WO2008006680A2 - Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren mittels mutanten des glta-gens kodierend für citratsynthase - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren mittels mutanten des glta-gens kodierend für citratsynthase Download PDF

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lysc
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Wilfried Claes
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    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)

Definitions

  • the invention relates to novel, for a polypeptide with citrate synthase activity encoding polynucleotides, bacteria containing them, and methods for producing amino acids using these bacteria.
  • Amino acids are used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and especially in animal nutrition.
  • amino acids are produced by fermentation of strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum. Because of the great importance is constantly working to improve the manufacturing process. Process improvements may include fermentation measures such as stirring and oxygen supply, or composition of the nutrient media such as sugar concentration during fermentation, or work up to product form by, for example
  • AEC lysine analog S- (2-aminoethyl) -L-cysteine
  • nucleotide sequences of the genome of Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium efficiens are also in the National Library of Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD), in the DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan ) or in the nucleotide sequence database of European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK, respectively).
  • NCBI National Library of Biotechnology Information
  • MD National Library of Medicine
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • EMBL European Molecular Biology Laboratories
  • SEQ ID NO: 1 The wild-type sequence of the coding region of the gltA gene of Corynebacterium glutamicum known from the prior art is shown in SEQ ID NO: 1 in the description part of the present application. Moreover, in SEQ ID NOs: 3 and 25, those are upstream and downstream the coding region located sequences.
  • the amino acid sequence of the encoded GltA polypeptide (citrate synthase) is accordingly represented in SEQ ID NOs: 2, 4 and 26.
  • L-amino acids preferably L-lysine, L-valine and L-isoleucine, particularly preferably L-lysine.
  • the invention relates to an isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the L-aspartic acid at position 5 of the amino acid sequence by another proteinogenic amino acid, preferably L-valine, L-leucine and L-isoleucine, more preferably L-valine, and wherein the polypeptide has citrate synthase activity (EC No. 4.1.3.7).
  • the polypeptide contains one or more conservative amino acid substitutions, the conserved amino acid substitutions leaving the citrate synthase activity of the polypeptide substantially unchanged.
  • Proteinogenic amino acids are the amino acids found in natural proteins, ie proteins of microorganisms, plants, animals and humans. These include in particular L-amino acids selected from the group L-aspartic acid, L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L - methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-
  • L-amino acids selected from the group L-aspartic acid, L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L - methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-
  • Phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine Phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.
  • the terms polypeptide and protein are used as synonyms.
  • the invention furthermore relates to vectors and bacteria, preferably of the genus Corynebacterium and Escherichia, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli, which contain said polynucleotide or have been prepared using said polynucleotide.
  • the invention finally bacteria preferred species of Corynebacterium and Escherichia, particularly preferably the species Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli, which have been transformed with said vector.
  • transformation encompasses all methods for the transfer of polynucleotides, in particular DNA, into a desired bacterium. These include the use of isolated DNA in the transformation,
  • Electro-transformation or electroporation the transmission by cell contact as in the conjugation or the transfer of DNA by means of particle bombardment.
  • Another aspect of the invention relates to a bacterium, in particular recombinant bacterium, of the genus
  • Corynebacterium containing a polynucleotide encoding a polypeptide having citrate synthase activity comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein at position 5 of the amino acid sequence any proteinogenic amino acid except L-aspartic acid, preferably L-valine, L-leucine and L-isoleucine, more preferably L-valine.
  • the polypeptide contains one or more conservative amino acid substitutions, the conserved amino acid substitutions leaving the citrate synthase activity of the polypeptide substantially unchanged.
  • a further aspect of the invention relates to a process for preparing L-amino acids, preferably L-lysine, L-valine and L-isoleucine, more preferably L-lysine, characterized in that it comprises the following steps: a) fermentation of the recombinant bacteria of the genus Corynebacterium according to the invention in a suitable nutrient medium, and
  • L-amino acids is meant the proteinogenic amino acids.
  • L-lysine or lysine is mentioned below, not only the bases but also the salts, e.g. Meant L-lysine monohydrochloride or L-lysine sulfate.
  • Corynebacterium efficiens such as the strain DSM44549,
  • Corynebacterium glutamicum such as strain ATCC13032,
  • thermoaminogenes such as strain FERM BP-1539, and
  • Corynebacterium ammoniagenes such as strain ATCC6871,
  • Corynebacterium glutamicum are also known in the art under other names. These include, for example:
  • Corynebacterium glutamicum AHP-3 Ferm BP-7382
  • Ferm BP-7382 Ferm BP-7382
  • Brevibacterium flavum FERM-BP 759 described in US 4,656,135, Corynebacterium glutamicum FERM-BP 757. described in US 4,656,135, Brevibacterium flavum FERM-BP 760. described in US 4,656,135, Corynebacterium glutamicum FERM-BP 758 described in US 4,656,135, Brevibacterium flavum FERM BP-2215 described in US 5,705, 370, and Brevibacterium flavum FERM BP-2433 described in US 5,705,370.
  • Strains designated "ATCC” can be purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.) Strains designated “DSM” can be obtained from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). "FERM” strains can be purchased from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) The strain Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, is in of US 5,250,434.
  • DNA is then provided from the mutants or isolated and polymerized using the polymerase chain reaction (PCR) using primer pairs that allow the amplification of the gltA gene or gltA allele, the corresponding polynucleotide and isolated.
  • PCR polymerase chain reaction
  • any primer pairs can be selected from the nucleotide sequence located upstream and downstream of the coding region and the complementary nucleotide sequence (see SEQ ID NOS: 3 and 25).
  • a primer of a primer pair preferably comprises at least 15, at least 18, at least 20, at least 21 or at least 24 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequence between position 1 and 1000 of SEQ ID NO: 25.
  • the associated second primer of a primer pair comprises at least 15, at least 18, at least 20, at least 21 or at least 24 consecutive nucleotides selected from complementary nucleotide sequence between position 3314 and 2312 of SEQ ID NO: 25.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide is then determined. This can be determined, for example, by the chain termination method of Sanger et al. (Proceedings of the National Academys of Sciences, U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)) with those of Zimmermann et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990)).
  • the polypeptide encoded by this nucleotide sequence can then be analyzed for amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence is entered into a program for the translation of DNA sequence into an amino acid sequence. Suitable programs are for example the
  • Patent program available from patent offices, such as the United States Patent Office (USPTO), or the "Translate Tool” available on the ExPASy Proteomics Server on the World Wide Web (Gasteiger et al., Nucleic Acids Research 31, 3784 3788 (2003)).
  • the polynucleotide according to the invention which is also referred to below as the gltA allele according to the invention, by methods of in vitro genetics.
  • Suitable methods for in vitro mutagenesis include Miller's Hydroxylamine treatment (Miller, JH: A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor , 1992) or the use of a polymerase chain reaction using a DNA polymerase which has a high error rate.
  • Such a DNA polymerase is, for example, Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, No.
  • citrate synthase allele according to the invention in Corynebacterium glutamicum or Escherichia coli, in order to subsequently represent it, for example, in purified or isolated form.
  • polynucleotide which has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the polypeptide encoded by this polynucleotide is shown in SEQ ID NOS: 6 and 8. It contains at position 5 of the amino acid sequence L-valine instead of L-aspartic acid.
  • the strain ATCC13032 when he instead of the wild-type gltA gene with the inventive gltA allele, which codes for the citrate synthase according to SEQ ID NO: 6 (ATCC13032:: gltA D5V), in comparison to the wild-type strain ATCC13032, which contains the citrate synthase according to SEQ ID NO: 2, a by about 40% has a maximum of about 90% reduced enzyme activity, preferably a by about 70% to a maximum of about 90% reduced enzyme activity.
  • the invention also relates to polynucleotides which code for polypeptides having citrate synthase activity which, in addition to the amino acid substitutions according to the invention at position 5 of the amino acid sequence, contain one (1) or more conservative amino acid substitutions which determine the enzymatic activity essentially does not change. This means that it remains essentially unchanged.
  • substantially unchanged or “essentially unchanged” in this context means that the citrate synthase activity of the polypeptide is changed by a maximum of 20%, preferably not more than 10% and more preferably by a maximum of 5% to a maximum of 2% in comparison for the citrate synthase activity of the polypeptide according to SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 6, preferably SEQ ID NO: 6.
  • the gltA gene of strain ATCC 13032 against the gltA allele is used for an experimental test.
  • the strain is cultured, a cell extract is produced and the citrate synthase activity is determined.
  • ATCC13032 :: gltA D5V determined.
  • L-lysine-secreting strains of Corynebacterium glutamicum can also be used which comprise the coding region of the wild-type gltA gene, including the upstream one Nucleotide sequences, corresponding to the nucleotide sequence between position 1 and 2064 of SEQ ID NO: 3, preferably SEQ ID NO: 3, included.
  • Suitable strains are, for example, DSM16833 described in PCT / EP2005 / 012417, DSM13994 described in EP 1 239 040 A2 or DSM17576 described in DE 102005045301. In these strains, the corresponding mutation (s) can be converted into the coding region of the gltA by allelic exchange. Introduce gene.
  • citrate synthase (EC No. 4.1.3.7) catalyzes the condensation reaction of oxaloacetate and acetyl-CoA, with citric acid and coenzyme A (CoA) as reaction products.
  • the enzyme is assigned the number EC 2.3.3.1.
  • aromatic L-amino acids are called conservative substitutions when L-phenylalanine, L-
  • the hydrophobic L-amino acids are called conservative exchanges when L-leucine, L-isoleucine and L-valine are interchanged.
  • the polar L-amino acids are called conservative exchanges when L-glutamine and L-asparagine are interchanged.
  • the basic L-amino acids are called conservative exchanges when L-arginine, L-lysine and L-histidine are interchanged.
  • the acidic L-amino acids are called conservative exchanges when L-aspartic acid and L-glutamic acid are exchanged.
  • the hydroxyl group-containing L-amino acids are called conservative exchanges when L-serine and L-threonine are interchanged.
  • the polypeptide preferably contains at most two (2), at most three (3), at most four (4) or at most five (5) conservative amino acid substitutions in addition to the inventive exchange at position 5 of SEQ ID NO: 2.
  • aminopeptidases the terminal methionine is removed during protein synthesis.
  • the isolated polynucleotides encoding the citrate synthase variant of the present invention, or portions thereof, may be used to produce recombinant strains of the genus Corynebacterium, preferably Corynebacterium glutamicum, which contain the amino acid sequence of the invention at position 5 of the amino acid sequence of the citrate synthase polypeptide and which are described in U.S. Pat Compared to the parent strain in an improved way
  • Amino acids in the surrounding medium release or accumulate in the cell interior.
  • a common method for incorporating mutations into genes of bacteria of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum, is that of
  • Allele exchange also known as "gene replacement.”
  • a DNA fragment containing the mutation of interest is transferred to the desired strain and the mutation is converted into the desired strain by at least two recombination events or "crossover" events Chromosome of the desired strain incorporated or replaced in the relevant strain sequence of a gene against the mutated sequence.
  • the DNA fragment containing the mutation of interest in this method is typically present in a vector, in particular a plasmid, which is preferably not or only to a limited extent replicated by the strain to be mutated, ie under selected culture conditions.
  • a bacterium of the genus Escherichia preferably the species Escherichia coli is generally used.
  • plasmid vectors examples include those of Shufer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) described pK * mob and pK * mobsacB vectors, such as pKl ⁇ mobsacB, and the vectors described in WO 02/070685 and WO 03/014362. These are replicative in Escherichia coli but not in Corynebacterium.
  • Particularly suitable vectors are those which contain a conditionally negatively dominant gene such as the sacB gene (levansucrase gene) of, for example, Bacillus or the galK gene (galactose kinase gene) of, for example, Escherichia coli.
  • a conditionally negatively dominant gene is understood as meaning a gene which, under certain conditions, is disadvantageous, for example, toxic to the host, but has no adverse effects on the host carrying the gene under other conditions.
  • Nakamura et al. (US 6,303,383) described a temperature-sensitive plasmid for Corynebacterium, which only at temperatures below
  • 31 ° C can replicate. It can also be used for the measures of the invention.
  • the vector is then conjugated, for example, by the method of Schwarzer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) or transformation, for example, by the method of Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) or the method of Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) into the Corynebacterium.
  • the transfer of the DNA can also be achieved by ballistic methods (eg particle bombardment).
  • Target gene is the gene in which the desired exchange is to take place.
  • Schwarzer and Puhler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991) used this method to substitute a lysA allele that carried a deletion and a lysA allele that carried an insertion into the chromosome of C. glutamicum of the wild-type gene.
  • Nakagawa et al. a mutation designated as Val59Ala into the homoserine dehydrogenase gene (hom), a mutation designated as Thr311Ile into the aspartate kinase gene (lysC or ask), a mutation in the pyruvate called Pro458Ser
  • Carboxylase gene (pyc) and one designated Ala213Thr To incorporate mutation into the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene (zwf) of C. glutamicum strains.
  • Amino acid sequence which comprises the amino acid exchange according to the invention at position 5 of SEQ ID NO: 2, as shown in SEQ ID NO: 10, and upstream and downstream thereof a nucleotide sequence with a length of at least about 51 (see also SEQ ID NO: 11 and 12) each preferably at least about 101 or 102, (see also SEQ ID NO: 13 and 14) particularly preferably in each case at least about 201 nucleobases (see also SEQ ID NO: 15 and 16) and very particularly preferably in each case at least about 500 or 498 nucleobases (see also SEQ ID NO: 17 and 18) selected from SEQ ID NO: 9 has.
  • the maximum length of the nucleotide sequence upstream and downstream of the mutation is generally about 500, about 750, about 1000, about 1500, about 2000 to 2100 nucleobases.
  • the nucleotide sequence upstream of the mutation includes, for example, the sequence between position 1 to 762 of SEQ ID NO: 9 or the sequence between position 1 to 1012 of SEQ ID NO: 25.
  • the nucleotide sequence downstream of the mutation comprises, for example, the sequence between position 766 to 2814 of SEQ ID NO: 9 or the sequence between position 1016 to 3314 of SEQ ID NO: 25. Accordingly, the total length of the polynucleotide used for the allele exchange is at most about 1000 , maximum about 1500, maximum about 2000, maximum about 3000 or maximum about 4000 to 4200 nucleobases.
  • the invention accordingly relates to a polynucleotide which comprises a nucleotide sequence which, from position 1 to 39, contains the nucleotide sequence corresponding to positions 1 to 39 of SEQ ID NO: 11 and from positions 40 to 105 a nucleotide sequence which is suitable for the nucleotide sequence
  • the position data 1 to 39 of SEQ ID NO: 11 correspond to the position data 712 to 750 of SEQ ID NO: 9.
  • the position data 40 to 105 of SEQ ID NO: 11 correspond to the position data 751 to 816 of SEQ ID NO: 9 ,
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, wherein the codon corresponding to positions 52 to 54 encodes each proteinogenic amino acid except L-aspartic acid.
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence from position 712 to 816 of SEQ ID NO: 7.
  • the invention accordingly further provides a polynucleotide which comprises a nucleotide sequence which, from position 1 to 89, contains the nucleotide sequence corresponding to position 1 to 89 of SEQ ID NO: 13 and from position 90 to 206 a nucleotide sequence which corresponds to the amino acid sequence according to SEQ ID NO : 14 encoded, wherein at position 5 any proteinogenic amino acid except L-aspartic acid is included.
  • the position data 1 to 89 of SEQ ID NO: 13 correspond to the position data 662 to 750 of SEQ ID NO: 9.
  • the position data 90 to 206 of SEQ ID NO: 13 correspond to the position data 751 to 867 of SEQ ID NO: 9 ,
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, wherein the codon corresponding to positions 102 to 104 encodes each proteinogenic amino acid except L-aspartic acid.
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence from position 662 to 867 of SEQ ID NO: 7.
