reagent is used after being dissolved in an aqueous medium.
  • the content of cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and cholesterol dehydrogenase in the HDL cholesterol measurement reagent and measurement kit of the present invention is such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to 1200 U /
  • the content of mL is preferable.
  • the content of 0.02 to 600 U / mL is more preferable.
  • the content of the compound (I) or the compound ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) in the HDL cholesterol measurement reagent and measurement kit of the present invention is such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.0001 to 3%. A content of 0.001-0.3% is more preferred.
  • the polyaone content in the reagent for measuring HD L cholesterol and the measurement kit of the present invention is preferably such that the concentration in the state dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 30%. A content of ⁇ 3% is more preferred.
  • Albumin in the HDL cholesterol measurement reagent and measurement kit of the present invention The content is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 30%, more preferably 0.01 to 3%.
  • the content of polyoxyalkylamine or polyoxyethylene alkylamine in the HDL cholesterol measurement reagent and measurement kit of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.0001 to 3%. A content of 0.001 to 0.3% is more preferable.
  • HEPES (manufactured by BDH Laboratory), EMSE (manufactured by Daito Chemix), sodium sulfate (manufactured by Kanto Yigaku Co., Ltd.), Amine BB (Dodecylamine; manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), Class 3 Ammine BB (Dodecyldimethylamine) ; Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), Cationic BB (Dodecyltrimethylammonium chloride; Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), Dextran Sodium Sulfate (Molecular Weight 500,000) (manufactured by Pharmacia), Usi Serum Albumin (BSA; Proliantone Earth) , 4-Aminoantipyrine (Saikyo Kasei Co., Ltd.), Peroxidase (Toyobo Co., Ltd.), 43 kDa esterase (Cholesterol ester hydrolase; Amano Enzyme),
  • first reagent (reagent A) and second reagent (reagent a) powerful HDL cholesterol measurement kits were prepared.
  • first reagent (reagent B) and second reagent (reagent a) powerful HDL cholesterol measurement kits were prepared.
  • first reagent (reagent C) and second reagent (reagent a) powerful HDL cholesterol measurement kits were prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent (reagent D) and second reagent (reagent a) was prepared.
  • An HDL cholesterol measurement kit comprising the following first reagent (reagent C) and second reagent (reagent b) was prepared.
  • the following kit for measuring HDL cholesterol was also prepared with the ability of the following first reagent (reagent D) and second reagent (reagent b).
  • kits for measuring HDL cholesterol were prepared, including the following first reagent (reagent E) and second reagent (reagent a).
  • absorbance represents a value obtained by subtracting E1 from E2 based on two absorbances (E1 and E2) measured in the following reaction.
  • the ⁇ absorbance '' in the sample was determined in the same manner as the (absorbance) calculation method in (1). Calculated.
  • HDL cholesterol in 30 samples of human serum was measured by Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as in the measurement method of Example 7, except that the kit of Comparative Example 1 was used instead of the kit of Example 1.
  • the present invention provides a method for measuring HDL cholesterol, a reagent for measurement and a kit for measurement useful for diagnosis of diseases such as arteriosclerosis.

Abstract

　簡便で、かつ、正確な測定を可能とするＨＤＬコレステロールの測定試薬、測定用試薬および測定用キットを提供する。 　検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、アミンまたはアンモニウム塩の構造を有する特定の含窒素界面活性剤およびポリアニオンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。

Description

明 細 書
高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬 および測定用キットに関する。
背景技術
[0002] 生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、 HDLと略記する）、低密 度リポ蛋白（以下、 LDLと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、 VLDLと略記する）、 カイロミクロン (以下、 CMと略記する）に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種 類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成もさまざまである。 その中で、 HDLは、動脈壁を含めた各組織力もコレステロールを受け取るために細 胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする 各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症 予知の有用な指針となることが知られている。
[0003] 従来の HDL中のコレステロール（以下、 HDLコレステロールと略記する）の測定法 は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法等による分画操作とコレステ ロール定量操作の 2段階力もなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長 時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離 操作を伴う測定法は極めて効率が悪ぐ実用化に適さない方法であった。
[0004] 近年、上記の問題を解決するために、種々の測定法が報告されて 、る。例えば、血 清または血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールォキシダーゼ、および 、胆汁酸塩または胆汁酸誘導体またはジォクチルスルホサクシネートを含有する緩 衝液中で当該酵素と反応させ、 VLDLおよび LDL中のコレステロールを HDLコレス テロールに先駆けて反応させ、生成した過酸化水素を測定した後、非イオン系のポリ ォキシエチレンォキシド基含有界面活性剤を反応液に添カ卩し、 HDLコレステロール と当該酵素とを反応させ、 HDLコレステロールを特異的に分別定量する方法 (特許 文献 1参照）、血清を、特定の pHおよび特定の温度の下、脾臓由来のコレステロ一 ルエステラーゼ、コレステロールォキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、および、非 イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることにより HDLコ レステロールを測定する方法 (特許文献 2参照）が知られている。特許文献 2に記載 の測定法では、まず、 LDLコレステロールと当該酵素との反応が進行し、次いで、 H DLコレステロールと当該酵素との反応が進行し、 HDLコレステロールの測定が可能 となる。しかしながら、これらの測定法は、測定に長時間を要し、また、必ずしも、 HD Lコレステロールに特異的な測定法ではな力つた。
