WO2010090040A1 - 胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体 Download PDF

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cholangiocarcinoma
antibody
monoclonal antibody
cells
cca
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阪口薫雄
桑原一彦
荒木令江
坂本珠美
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Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope, characterized by being able to diagnose cholangiocarcinoma using patient serum and inhibiting the proliferation of cholangiocarcinoma cells. .
  • Monoclonal antibodies are widely used for early diagnosis of cancer, specific diagnosis, screening, and identification of molecular targets for cancer treatment. Recently, humanization of monoclonal antibodies has become feasible, and various humanized monoclonal antibodies have been used in the treatment of malignant tumors and autoimmune diseases (for example, CD3 (Orthoclone OKT3), glycoprotein IIb / IIIa receptor ( ReoPro), ERBB2 (Herceptin), CD20 (Rituxan), CD25 (Zenapax and Simulect), RSVgpF (Synagis), TNF- ⁇ (Remicade), and IL-6R).
  • CD3 Orthoclone OKT3
  • ReoPro glycoprotein IIb / IIIa receptor
  • ERBB2 Herceptin
  • CD20 Raritan and Simulect
  • RSVgpF Sesarcomaset alpha-1
  • TNF- ⁇ Remicade
  • IL-6R IL-6R
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Non-patent Document 2 Monoclonal antibodies can recognize any epitope on a glycoprotein, but the immune response is enhanced in peripheral lymphoid organs by the combination of T and B cells as proposed in the hapten-carrier model (Non-Patent Document 3). ). Antigen induces proliferation of antigen-specific B cells in the germinal center region of peripheral lymphoid organs (ie, spleen, lymph nodes, and Peyer's plaques).
  • Antigen-induced B cells undergo cell division and induce activation-induced cytidine deaminase AID through interaction with T cells that are specifically activated and surround the germinal center region (Non-patent Document 4).
  • B cells undergo somatic hypermutation of the immunoglobulin V region (Ig-V) gene by the action of AID causing transmutation from cytosine (C) to uridine (U) and guanine (G) to adenine (A). SHM), followed by G to A and A to G transmutation mutations by uracil DNA glycosylase (UNG) and an error-prone DNA polymerase (Non-patent Document 5).
  • Ig-V immunoglobulin V region
  • Non-Patent Document 6 This process of inducing Ig-V region SHM is dependent on T cells as affinity maturation of the IgV region in a T cell-dependent immune response.
  • Activation of T cells requires antigen-presenting cells such as dendritic cells and macrophages. These cells have the phagocytic action of foreign antigens, process the antigen and cleave it into small peptide pieces (10-12 amino acids), which ultimately result in the ⁇ and ⁇ chains of antigen-specific T cells. It is present in the class II molecule split of the major histocompatibility complex (MHC) for the T cell antigen receptor.
  • MHC major histocompatibility complex
  • T cell and B cell collaboration occurs for an antigen having an epitope of the B cell antigen receptor, allowing the T cell antigen receptor to be recognized.
  • antigen presenting cells do not present sugar epitopes on MHC class II molecules.
  • antigens do not elicit sufficient activation of T cells and cannot activate antigen-reactive B cell clones known as T cell-independent immune responses. Therefore, it is expected that a glycoprotein having a very large sugar chain part is very difficult to produce an excellent monoclonal antibody by a usual method.
  • GANP GC-associated nucleoprotein
  • SAC3 Saccharomyces mRNA transport molecule SAC3
  • MCM3-interaction / acetylated region Non-patent Document 9
  • RNA primase region Non-patent Document 10
  • Non-patent Document 11 Due to GANP deficiency, when immunized with T cell-dependent antigen (TD-Ag), a serious deficiency occurred in the generation of SHM in the Ig-V region (Non-patent Document 11).
  • GANP TG mice overexpression of GANP in mice (GANP TG mice) induced an increase in antibody SHM and affinity maturation (12).
  • GANP TG mice are useful as a system for generating high affinity monoclonal antibodies against peptide antigens under a T cell-dependent immune response.
  • Blood 95 (7) Blood 95 (7) -2328, 2000 Fischer, T., Straser, K., Racz, A., Rodriguez-Navarro, S., Oppizzi, M., Toochner, J. & Hurt, E.
  • the mRNA export machinery requires the no-veloc Thp1p complex to dock at the nucleoplasmic entrance of the nuclear pores.
  • EMBO J. 21 (21): 5843-5852, 2002 Takei, Y., Swietlik, M., Tanoue, A., Tsujimoto, G., Kouzarides, T. & Laskey, R. MCM3AP, a novel acetyltransferaseAPthat acetylates replication protein MCM3.
  • GNP Germinal center-associated nuclear protein
  • the present invention provides a novel monoclonal antibody that recognizes a bile duct cancer-specific sugar chain epitope in mucin MUC5AC and can detect MUC5AC specifically in cholangiocarcinoma serum. It was.
  • the present invention further includes a hybridoma producing the monoclonal antibody, a method for producing the monoclonal antibody, a diagnostic agent for cholangiocarcinoma containing the monoclonal antibody, a medicament for inhibiting and / or treating cholangiocarcinoma containing the monoclonal antibody, and It was an object to be solved to provide a method for detecting cholangiocarcinoma using the above monoclonal antibody.
  • the present inventors obtained an efficient and specific monoclonal antibody that recognizes a sugar chain epitope appearing on a glycoprotein having a large sugar chain region, using a GANP transgenic mouse (GANP TG mouse).
  • GANP TG mice were immunized with cholangiocarcinoma (CCA), and a monoclonal antibody that recognizes the sugar chain epitope of MUC5AC applicable for pharmaceutical purposes was obtained.
  • CCA cholangiocarcinoma
  • Cholangiocarcinoma is known to develop after hepatic dystomosis in northeastern Thailand and after prolonged inflammation due to sclerosing cholangitis (Sripa, B., Kaewkes, S., Sithithaworn, P., Mairiang, E., Laha, T., Smout, M., Pairojkul, C., Bhudhisawasdi, V., Tesana, S., Thinkamrop, B., Bethony, JM, Loukas, A., Brindley , PJ Liver fluke induces cholangiocarcinoma.
  • MUC5AC is known to increase in the serum of CCA patients, but many anti-MUC5AC monoclonal antibodies are specific for the polypeptide portion of MUC5AC, and their affinity is higher in cancer patients with serum ELISA Not enough to find with sensitivity and specificity. Therefore, it was necessary to obtain a high affinity monoclonal antibody that detects the level of cancer-specific MUC5AC in the serum of CCA patients.
  • AS1 and AS2 Monoclonal antibodies against AS1 and AS2 inhibited CCA cell proliferation in vitro.
  • AS1 and AS2 epitopes are useful for definitive clinical diagnosis using patient sera and are applicable to antibody therapy.
  • AS1 and AS2 epitopes are also useful as molecular targets for drug design. The present invention has been completed based on these findings.
  • a monoclonal antibody that recognizes a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope of mucin MUC5AC in cholangiocarcinoma cells (2) Recognizes mucin MUC5AC in the serum of patients with cholangiocarcinoma but does not recognize mucin MUC5AC in the serum of healthy subjects, gastric cancer patients, pancreatic cancer patients, colon cancer patients and lung cancer patients, antibody. (3) The monoclonal antibody according to (1) or (2), which has an activity of inhibiting the growth of cholangiocarcinoma cells.
  • Collect antibody-producing cells from a GANP gene-transfected transgenic non-human mammal administered with an extract of cholangiocarcinoma tumor tissue, and select antibody-producing cells that produce antibodies reactive with cholangiocarcinoma tumor tissue The method for producing a monoclonal antibody according to any one of (1) to (5), further comprising producing the antibody in a selected antibody-producing cell.
  • a diagnostic agent for bile duct cancer comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (5).
  • a medicament for suppressing and / or treating bile duct cancer, comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (5).
  • the monoclonal antibody according to any one of (1) to (5) is contacted with a sample derived from a subject, and the presence or absence of a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope of mucin MUC5AC in the sample is detected.
  • a method for detecting cholangiocarcinoma (11) The method for detecting bile duct cancer according to (10), wherein the subject-derived sample is serum or plasma.
  • the monoclonal antibody of the present invention recognizes a bile duct cancer-specific sugar chain epitope in mucin MUC5AC, and can detect MUC5AC specifically in the bile duct cancer patient's serum.
  • the monoclonal antibody of the present invention is useful as a diagnostic agent for cholangiocarcinoma and a medicament for suppressing and / or treating cholangiocarcinoma.
  • FIG. 1 shows an outline of establishment of monoclonal antibodies against CCA cells.
  • FIG. 2 shows the detection of tumor associated antigens in patient samples using monoclonal antibodies.
  • FIG. 3 shows an overview of a typical screening for antibodies.
  • FIG. 4 shows an overview of a sandwich ELISA for identifying cancer-specific epitopes on glycoproteins.
  • FIG. 5 shows the results of the sandwich ELISA.
  • FIG. 6 shows the results of a sandwich ELISA comparing CCA with other cancers.
  • FIG. 7 shows the results of examining the reactivity with individual serum samples by sandwich ELISA.
  • FIG. 8 shows the results of examining the specificity of monoclonal antibodies by immunohistochemistry using CCA tumor clinical samples.
  • FIG. 9 shows the results of examining the specificity of monoclonal antibodies by immunohistochemistry using CCA tumor clinical samples.
  • FIG. 10 shows the results of examining the molecular size of AS1 and AS2 antigens in pooled serum of CCA patients compared to normal serum.
  • FIG. 11 shows the results of identifying AS1 and AS2 using Alb / IgG-depleted serum.