  • the invention accordingly accordingly provides a polynucleotide which comprises a nucleotide sequence which, from position 1 to 189, contains the nucleotide sequence corresponding to positions 1 to 189 of SEQ ID NO: 15 and from positions 190 to 405 a nucleotide sequence which corresponds to the nucleotide sequence
  • the position data 1 to 189 of SEQ ID NO: 15 correspond to the position data 562 to 750 of SEQ ID NO: 9.
  • the position data 190 to 405 of SEQ ID NO: 15 correspond to the position data 751 to 966 of SEQ ID NO: 9 ,
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, wherein the codon corresponding to position 202 to 204 encodes any proteinogenic amino acid except L-aspartic acid.
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence from position 562 to 966 of SEQ ID NO: 7.
  • the invention accordingly accordingly also provides a polynucleotide which comprises a nucleotide sequence which, from position 1 to 488, contains the nucleotide sequence corresponding to position 1 to 488 of SEQ ID NO: 17 and from position 489 to 1001 a nucleotide sequence which corresponds to the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 18 encoded, wherein at position 5 any proteinogenic amino acid except L-aspartic acid is included.
  • the position data 1 to 488 of SEQ ID NO: 17 correspond to the position data 263 to 750 of SEQ ID NO: 9.
  • the position data 489 to 1001 of SEQ ID NO: 15 correspond to the position data 751 to 1263 of SEQ ID NO: 9 .
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, wherein the codon corresponding to position 501 to 503 encodes each proteinogenic amino acid except L-aspartic acid.
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence from position 263 to 1263 of SEQ ID NO: 7.
  • the polynucleotide comprises the nucleotide sequence from position 9 to 1687 of SEQ ID NO: 31.
  • the invention also relates to vectors, preferably plasmids, containing said polynucleotides.
  • the invention likewise provides bacteria of the genus Escherichia, more preferably of the species Escherichia coli, and Corynebacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum, which contain the said vectors.
  • the invention also relates to strains of the genus Corynebacterium, preferably of the species Corynebacterium glutamicum, which are produced using the invention
  • Polynucleotides or using vectors containing the polynucleotides of the invention were prepared.
  • gltA allele of the invention into another location in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.
  • These may be, for example, the loci or genes aecD, ccpAl, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysRl, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi and poxB, as described in WO 03/04037.
  • recombinant strains obtained according to the invention show an increased excretion or production of the desired amino acid in a fermentation process compared to the starting strain or parent strain used.
  • the starting strains which excrete L-lysine for the purposes of the invention have, in particular, a lysine-insensitive aspartate kinase, among other properties.
  • a lysine-insensitive aspartate kinase is understood as meaning a polypeptide or protein having aspartate kinase activity (EC No. 2.7.2.4), which has a lower sensitivity to inhibition by mixtures of lysine and threonine or mixtures of AEC (aminoethylcysteine) and Threonine or lysine alone or AEC alone.
  • Such aspartate kinases are also referred to as "feed back" resistant or desensitized aspartate kinases and the nucleotide sequences encoding these desensitized aspartate kinases and aspartate kinase variants are also referred to as lysC FBR alleles
  • lysC FBR alleles Information on numerous lysC FBR alleles are available in the public databases also refer to the lysC gene as an ask gene.
  • the coding region of the wild-type lysC gene of Corynebacterium glutamicum corresponding to accession number AX756575 of the NCBI database is shown in SEQ ID NO: 19 and the polypeptide encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 20. Also, in SEQ ID NO: 21, the upstream of the 5 'end and downstream of the 3' end of the coding region
  • SEQ ID NO: 20 corresponds to SEQ ID NO: 22.
  • the bacteria exuding L-lysine for the purposes of the invention preferably have a lysC allele which codes for an aspartate kinase variant which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 one or more of the amino acid substitutions selected from the group:
  • LysC A279T exchange of L-alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for L-threonine; see US 5,688,671 and accession numbers E06825, E06826, E08178 and 174588 to 174597
  • LysC A279V replacement of L-alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against L-valine, see JP 6-261766 and accession number E08179
  • LysC L297Q replacement of L-leucine at position 297 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 by another proteinogenic amino acid, preferably L-glutamine, see DE 102006026328
  • LysC S301F replacement of L-serine at position 301 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against
  • LysC S301Y replacement of L-serine at position 301 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against L-tyrosine, see Kalinowski et al (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) and accession number X57226) .
  • LysC T308I exchange of L-threonine at position 308 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for L-isoleucine, see JP 6-261766 and accession number E08181)
  • LysC T311I exchange of L-threonine at position 311 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for L-isoleucine, see WO 00/63388 and US Pat. No. 6,893,848)
  • LysC S317A replacement of L-serine at position 317 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against L-alanine, see US 5,688,671 and accession number 174589
  • LysC R320G replacement of L-arginine at position 320 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against glycine, see Jetten et al (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) and accession number L27125
  • LysC G345D replacement of glycine at position 345 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against L-aspartic acid, see Jetten et al (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) and accession number L16848),
  • LysC T380I exchange of L-threonine at position 380 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for L-isoleucine, see WO 01/49854 and accession number AX192358)
  • LysC S381F replacement of L-serine at position 381 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against L-phenylalanine, see EP 0435132
  • strains whose aspartate kinase variants contain the amino acid substitution LysC T311I or one or more of the amino acid substitutions selected from the group LysC A279T, LysC L297Q, LysC S317A, LysC T380I and LysC S381F.
  • the aspartate kinases described are present in the Corynebacterium, which contains the amino acid exchange according to the invention in the gltA gene, overexpressed.
  • Overexpression is generally understood to mean an increase in the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein or an enzyme compared to the parent strain or wild-type strain.
  • An initial strain (parent strain) is understood to mean the strain on which the overexpression-leading measure was carried out.
  • the increase in concentration or activity can be achieved, for example, by increasing the copy number of the corresponding polynucleotides chromosomally or extrachromosomally by at least one copy.
  • a widely used method for increasing the copy number consists of incorporating the corresponding polynucleotide into a vector, preferably a plasmid, which is replicated by a coryneform bacterium.
  • Plasmid vectors are, for example, pZI (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) or those described by Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)) described pSELF vectors.
  • pZI Mossham et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554
  • Tauch et al. Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)
  • pSELF vectors A review on plasmids in Corynebacterium glutamicum can be found in Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
  • transposons insertion elements (IS elements) or phages
  • IS elements insertion elements
  • phages phages
  • Another common method for achieving overexpression is the method of chromosomal gene amplification.
  • this method at least one additional copy of the polynucleotide of interest is inserted into the chromosome of a coryneform bacterium.
  • Such amplification methods are described, for example, in WO 03/014330 or WO 03/040373.
  • Another method for achieving an overexpression is to link the corresponding gene or allele in a functional manner (operably linked) with a promoter or an expression cassette.
  • Suitable promoters for Corynebacterium glutamicum are described for example in FIG. 1 of the review article by Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003)).
  • the variants of the dapA promoter described by Vasicova et al Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)
  • the gap promoter of Corynebacterium glutamicum can be used.
  • promoters T3, T7, SP6, M13, lac, tac, and trc described in Amann and Brosius become.
  • a promoter may be inserted upstream of the subject gene, typically at a distance of about 1-500 nucleobases from the start codon.
  • the activity or concentration of the corresponding polypeptide will generally be at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, maximum up to 1000% or 2000% based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to overexpression.
  • the bacteria according to the invention of the genus Corynebacterium which preferably also contain a polynucleotide which codes for a lysine-insensitive aspartate kinase variant, have one or more of the features selected from the group a) overexpressed polynucleotide (dapA gene) encoding a dihydrodipicolinate synthase (DapA, EC No. 4.2.1.52),
  • polynucleotide coding for a polypeptide with L-lysine export activity (LysE, lysine efflux permease),
  • the genes known in the prior art for example the so-called wild-type genes, from Escherichia coli (Blattner et al., Science 277 (5), 1453-1462 (1997)), Bacillus subtilis (Kunst et al , Nature 390 (6657), 249-256 (1997)), Bacillus licheniformis (Veith et al, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 7 (4), 204-211 (2004)), Mycobacterium tuberculosis (Fleischmann et al, Journal of Bacteriology 1841, 5479-5490 (2004)), Mycobacterium bovis (Garnier et al, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (13th ed ), 7877-7882 (2003)), Streptomyces coeliclor (Redenbach et al, Molecular Microbiology 21 (1), 77-96 (1996)), Lactobacillus acidophilus (Alter
  • Endogenous genes or polynucleotides are understood as meaning the open reading frame (ORF), genes or alleles or their polynucleotides present in the population of a species.
  • the dapA gene of Corynebacterium glutamicum strain ATCC13032 is described for example in EP 0 197 335.
  • the mutations MC20 and MA16 of the dapA promoter as described in US 6,861,246, can be used.
  • the lysA gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (Brevibacterium lactofermentum) is described, for example, in US 6,090,597.
  • the aat gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 is described, for example, in Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003); see also accession number NC_006958). It is referred to there as the aspB gene.
  • a coding for an aspartate aminotransferase gene is referred to as aspC.
  • Marienhagen et al Journal of Bacteriology 187 (22), 7639-7646 (2005) designate the aat gene as the aspT gene.
  • the lysE gene of Corynebacterium glutamicum R127 is described, for example, in US Pat. No. 6,858,406.
  • Strain R127 is a restriction-defective mutant of ATCC13032 (Liebl et al, FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)).
  • the lysE gene of strain ATCC13032 used in US Pat. No. 6,861,246 can be used.
  • the pyc gene of Corynebacterium glutamicum of strain ATCC 13032 is described, for example, in WO 99/18228 and WO 00/39305. Furthermore, alleles of the pyc gene can be used, as described, for example, in US Pat. No. 6,965,021.
  • the pyruvate carboxylases described in this patent have one or more of the amino acid substitutions selected from the group: Pyc E153D (exchange of L-glutamic acid at position 153 for L-aspartic acid), Pyc A182S (replacement of L-alanine at position 182 for L-aspartic acid).
  • off or weakened activity is meant the reduction or elimination of intracellular activity or concentration of one or more enzymes or proteins in a microorganism which be encoded by the corresponding polynucleotide or DNA.
  • Said measures are preferably carried out in the region between the start codon and the penultimate coding codon, more preferably in the 5 '-terminal part of the coding region, which codes for the N-terminus of the polypeptide. If the total length of a polypeptide (measured as the number of chemically linked L-amino acids) is 100%, then part of the amino acid sequence belonging to the N-terminus of the polypeptide, calculated from the starting amino acid L, belongs within the scope of the present invention -Formyl-methionine contains 80% of the subsequent L-amino acids.
  • MQO malate quinone oxidoreductase
  • Mqo malate-quinone oxidoreductase
  • strains which contain a mqo-AlIeI which codes for an Mqo variant which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, wherein L-phenylalanine is present at position III.
  • the activity or concentration of the corresponding protein is generally 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-type protein , or the activity or concentration of the protein in the parent strain or parent decreased.
  • the bacteria of the genus Corynebacterium produced according to the invention can be used continuously - as described, for example, in PCT / EP2004 / 008882 or discontinuously in the batch process (batch culturing or batch process) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) Purposes of producing the desired L-amino acids.
  • a general summary of known cultivation methods is in the textbook by Chmiel (bioprocess 1. Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag,
  • the culture medium or fermentation medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology, of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981). The terms culture medium and fermentation medium or medium are mutually exchangeable.
  • the carbon source may be sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions from sugarcane or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soybean oil,
  • Sunflower oil peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerin, methanol and ethanol, and organic acids such as acetic or lactic acid. These substances can be used individually or as a mixture.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate,
  • Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the culture medium must further contain salts, for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • salts for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids such as homoserine and vitamins such as thiamine, biotin or pantothenic acid can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • the said starting materials can be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • pH control of the culture are basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such Phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner.
  • the pH is generally adjusted to a value of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.
  • foam antifoams such as Fettsaurepolyglykolester can be used.
  • suitable, selectively acting substances such as antibiotics, may be added to the medium.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as air, are introduced into the culture.
  • liquids enriched with hydrogen peroxide is also possible.
  • the fermentation at elevated pressure, for example at a pressure of 0.03 to 0.2 MPa, driven.
  • the temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 ° C and preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • the cultivation is continued until a maximum of the desired L-amino acid, has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours. In continuous processes longer cultivation times are possible.
  • the activity of the bacteria leads to an accumulation (accumulation) of the L-amino acid in the fermentation medium and / or in the bacterial cells.
  • L-amino acids Methods for the determination of L-amino acids are known in the art. For example, the analysis may be as described by Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography followed by ninhydrin derivatization, or it can be done by reversed phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). The invention accordingly also provides a process for preparing an L-amino acid, which comprises carrying out the following steps:
  • a fermentation broth is understood as meaning a fermentation medium or nutrient medium in which a microorganism has been cultivated for a certain time and at a certain temperature.
  • Fermentation medium or the media used during the fermentation contains / contain all substances or components that ensure an increase of the microorganism and formation of the desired amino acid.
  • the resulting fermentation broth accordingly contains a) the biomass (cell mass) of the microorganism resulting from the multiplication of the cells of the microorganism, b) the desired L-amino acid formed during the fermentation, such as L-lysine, L-valine or L-l Isoleucine c) the organic by-products formed during the fermentation and d) the components of the fermentation medium or of the starting materials not consumed by the fermentation, such as, for example, vitamins such as biotin,
  • Amino acids such as homoserine or salts such as magnesium sulfate.
  • the organic by-products include substances which, apart from the particular organoleptic organism desired, may be added to the microorganisms used in the fermentation. produced chemical compound and optionally excreted. These include sugars such as trehalose.
  • isolation and purification for example using one or more methods selected from the group of chromatographic methods, crystallization methods and use of activated carbon, is preferred so that substantially pure products, for example those having a purity of ⁇ 90 wt% or ⁇ 95 wt%.
  • a group of L-lysine containing products comprises concentrated, aqueous, alkaline solutions of purified L-lysine (EP-B-0534865).
  • Another group as described, for example, in US Pat. Nos. 6,340,486 and 6,465,025, comprises aqueous, acidic, biomass-containing concentrates of L-lysine-containing fermentation broths.
  • the most common group of solid products comprises powdered or crystalline forms of purified or pure L-lysine, which is typically in the form of a salt such as L-lysine monohydrochloride.
  • Another group of solid product forms is described for example in EP-B-0533039.
  • the product form described therein contains, in addition to L-lysine, the major part of the starting materials used during the fermentative production and not consumed and optionally the biomass of the microorganism used with a proportion of> 0% - 100%.
  • L-lysine is collected from the fermentation broth, isolated or purified to produce the L-lysine-containing product or the purified L-lysine.
  • essentially methods of ion exchange chromatography are optionally used, using activated carbon and crystallization methods.
  • the corresponding base or a corresponding salt is obtained, for example the monohydrochloride (Lys-HCl) or the lysine sulfate (Lys2-H 2 SO 4 ).
  • EP-B-0534865 describes a process for preparing aqueous, basic L-lysine-containing solutions from fermentation broths.
  • the biomass is separated from the fermentation broth and discarded.
  • a base such as sodium, potassium or ammonium hydroxide, a pH between 9 to 11 is set.
  • the mineral components are separated from the broth after concentration and cooling by crystallization and either used as fertilizer or discarded.
  • the biomass may be wholly or partially separated by separation methods such as e.g. centrifugation, filtration, decantation, or a combination thereof, from the fermentation broth or left completely in it.
  • separation methods such as e.g. centrifugation, filtration, decantation, or a combination thereof, from the fermentation broth or left completely in it.
  • the biomass or the biomass-containing fermentation broth is inactivated during a suitable process step, for example by thermal treatment (heating) or by acid addition.
  • the biomass is completely or almost completely removed so that no (0%) or at most 30%, at most 20%, at most 10%, at most 5%, at most 1% or at most 0.1% biomass is produced in the Product remains.