[0005] HDL以外のリポ蛋白を凝集させて HDLコレステロールを測定する方法としては、 例えばデキストラン硫酸等の HDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、 2価の金属塩、 および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法 (特許文献 3参照）、ポリア二オン 等の HDL以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン ポリオキ シプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しな 、界面活性剤とを用いる測定法 (特許文 献 4参照）、デキストラン硫酸等のポリア-オン、 2価の金属塩、特定の非イオン性界 面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法 (特許 文献 5参照）、血清または血漿を、リポ蛋白分画剤 (デキストラン硫酸等のポリアニォ ンとマグネシウムイオン等の 2価陽イオンとの組み合わせ)を含む溶液で処理し、得ら れた混合液を固体および液体の分離処理することなぐァ-オン性界面活性剤 (アル キルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエス テラーゼおよびコレステロールォキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定 することを特徴とする血清または血漿中の HDLコレステロールを測定する方法 (特許 文献 6参照)等が知られて 、る。
[0006] しかしながら、これらの HDL以外のリポ蛋白を凝集させる HDLコレステロール測定 法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、反応で生成する凝集物 による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属 塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷等 の問題がある。
HDL以外のリポ蛋白を凝集させずに HDLコレステロールを測定する方法としては 、例えば生体試料と、脾臓由来のコレステロールエステラーゼおよびコレステロール ォキシダーゼとを、胆汁酸もしくはその塩およびアルブミン存在下に反応させ、当該 酵素反応により消費または生成する化合物を測定することによる生体試料中の HDL コレステロールの測定方法 (特許文献 7参照）、 HDL画分に対して反応選択性をもつ HLB値が 16以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、検体と、 HDL画分に優先 的に作用するリポプロテインリパーゼおよび Zまたはコレステロールエステラーゼなら びにコレステロール酸ィ匕酵素とを反応させて、検体中の HDLコレステロールを測定 する方法 (特許文献 8参照）等が知られている。また、ァシルポリオキシエチレンソル ビタンエステルにより HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水 素へ変換し、生成した過酸ィ匕水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテ ルの添加により、 HDLコレステロールを酵素的に測定する方法 (特許文献 9参照)も 知られている。
しかしながら、これらの HDL以外のリポ蛋白を凝集させない HDLコレステロールの 測定法においては、 HDL以外のリポ蛋白中コレステロールの不完全な消去や、 HD L以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に起因する測定値の不正 確性が問題となる場合がある。
また、 HDL以外のリポ蛋白を凝集させない HDLコレステロールの測定法として、検 体と、 i)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素、また は、 ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型補酵素およびコレステロール脱 水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリア-オンおよびアルブミンを含有する水 性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特 徴とする検体中の HDLコレステロールの測定方法 (特許文献 10参照）や、検体と、コ レステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレス テロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型補酵素およびコレステロール脱水素酵素と を、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還 元型補酵素を測定することを特徴とする HDLコレステロールの測定方法 (特許文献
11参照）が知られている。
特許文献 1 :特開昭 62- 69999号公報
特許文献 2：特開昭 63 - 126498号公報 特許文献 3：特開平 8 - 131197号公報
特許文献 4：特開平 8 - 201393号公報
特許文献 5：特開平 9 - 285298号公報
特許文献 6：特開平 8 - 116996号公報
特許文献 7：国際公開第 97Z40376号パンフレット
特許文献 8：国際公開第 00Z52480号パンフレット
特許文献 9：特開平 9 299号公報
特許文献 10 :国際公開第 2004Z035816号パンフレット
特許文献 11：国際公開第 2004Z035817号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、簡便で、かつ、正確な測定ができる HDLコレステロールの測定 方法、測定用試薬および測定用キットを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明の発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討し、ァミンまたはアンモ-ゥム 塩の構造を有する特定の含窒素界面活性剤およびポリア-オンの共存下、コレステ ロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール 脱水素酵素が HDLに特異的に作用するという知見を見出し、本発明を完成させた。 すなわち、本発明は、下記（1)〜（13)に関する。
(1) 検体と、 i)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵 素、または、 ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステ ロール脱水素酵素とを、一般式 (I)
[0010] [化 1]
Figure imgf000005_0001
[0011] (式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[0012] [化 2]
Figure imgf000006_0001
[0013] (式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ならびに、ポリア-オンを含 有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定す ることを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
(2) 水性媒体が、さらにアルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオ キシエチレンアルケニルァミン力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有す る前記（1)記載の方法。
(3) ポリア二オンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（1)または（2)記載 の方法。
(4) 一般式 (I)
[0014] [化 3]
Figure imgf000006_0002
[0015] (式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[0016] [化 4]
Figure imgf000007_0001
[0017] (式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロール エステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、過酸化水素測定用試薬 を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(5) 一般式 (I)
[0018] [化 5]
Figure imgf000007_0002
[0019] (式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II) [0020] [化 6]
Figure imgf000008_0001
[0021] (式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロール エステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、および、酸化型補酵素を含有 することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(6) さらに、還元型補酵素を含有する前記 (5)記載の試薬。
(7) さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシェチレ ンァルケ-ルァミン力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する前記 (4) 〜（6)の!、ずれかに記載の試薬。
(8) ポリア-オンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記 (4)〜（7)の 、ずれ かに記載の試薬。
(9) 第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定 用キットであって、一般式 (I)
[0022] [化 7]
Figure imgf000008_0002
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[0024] [化 8]
Figure imgf000009_0001
[0025] (式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリア-オンを第一 試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有し、過酸化水素測定用試 薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル 加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴と するキット。
(10) 第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定 用キットであって、一般式 (I)
[0026] [化 9]
X ( I )
Figure imgf000009_0002
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基、または、炭素数 2 30のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖また は分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 X は陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[0028] [化 10]
Figure imgf000010_0001
[0029] (式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリア-オンを第一 試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有し、酸化型補酵素を第 一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステルカ卩水分 解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とするキ ッ卜。
(11) さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは 両方に含有する前記（10)記載のキット。