  • FIG. 12 shows the results of identifying AS1 and AS2 using immunoprecipitation.
  • FIG. 13 shows the results of identifying AS1 and AS2 using the immunochromatography method.
  • FIG. 14 shows the results of AS1-CCA mass spectrometry.
  • FIG. 15 shows the results of AS1-CCA mass spectrometry.
  • FIG. 16 shows the results of AS2-CCA mass spectrometry.
  • FIG. 17 shows the results of AS2-CCA mass spectrometry.
  • FIG. 18 shows the results of AS2-CCA mass spectrometry.
  • FIG. 19 shows the results of identifying AS1 and AS2 using the immunochromatography method.
  • FIG. 20 shows an overview of immunoprecipitation of AS1, AS2, and MUC5AC.
  • FIG. 21 shows the immunoprecipitation of AS1, AS2, and MUC5AC detected with AS1.
  • FIG. 22 shows AS1 and AS2 characterization (epitope).
  • FIG. 23 shows enzymatic deglycosylation of patient serum treated with AS1.
  • FIG. 24 shows enzymatically deglycosylated M213A SFM treated with AS1.
  • FIG. 25 shows the prediction of AS1 antigen location.
  • FIG. 26 shows the prediction of AS1 antigen location.
  • FIG. 27 shows the structure of the core O-linked glycan.
  • FIG. 28 shows the in vitro effects of AS1 and AS2 on the growth of the M055 CCA cell line.
  • FIG. 29 shows the in vitro effects of AS1 and AS2 on the growth of M055 CCA cell line.
  • a ganp gene transgenic mouse (GANP TG mice: PCT / JP2003 / 014221 (WO 2004/040971)) that produces a high-affinity monoclonal antibody against a T cell-dependent antigen (TD-Ag) is used. They succeeded in establishing a monoclonal antibody that recognizes a cancer-specific epitope on the sugar chain component of glycoprotein in cholangiocarcinoma.
  • Surgically excised extracts of CCA samples were immunized into GANP TG mice, spleen cells were fused with X63 myeloma cells using polyethylene glycol and combined with thymic feeder cells in the presence of IL-6 in 96-well culture plates Incubated in medium. After selection of IMDM medium with HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine), the supernatants of the growing clones were screened by ELISA using CCA extracts. Positive clones were further screened by immunostaining on cell lines. After cloning again, monoclonal antibodies designated AS1 and AS2 were selected as specific monoclonal antibodies against CCA cells.
  • the specificity of the monoclonal antibody was further investigated by immunohistochemical staining on clinical CCA tumor samples.
  • the monoclonal antibody AS1 specifically and strongly stained the whole tumor cell, and the monoclonal antibody AS2 selectively stained the tip region of the tumor cell. Neither antibody stained surrounding non-tumor cells or the tissues of the CCA patients tested.
  • monoclonal antibodies AS1 and AS2 recognized antigens in the pooled serum of CCA patients, but in pooled sera of healthy subjects, stomach cancer, pancreatic cancer, colon cancer and lung cancer. The antigen was not recognized.
  • the AS1 antigen is positive in about 54% of CCA cases, and the AS2 antigen is positive in about 27% of CCA cases, but the positive rate is very low in other malignant tumors and healthy cases.
  • Western blot analysis using sera from CCA patients showed that both monoclonal antibodies AS1 and AS2 recognize approximately 220-kDa broadband.
  • Proteomic analysis determined the target molecule containing the peptide backbone of MUC5AC. Further analysis by treatment with multiple glycosylation enzymes revealed that monoclonal antibodies AS1 and AS2 recognize different portions of the MUC5AC sugar chain secreted from CCA cells.
  • both monoclonal antibodies were found to inhibit cell growth of CCA cell lines expressing AS1 and AS2 epitopes on MUC5AC.
  • These findings indicate that tumor-specific modifications occur in the sugar chain component of MUC5AC in CCA cells, and the two monoclonal antibodies AS1 and AS2 of the present invention recognize these epitopes.
  • the tumor-specific monoclonal antibody of the present invention is useful for elucidation of a tumor-specific antigen epitope and application of cancer therapy as an antibody drug.
  • Monoclonal antibody of the present invention and production method thereof As an antigen for producing the monoclonal antibody of the present invention, a tumor tissue of bile duct cancer or an extract thereof is used.
  • a tumor tissue of cholangiocarcinoma a tissue surgically excised from a patient with cholangiocarcinoma can be used.
  • an extract for example, a supernatant obtained by homogenizing a collected tumor tissue in a buffer solution such as PBS Can be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention means the whole antibody molecule or a fragment thereof (for example, Fab or F (ab ′) 2 fragment) capable of recognizing and binding to a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope of mucin MUC5AC in cholangiocarcinoma cells. .
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced by various methods. Methods for producing such antibodies are well known in the art [see, eg, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • the monoclonal antibody of the present invention may be a human antibody or a human antibody.
  • the human antibody is, for example, a mouse-human chimeric antibody
  • the antibody gene is isolated from the mouse cell producing the monoclonal antibody of the present invention, and its H chain constant region is recombined with the human IgE H chain constant region gene. It can be prepared by introducing into myeloma cells.
  • human antibodies can be prepared by immunizing mice in which the immune system is replaced with humans with cholangiocarcinoma tumor tissue or an extract thereof as an antigen.
  • a tumor tissue of cholangiocarcinoma or an extract thereof is administered as an antigen to a mammal such as a rat, mouse, rabbit or the like.
  • the antigen can be administered to a transgenic non-human mammal into which a GANP gene has been introduced (for example, a transgenic mouse into which a GANP gene has been introduced).
  • TD-Ag T cell-dependent antigen
  • the ganp gene transgenic mouse is known and can be prepared by the method described in PCT / JP2003 / 014221 (WO 2004/040971), for example.
  • the dose of antigen per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (CFA), Freund's incomplete adjuvant (IFA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • CFA complete adjuvant
  • IFA incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • antibody-producing cells are collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days after the last immunization day.
  • Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred.
  • myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3X63-Ag.8.U1 (P3U1) and NS-I.
  • the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused.
  • Cell fusion is performed in animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI-1640 medium, etc., and 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 cells / ml of antibody-producing cells and 2 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 cells / ml of myeloma cells.
  • a cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 5: 1), and a fusion reaction is carried out in the presence of a cell fusion promoter.
  • the cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • a method after appropriately diluting the cell suspension with, for example, RPMI-1640 medium containing fetal bovine serum, sprinkle 3 ⁇ 10 5 cells / well on a microtiter plate, add selective medium to each well, and then select appropriately. Cultivate by changing the medium. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by enzyme immunoassay (such as ELISA), radioimmunoassay, immunohistochemical analysis, or the like. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally, a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell can be established.
  • enzyme immunoassay such as ELISA
  • radioimmunoassay radioimmunoassay
  • immunohistochemical analysis or the like.
  • Hybridomas AS1 and AS2 have been obtained as hybridomas producing the monoclonal antibodies AS1 and AS2 of the present invention.
  • Hybridoma AS1 (indication for identification: Mouse-mouse hybridomas AS1) and hybridoma AS2 (indication for identification: Mouse-mouse hybridomas AS2) have receipt number FERM AP-21750 (accession number FERM P-21750) and receipt, respectively.
  • No. FERM AP-21751 Accession number FERM P-21751 As of December 17, 2008, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) It is deposited at the address No. 1 Chuo No. 6 (zip code 305-8666).
  • hybridomas AS1 and AS2 with the accession number FERM P-21750 and the accession number FERM P-21717 are dated December 14, 2009, respectively, under the Budapest Treaty as the accession number FERM BP-11204 or the accession number FERM BP-11205. It has been transferred to an international deposit.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration).
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration).
  • hybridomas In the case of the ascites formation method, about 1 ⁇ 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and a homologous animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites are collected after 1-2 weeks.
  • known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.
  • a diagnostic agent for bile duct cancer comprising the monoclonal antibody of the present invention, and a pharmaceutical agent for suppressing and / or treating bile duct cancer
  • the monoclonal antibody of the present invention suppresses and / or suppresses a diagnostic agent for bile duct cancer and bile duct cancer. Or it can be used as a medicament for treatment.
  • the diagnostic agent and medicament of the present invention include a pharmaceutically acceptable carrier and an excipient as necessary.
  • An agent, a diluent and the like can be appropriately contained.
  • As a medicament for suppressing and / or treating cholangiocarcinoma it can be formulated, for example, as an injection.
  • the dose of the drug for suppressing and / or treating cholangiocarcinoma depends on the symptom of the patient, age and body weight, administration method, etc., and the weight of the antibody as the active ingredient is usually about 10 ng to about The range is 100 mg / kg body weight.
  • the monoclonal antibody of the present invention that recognizes a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope of mucin MUC5AC in a cholangiocarcinoma cell, a sample derived from a subject, Can be detected by detecting the presence or absence of a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope of mucin MUC5AC in the sample.
  • the subject-derived sample used in the present invention includes tissue, serum, plasma, saliva, urine and the like obtained from the subject, with serum or plasma being particularly preferred.
  • the contact between the subject-derived sample and the antibody is not particularly limited, and may be carried out based on a method commonly used in this field.
  • For detection for example, after contacting the sample with the above antibody, specific binding of the mucin MUC5AC to an antibody against a cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope that may be present in the sample is labeled with a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme, etc.
  • the detection can be performed quantitatively using a secondary antibody or the like.
  • the reaction for detection / diagnosis may be performed in a liquid phase such as a well, or may be performed on a solid support on which an antibody is immobilized.