  • the biomass is not removed or only in minor proportions, so that all (100%) or more than 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or 99.9% biomass remains in the product produced. Accordingly, in a method according to the invention, the biomass is removed in proportions of ⁇ 0% to ⁇ 100%.
  • the fermentation broth obtained after the fermentation can be adjusted to an acidic pH before or after complete or partial removal of the biomass with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or organic acid such as propionic acid (GB 1,439,728 or EP 1,331,220 ). It is also possible the fermentation broth with the completely contained
  • the broth may also be stabilized by the addition of sodium bisulfite (NaHSO 3 , GB 1,439,728) or another salt, for example, ammonium, alkali or alkaline earth salt of the sulfurous acid.
  • NaHSO 3 sodium bisulfite
  • another salt for example, ammonium, alkali or alkaline earth salt of the sulfurous acid.
  • organic or inorganic solids are partially or completely removed.
  • the organic by-products dissolved in the fermentation broth and the dissolved non-consumed constituents of the fermentation medium (starting materials) remain at least partially (> 0%), preferably at least 25%, more preferably at least 50% and most preferably at least 75% in the product.
  • these also remain complete (100%) or nearly complete, that is> 95% or> 98% or greater than 99%, in the product. If a product in this sense contains at least part of the constituents of the fermentation broth, this is also described by the term "product based on fermentation broth".
  • the broth is then treated by known methods such as, for example, by means of a rotary evaporator, Dunn Anlagenverdampfers, falling film evaporator, by reverse osmosis or by nanofiltration water extracted or thickened or concentrated.
  • This concentrated fermentation broth can then be purified by freeze drying, spray drying,
  • Spruhgranulation or by other methods such as described in the circulating fluidized bed according to PCT / EP2004 / 006655, are processed to free-flowing products, in particular to a finely divided powder or preferably coarse granules.
  • a desired product is isolated from the resulting granules by sieving or dust separation.
  • Free-flowing refers to powders that flow out of a series of glass outlet vessels with different sized outflow openings at least from the vessel with the opening 5 mm (millimeters) unhindered (Klein: Soaps, Ole, Fats, Wachse 94, 12 (1968)).
  • finely divided is meant a powder with a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 20 to 200 ⁇ m in diameter.
  • coarse grained is meant a product having a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 200 to 2000 ⁇ m in diameter.
  • the grain size determination can be carried out with methods of laser diffraction spectrometry. The corresponding methods are described in the textbook “Particle Size Measurement in Laboratory Practice” by RH Muller and R. Schuhmann,ticianliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) or in the textbook “Introduction to Particle Technology” by M. Rhodes, published by Wiley & Sons (1998).
  • the free-flowing, finely divided powder can in turn be converted by suitable compacting or granulating process into a coarse-grained, free-flowing, storable and substantially dust-free product.
  • dust-free means that the product contains only small amounts ( ⁇ 5%) of particle sizes smaller than 100 ⁇ m in diameter.
  • "storable” means a product which can be stored for at least one (1) year or more, preferably at least 1.5 years or longer, more preferably two (2) years or more, in a dry and cool environment, without a significant loss (maximum 5%) of the respective amino acid occurs.
  • the invention further relates to a process which is described in its basic features in DE 102006016158, and in which the fermentation broth obtained using the microorganisms according to the invention, from which the biomass has optionally been completely or partially separated off, is further processed by a process performing at least the following steps includes:
  • a) lowers the pH to 4.0 to 5.2, in particular 4.9 to 5.1, by addition of sulfuric acid, and a molar sulfate / L-lysine ratio of 0.85 to 1.2, preferably 0.9 to 1.0, more preferably> 0.9 to ⁇ 0.95, in the broth, optionally by adding a further or more sulphate compound (s) and
  • step a) where appropriate, prior to step a) one or both of the following measures is / are carried out:
  • a salt of sulfurous acid preferably alkali metal hydrogen sulfite, more preferably sodium hydrogen sulfite in a concentration of 0.01 to 0.5 wt .-%, preferably 0.1 to 0.3 wt .-%, particularly preferred 0.1 to 0.2% by weight, based on the fermentation broth.
  • Ammonium sulphate and / or ammonium hydrogen sulphate or corresponding mixtures of ammonia and sulfuric acid and sulfuric acid itself are to be mentioned as preferred sulphate-containing compounds in the sense of the abovementioned process steps.
  • the molar sulfate / L-lysine ratio V is calculated according to the
  • V 2 x [SO 4 2- ] / [L-lysine] calculated. This formula takes into account the fact that the SO 4 2- anion, or the sulfuric acid is bivalent.
  • auxiliaries such as starch, gelatin, cellulose derivatives or similar substances, such as are commonly used in food or feed processing as binders, gelling or thickening agents, or of other substances such as silicas, silicates (EP0743016A) stearates.
  • oils mineral oils vegetable oils or mixtures of vegetable oils can be used. Examples of such oils are soya oil, olive oil, Soy aol / lecithin mixtures.
  • silicone oils, polyethylene glycols or hydroxyethyl cellulose are suitable.
  • the proportion of dust d. H. Particles with a particle size ⁇ 100 microns is preferably> 0 to 1 wt .-%, more preferably at most 0.5 wt .-%.
  • the product can also be applied to a known and customary in animal feed processing organic or inorganic carrier material such as silicas, silicates, shot, bran, flour, starch, sugar or other and / or with conventional organic or inorganic carrier material such as silicas, silicates, shot, bran, flour, starch, sugar or other and / or with conventional organic or inorganic carrier material such as silicas, silicates, shot, bran, flour, starch, sugar or other and / or with conventional
  • Thickening or binding agents are mixed and stabilized. Application examples and processes for this purpose are described in the literature (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, page 817).
  • the L-lysine can be added during the process in the form of a concentrate or optionally a substantially pure substance or its salt in liquid or solid form. These can be added individually or as mixtures to the obtained or concentrated fermentation broth, or also during the drying or granulation process.
  • the invention further relates to a process for the preparation of a solid lysine-containing product, as described in its basic features in US 20050220933, and which comprises the processing of the fermentation broth obtained using the microorganisms according to the invention in the following steps:
  • step b) granulation of the concentrate obtained in step b), preferably at a temperature of 50 0 C to 62 ° C, and
  • coating compositions which are selected from the group consisting of
  • an L-lysine-containing compound preferably selected from the group L-lysine hydrochloride or L-lysine sulfate,
  • Lysine content ⁇ 1% by weight, preferably ⁇ 0.5% by weight, preferably selected from the group starch,
  • Karageenan agar, silicas, silicates, grits, bran and flours, and d4) a water-repellent substance, preferably selected from the group of oleic, polyethylene glycols and liquid paraffins.
  • the content of L-lysine is adjusted to a desired value.
  • the ratio of the ions is preferably adjusted so that the molar ion ratio according to the following formula
  • the fermentation broth-based solid product thus prepared has a lysine content (as lysine base) of 10% to 70% by weight or 20% to 70% by weight, preferably 30% by weight. % to 70 wt .-% and most preferably from 40 wt .-% to 70 wt .-% based on the dry weight of the product. Maximum levels of lysine base of 71% by weight, 72% by weight, 73% by weight are also possible.
  • the water content of the L-lysine-containing solid product is up to 5 wt .-%, preferably up to 4 wt .-%, and particularly preferably less than 3 wt .-%.
  • the strain Corynebacterium glutamicum DM678 (US 6,861,246) is a lysine production strain developed by mutagenesis and screening. It is auxotrophic for L-threonine and L-methionine sensitive. The strain was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) as DSM12866.
  • gltA_XL-Al (SEQ ID NO: 27): 5 "tgagttctattggcgtgacc 3"
  • gltA_XL-El (SEQ ID NO: 28): 5 "ttcgccaacgatgatgtcag 3"
  • the primers shown were synthesized by the company MWG Biotech (Ebersberg, Germany). They allow the amplification of a ca. 1.8 kb DNA segment carrying the gltA gene.
  • the primer gltA_XL-Al binds to the region corresponding to position 490 to 509 of the strand complementary to SEQ ID NO: 3 (and SEQ ID NO: 7).
  • the primer gltA XL-El binds to the region corresponding to position 2266 to 2247 of the strand according to SEQ ID NO: 3 (and SEQ ID NO: 7).
  • the PCR reaction was carried out with the Phusion High Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Germany). The reaction mixture was after
  • the PCR approach was first subjected to preliminary denaturation at 98 ° C for 30 seconds. Thereupon followed 35x repeating a denaturation step at 98 ° C for 20 seconds, a step for bonding the primer to the introduced DNA at 60 0 C for 20 seconds and the extension step extending the primers at 72 ° C for 60 seconds. After the final extension step for 5 minutes at 72 ° C., the PCR mixture was subjected to agarose gel electrophoresis (0.8% agarose). A DNA fragment of about 1.8 kb in length was identified, isolated from the gel and purified using the QIAquick Gel Extraction Kit from Qiagen, (Hilden, Germany).
  • the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment or PCR product was determined by Agowa (Berlin, Germany).
  • the nucleotide sequence of the coding region of the gltA allele from strain DM678 contains the nucleobase at position 14
  • Thymine The wild-type gene (see SEQ ID NO: 1) contains the nucleobase adenine at this position. This adenine-thymine transversion results in an amino acid substitution of aspartate to valine at position 5 of the resulting amino acid sequence. This mutation is referred to below as gltAD5V.
  • the allele gltAD5V is shown in SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence of the protein resulting from the program Patentin is shown in SEQ ID NO: 6.
  • a DNA fragment was amplified, which forms part of the "upstream region" of the gltA gene as well as a part of the coding region the mutation contains gltAD5V carries.
  • the chromosomal DNA of DM678 obtained in Example 1 was used as a template.
  • the following oligonucleotides were selected as primers for the PCR:
  • the primer gltA_l.p binds to the region corresponding to position 169 to 187 of the strand complementary to SEQ ID NO: 25.
  • Nucleotides 9 to 26 of the primer gltA_2.p bind to the region corresponding to positions 1855 to 1838 of the strand according to SEQ ID NO: 25.
  • the primer gltA lp contains the native cleavage site of the restriction enzyme Sali and the primer gltA_2.p the sequence of the cleavage site of the restriction enzyme EcoRI, which are each marked by underlining in the above nucleotide sequence.
  • the PCR reaction was performed with Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Germany). The reaction had the composition described above. The PCR was performed as described above. The nucleotide sequence of the approximately 1.7 kb amplicon is shown in SEQ ID NO: 31.
  • the amplificate was treated with the restriction endonucleases Sali and EcoRI and identified by electrophoresis in a 0.8% agarose gel. It was then isolated from the gel and purified with the QIAquick Gel Extraction Kit from Qiagen. The thus purified DNA fragment contains the described gltAD5V mutation and has compatible ends to Sali or EcoRI cut DNA (gltAD5V fragment or gltA s in FIG. 1). It was subsequently used in Schulfer et al. (Gene, 145, 69-73 (1994)), mobilizable vector pKl ⁇ mobsacB cloned to allow a Allel or mutation exchange.
  • pKl ⁇ mobsacB was digested with the restriction enzymes EcoRI and Sali and the ends were dephosphorylated with alkaline phosphatase (alkaline phosphatase, Boehringer Mannheim, Germany).
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase, Boehringer Mannheim, Germany.
  • the prepared vector was mixed with the gltAD5V fragment and the batch was treated with the Ready-To-Go T4 DNA ligase kit (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany).
  • the E. coli strain S17-1 (Simon et al., Bio / Technology 1: 784-791, 1993) was transformed with the ligation mixture (Hanahan, In. DNA cloning, A practical approach, Vol. I. ILR-Press CoId Spring Harbor, New York, 1989). Selection for plasmid-carrying cells was made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Ed Cold Spring Harbor, New York, 1989..), The 25 mg / 1 kanamycin had been supplemented.
  • Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction cleavage with the enzymes Sali and EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis.
  • the plasmid was named pK18mobsacB_gltAD5V and is shown in FIG.
  • the mutation gltAD5V is to be introduced into the strain Corynebacterium glutamicum DM1797.
  • Strain DM1797 is an aminoethylcysteine-resistant mutant of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and described in PCT / EP / 2005/012417. It is under the name DSM16833 deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany).
  • the vector pK18mobsacB_gltAD5V described in Example 2 was prepared according to the protocol of Shufer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) into the C. glutamicum strain DM1797 by conjugation.
  • the vector can not self-replicate in DM1797 and will only be retained in the cell if it is integrated into the chromosome as a result of a recombination event.
  • clones with integrated pK18mobsacB_gltAD5V was made by plating the conjugation batch on LB agar supplemented with 25 mg / l kanamycin and 50 mg / l nalidixic acid. Kanamycin-resistant transconjugants were then streaked on kanamycin (25 mg / l) supplemented LB agar plates and incubated for 24 hours at 33 ° C.
  • the clones were cultured unsupported in LB liquid medium for 30 hours, then streaked on LB agar supplemented with 10% sucrose for 24 hours Incubated at 33 ° C.
  • the plasmid pK18mobsacB_gltAD5V contains, in addition to the kanamycin resistance gene, a copy of the sacB gene coding for the Levan sucrase from Bacillus subtilis.
  • the sucrose-inducible expression of the sacB gene results in the formation of levan sucrase, which catalyzes the synthesis of the C. glutamicum toxic product levan.
  • On sucrose-supplemented LB agar therefore, only those clones grow in which the integrated pK18mobsacB_gltAD5V was excised as a result of a second recombination event.
  • the allelic exchange or the incorporation of the mutation takes place or the original copy remains in the chromosome of the host.
  • a clone was sought in which the desired exchange, i. H. the incorporation of the gltAD5V mutation had occurred.
  • the sequence of the gltA gene was determined from 10 clones with the phenotype "growth in the presence of sucrose” and "non-growth in the presence of kanamycin". In this way, a clone was identified that carries the mutation gltAD5V. This strain was designated as C. glutamicum DM1797_gltAD5V.
  • strain DM1797_gltAD5V obtained in Example 3 and the starting strain DM1797 were used in a production of
  • Lysine suitable nutrient medium cultured and determined the lysine content in the culture supernatant.
  • the clones were initially propagated on brain-heart agar plates (Merck, Darmstadt, Germany) for 24 hours at 33 ° C. Starting from these agar plate cultures, one preculture was in each case inoculated (10 ml of medium in the 100 ml Erlenmeyer flask). The medium MM was used as the medium for the precultures. The precultures were incubated for 24 hours at 33 ° C and 240 rpm on a shaker. Of these precultures, one main culture each was inoculated so that the initial OD (660 nm) of the main culture was 0.1 OD. The medium MM was also used for the main cultures.
  • CSL Corn Steep Liquor
  • MOPS morpholinopropanesulfonic acid
  • saline solution was adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions as well as the dry autoclaved CaCO 3 were added.
  • Culturing was done in volumes of 10 ml contained in 100 ml baffled Erlenmeyer flasks. The temperature was 33 ° C, the number of revolutions was 250 rpm and the humidity was 80%.
  • the optical density (OD) at a measuring wavelength of 660 nm was determined with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Kunststoff). The amount of lysine formed was determined using an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)
  • the mutation gltAD5V is to be introduced into the strain Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763.
  • Strain FERM BP-1763 is a mycophenolic acid-resistant valine producer (US Pat. No. 5,188,848). It is auxotrophic for L-isoleucine and L-methionine.
  • the vector pK18mobsacB_gltAD5V described in Example 2 was prepared according to the protocol of Shufer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) into strain FERM-BP-1763 by conjugation.
  • the vector can not self-replicate in FERM BP-1763 and will only be retained in the cell if it is integrated into the chromosome as a result of a recombination event.
  • transconjugants ie clones with integrated pK18mobsacB_gltAD5V. The selection of transconjugants, ie clones with integrated pK18mobsacB_gltAD5V, was carried out by plating the conjugation batch on LB agar supplemented with 25 mg / l kanamycin and 50 mg / l nalidixic acid. Kanamycin-resistant transconjugants were then streaked on kanamycin (25 mg / l) supplemented LB agar plates and incubated for 24 hours at 33 ° C.
