WO2009110324A1 - 低比重リポ蛋白質受容体の発現制御方法及び発現増強剤 - Google Patents

低比重リポ蛋白質受容体の発現制御方法及び発現増強剤 Download PDF

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WO2009110324A1
WO2009110324A1 PCT/JP2009/052969 JP2009052969W WO2009110324A1 WO 2009110324 A1 WO2009110324 A1 WO 2009110324A1 JP 2009052969 W JP2009052969 W JP 2009052969W WO 2009110324 A1 WO2009110324 A1 WO 2009110324A1
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zfp36
ldlr
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徹 夏目
俊一郎 家村
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the expression of a low density lipoprotein receptor and an expression enhancer. More specifically, the present invention relates to an expression control method for increasing the expression level of a low density lipoprotein receptor by suppressing the expression of the ZFP36 family.
  • lipoproteins are mainly classified into chylomicron, ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, low density lipoprotein, high density lipoprotein, and ultrahigh density lipoprotein according to their specific gravity.
  • LDL low density lipoprotein
  • ischemic diseases such as arteriosclerosis, cerebral infarction, myocardial infarction, angina pectoris, etc. develop based on this vascular disorder.
  • LDL is taken into cells from plasma by endocytosis via LDL receptor (Low Density Lipoprotein Receptor: LDLD) expressed in cells.
  • LDLR has a function of recognizing and binding apolipoprotein B (ApoB) and apolipoprotein E (ApoE) which are apoproteins constituting LDL.
  • ApoB apolipoprotein B
  • ApoE apolipoprotein E
  • LDLR expressed in the liver plays an important role in the clearance of plasma LDL.
  • the total cholesterol level is 600 mg / dl or more, and it is known to develop severe arteriosclerosis and ischemic disease.
  • the stability of mRNA in cells and the amount of translation are determined by the specific sequence called “cis-element” present in the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of mRNA and the “cis element binding factor” Is controlled by.
  • the cis element binding factor binds to the cis element as a “trans-acting factor”, regulates the stability and translation amount of mRNA positively and negatively, and regulates the expression level of the gene product (protein) encoded by mRNAm. .
  • the “ZFP36 family” is a cis element binding factor that binds to this cis element, and includes three genes of TTP (also known as ZFP36), ZFP36L1, and ZFP36L2. It has been reported that the ZFP36 family binds to cis elements and functions to promote mRNA destabilization and degradation (see Non-Patent Document 1).
  • RNA interference RNA interference
  • antisense method methods for suppressing gene expression in cells.
  • RNAi is a “double-stranded RNA (dsRNA)” complementary to a target gene mRNA or a “small interfering RNA (short interfering RNA) produced by degrading this dsRNA with an enzyme called Dicer belonging to the RNase III family; siRNA) "is introduced into cells to specifically degrade target gene mRNA by RISC (RNA Induced Silencing Complex) formed from siRNA and a plurality of proteins. Thereby, it is possible to specifically suppress the expression of the target gene.
  • RISC RNA Induced Silencing Complex
  • Patent Document 1 describes a gene expression suppression method using dsRNA.
  • Antisense method is a method in which single-stranded RNA or DNA (antisense strand) complementary to a target gene mRNA (sense strand) is introduced into a cell, and the translation of the sense strand into a protein is selectively inhibited. It is. Thereby, it is possible to specifically suppress the expression of the target gene.
  • the antisense method has high gene selectivity and acts directly on the target gene mRNA, so that it is expected to be highly effective with low toxicity.
  • an increase in plasma LDL level in hyperlipidemia is a major risk factor for arteriosclerosis and related ischemic diseases such as cerebral infarction, myocardial infarction and angina. Therefore, drugs capable of lowering plasma LDL levels are effective for preventing or treating these diseases.
  • HMG-CoA reductase inhibitors and fibrates have been developed as drugs that lower plasma lipid levels.
  • the currently mainstream HMG-CoA reductase inhibitor antagonist ically inhibits the HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA) enzyme, which is the rate-limiting enzyme for cholesterol biosynthesis in vivo, By suppressing the synthesis of cholesterol in cells, LDL uptake into cells is promoted and plasma LDL levels are reduced. However, there is still no clinical control of plasma LDL levels.
  • LDLR which functions in the clearance of plasma LDL
  • the main object of the present invention is to provide a novel LDLR expression control method and expression enhancer capable of increasing the expression level of LDLR.
  • the present invention is a method for controlling the expression of a low density lipoprotein receptor, wherein the expression level of the low density lipoprotein receptor is increased by suppressing the expression of the ZFP36 family.
  • An expression control method is provided.
  • the expression level of the low density lipoprotein receptor can be increased by stabilizing the mRNA of the low density lipoprotein receptor by suppressing the expression of the ZFP36 family.
  • RNA interference or an antisense method can be suitably employed.
  • the low density lipoprotein receptor in the target cell is reduced.
  • the expression level can be increased.
  • the present invention also relates to a low-density lipoprotein containing one or more selected from an antisense strand, double-stranded RNA, or small interfering RNA against mRNA of the ZFP36 family, or containing an expression vector capable of expressing these.
  • a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating hyperlipidemia or a hyperlipidemia-related disease comprising a receptor expression enhancer and the low-density lipoprotein receptor expression enhancer.
  • hyperlipidemia-related diseases to which this pharmaceutical composition can be applied include arteriosclerosis, hypertension, cerebral infarction, myocardial infarction, angina, diabetes, obesity, and cancer.
  • the present invention also includes the use of an antisense strand, a double-stranded RNA or a small interfering RNA against an mRNA of the ZFP36 family, or an expression vector capable of expressing these for the production of a low-density lipoprotein receptor expression enhancer. It is to provide.
  • the present invention provides a novel LDLR expression control method and expression enhancer capable of increasing the expression level of LDLR.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of an mRNA bait deleted from ARE1 to 3 synthesized in Example 3.
  • Example 3 it is a figure which shows the result of the Western blot which examined ARE which ZFP36L1 and ZFP36L2 couple
  • Example 4 it is a figure which shows the result of the Northern blot which examined the amount of LDLR3'UTR fragments in the cell which expressed the LDLR 3'UTR fragment which deleted ARE1-3. It is a figure which shows the change of the LDLR expression level at the time of suppressing the expression of ZFP36L1 and ZFP36L2 using RNAi. It is a schematic diagram explaining the mechanism of the LDLR expression control method which concerns on this invention.
  • LDLR 3 'untranslated region
  • the present inventors have identified the ZFP36 family as a cis element binding factor that binds to this region and is involved in the regulation of LDLR mRNA stability, and the ZFP36 family functions to destabilize and promote degradation of LDLR mRNA. Clarified that The inventors have found that the expression level of LDLR can be selectively enhanced by suppressing the expression of the ZFP36 family.
  • the present invention provides a method for controlling the expression of LDLR, which comprises increasing the expression level of LDLR by suppressing the expression of the ZFP36 family. .
  • the function of the ZFP36 family that destabilizes LDLR mRNA and promotes its degradation can be suppressed, and the LDLR mRNA can be selectively stabilized. Therefore, according to this expression control method, the amount of protein translation from LDLR mRNA can be increased, and the expression level of LDLR can be increased.
  • LDLR expression control method in order to suppress the expression of ZFP36, known gene expression suppression methods can be widely adopted.
  • RNAi and antisense methods having high gene selectivity are preferably employed.
  • RNAi method induces specific degradation of ZFP36 mRNA by RISC by introducing dsRNA or siRNA having a base sequence complementary to ZFP36 family mRNA (hereinafter also simply referred to as “ZFP36 mRNA”) into the cell. It is possible to suppress the expression of ZFP36 family proteins.
  • the dsRNA and siRNA to be used must have a base sequence complementary to at least a part of ZFP36 mRNA, and preferably all of them have a base sequence complementary to ZFP36 mRNA. Is. More desirably, having a complementary base sequence in the ZFP36 mRNA, particularly with respect to the translation region, is effective in suppressing the expression of the ZFP36 family with high specificity.
