WO2013018709A1 - ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子 - Google Patents

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美佐 落合
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • This application relates to a novel phosphatidic acid phosphatase gene and its use.
  • Fatty acids containing two or more unsaturated bonds are collectively referred to as polyunsaturated fatty acid (PUFA), and arachidonic acid, dihomo gamma linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid and the like are known. Some of these highly unsaturated fatty acids cannot be synthesized in the animal body, and such highly unsaturated fatty acids need to be taken from food as essential fatty acids. Polyunsaturated fatty acids are widely distributed. For example, arachidonic acid is separated from lipids extracted from the adrenal glands and livers of animals.
  • microorganisms belonging to the genus Mortierella are known as microorganisms that produce highly unsaturated fatty acid-containing lipids such as arachidonic acid.
  • polyunsaturated fatty acids constitute storage lipids such as triacylglycerol (also referred to as triglyceride, TG) and accumulate in microbial cells or plant seeds.
  • triacylglycerol also referred to as triglyceride, TG
  • Triacylglycerol a storage lipid, is produced in vivo as follows. An acyl group is transferred to glycerol-3-phosphate by glycerol-3-phosphate acyltransferase to produce lysophosphatidic acid, and an acyl group is transferred to lysophosphatidic acid by lysophosphatidic acid acyltransferase to phosphatidic acid Phosphatidic acid is dephosphorylated by phosphatidic acid phosphatase to give diacylglycerol, and acyl group is transferred to diacylglycerol by diacylglycerol acyltransferase to give triacylglycerol.
  • phosphatidic acid phosphatidic acid, hereinafter sometimes referred to as “PA” and sometimes 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate
  • PA phosphatidic acid
  • 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate is triacyl. It is a precursor of glycerol and a biosynthetic precursor of diacyl glycerophospholipid.
  • CDP diacylglycerol CDP-DG
  • CTP cytidine 5'-3 phosphate
  • Phosphatidic acid phosphatase EC 3.1.3.4, phosphatidic acid phosphatase, hereinafter “ It may be described as “PAP”. This PAP is known to exist in all organisms from bacteria to vertebrates.
  • Non-Patent Documents 1, 2, and 7 In yeast (Saccharomyces cerevisiae), two types of PAP are known (Non-Patent Documents 1, 2, and 7). One is Mg 2+ dependent PAP (PAP1) and the other is Mg 2+ independent PAP (PAP2).
  • the PAH1 gene is known as a gene encoding PAP1 (Non-patent Documents 3 to 5). Since the pah1 ⁇ mutant has PAP1 activity, there are other genes responsible for PAP1 activity. It is considered. In the pah1 ⁇ mutant, it is known that the nuclear membrane and ER membrane are abnormally expanded, and the expression of genes that are key to phospholipid biosynthesis is abnormally increased (Non-patent Document 6).
  • DGPP diacylglycerol pyrophosphate
  • lysophosphatidic acid lysophosphatidic acid
  • sphingoid-based phosphate isoprenoid phosphate
  • dephosphorylate dephosphorylate
  • Mg 2+ -dependent PAP1 homologs In Mortierella alpina, which is a lipid-producing bacterium, two types of MaPAH1.1 and MaPAH1.2 are known as Mg 2+ -dependent PAP1 homologs (Patent Document 1). In addition, the MaPAP1 gene, which is a Mg 2+ -independent PAP2 homolog, is known (Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a novel phosphatidic acid phosphatase gene, a protein encoded thereby, and a method for using them.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • the genome of the lipid-producing bacterium Mortierella alpina was analyzed, and a sequence homologous to a known Mg 2+ -independent phosphatidic acid phosphatase (PAP2) gene was extracted therefrom.
  • PAP2 Mg 2+ -independent phosphatidic acid phosphatase
  • ORF open reading frame
  • the full length cDNA was cloned by screening of a cDNA library or PCR.
  • the gene was introduced into a host cell having high growth ability such as yeast, and it was confirmed that the protein encoded by the cloned cDNA had phosphatidic acid phosphatase activity.
  • the gene relating to the novel phosphatidic acid phosphatase (PAP) was successfully cloned, and the present invention was completed. That is, in one aspect, the present invention may be as follows.
  • nucleic acid according to any one of the following (a) to (g).
  • A a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having phosphatidic acid phosphatase activity
  • B a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and includes a base sequence encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • c A nucleic acid comprising a base sequence having a identity of 70% or more with the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 and comprising a base sequence encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • nucleic acid according to any one of the following (a) to (g).
  • A a nucleic acid comprising a nucleotide sequence comprising an amino acid sequence in which 1-110 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • B a nucleotide sequence that hybridizes with a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 1 under the conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • Nucleic acid (c) comprising nucleic acid (d) consisting of a base sequence consisting of a base sequence consisting of 90% or more of the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1 and comprising a base sequence encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity (d) consisting of SEQ ID NO: 2 It consists of an amino acid sequence that is 90% or more identical to the amino acid sequence, and A nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein having diphosphate phosphatase activity (e) a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 2 ⁇ SSC A nucleic acid that hybridizes under conditions of 50 ° C.
  • nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence comprising SEQ ID NO: 4
  • a nucleic acid comprising a base sequence having an exon that encodes a protein having a phosphatidic acid phosphatase activity that hybridizes under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • 90% identity with the base sequence consisting of SEQ ID NO: 4 Tan comprising the above base sequence and having phosphatidic acid phosphatase activity
  • Nucleic acid comprising a nucleotide sequence having the exons encoding the click protein
  • nucleic acid according to any one of the following (a) to (d).
  • D a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a partial sequence thereof.
  • the phosphatidic acid phosphatase activity is higher in substrate specificity for a phosphatidic acid containing an acyl group having 18 carbon atoms than a phosphatidic acid containing an acyl group having 17 carbon atoms, (1) or ( The nucleic acid according to 2).
  • the phosphatidic acid phosphatase activity has a higher substrate specificity for phosphatidic acid containing an acyl group having 18 carbon atoms than phosphatidic acid containing an acyl group having 17 carbon atoms, (5) or ( The protein according to 6).
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the present invention provides a novel PAP gene, a protein encoded by the gene, and methods for using them.
  • the PAP of the present invention is expected to be able to produce in the host a fatty acid composition having a different composition compared to a fatty acid composition produced by a host into which PAP has not been introduced.
  • a lipid having desired characteristics and effects can be provided, which is useful as a product applicable to foods, cosmetics, pharmaceuticals, soaps and the like.
  • FIG. 1-1 shows the genomic sequence of MaPAP2.2 and the base sequence of CDS.
  • FIG. 1-2 is a continuation of FIG. 1-1.
  • FIG. 2 is an alignment of the amino acid sequence of MaPAP2.2 and the amino acid sequence of a putative protein derived from Otsutake and ScDPP1 derived from yeast (YDR284C: Accession No. AAS56070).
  • FIG. 3 is an alignment of the amino acid sequence of MaPAP2.2 and the amino acid sequence of MaPAP1 (WO2009 / 008466) known as Mg2 + -independent PAP (PAP2) from Mortierella alpina.
  • A shows the result when Mg 2+ is added.
  • B shows the results when EDTA is added (without Mg 2+ ).
  • the vertical axis shows the amount of protein ( ⁇ g / mg ⁇ protein) of the 18: 2 crude enzyme solution found in the DG fraction.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of examining Mg 2+ dependence on the activity of MaPAP2.2 converting 18:
  • the vertical axis shows the amount of protein ( ⁇ g / mg ⁇ protein) of the 18: 2 crude enzyme solution found in the DG fraction.
  • the vertical axis represents the amount of protein ( ⁇ g / mg ⁇ protein) of the crude enzyme solution of 18: 1 found in the DG fraction.
  • Each vertical axis indicates the amount per protein ( ⁇ g / mg ⁇ protein) of the crude enzyme solution of 17: 0 found in the DG fraction.
  • the present invention relates to a novel phosphatidic acid phosphatase gene derived from the genus Mortierella, characterized by dephosphorylating phosphatidic acid to produce diacylglycerol, and a method for using them.
  • the phosphatidic acid phosphatase is an enzyme that catalyzes a reaction of dephosphorylating phosphatidic acid to produce diacylglycerol.
  • the substrate of the PAP of the present invention is usually phosphatidic acid, but is not limited thereto.
  • Nucleic acids encoding phosphatidic acid phosphatases include MaPAP2.2 and variants thereof.
  • the correspondence relationship between the cDNA, CDS, ORF and amino acid sequence of the nucleic acid encoding MaPAP2.2 is summarized in Table 1 below.
  • SEQ ID NO: 2 which is the amino acid sequence of MaPAP2.2
  • SEQ ID NO: 1 which is the sequence indicating the ORF region of MaPAP2.2
  • the sequence which indicates the region of the CDS Examples include SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 which is the base sequence of the cDNA.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to the 75th to 1163rd base sequence of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 3 corresponds to the 75th to 1166th base sequence of SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 4 can be mentioned as a genomic base sequence encoding MaPAP2.2.
  • the genome sequence of SEQ ID NO: 4 consists of 3 exons and 2 introns, and the exon regions are 1st to 207th, 445th to 582th, and 889 to 1632th of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleic acid includes not only single-stranded and double-stranded DNA but also its RNA complement, which may be of natural origin or artificially produced.
  • DNA include genomic DNA, cDNA corresponding to the genomic DNA, chemically synthesized DNA, DNA amplified by PCR, a combination thereof, and a hybrid of DNA and RNA. It is not limited.
  • Preferred embodiments of the nucleic acid of the present invention include (a) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (b) a base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (c) represented by SEQ ID NO: 5. And a nucleic acid containing the nucleotide sequence.
  • a base sequence encoding a protein having homology with a protein having a known PAP activity can be searched from the base sequence data of an organism having PAP activity or genomic DNA.
  • the organism having PAP activity is preferably a lipid-producing bacterium, and examples of the lipid-producing bacterium include, but are not limited to, M. ⁇ alpina.
  • a cDNA library is first prepared.
  • a method for preparing a cDNA library "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)) can be referred to.
  • a commercially available cDNA library preparation kit may also be used. Examples of a method for preparing a cDNA library suitable for the present invention include the following methods. That is, an appropriate strain of M. alpina, which is a lipid-producing bacterium, is inoculated into an appropriate medium and pre-cultured for an appropriate period.
  • Examples of culture conditions suitable for this pre-culture include, for example, 1.8% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0 as a medium composition, a culture period of 3 to 4 days, and a culture temperature of 28 ° C. There are conditions. Thereafter, the preculture is subjected to main culture under appropriate conditions.