  • the clones were cultured unsupported in LB liquid medium for 30 hours, then on LB agar supplemented with 10% sucrose was streaked and incubated at 33 ° C for 24 hours.
  • the plasmid pKl ⁇ mobsacB gltAD5V contains as well as the starting plasmid pKl ⁇ mobsacB next to the kanamycin resistance gene a copy of the levan sucrase from
  • Bacillus subtilis encoding sacB gene Bacillus subtilis encoding sacB gene.
  • the sucrose inducible expression of the sacB gene results in the formation of levan sucrase, which catalyzes the synthesis of the C. glutamicum toxic product Levan.
  • levan sucrase catalyzes the synthesis of the C. glutamicum toxic product Levan.
  • On sucrose-supplemented LB agar therefore, only those clones grow in which the integrated pKl ⁇ mobsacB gltAD5V was excised as a result of a second recombination event.
  • the excision involves allelic replacement or incorporation of the mutation, or the original copy remains in the chromosome of the host.
  • a clone was sought in which the desired exchange, i. H. the incorporation of the gltAD5V mutation had occurred.
  • the sequence of the gltA gene was determined from 10 clones with the phenotype "growth in the presence of sucrose” and "non-growth in the presence of kanamycin". In this way, a clone was identified that carries the mutation gltAD5V. This strain was designated as C. glutamicum FERM BP-1763_gltAD5V.
  • the strain FERM BP-1763_gltAD5V obtained in Example 5 and the starting strain FERM BP-1763 were cultured in a nutrient medium suitable for the production of valine, and the valine content in the culture supernatant was determined.
  • the clones were initially propagated on brain-heart agar plates (Merck, Darmstadt, Germany) for 24 hours at 33 ° C. Based on these agar plate cultures was ever a preculture inoculated (10 ml of medium in 100 ml Erlenmeyer flask).
  • the medium CgIII (2.5 g / l NaCl, 10 g / l bacto-peptone, 10 g / l bacto-yeast extract, pH 7.4, 20 g / l glucose (separately autoclaved) was used for the precultures
  • the precultures were 24 hours incubated on a shaker at 33 ° C. and 240 rpm, each of which was inoculated with a main culture such that the initial OD (660 nm) of the main culture was 0.1 OD.
  • Medium MM was also used for the main cultures.
  • CaCO 3 25 g / l CSL (Corn Steep Liquor), MOPS (morpholinopropanesulfonic acid) and the saline solution were adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions as well as the dry autoclaved CaCC> 3 were added.
  • Culturing was done in volumes of 10 ml contained in 100 ml baffled Erlenmeyer flasks. The temperature was 33 ° C, the number of revolutions was 250 rpm and the humidity was 80%.
  • the optical density (OD) at a measuring wavelength of 660 nm was determined with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Kunststoff).
  • the valine amount formed was carried out with an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)
  • FIG. 1 Map of the plasmid pK18mobsacB_gltAD5V
  • the abbreviations and designations used have the following meaning.
  • the base pair numbers are approximations obtained as part of the reproducibility of measurements.
  • Kan kanamycin resistance gene
  • Sali Interface of the restriction enzyme Sali
  • gltA ' cloned DNA fragment containing the
  • sacB sacB gene
  • RP4-mob mob region with the replication origin for the transfer (oriT)

Abstract

Gegenstand der Erfindung sind neue, für ein Polypeptid mit Citratsynthase Aktivität kodierende Polynukleotide, Bakterien die diese enthalten, bevorzugt der Gattung Corynebacterium und Escherichia, und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung dieser Bakterien. Gegenstand der Erfindung ist dabei insbesondere ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfasst, wobei die L-Asparaginsäure an Position 5 der Aminosäuresequenz durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist und wobei das Polypeptid Citratsynthase Aktivität besitzt.

Description

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
Gegenstand der Erfindung sind neue, für ein Polypeptid mit Citratsynthase Aktivität kodierende Polynukleotide, Bakterien, die diese enthalten, und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung dieser Bakterien .
Stand der Technik
Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen .
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S- (2-Aminoethyl) -L-Cystein (AEC).
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen der Gattung Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure- Produktion untersucht.
Zusammenfassende Darstellungen zur Biologie, Genetik und Biotechnologie von Corynebacterium glutamicum sind im
„Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: L. Eggeling und M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), in der Spezialausgabe des Journal of Biotechnolgy (Chief Editor: A. Pühler) mit dem Titel ,,A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003)) und im Buch von T. Scheper (Managing Editor) „Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Deutschland, 2003) zu finden.
Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium glutamicum ist bei Ikeda und Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), in der EP 1 108 790 und bei Kalinowski et al . (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003)) beschrieben.
Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium efficiens ist bei Nishio et al (Genome Research. 13 (7), 1572-1579 (2003)) beschrieben.
Die Nukleotidsequenzen des Genoms von Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium efficiens sind ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) , in der DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) oder in der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) verfügbar.
Die aus dem Stand der Technik bekannte Wildtypsequenz der Kodierregion des gltA-Gens von Corynebacterium glutamicum ist in der SEQ ID NO: 1 im Beschreibungsteil der vorliegenden Anmeldung dargestellt. In der SEQ ID NO: 3 und 25 sind darüberhinaus die stromaufwärts und stromabwärts der Kodierregion gelegenen Sequenzen dargestellt. Die Aminosäuresequenz des kodierten GltA-Polypeptids (Citratsynthase) ist dementsprechend in den SEQ ID NO' s: 2, 4 und 26 wiedergegeben.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt neue Maßnahmen zur verbesserten Herstellung von L-Aminosäuren, bevorzugt L-Lysin, L-Valin und L-Isoleucin, besonders bevorzugt L- Lysin bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei die L- Asparaginsäure an Position 5 der Aminosäuresequenz durch eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Valin, L- Leucin und L-Isoleucin, besonders bevorzugt L-Valin, ersetzt ist und wobei das Polypeptid Citratsynthase Aktivität (EC Nr. 4.1.3.7) besitzt. Gegebenenfalls enthält das Polypeptid einen oder mehrere konservative Aminosäureaustausch (e) , wobei durch die konservativen Aminosäureaustausche die Citratsynthase-Aktivität des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleibt.
Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Hierzu gehören insbesondere L- Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L- Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L- Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L- Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-
Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin.
Die Begriffe Polypeptid und Protein werden als Synonyme verwendet . Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren und Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium und Escherichia, besonders bevorzugt der Spezies Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli, die das genannte Polynukleotid enthalten oder unter Verwendung des genannten Polynukleotids hergestellt wurden.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich Bakterien bevorzugt der Gattung Corynebacterium und Escherichia, besonders bevorzugt der Spezies Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli, die mit dem genannten Vektor transformiert worden sind.
Der Begriff Transformation umfasst samtliche Methoden zur Übertragung von Polynukleotiden, insbesondere DNA, in ein gewünschtes Bakterium. Hierzu gehören unter anderem die Verwendung von isolierter DNA bei der Transformation,
Elektrotransformation bzw. Elektroporation, die Übertragung durch Zellkontakt wie bei der Konjugation oder die Übertragung von DNA mittels Partikelbeschuss .
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Bakterium, insbesondere rekombinantes Bakterium, der Gattung
Corynebacterium, welches ein Polynukleotid enthalt, das für ein Polypeptid mit Citratsynthase-Aktivitat kodiert, welches die Aminosauresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei an Position 5 der Aminosauresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Asparaginsaure, bevorzugt L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin, besonders bevorzugt L-Valin, enthalten ist. Gegebenenfalls enthalt das Polypeptid einen oder mehrere konservative Aminosaureaustausch (e) , wobei durch die konservativen Aminosaureaustausche die Citratsynthase-Aktivitat des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleibt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosauren, bevorzugt L-Lysin, L- Valin und L-Isoleucin, besonders bevorzugt L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: a) Fermentation der erfindungsgemäßen rekombinanten Bakterien der Gattung Corynebacterium in einem geeignetem Nährmedium, und
b) Akkumulation der L-Aminosäure in dem Nährmedium oder in den Zellen der Bakterien.
Mit L-Aminosäuren sind die proteinogenen Aminosäuren gemeint .
Wird im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z.B. L-Lysin-Monohydrochlorid oder L-Lysin-Sulfat gemeint.
Bei den Bakterien der Gattung Corynebacterium werden L- Aminosäure-ausscheidende Stämme bevorzugt, die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871,
wobei die Art Corynebacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Bezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Bekannte Vertreter Aminosäure-ausscheidender Stämme der Gattung Corynebacterium sind beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme:
Corynebacterium glutamicum DM58-l/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in EP 0 358 940,
Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) beschrieben in Menkel et al . (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)),
Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) beschrieben in EP 1 108 790,
Corynebacterium glutamicum DSM16834 beschrieben in
(PCT/EP2005/012417) , Corynebacterium glutamicum DSM17119 beschrieben in
(PCT/EP2006/060851) ,
Corynebacterium glutamicum DSM17223 beschrieben in
(PCT/EP2006/062010) ,
Corynebacterium glutamicum DSM16937 beschrieben in (PCT/EP2005/057216) , und
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-
3304) beschrieben in US 5,250,423;
oder die L-Valin produzierenden Stämme:
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 beschrieben in US 5,188,948,
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 beschrieben in US 5,521,074,
Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 beschrieben in US 5,521,074, und Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 beschrieben in US 5,188,948;
oder die L-Isoleucin produzierenden Stämme:
Brevibacterium flavum FERM-BP 759 beschrieben in US 4,656,135, Corynebacterium glutamicum FERM-BP 757. beschrieben in US 4,656,135, Brevibacterium flavum FERM-BP 760. beschrieben in US 4,656,135, Corynebacterium glutamicum FERM-BP 758 beschrieben in US 4,656,135, Brevibacterium flavum FERM BP-2215 beschrieben in US 5,705, 370, und Brevibacterium flavum FERM BP-2433 beschrieben in US 5,705, 370.
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) und in der US 5,250,434.
Stämme mit der Bezeichnung „ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Der Stamm Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, ist in der US 5,250,434 beschrieben.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polynukleotide können klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen von Bakterien der Gattung Corynebacterium unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N ' -Nitro-N- Nitrosoguanidin (MNNG) oder von ultraviolettem Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al . (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al . (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben .
Aus der mutagenisierten Zellpopulation werden diejenigen Mutanten entnommen und vermehrt, welche L-Glutaminsäure oder Zitronensäure benötigen, um auf einem Minimalagar wachsen zu können oder deren Wachstum auf Minimalagar durch Gabe von L-Glutaminsäure bzw. Zitronensäure verbessert wird. Es ist weiterhin möglich ausgehend von den L- Glutaminsäure- bzw. Zitronensäure-bedürftigen Mutanten sogenannte Revertanten zu isolieren, die für ihr Wachstum die L-Glutaminsäure bzw. Zitronensäure nicht benötigen. Diese L-Glutaminsäure- bzw. Zitronensäure-auxotrophen Mutanten beziehungsweise deren Revertanten werden anschließend untersucht. Technische Einzelheiten zur Isolierung von Mutanten mit defekter Citratsynthase Aktivität können beispielsweise bei Shiio et al . (Agricultural and Biological Chemistry 46(1), 101-107 (1982)) nachgelesen werden.
Anschließend wird aus den Mutanten DNA bereitgestellt, beziehungsweise isoliert und mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primerpaaren, die die Amplifizierung des gltA-Gens bzw. gltA-Allels erlauben, das entsprechende Polynukleotid synthetisiert und isoliert.
Hierzu können beliebige Primerpaare aus der stromaufwärts und stromabwärts der Kodierregion gelegenen Nukleotidsequenz und der dazu komplementären Nukleotidsequenz ausgewählt werden (Siehe SEQ ID NO' s: 3 und 25) . Ein Primer eines Primerpaares umfasst hierbei bevorzugt mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 1000 von SEQ ID NO:25. Der dazugehörige zweite Primer eines Primerpaares umfasst mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 3314 und 2312 von SEQ ID NO:25.
Anleitungen und Informationen zur PCR findet der Fachmann beispielsweise im Handbuch „PCR-Strategies" (Innis, Feifand und Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), im Handbuch von Diefenbach und Dveksler „PCR Primer - a laboratory manual" (CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1995), im Handbuch von Gait „Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham „PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) .
Weitere Anleitungen zur PCR finden sich beispielsweise in der WO 06/100177 auf Seiten 15 bis 17.
In einem weiteren Arbeitschritt wird dann die Nukleotid- sequenz des Polynukleotids bestimmt. Diese kann beispielsweise nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et al . (Proceedings of the National Academies of Sciences, U. S. A., 74, 5463-5467 (1977)) mit den von Zimmermann et al . (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990)) angegebenen Modifikationen bestimmt werden.
Das von dieser Nukleotidsequenz kodierte Polypeptid kann dann bezuglich der Aminosauresequenz analysiert werden. Dazu wird die Nukleotidsequenz in ein Programm zur Übersetzung von DNA-Sequenz in eine Aminosauresequenz eingegeben. Geeignete Programme sind beispielsweise das
Programm „Patentin", das bei Patentamtern, beispielsweise dem US-Patentamt (USPTO) erhaltlich ist, oder das „Translate Tool", das auf dem ExPASy Proteomics Server im World Wide Web (Gasteiger et al . , Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)) verfugbar ist.
Es ist ebenfalls möglich das erfindungsgemaße Polynukleotid, das im Folgenden auch als erfindungsgemaßes gltA-Allel bezeichnet wird, durch Methoden der in vitro Genetik herzustellen. Geeignete Methoden für die in-vitro Mutagenese sind unter anderem die Behandlung mit Hydroxylamin nach Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, 1992) oder der Einsatz einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer DNA- Polymerase, die eine hohe Fehlerquote aufweist. Eine derartige DNA-Polymerase ist beispielsweise die Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, Nr.600550) der Firma Stratagene (LaJoIIa, CA, USA) . Weiterhin können mutagene Oligonukleotide, wie bei T. A. Brown (Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) und R. M. Horton (PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) beschrieben, eingesetzt werden. Die von Papworth et al . (Strategies 9(3), 3-4 (1996)) beschriebene Methode unter Verwendung des "Quik Change Site-directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene (La Jolla, California, USA) kann ebenfalls eingesetzt werden.
Methoden zur Bestimmung der Citratsynthase Aktivität können bei Eikmanns et al . (Microbiology 140, 1817-1828 (1994)) und bei Shiio et al . (Agricultural and Biological Chemistry 46(1), 101-107 (1982)) nachgelesen werden.
Es ist weiterhin möglich, das erfindungsgemäße Allel der Citratsynthase in Corynebacterium glutamicum oder Escherichia coli zu überexprimieren, um es beispielsweise anschließend in aufgereinigter beziehungsweise isolierter Form darzustellen.
Auf diese Weise wurde ein Polynukleotid isoliert, das die in SEQ ID NO : 5 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist. Das von diesem Polynukleotid kodierte Polypeptid ist in SEQ ID NO: 6 und 8 dargestellt. Es enthält an Position 5 der Aminosäuresequenz L-Valin anstelle L-Asparaginsäure .
Es wurde gefunden, dass der Stamm ATCC13032, wenn er anstelle des Wildtyp gltA-Gens mit dem erfindungsgemäßen gltA-Allel ausgestattet ist, welches für die Citratsynthase gemäß SEQ ID NO: 6 kodiert (ATCC13032 : : gltA D5V) , im Vergleich zum Wildtyp Stamm ATCC13032, welcher die Citratsynthase gemäß SEQ ID NO:2 enthält, eine um ca. 40% bis maximal ca. 90% verringerte Enzymaktivität, bevorzugt eine um ca. 70% bis maximal ca. 90% verringerte Enzymaktivität aufweist.