(12) さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシェチレ ンァルケ-ルァミン力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質を第一試薬、第二試 薬の 、ずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試 薬、第二試薬の 、ずれかまたは両方に含有する前記（9)〜（11)の 、ずれかに記載 のキット。
(13) ポリア-オンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（9)〜（12)のいず れかに記載のキット。
発明の効果
[0030] 本発明により、簡便で、かつ、正確な HDLコレステロールの測定方法、測定用試薬 、および、測定用キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態 [0031] 本発明の HDLコレステロールの測定方法は、 HDL以外のリポ蛋白中のコレステロ ールを消去することなぐかつ、 HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを凝集させ ることなぐ HDLコレステロールを測定する方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄 液、唾液、羊水、尿、汗、脾液等が挙げられる力 血漿および血清が好ましい。
[0032] 本発明におけるコレステロールエステルカ卩水分解酵素としては、コレステロールエス テルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなぐ例えば動物、植物 または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝 子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパー ゼ等も用いることができる。
[0033] コレステロールエステルカ卩水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル 加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用 することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用 することちでさる。
市販されて 、るコレステロールエステルカ卩水分解酵素としては、コレステロールエス テラーゼ" Amano"2 (CHE2 ;天野ェンザィム社製）、コレステロールエステラーゼ" Am ano"3 (CHE3；天野ェンザィム社製）、リポプロテインリパーゼ (LPL311；東洋紡製 社製）、リポプロテインリパーゼ" Amano"3 (LPL3 ;天野ェンザィム社製）、 43kDaェ ステラーゼ (天野ェンザィム社製）、 40kDaエステラーゼ (天野ェンザィム社製）、 ES T"Amano"2 (天野ェンザィム社製）、コレステロールエステラーゼ [COE313 (化学的 に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製]等が挙げられる。また、 本発明にお 、ては、 2種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わ せて用いることちできる。
[0034] コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾にぉ ヽて当該酵素を修飾する基
(化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピ レングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコール の共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブ チル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられる力 ポリエチレンダリ コールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プ ルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
[0035] コレステロールエステル加水分解酵素をィ匕学的に修飾するための試薬 (化学修飾 剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル 基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中の ァミノ基と反応し得る官能基または構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステ ル基 (N ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシ ド基、 1, 3 プロパンスルトン、 1, 4 ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカル ボキシル基と反応し得る官能基または構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。 酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマレイミド基
、ジスルフイド、 aーハロエステル（ α ョードエステル等）等が挙げられる。
[0036] 化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤とし ては、ポリエチレングリコールを主成分とする基と N ヒドロキシサクシンイミド基とを有 するサンブライト VFM— 4101、サンブライト ME— 050AS、サンブライト DE— 030 AS (いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水 物構造とを有するサンブライト AKMシリーズ (例えば、サンブライト AKM— 1510等） 、サンブライト ADMシリーズ、サンブライト ACMシリーズ (いずれも日本油脂社製）、 ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有する EPOX— 3400、 M-EPOX- 5000 ( 、ずれも SheawaterPolymers社製）、キレート機能を有する 基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミンー N, N, Ν' , Ν" , Ν" ペンタ 無水二酢酸 (DTPA anhydride；同仁化学社製)等が挙げられる。
[0037] コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うこと ができる力 本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分 解酵素を PH8. 0以上の緩衝液（例えば HEPES緩衝液）に溶解し、 0〜55°Cで 0. 0 1〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、 5分間〜 5時間攪拌する。実際の酵素反 応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、こ の反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾 剤等を除去したものも、使用することもできる。 [0038] 本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、 本発明の HDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、 反応液中で 0. 01〜400UZmLの濃度であることが好ましぐ 0. 02~200U/mL であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸ィ匕酵素としては、コレステロールを酸ィ匕して過酸 化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなぐ例えば動物、植物ま たは微生物由来のコレステロールォキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製 造されるコレステロールォキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールォキシダ ーゼ" Amano"l (CHOD1；天野ェンザィム社製）、コレステロールォキシダーゼ（CH OPE ;キッコ一マン社製）、コレステロールォキシダーゼ（C00321；東洋紡績社製） 、コレステロールォキシダーゼ協和 (協和醱酵社製)等の市販品を用いることもできる
。また、本発明においては、 2種類以上のコレステロール酸ィ匕酵素を組み合わせて用 いることちでさる。
[0039] コレステロール酸ィ匕酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素で あってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸ィ匕酵素は、例えば前述の化学 修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸ィ匕酵素の濃度としては、本発明の HD Lコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はな 、が、反応液中で 0 . 01〜400UZmLの濃度であることが好ましぐ 0. 02〜200UZmLの濃度である ことがより好ましい。
[0040] 本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコ レステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制 限はなぐ例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの 他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用い ることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ" Amano"5 (CHDH5 ;天野ェンザィ ム社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、 2種類以上のコ レステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素 酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的 に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前 述の化学修飾方法により作製することができる。
[0041] 本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明の H DLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はな 、が、反応液中 で 0. 01〜400UZmLの濃度であることが好ましぐ 0. 02〜200UZmLの濃度で あることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が 使用される。酸化型補酵素としては、例えば NAD、 NADP、 thio— NAD、 thio— N ADP等が挙げられる。
[0042] 本発明にお 、ては、ポリア-オンと共に、一般式 (I)
[0043] [化 11]
Figure imgf000014_0001
[0044] (式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質 [以下、化合物 (I)という]、または、一般式 (II)
[0045] [化 12]
Figure imgf000014_0002
[0046] (式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質 [以下、化合物 (Π)という]が使用される。