  • siRNA having the base sequence shown in “Table 1” used in the Examples into cells subject to LDLR expression control (hereinafter referred to as “target cells”), Degradation can be induced.
  • target cells cells subject to LDLR expression control
  • the siRNAs listed here are examples, and siRNAs that can be used for the ZFP36 family are not limited to these.
  • dsRNA or siRNA only needs to have a base sequence that is at least partially complementary to ZFP36 mRNA, and those that can interact with ZFP36 mRNA by forming a double strand are widely included.
  • the base sequence of dsRNA or siRNA is completely complementary to part of the base sequence of any one of ZFP36L1 shown in SEQ ID NO: 7, ZFP36L2 shown in SEQ ID NO: 8, and TTP (ZFP36) shown in SEQ ID NO: 9.
  • ZFP36 TTP
  • the siRNA that can be used in the present invention is, for example, an RNA having a modified sequence obtained by deleting, adding, substituting, or inserting one or more bases in the base sequence in the siRNA shown in “Table 1”.
  • siRNA capable of exhibiting RNA interference ability equivalent to RNA containing the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 6, that is, an effect of suppressing ZFP36 family expression, by interacting with ZFP36 mRNA is included.
  • RNAi In order to suppress the expression of the ZFP36 family, other than the above RNAi, for example, a known antisense method may be employed.
  • ZFP36 ⁇ mRNA (sense strand) complementary single-stranded RNA or DNA and other antisense strands are introduced into the cell, and the translation of the sense strand into proteins is selectively inhibited. It is possible to suppress the expression of family proteins.
  • the base sequence of the antisense strand does not need to be completely complementary to the base sequence of ZFP36 mRNA as in siRNA, and may be any base sequence that can form and interact with an LDLR mRNA duplex.
  • a nucleic acid strand modified or modified with RNA or DNA for the purpose of enhancing nuclease resistance and improving the efficiency of introduction into cells. Can do.
  • modified or altered nucleic acid chains include LNA (Locked Nucleic Acid), PNA, Morpholino, 2′-O-methyl-RNA, thioDNA, thioRNA, and the like.
  • suppression of expression of ZFP36 family refers to a state in which, in this evaluation, the amount of ZFP36 family protein in the test cell is evaluated to be less than that of the control cell.
  • the protein expression level of the ZFP36 family For the measurement of the protein expression level of the ZFP36 family, a known method such as Western blotting or ELISA using an antibody against the ZFP36 family can be suitably employed.
  • the protein amount should be measured under the same conditions using the same cell type as the test cell and the control cell.
  • the measurement in a test individual (or tissue) and a control individual should be measured under similar conditions using the same animal species, even if they are not the same.
  • DsRNA or siRNA and antisense strand can be obtained by known genetic engineering techniques and nucleic acid synthesis methods. Specifically, dsRNA can be prepared by chemical synthesis or in vitro transcription. In addition to these methods, siRNA can be prepared by cleaving dsRNA into siRNA using Dicer.
  • dsRNA or siRNA or an antisense strand is added to the cell culture solution and taken into the cell to bind to ZFP36 mRNA in the cell. Can do.
  • dFP or siRNA or antisense strand may be introduced into cells by lipofection or microinjection to bind to ZFP36 mRNA.
  • the target of gene expression is a living organ or a living body
  • dsRNA or siRNA or anti-antigen is administered by administration route such as oral route, rectal route, nasal route, vascular route, or by direct local administration to the target organ.
  • a sense strand is introduced into a living body or a living organ, and taken into a cell.
  • these can be expressed in cells by transfection with a vector capable of expressing dsRNA or siRNA or an antisense strand, and bound to ZFP36 mRNA.
  • a vector capable of expressing dsRNA or siRNA or an antisense strand, and bound to ZFP36 mRNA.
  • plasmids derived from Escherichia coli, Bacillus subtilis or yeast, animal viruses such as bacteriophages, retroviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, or those obtained by fusing them with liposomes can be used.
  • a retroviral vector or a fusion of these with a liposome is preferably selected.
  • the expression vector can be constructed by a known genetic engineering technique.
  • the LDLR expression enhancer according to the present invention contains one or more selected from an antisense strand, dsRNA, or siRNA against mRNA of ZFP36, or contains an expression vector capable of expressing these.
  • dsRNA siRNA and antisense strand (hereinafter also referred to as “dsRNA etc.”) against ZFP36 mRNA
  • the expression of the ZFP36 family is suppressed and its function is suppressed, whereby LDLR mRNA is selectively It is possible to stabilize and increase the expression level of LDLR. Therefore, dsRNA and the like can be used as an LDLR expression enhancer.
  • Methods for treating LDLR expression enhancer for cells and living organs include the addition of dsRNA to cell culture medium, introduction into cells by lipofection, etc., introduction into living organs by oral administration, and expression
  • a method such as expression in a cell using a vector can be appropriately selected and used.
  • this LDLR expression enhancer can selectively enhance the expression of LDLR
  • a pharmaceutical composition containing this LDLR expression enhancer as an active ingredient can be applied to, for example, the liver, especially for the expression of LDLR.
  • prevention includes not only prevention in the previous stage of disease, but also prevention against recurrence after treatment of the disease.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention requires this LDLR expression enhancer for the generally recognized formulation implementation together with the physically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc.
  • This pharmaceutical composition is sterilized, for example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections such as solutions or suspensions.
  • additives that can mix the gene product expression enhancer or inhibitor according to the present invention into raw tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, crystalline cellulose Excipients such as corn starch, gelatin, alginic acid, etc., lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavors such as peppermint, red mono oil or cherry An agent is used.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic
  • crystalline cellulose Excipients such as corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavors such as peppermint, red mono oil or cherry An agent is used.
  • the dosage, dosage form, and administration method of the pharmaceutical composition are determined in consideration of the age, weight, symptoms, etc. of the administration subject (including animals).
  • administration method administration by oral route, rectal route, nasal route, vascular route, or the like, or local administration to a target organ can be appropriately selected.
  • hyperlipidemia-related diseases examples include arteriosclerosis and related ischemic diseases such as cerebral infarction, myocardial infarction and angina, and lipid metabolism such as obesity and diabetes.
  • arteriosclerosis and related ischemic diseases such as cerebral infarction, myocardial infarction and angina
  • lipid metabolism such as obesity and diabetes.
  • Examples include metabolic diseases with abnormalities, hypertension, cancer, etc., but application to other diseases is not excluded.
  • Example 1 Isolation and identification of cis-element binding factors that bind to LDLR mRNA It has been reported that a specific region within the 3 'untranslated region (UTR) of LDLR mRNA is involved in mRNA stability control ( “Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins.” Nature Medicine, 2004, Vol. 10, No. 12, p. 1344-1351, Fig. 2f). Therefore, for the purpose of isolating a cis-element binding factor that binds to this region and is involved in the stability control of LDL mRNA, immunoprecipitation was performed using the region as a bait, and the protein bound to this region was isolated. Identification was performed.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the region involved in mRNA stability control in the 3′UTR of LDLR mRNA. This region corresponds to the region 2677-3585 bp from the 5 'end of 5175 bp of LDLR mRNA (GenBank Accession No. NM_000527) shown in SEQ ID NO: 10.
  • ARE1”, “ARE2”, and “ARE3” indicate three “AU-rich elements (AU-Rich Element: ⁇ ⁇ ARE)” that exist in the area.
  • UCAU indicates “UCAU repeat” in which 4 bases of “UCAU” are arranged 4 times in duplicate. This region where ARE1 to ARE3 are arranged in the 3′UTR of LDLR mRNA is a region involved in the control of mRNA stability.
  • ARE is one of the typical cis elements. ARE binding protein binds to ARE as trans-acting factor, and mRNA stability and translation amount are mainly negatively controlled (“AU-rich-elements and associated factors: are there unifying principles?” Nucleic Acids Research , 2005, Vol.33, No.22, p.7138-7150 and “AU-rich“ element-mediated translational control: complexity and multiple activities of trans-activating factors. ”Biochemical Society Transactions, 2002, Vol.30, part 6 , Pp.952-958). ARE is currently tentatively classified into the following three groups (“AU-rich elements and associated factors: are there unifying principles?” Nucleic Acids Research, 2005, Vol.33, No.22, p.7138 -7150).