  • a medium composition suitable for the main culture for example, 1.8% glucose, 1% soybean flour, 0.1% olive oil, 0.01% adecanol, 0.3% KH 2 PO 4 , 0.1% Na 2 SO 4 , 0.05% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.05% MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, pH 6.0.
  • Examples of culture conditions suitable for the main culture include conditions of aeration and agitation culture at 300 rpm, 1 vvm, and 26 ° C. for 8 days. An appropriate amount of glucose may be added during the culture period. Timely cultures are collected during the main culture, and the cells are collected therefrom to prepare total RNA. For preparation of total RNA, a known method such as guanidine hydrochloride / CsCl method can be used. Poly (A) + RNA can be purified from the obtained total RNA using a commercially available kit. Furthermore, a cDNA library can be prepared using a commercially available kit.
  • the base sequence of an arbitrary clone of the prepared cDNA library can be determined using a primer designed to determine the base sequence of the insert portion on the vector to obtain an EST.
  • a primer designed to determine the base sequence of the insert portion on the vector can be determined using a primer designed to determine the base sequence of the insert portion on the vector to obtain an EST.
  • a cDNA library is prepared using the ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)
  • directional cloning can be performed.
  • genomic DNA When analyzing genomic DNA, cells of an organism having PAP activity are cultured, and genomic DNA is prepared from the cells. The base sequence of the obtained genomic DNA is determined, and the determined base sequence is assembled. A sequence encoding an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of a protein having a known PAP activity is searched from the finally obtained supercontig sequence. Primers are prepared from the hit supercontig sequences as coding for such amino acid sequences, PCR is performed using the cDNA library described above as a template, and the resulting DNA fragment is incorporated into a plasmid and cloned. Using the cloned plasmid as a template, a probe is prepared by performing PCR using the above-mentioned primers. A cDNA library is screened using the prepared probe.
  • the homology search of the amino acid sequence of MaPAP2.2 was performed with the BLASTp program against the amino acid sequence registered in GenBank. This amino acid sequence is derived from the predicted protein of the red fox (SEQ ID NO: 10, accession number: XP 001878243) with the highest score, and the identity is 36.7%. Moreover, the identity between the amino acid sequence of MaPAP1, which is a known PAP2 (Mg 2+ -independent PAP) derived from Mortierella alpina, and the amino acid sequence of MaPAP2.2 is 20.5%.
  • the present invention also includes a nucleic acid having a function equivalent to that of a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • “Having an equivalent function” means that the protein encoded by the base sequence of the present invention and the protein comprising the amino acid sequence of the present invention have phosphatidic acid phosphatase (PAP) activity.
  • PAP activity is an activity that catalyzes a reaction in which phosphatidic acid is dephosphorylated to produce diacylglycerol.
  • the PAP activity may be higher in substrate specificity for phosphatidic acid containing an acyl group having 18 carbon atoms than phosphatidic acid containing an acyl group having 17 carbon atoms, but is not limited thereto. Further, the PAP activity may be independent of Mg 2+ , but is not limited thereto.
  • a nucleic acid variant comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a function equivalent to the nucleic acid is as follows: (A) to (g) of the nucleic acid comprising the base sequence described in any one of the above.
  • nucleic acid comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising a base sequence encoding a protein having PAP activity
  • the base sequence contained in the nucleic acid consists of an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a base sequence encoding a protein having PAP activity.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 preferably one or several (eg, 1 to 110, 1 to 100, 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30, 1-25, 1-20, 1-15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1)) amino acids) deleted Amino acid sequence
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 preferably one or several (for example, 1 to 110, 1 to 100, 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30), 1-25, 1-20, 1-15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1))
  • substitution is preferably a conservative substitution.
  • a conservative substitution is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics, but any substitution that does not substantially change the structural characteristics of the original sequence.
  • any substitution may be made so long as the substituted amino acid does not destroy the helix present in the original sequence or other types of secondary structures characterizing the original sequence.
  • non-natural amino acid residue may be included in the substituent, and the reversed type or the same region in which the non-substituted region is reversed in the peptidomimetic or amino acid sequence is reversed. Inverted types are also included.
  • amino acid residues are classified and exemplified for each substitutable residue, but the substitutable amino acid residues are not limited to those described below.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine and cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid and 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine and glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid and 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline and 4-hydroxyproline group
  • F serine, threonine and homos
  • one member of the above types can be exchanged with another type of member, in this case, in order to preserve the biological function of the protein of the present invention. It is preferable to consider the hydropathic index of amino acids (hydropathic amino acid index) (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982)).
  • amino acid substitution can be performed based on hydrophilicity.
  • Stereoisomers of the above amino acids such as D-amino acids, unnatural amino acids such as ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, and other unconventional amino acids also constitute the protein of the present invention.
  • the protein notation used in the present specification is based on the standard usage and the notation commonly used in the art, the left direction is the amino terminal direction, and the right direction is the carboxy terminal direction.
  • the left end of a single-stranded polynucleotide sequence is the 5 'end, and the left direction of the double-stranded polynucleotide sequence is the 5' direction.
  • Those skilled in the art can design and prepare appropriate mutants of the proteins described herein using techniques known in the art. For example, in a protein molecule that can change its structure without damaging the biological activity of the protein of the present invention by targeting a region that is considered to be less important for the biological activity of the protein of the present invention. Appropriate regions can be identified. It is also possible to identify molecular residues and regions that are conserved among similar proteins. In addition, conservative amino acid substitutions are introduced into regions believed to be important for the biological activity or structure of the protein of the invention without compromising biological activity and without adversely affecting the polypeptide structure of the protein. You can also
  • a person skilled in the art identifies residues of peptides that are important for the biological activity or structure of the protein of the invention and are similar to the peptides of the proteins, and compares the amino acid residues of the two peptides, A so-called structure-function study can be performed to predict which residues of a protein similar to the protein of the invention are amino acid residues corresponding to amino acid residues important for biological activity or structure. . Furthermore, by selecting a chemically similar amino acid substitution of the amino acid residue predicted in this way, a mutant that retains the biological activity of the protein of the present invention can also be selected. Those skilled in the art can also analyze the three-dimensional structure and amino acid sequence of the mutant of this protein.
  • amino acid residues predicted to be on the protein surface may be involved in important interactions with other molecules, but those skilled in the art will be able to do this based on the analysis results described above.
  • Mutants can be made that do not change the amino acid residues predicted to be on the surface of various proteins.
  • those skilled in the art can also produce mutants that substitute only one amino acid residue among the amino acid residues constituting the protein of the present invention. Such mutants can be screened by known assay methods and information on individual mutants can be collected.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kunkel (1988) Method 85: 2763-6 etc., and can be prepared according to the method such as site-directed mutagenesis etc. The production of such mutants with mutations such as deletion, substitution or addition of amino acids is possible.
  • a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System Manufactured by emissions Ltd.), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio Inc.) and the like can be carried out using.
  • a gene can be mutated as a method for introducing deletion, substitution or addition of one or more amino acids into a protein amino acid sequence while maintaining its activity. And a method of ligation after selective cleavage of a gene to remove, substitute or add selected nucleotides.
  • the nucleotide sequence contained in the nucleic acid of the present invention preferably has 1-30, 1-20, or 1-10 amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It is a base sequence consisting of an amino acid sequence and encoding a protein having PAP activity.
  • the number of amino acid mutations or modifications in the protein encoded by the nucleic acid of the present invention, or the site of mutation or modification is not limited as long as the PAP activity is retained.
  • PAP activity can be measured using a known method.
  • PAP activity may be measured as follows.
  • the transformed cells expressing the PAP of the present invention are crushed, the cell lysate is centrifuged, and the supernatant is recovered to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution may be further purified for the PAP of the present invention.
  • the crude enzyme solution containing the PAP of the present invention or the purified PAP of the present invention is added to a reaction solution containing 100 ⁇ g / mL phosphatidic acid and 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), and it is suitably used at 25 to 28 ° C. React for a long time.
  • the reaction is stopped by adding chloroform: methanol, lipids are extracted, the obtained lipids are fractionated by thin layer chromatography or the like, and the amount of produced diacylglycerol can be quantified.
  • the nucleic acid of the present invention includes a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 and encodes a protein having PAP activity.
  • the above nucleotide sequence is prepared by preparing a probe using an appropriate fragment by a method known to those skilled in the art, and using this probe by a known hybridization method such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. And a genomic library.
  • hybridization conditions The strength of hybridization conditions is mainly determined by hybridization conditions, more preferably, hybridization conditions and washing conditions.
  • stringent conditions include moderately or highly stringent conditions.
  • moderately stringent conditions include, for example, hybridization conditions of 1 ⁇ SSC to 6 ⁇ SSC, 42 ° C. to 55 ° C., more preferably 1 ⁇ SSC to 3 ⁇ SSC, 45
  • the conditions are from 50 ° C. to 50 ° C., most preferably, 2 ⁇ SSC, 50 ° C.
  • the hybridization solution contains, for example, about 50% formamide, a temperature 5 to 15 ° C. lower than the above temperature is adopted.
  • Cleaning conditions include 0.5 ⁇ SSC to 6 ⁇ SSC, 40 ° C. to 60 ° C. During hybridization and washing, 0.05% to 0.2%, preferably about 0.1% SDS may generally be added.
  • Highly stringent conditions include hybridization and / or washing at higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • the hybridization conditions are 0.1 ⁇ SSC to 2 ⁇ SSC, 55 ° C. to 65 ° C., more preferably 0.1 ⁇ SSC to 1 ⁇ SSC, 60 ° C. to 65 ° C., most preferably , 0.2 ⁇ SSC, 63 ° C.
  • the washing conditions include 0.2 ⁇ SSC to 2 ⁇ SSC, 50 ° C. to 68 ° C., and more preferably 0.2 ⁇ SSC, 60 to 65 ° C.
  • hybridization conditions used in the present invention for example, prehybridization is performed in 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 50% formamide at 42 ° C., and then the probe is used. And overnight at 42 ° C. to allow hybridization, followed by washing in 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. for 20 minutes three times. It is not limited.
  • a commercially available hybridization kit that does not use a radioactive substance for the probe can be used. Specific examples include hybridization using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics), ECL direct labeling & detection system (Amersham).
  • the base sequence included in the present invention preferably hybridizes with a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 under the conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C., and has PAP activity. Examples thereof include a base sequence encoding a protein possessed.
  • nucleic acid comprising a base sequence having a identity of 70% or more to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having PAP activity
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is a sequence It comprises a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence having at least 70% identity to the nucleotide sequence shown in No. 1 and encoding a protein having PAP activity.
  • it is at least 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more, further 95%, 98% or 99%) with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. And the like) and a nucleotide sequence encoding a protein having PAP activity.