化合物 (I)および化合物 (Π)における直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキ ル基としては、例えばへキシル、ヘプチル、ォクチル、イソオタチル、ノニル、デシル、 ゥンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル 、へキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデシル、ィ コシル、へネィコシル、ドコシル（ベへ-ル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、 へキサコシル、ヘプタコシル、ォクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等の基が挙げ られ、炭素数 8〜24のアルキル基であることが好ましぐ炭素数 10〜 18のアルキル 基であることがより好まし!/、。
[0047] 化合物 (I)および化合物 (Π)における直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のァルケ -ル基としては、例えばへキセ -ル、ヘプテュル、オタテュル、ノネ-ル、デセ -ル、 シトロネリル、ゥンデセ -ル、ドデセ -ル、トリデセ -ル、テトラデセ-ル、ペンタデセ- ル、へキサデセ -ル、ヘプタデセ -ル、ォレイル、ノナデセ -ル、エイコセ -ル、ヘン エイコセニノレ、ドコセ二ノレ、トリコセニノレ、テトラコセニノレ、ペンタコセ二ノレ、へキサコセ -ル、ヘプタコセ -ル、ォクタコセ -ル、ノナコセ -ル、トリァコンテ-ル等が挙げられ 、炭素数 8〜24のァルケ-ル基であることが好ましぐ炭素数 10〜18のァルケ-ル 基であることがより好まし!/、。
[0048] 化合物 (I)および化合物 (Π)における直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキ ル基としては、例えばメチル、ェチル、プロピル、ブチル、ペンチル、へキシル、ヘプ チル、ォクチル、イソオタチル、ノエル、デシル、ゥンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリ デシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、へキサデシル（セチル）、ヘプタデ シル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデシル、ィコシル、へネィコシル、ドコシル（ベ へ二ノレ）、トリコシノレ、テトラコシル、ペンタコシル、へキサコシル、ヘプタコシル、ォクタ コシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられ、炭素数 1〜24のアルキル基である ことが好ましぐ炭素数 1〜18のアルキル基であることがより好ましい。
[0049] 化合物 (I)および化合物 (Π)における直鎖または分枝状の炭素数 1〜6のアルキル 基としては、例えばメチル、ェチル、プロピル、ブチル、ペンチル、へキシル等が挙げ られ、メチル、ェチル、プロピル基のいずれかであることが好ましぐメチル基であるこ とがより好ましい。
化合物 (I)および化合物 (Π)における直鎖または分枝状の炭素数 2〜30のァルケ -ル基としては、例えばビュル、プロべ-ル、ァリル、ブテニル、ペンテ-ル、へキセ -ル、ヘプテュル、オタテュル、ノネ-ル、デセ -ル、シトロネリル、ゥンデセ -ル、ド デセ -ル、トリデセニル、テトラデセ-ル、ペンタデセ -ル、へキサデセ -ル、ヘプタ デセ -ル、ォレイル、ノナデセ -ル、エイコセ -ル、ヘンエイコセ -ル、ドコセ -ル、トリ コセニノレ、テトラコセニノレ、ペンタコセ二ノレ、へキサコセニノレ、ヘプタコセ二ノレ、ォクタ コセ -ル、ノナコセ -ル、トリァコンテ-ル等が挙げられ、炭素数 2〜24のァルケ-ル 基であることが好ましぐ炭素数 2〜18のァルケ-ル基であることがより好ましい。
[0050] 化合物 (I)および化合物 (Π)における直鎖または分枝状の炭素数 2〜6のァルケ二 ル基としては、例えばビュル、プロべ-ル、ァリル、ブテュル、ペンテ-ル、へキセニ ル等が挙げられ、ビュル、プロべ-ル基のいずれかであることが好ましぐビニル基で あることがより好ましい。
化合物 (I)における陰イオンとしては、例えば水酸イオン、ハロゲンイオン、無機酸 由来の陰イオン、有機酸由来の陰イオン等があげられる。ハロゲンイオンとしては、フ ッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等が挙げられる。無機酸由来の陰 イオンとしては、例えば硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン等が挙げ られる。有機酸由来の陰イオンとしては、例えばギ酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン 、クェン酸イオン、グルタミン酸イオン等のカルボン酸イオン等が挙げられる。
[0051] なお、一般式 (I)にお 、て、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル 基またはァルケ-ル基を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル 基または炭素数 2〜30のアルケニル基を表し、 R3および R4が共にメチルを表し、 Xは 陰イオンを表すィ匕合物が好まし ヽ。
化合物 (I)の具体例 (製品）としては、例えばカチオン AB、カチオン BB、カチオン 2 ABT、カチオン 2DB— 500E、カチオン 2— OLR (いずれも日本油脂社製）等が挙 げられる。化合物 (Π)の具体例 (製品）としては、例えばァミン BB、ァミン AB、ァミン 2 — OLR、 3級ァミン BB、 3級ァミン FB (いずれも日本油脂社製)等が挙げられる。
[0052] 化合物 (I)または化合物 (Π)の濃度としては、本発明の HDLコレステロールの測定 を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が 0. 0001〜1%で あることが好ましぐ 0. 001-0. 1%がより好ましい。
本発明において用いられるポリア-オンとしては、本発明の HDLコレステロールの 測定を可能とするポリア二オンであれば特に制限はなぐ例えばデキストラン硫酸もし くはその塩、へノ^ンもしくはその塩、リンタングステン酸またはその塩、硫酸化シクロ デキストリンまたはその塩、硫酸ィ匕オリゴ糖またはその塩等が挙げられる力 デキスト ラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が 4万、 8万、 20万、 50万、 100万、 200万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ 糖としては、例えば硫酸ィ匕ァガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が 挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニゥム塩 、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリア-オンを 2種以上 用いてもよい。本発明の HDLコレステロールの測定におけるポリア-オンの濃度とし ては、本発明の HDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はな いが、反応液中の濃度が 0. 001〜10%であることが好ましぐ 0. 01〜1%がより好 ましい。
[0053] 本発明において使用されるアルブミンとしては、本発明の HDLコレステロールの測 定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなぐ例えばゥシ、ゥマ、ヒッジ、ヒト由 来のアルブミン等が挙げられる力 ゥシ血清アルブミン (BSA)が好ましい。また、遺 伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明にお!/ヽ ては、 2種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明の HDL コレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明の HDLコレステロ ールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が 0. 00 1〜10%であることが好ましぐ 0. 01〜1%がより好ましい。
[0054] 本発明にお!/、て使用されるポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシェチ レンァルケ-ルァミンとしては、例えば一般式 (III)
[0055] [化 13]
Figure imgf000018_0001
[0056] [式中、 R8は直鎖または分岐状のアルキル基またはァルケ-ル基を表し、 R9は水素 原子または（CH CH O) Hを表し、 mおよび nは同一または異なって、 1〜100の整
2 2 η
数を表し、 m+nは 2〜200の整数である]で表される化合物 [以下、化合物 (III)とい う]が挙げられる。化合物（ΠΙ)におけるアルキル基およびアルケニル基としては、そ れぞれ、例えば前述の直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基、前述の直 鎖または分枝状の炭素数 6〜30のァルケ-ル基等が挙げられ、炭素数 8〜24のァ ルキル基またはァルケ-ル基であることが好ましぐ炭素数 10〜18のアルキル基ま たはアルケニル基であることがより好まし!/、。
[0057] ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンァルケ-ルァミンの具 体例 (製品）としては、例えばナイミーン L201 (ォキシエチレンドデシルァミン；日本油 脂社製）、ナイミーン L207 (ポリオキシエチレンドデシルァミン；日本油脂社製）、ナイ ミーン S204、ナイミーン S210 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン；日本油脂社 製）、ニューコール OD420 (ポリオキシエチレンォクタデシルァミン；日本乳ィ匕剤社製 )、バイオニン D3104 (ポリオキシエチレンラウリルァミン;竹本油脂社製）、バイオニン D3110 (ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、ノィォニン D3605 [ポリ ォキシエチレンアルキル (大豆)ァミン；竹本油脂社製]、バイオニン D3615T [ポリオ キシエチレンアルキル (牛脂）ァミン;竹本油脂社製]、 BLAUNON O209 (ポリオキ シエチレンォレイルァミノエーテル；青木油脂社製）、 BLAUNON L205 (ポリオキ シエチレンラウリルアミノエ一テル；青木油脂社製)等が挙げられる。
[0058] ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアルキレンァミンにおけ るォキシエチレン鎖の重合度は、好ましくは 1〜100、より好ましくは 1〜60である。本 発明にお 、ては、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアルキ レンアミンを 2種類以上用いても良い。ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリ ォキシエチレンアルキレンァミンの濃度としては、本発明の HDLコレステロールの測 定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が 0. 0001〜1% であることが好ましぐ 0. 001-0. 1%がより好ましい。
[0059] 本発明の HDLコレステロール測定方法において使用される水性媒体としては、例 えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられる力 緩衝液が好ましい。緩衝液に 用いる緩衝剤としては、例えばトリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝 剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