  • the measured value is positive as cholangiocarcinoma by comparing with a standard value prepared in advance using a normal sample not affected by cholangiocarcinoma or a sample known to be cholangiocarcinoma. It can be determined whether or not there is.
  • the cut-off value can be set by measuring the amount of the cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope of mucin MUC5AC in the serum or plasma of many patients with bile duct cancer and healthy individuals.
  • a method for detecting the presence or absence of mucin MUC5AC cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope in a sample using the monoclonal antibody of the present invention include enzyme immunoassay (EIA) such as sandwich ELISA, or radioactive These techniques are well known to those skilled in the art, such as immunoassay (RIA).
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA immunoassay
  • an enzyme, a radioisotope, a fluorescent compound, a chemiluminescent compound, or the like may be appropriately selected according to the measurement method.
  • the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase and the like.
  • the detection sensitivity of the labeling substance can be improved.
  • the radioactive isotope include 125I
  • examples of the fluorescent compound include fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC).
  • examples of chemiluminescent compounds include lophine, luminol, and lucigenin. Labeling of the antibody with the labeling substance can be performed according to a conventional method. Hereinafter, a labeled immunoassay method using a labeled antibody and an ELISA method will be described.
  • a measurement system for detecting the antibody of the present invention by a labeled immunoassay can be constructed using a non-competitive reaction system or a competitive reaction system.
  • a solid phase is required (solid phase method).
  • a competitive reaction system it is not always necessary to use a solid phase (liquid phase method), but it is preferable to use a solid phase because the measurement operation is simple.
  • the solid phase material include polystyrene, nylon, glass, silicon rubber, and cellulose.
  • Examples of the solid phase shape include a spherical shape, a well shape, a tube shape, and a sheet shape, but are not limited thereto.
  • a publicly known one used for labeled immunoassay can be arbitrarily used.
  • the antigen to be detected (a sample that may contain a mucin MUC5AC cholangiocarcinoma-specific sugar chain epitope) is immobilized and then reacted with the antibody of the present invention. Then, a prelabeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) is added to react with the antibody reacting with the immobilized antigen. By this secondary antibody labeling, the amount of antibody bound to the antigen can be detected. Since the detected amount of label is positively correlated with the amount of antigen to be detected, the amount of antigen can be determined from this.
  • an anti-immunoglobulin antibody secondary antibody
  • an anti-IgG antibody an anti-IgM antibody, etc.
  • antibody molecules may be used as they are, or Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, which are antibody fragments containing an antigen binding site obtained by enzymatic treatment of an antibody, may be used.
  • a substance having a specific affinity for the antibody molecule for example, protein A having a specific affinity for IgG may be used.
  • the labeled immunoassay include an immunoassay using an enzyme as a label and an ELISA method.
  • a specimen or a diluted solution thereof is placed in a 96-well plate, and left at 4 ° C. to room temperature overnight or at 37 ° C. for about 1 to 3 hours to adsorb the sample to be detected and adsorbed to the solid phase.
  • the antibody of the present invention is reacted, and then an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) conjugated with an enzyme in advance is reacted.
  • an appropriate chromogenic substrate that reacts with the enzyme for example, p-nitrophenyl phosphate if the enzyme is phosphatase
  • the antibody can be detected by this color development.
  • Bile Duct Cancer Samples Surgically excised samples were obtained from 100 patients with intrahepatic CCA approved at Srinagarind Hospital, Khon Kaen University, Thailand. Informed consent was obtained from all patients who participated in a project approved by the Human Research Ethics Committee at Khon Kaen University. Data including age, gender, histological grade, and involvement of lymph nodes, blood vessels and peri-neurons retrospectively based on medical records and pathology records from Khon Kaen University's Center for Liver Dystoma and Cholangiocarcinoma It was.
  • Immortalized human bile duct cells MMNK-1 (Maruyama, M., Kobayashi, N., Westerman, KA, Sakaguchi, M., Allain, JE, Totsugawa, T., Okitsu, T., Fukazawa, T., Weber, A., Stolz, DB, Leboulch, P. & Tanaka, N.
  • the breast cancer cell line MCF7 was maintained with RPMI-1640.
  • a novel nuclear phosphoprotein, GANP is up-regulated in centrocytes of the germinal center and associated with MCM3, a protein essential for DNA replication.
  • Mice with higher antibody titer were further immunized, and after 3 days, spleen cells were collected and fused with mouse myeloma cell line X63 by the standard polyethylene glycol method (Kuwahara, K., Tomiyasu, S., Fujimura). , S., Nomura, K., Xing, Y., Nishiyama, N., Ogawa, M., Imajoh-Ohmi, S., Izuta, S.
  • GNP Germinal center-associated nuclear protein
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB horseradish peroxidase
  • the gel was transferred to a transfer buffer [40 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20 mM sodium acetate, 2 mM EDTA, 20% (v / v) methanol and 0.05% SDS] After 15 minutes pre-equilibration in the protein, the proteins in the gel were electrotransferred to a nitrocellulose membrane. Membranes were blocked overnight at 4 ° C. with 1% (w / v) non-fat dry milk (PBS-T). The blot was incubated with primary antibody (established monoclonal antibody) for 1 hour at room temperature. HRP-conjugated goat anti-mouse IgM was used as a secondary antibody. Protein expression was detected with the Enhanced ChemiLuminescence kit (GE Healthcare).
  • GE Healthcare Enhanced ChemiLuminescence kit
  • Degraded peptides were dried, resolved with 2% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid and desalted with ZipTip (Millipore, Billerica, Mass.). Samples were repeatedly dried, resolved with 2% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid and subjected to liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC / MS / MS). Known contamination peaks such as keratin and self-photolysis peaks were removed. LC / MS / MS results were compared with the NCBI database.
  • Germinal center-associated nuclear protein has a phosphorylation-dependent DNA-primase activity that is up-regulated in germinal center regions.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (18): 10279-10283, 2001) and fused with myeloma cell line X63 using polyethylene glycol. After selection in HAT medium, monoclonal antibodies against CCA cells were first selected by indirect ELISA using 96 well microculture plates pretreated with CCA extract (FIG. 1). Three independent fusions with myeloma cell lines further screened by ELISA using patient sera and immunohistochemical analysis on tissue sections, and the strategy shown in FIG. I found it.
  • FERM AP-21715 (Accession No. FERM P-21715) as of December 17, 2008 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan) It is deposited in 1st, 1-chome Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan (zip code 305-8565).
  • a sandwich ELISA as shown in FIG. 4 was used. Microtiter plates were coated with soy agglutinin and pooled serum from CCA patients was applied. Monoclonal antibodies were screened using HRP-conjugated goat anti-mouse Ig antibody secondary antibody reagents to detect the presence of antigen in patient sera. The reactivity was measured by optical density at 450 nm (optical density: OD). Specificity was determined by subtracting the background OD. The reactivity with pooled serum is shown in FIG. Monoclonal antibody AS1 specifically reacted with pooled serum from CCA patients, but not with normal serum.
  • Monoclonal antibody AS2 had higher background reactivity against normal serum and blank samples, but was more reactive against CCA serum.
  • Monoclonal antibodies AS1 and AS2 were tested for reactivity using normal, CCA, liver cancer, pancreas, stomach, colon and benign tumors (FIG. 6).
  • Monoclonal antibody AS1 was very specific for CCA serum.
  • the monoclonal antibody AS2 is selective for CCA serum while showing higher background with other serum samples. A part of the result of examining the reactivity with each serum sample is shown in FIG. In terms of overall reactivity with 100 CCA serum samples, AS1 was positive in 54% of CCA serum and AS2 was positive in 27%.
  • affinity chromatography columns were prepared using AS1 and AS2 binding Sepharose beads. After the AS1 and AS2 antigens in CCA patient serum were purified in two steps, the antigens were subjected to mass spectrometry (FIG. 13). AS1 was hit with the peptide sequence of MUC5AC glycoprotein (FIGS. 14 and 15). AS2 hit with a high score against the peptide sequence of MUC5AC and multiple peptide sequences (FIGS. 16, 17, and 18). These results indicate that AS1 and AS2 recognize different epitopes of the large molecular size glycoprotein of 220-kDa. This glycoprotein was determined to be MUC5AC and MUC6 by mass spectrometry (FIG. 19).
  • the culture supernatant of M213A had low reactivity with the monoclonal antibody AS1. This was confirmed by immunoprecipitation and Western blot analysis of M213A cells. Monoclonal antibody AS1 was specific for M213 CCA tumor cells. Monoclonal antibody AS2 showed a Western blot profile similar to that when reacted with monoclonal antibody AS1, indicating that monoclonal antibody AS1 recognizes a different epitope of AS2 antigen, ie MUC5AC. A similar experiment was attempted using a commercially available anti-MUC5AC antibody.
  • the two monoclonal antibodies of the present invention were prepared by immunoprecipitation, Western blot analysis and ELISA. Showed strong reactivity to the MUC5AC antigen.
  • the antigenic epitope of AS1 is a sugar structure coated with sialic acid, and a part of this sugar structure can be cleaved with ⁇ -galactosidase, N-acetylglucosamidase, and O-glycanase (FIG. 25).
  • the antigenic epitope of AS1 is the sugar region, some of which is linked to Gal ⁇ (1-4) bonds.
  • GlcNAc ⁇ (1-6) has the former linked to the protein center of high molecular weight glycoprotein (MUC5AC) by O-bonding (see FIG. 27).