Es ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend auch Polynukleotide, die für Polypeptide mit Citratsynthase Aktivität kodieren, welche zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Aminosäureaustauschen an Position 5 der Aminosäuresequenz einen (1) oder mehrere konservative (n) Aminosäureaustausch (e) enthalten, welche (r) die enzymatische Aktivität im wesentlichen nicht ändert. Das heisst sie bleibt im wesentlichen unverändert. Der Begriff „im wesentlichen nicht geändert" bzw. „im wesentlichen unverändert" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Citratsynthase Aktivität des Polypeptids um maximal 20 %, bevorzugt maximal 10% und besonders bevorzugt um maximal 5% bis maximal 2% verändert ist im Vergleich zur Citratsynthase Aktivität des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 6, bevorzugt SEQ ID NO: 6.
Für einen experimentellen Test wird das gltA-Gen des Stammes ATCC 13032 gegen das gltA-Allel, welches für ein
Polypeptid, enthaltend den erfindungsgemäßen
Aminosäureaustausch an Position 5 und einen oder mehrere konservative Aminosäureaustausch (e) , kodiert, ausgetauscht.
Anschließend wird der Stamm kultiviert, ein Zellextrakt hergestellt und die Citratsynthase-Aktivität bestimmt. Als
Referenz wird die Citratsynthase-Aktivit in Stamm
ATCC13032: :gltA D5V bestimmt.
Anstelle von Stamm ATCC13032 können auch L-Lysin ausscheidende Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt werden, welche die Kodierregion des gltA-Gens des Wildtyps einschließlich der stromaufwärts gelegenen Nukleotidsequenzen, entsprechend der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 2064 von SEQ ID NO: 3, bevorzugt SEQ ID NO: 3, enthalten. Geeignete Stämme sind beispielsweise DSM16833 beschrieben in PCT/EP2005/012417, DSM13994 beschrieben in EP 1 239 040 A2 oder DSM17576 beschrieben in DE 102005045301. In diese Stämme lässt sich durch Allelaustausch die entsprechende (n) Mutation (en) in die Kodierregion des gltA-Gens einführen.
Es ist ebenfalls möglich die Polypeptide zu reinigen und an den gereinigten Polypeptiden die Vergleichstests durchzuführen .
Das Enzym Citratsynthase (EC Nr. 4.1.3.7) katalysiert die Kondensationsreaktion von Oxalacetat und Acetyl-CoA, wobei als Reaktionsprodukte Zitronensäure und Coenzym A (CoA) entstehen. In der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, Kanehisa Laboratory, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research, Kyoto University, Japan) wird dem Enzym die Nr. EC 2.3.3.1 zugeordnet.
Bei den aromatischen L-Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn L-Phenylalanin, L-
Tryptophan und L-Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben L-Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren L-Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn L-Glutamin und L-Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen L-Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn L-Arginin, L-Lysin und L- Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren L-Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn L-Asparaginsäure und L-Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden L-Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn L-Serin und L-Threonin gegeneinander ausgetauscht werden. Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Austausch an Position 5 von SEQ ID NO: 2.
Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen, das endständige Methionin bei der Proteinsynthese entfernt wird.
Die isolierten Polynukleotide, die für die erfindungsgemäße Citratsynthase Variante kodieren, oder Teile davon, können dazu verwendet werden, um rekombinante Stämme der Gattung Corynebacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum herzustellen, die den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch an Position 5 der Aminosäuresequenz des Citratsynthase- Polypeptids enthalten und die im Vergleich zum Ausgangs- beziehungsweise Elternstamm in verbesserter Weise L-
Aminosäuren in das sie umgebende Medium abgeben oder im Zellinneren anhäufen.
Bevorzugt werden solche Ausgangsstämme verwendet, die bereits die Fähigkeit besitzen mindestens 1 g/l, bevorzugt mindestens 5 g/l, besonders bevorzugt mindestens 10 g/l der gewünschten L-Aminosäure in das sie umgebende Nährmedium auszuscheiden .
Eine verbreitete Methode zum Einbau von Mutationen in Gene von Bakterien der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, ist die des
Allelaustausches, die auch unter der Bezeichnung „gene replacement" bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende Mutation enthält, in den gewünschten Stamm überführt und die Mutation durch wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross over"-Ereignisse in das Chromosom des gewünschten Stammes inkorporiert beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht. Das DNA-Fragment, enthaltend die interessierende Mutation, liegt bei dieser Methode typischerweise in einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, vor, das vorzugsweise von dem mit der Mutation zu versehenden Stamm nicht oder nur begrenzt, d. h. unter ausgewählten Kulturbedingungen, repliziert wird. Als Hilfs- oder Zwischenwirt, in dem der Vektor replizierbar ist, wird im Allgemeinen ein Bakterium der Gattung Escherichia, bevorzugt der Spezies Escherichia coli verwendet.
Beispiele für derartige Plasmidvektoren sind die von Schäfer et al . (Gene 145, 69-73 (1994)) beschriebenen pK*mob und pK*mobsacB Vektoren, wie beispielsweise pKlδmobsacB, und die in der WO 02/070685 und WO 03/014362 beschriebenen Vektoren. Diese sind in Escherichia coli aber nicht in Corynebacterium replikativ. Besonders geeignet sind Vektoren, die ein konditional negativ dominant wirkendes Gen wie beispielsweise das sacB-Gen (Levansucrase-Gen) von beispielsweise Bacillus oder das galK-Gen (Galaktosekinase-Gen) von beispielsweise Escherichia coli enthalten. Unter einem konditional negativ dominant wirkenden Gen versteht man ein Gen, das unter bestimmten Bedingungen nachteilig beispielsweise toxisch für den Wirt ist, unter anderen Bedingungen aber keine negativen Auswirkungen auf den das Gen tragenden Wirt hat. Diese ermöglichen die Selektion auf
Rekombinationsereignisse, bei denen der Vektor aus dem Chromosom eliminiert wird.
Weiterhin wurde von Nakamura et al . (US 6,303,383) ein Temperatur-sensitives Plasmid für Corynebacterium beschrieben, das lediglich bei Temperaturen unterhalb von
31°C replizieren kann. Es kann ebenfalls für die Massnahmen der Erfindung eingesetzt werden.
Der Vektor wird anschließend durch Konjugation beispielsweise nach der Methode von Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) oder Transformation beispielsweise nach der Methode von Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) oder der Methode von Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) in das Corynebacterium überfuhrt. Gegebenenfalls kann die Überführung der DNA auch durch ballistische Methoden (z. B. Partikelbeschuss) erzielt werden .
Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"- Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation und erhalt ein rekombinantes Bakterium. Als Zielgen bezeichnet man das Gen, in dem der gewünschte Austausch erfolgen soll.
Zur Identifizierung und Charakterisierung der erhaltenen Stamme können unter anderem die Methoden der Southern
Blotting Hybridisierung, der Polymerase-Kettenreaktion, der Sequenzbestimmung, die Methode des „Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) (Lay et al . Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) oder Methoden der Enzymologie eingesetzt werden.
Von Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) wurde diese Methode verwendet um ein lysA-Allel, welches eine Deletion trug, und um ein lysA-Allel, welches eine Insertion trug in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens einzubauen.
Von Nakagawa et al . (EP 1108790) und Ohnishi et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) wurde diese Methode eingesetzt um verschiedene Mutationen ausgehend von den isolierten Allelen bzw. Polynukleotiden in das Chromosom von C. glutamicum einzubauen. Auf diese Weise gelang es Nakagawa et al . eine als Val59Ala bezeichnete Mutation in das Homoserin- Dehydrogenase Gen (hom) , eine als Thr311Ile bezeichnete Mutation in das Aspartatkinase-Gen (lysC bzw. ask) , eine als Pro458Ser bezeichnete Mutation in das Pyruvat-
Carboxylase-Gen (pyc) und eine als Ala213Thr bezeichnete Mutation in das Glucose-6-phoshat-Dehydrogenase Gen (zwf) von C. glutamicum Stämmen einzubauen.
Für den Einbau der erfindungsgemäßen Mutation im gltA-Gen in das Chromosom mittels Allelaustausch kann ein Polynukleotid verwendet werden, das für eine
Aminosäuresequenz kodiert, die den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch an Position 5 von SEQ ID NO:2, wie in SEQ ID NO: 10 dargestellt, aufweist und stromaufwärts und stromabwärts davon eine Nukleotidsequenz mit einer Länge von jeweils mindestens ca. 51 (siehe auch SEQ ID NO: 11 und 12) bevorzugt jeweils mindestens ca. 101 bzw. 102, (siehe auch SEQ ID NO: 13 und 14) besonders bevorzugt jeweils mindestens ca. 201 Nukleobasen (siehe auch SEQ ID NO: 15 und 16) und ganz besonders bevorzugt jeweils mindestens ca. 500 bzw. 498 Nukleobasen (siehe auch SEQ ID NO: 17 und 18) ausgewählt aus SEQ ID NO: 9 besitzt. Die maximale Länge der stromaufwärts und stromabwärts der Mutation gelegenen Nukleotidsequenz liegt im Allgemeinen bei ca. 500, ca. 750, ca. 1000, ca. 1500, ca. 2000 bis 2100 Nukleobasen. Die stromaufwärts der Mutation gelegene Nukleotidsequenz umfasst beispielsweise die Sequenz zwischen Position 1 bis 762 von SEQ ID NO : 9 oder die Sequenz zwischen Position 1 bis 1012 von SEQ ID NO:25. Die stromabwärts der Mutation gelegene Nukleotidsequenz umfasst beispielsweise die Sequenz zwischen Position 766 bis 2814 von SEQ ID NO: 9 oder die Sequenz zwischen Position 1016 bis 3314 von SEQ ID NO: 25. Die Gesamtlänge des für den Allelaustausch eingesetzten Polynukleotids beträgt dementsprechend maximal ca. 1000, maximal ca. 1500, maximal ca. 2000, maximal ca. 3000 oder maximal ca. 4000 bis 4200 Nukleobasen.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche von Position 1 bis 39 die Nukleotidsequenz entsprechend Position 1 bis 39 von SEQ ID NO: 11 und von Position 40 bis 105 eine Nukleotidsequenz enthält, die für die
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 kodiert, wobei an Position 5 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Asparaginsäure enthalten ist.
In diesem Zusammenhang entsprechen die Positionsangaben 1 bis 39 von SEQ ID NO: 11 den Positionsangaben 712 bis 750 von SEQ ID NO : 9. Die Positionsangaben 40 bis 105 von SEQ ID NO: 11 entsprechen den Positionsangaben 751 bis 816 von SEQ ID NO:9.
In einer bevorzugten Form umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 11, wobei das Kodon entsprechend Position 52 bis 54 für jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Asparaginsäure kodiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von Position 712 bis 816 von SEQ ID NO : 7.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend weiterhin ein Polynukleotid das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche von Position 1 bis 89 die Nukleotidsequenz entsprechend Position 1 bis 89 von SEQ ID NO: 13 und von Position 90 bis 206 eine Nukleotidsequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 kodiert, wobei an Position 5 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Asparaginsäure enthalten ist.
In diesem Zusammenhang entsprechen die Positionsangaben 1 bis 89 von SEQ ID NO: 13 den Positionsangaben 662 bis 750 von SEQ ID NO : 9. Die Positionsangaben 90 bis 206 von SEQ ID NO: 13 entsprechen den Positionsangaben 751 bis 867 von SEQ ID NO:9.
In einer bevorzugten Form umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 13, wobei das Kodon entsprechend Position 102 bis 104 für jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Asparaginsäure kodiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von Position 662 bis 867 von SEQ ID NO : 7. Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend schließlich ein Polynukleotid das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche von Position 1 bis 189 die Nukleotidsequenz entsprechend Position 1 bis 189 von SEQ ID NO:15 und von Position 190 bis 405 eine Nukleotidsequenz enthält, die für die
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16 kodiert, wobei an Position 5 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Asparaginsäure enthalten ist.
In diesem Zusammenhang entsprechen die Positionsangaben 1 bis 189 von SEQ ID NO: 15 den Positionsangaben 562 bis 750 von SEQ ID NO : 9. Die Positionsangaben 190 bis 405 von SEQ ID NO: 15 entsprechen den Positionsangaben 751 bis 966 von SEQ ID NO:9.
In einer bevorzugten Form umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 15, wobei das Kodon entsprechend Position 202 bis 204 für jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Asparaginsäure kodiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von Position 562 bis 966 von SEQ ID NO : 7.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend schließlich auch ein Polynukleotid das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche von Position 1 bis 488 die Nukleotidsequenz entsprechend Position 1 bis 488 von SEQ ID NO: 17 und von Position 489 bis 1001 eine Nukleotidsequenz enthält, die für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 18 kodiert, wobei an Position 5 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Asparaginsäure enthalten ist.
In diesem Zusammenhang entsprechen die Positionsangaben 1 bis 488 von SEQ ID NO: 17 den Positionsangaben 263 bis 750 von SEQ ID NO : 9. Die Positionsangaben 489 bis 1001 von SEQ ID NO: 15 entsprechen den Positionsangaben 751 bis 1263 von SEQ ID NO:9. In einer bevorzugten Form umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 17, wobei das Kodon entsprechend Position 501 bis 503 für jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Asparaginsäure kodiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von Position 263 bis 1263 von SEQ ID NO : 7.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von Position 9 bis 1687 von SEQ ID NO:31.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Vektoren, bevorzugt Plasmide, die die genannten Polynukleotide enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Bakterien bevorzugt der Gattung Escherichia, besonders bevorzugt der Art Escherichia coli, und Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum, die die genannten Vektoren enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Stämme der Gattung Corynebacterium, bevorzugt der Spezies Corynebacterium glutamicum, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Polynukleotide oder unter Verwendung von Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten, hergestellt wurden .
Es ist ebenfalls möglich das erfindungsgemäße gltA-Allel an einen anderen Ort im Chromosom von Corynebacterium glutamicum einzubauen. Hierbei kann es sich beispielsweise um die Orte bzw. Gene aecD, ccpAl, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysRl, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi und poxB handeln, so wie in der WO 03/04037 beschrieben. Hierbei kann es sich weiterhin beispielsweise um intergenische Regionen, DNA von Prophagen, defekten Phagen und Phagen Komponenten handeln, so wie in der WO 04/069996 beschrieben. Die erfindungsgemäß erhaltenen, rekombinanten Stämme zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess .
Die für die Massnahmen der Erfindung einsetzbaren L-Lysin ausscheidenden Ausgangstämme besitzen neben anderen Eigenschaften insbesondere eine Lysin-insensitive Aspartatkinase .
Unter einer Lysin-insensitive Aspartatkinase versteht man ein Polypeptid bzw. Protein mit Aspartatkinase-Aktivität (EC Nr 2.7.2.4), die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Derartige Aspartatkinasen werden auch als „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Aspartatkinasen bezeichnet. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen bzw. Aspartatkinasevarianten kodierenden Nukleotidsequenzen werden auch als lysCFBR-Allele bezeichnet. Informationen zu zahlreichen lysCFBR-Allelen sind in den öffentlichen Datenbanken verfügbar. Einige Autoren bezeichnen das lysC- Gen auch als ask-Gen.
Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO: 19 und das von diesem Gen kodierte Polypeptid in SEQ ID NO: 20 dargestellt. In der SEQ ID NO: 21 sind außerdem die stromaufwärts des 5 ' -Endes und stromabwärts des 3 ' -Endes der Kodierregion gelegenen
Nukleotidsequenzen angegeben. SEQ ID NO:20 entspricht SEQ ID NO:22.