[0060] グッドの緩衝剤としては、例えば 2 モルホリノエタンスルホン酸（MES)、ビス（2— ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル)メタン（Bis— Tris)、 N— (2—ァセトァ ミド)イミノニ酢酸 (ADA)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2—エタンスルホン酸） (PIPE S)、 N— (2 ァセトアミド） - 2-アミノエタンスルホン酸 (ACES)、 3 -モルホリノ一 2 —ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） 2 アミノエタンスルホン酸（BES)、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 2 アミノエタンスルホン酸 (TES)、 2— [4- (2- ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕エタンスルホン酸（HEPES)、 3—〔N, N ビ ス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ〕— 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 - 2-ヒドロキシ 3—ァミノプロパンスルホン酸 (TA PSO)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）（POPSO)、 3 —〔4— (2—ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕 2—ヒドロキシプロパンスルホン 酸（HEPPSO)、 3—〔4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル〕プロパンスル ホン酸〔（H) EPPS〕、 N 〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Tricine)、 N, N
—3 ァミノプロパンスルホン酸（TAPS)、 N シクロへキシル 2 アミノエタンスル ホン酸（CHES)、 N -シクロへキシル 3 ァミノ 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸 (CAPSO)、 N シクロへキシル—3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPS)等が挙げ られる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、 0. 001 〜2. Omol/!L力好ましく、 0. 005〜1. 0mol/:L力 ^より好まし!/ヽ。
[0061] 以下に、本発明の HDLコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キッ トを具体的に説明する。
(HDLコレステロールの測定方法）
本発明の HDLコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法が挙 げられる。
[0062] 沏 I 法
(1)検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素 、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型補酵素およびコレステロ一 ル脱水素酵素とを、化合物 (I)もしくは化合物 (Π)およびポリア二オンを含有し、必要 に応じ、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアル ケニルァミン力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する水性媒体中で 反応させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、
(2)生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3) (2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中の HDLコレステロール 濃度を算出することにより、検体中の HDLコレステロールを測定することができる。
[0063] 本測定法においては、（1)の反応は、例えば 10〜50°Cで、好ましくは 20〜40°Cで 、 1〜60分間、好ましくは 2〜30分間行う。
生成した過酸ィ匕水素の量は、例えば直接過酸ィ匕水素電極で測定することもできる 力 過酸ィ匕水素測定用試薬により測定することもできる。過酸化水素測定用試薬は、 生成した過酸ィ匕水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な 物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物 質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルォ キシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後 述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸ィ匕 水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミ ノール、イソルミノール、ルシゲニン、アタリジ-ゥムエステル等があげられる。
[0064] 過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルォキシダーゼ等の 過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物 質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量する ことにより、過酸ィ匕水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸 化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸ィ匕水素は、化学発光物質と反応してフォ トンを生じ、生じたフオトンを定量することにより、過酸ィ匕水素を定量することができる。
[0065] 酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原 体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルォキシダーゼ等の過酸化活性物質の存 在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、 10— N—カルボキシメチ ルカルバモイル— 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン（CCAP)、 10 —N—メチルカルバモイルー 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン（M CDP)、 N- (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）—4, 4， 一ビス（ジメチルァミノ）ジフ ェ-ルァミンナトリウム塩（DA— 64)、 4, 4，—ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミン、 ビス〔3—ビス（4—クロ口フエ-ル）メチル 4—ジメチルァミノフエ-ル〕ァミン（BCM A)等が挙げられる。
[0066] 酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルォキシダーゼ等の過酸 化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸ィ匕的カップリングして色素を生成する物質 である。
2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとァ-リン類との組み合わせ、カプラ 一とフエノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば 4 アミ ノアンチピリン (4— AA)、 3—メチルー 2 べンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられ る。ァ-リン類としては、 N— (3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (2 ヒ ドロキシ— 3—スルホプロピル）— 3—メチルァ-リン（TOOS)、 N—ェチルー N— (2 —ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）—3, 5—ジメチルァ-リン（MAOS)、 N ェチル — N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3, 5—ジメトキシァ-リン（DAOS)、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） 3—メチルァ-リン（TOPS)、 N— (2 ヒド 口キシ— 3—スルホプロピル）— 3, 5—ジメトキシァ-リン（HDAOS)、 N, N ジメチ ルー 3—メチルァ-リン、 N, N ジ（3—スルホプロピル）一 3, 5—ジメトキシァ-リン 、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N ェチル N— ( 3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） 3, 5—ジメト キシァ二リン、 N- (3—スルホプロピル）—3, 5—ジメトキシァ-リン、 N ェチル N - (3—スルホプロピル） - 3, 5 ジメチルァ-リン、 N ェチル N— (2 ヒドロキシ —3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ一 3 —スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—メチルフエ-ル） N，—サクシ- ルエチレンジァミン（EMSE)、 N—ェチルー N— (3—メチルフエ-ル） N，—ァセ チルエチレンジァミン、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）—4 フルオロー 3, 5—ジメトキシァ-リン（F—DAOS)等が挙げられる。フエノール類と しては、フエノール、 4 クロ口フエノール、 3—メチルフエノール、 3 ヒドロキシ一 2, 4 , 6 トリョード安息香酸 (HTIB)等が挙げられる。
[0067] 過酸ィ匕水素の測定にぉ 、て、過酸ィ匕活性物質の濃度は、測定に適した濃度であ れば特に制限はな ヽが、過酸ィ匕活性物質としてペルォキシダーゼを用いる場合は、 1〜： LOOkUZLが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度 であれば特に制限はないが、 0. 01〜10gZLが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測 定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵 素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、 300〜500nmが好ましぐ 33 0〜400nmがより好ましぐ 340nm付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬 は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可 能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還 元型補酵素測定用試薬としては、例えばジァホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発 色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリア一としては、例えば 1ーメトキ シー 5—メチルフエナジゥムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定 用試薬として、ジァホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試 薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量すること により、還元型補酵素を定量することができる。
[0068] 還元発色型色原体としては、例えば 3— (4, 5 ジメチルー 2 チアゾリル） 2, 5 —ジフエ-ル一 2H—テトラゾリゥムブロミド（MTT)ゝ 2- (4—ョードフエ-ル） 3— (4 -トロフエ-ル） 5— (2, 4 ジスルホフエ-ル） 2H—テトラゾリゥムモノナトリ ゥム塩 (WST— 1)、 2— (4—ョードフエ-ル）—3— (2, 4—ジニトロフエ-ル）— 5— ( 2, 4—ジスルホフエ-ル）— 2H—テトラゾリゥムモノナトリウム塩 (WST— 3)等が挙 げられる。