  • the percent identity between two base sequences can be determined by visual inspection or mathematical calculation, but is preferably determined by comparing the sequence information of two nucleic acids using a computer program.
  • sequence comparison computer program include the BLASTN program (Altschul et al. (Altschul et al.) Available from the website of the National Library of Medicine: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html. 1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10: Version 2.2.7, WU-BLAST 2.0 algorithm or the like. Standard default parameter settings for WU-BLAST 2.0 can be those described in the following Internet site: http://blast.wustl.edu.
  • nucleic acid of the present invention comprises a base sequence that encodes a protein having an amino acid sequence with 70% or more identity with the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 and having PAP activity.
  • the protein encoded by the nucleic acid of the present invention may be a protein having the same amino acid sequence as MaPAP2.2 as long as it has PAP activity.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the nucleic acid of the present invention is 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85%, still more preferably 90% (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2). 95%, and even 98%) amino acid sequences having identity of at least.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is preferably a base sequence encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 and having PAP activity. More preferably, it is a nucleotide sequence consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having PAP activity.
  • The% identity between two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity can also be determined using a computer program.
  • Examples of such computer programs include BLAST, FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)), ClustalW, and the like.
  • various conditions (parameters) for identity search using the BLAST program are described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997), and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) ) And DNA Data Bank of Japan (DDBJ) website (BLAST Manual, Altschul et al.
  • a specific alignment scheme that juxtaposes multiple amino acid sequences can also show a match of a specific short region of the sequence, so even if there is no significant relationship between the full length sequences of the sequences used, In such a region, a region having a very high specific sequence identity can also be detected.
  • the BLAST algorithm can use the BLOSUM62 amino acid scoring matrix, but the following can be used as selection parameters: (A) Segments of query sequences with low composition complexity (Wootton and Federhen's SEG program (ComputersCompand Chemistry, 1993); Wootton and Federhen, 1996 "Analysis ofpositionalpositionbiased regions in sequence databases” Methods Enzymol., 266: 544-71 Including filters to mask segments that consist of short-period internal repeats (determined by the XNU program of Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)), and (B) the database Statistical significance threshold for reporting fit to sequence, or E Expected probability of fit found simply by chance, according to a statistical model of scores (Karlin and Altschul, 1990); if the statistical significance difference due to a fit is greater than the E-score threshold, this fit is not reported .
  • Nucleic acid containing a base sequence that comprises a base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is a stringent condition with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to a base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 And a base sequence encoding a protein having PAP activity.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the hybridization conditions are as described above.
  • the base sequence consisting of SEQ ID NO: 4 is a genomic DNA sequence encoding MaPAP2.2.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 4 and encodes a protein having PAP activity. It includes a base sequence having an exon.
  • the above base sequence is prepared by preparing a probe using an appropriate fragment by a method known to those skilled in the art, and using this probe by a known hybridization method such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. It can be obtained from rally etc.
  • the hybridization conditions are as described above.
  • a nucleic acid comprising a base sequence having an exon that encodes a protein having a PAP activity, the base sequence comprising 70% or more of the identity of the base sequence consisting of SEQ ID NO: 4 and contained in the nucleic acid of the present invention
  • a base sequence that consists of a base sequence having at least 70% identity to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 4 and encodes a protein having PAP activity.
  • it is at least 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more, further 95%, 98% or 99) with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. % Or more), and an exon encoding a protein having PAP activity.
  • the percent identity between two base sequences can be determined as described above.
  • the genomic DNA sequence of SEQ ID NO: 4 consists of 3 exons and 2 introns, and the exon regions are 1st to 207th, 445th to 582th, and 889 to 1632th of SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is 100% identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the base sequence of the intron region in the genomic DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, and
  • the base sequence of the exon region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more, Includes a nucleotide sequence having an identity of 95% or more, 98% or more, or 99% or more) and having an exon encoding a protein having PAP activity.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is 100% identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the base sequence of the exon region in the genomic DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence of the intron region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more) with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a protein having a base sequence having an identity of 95% or more, 98% or more, or 99% or more) and having an intron region detachable by splicing, whereby exon regions are linked and have PAP activity The nucleotide sequence encoding
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is at least 70% or more of the base sequence of the intron region in the genomic DNA sequence shown in SEQ ID NO: 4, preferably the sequence shown in SEQ ID NO: 4 Includes a nucleotide sequence having identity of 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more, further 95% or more, 98% or more, 99% or more), Further, the base sequence of the exon region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably) with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10.
  • nucleotide sequence having identity and by splicing Intron regions are possible desorption, it exon region linked by encodes a protein having PAP activity, nucleotide sequences.
  • the percent identity between two base sequences can be determined by the method described above.
  • nucleic acid of the present invention comprises a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1, and which encodes a protein having PAP activity. Nucleic acids are also included.
  • Pieces 1-100 pieces, 1-50 pieces, 1-30 pieces, 1-25 pieces, 1-20 pieces, 1-15 pieces, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 2 or 1))) a base sequence to which another base is added, or (iv) a base sequence combining the above (i) to (iii),
  • a nucleic acid containing a base sequence encoding a protein having PAP activity can also be used.
  • nucleic acid of the present invention includes a nucleic acid comprising a fragment of the base sequence described in any of the following (a) to (d).
  • A a base sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • b a base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • c a base sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 5 Base sequence
  • the nucleic acid of the present invention also includes the following nucleic acids.
  • the nucleic acid according to any one of the following (a) to (g).
  • (b) a base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 A nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid consisting of a complementary base sequence
  • c a base sequence encoding a protein consisting of a base sequence that is 70% or more identical to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1
  • nucleic acid according to (1) which is any of the following (a) to (g): (A) a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 130 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) a base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 A nucleic acid that hybridizes with a complementary nucleotide sequence to 2 ⁇ SSC at 50 ° C.
  • nucleic acid containing Nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2
  • e Encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2
  • the phosphatidic acid phosphatase protein includes a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and variants thereof having a function equivalent to that of the protein. It may be produced manually.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is as described above.
  • the “protein having an equivalent function” means a protein having PAP activity as described in the section “Nucleic acid encoding phosphatidic acid phosphatase” above.
  • examples of the protein having the same function as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include the proteins described in either of the following (a) or (b).
  • the “protein having PAP activity” is a variant of a protein encoded by a nucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Included are proteins mutated by many types of modifications such as deletion or addition, modified proteins with modified amino acid side chains, etc., fusion proteins with other proteins, and proteins with PAP activity It is.
  • the protein of the present invention may be artificially prepared.
  • chemical synthesis such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), etc. It can also be manufactured by the law.
  • Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instruments, Syntheselvega, Perceptive, Shimadzu, etc. You can also.
  • the protein of the present invention also includes the following proteins.
  • (1) (a) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 (2) The protein according to any one of (a) and (b) below.
  • Nucleic Acid Cloning PAP nucleic acids can be cloned , for example, by screening from a cDNA library using an appropriate probe. Moreover, it can clone by amplifying by PCR reaction using a suitable primer, and ligating to a suitable vector. Furthermore, it can be subcloned into another vector.
  • plasmids such as pBlue-Script TM SK (+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp (TM: Gibco-BRL), p-Direct (Clontech), pCR2.1-TOPO (Invitrogene) Vectors can be used.
  • pBlue-Script TM SK (+) Stratagene
  • pGEM-T Promega
  • pAmp TM: Gibco-BRL
  • p-Direct Clontech
  • pCR2.1-TOPO Invitrogene
  • any part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or the like can be used as a primer.
  • primer PAP2.2-1f 5′-TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • primer PAP2.2-4r 5′-GACAATGCCGAGGATCGAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • Etc. can be used respectively.
  • the above primer, DNA polymerase and the like are allowed to act on cDNA prepared from M. alpina cells to carry out a PCR reaction.
  • the above method can be easily carried out by those skilled in the art according to “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)), etc. For example, the following conditions can be given. Denaturation temperature: 90-95 ° C Annealing temperature: 40-60 °C Elongation temperature: 60-75 ° C Number of cycles: 10 times or more
  • a known method can be used to purify the obtained PCR product.
  • a kit such as GENECLEAN, QIAquick) PCR purification Kits (QIAGEN), ExoSAP-IT (GE Healthcare Bioscience), a method using DEAE-cellulose filter paper, a method using a dialysis tube, and the like.
  • GENECLEAN, QIAquick PCR purification Kits
  • ExoSAP-IT GE Healthcare Bioscience
  • DEAE-cellulose filter paper a method using DEAE-cellulose filter paper
  • a method using a dialysis tube and the like.
  • the base sequence of the cloned nucleic acid can be determined using a base sequencer.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing a nucleic acid encoding PAP.
  • the present invention further provides a transformant transformed with the above recombinant vector.
  • Such a recombinant vector and transformant can be obtained as follows. That is, a plasmid having a nucleic acid encoding MaPAP2.2 or a variant thereof is digested with a restriction enzyme. Examples of restriction enzymes used include, but are not limited to, EcoRI, KpnI, BamHI, and SalI. The ends may be smoothed by treating with T4 polymerase. The digested DNA fragment is purified by agarose gel electrophoresis. A PAP expression vector can be obtained by incorporating this DNA fragment into an expression vector using a known method. This expression vector is introduced into a host to produce a transformant and used for expression of the target protein.
  • a restriction enzyme include, but are not limited to, EcoRI, KpnI, BamHI, and SalI.
  • the ends may be smoothed by treating with T4 polymerase.
  • the digested DNA fragment is purified by agarose gel electrophoresis.
  • a PAP expression vector can be obtained by incorporating this
  • the expression vector and the host are not particularly limited as long as the target protein can be expressed, and examples of the host include fungi, bacteria, plants, animals, or cells thereof.
  • fungi include filamentous fungi such as M. alpina, which are lipid-producing bacteria, and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae.
  • bacteria include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • plants include oil plants such as rapeseed, soybean, cotton, safflower and flax.
  • a strain described in MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265 (1992) can be used, and specifically, a Mortierella genus.
  • the nucleic acid of the present invention is preferably capable of autonomous replication in the host or has a structure that can be inserted into the chromosome of the fungus.
  • a structure including a promoter and a terminator is preferable.
  • examples of expression vectors include pD4, pDuraSC, pDura5 and the like.
  • the promoter any promoter that can be expressed in the host may be used. For example, histonH4.1 gene promoter, GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene promoter, TEF (Translation elongation factor) gene A promoter derived from M. alpina such as a promoter is used.
  • Examples of methods for introducing a recombinant vector into filamentous fungi such as M. alpina include electroporation, spheroplast, particle delivery, and direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • a transformed strain can be obtained by selecting a strain that grows on a selective medium lacking the nutrient.