  • MUC5AC protein center of high molecular weight glycoprotein
  • the antigenic epitope of AS2 is presumed to be in the sugar component, most of which is linked to Gal ⁇ (1-4) bonds, which are linked to the polypeptide backbone of the high molecular weight glycoprotein (MUC5AC) by O-linkages. They are connected (FIGS. 26 and 27).
  • Epitopes specific or selective for cancer in glycoprotein sugar chains are useful as targets for drug delivery and antibody therapy. As shown in FIGS. 28 and 29, monoclonal antibodies AS1 and AS2 inhibited the growth of CCA cell lines in vitro. This result indicates that this sugar chain epitope can be a target for medical treatment.
  • the method for producing a monoclonal antibody of the present invention is an efficient method for producing a specific monoclonal antibody against a sugar chain epitope, which has been difficult to produce by conventional techniques. Screening focused on the establishment of monoclonal antibodies against glycoproteins revealed that most of the specific epitopes were in the sugar chain region of MUC5AC. GANP TG mice were able to produce antibodies against cancer-specific carbohydrate epitopes with high efficiency.
  • Monoclonal antibodies AS1 and AS2 are useful for studying cancer-specific epitopes and are excellent probes for identifying cancer-specific epitopes in various glycoproteins.
  • the information of the monoclonal antibody of the present invention can also be applied to design a tertiary structure molecular probe based on the crystal information of the antigen binding site created by the heavy and light chain Ig-V regions.

Abstract

　本発明の目的は、ムチンMUC5ACにおける胆管癌特異的な糖鎖エピトープを認識し、胆管癌患者の血清において胆管癌特異的にMUC5ACを検出することができる新規なモノクローナル抗体を提供することである。本発明によれば、胆管癌細胞におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体が提供される。

Description

胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体
　本発明は、胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体に関する。より詳細には、本発明は、患者血清を用いて胆管癌を診断することができ、かつ胆管癌細胞の増殖を阻害できることを特徴とする、胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体に関する。
　モノクローナル抗体 は、癌の早期診断、特異的診断、スクリーニング、及び癌治療の分子標的の同定のために広く使用されている。最近、モノクローナル抗体のヒト化が実現可能となり、各種のヒト化モノクローナル抗体が、悪性腫瘍や自己免疫疾患の治療において使用されている（例えば、CD3 (Orthoclone OKT3)、糖タンパクIIb/IIIa受容体 (ReoPro), ERBB2 (Herceptin), CD20 (Rituxan), CD25 (Zenapax and Simulect), RSVgpF (Synagis), TNF-α(Remicade), 及びIL-6Rなど）。モノクローナル抗体の応用のためには、各種腫瘍の癌特異的抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を樹立することが必要である。抗体の特異性は、モノクローナル抗体の臨床応用にとって重要な問題である。癌細胞の表面や癌患者の血清中に特異的に発現する新規分子を同定するために多くの研究がなされているが、それらの多くは、癌特異的マーカーと思われる分子やエピトープを効率的に同定するものではない（非特許文献１）
　プロテオミクス研究により、癌細胞では糖タンパク質の糖鎖の発現に変動が生じ、糖鎖領域上のエピトープが臨床診断や薬剤治療の分子標的の候補となり得ることが示されている（非特許文献２）。モノクローナル抗体は糖タンパク質上の任意のエピトープを認識できるが、免疫応答は、ハプテン－キャリアモデルで提唱されているようにＴ細胞とＢ細胞の共同によって末梢リンパ器官で増強される（非特許文献３）。抗原は、末梢リンパ器官（即ち、脾臓、リンパ節、及びパイアー斑）の胚中心領域において抗原特異的Ｂ細胞の増殖を誘導する。抗原誘導されたＢ細胞は細胞分裂を経て、特異的に活性化されて胚中心領域を包囲しているＴ細胞との相互作用を通じて活性化誘導シチジンデアミナーゼAIDを誘導する（非特許文献４）。Ｂ細胞は、シトシン(Ｃ)からウリジン（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への転位変異を起こすAIDの作用により免疫グロブリンＶ領域（Ig-V）遺伝子の体細胞超変異（ＳＨＭ）を受け、その後、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG）と変異性（error-prone）DNAポリメラーゼによって、ＧからＡ、及びＡからＧへのトランスバーション変異を受ける（非特許文献５）。Ig-V領域のＳＨＭを誘導するこのプロセスは、Ｔ細胞依存性免疫応答においてIgV領域の親和性成熟としてＴ細胞に依存している（非特許文献６）。Ｔ細胞の活性化には、樹状細胞やマクロファージのような抗原提示細胞が必要である。これらの細胞は、外来抗原の食細胞作用を有し、抗原を処理して小さなペプチド片（１０～１２アミノ酸）に切断し、それらは最終的に、抗原特異的Ｔ細胞のα及びβ鎖のＴ細胞抗原受容体に対する主要組織適合性抗原複合体（MHC）のクラスII分子の割れ目に存在する。最も効率的なＴ細胞とＢ細胞の共同がＢ細胞抗原受容体のエピトープを有する抗原に対して起こり、Ｔ細胞抗原受容体が認識できるようになる。しかし、特に非常に大きな糖鎖部分を有する糖タンパク質抗原の場合、抗原提示細胞は、MHCクラスII分子上に糖エピトープを提示しない。従って、そのような抗原はＴ細胞の十分な活性化を喚起せず、Ｔ細胞に依存しない免疫応答として知られる抗原反応性Ｂ細胞クローンを活性化できない。従って、非常に大きな糖鎖部分を有する糖タンパク質は、通常の方法では優れたモノクローナル抗体を作ることは非常に困難であることが予想される。
　以前に、本発明者らは、免疫応答中にGCのB細胞で選択的に上昇するGC関連核タンパク質（GANP）を命名される分子を同定した（非特許文献７）。GANPは210-kDaの核タンパク質であり、Saccharomyces mRNA輸送分子SAC3（非特許文献８）、MCM3-相互作用／アセチル化領域（非特許文献９）、及びRNAプライマーゼ領域(非特許文献１０)と構造が類似している。GANPの欠損により、T細胞依存性抗原（TD-Ag）で免疫した際、Ig-V領域のSHMの生成に重大な欠損が生じた (非特許文献１１)。対照的に、マウスでGANPを過剰発現すると (GANPTGマウス)、抗体のSHMと親和性成熟の増大が誘導された（非特許文献１２）。GANPTG マウスは、モデルハプテン抗原エピトープであるニトロフェニル（非特許文献１３）、及びHIVのV3ループ上のNL4-3ペプチドエピトープ（非特許文献１４）に対する親和性が２倍高いモノクローナル抗体（KD = 1.1 x 10-11 M）を生成した。GANPの作用は、ニワトリDT40細胞及びDaudiヒトＢ細胞株でインビトロで培養した細胞株によって確認した。GANPTG マウスは、Ｔ細胞依存性免疫応答の下でペプチド抗原に対する高親和性モノクローナル抗体を作成するためのシステムとして有用である。
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　本発明は、ムチンMUC5ACにおける胆管癌特異的な糖鎖エピトープを認識し、胆管癌患者の血清において胆管癌特異的にMUC5ACを検出することができる新規なモノクローナル抗体を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、上記モノクローナル抗体の製造方法、上記モノクローナル抗体を含む胆管癌の診断薬、上記モノクローナル抗体を含む胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬、並びに上記モノクローナル抗体を用いた胆管癌の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らはGANPトランスジェニックマウス（GANPTG マウス）を用いて、大きな糖鎖領域を有する糖タンパク質上に現れる糖鎖エピトープを認識する効率的かつ特異的なモノクローナル抗体を得た。GANPTGマウスを胆管癌（CCA）で免疫し、医薬目的に適用可能なMUC5ACの糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体を取得した。胆管癌（CCA）は、タイ北東部で肝臓ジストマ病の後に発症すること、そして硬化性胆管炎による長期の炎症後にも発症することが知られている（Sripa, B., Kaewkes, S., Sithithaworn, P., Mairiang, E., Laha, T., Smout, M., Pairojkul, C., Bhudhisawasdi, V., Tesana, S., Thinkamrop, B., Bethony, J.M., Loukas, A., Brindley, P.J.  Liver fluke induces cholangiocarcinoma.  PLoS Med.  4(7):e201, 2007）。MUC5AC は、CCA患者の血清中で増加することが知られているが、多くの抗MUC5ACモノクローナル抗体はMUC5ACのポリペプチド部分に特異的であり、その親和性は、血清のELISAで癌患者を高い感度と特異性で見つけるためには不十分である。従って、CCA患者の血清で癌特異的MUC5ACのレベルを検出する高親和性モノクローナル抗体を入手する必要があった。スクリーニング後、本発明者らは、CCA細胞の糖タンパク質に対する複数のモノクローナル抗体を取得した。これらの抗体は、AS1及びAS2と命名した２つのエピトープに特異的であった。AS1及びAS2エピトープは、CCA症例の大部分から分泌・発現される大きな糖鎖領域を有する糖タンパク質上に検出された。AS1及びAS2エピトープの発現は、CCAに特異的である。AS1及びAS2に対するモノクローナル抗体は、CCA細胞の増殖をインビトロで阻害した。AS1及びAS2エピトープは、患者血清を用いた確定臨床診断に有用であり、抗体療法に適用可能である。AS1及びAS2エピトープはまた、薬剤設計のための分子標的としても有用である。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）　胆管癌細胞におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体。