  • UCAU repeats have been reported to be involved in the regulation of mRNA stability via a binding protein called “K-homology-type RNA binding ⁇ protein ”in experiments using fission yeast (“ Feedback regulation of ” MAPK signalingby an RNA-binding protein. ”Nature, 2003, Vol.424, No.6951, p.961-965).
  • LDL mRNA bait LDL mRNA was synthesized by in vitro translation. Amplify the 2677-3585bp region of LDLR mRNA (SEQ ID NO: 10) by PCR using a primer with a T7 promoter sequence at the 5 'end, and use the MEGAscript T7 kit (Cat.No. 1333, Ambion) according to the attached protocol. RNA synthesis was performed. A reaction for covalently binding Flag-hydrazide to the 3 ′ end of the synthesized LDL mRNA was performed, and the 3 ′ end of LDLR mRNA was labeled with Flag. The labeled mRNA was purified using the Qiagen RNeasy Mini Kit (Cat. No. 74106).
  • the mRNA is labeled with a flag according to a known method (see “Programmable ribozymes for mischarging tRNA with nonnatural amino acids and their applications to translation.” Methods, 2005, Vol, 36, No. 3, p.239-244). It was.
  • the eluate sample was treated with lysyl endopeptidase, and a known method (“A direct nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry system for interaction proteomics.” Analytical Chemistry, 2002, Vol.74, No.18, p.4725-4733 Analysis was carried out according to (see). LC-MS / MS (QSTAR XL, Applied Biosystem) was used for the mass spectrometer.
  • ZFP36L1 and ZFP36L2 were identified by LC-MS / MS.
  • the ZFP36 family has been reported to have the function of deactivating mRNA by binding to ARE and promoting degradation (“Tristetraprolin and its family members can promote the cell-free deadenylation of AU-rich element-containing mRNAs by poly (A) ribonuclease. ”Molecular Cell Biology, 2003, Vol. 23, No. 11, p. 3798-812).
  • ARE is currently estimated to be present in 5-8% of all genes (“ARED: human AU-rich element-containing mRNA database reveals an unexpectedly diverse functional repertoire of encoded proteins.” Nucleic Acids Research, 2001, Vol .29, No.1, p.246-254), it is known that at least one “AUUUA pentamer” exists in the 3′UTR of beta-ActinAmRNA.
  • ActinL mRNA was used as a bait, ZFP36L1 and ZFP36L2 were not identified.
  • ZFP36L1 and ZFP36L2 bind to specific regions of LDLR mRNA 3'UTR, and ZFP36L1 and ZFP36L2 bind to ARE1-3 present in the region and promote the destabilization and degradation of LDLR mRNA. It was suggested to be involved in
  • Example 2 Examination of the specificity of ZFP36L1 and ZFP36L2 for LDLR mRNA 3'UTR
  • ZFP36L1 and ZFP36L2 bind with high specificity to the ARE present in LDLR mRNA 3'UTR, and ZFP36L1 and ZFP36L2 are particularly involved in destabilization and degradation of LDLR mRNA. It was suggested that
  • Example 3 Identification of ARE to which ZFP36L1 and ZFP36L2 bind In the region shown in Fig. 1, to identify the ARE to which ZFP36L1 and ZFP36L2 bind, a bait lacking ARE1 to 3 is synthesized, and the binding ability of ZFP36L1 and ZFP36L2 is evaluated. Went.
  • FIG. 3 shows the structure of the synthesized mRNA bait.
  • FIG. 3 (A) is an mRNA bait (LDLR 3′UTR- (WT) -Flag) containing the 2677-3585 bp region of LDLR mRNA.
  • B) and (C) are the mRNA bait (LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE1) -Flag) from which the ARE1 portion has been deleted and the mRNA bait (LDLR 3'UTR from which ARE2 and ARE3 have been deleted, respectively. -( ⁇ -ARE2,3) -Flag).
  • Each mRNA bait was synthesized according to the method described in “(1) Synthesis of LDLR mRNA bait” in Example 1.
  • LDLR 3'UTR- (WT) -Flag containing the entire region, or LDLR'3'UTR- ( ⁇ -ARE2,3) -Flag from which ARE2 and ARE3 have been deleted include Myc-tagged-ZFP36L1 / ZFP36L2 ZFP36L1 and ZFP36L2 were detected in the sample obtained by mixing with cell extract protein and immunoprecipitation with anti-Flag antibody (lanes 2 and 3 in the figure).
  • Example 4 Functional analysis of ZFP36L1 and ZFP36L2 From the results of Examples 1 to 3, ZFP36L1 and ZFP36L2 bind to ARE1 of LDLR mRNA 3'UTR and are involved in stability control of LDLR mRNA, in particular, destabilization and degradation promotion. It is thought that. In order to confirm this, LDLR 3′UTR fragment lacking ARE1-3 was expressed in cells, and its stability was evaluated.
  • LDLR 3'UTR fragment expression vector mRNA baits shown in Fig. 3 (LDLR 3'UTR- (WT) -Flag, LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE1) -Flag, LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE2,3) -Flag) LDLR 3'UTR fragments (LDLR 3'UTR- (WT), LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE1), LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE2, A plasmid expressing 3) was constructed.
  • the plasmid was constructed based on Invitrogen's “pDEST” 12.2 Vector (Cat. No. 11808-011), and a plasmid vector in which a sequence encoding the RFP protein was added to the 5 ′ side of the insertion region. Furthermore, according to the attached protocol of Invitrogen, PCR reaction and LR recombination reaction are performed, and expression vectors pDEST 12.2-RFP-LDLR 3'UTR- (WT), pDEST 12.2-RFP-LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE1), pDEST 12.2-RFP-LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE2,3) was created.
  • antisense RNA Dig-labeled with the DIG Northern Starter Kit (Cat. No. 2039672, Roche) was used for the 2677-3585 bp region of LDLR mRNA (SEQ ID NO: 10).
  • FIG. 5 shows the detection band of the LDLR 3'UTR fragment.
  • FIG. (B) the quantitative value of the detection band concentration is shown as a relative ratio with the LDLR 3′UTR- (WT) fragment (lane 1 in FIG. (A)) as 100.
  • LDLR 3'UTR- In cells overexpressing LDLR 3'UTR- ( ⁇ -ARE1) lacking ARE1 (lane 3), LDLR 3'UTR- (WT) including the entire region or LDLR lacking ARE2 and ARE3 Compared with cells overexpressing 3′UTR- ( ⁇ -ARE2,3) (lanes 1, 5), the amount of LDLR 3′UTR fragment detected in total RNA increased.
  • RNA synthesis in cells was inhibited by treating cells with Actiomycin D (final concentration 5 ⁇ g / ml, 2 hours) prior to total RNA extraction 24 hours after transfection. .
  • LDLRLD3'UTR- ( ⁇ -ARE1) lacking ARE1 was overexpressed, and ActD-treated cells (lane 4) were compared to cells not treated with ActD (lane 3).
  • the decrease in the detection amount was remarkably suppressed, and a large amount of LDLR 3'UTR fragment could be detected.
  • Example 5 LDFP expression control experiment by suppressing the expression of ZFP36L1 and ZFP36L2 From the results of Example 3, ZFP36L1 and ZFP36L2 bind to ARE1 present in LDLR mRNA 3′UTR and function to destabilize and promote degradation of LDLR mRNA. It was thought that there was. This suggests that by suppressing the expression of ZFP36L1 and ZFP36L2 and suppressing its function, LDLR mRNA can be stabilized and the expression level of LDLR can be enhanced. In order to confirm this, changes in the expression level of LDLR when RNAi was used to suppress the expression of ZFP36L1 and ZFP36L2 were examined.
  • siRNA used was purchased from Invitrogen.
  • the Cat.No. of the three types of siRNA used for each of ZFP36L1 and ZFP36L2 is shown in “Table 2”.
  • Stealth RNAiNegative Control (Cat. No. 12935-100, Invitrogen) was used as a control siRNA 7-9 for comparison.