  • a drug resistance marker gene is used for transformation, cell colonies exhibiting drug resistance can be obtained by culturing in a selective medium containing the drug.
  • yeast When yeast is used as a host, examples of expression vectors include pYE22m. Commercially available yeast expression vectors such as pYES (Invitrogen) and pESC (STRATAGENE) may also be used. Suitable hosts for the present invention include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae EH13-15 (trp1, MAT ⁇ ). As the promoter, for example, promoters derived from yeast such as GAPDH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, etc. are used.
  • a method for introducing a recombinant vector into yeast for example, lithium acetate method, electroporation method, spheroplast method, dextran-mediated transfection, calcium phosphate precipitation, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, polynucleotide in liposome ( Singular or plural) encapsulation, and direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • examples of the expression vector include Pharmacia pGEX and pUC18.
  • the promoter for example, a promoter derived from Escherichia coli, phage or the like, such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter or the like is used.
  • an electroporation method or a calcium chloride method can be used as a method for introducing a recombinant vector into bacteria.
  • the present invention provides a method for producing a fatty acid composition from the transformant. That is, it is a method for producing a fatty acid composition from a culture obtained by culturing the transformant.
  • a fatty acid composition is a composition comprising a combination of one or more fatty acids.
  • the fatty acid may be a free fatty acid or may exist as a lipid containing a fatty acid such as triglyceride or phospholipid.
  • the fatty acid composition of the present invention can be produced by the following method. However, the production method is not limited to this method, and can be carried out using other generally known methods.
  • a medium used for culturing a PAP-expressing organism has an appropriate pH and osmotic pressure, and contains a nutrient solution necessary for growth of each host, trace components, and biological materials such as serum and antibiotics ( Any culture solution can be used as long as it is a medium.
  • yeast is transformed to express PAP, SC-Trp medium, YPD medium, YPD5 medium, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • SC-Trp medium is exemplified as a specific medium composition: YeastgnitroYbase w / o amino acids (DIFCO) 6.7g, glucose 20g, amino acid powder (1.25g of adenine sulfate, 0.6g of arginine per liter) Aspartic acid 3 g, Glutamic acid 3 g, Histidine 0.6 g, Leucine 1.8 g, Lysine 0.9 g, Methionine 0.6 g, Phenylalanine 1.5 g, Serine 11.25 g, Tyrosine 0.9 g, Valine 4.5 g, Threonine 6 g , Mixed with 0.6 g of uracil) 1.3 g.
  • DIFCO YeastgnitroYbase w / o amino acids
  • the culture conditions may be any conditions as long as they are suitable for the growth of the host and are suitable for keeping the produced enzyme stable. Specifically, anaerobic degree, culture time, temperature, humidity, static Individual conditions such as stationary culture or shaking culture can be adjusted.
  • the culture method may be culture under the same conditions (one-stage culture), or so-called two-stage culture or three-stage culture using two or more different culture conditions, but in the case of mass culture, the culture efficiency is good. Two-stage culture is preferred.
  • the method for producing a fatty acid composition of the present invention can be performed as follows.
  • a pre-culture colonies of the transformant are inoculated into the above SC-Trp medium or the like and subjected to shaking culture at 30 ° C. for 2 days.
  • 500 ⁇ l of a preculture solution is added to 10 ml of YPD5 (2% yeast extract, 1% polypeptone, 5% glucose) medium, and shake culture is performed at 30 ° C. for 2 days.
  • the present invention also provides a fatty acid composition that is a collection of one or more fatty acids in cells in which MaPAP2.2 or a variant thereof is expressed.
  • a fatty acid composition obtained by culturing a transformant expressing MaPAP2.2 or a variant thereof.
  • the fatty acid may be a free fatty acid or may exist in the form of a lipid containing a fatty acid such as triglyceride or phospholipid.
  • the fatty acid contained in the fatty acid composition of the present invention refers to a long-chain carbohydrate chain or branched monocarboxylic acid, such as myristic acid (tetradecanoic acid) (14: 0), myristoleic acid (tetradecenoic acid).
  • the fatty acid composition of the present invention may be a composition comprising any number and any kind of fatty acids as long as it is a combination of one or more of the above fatty acids.
  • the foodstuff etc. which contain a fatty acid composition Moreover, this invention provides the foodstuff containing the said fatty acid composition.
  • the fatty acid composition of the present invention can be used for applications such as production of foods containing fats and oils, industrial raw materials (raw materials such as cosmetics, pharmaceuticals (for example, topical drugs for skin), soaps) according to conventional methods.
  • Examples of the dosage form of the cosmetic (composition) or medicine (composition) include, but are not limited to, any dosage form such as solution, paste, gel, solid, and powder.
  • a form of food such as a capsule, or a natural liquid food in which the fatty acid composition of the present invention is blended with protein, saccharide, fat, trace element, vitamins, emulsifier, fragrance, etc., semi-digested Processing forms such as state nutrition foods, ingredient nutrition foods, drinks, enteral nutrients and the like can be mentioned.
  • examples of food include, but are not limited to, nutritional supplements, health foods, functional foods, infant foods, infant formulas, premature infant formulas, and elderly foods.
  • food refers to a generic term for solids, fluids, liquids, and mixtures thereof that can be consumed.
  • Nutritional supplements are foods that are enriched with specific nutritional ingredients.
  • the health food refers to food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements, natural foods, diet foods, and the like.
  • Functional food means food for supplementing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use.
  • Infant food refers to food for children up to about 6 years old.
  • the food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food.
  • Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old.
  • Premature infant formula refers to formula that is given to premature infants until about 6 months after birth.
  • These foods include natural foods such as meat, fish and nuts (treated with oils and fats); foods to which fats and oils are added when cooking Chinese food, ramen, soup, etc .; tempura, fries, fried chicken, fried rice, donuts, sugar sugar, etc. Foods that use fats and oils as a heating medium for foods; butters, margarines, mayonnaise, dressings, chocolates, instant ramen, caramels, biscuits, cookies, cakes, ice creams, etc. or processed foods with added fats during processing; The food etc. which sprayed or apply
  • lifted can be mention
  • the food of the present invention is not limited to foods containing fats and oils, such as bread, noodles, rice, confectionery (candy, chewing gum, gummi, tablet confectionery, Japanese confectionery), tofu and processed products thereof.
  • Agricultural foods such as sake, medicinal liquor, mirin, vinegar, soy sauce, miso; livestock foods such as yoghurt, ham, bacon, sausage; marine foods such as kamaboko, fried tempura, hampen; fruit juices, soft drinks, sports Beverages, alcoholic beverages, tea, etc. are listed.
  • the present invention also provides a method for evaluating and selecting lipid-producing bacteria using the nucleic acid encoding PAP or PAP protein of the present invention. . Specifically, it is as follows.
  • Evaluation method As one embodiment of the present invention, a method for evaluating lipid-producing bacteria using the nucleic acid or PAP protein encoding the PAP of the present invention can be mentioned.
  • the evaluation method include a method of evaluating the PAP activity of a lipid-producing strain as a test strain using a primer or probe designed based on the base sequence of the nucleic acid encoding the PAP of the present invention.
  • a general method of such an evaluation method is known and described in, for example, International Patent Application Pamphlet WO01 / 040514, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-205900, and the like. Hereinafter, this evaluation method will be briefly described.
  • the genome of the test strain is prepared.
  • any known method such as Hereford method or potassium acetate method can be used (see, for example, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)).
  • a primer or probe is designed based on the base sequence of the nucleic acid encoding the PAP of the present invention, preferably SEQ ID NO: 1. Any part of the base sequence of the nucleic acid encoding the PAP of the present invention can be used as the primer or probe, and the design thereof can be performed using a known method.
  • the number of bases of the polynucleotide used as a primer is usually 10 bases or more, preferably 15 to 25 bases. In addition, the number of bases in the sandwiched portion is usually 300 to 2000 bases.
  • a sequence specifically corresponding to the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the PAP of the present invention exists in the genome of the test strain. Detection of a specifically corresponding sequence can be performed using a known method. For example, a polynucleotide containing a part of the base sequence of the nucleic acid encoding the PAP of the present invention or a polynucleotide containing a base sequence complementary to a part of the base sequence is used as one primer.
  • the nucleic acid of the test strain can be obtained, for example, by PCR or the like. After amplification, the presence or absence of the amplified product, the size of the molecular weight of the amplified product, and the like can be measured.
  • Reaction conditions of the PCR method suitable for the method of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include the following conditions.
  • Cycle number Conditions such as 10 times or more.
  • the obtained reaction product can be separated by electrophoresis using an agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured.
  • the PAP activity of the test strain can be predicted or evaluated by confirming whether or not the molecular weight of the amplification product is large enough to include a nucleic acid molecule corresponding to a region specific to the base sequence of the present invention. Further, by analyzing the base sequence of the amplification product by the above method or the like, the PAP activity can be predicted or evaluated more accurately.
  • the method for evaluating PAP activity is as described above.
  • the evaluation method of the present invention is to evaluate the PAP activity of a test strain by culturing the test strain and measuring the expression level of PAP encoded by the base sequence of the present invention such as SEQ ID NO: 1. There may be.
  • the expression level of PAP can be measured by culturing the test strain under suitable conditions and quantifying the PAP mRNA or protein. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. For example, mRNA quantification can be performed by Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein quantification can be performed by, for example, Western blotting (Current Protocols in Molecular Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
  • a method for selecting a lipid-producing bacterium using a nucleic acid encoding the PAP of the present invention or a PAP protein there is a method for selecting a lipid-producing bacterium using a nucleic acid encoding the PAP of the present invention or a PAP protein.
  • a test strain by culturing a test strain, measuring the expression level of PAP encoded by the nucleotide sequence of the present invention such as SEQ ID NO: 1 and the like, and selecting a strain having the desired expression level A strain having a desired activity can be selected.
  • a reference strain is set, each of the reference strain and the test strain is cultured, the expression level of each strain is measured, the reference strain and the test strain are compared, and the desired strain is determined. You can also choose.
  • the reference strain and the test strain are cultured under appropriate conditions, the expression level of each strain is measured, and the test strain has a higher or lower expression than the reference strain.
  • a strain having a desired activity can be selected. Examples of the desired activity include a method of measuring the expression level of PAP and the composition of the fatty acid composition produced by PAP as described above.
  • a test strain having a desired activity can be selected by culturing a test strain and selecting a strain having a high or low activity of the present invention.
  • the desired activity include a method of measuring the expression level of PAP and the composition of the fatty acid composition produced by PAP as described above.