（２）　胆管癌患者の血清中のムチンMUC5ACを認識するが、健常者、胃癌患者、膵臓癌患者、結腸癌患者及び肺癌患者の血清中のムチンMUC5ACを認識しない、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）　胆管癌細胞の増殖阻害作用を有する、（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）　胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物を投与したＧＡＮＰ遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を回収し、胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物と反応性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選別し、選別された抗体産生細胞に抗体を産生させることにより得られる、（１）から（３）の何れかに記載のモノクローナル抗体。
（５）　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
（６）　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５を有するハイブリドーマ。
（７）　胆管癌の腫瘍組織の抽出物を投与したＧＡＮＰ遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を回収し、胆管癌の腫瘍組織と反応性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選別し、選別された抗体産生細胞に抗体を産生させることを含む、（１）から（５）の何れかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（８）　（１）から（５）の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、胆管癌の診断薬。
（９）　（１）から（５）の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬。
（１０）　（１）から（５）の何れかに記載のモノクローナル抗体と被験者由来の試料とを接触させて、該試料中におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープの存在の有無を検出することを含む、胆管癌の検出方法。
（１１）　被験者由来の試料が血清又は血漿である、（１０）に記載の胆管癌の検出方法。
　本発明のモノクローナル抗体は、ムチンMUC5ACにおける胆管癌特異的な糖鎖エピトープを認識し、胆管癌患者の血清において胆管癌特異的にMUC5ACを検出することができる。本発明のモノクローナル抗体は、胆管癌の診断薬、並びに胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬として有用である。
図１は、ＣＣＡ細胞に対するモノクローナル抗体の樹立の概要を示す。 図２は、モノクローナル抗体を用いた患者試料中の腫瘍関連抗原の検出を示す。 図３は、抗体の典型的スクリーニングの概要を示す。 図４は、糖タンパク質上の癌特異的エピトープを同定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの概要を示す。 図５は、サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。 図６は、ＣＣＡと他の癌を比較するサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。 図７は、個々の血清試料との反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡで調べた結果を示す。 図８は、モノクローナル抗体の特異性をＣＣＡ腫瘍臨床試料を用いて免疫組織化学により調べた結果を示す。 図９は、モノクローナル抗体の特異性をＣＣＡ腫瘍臨床試料を用いて免疫組織化学により調べた結果を示す。 図１０は、ＣＣＡ患者のプールした血清中のＡＳ１及びＡＳ２抗原の分子の大きさを通常血清と比較して調べた結果を示す。 図１１は、Ａｌｂ／ＩｇＧ除去血清を用いてＡＳ１及びＡＳ２を同定した結果を示す。 図１２は、免疫沈降法を用いてＡＳ１及びＡＳ２を同定した結果を示す。 図１３は、イムノクロマトグラフィー法を用いてＡＳ１及びＡＳ２を同定した結果を示す。 図１４は、ＡＳ１－ＣＣＡ質量分析の結果を示す。 図１５は、ＡＳ１－ＣＣＡ質量分析の結果を示す。 図１６は、ＡＳ２－ＣＣＡ質量分析の結果を示す。 図１７は、ＡＳ２－ＣＣＡ質量分析の結果を示す。 図１８は、ＡＳ２－ＣＣＡ質量分析の結果を示す。 図１９は、イムノクロマトグラフィー法を用いてＡＳ１及びＡＳ２を同定した結果を示す。 図２０は、ＡＳ１、ＡＳ２、ＭＵＣ５ＡＣの免疫沈降の概要を示す。 図２１は、ＡＳ１で検出されるＡＳ１、ＡＳ２、及びＭＵＣ５ＡＣの免疫沈降を示す。 図２２は、ＡＳ１及びＡＳ２の特性決定（エピトープ）を示す。 図２３は、ＡＳ１で処理した患者血清の酵素によるデグリコシレーションを示す。 図２４は、ＡＳ１で処理した、酵素によるデグリコシル化したＭ２１３Ａ　ＳＦＭを示す。 図２５は、ＡＳ１の抗原の位置の予想を示す。 図２６は、ＡＳ１の抗原の位置の予想を示す。 図２７は、コアＯ－結合型グリカンの構造を示す。 図２８は、Ｍ０５５　ＣＣＡ　細胞株の増殖に及ぼすＡＳ１及びＡＳ２のインビトロでの効果を示す。 図２９は、Ｍ０５５　ＣＣＡ　細胞株の増殖に及ぼすＡＳ１及びＡＳ２のインビトロでの効果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明においては、T細胞依存性抗原（TD-Ag）に対する高親和性モノクローナル抗体を産生するｇａｎｐ遺伝子トランスジェニックマウス(GANPTG mice: PCT/JP2003/014221（ＷＯ２００４／０４０９７１号公報）)を用いて、胆管癌における糖タンパク質の糖鎖成分上の癌特異的エピトープを認識するモノクローナル抗体を樹立することに成功した。外科的に切除したＣＣＡ試料の抽出物をGANPTGマウスに免疫し、脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いてＸ６３ミエローマ細胞と融合し、９６ウエル培養プレートでＩＬ－６の存在下で胸腺フィーダー細胞と一緒に培地中でインキュベートした。IMDM培地のHAT（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）による選択後、増殖するクローンの上清をＣＣＡ抽出物を用いてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性クローンは、細胞株上での免疫染色により更にスクリーニングした。再度クローニングした後、ＡＳ１及びＡＳ２と命名したモノクローナル抗体を、ＣＣＡ細胞に対する特異的モノクローナル抗体として選択した。臨床ＣＣＡ腫瘍試料上で免疫組織化学染色により、モノクローナル抗体の特異性を更に調べた。モノクローナル抗体ＡＳ１は腫瘍細胞の全体を特異的かつ強く染色し、モノクローナル抗体ＡＳ２は腫瘍細胞の先端領域を選択的に染色した。両抗体とも、周囲の非腫瘍細胞や、試験したＣＣＡ患者の組織は染色しなかった。糖タンパク質を捕捉するプレートを用いたＥＬＩＳＡでは、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、ＣＣＡ患者のプールした血清中の抗原を認識したが、健常者、胃癌、膵臓癌、結腸癌及び肺癌のプールした血清中の抗原は認識しなかった。ＡＳ１抗原はＣＣＡ症例の約５４％で陽性であり、ＡＳ２抗原はＣＣＡ症例の約２７％で陽性であるが、他の悪性腫瘍や健常者の症例では陽性率は非常に低い。ＣＣＡ患者の血清を用いたウエスタンブロット分析により、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は共に約220-kDaのブロードバンドを認識することが分かった。プロテオミクス分析により、MUC5AC のペプチド骨格を含む標的分子を決定した。複数の糖鎖切断酵素での処理により更に分析した結果、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２はＣＣＡ細胞から分泌されるMUC5ACの糖鎖の異なる部分を認識することが分かった。ＣＣＡ細胞株の増殖に及ぼすモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２の影響をインビトロで調べた結果、両方のモノクローナル抗体は、MUC5AC上にＡＳ１及びＡＳ２エピトープを発現するＣＣＡ細胞株の細胞増殖を阻害することを見出した。これらの知見は、CCA細胞ではMUC5ACの糖鎖成分に腫瘍特異的な修飾が生じ、本発明の２種のモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２はこれらのエピトープを認識することを示している。本発明の腫瘍特異的モノクローナル抗体は、腫瘍特異的抗原エピトープの解明及び抗体医薬として癌治療の応用に有用である。
（１）本発明のモノクローナル抗体及びその製造方法
　本発明のモノクローナル抗体を作成するための抗原としては、胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物を用いる。胆管癌の腫瘍組織は、胆管癌患者から外科的に切除した組織を用いることができ、抽出物としては、例えば、採取した腫瘍組織をＰＢＳなどの緩衝液中でホモジネートして得られた上清を用いることができる。
　本発明のモノクローナル抗体は、胆管癌細胞におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識して結合し得る抗体分子全体またはその断片(例えば、Fab又はF(ab')2断片)を意味する。本発明のモノクローナル抗体は、種々の方法で製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照]。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト型抗体又はヒト抗体であってもよい。ヒト型抗体は、例えば、マウス-ヒトキメラ抗体であれば、本発明のモノクローナル抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのH鎖定常部をヒトIgE H鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに抗原である胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物を免疫することにより調製することが可能である。
　モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。本発明では、好ましくは、ＧＡＮＰ遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、ＧＡＮＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスなど）に、上記抗原を投与することができる。本発明では、T細胞依存性抗原（TD-Ag）に対する高親和性モノクローナル抗体を産生することができることから、免疫動物としてＧＡＮＰ遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることが好ましい。なお、ｇａｎｐ遺伝子トランスジェニックマウスは公知であり、例えば、PCT/JP2003/014221（ＷＯ２００４／０４０９７１号公報）に記載の方法により作製することができる。
　抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1～100mgであり、アジュバントを用いるときは1～100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(CFA)、フロイント不完全アジュバント(IFA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。抗原投与の好ましい例の一つとしては、完全フロイントアジュバンド(ＣＦＡ)を用いて一次免疫を行い、不完全フロイントアジュバンド（ＩＦＡ）を用いて追加免疫を行うことができる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2～5週間間隔で、１～10回、好ましくは2～5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１～60日後、好ましくは１～14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
　次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、１x106～１x107個/mlの抗体産生細胞と2x105～２×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000～6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に3x105個/well程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡなど）、放射性免疫測定法、免疫組織化学分析など等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