Die für die Massnahmen der Erfindung eingesetzten L-Lysin ausscheidenden Bakterien verfügen bevorzugt über ein lysC- Allel, das für eine Aspartatkinasevariante kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 besitzt, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe:
a) LysC A279T (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Threonin; siehe US 5,688,671 und Zugangsnummern E06825, E06826, E08178 und 174588 bis 174597),
b) LysC A279V (Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Valin, siehe JP 6-261766 und Zugangsnummer E08179),
c) LysC L297Q (Austausch von L-Leucin an Position 297 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Glutamin; siehe DE 102006026328) ,
d) LysC S301F (Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen
L-Phenylalanin; siehe US 6,844,176 und Zugangsnummer E08180) ,
e) LysC S301Y (Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Tyrosin, siehe Kalinowski et al . (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) und Zugangsnummer X57226),
f) LysC T308I (Austausch von L-Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Isoleucin; siehe JP 6-261766 und Zugangsnummer E08181)
g) LysC T311I (Austausch von L-Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Isoleucin; siehe WO 00/63388 und US 6,893,848),
h) LysC S317A (Austausch von L-Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Alanin; siehe US 5,688,671 und Zugangsnummer 174589), i) LysC R320G (Austausch von L-Arginin an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Glycin; siehe Jetten et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L27125) ,
j) LysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Asparaginsäure; siehe Jetten et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) und Zugangsnummer L16848) ,
k) LysC T380I (Austausch von L-Threonin an Position 380 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Isoleucin; siehe WO 01/49854 und Zugangsnummer AX192358), und
1) LysC S381F (Austausch von L-Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Phenylalanin; siehe EP 0435132)
umfasst .
Ganz besonders bevorzugt werden Stämme, deren Aspartatkinasevarianten den Aminosäureaustausch LysC T311I oder einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe LysC A279T, LysC L297Q, LysC S317A, LysC T380I und LysC S381F enthalten.
Es ist naturgemäß ebenfalls möglich zunächst den Einbau der erfindungsgemäßen Mutation im gltA-Gen des Chromosoms eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium durchzuführen und anschließend eine oder mehrere der gewünschte (n) Mutation (n) im lysC-Gen des betreffenden Stammes einzubauen .
In einer weiteren Ausführungsform liegen die beschriebenen Aspartatkinasen in dem Corynebacterium, welches den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch im gltA-Gen enthält, überexprimiert vor. Unter Uberexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellularen Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms im Vergleich zum Ausgangsstamm (Elternstamm) oder Wildtypstamm. Unter einem Ausgangsstamm (Elternstamm) versteht man den Stamm, an dem die zur Uberexpression fuhrende Massnahme durchgeführt wurde.
Die Erhöhung der Konzentration oder Aktivität lasst sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide chromosomal oder extrachromosomal um mindestens eine Kopie erhöht.
Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Polynukleotid in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete
Plasmidvektoren sind beispielsweise pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) oder die von Tauch et al . (Journal of Biotechnology 99, 79- 91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren . Ein Ubersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al . (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
Weiterhin kann man als Vektoren Transposons, Insertionselemente (IS-Elemente) oder Phagen einsetzen. Derartige genetische Systeme sind beispielsweise in den
Patentschriften US 4,822,738, US 5,804,414 und US 5,804414. In gleicher Weise kann das in der WO 92/02627 beschriebene IS-Element ISaBl oder das Transposon Tn 45 des Plasmids pXZ10142 (zitiert im „Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber: L. Eggeling und M. Bott) ) verwendet werden.
Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Uberexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation . Bei dieser Methode wird mindestens eine zusatzliche Kopie des interessierenden Polynukleotids in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefugt. Derartige Amplifikationsverfahren sind beispielsweise in der WO 03/014330 oder WO 03/040373 beschrieben.
Eine weitere Methode zur Erzielung einer Uberexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in der Fig. 1 des Ubersichtsartikel von Patek et al . (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)) beschrieben. In gleicher Weise können die von Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)) beschrieben Varianten des dapA-Promotors, beispielsweise der Promotor A25 eingesetzt werden. Weiterhin kann der gap-Promotor von Corynebacterium glutamicum (EP 06007373) verwendet werden. Schließlich können die hinlänglich bekannten von Amann et al . (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1 - 500 Nukleobasen vom Startkodon eingefugt werden.
Durch die Maßnahmen der Uberexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Uberexpression fuhrenden Massnahme, erhöht.
In einer weiteren Ausfuhrungsform besitzen die erfindungsgemaßen Bakterien der Gattung Corynebacterium, die bevorzugt außerdem ein Polynukleotid enthalten, das für eine Lysin-insensitive Aspartatkinasevariante kodiert, eines oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe a) uberexprimiertes Polynukleotid (dapA-Gen) , das für eine Dihydrodipicolinat-Synthase (DapA, EC Nr. 4.2.1.52) kodiert,
b) uberexprimiertes Polynukleotid (asd-Gen) , das für eine Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase (Asd, EC Nr.
1.2.1.11) kodiert,
c) uberexprimiertes Polynukleotid, (lysA-Gen) , das für eine Diaminopimelat-Decarboxylase (LysA, EC Nr. 4.1.1.20) kodiert,
d) uberexprimiertes Polynukleotid (aat-Gen) , das für eine Aspartat-Aminotransferase (Aat, EC Nr. 2.6.1.1) kodiert,
e) uberexprimiertes Polynukleotid (lysE-Gen) , das für eine Polypeptid mit L-Lysin-Export Aktivität (LysE, Lysin Efflux Permease) kodiert,
f) ausgeschaltete oder abgeschwächte Aktivität der Malat- Dehydrogenase (Mdh, EC Nr. 1.1.1.37),
g) ausgeschaltete oder abgeschwächte Aktivität der Malat- Chinon Oxidoreduktase (Mqo, EC Nr. 1.1.99.16),
h) uberexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat- Carboxylase (Pyc, EC Nr. 6.4.1.1) kodiert, und
i) ausgeschaltete oder abgeschwächte Aktivität der EIp Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase Komplexes (AceE, EC Nr. 1.2.4.1) .
Die Merkmale a) bis g) werden besonders bevorzugt.
Zur Uberexpression der aufgeführten Gene beziehungsweise Polynukleotide können die im Stand der Technik bekannten Gene, beispielsweise die sogenannten Wildtypgene, von Escherichia coli (Blattner et al . , Science 277(5), 1453- 1462 (1997)), Bacillus subtilis (Kunst et al, Nature 390 (6657), 249-256 (1997)), Bacillus licheniformis (Veith et al, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 7 (4), 204-211 (2004)), Mycobacterium tuberculosis (Fleischmann et al, Journal of Bacteriology 1841, 5479-5490 (2004)), Mycobacterium bovis (Garnier et al, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (13), 7877-7882 (2003) ) , Streptomyces coeliclor (Redenbach et al, Molecular Microbiology 21 (1), 77-96 (1996)), Lactobacillus acidophilus (Altermann et al, Proceedings of the National Acadamy of Sciences U. S. A. 102 (11), 3906-3912 (2005)), Lactobacillus johnsonii (Pridmore et al, Proceedings of National Academy of Sciences U. S. A. 101 (8), 2512-2517
(2004)), Bifidobacterium longum (Schell et al, Proceedings of National Academy of Sciences U. S. A. 99 (22), 14422-14427 (2002)), und Saccharomyces cerevisiae verwendet werden. Die Genome der Wildtypformen dieser Bakterien liegen in sequenzierter und annotierter Form vor. Vorzugsweise werden die endogenen Gene beziehungsweise Polynukleotide der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum verwendet.
Unter endogenen Genen beziehungsweise Polynukleotiden versteht man die in der Population einer Art vorhandenen offenen Leserahmen (ORF) , Gene oder Allele beziehungsweise deren Polynukleotide.
Das dapA-Gen von Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC13032 ist beispielsweise in der EP 0 197 335 beschrieben. Zur Uberexpression des dapA-Gens von Corynebacterium glutamicum können außerdem unter anderem die Mutationen MC20 und MA16 des dapA-Promotors, wie in der US 6,861,246 beschrieben, eingesetzt werden.
Das asd-Gen von Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 21529 ist beispielsweise in der US 6,927,046 beschrieben.
Das lysA-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (Brevibacterium lactofermentum) ist beispielsweise in der US 6,090,597 beschrieben.
Das aat-Gen von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ist beispielsweise bei Kalinowski et al (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003); siehe auch Zugangsnummer NC_006958) beschrieben. Es wird dort als aspB-Gen bezeichnet. In der US 6,004,773 wird ein für eine Aspartat-Aminotransferase kodierendes Gen als aspC bezeichnet. Marienhagen et al (Journal of Bacteriology 187 (22), 7639-7646 (2005) bezeichnen das aat-Gen als aspT-Gen.
Das lysE-Gen von Corynebacterium glutamicum R127 ist beispielweise in der US 6,858,406 beschrieben. Bei Stamm R127 handelt es sich um eine restriktionsdefekte Mutante von ATCC13032 (Liebl et al, FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)). In gleicher Weise kann das in der US 6,861,246 verwendete lysE-Gen von Stamm ATCC13032 eingesetzt werden.
Das pyc-Gen von Corynebacterium glutamicum von Stamm ATCC 13032 ist beispielsweise in der WO 99/18228 und WO 00/39305 beschrieben. Weiterhin können Allele des pyc-Gens verwendet werden wie sie beispielsweise in der US 6,965,021 beschrieben sind. Die in dieser Patentschrift beschriebenen Pyruvat-Carboxylasen besitzen einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe: Pyc E153D (Austausch von L-Glutaminsäure an Position 153 gegen L- Asparaginsäure) , Pyc A182S (Austausch von L-Alanin an Position 182 gegen L-Serin) , Pyc A206S (Austausch von L- Alanin an Position 206 gegen L-Serin), Pyc H227R (Austausch von L-Histidin an Position 227 gegen L-Arginin) , Pyc A455G (Austausch von L-Alanin an Position 455 gegen Glycin) , und Pyc D1120E (Austausch von L-Asparaginsäure an Position 1120 gegen L-Glutaminsäure) . In gleicher weise kann das in der EP 1 108 790 beschrieben pyc-Allel verwendet werden, das für eine Pyruvat-Carboxylase kodiert, welche den
Aminosäureaustausch Pyc P458S (Austausch von L-Prolin an Position 458 gegen L-Serin) enthält.
Unter ausgeschalteter oder abgeschwächter Aktivität versteht man die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch das entsprechende Polynukleotid beziehungsweise DNA kodiert werden.
Zur Erzeugung eines Stammes, in dem die intrazelluläre Aktivität eines gewünschten Polypeptids ausgeschaltet ist, wird eine Deletion oder Insertion von mindestens einer (1) Nukleobase, bevorzugt von einer (1) oder von zwei (2) Nukleobasen, in die Kodierregion des entsprechenden Gens, eingebaut. Es ist gleichfalls möglich mindestens ein (1) oder auch mehrere Kodon (e) innerhalb der Kodierregion zu deletieren. Diese Massnahmen führen zu einer Verschiebung des Leserasters („frame shift mutations") und damit typischerweise zur Synthese eines funktionsunfähigen Polypeptids. In gleicher Weise wirkt die Einführung einer Nichtsinnmutation („nonsense mutation") durch Transversion oder Transition von mindestens einer (1) Nukleobase innerhalb der Kodierregion. Aufgrund des entstandenen Stop- Kodons kommt es zu einem vorzeitigem Abbruch der Translation. Die genannten Massnahmen werden bevorzugt in der Region zwischen dem Startkodon und dem vorletzten kodierenden Kodon, besonders bevorzugt im 5 ' -terminalen Teil der Kodierregion, durchgeführt, welcher für den N- Terminus des Polypeptids kodiert. Bezeichnet man die Gesamtlänge eines Polypeptids (gemessen als Anzahl der chemisch verbundenen L-Aminosäuren) mit 100%, so gehört - im Rahmen der vorliegenden Erfindung - zum N-Terminus des Polypeptids der Teil der Aminosäuresequenz, welcher, gerechnet ab der Start-Aminosäure L-Formyl-Methionin 80% der nachfolgenden L-Aminosäuren enthält.
Genetische Massnahmen zur Ausschaltung der Malat-Chinon Oxidoreduktase (Mqo) sind beispielsweise in der US 7,094,106 beschrieben.
Genetische Massnahmen zur Ausschaltung der Malat- Dehydrogenase (Mdh) sind beispielsweise in der WO 02/02778 beschrieben .
Genetische Massnahmen zur Ausschaltung der EIp Untereinheit (AceE) des Pyruvat-Dehydrogenase Komplexes sind beispielsweise in der EP 06119615 und bei Schreiner et al . (Journal of Bacteriology 187(17), 6005-6018 (2005)) beschrieben .
Es ist gleichfalls möglich durch geeignete Aminosäureaustausche die katalytische Eigenschaft des betreffenden Polypeptides zu senken.
Im Falle der Malat-Chinon Oxidoreduktase (Mqo) kann dies, wie in der WO 06/077004 beschrieben, dadurch erzielt werden, dass man Allele des mqo-Gens herstellt bzw. verwendet, welche für eine Mqo-Variante kodieren, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24 besitzt und einen oder mehrere Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe
a) Austausch des L-Serins an Position 111 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L- Phenylalanin oder L-Alanin, und
b) Austausch des L-Alanin an Position 201 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Serin,
enthält .
Ganz besonders bevorzugt werden Stämme die ein mqo-AlIeI enthalten, das für eine Mqo-Variante kodiert, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24 besitzt, wobei an Position 111 L-Phenylalanin enthalten ist.
Durch die Maßnahmen der Ausschaltung oder Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsstamm bzw. Elternstamm herabgesenkt.
Die Leistung der erfindungsgemäß hergestellten Bakterien der Gattung Corynebacterium bzw. des Fermentationsprozesses unter Verwendung derselben bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der L-Aminosäure- Konzentration (gebildete L-Aminosäure pro Volumen) , der L- Aminosäure-Ausbeute (gebildete L-Aminosäure pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) , der L-Aminosäure-Bildung (gebildete L-Aminosäure pro Volumen und Zeit) und der spezifischen L-Aminosäure-Bildung (gebildete L-Aminosäure pro Zelltrockenmasse bzw. Biotrockenmasse und Zeit oder gebildete L-Aminosäure pro Zellprotein und Zeit) oder auch anderer Prozess-Parameter und Kombinationen davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw. den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben erhöht .
Die erfindungsgemäß hergestellten Bakterien der Gattung Corynebacterium können kontinuierlich - wie beispielsweise in der PCT/EP2004/008882 beschrieben- oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung bzw. Satzverfahren) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion der gewünschten L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Losungen aus der Zuckerruben- oder Zuckerrohrherstellung, Starke, Starkehydrolysat und Cellulose, Ole und Fette, wie zum Beispiel Sojaol,
Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsauren, wie zum Beispiel Palmitinsaure, Stearinsaure und Linolsaure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Sauren, wie zum Beispiel Essigsaure oder Milchsaure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsaure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensaure zusatzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise wahrend der Kultivierung zugefuttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsaure oder Schwefelsaure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsaurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefugt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten L- Aminosaure, gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich. Durch die Tätigkeit der Bakterien kommt es zu einer Anreicherung (Akkumulation) der L-Aminosaure im Fermentationsmedium und/oder in den Bakterienzellen.
Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften 5,770,409, US 5,840,551 und US 5,990,350 oder US 5,275,940.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosauren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben. Gegenstand der Erfindung ist demzufolge auch ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:
a) Fermentation der erfindungsgemäßen Bakterien in einem geeignetem Nährmedium,
b) Akkumulation der L- Aminosäure in dem Nährmedium oder in den Zellen der genannten Bakterien.
Daran schließt sich im Allgemeinen das Sammeln (collecting) der im Nährmedium bzw. in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Bakterien akkumulierten L-Aminosäure an, um zu einem festen oder flüssigen Produkt zu gelangen.
Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium bzw. Nährmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das
Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medien enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellen.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse (Zellmasse) des Mikroorganismus, b) die im Laufe der Fermentation gebildete gewünschte L-Aminosäure wie L- Lysin, L-Valin oder L-Isoleucin c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin,
Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben der jeweiligen erwünschten organisch- chemischen Verbindung erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu gehören auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Im Falle der Aminosäuren L-Valin und L-Isoleucin wird eine Isolierung und Reinigung, beispielsweise unter Verwendung einer oder mehrerer Verfahren ausgewählt aus der Gruppe chromatographische Verfahren, Kristallisationsverfahren und Verwendung von Aktivkohle, bevorzugt, so dass weitgehend reine Produkte, beispielsweise solche mit einer Reinheit von ≥90 Gew.-% oder ≥95 Gew.-% erhalten werden.