[0069] (HDLコレステロール測定用試薬）
本発明の HDLコレステロール測定用試薬は、化合物 (I)および化合物 (Π)力 な る群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロールエステル加水 分解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素および過酸ィ匕水素測定用試薬を含有し、必要に 応じて、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアル ケニルァミン力 なる群力 選ばれる少なくとも一つの物質を含有する。
[0070] 該測定用試薬としては、化合物 (I)および化合物 (Π)カゝらなる群より選ばれる少なく とも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンァルケ -ルァミン力もなる群力も選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素および過酸ィ匕水素測定用試薬 を含有する試薬や、化合物 (I)および化合物 (Π)カゝらなる群より選ばれる少なくとも一 つの物質、ポリア-オン、アルブミン、コレステロールエステルカ卩水分解酵素、コレス テロール酸ィ匕酵素および過酸ィ匕水素測定用試薬を含有する試薬が好ましい。
[0071] また、該測定用試薬としては、化合物 (I)および化合物 (Π)力もなる群より選ばれる 少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレン ァルケ-ルァミン力もなる群力も選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、アル ブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸 化水素測定用試薬を含有する試薬が特に好ま ヽ。
[0072] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬は、化合物 (I)および化合物 (Π)力 な る群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロールエステル加水 分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有し、必要に応じて 、還元型補酵素測定用試薬、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポ リオキシエチレンァルケ-ルァミン力もなる群力も選ばれる少なくとも一つの物質を含 有する。
[0073] 該測定用試薬としては、化合物 (I)および化合物 (Π)カゝらなる群より選ばれる少なく とも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンァルケ -ルァミン力もなる群力も選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型 補酵素測定用試薬を含有する試薬や、化合物 (I)および化合物 (II)からなる群より 選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、アルブミン、コレステロールエステルカロ 水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定 用試薬を含有する試薬が好ま Uヽ。
[0074] また、該測定用試薬としては、化合物 (I)および化合物 (Π)力もなる群より選ばれる 少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレン ァルケ-ルァミン力もなる群力も選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、アル ブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸ィ匕型 補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有するものが特に好ましい。
[0075] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬が挙 げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、便宜上、化合 物 (I)および化合物 (Π)力 なる群力 選ばれる少なくとも一つの物質を以下「ィ匕合 物 A」といい、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシェチレ ンァルケ-ルァミン力 なる群力 選ばれる少なくとも一つの物質を以下「ィ匕合物 B」 という。本発明の測定用試薬においては、化合物 Aを 1つまたは複数用いることがで き、化合物 Bを 1つまたは複数用いることができる。
[0076] 試薬 1
化合物 A、ポリア-オン、コレステロールエステルカ卩水分解酵素、コレステロール酸 化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 2
化合物 A、ポリア-オン、化合物 B、コレステロールエステル加水分解酵素、コレス テロール酸ィ匕酵素および過酸ィ匕水素測定用試薬を含有する試薬。
[0077] 試薬 3
化合物 A、ポリア-オン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素お よびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。 纏 4
化合物 A、ポリア-オン、化合物 B、コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型 補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
[0078] 試薬 5
化合物 A、ポリア-オン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コ レステロール脱水素酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 6
化合物 A、ポリア-オン、化合物 B、コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型 補酵素、コレステロール脱水素酵素素および還元型補酵素測定用試薬を含有する 試薬。
[0079] (HDLコレステロール測定用キット）
本発明の HDLコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通および使 用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなぐ 2試薬系、 3試薬系等のいず れであってもよいが、 2試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる 2試薬系の HDLコレステロール測定用キットにおい ては、コレステロールエステルカ卩水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレス テロール脱水素酵素とは、第一試薬と第二試薬に別々に含有されても、第二試薬に 一緒に含有されてもよいが、第一試薬と第二試薬に別々に含有される場合には、コ レステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、コレステロール酸ィ匕酵素または コレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有される態様が好まし 、。コレステロール 脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸ィ匕型補酵素は、第一試薬、第二 試薬の 、ずれかまたは両方に含有されてもよ 、。
[0080] 化合物 (I)および化合物 (Π)力 なる群力 選ばれる少なくとも一つの物質 (化合物 A)は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬 に含有されることが好ましい。ポリア-オンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまた は両方に含有されてもょ ヽが、第一試薬に含有されることが好まし ヽ。
アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアルケニル アミンカ なる群力 選ばれる少なくとも一つの物質 (ィ匕合物 B)は、第一試薬、第二 試薬の 、ずれかまたは両方に含有されてもよ 、。
[0081] 過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有さ れてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カツ プリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様、すなわち、 過酸化水素測定用試薬が第一試薬および第二試薬の両方に含有される態様が好ま しい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に 含有されてもよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有されることが好ましい。
[0082] 本発明の HDLコレステロール測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが 挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット 1
第一試薬
化合物 A、ポリア-オン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分 解酵素
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸ィヒ酵素
キット 2
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸 化酵素
[0083] キット 3
第一試薬
化合物 A、化合物 B、ポリア-オン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステ ル加水分解酵素
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸ィヒ酵素
キット 4 第一試薬
化合物 A、化合物 B、ポリア二オン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸 化酵素
[0084] キット 5
第一試薬
化合物 A、ポリア-オン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分 第二試薬
化合物 B、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸ィヒ酵素
ソ卜 6
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
化合物 B、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレス テロール酸ィ匕酵素
[0085] キット 7
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素 第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット 8
第一試薬
化合物 A、ポリア-オン、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
[0086] キ、 t9 第一試薬
化合物 A、化合物 B、ポリア-オン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット 10
第一試薬
化合物 A、化合物 B、ポリア二オン、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
[0087] キット 11
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素 第二試薬
化合物 B、コレステロール脱水素酵素