　本発明のモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２を産生するハイブリドーマとしては、ハイブリドーマＡＳ１及びＡＳ２が得られている。ハイブリドーマＡＳ１（識別のための表示：Mouse-mouse hybridomas AS1）及びハイブリドーマＡＳ２（識別のための表示：Mouse-mouse hybridomas AS2）はそれぞれ、受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１７５０（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５０）及び受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１７５１（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５１）として、２００８年（平成２０年）１２月１７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５－８５６６））に寄託されている。受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５０及び受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５１を有するハイブリドーマＡＳ１及びＡＳ２はそれぞれ、２００９年１２月１４日付けで、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５としてブダペスト条約の下の国際寄託に移管されている。
　樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37°C、５％ CO2濃度)で7～14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。
　腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１x107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（２）本発明のモノクローナル抗体を含む、胆管癌の診断薬、並びに胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬
　本発明のモノクローナル抗体は、胆管癌の診断薬、並びに胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬として使用することができる。
　本発明の診断薬及び医薬には、胆管癌細胞におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識する本発明のモノクローナル抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬としては例えば注射剤として製剤することができる。胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
（３）本発明のモノクローナル抗体を用いた胆管癌の検出方法
　本発明によれば、胆管癌細胞におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識する本発明のモノクローナル抗体と被験者由来の試料とを接触させて、該試料中におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープの存在の有無を検出することによって、胆管癌を検出することができる。
　本発明において用いる被験者由来の試料としては、被験者から得られる組織、血清、血漿、唾液、尿等が挙げられるが、特に好ましくは血清又は血漿である。被験者由来の試料と上記抗体との接触は、当分野において通常行われている方法に基づいて行えばよく、特に限定するものではない。検出は、例えば試料と上記抗体との接触の後、試料中に存在し得るムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープに対する抗体との特異的結合を、蛍光物質や発光物質、酵素等で標識した二次抗体等を使用して定量的に検出することにより行うことができる。また、検出・診断のための反応をウェル等の液相中で行ってもよく、あるいは抗体を固定した固相支持体上で行ってもよい。この場合、胆管癌に罹患していない正常な試料、あるいは胆管癌であることが判明している試料を用いて予め作製した標準値と比較することによって、測定された値が胆管癌として陽性であるか否かを判定することができる。また、診断の際には、多数の胆管癌の患者と健常人の血清又は血漿中のムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープの量を測定して、カットオフ値を設定することができる。
　本発明のモノクローナル抗体を用いて、試料中におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープの存在の有無を検出する方法の具体例としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、又は放射性免疫測定法（ＲＩＡ）などがあり、これらの技術は当業者に周知である。用いる標識物質は、上記測定法に応じて、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、および化学発光化合物等を適宜選択すればよい。前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。上記標識物質はアビジン－ビオチン複合体を用いることにより、標識物質の検出感度を向上させることも可能である。また、放射性同位体としては、主に125Iが、蛍光化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（RITC）等が挙げられる。化学発光化合物としては、ロフィン、ルミノール、ルシゲニン等が挙げられる。上記標識物質による抗体の標識は、常法に従って行うことができる。以下、標識抗体を用いた標識免疫測定法及びＥＬＩＳＡ法について説明する。
（ａ）標識免疫測定法
　標識免疫測定法による、本発明の抗体を検出する測定系は、非競合反応系あるいは競合反応系を用いて構築することができる。非競合反応系においては、固相が必要である（固相法）。競合反応系においては、必ずしも固相を必要としない（液相法）が、固相を用いた方が、測定操作が簡便になるため好ましい。固相の材質としては、例えば、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セルロース等が挙げられ、固相の形状としては、球状、ウェル状、チューブ状、シート状等が挙げられるが、これらに限定されず、標識免疫測定法に用いられる公知のものを任意に用いることができる。
　測定操作は、非競合反応系であれば、例えば、検出すべき抗原（ムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを含む可能性のある試料）を固相化した後、本発明の抗体と反応させ、次いであらかじめ標識しておいた抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）を加えて固相化した抗原と反応している抗体と反応させる。この二次抗体の標識により、抗原に結合した抗体量を検出することができる。検出された標識量は、検出すべき抗原量と正相関するので、これにより抗原量を求めることができる。
　抗原または抗体の固相化法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法等、公知の方法を使用できる。特に、物理的吸着法が簡便という点で好ましい。また、抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）としては、例えば、抗IgG抗体、抗IgM抗体等を用いることができる。これらの抗体は、抗体分子をそのまま使用してもよいし、あるいは抗体を酵素処理して得られる抗原結合部位を含む抗体フラグメントであるFab、Fab'、F(ab')2を使用してもよい。さらに、標識した抗免疫グロブリン抗体の代わりに、抗体分子に特異的な親和性をもつ物質、例えばIgGに特異的な親和性をもつプロテインＡ等を標識して使用してもよい。
（ｂ）ＥＬＩＳＡ法
　前記標識免疫測定法の好適な例として、酵素を標識とした免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、９６穴プレートに検体またはその希釈液を入れて、４℃～室温で一晩、または３７℃で１～３時間程度静置して検出すべき試料を吸着させて固相化する。次に、本発明の抗体を反応させ、次いであらかじめ酵素を結合させた抗免疫グロブリン抗体（二次抗体）を反応させる。最後に酵素と反応する適当な発色性の基質（例えば、酵素がホスファターゼならｐ－ニトロフェニルリン酸等）を加え、この発色によって抗体を検出することができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（Ａ）材料と方法
（１）胆管癌（CCA）試料
　外科的に切除した試料を、タイのKhon Kaen大学のSrinagarind病院で承認された肝内CCAを有する１００人の患者から得た。インフォームド・コンセントは、Khon Kaen大学のヒト研究倫理委員会で承認されたプロジェクトに参加した全患者から得た。年齢、性別、組織学的等級、及びリンパ節、血管及びペリニューロンの関与を含むデータを、Khon Kaen大学の肝臓ジストマ症及び胆管癌研究センターの医療記録及び病理記録に基づいて過去に遡って調べた。
（２）細胞株及び細胞培養
　ヒトCCA細胞株(M213A, M055及びKKU-100) は、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS; Sigma, St. Louis, MO)、2 mM L-グルタミン(Cambrex, Baltimore, MD)、100μg/ml ストレプトマイシン、100 U/ml ペニシリン及び50 μM 2-メルカプトエタノールを補充したHam-F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) で培養した。不死化したヒト胆管細胞MMNK-1 (Maruyama, M., Kobayashi, N., Westerman, K.A., Sakaguchi, M., Allain, J.E., Totsugawa, T., Okitsu, T., Fukazawa, T., Weber, A., Stolz, D.B., Leboulch, P. & Tanaka, N.  Establishment of a highly differentiated immortalized human cholangiocyte cell line with SV40T and hTERT.  Transplantation  77(3):446-451, 2004)は、補充したダルベッコ改変イーグル培地で37 oCで5% CO2で培養した。乳癌細胞株MCF7はRPMI-1640で維持した。
（３）モノクローナル抗体の樹立
　各種のCCA (n=5)からの腫瘍組織をＰＢＳ中でホモジネートし、得られた上清をBalb/c-GANPTGマウスに腹腔内注入した。抗原投与は、完全フロイントアジュバンド(ＣＦＡ)を用いて一次免疫として行い、不完全フロイントアジュバンド（ＩＦＡ）を用いて追加免疫を行った（Kuwahara, K., Yoshida, M., Kondo, E., Sakata, A., Watanabe, Y., Abe, E., Kouno, Y., Tomiyasu, S., Fujimura, S., Tokuhisa, T., Kimura, H., Ezaki, T. & Sakaguchi, N.  A novel nuclear phosphoprotein, GANP, is up-regulated in centrocytes of the germinal center and associated with MCM3, a protein essential for DNA replication.  Blood  95(7):2321-2328, 2000）。より高い抗体価を有するマウスを更に免疫し、3日後、脾臓細胞を採取し、標準手法のポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞株Ｘ６３と細胞融合させた（Kuwahara, K., Tomiyasu, S., Fujimura, S., Nomura, K., Xing, Y., Nishiyama, N., Ogawa, M., Imajoh-Ohmi, S., Izuta, S. & Sakaguchi, N.  Germinal center-associated nuclear protein (GANP) has a phosphorylation-dependent DNA-primase activity that is up-regulated in germinal center regions.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA.  98(18):10279-10283, 2001）。融合細胞は、IL-6 (5 units/ml)の存在下で2 x 104 細胞/ウエルの濃度でマイクロ培養プレート上でＨＡＴ培地により選択した。スクリーニングは、間接ＥＩＳＡと免疫組織化学の組み合わせで行った。最終的に、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２を樹立した。