  • test strains or reference strains include strains into which the above-described vector of the present invention has been introduced, strains in which the expression of the nucleic acid of the present invention has been suppressed, strains that have been subjected to mutation treatment, naturally-mutated strains, etc. Although it can be used, it is not limited to these.
  • the PAP activity can be measured, for example, by the method described in the item “Nucleic acid encoding phosphatidic acid phosphatase” in this specification.
  • mutation treatment examples include physical methods such as ultraviolet irradiation and radiation irradiation, and chemical methods using chemical treatment such as EMS (ethyl methanesulfonate) and N-methyl-N-nitrosoguanidine (for example, Oshima). Edited by Taiji, see Biochemical Experimental Method 39, Yeast Molecular Genetics Experimental Method, p.67-75, Academic Publishing Center, etc.).
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • N-methyl-N-nitrosoguanidine for example, Oshima
  • examples of the strain used as the reference strain or test strain of the present invention include, but are not limited to, the above lipid-producing bacteria and yeasts.
  • the reference strain and the test strain may be used in combination with any strain belonging to different genera or species, and one or more strains may be used simultaneously as the test strain.
  • Example 1 Genomic analysis of Mortierella alpina M. alpina 1S-4 strain was inoculated into 100 ml of GY2: 1 medium (2% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0), and cultured with shaking at 28 ° C for 2 days. did. The cells were collected by filtration, and genomic DNA was prepared using DNeasy (QIAGEN).
  • the base sequence of the genomic DNA was determined using Roche 454 GS GS FLX Standard. At that time, the base sequence of the fragment library was determined for 2 runs, and the base sequence of the mate pair library was determined for 3 runs. By assembling the obtained base sequences, 300 super tigs were obtained.
  • Example 2 Synthesis of cDNA and preparation of cDNA library M. alpina 1S-4 strain was inoculated into 100 ml of medium (1.8% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0) at 28 ° C for 3 days. Pre-cultured. In a 10 L culture tank (Able Co., Tokyo), 5 L medium (1.8% glucose, 1% soybean flour, 0.1% olive oil, 0.01% adecanol, 0.3% KH 2 PO 4 , 0.1 % Na 2 SO 4 , 0.05% CaCl 2 .2H 2 O, 0.05% MgCl 2 .6H 2 O, pH 6.0), inoculating the entire preculture, 300 rpm, 1 vvm, 26 ° C.
  • medium 1.8% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0
  • Poly (A) + RNA was purified from total RNA using Oligotex-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (Takara Bio Inc.).
  • a cDNA library of each stage was prepared using ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE).
  • Example 3 Search for yeast-derived DPP1 homologs
  • yeast ScDPP1 accession number AAS56070
  • ScLPP1 accession number AAT93210
  • two Super Contigs were hit.
  • the gene according to SEQ ID NO: 4 was named MaPAP2.2.
  • Example 4 Cloning and sequence analysis of MaPAP2.2 (1) Cloning In order to clone MaPAP2.2 cDNA, the following primers were prepared. Primer PAP2.2-1f: TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT (SEQ ID NO: 6) Primer PAP2.2-4r: GACAATGCCGAGGATCGAGCC (SEQ ID NO: 7)
  • a probe was prepared by PCR using the plasmid pCR-MaPAP2.2-P as a template and the above primers.
  • ExTaq (Takara Bio) was used, but instead of the attached dNTP mix, a PCR labeling mix (Roche Diagnostics) was used to prepare a probe in which the amplified DNA was labeled with digoxigenin (DIG), MaPAP2.2 probe was used.
  • DIG digoxigenin
  • MaPAP2.2 probe was used. Using these probes, a cDNA library was screened.
  • Hybridization conditions are as follows. Buffer: 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamide; Temperature: 42 ° C. (overnight); Washing conditions: 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution (65 ° C.), 20 minutes ⁇ 3 times.
  • plasmid pB-MaPAP2.2 The one with the longest insert length contains the base sequence of SEQ ID NO: 5, and was named plasmid pB-MaPAP2.2.
  • FIG. 2 shows an alignment of the amino acid sequence of MaPAP2.2 and the amino acid sequence of a putative protein derived from Otsutake and ScDPP1 (YDR284C: Accession No. AAS56070) from yeast.
  • the identity of the amino acid sequence of MaPAP2.2 with MaPAP1 known as Mg2 + -independent PAP (PAP2) derived from Mortierella alpina was 20.5%.
  • the alignment of the amino acid sequences of MaPAP2.2 and MaPAP1 is shown in FIG.
  • the PAP2 family enzyme has three conserved regions, and amino acids essential for activity are also known. As shown in FIG. 3, these conserved regions are also conserved in MaPAP2.2 (the region indicated by the double underline in FIG. 3), and the arginine residue of domain 1 that is essential for activity, domain 2 and The histidine residue of domain 3 (residue indicated by * in FIG. 3) was conserved.
  • Example 5 Functional analysis of MaPAP2.2
  • a yeast expression vector was constructed as follows. First, primers Eco-PAP2-2-F and Kpn-PAP2-2-R were prepared, and PCR reaction was performed with ExTaq (Takara Bio) using pB-MaPAP2.2 as a template.
  • Eco-PAP2-2-F GAATTC ATG TTCTCGTCCATGCGCTTCAAG (SEQ ID NO: 8)
  • Kpn-PAP2-2-R TGGTACC TCA TGGTCCCAAGTATACATCGTTCC (SEQ ID NO: 9)
  • the obtained 1.1 kbp DNA fragment was TA-cloned using TOPO-TA cloning Kit (Invitrogen), the nucleotide sequence was confirmed, and a plasmid having the correct nucleotide sequence of MaPAP2.2 CDS (SEQ ID NO: 3) was pCR. -It was set as MaPAP2.2. Restriction of about 1.1 kbp DNA fragment obtained by digesting pCR-MaPAP2.2 with restriction enzymes EcoRI and KpnI and yeast expression vector pYE22m (Biosci. Biotech.
  • yeast culture Transformants with the respective vectors were cultured under the following conditions. That is, as a preculture, yeast was inoculated into 10 ml of SD-Trp and cultured at 30 ° C. for 1 day with shaking. As the main culture, 1 ml of the preculture was added to 100 ml of SD-Trp and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • PAP activity was measured as follows. As a reaction solution, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 ⁇ g linoleic acid (18: 2) -PA or oleic acid (18: 1) -PA or margaric acid (17: 0) -PA (phosphatidic acid as a substrate) ), 0.5 mM MgCl 2 or 0.5 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 ⁇ l crude enzyme solution in a total volume of 500 ⁇ l was prepared and reacted at 28 ° C. for 30 minutes. Chloroform: methanol (1: 2) was added to stop the reaction.
  • a reaction solution to which the supernatant of a yeast cell disruption solution of yeast (control strain) transformed with the plasmid pYE22m not containing the MaPAP2.2 gene was added was used.
  • Lipids were extracted by the Bligh & Dyer method and dried with a centrifugal concentrator. It melt
  • dissolved in chloroform and the lipid was fractionated by TLC (Silica gel 60 plate, hexane: diethyl ether: acetic acid 70: 30: 1).
  • the lipid was visualized under UV irradiation, the phospholipid fraction and the diglyceride (DG) fraction were scraped, and the total fatty acid contained was induced into a methyl ester and analyzed by gas chromatography.
  • DG diglyceride
  • PAP activity can be measured by measuring the amount of diglyceride (DG) converted from phosphatidic acid (PA) added as a substrate.
  • DG diglyceride
  • PA phosphatidic acid
  • FIG. 5 shows the result of examining the amount of 18: 2-DG in a reaction solution containing no Mg 2+ to which a crude enzyme solution of MaPAP2.2 or a crude enzyme solution of MaPAP1 was added.
  • 18: 2-DG the conversion from 18: 2-PA to 18: 2-DG was significantly enhanced, whereas when MaPAP1 was used, 18: 2-DG, similar to the control, was obtained. It was only recognized. This indicates that MaPAP2.2 and MaPAP1 have different substrate specificities.
  • FIG. 6 examined the amount of 18: 1-DG after the reaction in the case of adding and not adding 18: 1-PA as a substrate in the reaction solution containing the crude enzyme solution of MaPAP2.2 and the control.
  • the result is shown. Since 18: 1-PA is a phosphatidic acid originally present in yeast, the amount (background) of 18: 1-PA in the crude enzyme solution was measured without adding 18: 1-PA, and MaPAP2.2 It was confirmed that there was no difference between the expression strain and the control strain (FIG. 6A). After that, the amount of 18: 1-DG after the reaction when 18: 1-PA was added was measured. As a result, the MaPAP2.2 crude enzyme solution was compared with the control crude enzyme solution. It was confirmed that more 18: 1-PA was produced when used (FIG. 6B). This result shows that MaPAP2.2 has PAP activity even when 18: 1-PA is used as a substrate.
  • FIG. 7 shows the results of examining the amount of 17: 0-DG after the reaction when 17: 0-PA was added as a substrate in a reaction solution containing a crude enzyme solution of MaPAP2.2 and a control. is there.
  • the results shown in FIG. 7 indicate that MaPAP2.2 has PAP activity even when 17: 0-PA is used as a substrate.
  • the activity for converting 18: 2-PA to 18: 2-DG and the activity for converting 18: 1-PA to 18: 1-DG are comparable. It was.
  • the activity to convert 17: 0-PA to 17: 0-DG is the activity to convert 18: 2-PA to 18: 2-DG and the activity to convert 18: 1-PA to 18: 1-DG. It was estimated to be about 1/5.
  • the phosphatidic acid phosphatase activity of MaPAP2.2 is higher in substrate specificity for phosphatidic acid containing an acyl group having 18 carbon atoms than phosphatidic acid containing an acyl group having 17 carbon atoms. Show.