キット 12
第一試薬
化合物 A、ポリア-オン、酸化型補酵素
第二試薬
化合物 B、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素 [0088] キット 13
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット 14
第一試薬 化合物 A、ポリア二オン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬 第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール 脱水素酵素
[0089] キット 15
第一試薬
化合物 A、化合物 B、ポリア二オン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コ レステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
ソ卜 16
第一試薬
化合物 A、化合物 B、ポリア二オン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬 第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール 脱水素酵素
[0090] キット 17
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素第二試薬
化合物 B、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット 18
第一試薬
化合物 A、ポリア二オン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
化合物 B、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレ ステロール脱水素酵素
[0091] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬およびキットにおいては、前述の本発明 の HDLコレステロールの測定方法において挙げられた、化合物（I)、化合物（Π)、ポ リア二オン、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミン、ポリオキシエチレンアル ケ-ルァミン、コレステロールエステルカ卩水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレ ステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測 定用試薬を用いることができる。
[0092] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要に応じて、 水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい 。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例 えばエチレンジァミン四酢酸 (EDTA)、シユークロース、塩化カルシウム等が挙げら れる。防腐剤としては、例えばアジィ匕ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質 消去剤としては、例えばァスコルビン酸の影響を消去するためのァスコルビン酸ォキ シダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等 の酵素、硫酸ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
[0093] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥された 状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用い て検体中の HDLコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解 して使用される。
本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレステロ一 ルエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の 含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 01〜1200U/mLとなる 含量が好ましぐ 0. 02〜600U/mLとなる含量がより好ましい。
[0094] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける化合物（I)ま たは化合物 (Π)の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 0001〜 3%となる含量が好ましぐ 0. 001-0. 3%となる含量がより好ましい。本発明の HD Lコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリア-オンの含量としては 、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 001〜30%となる含量が好ましぐ 0. 0 1〜3%となる含量がより好ましい。
[0095] 本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるアルブミンの 含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 001〜30%となる含量が 好ましぐ 0. 01〜3%となる含量がより好ましい。
本発明の HDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリオキシァ ルキルアミンまたはポリオキシエチレンァルケ-ルァミンの含量としては、水性媒体で 溶解された状態での濃度が 0. 0001〜3%となる含量が好ましぐ 0. 001〜0. 3%と なる含量がより好ましい。
[0096] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら 限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および酵素 を使用した。
HEPES (BDH Laboratory社製）、 EMSE (ダイトーケミックス社製）、硫酸ナトリ ゥム（関東ィ匕学社製)、ァミン BB (ドデシルァミン；日本油脂社製)、 3級ァミン BB (ドデ シルジメチルァミン；日本油脂社製）、カチオン BB (ドデシルトリメチルアンモ -ゥム クロライド；日本油脂社製)、デキストラン硫酸ナトリウム (分子量 50万）（フアルマシア 社製）、ゥシ血清アルブミン (BSA;プロライアントネ土製）、 4—ァミノアンチピリン (埼京 化成社製）、ペルォキシダーゼ (東洋紡績社製）、 43kDaエステラーゼ (コレステロ一 ルエステル加水分解酵素；天野ェンザィム社製）、 CHOPE (コレステロール酸化酵 素；キッコ一マン社製）、 BLAUNON L205 (ポリオキシエチレンラウリルアミノエ一 テル;青木油脂社製)。
実施例 1
[0097] 以下の第一試薬 (試薬 A)および第二試薬 (試薬 a)力 なる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000031_0001
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
ァミン BB 0. 1 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
第二試薬 (試薬 a) HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
実施例 2
[0098] 以下の第一試薬 (試薬 B)および第二試薬 (試薬 a)力 なる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 B)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000032_0001
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
3級ァミン BB 0. 03 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
第二試薬 (試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
実施例 3
[0099] 以下の第一試薬 (試薬 C)および第二試薬 (試薬 a)力 なる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 C)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000032_0002
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
カチオン BB 0. 14 g/L デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
第二試薬 (試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
実施例 4
[0100] 以下の第一試薬 (試薬 D)および第二試薬 (試薬 a)カゝらなる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 D)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000033_0001
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
カチオン BB 0. 14 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
Figure imgf000033_0002
第二試薬 (試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
実施例 5
[0101] 以下の第一試薬 (試薬 C)および第二試薬 (試薬 b)カゝらなる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 C)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000034_0001
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
カチオン BB 0. 14 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
第二試薬 (試薬 b)
HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
BLAUNON L205 0. 16 g/L
実施例 6
以下の第一試薬（試薬 D)および第二試薬（試薬 b)力もなる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 D)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000034_0002
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
カチオン BB 0. 14 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
Figure imgf000034_0003
第二試薬 (試薬 b)
HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
BLAUNON L205 0. 16 g/L [0103] 比較例 1
以下の第一試薬（試薬 E)および第二試薬（試薬 a)カゝらなる HDLコレステロール測 定用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 E)
HEPES (pH7. 5) 10 mmol/L
Figure imgf000035_0001
硫酸ナトリウム 5. 0 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1. 0 g/L
第二試薬 (試薬 a)
HEPES (pH7. 0) 10 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