（４）ＥＬＩＳＡ
　９６ウエル平底プレートを、炭酸バッファーpH9.6 (0.15 M Na2CO3 and 0.35 M NaHCO3)中で4℃で40 μg/mlの大豆アグルチニン(SBA; Sigma, St. Louis, MO)で被覆した。プレートは、0.9% NaCl中の0.05% Tween-20(NSST)で5回洗浄した。ブロッキングは、PBS/0.05% Tween-20 (PBS-T)中の2% BSAを用いて行った。NSSTで5回洗浄した後、患者の血清の適当な希釈物50μlを各ウエルに添加し、プレートを３７℃で1時間インキュベートした。プレートをNSSTで5回洗浄した。樹立したモノクローナル抗体の適当な希釈物50μlを各ウエルに添加した。３７℃で1時間インキュベートし、NSSTで洗浄した後、プレートを、西洋サワビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウス(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)とともに37℃で1時間さらにインキュベートした。3,3',5,5'-テトラメチル－ベンジジン (TMB)基質の添加によって発色させた。1N H2SO4 （50 μl）を各ウエルに添加して、反応を停止させた。ELISAリーダーで450nmでプレートを測定した。間接ELISAでは、5μg/mのCCA抽出物を９６ウエルに被覆した。CCAに対する樹立したモノクローナル抗体及びHRP結合ヤギ抗マウスIgMをそれぞれ、一次抗体及び二次抗体としてそれぞれ使用した。
（５）免疫組織化学
　パラフィン切片 (4μm) をキシレンで脱パラフィン化し、続いて、再水和し、クエン酸バッファー(pH 6.0)中でマイクロ波で処理した。0.3% H2O2で内因性のペルオキシダーゼをブロックし、スライドを５％正常ウマ血清で予めインキュベートした後、モノクローナル抗体で4℃で一晩インキュベートし、次いで、ビオチン化抗マウスIg抗体とベクタスタチン（Vectastain） ABC 複合体(Vector Laboratories, Burlingame, CA)で増幅し、シグナルを3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド(Sigma)で可視化した。
（６）モノクローナル抗体の精製
　選択したハイブリドーマ(AS1及びAS2)をPBSで3回洗浄し、血清を含まない培地中で7日間培養した。培養上清をローディングバッファー(0.05 M リン酸ナトリウム, pH7.0)に対して透析した。KAPTIV-M樹脂(Tecnogen S.C.p.A., Piana di Monte Verna, Italy)を５ベッド体積のローディングバッファーで平衡化した後、透析した上清を樹脂を含むカラムに適用し、ローディングバッファーで十分に洗浄した。保持されたタンパク質を溶出バッファー(0.1 M 酢酸)で溶出し、回収した画分を1 M Tris-HCl (pH9.0)で直ちに中和し、pHを7.0付近にした。
（７）免疫沈降
　精製したモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、CNBrで活性化したセファロース(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) に取扱説明書に従って結合した。抗原抗体複合体をセファロース上に捕捉し、SDS-PAGEで分離し、ウエスタンブロット及び免疫検出によって検出した。
（８）ウエスタンブロット分析
　培養デッィシュ中のCCA細胞株はＰＢＳで洗浄し、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl (pH7.4)、1% Tween-20、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS 及び1x プロテアーゼ・インヒビター・カクテル(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)を含む溶解バッファーで溶解した。細胞溶解物を10,000 x gで30分間４℃で遠心した。上清のタンパク質濃度をLowry法を用いて測定した。タンパク質をマイクロスラブSDS-PAGEで分離した後、ゲルをトランスファーバッファー[40 mM Tris-HCl (pH7.4), 20 mM 酢酸ナトリウム, 2 mM EDTA, 20% (v/v) メタノール及び0.05% SDS]中で15分間予め平衡化してから、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜に電気トランスファーした。膜は、1% (w/v) 非脂肪ドライミルク（PBS-T ）で4℃で一晩ブロッキングした。ブロットは、一次抗体（樹立したモノクローナル抗体）と一緒に室温で1時間インキュベートした。HRP結合ヤギ抗マウスIgMを二次抗体として使用した。タンパク質の発現は、Enhanced ChemiLuminescenceキット (GE Healthcare)で検出した。
（９）標的分子のプロテオミクス分析
　CCA患者又は正常ボランティアからのアルブミン/IgG-枯渇血清を、モノクローナル抗体ＡＳ１又はＡＳ２を結合させたセファロースを用いた免疫アフィニティーカラムに適用した。溶出した試料はSDS-PAGEで分離し、ゲルを深紫色で染色するか、又は免疫検出した。免疫反応性を有するスポットをゲルから切り出し、マイクロチューブに別々に移した。ゲル粒子を乾燥した後、還元及びアルキル化を行った。ゲル内消化を標準的な手法で行った簡単に言うと、ゲル内のタンパク質をトリプシンで一晩消化した。分解したペプチドを乾燥し、2%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸で分割し、ZipTip (Millipore, Billerica, MA)で脱塩した。試料は繰り返し乾燥し、2%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸で分割し、液体クロマトグラフィー・タンデムマススペクトロメトリー(LC/MS/MS)に供した。  ケラチンなどの既知のコンタミネーションピーク、自己光分解ピークは除去した。LC/MS/MS の結果を、NCBI データベースと比較した。
（１０）標的糖タンパク質の酵素処理
　標的糖タンパク質のグリコシル化を評価するために、Glyko enzymatic deglycosylationキット(Glyko, Inc., Novato, CA)を用いた。M213A 細胞は、各種の酵素の組み合わせの存在下において血清を含まない培地中で37℃で一晩培養した。培養上清を回収し、Centricon (Millipore)を用いて濃縮した。幾つかの実験では、CCA血清は、 デグリコシダーゼで処理した。酵素消化後の試料は、上記の通り、SDS-PAGE及びイムノブロットに用いた。
（１１）インビトロでのCCA細胞株の増殖におけるモノクローナル抗体の影響
　CCA細胞株は、コラーゲンＩ型で被覆したプレート（和光純薬工業、大阪、日本）上で培養した。FCSを含む培地で洗浄した後、モノクローナル抗AS1又はAS2、又は対照IgMを最終濃度1 μg/mlで培地に添加した。画像は、経時的顕微鏡(IX81; オリンパス、東京、日本)を用いて１０分毎に４８時間取得した。
（Ｂ）結果
（１）ＣＣＡ細胞に対するモノクローナル抗体の樹立
　GANPTG マウスに、ヒトＣＣＡ組織のプールした細胞溶解物をCFAと一緒に免疫し、IFA中の溶解物で追加免疫した。脾臓細胞を単離し、既報の標準法で（Kuwahara, K., Tomiyasu, S., Fujimura, S., Nomura, K., Xing, Y., Nishiyama, N., Ogawa, M., Imajoh-Ohmi, S., Izuta, S. & Sakaguchi, N.  Germinal center-associated nuclear protein (GANP) has a phosphorylation-dependent DNA-primase activity that is up-regulated in germinal center regions.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA.  98(18):10279-10283, 2001）でポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞株X63と融合した。ＨＡＴ培地での選択後、ＣＣＡ細胞に対するモノクローナル抗体を、ＣＣＡ抽出物で予め処理した９６ウエルのマイクロ培養プレートを用いた間接ＥＬＩＳＡによって先ず選択した（図１）。ミエローマ細胞株による3回の独立した融合により、患者血清を用いたＥＬＩＳＡと組織切片における免疫組織化学分析によりさらにスクリーニングを行い、図２に示す戦略により、癌に特異的又は選択的なモノクローナル抗体を見出した。特異性は、肝癌、膵臓癌及び胃癌のような他の癌細胞を用いて確認した。図３に示す典型的スクリーニングにおいて、細胞ＥＬＩＳＡでＣＣＡ細胞を選択的に認識する複数のモノクローナル抗体を得た。代表的モノクローナル抗体は２群に分類され、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２と命名した。何れのモノクローナル抗体ともIgM/κであった。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２を産生するハイブリドーマＡＳ１（識別のための表示：Mouse-mouse hybridomas AS1）及びハイブリドーマＡＳ２（識別のための表示：Mouse-mouse hybridomas AS2）はそれぞれ、受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１７５０（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５０）及び受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１７５１（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５１）として、２００８年（平成２０年）１２月１７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５－８５６６））に寄託されている。受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５０及び受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７５１を有するハイブリドーマＡＳ１及びＡＳ２はそれぞれ、２００９年１２月１４日付けで、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５としてブダペスト条約の下の国際寄託に移管されている。
　糖タンパク質上の癌特異的エピトープを同定するために、図４に示すようなサンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。マイクロタイタープレートを大豆アグルチニンで被覆し、ＣＣＡ患者のプールした血清を適用した。モノクローナル抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体の二次抗体試薬を用いて、患者血清中に抗原が存在するかどうかを検出してスクリーニングした。反応性は、４５０ｎｍにおける光学濃度（光学密度：ＯＤ）によって測定した。バックグラウンドＯＤを差し引いて、特異性を測定した。プールした血清との反応性を図５に示す。モノクローナル抗体ＡＳ１は、ＣＣＡ患者のプールした血清と特異的に反応したが、正常血清とは反応しなかった。モノクローナル抗体ＡＳ２は、正常血清及びブランク試料に対するバックグラウンド反応性がより高かったが、ＣＣＡ血清に対する反応性はより強かった。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２の反応性を、正常、ＣＣＡ、肝癌、膵臓、胃、結腸及び良性の腫瘍を用いて調べた（図６）。モノクローナル抗体ＡＳ１はＣＣＡ血清に対して非常に特異的であった。大豆アグルチニンで被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡアッセイでは、他の血清試料とより高いバックグラウンドを示す一方で、モノクローナル抗体ＡＳ２は、ＣＣＡ血清に選択的である。個々の血清試料との反応性を調べた結果の一部を図７に示す。１００個のＣＣＡ血清試料との全体的反応性としては、ＡＳ１はＣＣＡ血清の５４％で陽性であり、ＡＳ２は２７％で陽性であった。これら2種の抗体を組み合わせると、６０％近くが、モノクローナル抗体ＡＳ１又はＡＳ２の何れかで陽性であった。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２の特異性を、ＣＣＡ腫瘍臨床試料を用いて免疫組織化学によりさらに調べた（図８）。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、腺癌の腫瘍細胞と明確に反応したが、周囲の細胞又は組織とは反応しなかった。図９に示す通り、ＡＳ１は管状表面の細胞及び周辺に現れ、この傾向はＡＳ２ではより顕著になり、ＡＳ２は腫瘍細胞の先端周辺において強く陽性であった。即ち、この２種のモノクローナル抗体は同様の糖タンパク質と反応するが、腫瘍細胞における局在は異なっている。