  • Sequence number 6 Primer PAP2.2-1f Sequence number 7: Primer PAP2.2-4r Sequence number 8: Primer Eco-PAP2-2-F Sequence number 9: Primer Kpn-PAP2-2-R

Abstract

　新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を提供する。　上記課題は、配列番号１、配列番号４、又は配列番号５の塩基配列を含む核酸、及び配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、ならびにそれらの変異体の提供により解決する。

Description

ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子
　本出願は、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用に関する。
　不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ：polyunsaturated fatty acid）と総称され、アラキドン酸やジホモγリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが知られている。この高度不飽和脂肪酸は、動物体内で合成できないものも含まれており、このような高度不飽和脂肪酸については、必須脂肪酸として食物から摂取する必要がある。高度不飽和脂肪酸は広く分布しており、例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離される。しかしながら、動物臓器に含まれる高度不飽和脂肪酸は少量で、動物臓器から高度不飽和脂肪酸を抽出したり分離したりするだけでは、大量に供給するには十分ではなかった。そのため、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ（Mortierella）属微生物は、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を生産する微生物として知られている。
　また、高度不飽和脂肪酸を植物で生産させる試みもなされている。高度不飽和脂肪酸は、トリアシルグリセロール（トリグリセリド、ＴＧともいう）などの貯蔵脂質を構成し、微生物の菌体内もしくは植物種子中に蓄積されることが知られている。
　貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、生体内で以下のとおり生成される。グリセロール－３－リン酸にグリセロール－３－リン酸アシル基転移酵素によりアシル基が転移されてリゾホスファチジン酸が生じ、リゾホスファチジン酸にリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりアシル基が転移されてホスファチジン酸が生じ、ホスファチジン酸がホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されてジアシルグリセロールが生じ、ジアシルグリセロールにジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりアシル基が転移されてトリアシルグリセロールが生じる。
　上記系路の中で、ホスファチジン酸（phosphatidic acid、以下「ＰＡ」と記載する場合もある。また、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸という場合もある。）は、トリアシルグリセロールの前駆体であるとともに、ジアシル型グリセロリン脂質の生合成前駆体である。酵母などではＰＡとシチジン５’－３リン酸（ＣＴＰ）からホスファチジン酸シチジルトランスフェラーゼ、によりＣＤＰジアシルグリセロール（ＣＤＰ－ＤＧ）が合成され、種々のリン脂質へと生合成される。
　上述したとおり、ＰＡを脱リン酸化してジアシルグリセロール（diacylglycerol、以下「ＤＧ」と記載する場合もある。）を生合成する反応は、ホスファチジン酸ホスファターゼ（E.C. 3.1.3.4、phosphatidic acid phosphatase、以下「ＰＡＰ」と記載する場合もある。）が触媒することが知られている。このＰＡＰは細菌から脊椎動物までのすべての生物で存在することが知られている。
　真菌類である酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、２つのタイプのＰＡＰが知られている（非特許文献１、２、７）。一方はＭｇ２＋依存性のＰＡＰ（ＰＡＰ１）であり、他方はＭｇ２＋非依存性のＰＡＰ（ＰＡＰ２）である。ＰＡＰ１をコードする遺伝子としては、ＰＡＨ１遺伝子が知られているが（非特許文献３～５）、ｐａｈ１Δ変異株はＰＡＰ１活性を有していることから、ほかにもＰＡＰ１活性を担う遺伝子があると考えられている。ｐａｈ１Δ変異株では、核膜やＥＲの膜が異常に拡張し、さらにリン脂質の生合成のキーとなる遺伝子の発現が異常に高まることが知られている（非特許文献６）。
　一方、ＰＡＰ２をコードする遺伝子としては、ＤＰＰ１遺伝子とＬＰＰ１遺伝子が知られており、これらが酵母におけるＰＡＰ２活性をほぼ担っている。これらの遺伝子がコードする酵素は基質特異性が広く、ジアシルグリセロールピロホスフェート（ＤＧＰＰ）、リゾホスファチジン酸、スフィンゴイドベースホスフェートやイソプレノイドホスフェートなどにも作用し、脱リン酸化することが知られている。
　脂質生産菌であるモルティエレラ　アルピナ（Mortierella alpina）では、Ｍｇ２＋依存性ＰＡＰ１ホモログとして、ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２の２種類が知られている（特許文献１）。また、Ｍｇ２＋非依存性のＰＡＰ２ホモログであるＭａＰＡＰ１遺伝子が知られている（特許文献２）。
国際公開公報第ＷＯ２０１１／０８１１３５号パンフレット 国際公開公報第ＷＯ２００９／００８４６６号パンフレット
Biochem. Biophys. Acta, 1348, 45-55, 1997 Trends Biochem Sci., 31(12), 694-699, 2006 EMBO J., 24, 1931-1941, 2005, J. Biol. Chem., 281(14), 9210-9218, 2006 J. Biol. Chem., 281(45), 34537-34548, 2006 J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, 2007 J. Biol. Chem., 284(5), 2593-2597, 2009
　これまでにいくつかのＰＡＰ遺伝子が報告されているが、宿主細胞に導入して発現させた場合に、当該宿主が産生する脂肪酸組成物の脂肪酸組成を変化させ得ることについて検討された例は少ない。宿主細胞に導入する又は発現させることで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりできるような、新規な遺伝子を導入することが求められている。
　本発明の目的は、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子、およびそれにコードされるタンパク質、ならびにそれら利用法を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Mortierella alpinaのゲノムを解析し、この中から既知のＭｇ２＋非依存性のホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ２）遺伝子と相同性のある配列を抽出した。さらに、ＰＡＰをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより全長ｃＤＮＡをクローニングした。その遺伝子を酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して、クローニングしたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質がホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有することを確認した。それにより、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）に関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、一態様において、本発明は以下の通りであってよい。
　（１）以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　（２）以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～１１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　（３）以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
　（４）ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、（１）又は（２）に記載の核酸。
　（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
　（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１～１１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
　（７）ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、（５）又は（６）に記載のタンパク質。
　（８）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
　（９）（１）～（４）のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
　（１０）（９）に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
　本発明は、新規なＰＡＰ遺伝子、及びそれにコードされるタンパク質、ならびにそれらの利用法を提供する。本発明のＰＡＰは、ＰＡＰを導入していない宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、組成が異なる脂肪酸組成物を宿主中に産生可能であることが期待される。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
図１－１は、ＭａＰＡＰ２．２のゲノム配列およびＣＤＳの塩基配列を示す。 図１－２は、図１－１の続きである。 図２は、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と、オオキツネタケ由来の推定タンパク質および酵母由来のＳｃＤＰＰ１（YDR284C：アクセッション番号　AAS56070））のアミノ酸配列のアラインメントである。 図３は、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と、Mortierella alpina由来のＭｇ２＋非依存性ＰＡＰ（ＰＡＰ２）として既知のＭａＰＡＰ１（WO2009/008466）のアミノ酸配列のアラインメントである。二重下線は、Ｍｇ２＋非依存性のホスファチジン酸ホスファターゼ２型（ＰＡＰ２）ファミリー酵素の３つの保存領域（Ｎ末端側より順に、ドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３）を示す。＊は、ＰＡＰ活性に必至なアミノ酸を示す。 図４は、ＭａＰＡＰ２．２の１８：２－ＰＡを１８：２－ＤＧに変換する活性に関し、Ｍｇ２＋依存性について検討した結果を示すグラフである（ｎ＝１）。Ａは、Ｍｇ２＋を添加した場合の結果を示す。Ｂは、ＥＤＴＡを添加した場合（Ｍｇ２＋不含）の結果を示す。縦軸は、ＤＧ画分中に見出された１８：２の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。 図５は、Ｍｇ２＋不含の反応液における、ＭａＰＡＰ２．２（Ａ）及びＭａＰＡＰ１（Ｂ）の１８：２－ＰＡを１８：２－ＤＧに変換する活性について検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。縦軸は、ＤＧ画分中に見出された１８：２の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。 図６Ａは、ＭａＰＡＰ２．２を含む反応液およびコントロールにおいて、基質であるホスファチジン酸を添加しない場合の１８：１－ＤＧの量を検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図６Ｂは、ＭａＰＡＰ２．２を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１８：１－ＰＡを添加した場合の、反応後の１８：１－ＤＧの量を検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。縦軸はいずれも、ＤＧ画分中に見出された１８：１の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。 図７は、ＭａＰＡＰ２．２を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１７：０－ＰＡを添加した場合の、反応後の１７：０－ＤＧの量を検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。縦軸はいずれも、ＤＧ画分中に見出された１７：０の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。
　本発明は、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成させることを特徴とする、Mortierella属由来の新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子、それにコードされるタンパク質、およびそれらの利用法に関する。
　ホスファチジン酸ホスファターゼは、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成する反応を触媒する酵素である。本発明のＰＡＰの基質は、通常、ホスファチジン酸であるが、これに限定されない。
　ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸
　本発明のホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）には、ＭａＰＡＰ２．２及びその変異体が含まれる。ＭａＰＡＰ２．２をコードする核酸のｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及びアミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　つまり、ＭａＰＡＰ２．２に関連する配列としては、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列である配列番号２、ＭａＰＡＰ２．２のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号１、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号３、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号５があげられる。このうち、配列番号１は配列番号５の第７５～１１６３番目の塩基配列に相当し、配列番号３は配列番号５の第７５～１１６６番目の塩基配列に相当する。また、ＭａＰＡＰ２．２をコードするゲノム塩基配列として、配列番号４があげられる。配列番号４のゲノム配列は、エキソン３個とイントロン２個からなっており、エキソン領域は配列番号４の第１～２０７番目、第４４５～５８２番目、第８８９～１６３２番目である。
　本明細書において核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
　本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号５で示される塩基配列、等を含む核酸があげられる。
　上記塩基配列を得るためには、ＰＡＰ活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のＰＡＰ活性を有するタンパク質と相同性のあるタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＰＡＰ活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これに限定されない。
　ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３～４日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％　Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてpoly（Ａ）＋ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
　ゲノムＤＮＡを解析する場合は、ＰＡＰ活性を有する生物の細胞を培養し、当該細胞からゲノムＤＮＡを調製する。得られたゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、決定した塩基配列をアッセンブリする。最終的に得られたスーパーコンティグの配列から、既知のＰＡＰ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする配列を探索する。このようなアミノ酸配列をコードするものとしてヒットしたスーパーコンティグの配列からプライマーを作製し、上述したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込み、クローン化する。クローン化されたプラスミドを鋳型として、上述のプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりプローブを作製する。作製したプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
　ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列を、GenBankに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpプログラムで相同性検索を行った。このアミノ酸配列は、オオキツネタケの推定タンパク質（配列番号１０、アクセッション番号：XP　001878243）と最も高いスコアでヒットし、同一性は３６．７％である。また、Mortierella alpina由来の公知のＰＡＰ２（Ｍｇ２＋非依存性のＰＡＰ）であるＭａＰＡＰ１のアミノ酸配列と、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列の間の同一性は２０．５％である。
　本発明はまた、上記配列番号１で示される塩基配列、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質がホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）活性を有することを意味する。本明細書において、ＰＡＰ活性とは、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成する反応を触媒する活性である。また、ＰＡＰ活性は、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いものであってもよいが、これに限定されない。また、ＰＡＰ活性は、Ｍｇ２＋非依存性であってもよいが、これに限定されない。
　配列番号１で示される塩基配列、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、を含む核酸の変異体であって当該核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　具体的には、
(i) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～110個、1～100個、1～75個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～110個、1～100個、1～75個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２に示すアミノ酸配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～110個、1～100個、1～75個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)～(iii)を組み合わせたアミノ酸配列、
からなるタンパク質であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
　上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
　保存的置換は、一般的には、生物学的合成系や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