  • FIG. 6 Western blotting results are shown in “Fig. 6”.
  • the upper part of FIG. (A) shows the detection band of LDLR, and the middle and lower parts show the detection band of ⁇ -actin for comparison.
  • FIG. (B) the quantitative value of the detection band concentration is shown as a relative ratio with 1 being the cell transfected with control siRNA7 (lane 1 in FIG. (A)).
  • LDLR expression level is significantly higher in cells transfected with any of siRNA 1-3 and siRNA 4-6 in combination and suppressed ZFP36L1 and ZFP36L2 expression Enhanced.
  • LDLR expression level can be selectively enhanced by transfection of siRNA that inhibits the expression of ZFP36L1 and ZFP36L2.
  • ZFP36L1 and ZFP36L2 bind to a specific ARE (ARE1) present in LDLR mRNA 3'UTR with high specificity, destabilize LDLR mRNA, and promote degradation. It became clear that it was demonstrating. It was shown that by suppressing the expression of ZFP36L1 and ZFP36L2, the functional expression of ZFP36L1 and ZFP36L2 can be inhibited and the expression level of LDLR can be selectively enhanced (see FIG. 7).
  • TTP ZFP36
  • ZFP36L1 and ZFP36L2 have been reported to function in common in mRNA destabilization and degradation. Therefore (see Non-Patent Document 1 above), it was considered that not only ZFP36L1 and ZFP36L2 but also the expression level of LDLR can be increased by suppressing the expression of TTP.
  • a novel LDLR expression control method and expression enhancer capable of increasing the expression level of LDLR are provided.
  • the pharmaceutical composition containing the low-density lipoprotein receptor expression enhancer is useful as a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating hyperlipidemia or hyperlipidemia-related diseases.
  • hyperlipidemia-related diseases to which this pharmaceutical composition can be applied include arteriosclerosis, hypertension, cerebral infarction, myocardial infarction, angina, diabetes, obesity, and cancer.

Abstract

　本発明は、低比重リポ蛋白質受容体（LDLR）の発現量を増加させることが可能な新規なLDLR発現制御方法及び発現増強剤を提供する。 　本発明では、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、LDLRの発現量を増加させる。ZFP36ファミリーの発現を抑制するには、ZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNAから選択される１以上を含有する、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターを用いることができる。

Description

低比重リポ蛋白質受容体の発現制御方法及び発現増強剤
　本発明は、低比重リポ蛋白質受容体の発現制御方法及び発現増強剤に関する。より詳しくは、ZFP36ファミリーの発現を抑制することによって、低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させる発現制御方法等に関する。
　生体内において、コレステロールは、アポタンパク質（Apoprotein）と呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、ミセルとなって血漿中に存在している。このコレステロールを含む脂質とアポタンパク質との複合体は、リポ蛋白質（Lipoprotein）と称される。リポ蛋白質は、主としてその比重に応じて、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白質、中間比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、高比重リポ蛋白質、超高比重リポ蛋白質に分類されている。
　このうち、低比重リポ蛋白質（Low Density Lipoprotein: LDL）は、肝臓で合成されたコレステロールの末梢組織への輸送に関与している。LDLは、俗に「悪玉コレステロール」とも呼ばれ、LDLの血漿中濃度（レベル）の増加は動脈硬化症発症の大きなリスクとなる。高脂血症において、LDLの血漿レベルが正常値を超えて増加すると、LDLが血管内壁へ沈着し、血管内膜の炎症やマクロファージの泡沫化を惹起して血管の傷害が引き起こされる。動脈硬化症や、脳梗塞や心筋梗塞、狭心症等の虚血性疾患は、この血管障害を基盤として発症すると考えられている。
　LDLは、細胞に発現するLDL受容体（Low Density Lipoprotein Receptor: LDLR）を介したエンドサイトーシスによって、血漿中から細胞内へ取り込まれる。LDLRは、LDLを構成するアポタンパク質であるアポリポプロテインB（ApoB）やアポリポプロテインE（ApoE）を認識し、これを結合させる機能を有している。特に、肝臓に発現するLDLRは、血漿LDLのクリアランスに重要な役割を果たしている。LDLR欠損症では、総コレステロール値が600mg/dl以上にもなり、重篤な動脈硬化や虚血性疾患を発症することが知られている。
　以下、本発明に関連して、「ZFP36ファミリー」と、「RNA干渉」及び「アンチセンス法」を用いた遺伝子発現制御方法について説明する。
　細胞内におけるmRNAの安定性やその翻訳量は、mRNAの5’及び3’非翻訳領域に存在する「シスエレメント（cis-element）」と呼ばれる特定配列と、これに結合する「シスエレメント結合因子」によって制御されている。シスエレメント結合因子は、「trans-acting factor」としてシスエレメントに結合し、mRNAの安定性や翻訳量を正負に制御し、mRNA にコードされる遺伝子産物（タンパク質）の発現量を調節している。「ZFP36ファミリー」は、このシスエレメントに結合するシスエレメント結合因子であり、TTP（別名ZFP36）、ZFP36L1及びZFP36L2の３遺伝子を含んでいる。ZFP36ファミリーは、シスエレメントに結合し、mRNAの不安定化・分解促進に機能していることが報告されている（非特許文献１参照）。
　従来、細胞内の遺伝子発現を抑制するための方法として、「RNA干渉（RNA interference; RNAi）」と「アンチセンス法」が知られている。「RNAi」は、標的遺伝子mRNAに相補的な「二本鎖RNA（dsRNA）」又はこのdsRNAがRNaseIIIファミリーに属するDicerと呼ばれる酵素によって分解されて生成する「低分子干渉性RNA（short interfering RNA; siRNA）」を細胞内に導入することで、siRNAと複数のタンパク質から形成されるRISC（RNA Induced Silencing Complex）によって標的遺伝子mRNAを特異的に分解させるものである。これにより、標的遺伝子の発現を特異的に抑制することが可能である。次に説明するアンチセンス法では自然に存在しないアンチセンス鎖を用いるのに対して、RNAiは細胞内の既存の遺伝子発現制御系を利用したものであるため、より安全性が高いものと期待されている。特許文献１には、dsRNAを用いた遺伝子発現抑制方法が記載されている。
　「アンチセンス法」は、標的遺伝子mRNA（センス鎖）に相補的な一本鎖RNA又はDNA（アンチセンス鎖）を細胞内へ導入し、センス鎖のタンパク質への翻訳を選択的に阻害する方法である。これにより、標的遺伝子の発現を特異的に抑制することが可能である。アンチセンス法は、遺伝子選択性が高く、標的遺伝子mRNAに直接作用するので、低毒性で高い効果を得られるものと期待されている。
米国特許第６，５０６，５５９号明細書 "Tristetraprolinand its familymembers can promote the cell-free deadenylationof AU-rich element-containing mRNAs by poly(A) ribonuclease." Molecular Cell Biology, 2003, Vol.23, No.11, p.3798-812
　上述の通り、高脂血症における血漿LDLレベルの増加は、動脈硬化症やこれに関連する脳梗塞や心筋梗塞、狭心症等の虚血性疾患などの主要なリスク因子となっている。従って、血漿LDLレベルを低下させることが可能な薬物は、これらの疾患を予防又は治療するため有効となる。