（２）ＡＳ１及びＡＳ２の分子研究
　ＣＣＡ患者のプールした血清中のＡＳ１及びＡＳ２抗原の分子の大きさを、通常血清と比較して調べた（図１０）。幅広いバンドがプールしたCCA血清中でのみ見られ、正常血清では見られなかった。抗原構造を決定するために、アルブミン／IgG除去可能カラムにプールした血清を通し、Microcon YM-30で濃縮して標的糖タンパク質を濃縮した（図１１）。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２で検出された抗原は、SDS-PAGE上で推定~220-kDaのブロードなバンドであった。CCA血清中に存在する220-kDa近傍の大きなタンパク質をQstar (LC/MS/MS)を用いたMass分析により直接解析したところ、α2-マクログロブリンが同定された。しかし、ＡＳ１とＡＳ２の発現パターンはα2-マクログロブリンとは明らかに相関しないため、この方法では目的の分子を同定することは困難であると判断した。そこでモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２を無血清培地から精製し、IgM精製キットで濃縮した。精製したモノクローナル抗体はセファロースビーズと結合させ、それを用いた免疫沈降法とウェスタンブロット解析により、ＡＳ１とＡＳ２は~220-kDaのブロードなバンドを特異的に検出した（図１２）。次にＡＳ１及びＡＳ２結合セファロースビーズを用いてアフィニティークロマトグラフィーカラムを作成した。ＣＣＡ患者血清中のＡＳ１及びＡＳ２抗原を２段階で精製した後、抗原を質量分析に供した（図１３）。ＡＳ１はMUC5AC糖タンパク質のペプチド配列とヒットした（図１４及び１５）。ＡＳ２はMUC5ACのペプチド配列と複数のペプチド配列と高いスコアでヒットした（図１６、１７及び１８）。これらの結果は、ＡＳ１及びＡＳ２が220-kDaの大きな分子サイズの糖タンパク質の異なるエピトープを認識することを示す。この糖タンパク質は、質量分析によりMUC5AC及びMUC6と決定された（図１９）。
（３）MUC5ACに対するモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２の反応性
　免疫沈降及びウエスタンブロット解析によりMUC5ACに対するモノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２の反応性を調べた（図２０）。モノクローナル抗体AS1 (IgM,κ)は、ウエスタンブロット解析では220-kDaのバンドと強く反応した。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、大きなサイズの糖タンパク質を免疫沈降させた（図２１）。モノクローナル抗体ＡＳ１は、M213A CCA細胞株における糖タンパク質を認識したが、正常胆管細胞株MNNK1及び乳癌細胞株MCF7における糖タンパク質は認識しなかった。M213Aの培養上清は、モノクローナル抗体ＡＳ１に対する反応性が低かった。これは、M213A細胞の免疫沈降及びウエスタンブロット解析により確認された。モノクローナル抗体ＡＳ１は、M213 CCA腫瘍細胞に特異的であった。モノクローナル抗体ＡＳ２は、モノクローナル抗体ＡＳ１と反応させた場合と同様のウエスタンブロットプロフィールを示したことにより、モノクローナル抗体ＡＳ１は、ＡＳ２抗原、即ちMUC5ACの異なるエピトープを認識することが示された。市販の抗MUC5AC抗体を用いて同様の実験を試みた。市販の抗MUC5AC抗体の多くは、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２と比べて、ウエスタンブロット分析において反応性が比較的弱かったことから、本発明の２種類のモノクローナル抗体は、免疫沈降、ウエスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡにおいてMUC5AC抗原に対する反応性が強いことが示された。
（４）ＡＳ１及びＡＳ２抗原の糖特性の研究
　ＡＳ１及びＡＳ２エピトープが大きなサイズの糖タンパク質の糖成分上に存在するかどうかを調べてみることにした（図２２）。ＣＣＡのプールした血清を、シアリダーゼ(2)、O-グリカナーゼ(3)、シアリダーゼ + O-グリカナーゼ(4)、N-グリカナーゼ(5)、N-グリカナーゼ + シアリダーゼ(6)、シアリダーゼ + O-グリカナーゼ+ シアリダーゼ (7)、及び0.1 M NaOHで処理した。ＡＳ１は、シアリダーゼによる処理後に、鋭いより高い分子サイズのバンドに移動し、NaOH処理によりウエスタンブロット上のシグナルを消失さえた。これらの結果は、ＡＳ１の抗原エピトープはシアル酸で僅かにマスクされており、シアリダーゼ処理後に鋭いバンドになることを示している。O-結合型糖成分は、0.1 M NaOH処理に感受性である。即ち、ＡＳ１エピトープは、MUC5AC糖タンパク質 の糖成分上にある（図２３）。M213A細胞を無血清培地で培養した上清を用いたＡＳ１エピトープの解析結果は、ＣＣＡのプール血清を用いた場合と同様であった（図２４）。糖タンパク質の酵素によるデグリコシレーションにより、シアリダーゼの処理によりＡＳ１の反応性が増大することが判明したが、これは、シアル酸が抗原エピトープを被覆していることを示唆している。β-ガラクトシダーゼ、N-アセチルグルコサミダーゼ及びO-グリカナーゼによる処理により、ＡＳ１の反応性は減少した。N-グリカナーゼの処理は、ＡＳ１反応性に影響しない。これを考慮すると、ＡＳ１の抗原エピトープは、シアル酸により被覆されている糖構造であり、この糖構造の一部はβ-ガラクトシダーゼ、N-アセチルグルコサミダーゼ、及びO-グリカナーゼで切断できる（図２５）。ＡＳ１の抗原エピトープは糖領域であり、そのうちの一部はGal β(1-4)結合に連結している。GlcNAcβ(1-6)は、Ｏ－結合によって高分子量糖タンパク質(MUC5AC)のタンパク質中心に連結している前者を有する（図２７を参照）。同様に、ＡＳ２の抗原エピトープは、糖成分にあると推定され、その大部分はGalβ(1-4)結合に連結し、これは高分子量糖タンパク質(MUC5AC)のポリペプチド骨格にＯ－結合によって連結している（図２６、図２７）。
（５）CCA癌細胞の増殖におけるＡＳ１及びＡＳ２エピトープの効果
　AS1及びAS2エピトープはCCA細胞で発現しているので、本発明のモノクローナル抗体がCCA細胞株の増殖に影響を及ぼすかどうかを調べた。モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、複数のCCA細胞株を阻害した。図２８では、M055細胞は、AS1 (1μg/ml), AS2 (1μg/ml), 対照IgM (1μg/ml), 又は未処理の培地の存在下で培養した。経時的顕微鏡観察により、DNAの染色によって確認される通り、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２の存在下で細胞増殖の阻害が示された（図２９）。この実験により、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２が、CCA癌細胞の腫瘍特異的阻害に有用であることが示された。
（Ｃ）考察
　上記の結果から、本発明のモノクローナル抗体で認識される癌特異的エピトープは、CCA癌細胞に分泌・発現するMUC5ACの糖タンパク質に存在することが示された。エピトープが糖鎖領域に存在することは、癌細胞ではグリコシレーションパターンの変化が生じていることを示唆している。
　糖タンパク質の糖鎖における癌に特異的又は選択的なエピトープは、薬物送達及び抗体療法の標的として有用である。図２８及び図２９に示すように、モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、ＣＣＡ細胞株の増殖をインビトロで阻害した。この結果は、この糖鎖エピトープが、医療治療のための標的となりうることを示している。
　また、本発明のモノクロナール抗体の製造方法は、従来の技術では作成するのが困難であった糖鎖エピトープに対する特異的モノクローナル抗体を製造するための効率的な方法である。糖タンパク質に対するモノクローナル抗体の樹立に焦点をあててスクリーニングを行った結果、特異的エピトープの大部分がMUC5ACの糖鎖領域であることが判明した。GANPTG マウスは、高い効率で、癌特異的糖鎖エピトープに対する抗体を産生することができた。
　モノクローナル抗体ＡＳ１及びＡＳ２は、癌特異的エピトープの研究に有用であり、各種の糖タンパク質における癌特異的エピトープの同定のための優れたプローブである。また、本発明のモノクローナル抗体の情報は、重鎖及び軽鎖のIg-V領域によって作成される抗原結合部位の結晶情報に基づく３次構造の分子プローブを設計するのに適用可能である。
受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４
受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５

Claims (11)

  1. 胆管癌細胞におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープを認識するモノクローナル抗体。
  2. 胆管癌患者の血清中のムチンMUC5ACを認識するが、健常者、胃癌患者、膵臓癌患者、結腸癌患者及び肺癌患者の血清中のムチンMUC5ACを認識しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 胆管癌細胞の増殖阻害作用を有する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
  4. 胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物を投与したＧＡＮＰ遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を回収し、胆管癌の腫瘍組織又はその抽出物と反応性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選別し、選別された抗体産生細胞に抗体を産生させることにより得られる、請求項１から３の何れかに記載のモノクローナル抗体。
  5. 受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
  6. 受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０４又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２０５を有するハイブリドーマ。
  7. 胆管癌の腫瘍組織の抽出物を投与したＧＡＮＰ遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を回収し、胆管癌の腫瘍組織と反応性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を選別し、選別された抗体産生細胞に抗体を産生させることを含む、請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。
  8. 請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、胆管癌の診断薬。
  9. 請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体を含む、胆管癌を抑制及び／又は治療するための医薬。
  10. 請求項１から５の何れかに記載のモノクローナル抗体と被験者由来の試料とを接触させて、該試料中におけるムチンMUC5ACの胆管癌特異的糖鎖エピトープの存在の有無を検出することを含む、胆管癌の検出方法。
  11. 被験者由来の試料が血清又は血漿である、請求項１０に記載の胆管癌の検出方法。
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