　以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸及び２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸及び２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン及び４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
　非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
　また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
　本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
　Ｄ－アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α－二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
　なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
　同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
　当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
　特に、図３において二重下線で示したように、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列（配列番号２）中の第１１５～１２３残基、第１７２～１７５残基、及び第２２９～２３３残基に、Ｍｇ２＋非依存性のホスファチジン酸ホスファターゼ２型（ＰＡＰ２）ファミリー酵素の３つの保存領域が存在する。また、ＰＡＰ２ファミリー酵素の３つの保存領域中、ドメイン１のアルギニン、ドメイン２及び３のヒスチジンは、活性に必須なアミノ酸として知られており、ＭａＰＡＰ２．２においても当該アミノ酸が、それぞれ配列番号２の第１２２残基のアルギニン、第１７５残基のヒスチジン及び第２２９残基のヒスチジンとして保存されている。上記保存領域は、ＰＡＰ２ファミリー酵素に必須の領域であり、本発明のＰＡＰにとっても重要な領域である。従って、本発明の変異体は、上記保存領域が保存されている限り、いかなる変異体であってもよい。
　当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造－機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
　上記したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
　なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１～３０個、１～２０個、又は１～１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
　本発明の核酸がコードするタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異または修飾の部位は、ＰＡＰ活性が保持される限り制限はない。
　ＰＡＰ活性は、公知の方法を用いて測定することが可能である。例えば、以下の文献：J. Biol. Chem., 273, 14331-14338(1998)を参照することができる。
　例えば、ＰＡＰ活性は以下の通り測定してもよい。本発明のＰＡＰを発現させた形質転換細胞を破砕し、その細胞破砕液を遠心分離して上清を回収し、粗酵素液とする。粗酵素液をさらに本発明のＰＡＰについて精製してもよい。そして、本発明のＰＡＰを含む粗酵素液又は精製した本発明のＰＡＰを、１００μｇ／ｍＬ　ホスファチジン酸、および５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む反応液に添加し、２５～２８℃で適当な時間反応させる。クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したジアシルグリセロール量を定量することができる。
　（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
　ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
　具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ、４２℃～５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ～３×ＳＳＣ、４５℃～５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ、４０℃～６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％～０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
　高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ～２×ＳＳＣ、５５℃～６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ～１×ＳＳＣ、６０℃～６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ～２×ＳＳＣ、５０℃～６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０～６５℃があげられる。
　特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
　また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
　本発明に含まれる塩基配列としては、好ましくは、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
　（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　好ましくは、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
　２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
　（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む。
　本発明の核酸がコードするタンパク質は、ＰＡＰ活性を有する限り、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。具体的には、本発明の核酸がコードするタンパク質のアミノ酸配列として、配列番号２で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％（例えば、９５％、さらには、９８％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列である。さらに好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
　２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びClustalW等があげられる。特に、BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI(Infomax)等のプログラムを用いて決定することもできる。
　複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ－スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ－スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
　（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。
　（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　配列番号４からなる塩基配列は、ＭａＰＡＰ２．２をコードするゲノムＤＮＡ配列である。
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む。
　上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ゲノムライブラリー等から得ることができる。ハイブリダイズの条件は、上記の通りである。
　（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４からなる塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。好ましくは、配列番号４に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは、９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列があげられる。２つの塩基配列の同一性％は、上述したように決定することができる。
　配列番号４のゲノムＤＮＡ配列は、エキソン３個とイントロン２個からなっており、エキソン領域は配列番号４の第１～２０７番目、第４４５～５８２番目、第８８９～１６３２番目である。
　別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して１００％同一であり、そして、エキソン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列があげられる。
　また別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示されるゲノムＤＮＡ配列において、エキソン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して１００％同一であり、そして、イントロン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それによりエキソン領域が連結してＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、があげられる。
　さらに別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、そして、エキソン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それにより連結したエキソン領域がＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする、塩基配列があげられる。
　２つの塩基配列の同一性％は、上述した方法により決定することができる。
　また、本発明の核酸には、配列番号１からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号１に示す塩基配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～330個、1～300個、1～250個、1～200個、1～150個、1～100個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号１に示す塩基配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～330個、1～300個、1～250個、1～200個、1～150個、1～100個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号１に示す塩基配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～330個、1～300個、1～250個、1～200個、1～150個、1～100個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)～(iii)を組み合わせた塩基配列、
であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
　本発明の核酸の別の態様としては、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列のフラグメントを含む核酸も含まれる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列
　（ａ）配列番号１で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｄ）配列番号５で示される塩基配列については、表１に記載したとおりである。また、配列番号４で示される塩基配列についても上述の通りである。上記配列のフラグメントとは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
　また、本発明の核酸には以下の核酸も含まれる。
（１）　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（２）　以下の(ａ)～（ｇ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
　ホスファチジン酸ホスファターゼタンパク質
　本発明のタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びその変異体であって前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおり、ＰＡＰ活性を有するタンパク質を意味する。
　本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質
　上記のうち、配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列については、上記、『ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「ＰＡＰ活性を有するタンパク質」は、配列番号１の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質も含まれる。
　また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
　また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１～１１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
　核酸のクローニング
　ＰＡＰの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
　例えば、pBlue-Script TMSK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号５等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、
上流側用プライマーとして、プライマーPAP2.2-1f：５’－TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT－３’（配列番号６）、
下流側用プライマーとして、プライマーPAP2.2-4r：５’－GACAATGCCGAGGATCGAGCC－３’（配列番号７）、
等を、各々用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば以下の条件があげられる。
変性温度：９０～９５℃
アニーリング温度：４０～６０℃
伸長温度：６０～７５℃
サイクル数：１０回以上
　得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
　クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
　ＰＡＰ発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
　本発明はまた、ＰＡＰをコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
　このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、ＭａＰＡＰ２．２またはその変異体をコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このＤＮＡ断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、ＰＡＰ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
　このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
　脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等があげられる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
　真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、TEF（Translation elongation factor）遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来するプロモーターが用いられる。
　M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
　酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられる。また、pYES（Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
　酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
　大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
　脂肪酸組成物の製造方法
　本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。脂肪酸組成物は、１又はそれ以上の脂肪酸の組み合わせを含む組成物である。ここで、脂肪酸は遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリドやリン脂質等の脂肪酸を含む脂質として存在していてもよい。本発明の脂肪酸組成物は、具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
　ＰＡＰを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してＰＡＰを発現させた場合は、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する：１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ。
　培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
　宿主として酵母を用いて２段階培養を行う場合、本発明の脂肪酸組成物の製造方法は以下のように行うことができる。前培養として、形質転換体のコロニーを、上記のSC-Trp培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、YPD5（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う。
　脂肪酸組成物
　本発明はまた、ＭａＰＡＰ２．２又はその変異体が発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、ＭａＰＡＰ２．２又はその変異体が発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリド、リン脂質等の脂肪酸を含む脂質の形で存在していてもよい。
　本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）(14:0)、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（14:1）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）(16:0)、パルミトレイン酸（9－ヘキサデセン酸）(16:1)、マルガリン酸（ヘプタデカン酸）（17:0)、ステアリン酸（オクタデカン酸）(18:0)、オレイン酸（cis－9－オクタデセン酸）(18:1(9))、バクセン酸（11－オクタデセン酸）(18:1(11))、リノール酸（cis, cis－9,12 オクタデカジエン酸）(18:2(9,12))、α－リノレン酸（9,12,15－オクタデカトリエン酸）(18:3(9,12,15))、γ－リノレン酸（6,9,12－オクタデカトリエン酸）(18:3(6,9,12))、ステアリドン酸(6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸（イコサン酸）(20:0)、（8,11－イコサジエン酸）(20:2(8,11))、ミード酸（5,8,11－イコサトリエン酸）(20:3(5,8,11))、ジホモγ-リノレン酸（8,11,14-イコサトリエン酸）(20:3(8,11,14))、アラキドン酸（5,8,11,14－イコサテトラエン酸）(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸（8,11,14,17-イコサテトラエン酸）（20:4(8,11,14,17)、エイコサペンタエン酸（5,8,11,14,17-イコサペンタエン酸）（20:5(5,8,11,14,17)）、ベヘン酸（ドコサン酸）(22:0)、（7,10,13,16-ドコサテトラエン酸）(22:4(7,10,13,16))、（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）(22:5(7,10,13,16,19))、（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,10,13,16))、（4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸）(22:6(4,7,10,13,16,19))、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）(24:0)、ネルボン酸（cis－15－テトラコセン酸）(24:1)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）(26:0)、等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