　これまでに、血漿脂質レベルを低下させる薬物として、HMG-CoA還元酵素阻害薬やフィブラート系薬剤等の種々の薬物が開発されてきている。現在主流となっているHMG-CoA還元酵素阻害薬は、生体内におけるコレステロール生合成の律速酵素となっているHMG-CoA（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA）酵素を拮抗的に阻害し、細胞内でのコレステロール合成を抑制することで、細胞内へのLDL取り込みを亢進させ、血漿LDLレベルを低下させようとするものである。しかし、いまだ臨床において血漿LDLレベルを完全にコントロールできるにはいたっていない。
　血漿LDLのクリアランスに機能するLDLRの発現量を選択的に増強させ、細胞内へのLDL取り込みを直接促進させることができれば、HMG-CoA還元酵素阻害薬に替わる有効な治療方法となるものと考えられる。
　そこで、本発明は、LDLRの発現量を増加させることが可能な新規なLDLR発現制御方法及び発現増強剤を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本発明は低比重リポ蛋白質受容体の発現を制御するための方法であって、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることを特徴とする発現制御方法を提供する。
　この発現制御方法においては、ZFP36ファミリーの発現抑制によって、低比重リポ蛋白質受容体のmRNAを安定化することで、低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることが可能である。
　ZFP36ファミリーの発現抑制のためには、RNA干渉又はアンチセンス法を好適に採用することができる。
　具体的には、配列番号１～６記載の塩基配列を有する低分子干渉性RNAを標的細胞内に導入し、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、前記標的細胞における低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることができる。
　また、本発明は、ZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNAから選択される１以上を含有する、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターを含有する低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤、及びこの低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤を含有する、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療するための医薬組成物を提供する。
　この医薬組成物を適用可能な高脂血症関連疾患としては、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌が挙げられる。
　さらに、本発明は、低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤製造のためZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNA、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターの使用をも提供するものである。
　本発明により、LDLRの発現量を増加させることが可能な新規なLDLR発現制御方法及び発現増強剤が提供される。
LDLR mRNAの3’UTRのうち、mRNA安定性制御に関与する領域の構造を示す模式図である。 実施例2において、ZFP36L1及びZFP36L2のLDLRmRNA 3’UTRに対する特異性を検討したウェスタンブロットの結果を示す図である。 実施例3において合成したARE1～3を欠失させたmRNAベイトの構造を示す模式図である。 実施例3において、ZFP36L1及びZFP36L2が結合するAREを検討したウェスタンブロットの結果を示す図である。 実施例4において、ARE1～3を欠失させたLDLR 3’UTRフラグメントを発現させた細胞内におけるLDLR3’UTRフラグメント量を検討したノーザンブロットの結果を示す図である。 RNAiを用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のLDLR発現量の変化を示す図である。 本発明に係るLDLR発現制御方法のメカニズムを説明する模式図である。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　これまでにLDLR mRNAの3’非翻訳領域（UTR）内の特定領域が、mRNAの安定性制御に関与していることが報告されている（”Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins.”Nature Medicine, 2004, Vol.10, No.12, p.1344-1351・Fig.2f参照）。今回、本発明者らは、この領域に結合し、LDLR mRNAの安定性制御に関与しているシスエレメント結合因子としてZFP36ファミリーを同定し、ZFP36ファミリーがLDLR mRNAの不安定化及び分解促進に機能していることを明らかにした。そしてZFP36ファミリーの発現を抑制することで、LDLRの発現量を選択的に増強できることを見出した。
　従って、本発明は、LDLRの発現を制御するための方法であって、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、LDLRの発現量を増加させることを特徴とする発現制御方法を提供するものである。
　ZFP36ファミリーの発現を抑制することで、LDLR mRNAを不安定化してその分解を促進するZFP36ファミリーの機能を抑制し、LDLR mRNAを選択的に安定化させることができる。従って、この発現制御方法によれば、LDLR mRNAからのタンパク質翻訳量を増加させ、LDLRの発現量を増加させることが可能となる。
　本発明に係るLDLR発現制御方法おいて、ZFP36の発現を抑制するためには、公知の遺伝子発現抑制方法を広く採用することができる。特に、高い遺伝子選択性を備えるRNAi及びアンチセンス法が好適に採用される。
　RNAiによる方法では、ZFP36ファミリー mRNA（以下、単に「ZFP36 mRNA」ともいう）に相補的な塩基配列を有するdsRNA又はsiRNAを細胞内に導入することで、RISCによるZFP36 mRNAの特異的分解を誘導し、ZFP36ファミリータンパク質の発現を抑制することが可能である。
　使用するdsRNA及びsiRNAは、ZFP36 mRNAに対して少なくともその一部において相補的な塩基配列を有していることが必要であり、望ましくはその全部がZFP36 mRNAに対して相補的な塩基配列を有するものである。また、さらに望ましくは、ZFP36 mRNAのうち、特に翻訳領域に対して、相補的な塩基配列を有していることが、ZFP36ファミリーの発現を特異性高く抑制するため効果的となる。
　具体的には、例えば実施例で用いた「表1」に示す塩基配列を有するsiRNAをLDLRの発現制御対象とする細胞（以下、「標的細胞」という）内に導入することで、ZFP36 mRNAの分解を誘導することができる。なお、ここに挙げるsiRNAは例示であって、ZFP36ファミリーに対して使用可能なsiRNAはこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　dsRNA又はsiRNAは、上述の通り、ZFP36 mRNAに対し少なくとも一部において相補的な塩基配列を有していればよく、ZFP36 mRNAと二本鎖を形成することにより相互作用し得るものが広く包含されるものとする。すなわち、dsRNA又はsiRNAの塩基配列は、配列番号７に示すZFP36L1、配列番号8に示すZFP36L2、配列番号９に示すTTP（ZFP36）のいずれかの塩基配列の一部に完全に相補的であることがZFP36ファミリーに対する高い発現抑制効果、ひいては高いLDLR発現増強効果を得るために望ましい。しかし、必ずしも完全一致である必要はなく、ZFP36 mRNAと二本鎖を形成し相互作用して、RNAiを仲介し得る塩基配列を有するdsRNA又はsiRNAであれば用いることができる。
　従って、本発明において使用可能なsiRNAには、例えば「表1」に示したsiRNAにおいて、塩基配列中の1又は2以上の塩基を欠失、付加、置換、挿入した改変配列を有するRNAであって、ZFP36 mRNAと相互作用することによって、配列番号1～6のいずれかに示す塩基配列を含むRNAと同等のRNA干渉能、すなわちZFP36ファミリー発現抑制効果を発揮し得るsiRNAが含まれる。
　ZFP36ファミリーの発現を抑制するためには、上記のRNAi以外にも、例えば、公知のアンチセンス法を採用してもよい。アンチセンス法では、ZFP36 mRNA（センス鎖）に相補的な一本鎖RNAやDNA等のアンチセンス鎖を細胞内へ導入し、センス鎖のタンパク質への翻訳を選択的に阻害することで、ZFP36ファミリータンパク質の発現を抑制することが可能である。
　アンチセンス鎖の塩基配列についても、siRNAと同様に、ZFP36 mRNAの塩基配列と完全に相補的である必要はなく、LDLR mRNA二本鎖を形成し相互作用し得る塩基配列であればよい。また、アンチセンス鎖には、一本鎖RNA又はDNAの他、ヌクレアーゼ耐性を高め、細胞内への導入効率を向上させることを目的として、RNA又はDNAを修飾又は改変した核酸鎖を使用することができる。このような修飾又は改変した核酸鎖としては、例えば、LNA（Locked Nucleic Acid）やPNA, Morpholino、2'-O-methyl-RNA、チオDNA、チオRNAなどが挙げられる。
　RNAi、アンチセンス法及びその他の公知の遺伝子発現抑制方法により、ZFP36ファミリーの発現を抑制する場合、その抑制効果は、遺伝子発現抑制の対象とする被検細胞（又は組織や個体）と、比較のための対照細胞との間で、ZFP36ファミリーのタンパク質発現量を測定することによって評価できる。本発明における「ZFP36ファミリーの発現抑制」は、この評価において、対照細胞に比して、被検細胞におけるZFP36ファミリーのタンパク質量が少ないと評価される状態を指すものとする。
　ZFP36ファミリーのタンパク質発現量の測定には、ZFP36ファミリーに対する抗体を用いたウェスタンブロット法やELISA法などの公知の方法を好適に採用できる。タンパク質量の測定は、被検細胞と対照細胞として、同一の細胞種を用いて同一の条件下で測定されるべきである。また、被検個体（又は組織）と対照個体における測定も、たとえ同一でないとしても、同一動物種を用いて類似した条件の下で測定されるべきものである。