ぺノレォキシダーゼ 20 kU/L
43kDaエステラーゼ 100 kU/L
CHOPE 1. 2 kU/L
実施例 7
[0104] 実施例 1のキットを用いて、ヒト血清 30検体中の HDLコレステロールを測定した。（ 1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水 (HDLコレステロール濃度: 0. OmgZdL)および血清（ HDLコレステロール濃度： 80. OmgZdL)を、実施例 1のキットを用いて、日立 7170 S形自動分析装置により、 HDLコレステロール濃度と「吸光度」との間の関係を示す 検量線を作成した。
[0105] ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された 2つの吸光度 (E1および E2)を基 に、 E2から E1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（2 μ L)と第一試薬 (0. 15mL)とを添加し 37°Cで 5分間加温し 、反応液の吸光度 (E1)を主波長 600nm、副波長 700nmで測定し、次いで、この反 応液に第二試薬 (0. 05mL)を添加しさらに 37°Cで 5分間加温し、反応液の吸光度（ E2)を主波長 600nm、副波長 700nmで測定した。
(2)ヒト血清検体と実施例 1のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算 出
(1)の検量線の作成にぉ 、て用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外 は、（1)の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を 算出した。
(3)ヒト血清検体中の HDLコレステロール濃度の測定
(2)で算出した「吸光度」と、（1)で作成した検量線とから、各検体中の HDLコレス テロール濃度を測定した。
実施例 8
[0106] 実施例 1のキットの代わりに実施例 2のキットを用いる以外は実施例 7の測定法と同 様にして、日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 30検体中の HDLコレステロ一 ルを測定した。
実施例 9
[0107] 実施例 1のキットの代わりに実施例 3のキットを用いる以外は実施例 7の測定法と同 様にして、日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 30検体中の HDLコレステロ一 ルを測定した。
実施例 10
[0108] 実施例 1のキットの代わりに実施例 4のキットを用いる以外は実施例 7の測定法と同 様にして、日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 30検体中の HDLコレステロ一 ルを測定した。
実施例 11
[0109] 実施例 1のキットの代わりに実施例 5のキットを用いる以外は実施例 7の測定法と同 様にして、日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 30検体中の HDLコレステロ一 ルを測定した。
実施例 12
[0110] 実施例 1のキットの代わりに実施例 6のキットを用いる以外は実施例 7の測定法と同 様にして、日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 30検体中の HDLコレステロ一 ルを測定した。 [0111] 比較例 2
実施例 1のキットの代わりに比較例 1のキットを用いる以外は実施例 7の測定法と同 様にして、日立 7170形自動分析装置によりヒト血清 30検体中の HDLコレステロ一 ルを測定した。
[0112] 次に、実施例 7〜12および比較例 2の測定において用いたヒト血清 30検体を用い て、タリ-カルケミストリー第 45卷、 10号（1999年）に記載された DCM法 (Designate dComparison Method)により当該検体中の HDLコレステロールを測定し、各実施例 および比較例での測定値と比較した。各実施例および比較例それぞれの測定と、 D CM法による測定との相関係数を第 1表に示す。
[0113] [表 1] 第 1表
Figure imgf000037_0001
第 1表の比較例 2と実施例 7〜12との比較から、化合物（I)または化合物 (Π)とポリ ァ-オンとを含有するキットを用いた測定において、 DCMとの良好な相関関係が認 められることが判明した。さらに、実施例 9と実施例 10〜12との比較から、化合物（I) または化合物（Π)とポリア二オンの他に、アルブミンまたはポリオキシエチレンアルキ ルァミンを共存させることにより DCMとの相関係数がより向上することが判明した。 産業上の利用可能性
本発明により、動脈硬化などの疾患の診断に有用な HDLコレステロールの測定方 法、測定用試薬および測定用キットが提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 検体と、 i)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素、ま たは、 ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型補酵素およびコレステロール 脱水素酵素とを、一般式 (I)
[化 14]
Figure imgf000039_0001
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[化 15]
Figure imgf000039_0002
(式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ならびに、ポリア-オンを含 有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定す ることを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[2] 水性媒体が、さらにアルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシ エチレンァルケ-ルァミン力もなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する請 求項 1記載の方法。
[3] ポリア-オンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項 1または 2記載の方法。
[4] 一般式 (I)
[化 16]
(り
Figure imgf000040_0001
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[化 17]
Figure imgf000040_0002
(式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロール エステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、過酸化水素測定用試薬 を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[5] 一般式 (I) [化 18]
Figure imgf000041_0001
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[化 19]
Figure imgf000041_0002
(式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリア-オン、コレステロール エステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、および、酸化型補酵素を含有 することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[6] さらに、還元型補酵素を含有する請求項 5記載の試薬。
[7] さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアル ケニルァミン力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する請求項 4〜6の いずれかに記載の試薬。
[8] ポリア-オンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項 4〜7のいずれかに記載 の試薬。
第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キッ トであって、一般式 (I)
[化 20]
(り
Figure imgf000042_0001
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30 のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖または 分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 Xは 陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[化 21]
Figure imgf000042_0002
(式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリア-オンを第一 試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有し、過酸化水素測定用試 薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル 加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴と するキット。 第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キッ トであって、一般式 (I)
[化 22]
Figure imgf000043_0001
(式中、 R1は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R2は、直鎖または分枝状の炭素数 1〜30のアルキル基、または、炭素数 2〜 30のアルケニル基を表し、 R3および R4は、同一または異なって、それぞれ直鎖また は分枝状の炭素数 1〜6のアルキル基または炭素数 2〜6のァルケ-ル基を表し、 X は陰イオンを表す)で表される物質、および、一般式 (II)
[化 23]
Figure imgf000043_0002
(式中、 R5は、直鎖または分枝状の炭素数 6〜30のアルキル基またはァルケ-ル基 を表し、 R6および R7は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝 状の炭素数 1〜30のアルキル基または炭素数 2〜30のァルケ-ル基を表す）で表さ れる物質力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリア-オンを第一 試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有し、酸化型補酵素を第 一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステルカ卩水分 解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とするキ ッ卜。
[11] さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれ力または両方に 含有する請求項 10記載のキット。
[12] さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルァミンおよびポリオキシエチレンアル ケ-ルァミン力もなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を第一試薬、第二試薬の
V、ずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、 第二試薬の 、ずれかまたは両方に含有する請求項 9〜： L 1の 、ずれかに記載のキッ
[13] ポリア-オンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項 9〜 12のいずれかに記 載のキット。
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