Im Falle der Aminosäure L-Lysin sind im Stand der Technik im wesentlichen vier verschiedene Produktformen bekannt.
Eine Gruppe L-Lysin-haltiger Produkte umfasst konzentrierte, wässrige, alkalische Lösungen von aufgereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865) . Eine weitere Gruppe, wie beispielsweise in der US 6,340,486 und US 6,465,025 beschrieben, umfasst wässrige, saure, Biomasse-haltige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder kristalline Formen von aufgereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin, das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene Produktform enthält neben L-Lysin den größten Teil der während der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus mit einem Anteil von >0% - 100%.
Entsprechend der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren, bei denen das L-Lysin aus der Fermentationsbrühe gesammelt, isoliert oder gereinigt wird, um das L-Lysin-haltige Produkt oder das gereinigte L-Lysin herzustellen . Zur Herstellung von festem, reinen L-Lysin werden im wesentlichen Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung von Aktivkohle und Methoden der Kristallisierung angewendet. Auf diese Weise erhält man die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat (Lys2-H2SO4) .
In der EP-B-0534865 ein Verfahren zur Herstellung wässriger, basischer L-Lysin-haltiger Lösungen aus Fermentationsbrühen beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen 9 bis 11 eingestellt. Die mineralischen Bestandteile (anorganischen Salze) werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation aus der Brühe abgetrennt und entweder als Dünger verwendet oder verworfen .
Bei Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.
Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen) oder durch Säurezugabe.
In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, sodass keine (0 %) oder höchstens 30%, höchstens 20%, höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen ≥ 0% bis ≤ 100% entfernt .
Schließlich kann die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe vor oder nach der vollständigen oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säure wie beispielsweise Propionsäure auf einen sauren pH Wert gestellt werden (GB 1,439,728 oder EP 1 331 220). Es ist gleichfalls möglich die Fermentationsbrühe mit der vollständig enthaltenen
Biomasse anzusäuern. Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSO3, GB 1,439,728) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert werden.
Bei der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0%) , bevorzugt zu mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100%) oder nahezu vollständig, das heißt > 95% oder > 98% oder größer 99%, im Produkt. Enthält ein Produkt in diesem Sinn mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe, so wird dies auch mit dem Begriff „Produkt auf Fermentationsbrühebasis" umschrieben.
Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie z.B, mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dunnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbruhe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der
Spruhgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP2004/006655 beschrieben, zu rieselfahigen Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise grobkörnigem Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein gewünschtes Produkt isoliert.
Es ist ebenfalls möglich, die Fermentationsbruhe direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Spruhgranulation zu trocknen.
Unter „rieselfahig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefaßen mit verschieden großen Auslaufoffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Ole, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngroße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint .
Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngroße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint.
Die Korngroßenbestimmung kann mit Methoden der Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur „Teilchengroßenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Muller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben . Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerfähiges und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5 %) an Körngrößen unter 100 μm Durchmesser enthält.
„Lagerfähig", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder länger, bevorzugt mindestens 1,5 Jahre oder länger, besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung gelagert werden kann, ohne dass ein wesentlicher Verlust (maximal 5%) der jeweiligen Aminosäure auftritt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, das in seinen Grundzügen in der DE 102006016158 beschrieben ist, und bei dem die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen erhaltene Fermentationsbrühe, aus der die Biomasse gegebenenfalls ganz oder teilweise abgetrennt wurde, weiterverarbeitet wird, indem man ein Verfahren durchführt das mindestens folgende Schritte umfasst:
a) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,0 bis 5,2, insbesondere 4,9 bis 5,1, absenkt, und ein molares SuIfat/L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt >0,9 bis <0,95, in der Brühe einstellt, gegebenenfalls durch Zugabe von einer weiteren oder mehreren Sulfathaltigen Verbindung (n) und
b) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert , und gegebenenfalls granuliert,
wobei gegebenenfalls vor Schritt a) eine oder beide der folgenden Massnahmen durchgeführt wird/werden:
c) Messung des molaren Verhältnisses von SuIfat/L-Lysin zur Ermittlung der benötigten Menge an Sulfat-haltigen Verbindung (n) d) Zusatz einer Sulfat-haltigen Verbindung ausgewählt aus der Gruppe Ammoniumsulfat, Ammoniumhydrogensulfat und Schwefelsaure in entsprechenden Verhaltnissen.
Gegebenenfalls wird weiterhin vor Schritt b) ein Salz der schwefligen Saure, bevorzugt Alkalihydrogensulfit, besonders bevorzugt Natriumhydrogensulfit in einer Konzentration von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 0,3 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gew.-% bezogen auf die Fermentationsbruhe hinzugesetzt.
Als bevorzugte Sulfat-haltigen Verbindungen im Sinne der oben genannten Verfahrensschritte sind insbesondere Ammoniumsulfat und/oder Ammoniumhydrogensulfat oder entsprechende Mischungen von Ammoniak und Schwefelsaure und Schwefelsaure selbst zu nennen.
Das molare SuIfat/L-Lysin-Verhaltnis V wird nach der
Formel: V = 2 x [SO4 2-] / [L-Lysin] berechnet. Diese Formel berücksichtigt die Tatsache, dass das SO4 2- Anion, bzw. die Schwefelsaure zweiwertig ist. Ein Verhältnis V = I bedeutet, dass ein stochiometrisch zusammengesetztes LyS2- H2SO4) vorliegt, wahrend bei einem Verhältnis von V = 0,9 ein 10%iger Sulfatmangel und bei einem Verhältnis von V = 1,1 ein 10% SuIfatuberschuss gefunden wird.
Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Tragern wie Starke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ahnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsauren, Silikaten (EP0743016A) Stearaten.
Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberflache der erhaltenen Granulate mit Ölen zu behandeln so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Ole können Mineralole, pflanzliche Ole oder Mischungen pflanzlicher Ole verwendet werden. Beispiele für derartige Ole sind Sojaol, Olivenöl, Soj aol/Lecithingemische . In gleicher Weise sind auch Silikonole, Polyethylenglykole oder Hydroxyethylcellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflachen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Ol im Produkt betragt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs .
Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngroße von 100 bis 1800 μm oder einem Anteil von ≥ 95 Gew.-% einer Korngroße von 300 bis 1800 μm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrosse < 100 μm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.- besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%.
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Tragerstoff wie zum Beispiel Kieselsauren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Starken, Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt auch durch
Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsauren, Silikate, Alginate, Stearate, Starken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-4100920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermagen insbesondere dem Magen von Wiederkauern ist.
Zur Einstellung einer gewünschten L-Lysin Konzentration im Produkt kann je nach Anforderung das L-Lysin wahrend des Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gegebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flussiger oder fester Form hinzugefugt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines festen Lysin-haltigen Produktes, wie es in seinen Grundzügen in der US 20050220933 beschrieben ist, und das die Aufarbeitung der unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen erhaltenen Fermentationsbrühe in folgenden Schritten umfasst:
a) Filtration der Fermentationsbrühe, bevorzugt mit einem Membranfilter, so dass ein Biomasse-haltiger Schlamm und ein Filtrat erhalten wird,
b) Aufkonzentration des Filtrates, bevorzugt so, dass ein Feststoffgehalt von 48 bis 52 Gew.-% erhalten wird,
c) Granulation des in Schritt b) erhaltenen Konzentrates, bevorzugt bei einer Temperatur von 500C bis 62°C, und
d) Beschichtung des in c) erhaltenen Granulates mit einem oder mehreren der Beschichtungsmittel (coating agent(s))
Zur Beschichtung in Schritt d) werden bevorzugt Beschichtungsmittel verwendet, welche ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus
dl) der in Schritt a) erhaltenen Biomasse,
d2) einer L-Lysin-haltigen Verbindung, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe L-Lysinhydrochlorid oder L- Lysinsulfat,
d3) einem im wesentlichen L-Lysin-freien Stoff mit L-
Lysingehalt < 1 Gew.-%, bevorzugt < 0,5 Gew.-%, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Stärke,
Karageenan, Agar, Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien und Mehle, und d4) einem wasserabstoßenden Stoff, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Ole, Polyethylenglykole und flussige Paraffine .
Durch die Massnahmen entsprechend den Schritten dl) bis d4), insbesondere dl) bis d3) , wird der Gehalt an L-Lysin auf einen gewünschten Wert eingestellt.
Bei der Herstellung L-Lysin-haltiger Produkte wird das Verhältnis der Ionen bevorzugt so eingestellt, dass das molare Ionenverhaltnis entsprechend nachstehender Formel
2 x [ SO4 2 " ] + [ Cl" ] - [ NH4 + ] - [ Na+ ] - [ K+ ] - 2 x [ Mg2+ ] - 2 x [ Ca2+ ] / [ L-Lys ]
0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68 bis 0,90 ergibt, so wie von Kushiki et al . in der US 20030152633 beschrieben.
Im Falle des Lysins hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbruhebasis einen Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an Lysinbase von 71 Gew.-% , 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Der Wassergehalt des L-Lysin-haltigen, festen Produktes betragt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.
Bei spiel 1
Sequenzierung des gltA-Gens des Stammes DM678
Der Stamm Corynebacterium glutamicum DM678 (US 6,861,246) ist ein Lysin-Produktionsstamm, der durch Mutagenese und Screening entwickelt wurde. Er ist auxotroph für L-Threonin und L-Methionin-sensitiv. Der Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM12866 hinterlegt.
Aus dem Stamm DM678 wurde mit der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein DNA-Abschnitt amplifiziert, welcher das gltA-Gen trägt. Hierfür wurden folgende Oligonukleotide als Primer verwendet :
gltA_XL-Al (SEQ ID NO: 27) : 5 " tgagttctattggcgtgacc 3 "
gltA_XL-El (SEQ ID NO: 28) : 5 " ttcgccaacgatgatgtcag 3 "
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Sie ermöglichen die Amplifizierung eines ca. 1,8 kb langen DNA-Abschnittes, welcher das gltA-Gen trägt. Der Primer gltA_XL-Al bindet an die Region entsprechend Position 490 bis 509 des zu SEQ ID NO: 3 (und SEQ ID NO: 7) komplementären Stranges. Der Primer gltA XL-El bindet an die Region ensprechend Position 2266 bis 2247 des Stranges gemäß SEQ ID NO: 3 (und SEQ ID NO: 7) .
Die PCR-Reaktion wurde mit der Phusion High Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Der Reaktionsansatz wurde nach
Herstellerangaben angesetzt und enthielt bei 50 μl Gesamtvolumen 10 μl des mitgelieferten 5 x Phusion HF Buffer, Desoxynucleosidtriphosphate in einer Konzentration von jeweils 200 μM, Primer in einer Konzentration von 0,5 μM, ungefähr 50 ng Template-DNA und 2 Units Phusion Polymerase. Durch Zugabe von H2O wurde das Volumen auf 50 μl eingestellt .
Der PCR-Ansatz wurde zuerst einer einleitenden Denaturierung bei 98°C für 30 Sekunden unterzogen. Darauf folgten sich 35x wiederholend ein Denaturierungsschritt bei 98°C für 20 Sekunden, ein Schritt zum Binden der Primer an die vorgelegte DNA bei 600C für 20 Sekunden und der Extensionsschritt zur Verlängerung der Primer bei 72°C für 60 Sekunden. Nach dem abschliessenden Extensionsschritt für 5 Minuten bei 720C wurde der PCR-Ansatz einer Agarosegel- Elektrophorese (0,8% Agarose) unterworfen. Ein DNA-Fragment von ca. 1,8 kb Länge wurde identifiziert, aus dem Gel isoliert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen, (Hilden, Deutschland) aufgereinigt .
Die Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragmentes bzw. PCR-Produktes wurde von der Firma Agowa (Berlin, Deutschland) bestimmt.
Die Nukleotidsequenz der Kodierregion des gltA-Allels aus dem Stamm DM678 enthält an Position 14 die Nukleobase
Thymin. Das Gen des Wildtyps (siehe SEQ ID NO: 1) enthält an dieser Position die Nukleobase Adenin. Diese Adenin- Thymin Transversion führt zu einem Aminosäureaustausch von Aspartat zu Valin an Position 5 der resultierenden Aminosäuresequenz. Diese Mutation wird im Folgenden als gltAD5V bezeichnet. Das Allel gltAD5V ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt, die sich mit Hilfe des Programmes Patentin ergebende Aminosäuresequenz des Proteins ist in der SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Beispiel 2
Konstruktion des Austauschvektors pK18mobsacB gltAD5V
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein DNA- Fragment amplifiziert, das einen Teil der „upstream-Region" des gltA-Gens sowie einen Teil der Kodierregion, welcher die Mutation gltAD5V enthält, trägt. Als Template wurde die in Beispiel 1 gewonnene chromosomale DNA von DM678 verwendet. Folgende Oligonukleotide wurden als Primer für die PCR ausgewählt:
gltA_l.p (SEQ ID NO: 29):
5S CCGTCGACAATAGCCTGAA 3S
gltA_2.p (SEQ ID NO: 30):
5S CC-GAATTC-TTCGAGCATCTCCAGAAC 3S
Sie wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und ermöglichen die
Amplifizierung eines ca. 1,7 kb langen DNA-Abschnittes, enthaltend 832 bp der upstream-Region und die Nukleotide 1- 855 bp der Kodierregion des gltA-Gens aus DM678.
Der Primer gltA_l.p bindet an die Region entsprechend Position 169 bis 187 des zu SEQ ID NO: 25 komplementären Stranges. Die Nukleotide 9 bis 26 des Primers gltA_2.p binden an die Region ensprechend Position 1855 bis 1838 des Stranges gemäß SEQ ID NO: 25. Außerdem enthält der Primer gltA l.p die native Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sali und der Primer gltA_2.p die Sequenz der Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI, die in der oben dargestellten Nukleotidabfolge jeweils durch Unterstreichen markiert sind.
Die PCR-Reaktion wurde mit der Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Der Reaktionsansatz hatte die oben beschriebene Zusammensetzung. Die PCR wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Nukleotidsequenz des ca. 1,7 kb langen Amplifikates ist in SEQ ID NO: 31 dargestellt.
Das Amplifikat wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sali und EcoRI behandelt und durch Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel identifiziert. Es wurde anschließend aus dem Gel isoliert und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen aufgereinigt . Das dergestalt gereinigte DNA-Fragment enthält die beschrieben gltAD5V-Mutation und besitzt kompatible Enden zu mit Sali bzw. EcoRI geschnittener DNA (gltAD5V-Fragment bzw. gltAs in Figur 1) . Es wurde anschließend in den von Schäfer et al . (Gene, 145, 69-73 (1994)) beschriebenen, mobilisierbaren Vektor pKlδmobsacB kloniert, um einen Allel- beziehungsweise Mutationsaustausch zu ermöglichen. Hierzu wurde pKlδmobsacB mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Sali verdaut und die Enden mit alkalischer Phosphatase (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert . Der so vorbereitete Vektor wurde mit dem gltAD5V-Fragment gemischt und der Ansatz mit dem Ready-To- Go T4 DNA Ligase Kit (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) behandelt.
Anschließend wurde der E. coli Stamm S17-1 (Simon et al. , Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) mit dem Ligationsansatz transformiert (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. Vol.l. ILR-Press, CoId Spring Harbor, New York, 1989) . Die Selektion auf Plasmid-tragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Tansformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. CoId Spring Harbor, New York, 1989), der mit 25 mg/1 Kanamycin supplementiert worden war.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktionsspaltung mit den Enzymen Sali und EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pK18mobsacB_gltAD5V genannt und ist in Figur 1 dargestellt.