　dsRNA又はsiRNAやアンチセンス鎖は、公知の遺伝子工学的手法及び核酸合成方法により得ることができる。具体的には、dsRNAは、化学合成やインビトロ転写（in vitro translation）により調製し得る。また、siRNAは、これらの方法に加え、dsRNAをDicerによりsiRNAに切断することによって調製することができる。
　本発明に係るLDLR発現制御方法において、制御対象を細胞とする場合、dsRNA又はsiRNAやアンチセンス鎖は、細胞培養液に添加し細胞内へ取り込ませることによって、細胞内のZFP36 mRNAへ結合させることができる。また、dsRNA又はsiRNAやアンチセンス鎖をリポフェクションやマイクロインジェクションによって細胞内へ導入することにより、ZFP36 mRNAへ結合させてもよい。また、遺伝子発現の制御対象が生体臓器又は生体である場合には、経口経路、直腸経路、鼻腔経路、血管経路などの投与経路によって、又は対象臓器への直接局所投与によって、dsRNA又はsiRNAやアンチセンス鎖を生体内又は生体臓器内へ導入し、細胞内へ取り込ませる。
　さらに、dsRNA又はsiRNAやアンチセンス鎖を発現可能なベクターのトランスフェクトにより、これらを細胞内で発現させ、ZFP36 mRNAへ結合させることもできる。ベクターには、大腸菌由来や枯草菌由来、酵母由来のプラスミドや、バクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス又はこれらをリポソームと融合させたものなどが用いることができる。特に、dsRNA及びsiRNA、アンチセンス鎖をRNAとする場合には、レトロウイルスベクター又はこれらをリポソームと融合させたものが好適に選択される。発現ベクターの構築は、公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
　次に、本発明に係るLDLR発現増強剤、及びこれを含有する医薬組成物について説明する。
　本発明に係るLDLR発現増強剤は、ZFP36のmRNAに対するアンチセンス鎖、dsRNA又はsiRNAから選択される１以上を含有する、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターを含有するものである。
　上記の通り、ZFP36 mRNAに対するdsRNA、siRNA及びアンチセンス鎖（以下、「dsRNA等」ともいう）によれば、ZFP36ファミリーの発現を抑制してその機能を抑制することで、LDLR mRNAを選択的に安定化し、LDLRの発現量を増加させることが可能である。従って、dsRNA等は、LDLR発現増強剤として利用し得るものである。
　LDLR発現増強剤を対象とする細胞や生体臓器等へ処置するための方法は、dsRNA等の細胞培養液への添加やリポフェクション等による細胞内導入、経口投与等による生体臓器内への導入、発現ベクターを用いた細胞内での発現などの方法を、適宜選択して用いることができる。
　このLDLR発現増強剤によれば、LDLRの発現を選択的に増強することが可能であるため、このLDLR発現増強剤を有効成分とする医薬組成物は、例えば特に肝臓へ適用してLDLRの発現量を増加させることで、血漿LDLコレステロールのクリアランスを高め、高脂血症及び高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療することが可能となる。なお、ここで「予防」には、疾患を罹患する前段階の予防だけではなく、疾患治療後の再発に対する予防も含まれる。
　本発明に係る医薬組成物は、このLDLR発現増強剤を、理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造できる。この医薬組成物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。本発明に係る遺伝子産物発現増強剤又は抑制剤を、生錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。
　医薬組成物の投与量や剤型の種類、投与方法は、投与対象（動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものである。投与方法は、経口経路、直腸経路、鼻腔経路、血管経路などによる投与、又は対象臓器への局所投与を適宜選択し得る。
　この医薬組成物を適用可能な高脂血症関連疾患としては、動脈硬化症やこれに関連する脳梗塞や心筋梗塞、狭心症等の虚血性疾患、さらには肥満症や糖尿病などの脂質代謝異常を伴う代謝性疾患、高血圧症や癌などが挙げられるが、この他の疾患への適用を除外するものではない。
＜実施例１＞
１．LDLR mRNAに結合するシスエレメント結合因子の単離同定
　これまでにLDLR mRNAの3’非翻訳領域（UTR）内の特定領域が、mRNAの安定性制御に関与していることが報告されている（”Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins.”Nature Medicine, 2004, Vol.10, No.12, p.1344-1351・Fig.2f参照）。そこで、この領域に結合し、LDL mRNAの安定性制御に関与しているシスエレメント結合因子を単離することを目的として、当該領域部分をベイトとした免疫沈降を行い、これに結合したタンパク質の同定を行った。
　「図1」は、LDLR mRNAの3’UTRのうち、mRNA安定性制御に関与する領域の構造を示す模式図である。この領域は、配列番号10に示すLDLR mRNA　5175bp（GenBank Accession No.NM_000527）のうち、5’末端から2677-3585bpの領域に相当する。
　図1中、「ARE1」, 「ARE2」及び「ARE3」は、それぞれ当該領域に存在する3つの「AUリッチエレメント（AU-Rich Element: ARE）」を示す。また、「UCAU」は、「UCAU」の4塩基が4回重複して配列する「UCAUリピート」を示す。LDLR mRNAの3’UTRのうち、ARE1からARE3までが配列するこの領域が、mRNAの安定性の制御に関与する領域である。
　AREは、代表的なシスエレメントの一つである。AREには、trans-acting factor としてARE結合タンパク質が結合し、mRNAの安定性や翻訳量を主として負に制御している（“AU-rich elements and associated factors: are there unifying principles？” Nucleic Acids Research, 2005, Vol.33, No.22, p.7138-7150及び“AU-rich element-mediated translational control: complexity and multiple activities of trans-activating factors.” Biochemical Society Transactions, 2002, Vol.30, part 6, p.952-958参照）。AREは、現在、暫定的に以下の３グループに分類されている（“AU-rich elements and associated factors: are there unifying principles？” Nucleic Acids Research, 2005, Vol.33, No.22, p.7138-7150参照）。すなわち、（１）ウリジンに富む配列中に数コピーの「AUUUAペンタマー」を含む領域、（２）少なくとも2以上の重複する「UUAUUUA(U/A)(U/A)ノナマー」を含む領域、（３）「AUUUAペンタマー」を含まないがウリジンに富む領域である。
　また、UCAUリピートは、分裂酵母を用いた実験で、「K-homology-type RNA binding protein」と呼ばれる結合タンパク質を介したmRNAの安定性制御に関与することが報告されている（”Feedback regulation of MAPK signallingby an RNA-binding protein.”Nature, 2003, Vol.424, No.6951, p.961-965参照）。
１－（１）．LDL mRNAベイトの合成
　LDL mRNAをin vitro translationにより合成した。5’末端にT7 promoter 配列を持つプライマーを用いてPCRによりLDLR mRNA (配列番号10)の2677-3585bp領域の増幅を行い、MEGAscript T7 キット (Cat.No.1333, Ambion)を用い、添付プロトコールに従ってRNAの合成を行った。合成されたLDL mRNAの3’末端にFlag-hydrazideを共有結合させる反応を行い、LDLR mRNAの3’末端をFlag標識した。標識mRNAをQiagen社のRNeasy Mini Kit（Cat.No.74106）を用いて精製した。なお、mRNAのFlag標識は、公知の手法（”Programmable ribozymes for mischarging tRNA with nonnatural amino acids and their applications to translation.” Methods, 2005, Vol,36, No.3, p.239-244参照）に従って行った。
１－（２）．免疫沈降・タンパク質同定
　精製後のFlag標識LDLR mRNA 10pmolを抗Flag抗体ビーズ（Cat.No.F2426, Sigma）と混合、4℃で１時間反応を行った。その後、10%FBS 含有DMEM培地で培養した293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgを加えさらに、4℃で１時間反応を行った。非結合タンパク質を洗い流した後、RNA及びRNA結合タンパク質をFlagペプチドで溶出させた。溶出させて得た試料をリジルエンドペプチダーゼ処理し、公知の手法（”A direct nanoflowliquid chromatography-tandem mass spectrometry system for interaction proteomics.” Analytical Chemistry, 2002, Vol.74, No.18, p.4725-4733参照)に従って解析を行った。マススペクトロメーターには、LC-MS/MS（QSTAR XL, アプライドバイオシステム）を用いた。
１－（３）．結果
　LC-MS/MSにより「ZFP36L1」及び「ZFP36L2」が同定された。ZFP36ファミリーは、AREに結合してmRNAを不安定化し、分解を促進する機能を有することが報告されている（”Tristetraprolin and its family members can promote the cell-free deadenylation of AU-rich element-containing mRNAs by poly(A) ribonuclease.” Molecular Cell Biology, 2003, Vol.23, No.11, p.3798-812参照）。
　比較のため、beta-ActinmRNA（配列番号11, GenBank Accession No.NM_001101）の3’UTR（5’側末端から1199-1770bps）について同様にベイトを合成し、免疫沈降とLC-MS/MSによる解析を行った。AREは、現在では全遺伝子の5～8％に存在すると推定されており（“ARED: human AU-rich element-containing mRNA database reveals an unexpectedly diverse functional repertoire of encoded proteins.” Nucleic Acids Research, 2001, Vol.29, No.1, p.246-254参照）、beta-Actin mRNAの3’UTRにも「AUUUAペンタマー」が少なくとも一箇所存在していることが知られている。しかしながら、Actin mRNAをベイトとした場合には、ZFP36L1及びZFP36L2は同定されなかった。
　これらの結果から、ZFP36L1及びZFP36L2がLDLR mRNA 3’UTRの特定領域に結合することが明らかとなり、ZFP36L1及びZFP36L2が当該領域に存在するARE1～3に結合してLDLR mRNAの不安定化及び分解促進に関与していることが示唆された。
＜実施例２＞
２．ZFP36L1及びZFP36L2のLDLR mRNA 3’UTRに対する特異性の検討
　ZFP36L1及びZFP36L2のLDLR mRNA 3’UTRに対する特異性を検討するため、Actin-mRNAに加えて、Histone mRNA（GenBank Accession No.BC001629）とHNRNPA2B1（GenBank Accession No.NM_002137）の3’UTRについても同様にベイトを合成し、ZFP36L1及びZFP36L2の結合能の評価を行った。
２－（１）．LDL mRNAベイトの合成
　実施例１中「１－（１）．LDLR mRNAベイトの合成」で説明した方法に従い、Histone mRNA（配列番号12）の39-549bp領域とHNRNPA2B1（hnA/B） mRNA（配列番号13）の39-549bp領域についても、Flag標識mRNAを調製した。hnA/B mRNAの3’UTRには、Actinと同様に、少なくとも一箇所の「AUUUAペンタマー」が存在している。他方、Histone mRNAの3’UTRにはAREは存在しない。
２－（２）．免疫沈降
　実施例１中「１－（２）．免疫沈降・タンパク質同定」で説明した方法に従い、精製後のFlag標識mRNAを抗Flag抗体ビーズと混合・反応を行った後、MycタグをフューズしたZFP36L1及びZFP36L2（Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2）を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgと混合し反応を行なった。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体(Cat.No.1667149, Roche)を用いてウエスタンブロッティングを行った。
２－（３）．結果
　ウェスタンブロットの結果を「図2」に示す。上段は抗Myc抗体検出のMyc-tagged-ZFP36L2バンド、下段はMyc-tagged-ZFP36L1バンドを示す。
　Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2が含まれる細胞抽出タンパク質をFlag標識LDLR 3’UTR （LDLR 3’UTR-Flag）と混合し、抗Flag抗体で免疫沈降させて得た試料（図中レーン4）では、ZFP36L1及び多量のZFP36L2が検出された。
　一方、同様にARE（AUUUAペンタマー）を有しているActin 3’UTR-Flag（レーン2）やhnA/B 3’UTR-Flag（レーン５）との反応で得られた試料ではZFP36L1及びZFP36L2はほとんど検出されなかった。また、ARE が存在しないHistone 3’UTR-Flag（レーン3）についても、ZFP36L1及びZFP36L2は検出されなかった。
　これらの結果から、ZFP36L1及びZFP36L2がLDLR mRNA 3’UTRに存在するAREに対して高い特異性をもって結合することが確認され、ZFP36L1及びZFP36L2が特にLDLR ｍRNAの不安定化及び分解促進に関与していることが示唆された。
＜実施例３＞
３．ZFP36L1及びZFP36L2が結合するAREの同定
　図1に示した領域において、ZFP36L1及びZFP36L2が結合するAREを同定するため、ARE1～3を欠失させたベイトを合成し、ZFP36L1及びZFP36L2の結合能の評価を行った。
３－（１）．LDL mRNAベイトの合成
　「図3」に合成したmRNAベイトの構造を示す。図3（A）は、LDLR mRNAの2677-3585bp領域を含むmRNAベイト（LDLR 3’UTR-(WT)-Flag）である。また（B）及び（C）は、それぞれARE1部分を欠失させたmRNAベイト（LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flag）とARE2及びARE3を欠失させたmRNAベイト（LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flag）である。各mRNAベイトの合成は、実施例１中「（１）LDLR mRNAベイトの合成」で説明した方法に従って行った。
３－（２）．免疫沈降
　実施例２中「２－（２）．免疫沈降」で説明した方法に従い、精製後のFlag標識mRNAを抗Flag抗体ビーズと混合・反応を行った後、Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2を強制発現させた293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質3mgと混合し反応を行なった。免疫沈降後、溶出させた試料について、抗Myc抗体(Cat.No.1667149, Roche)を用いてウエスタンブロッティングを行った。
３－（３）．結果
　ウェスタンブロットの結果を「図4」に示す。上段は抗Myc抗体検出のMyc-tagged-ZFP36L2バンド、下段はMyc-tagged-ZFP36L1バンドを示す。
　全領域を含むLDLR 3’UTR-(WT)-Flag、又はARE2及びARE3を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flagを、Myc-tagged-ZFP36L1/ ZFP36L2が含まれる細胞抽出タンパク質と混合し、抗Flag抗体で免疫沈降させて得た試料（図中レーン2, 3）では、ZFP36L1及びZFP36L2が検出された。
　これに対して、ARE1を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flagとの反応により得られた試料（レーン4）ではZFP36L1及びZFP36L2はほとんど検出されなかった。
　この結果は、ZFP36L1及びZFP36L2が、図1に示したLDLR mRNA 3’UTRの特定領域中において、特にARE1に結合していることが明らかにするものである。
＜実施例４＞
４．ZFP36L1及びZFP36L2の機能解析
　実施例1～3の結果から、ZFP36L1及びZFP36L2は、LDLR mRNA 3’UTRのARE1に結合して、LDLR mRNAの安定性制御、特に不安定化及び分解促進、に関与しているものと考えられる。これを確認するため、ARE1～3を欠失させたLDLR 3’UTRフラグメントを細胞に発現させ、その安定性の評価を行った。
４－（１）．LDLR 3’UTRフラグメント発現ベクターの構築
　「図3」に示したmRNAベイト（LDLR 3’UTR-(WT)-Flag, LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)-Flag, LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)-Flag）と同様の構造を有するLDLR 3’UTRフラグメント（LDLR 3’UTR-(WT), LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1), LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)）を発現するプラスミドを構築した。
　プラスミドは、Invitrogen社の pDEST 12.2 Vector (Cat. No. 11808-011) をもとにして、挿入領域の5'側にRFPタンパク質をコードする配列を加えたプラスミドベクターを構築した。さらにInvitrogen社の添付プロトコールに従って、PCR反応およびLR組み替え反応を行ない、発現ベクターpDEST 12.2-RFP-LDLR 3’UTR-(WT), pDEST 12.2-RFP-LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1), pDEST 12.2-RFP-LDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)を作成した。
４－（２）．細胞内LDLR 3’UTRフラグメント量の評価
　293T細胞を、6-well プレートに8.0×105cells / wellで播種し、10%FBS 含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、発現ベクターをリポフェクション（Lipofectamine 2000, Cat.No.11668-019, Invitrogen）によって細胞にトランスフェクトした。発現ベクター2.0μgを100μlのOpti-MEMで希釈した。また、4μlのLipofectamine2000を100μlのOpti-MEMで希釈した。希釈後、室温にて5分間静置し、発現ベクターとLipofectamine希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を6-well プレートに加えた。トランスフェクト24時間後に、細胞からトータルRNAを抽出し、定法によりノーザンブロットを行った。プローブは、LDLR mRNA (配列番号10)の2677-3585bp領域についてDIGノーザンスターターキット(Cat.No.2039672, Roche)によりDig ラベルしたアンチセンスRNAを用いた。