Beispiel 3
Einbau der Mutation gltAD5V in den Stamm Corynebacterium glutamicum DM1797
Die Mutation gltAD5V soll in den Stamm Corynebacterium glutamicum DM1797 eingebracht werden. Der Stamm DM1797 ist eine Aminoethylcystein-resistente Mutante von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 und in der PCT/EP/2005/012417 beschrieben. Sie ist unter der Bezeichnung DSM16833 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Der in Beispiel 2 beschriebene Vektor pK18mobsacB_gltAD5V wurde nach dem Protokoll von Schäfer et al . (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) in den C. glutamicum Stamm DM1797 durch Konjugation transferiert. Der Vektor kann in DM1797 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er als Folge eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt. Die Selektion von Transkonjuganten, d. h. von Klonen mit integriertem pK18mobsacB_gltAD5V erfolgte durch Ausplattieren des Konjugationsansatzes auf LB-Agar, der mit 25 mg/1 Kanamycin und 50 mg/1 Nalidixinsäure supplementiert worden war. Kanamycin-resistente Transkonjuganten wurden anschließend auf mit Kanamycin (25 mg/1) supplementierten LB-Agarplatten ausgestrichen und für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden hatte, wurden die Klone 30 Stunden unselektiv in LB-Flüssigmedium kultiviert, anschließend auf LB-Agar, der mit 10% Sucrose supplementiert worden war ausgestrichen und 24 Stunden bei 33°C bebrütet.
Das Plasmid pK18mobsacB_gltAD5V enthält ebenso wie das Ausgangsplasmid pK18mobsacB neben dem Kanamycin- Resistenzgen eine Kopie des für die Levan-Sucrase aus Bacillus subtilis kodierenden sacB-Gens. Die durch Sucrose induzierbare Expression des sacB-Gens führt zur Bildung der Levan-Sucrase, welche die Synthese des für C. glutamicum toxischen Produktes Levan katalysiert. Auf mit Sucrose supplementiertem LB-Agar wachsen daher nur solche Klone, bei denen das integrierte pK18mobsacB_gltAD5V als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert wurde. In Abhängigkeit von der Lage des zweiten Rekombinationsereignisses in bezug auf den Mutationsort findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw. der Einbau der Mutation statt oder es verbleibt die ursprüngliche Kopie im Chromosom des Wirtes.
Anschließend wurde ein Klon gesucht, bei dem der gewünschte Austausch, d. h. der Einbau der Mutation gltAD5V, erfolgt war. Hierzu wurde von 10 Klonen mit dem Phänotyp „Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und „Nicht-Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" die Sequenz des gltA-Gens bestimmt. Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der die Mutation gltAD5V trägt. Dieser Stamm wurde als C. glutamicum DM1797_gltAD5V bezeichnet.
Beispiel 4
Produktion von L-Lysin
Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm DM1797_gltAD5V und der Ausgangsstamm DM1797 wurden in einem zur Produktion von
Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Klone zunächst auf Hirn-Herz-Agarplatten (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 24 Stunden bei 33°C vermehrt. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde je eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) . Als Medium für die Vorkulturen wurde das Medium MM verwendet. Die Vorkulturen wurden 24 Stunden bei 33°C und 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von diesen Vorkulturen wurde je eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkulturen wurde ebenfalls das Medium MM verwendet.
Medium MM
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/l Sal ze :
(NH4) 2SO4) 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l
CaCl2 * 2 H2O 10 mg/1
FeSO4 * 7 H2O 10 mg/1
MnSO4 * H2O 5,0mg/l
Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/1
Thiamin * HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/1
CaCO3 25 g/l
CSL (Corn Steep Liquor) , MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert . Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgte in Volumina von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen enthalten waren. Die Temperatur betrug bei 33°C, die Umdrehungszahl war 250 rpm und die Luftfeuchte 80%.
Nach 48 Stunden wurde die optische Dichte (OD) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch
Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt. Tabel le 1
Figure imgf000051_0001
Bei spiel 5
Einbau der Mutation gltAD5V in den Stamm Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763
Die Mutation gltAD5V soll in den Stamm Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 eingebracht werden. Der Stamm FERM BP-1763 ist ein Mycophenolsäure-resistenter Valin- Produzent (US-A-5, 188, 948) . Er ist auxotroph für L- Isoleucin und L-Methionin.
Der in Beispiel 2 beschriebene Vektor pK18mobsacB_gltAD5V wurde nach dem Protokoll von Schäfer et al . (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) in den Stamm FERM-BP- 1763 durch Konjugation transferiert. Der Vektor kann in FERM BP-1763 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er als Folge eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt. Die Selektion von Transkonjuganten, d. h. von Klonen mit integriertem pK18mobsacB_gltAD5V erfolgte durch Ausplattieren des Konjugationsansatzes auf LB-Agar, der mit 25 mg/1 Kanamycin und 50 mg/1 Nalidixinsäure supplementiert worden war. Kanamycin-resistente Transkonjuganten wurden anschließend auf mit Kanamycin (25 mg/1) supplementierten LB-Agarplatten ausgestrichen und für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden hatte, wurden die Klone 30 Stunden unselektiv in LB-Flüssigmedium kultiviert, anschließend auf LB-Agar, der mit 10% Sucrose supplementiert worden war ausgestrichen und 24 Stunden bei 33°C bebrütet.
Das Plasmid pKlδmobsacB gltAD5V enthält ebenso wie das Ausgangsplasmid pKlδmobsacB neben dem Kanamycin- Resistenzgen eine Kopie des für die Levan-Sucrase aus
Bacillus subtilis kodierenden sacB-Gens. Die durch Sucrose induzierbare Expression des sacB-Gens führt zur Bildung der Levan-Sucrase, die die Synthese des für C. glutamicum toxischen Produktes Levan katalysiert. Auf mit Sucrose supplementiertem LB-Agar wachsen daher nur solche Klone, bei denen das integrierte pKlδmobsacB gltAD5V als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert wurde. In Abhängigkeit von der Lage des zweiten Rekombinationsereignisses in bezug auf den Mutationsort findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw. der Einbau der Mutation statt oder es verbleibt die ursprüngliche Kopie im Chromosom des Wirtes.
Anschließend wurde ein Klon gesucht, bei dem der gewünschte Austausch, d. h. der Einbau der Mutation gltAD5V, erfolgt war. Hierzu wurde von 10 Klonen mit dem Phänotyp „Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und „Nicht-Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" die Sequenz des gltA-Gens bestimmt. Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der die Mutation gltAD5V trägt. Dieser Stamm wurde als C. glutamicum FERM BP-1763_gltAD5V bezeichnet.
Beispiel 6
Produktion von L-Valin
Der in Beispiel 5 erhaltene Stamm FERM BP-1763_gltAD5V und der Ausgangsstamm FERM BP-1763 wurden in einem zur Produktion von Valin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Valingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Klone zunächst auf Hirn-Herz-Agarplatten (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 24 Stunden bei 33°C vermehrt. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde je eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) .
Das Medium CgIII (2.5 g/l NaCl, 10 g/l Bacto-Pepton, 10 g/l Bacto-Yeast Extrakt, pH 7.4, 20 g/l Glukose (getrennt autoklaviert) wurde für die Vorkulturen verwendet. Die Vorkulturen wurden 24 Stunden bei 33°C und 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von diesen Vorkulturen wurde je eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkulturen wurde ebenfalls Medium MM verwendet.
Medium MM
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/l
Salze:
(NH4) 2SO4) 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l
CaCl2 * 2 H2O 10 mg/1
FeSO4 * 7 H2O 10 mg/1
MnSO4 * H2O 5,0mg/l
Isoleucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l
Methionin (sterilfiltriert) 0,1 g/l
Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/l
Thiamin * HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/1
CaCO3 25 g/l CSL (Corn Steep Liquor) , MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert . Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCC>3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgte in Volumina von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen enthalten waren. Die Temperatur betrug bei 33°C, die Umdrehungszahl war 250 rpm und die Luftfeuchte 80%.
Nach 48 Stunden wurde die optische Dichte (OD) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Valinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch
Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
Tabelle 2
Figure imgf000054_0001
Kurze Beschreibung der Figur:
Figur 1: Karte des Plasmids pK18mobsacB_gltAD5V
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Kan : Kanamycin Resistenz-Gen
Sali: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sali
EcoRI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
gltA' : kloniertes DNA-Fragment enthaltend die
Mutation gltAD5V
sacB: sacB-Gen
RP4-mob: mob-Region mit dem Replikationsursprung für den Transfer (oriT)
oriV: Replikationsursprung V

Claims

Ansprüche
1. Isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei die L-Asparaginsäure an Position 5 der Aminosäuresequenz durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist und wobei das Polypeptid Citratsynthase Aktivität besitzt.
2. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid einen oder mehrere konservative Aminosäuraustausch (e) enthält, wobei die Citratsynthase-Aktivität des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleibt.
3. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinogene Aminosäure an Position 5 L-Valin, L-Isoleucin oder L- Leucin ist.
4. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinogene Aminosäure L- VaIin ist.
5. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 besitzt.
6. Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche von Position 1 bis 39 die Nukleotidsequenz entsprechend Position 1 bis 39 von
SEQ ID NO: 11 enthält und von Position 40 bis 105 eine Nukleotidsequenz enthält, die für die
Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 kodiert, wobei an Position 5 eine proteinogenen Aminosäuren ausgenommen L-Asparaginsäure enthalten ist.
7. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinogene Aminosäure L- Valin, L-Isoleucin oder L-Leucin ist.
8. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinogene Aminosäure L- VaIin ist.
9. Das isolierte Polynukleotid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es die Nukleotidsequenz von
Position 263 bis 1263 von SEQ ID NO:7 umfasst.
10. Vektor, der ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 enthält.
11. Bakterium, das mit dem Vektor gemäß Anspruch 10 transformiert worden ist.
12. Das Bakterium gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Bakterium der Gattung Corynebacterium oder Escherichia handelt.
13. Das Bakterium gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Corynebacterium glutamicum oder Escherichia coli handelt.
14. Bakterium der Gattung Corynebacterium, das ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 enthält.
15. Das Bakterium gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Corynebacterium glutamicum handelt.
16. Rekombinantes Bakterium der Gattung Corynebacterium welches ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid mit Citratsynthase-Aktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei an Position 5 der Aminosäuresequenz eine der proteinogenen Aminosäuren ausgenommen L-Asparaginsäure enthalten ist.
17. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das
Polypeptid einen oder mehrere konservative Aminosäuraustausch (e) enthält, wobei die Citratsynthase-Aktivität des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleibt.
18. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinogene Aminosäure L-Valin, L-Isoleucin oder L-Leucin ist.
19. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinogene Aminosäure L-Valin ist.
20. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 besitzt .
21. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid mit Aspartatkinase- Aktivität kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 umfasst, und einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe
a) Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Threonin (LysC A279T),
b) Austausch von L-Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:
20 gegen L-Valin (LysC A279V),
c) Austausch von L-Leucin an Position 297 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Glutamin (LysC L297Q),
d) Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Phenylalanin (LysC S301F) , e) Austausch von L-Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Tyrosin (LysC S301Y) ,
f) Austausch von L-Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:
20 gegen L-Isoleucin (LysC T308I),
g) Austausch von L-Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Isoleucin (LysC T311I),
h) Austausch von L-Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Alanin (LysC S317A) ,
i) Austausch von L-Arginin an Position 320 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Glycin (LysC R320G) ,
j) Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Asparaginsäure (LysC G345D) ,
k) Austausch von L-Threonin an Position 380 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO:
20 gegen L-Isoleucin (LysC T380I), und
1) Austausch von L-Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen L-Phenylalanin (LysC S381F) .
22. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit Aspartatkinase-Aktivität kodiert, überexprimiert wird.
23. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eines oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe besitzt :
a) überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Dihydrodipicolinat-Synthase (DapA) kodiert,
b) überexprimiertes Polynukleotid, das für eine
Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase (Asd) kodiert,
c) überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Diaminopimelat-Decarboxylase (LysA) kodiert,
d) überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Aspartat-Aminotransferase (Aat) kodiert,
e) überexprimiertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit L-Lysin-Export Aktivität (LysE) kodiert,
f) ausgeschaltete oder abgeschwächte Aktivität der Malat-Dehydrogenase (Mdh) ,
g) ausgeschaltete oder abgeschwächte Aktivität der Malat-Chinon Oxidoreduktase (Mqo) ,
h) überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Carboxylase (Pyc) kodiert, und
i) ausgeschaltete oder abgeschwächte Aktivität der EIp Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase Komplexes (AceE) .
24. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sämtliche der Merkmale a) bis g) enthält.
25. Das rekombinante Bakterium der Gattung Corynebacterium gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Corynebacterium glutamicum handelt.
26. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:
a) Fermentation der Bakterien gemäß einem oder mehreren der Ansprüchen 15 bis 25 in einem geeignetem Nährmedium,
b) Akkumulation der L- Aminosäure in dem Nährmedium oder in den Zellen der genannten Bakterien.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der L-Aminosäure um L-Lysin, L-Valin oder L-Isoleucin handelt.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der L-Aminosäure um L-Lysin handelt.
29. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 25 -
28, dadurch gekennzeichnet, dass man die L-Aminosäure sammelt.
30. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 25 -
29, dadurch gekennzeichnet, dass man die L-Aminosäure isoliert und reinigt.
31. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 26 - 29, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteile der
Fermentationsbrühe und/oder Biomasse in ihrer Gesamtheit oder in Anteilen (> 0 bis 100%) im Endprodukt verbleiben.
32. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 26 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein
Satzverfahren handelt.
33. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 26 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Zulaufverfahren handelt.
34. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 26 - 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein kontinuierliches Verfahren handelt.
35. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man einer L-Lysin haltigen Fermentationsbruhe Wasser entzieht und ein Produkt mit einem Wassergehalt von maximal 5 Gew.-% erhalt.
36. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man eine L-Lysin haltige Fermentationsbruhe zunächst konzentriert und anschließend spruhtrocknet oder spruhgranuliert .
37. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchfuhrt
a) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsaure auf 4,0 bis 5,2 absenkt, und ein molares Sulfat/L- Lysin-Verhaltnis von 0,85 bis 1,2 in der Brühe einstellt, gegebenenfalls durch Zugabe von weiteren Sulfat-haltigen Verbindung (n) und
b) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug aufkonzentriert , und gegebenenfalls granuliert.
38. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass als Sulfat-haltige Verbindung Ammoniumsulfat und/ oder Ammoniumhydrogensulfat oder Schwefelsaure und Ammoniak in entsprechenden Verhaltnissen zugesetzt werden .
39. Verfahren gemäß Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) das Verhältnis SuIfat/L-Lysin gemessen wird zur Ermittlung der benotigten Menge an Sulfat-haltigen Verbindungen.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oberflache des erhaltenen Granulats mit einem Ol behandelt.
41. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass zusatzlich folgende weitere Schritte durchgeführt werden : c) Filtration der Fermentationsbruhe, bevorzugt mit einem Membranfilter, so dass ein Biomasse- haltiger Schlamm und ein Filtrat erhalten wird,
d) Aufkonzentration des Filtrates, bevorzugt so, dass ein Feststoffgehalt von 48 bis 52 Gew.-% erhalten wird,
e) Granulation des in Schritt d) erhaltenen Konzentrates, bevorzugt bei einer Temperatur von 500C bis 62°C, und
f) Beschichtung des in e) erhaltenen Granulates mit einem oder mehreren Beschichtungsmittel (n) .
42. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Beschichtungsmittel ausgewählt aus der Gruppe
fl) der in Schritt c) erhaltenen Biomasse,
f2) einer L-Lysin-haltigen Verbindung, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe L-Lysinhydrochlorid oder L-Lysinsulfat,
f3) einem im wesentlichen L-Lysin-freien Stoff mit einem L-Lysingehalt < 1 Gew.-%, bevorzugt < 0,5
Gew.-%, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Starke, Karageenan, Agar, Kieselsauren, Silikate, Schrote, Kleien und Mehle, und
f4) einem wasserabstoßenden Stoff, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Ole, Polyethylenglykole und flussige Paraffine
eingesetzt werden.
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