４－（３）．結果
　ノーザンブロットの結果を「図5」に示す。図（A）は、LDLR 3’UTRフラグメントの検出バンドを示す。また、図（B）には、検出バンド濃度の定量値を、LDLR 3’UTR-(WT)フラグメント（図（A）中レーン1）を100とした相対比によって示す。
　ARE1を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE1)を過剰発現させた細胞（レーン3）では、全領域を含むLDLR 3’UTR-(WT) 又はARE2及びARE3を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)を過剰発現させた細胞（レーン1, 5）に比べ、トータルRNA中に検出されたLDLR 3’UTRフラグメントの量が増加した。
　この傾向は、トランスフェクト24時間後のトータルRNA抽出に先立って、細胞をActiomycinD処理（終濃度5μg/ml, 2時間）することにより、細胞内のRNA合成を阻害した場合、さらに顕著であった。
　すなわち、LDLR 3’UTR-(WT) 又はLDLR 3’UTR-(Δ-ARE2,3)を過剰発現させた細胞をトランスフェクト後、ActiomycinD（ActD）処理した細胞（レーン2, 6）では、ActDによって新たなLDLR 3’UTRフラグメントの合成が阻害される結果、フラグメントの分解が優位となり、検出されるフラグメントの量は20％程度にまで減少する（レーン1, 5と比較）。
　これに対して、ARE1を欠失させたLDLR 3’UTR-(Δ-ARE1) を過剰発現させ、ActD処理を行った細胞（レーン4）では、ActD処理をしていない細胞（レーン3）に対する検出量の減少が顕著に抑制され、多量のLDLR 3’UTRフラグメントを検出することができた。
　これは、LDLR 3’UTR-(Δ-ARE1) を過剰発現させた細胞では、ActDによって新たなLDLR 3’UTRフラグメントの合成を阻害しても、ARE1を欠失させたことによってLDLR 3’UTRフラグメントの分解が抑制され、フラグメント量の減少が抑えられたことによるものと考えられた。
　以上のように、ARE1の欠失によってLDLR 3’UTRフラグメントの検出量が増加したことは、ARE1がLDLR mRNAの不安定化及び分解促進に関与していることを示すものであり、これはARE1に結合するZFP36L1及びZFP36L2の機能によるものであることが強く示唆された。
＜実施例５＞
５．ZFP36L1及びZFP36L2の発現抑制によるLDLRの発現制御実験
　実施例3の結果から、ZFP36L1及びZFP36L2が、LDLR mRNA 3’UTRに存在するARE1に結合し、LDLR mRNAの不安定化及び分解促進に機能しているものと考えられた。このことは、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制し、その機能を抑制することで、LDLR mRNAを安定化し、LDLRの発現量を増強できる可能性を示唆している。そこで、これを確認するため、RNAiを用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のLDLR発現量の変化について検討を行った。
５－（１）ZFP36L1及びZFP36L2の発現抑制
　Hela細胞を、6-well プレートに4.0×105 cells / wellで播種し、10%FBS 含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、siRNAをリポフェクション（Lipofectamine 2000, Cat.No.11668-019, Invitrogen）によって細胞にトランスフェクトした。siRNAを200pmolを100μlをOpti-MEMで希釈した。また、10μlのLipofectamine2000を100μlのOpti-MEMで希釈した。希釈後室温にて5分間静置し、siRNA希釈液とLipofectamine希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を6-well プレートの各ウェルに加えた。
　使用したsiRNAはInvitrogen社から購入した。ZFP36L1及びZFP36L2のそれぞれについて使用した3種類のsiRNAのCat.No.を「表2」に示す。比較のためのコントロールsiRNA7-9には、Stealth RNAiNegative Control  （Cat.No.12935-100, Invitrogen）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
５－（２）LDLRの発現量の評価
　トランスフェクション60時間後の細胞を回収し抽出したタンパク質を用いてウェスタンブロットを行い、LDLRの発現量を評価した。
　ウェスタンブロットの結果を「図6」に示す。図（A）上段にはLDLRの検出バンド、中段及び下段には比較のためβ-actinの検出バンドを示す。また、図（B）には、検出バンド濃度の定量値を、コントロールsiRNA7をトランスフェクトした細胞（図（A）中レーン1）を１とした相対比によって示す。
　コントロールsiRNA7～9をトランスフェクトした細胞に比べて、siRNA1～3のいずれかとsiRNA4～6のいずれかを組み合わせてトランスフェクトし、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した細胞では、LDLRの発現量が顕著に増強された。
　一方、β-actinについては、siRNA1～6をトランスフェクトしても、その発現量に有意な変化は認められなかった。
　以上のように、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を阻害するsiRNAのトランスフェクトによって、LDLR発現量を選択的に増強できることが明らかとなった。
　本実施例１～５の結果から、ZFP36L1及びZFP36L2がLDLR mRNA　3’UTRに存在する特定のARE（ARE1）に高い特異性をもって結合して、LDLR mRNAを不安定化し、分解を促進する機能を発揮していることが明らかになった。そして、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制することにより、このZFP36L1及びZFP36L2の機能発現を阻害して、LDLRの発現量を選択的に増強させ得ることが示された（図7参照）。
　今回、TTP（ZFP36）については詳細な検討を行っていないが、ZFP36ファミリーに関しては、TTP, ZFP36L1及びZFP36L2が共通してmRNAの不安定化・分解促進に機能していることが報告されていることから（上記非特許文献１参照）、ZFP36L1及びZFP36L2のみならず、TTPの発現抑制によっても、同様にLDLR発現量を増加させられるものと考えられた。
　本発明により、LDLRの発現量を増加させることが可能な新規なLDLR発現制御方法及び発現増強剤が提供される。
　この低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤を含有する医薬組成物は、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療するための医薬組成物として有用である。この医薬組成物を適用可能な高脂血症関連疾患としては、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌が挙げられる。
　本国際出願は、2008年3月4日に出願された日本国特許出願2008-052931に基づく優先権を主張するものであり、その全内容をここに参照して取り入れる。また、本特許出願で引用した先行刊行物及び特許の開示は全て本出願で参照して取り入れる。

Claims (10)

  1. 　低比重リポ蛋白質受容体の発現を制御するための方法であって、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることを特徴とする発現制御方法。
  2. 　ZFP36ファミリーの発現抑制によって、低比重リポ蛋白質受容体のmRNAを安定化することを特徴とする請求項１に記載の発現制御方法。
  3. 　RNA干渉又はアンチセンス法によってZFP36ファミリーの発現を抑制することを特徴とする請求項２に記載の発現制御方法。
  4. 　ZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNAから選択される１以上を含有する、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターを用いてZFP36ファミリーの発現を抑制することを特徴とする請求項３に記載の発現制御方法。
  5. 　配列番号１～６記載の塩基配列を有する低分子干渉性RNAを標的細胞内に導入し、ZFP36ファミリーの発現を抑制することにより、前記標的細胞における低比重リポ蛋白質受容体の発現量を増加させることを特徴とする請求項４に記載の発現制御方法。
  6. 　ZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNAから選択される１以上を含有する、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターを含有する低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤。
  7. 　前記低分子干渉性RNAが、配列番号１～６記載の塩基配列を有するものであることを特徴とする請求項６に記載の低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤。
  8. 　請求項6又は7に記載の低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤を含有する、高脂血症あるいは高脂血症関連疾患を予防、改善又は治療するための医薬組成物。
  9. 　前記疾患が、動脈硬化症、高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、糖尿病、肥満症、癌からなる群より選択される一以上の疾患であることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　低比重リポ蛋白質受容体発現増強剤製造のためZFP36ファミリーのmRNAに対するアンチセンス鎖、二本鎖RNA又は低分子干渉性RNA、若しくはこれらを発現可能な発現ベクターの使用。
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