　本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
　脂肪酸組成物を含む食品等
　また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
　さらに、食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
　栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
　これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
　ＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
　本発明はまた、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
　（１）評価方法
　本発明の一態様として、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。上記評価方法としては、まず、本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株のＰＡＰ活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
　まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
　本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列、好ましくは、配列番号１に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５～２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００～２０００塩基が適当である。
　上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列と特異的に対応する配列が存在するか否かを調べる。特異的に対応する配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列の一部に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流若しくは下流の配列の一部を含むポリヌクレオチド、又は上記配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。
　本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０～９５℃
アニーリング温度：４０～６０℃
伸長温度：６０～７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株のＰＡＰ活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらにＰＡＰ活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、ＰＡＰ活性の評価方法は、上記のとおりである。
　また、本発明の評価方法は、被検菌株を培養し、配列番号１等の本発明の塩基配列がコードするＰＡＰの発現量を測定することによって、被検菌株のＰＡＰ活性を評価するものであってもよい。なお、ＰＡＰの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、ＰＡＰのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
　（２）選択方法
　本発明の他の態様として、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１等の本発明の塩基配列がコードするＰＡＰの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、ＰＡＰの発現量及びＰＡＰが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
　また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、ＰＡＰの発現量及びＰＡＰが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
　被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、ＰＡＰ活性は、例えば本明細書中の「ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39　酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。
　なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
　実施例１：　Mortierella alpinaのゲノム解析
　M. alpina 1S-4株を１００ｍｌのＧＹ２：１培地（２％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy (QIAGEN) を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
　上記ゲノムＤＮＡの塩基配列を、Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を３ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、３００個のスーパーコンティグが得られた。
　実施例２：　ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラリーの作製
　M. alpina 1S-4株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、３日間２８℃で前培養した。１０Ｌ培養槽（Able Co.、東京）に５Ｌの培地（１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）を入れ、前培養物を全量植菌し、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃の条件で８日間通気攪拌培養した。培養１、２、及び３日目に各々２％、２％、及び１．５％相当のグルコースを添加した。培養１、２、３、６、及び８日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法でトータルＲＮＡを調製した。Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（Takara Bio Inc.）を用いて、トータルＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの精製を行った。各ステージのｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit （STRATAGENE）を用いて作製した。
　実施例３：　酵母由来ＤＰＰ１ホモログの探索
　酵母のＳｃＤＰＰ１（YDR284C：アクセッション番号　AAS56070）とＳｃＬＰＰ１（YDR503C：アクセッション番号　AAT93210）のホモログをゲノムデータベースより検討した。その結果、２つのスーパーコンティグがヒットした。１つは、ＭａＰＡＰ１に係るゲノム配列を含むスーパーコンティグであり、他方は、配列番号４を含むスーパーコンティグであった。配列番号４に係る遺伝子をＭａＰＡＰ２.２と命名した。　
　実施例４：　ＭａＰＡＰ２．２のクローニング及び配列解析
　（１）クローニング
　MaＰＡＰ２．２のｃＤＮＡをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
プライマーPAP2.2-1f：TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT（配列番号６）
プライマーPAP2.2-4r：GACAATGCCGAGGATCGAGCC（配列番号７）
　上記のとおり作製したライブラリーを鋳型とし、プライマーPAP2.2-1FとプライマーPAP2.2-4Rの組み合わせでExTaq(タカラバイオ)を用いて、９４℃　２分、（９４℃　１分、５５℃　１分、７２℃　１分）３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。得られた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、TOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を使ってクローン化し、インサート部分の塩基配列を決定した。配列番号３の５３４～９０４番目の塩基配列を有するプラスミドをpCR-MaPAP2.2-Pとした。
　次に、このプラスミドpCR-MaPAP2.2-Pを鋳型として、上記プライマーを用いてPCRによりプローブを作製した。反応には、ExTaq（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（DIG）ラベルしたプローブを作製し、MaPAP2.2プローブとした。これらのプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
　ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回。
　検出は、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンにより、プラスミドを切り出し、プラスミドＤＮＡを得た。最もインサート長の長いものは、配列番号５の塩基配列を含んでおり、プラスミドpB-MaPAP2.2と名づけた。
　開始コドンや終止コドンの存在、他のPAP2ホモログとの比較から、配列番号５の７５番目～１１６６番目（配列番号３と同じ）が、ＭａＰＡＰ２．２のＣＤＳであると考えられた。
　（２）配列解析
　ＭａＰＡＰ２．２遺伝子の塩基配列及びこれのコードする推定アミノ酸配列について、BLAST及びclustalWによる解析で、既知の核酸の塩基配列及びアミノ酸配列に対する相同性検索を行った。BLASTXによるGENBANKに登録されているアミノ酸配列に対する相同性検索でヒットしたものの中で、もっともE-Valueの低かった配列は、オオキツネタケ（Laccaria bicolor）由来の推定タンパク質（アクセッション番号：XP　001878243）で、アミノ酸配列の同一性は３６．７％であった。ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と、オオキツネタケ由来の推定タンパク質および酵母由来のＳｃＤＰＰ１（YDR284C：アクセッション番号　AAS56070））のアミノ酸配列のアラインメントを図２に示した。
　また、Mortierella alpina由来のＭｇ２＋非依存性ＰＡＰ（ＰＡＰ２）として既知のＭａＰＡＰ１（WO2009/008466）と、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列の同一性は２０．５％であった。ＭａＰＡＰ２．２とＭａＰＡＰ１のアミノ酸配列のアラインメントを図３に示した。ＰＡＰ２ファミリー酵素には３つの保存領域があり、活性に必須のアミノ酸も知られている。図３に示したとおり、ＭａＰＡＰ２．２においてもこれらの保存領域は保存されており（図３中、二重下線で示した領域）、活性に必須であるドメイン１のアルギニン残基、ドメイン２とドメイン３のヒスチジン残基（図３中、＊で示した残基）が保存されていた。
　実施例５：　ＭａＰＡＰ２．２の機能解析
　（１）酵母発現ベクターの構築
　MaPAP2.2を酵母で発現させるために、以下のとおり酵母発現用ベクターを構築した。まず、プライマーEco-PAP2-2-FとKpn-PAP2-2-Rを作成し、pB-MaPAP2.2を鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）にてＰＣＲ反応を行った。
Eco-PAP2-2-F：GAATTCATGTTCTCGTCCATGCGCTTCAAG（配列番号８）
Kpn-PAP2-2-R：TGGTACCTCATGGTCCCAAGTATACATCGTTCC（配列番号９）
　得られた１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO-TA cloning Kit（インビトロジェン）を用いてＴＡクローニングし、塩基配列を確認し、ＭａＰＡＰ２．２のＣＤＳの正しい塩基配列（配列番号３）を持つプラスミドをpCR-MaPAP2.2とした。pCR-MaPAP2.2を制限酵素EcoRIとKpnIで消化して得られた約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片と、酵母発現用ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで消化して得られた約８．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ligation high（TOYOBO）で連結し、プラスミドpYE-MaPAP2.2を構築した。
　（２）形質転換酵母の取得
　プラスミドpYE22m、pYE-MaPAP2.2、pYE-MaPAP1（WO2009/008466）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母S. cerevisiae EH13-15株（trp1，MATα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids（DIFCO）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。
　（３）酵母の培養
　それぞれのベクターでの形質転換株を、以下の条件で培養した。すなわち、前培養として、SD-Trp　１０ｍｌに酵母を植菌し、３０℃で１日、振とう培養を行った。本培養として、前培養液１ｍｌをSD-Trp　１００ｍｌに添加し、３０℃で１日、振とう培養した。
　（４）粗酵素液の調製
　遠心分離にて集菌後、水洗し、－８０℃にて一時保存した。菌体に５ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、０．３Ｍスクロース、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ）を添加し、よく懸濁した。その後、フレンチプレスにて１６ｋＰａで３回処理することにより、菌体を破砕した。菌体破砕液を１，５００×ｇ、４℃にて１０分間、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
　（５）ＰＡＰ活性測定
　方法
　ＰＡＰ活性は、以下の通り測定した。反応液として、５０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、５０μｇ　リノール酸（１８：２）－ＰＡまたはオレイン酸（１８：１）－ＰＡまたはマルガリン酸（１７：０）－ＰＡ（基質となるホスファチジン酸）、０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２または０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１００μｌ粗酵素液、を含む全量５００μｌの反応液を調製し、２８℃で３０分間反応させた。クロロホルム：メタノール（１：２）を添加して反応を停止させた。コントロールとして、粗酵素液のかわりにＭａＰＡＰ２．２遺伝子を含まないプラスミドpYE22mで形質転換した酵母（コントロール株）の菌体破砕液の上清を添加した反応液を用いた。Bligh & Dyer法により脂質を抽出し、遠心濃縮機で乾固させた。クロロホルムに溶解し、ＴＬＣ（シリカゲル６０プレート、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝７０：３０：１）により脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧後、ＵＶ照射下で脂質を可視化し、リン脂質画分とジグリセリド（ＤＧ）画分を掻きとり、含まれる全脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにて分析した。
　上記の反応において、基質として添加したホスファチジン酸（ＰＡ）から変換されたジグリセリド（ＤＧ）の量を測定することにより、ＰＡＰ活性を測定することができる。
　結果
　結果を図４～７に示した。
　図４に示すとおり、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を添加した反応液においては、コントロールと比較して１８：２－ＤＧの量が増加した。このことは、ＭａＰＡＰ２．２の存在により、１８：２－ＰＡから１８：２－ＤＧへの変換が高められた、すなわちＭａＰＡＰ２．２のはＰＡＰ活性を有することが示された。また、図４に記載の結果から、Ｍｇ２＋の有無にかかわらず、コントロールとＭａＰＡＰ２．２の高発現株（図４において、MaPAP2-2と表記した）の１８：２－ＰＡから１８：２－ＤＧへの変換の程度は同等、すなわち、ＭａＰＡＰ２．２はＭｇ２＋の有無にかかわらず同等のＰＡＰ活性を示すことが明らかとなった。このことは、ＭａＰＡＰ２．２のＰＡＰ活性はＭｇ２＋に依存しないことを示すものである。
　図５は、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液、又はＭａＰＡＰ１の粗酵素液を添加したＭｇ２＋不含の反応液における１８：２－ＤＧの量を検討した結果を示すものである。ＭａＰＡＰ２．２を用いた場合には、１８：２－ＰＡから１８：２－ＤＧへの変換が有意に高められたのに対し、ＭａＰＡＰ１を用いた場合はコントロールと同程度の１８：２－ＤＧしか認められなかった。このことは、ＭａＰＡＰ２．２とＭａＰＡＰ１とでは異なる基質特異性を有することを示している。
　図６は、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１８：１－ＰＡを添加した場合、ならびに添加しない場合の、反応後の１８：１－ＤＧの量を検討した結果を示すものである。１８：１－ＰＡは酵母において元々存在するホスファチジン酸であるので、１８：１－ＰＡを添加しない条件で粗酵素液中の１８：１－ＰＡの量（バックグラウンド）を測定し、ＭａＰＡＰ２．２発現株とコントロール株の間で差がないことを確認した（図６Ａ）。その上で、１８：１－ＰＡを添加した場合の反応後の１８：１－ＤＧの量を測定したところ、コントロールの粗酵素液を用いた場合に比べて、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を用いた場合に、より多くの１８：１－ＰＡが生成することが確認された（図６Ｂ）。この結果は、ＭａＰＡＰ２．２が、１８：１－ＰＡを基質とした場合にもＰＡＰ活性を有することを示している。
　図７は、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１７：０－ＰＡを添加した場合の、反応後の１７：０－ＤＧの量を検討した結果を示すものである。図７に示す結果は、この結果は、ＭａＰＡＰ２．２が、１７：０－ＰＡを基質とした場合にもＰＡＰ活性を有することを示している。
　また、図５ないし図７の結果の比較から、１８：２－ＰＡを１８：２－ＤＧに変換する活性と、１８：１－ＰＡを１８：１－ＤＧに変換する活性は同程度と考えられた。一方、１７：０－ＰＡを１７：０－ＤＧに変換する活性は、１８：２－ＰＡを１８：２－ＤＧに変換する活性や１８：１－ＰＡを１８：１－ＤＧに変換する活性の１／５程度と見積もられた。このことは、ＭａＰＡＰ２．２のホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも、炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いものであることを示している。
　配列番号６：プライマーPAP2.2-1f
　配列番号７：プライマーPAP2.2-4r
　配列番号８：プライマーEco-PAP2-2-F
　配列番号９：プライマーKpn-PAP2-2-R

Claims (10)

  1. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
  2. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～１１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
  3. 　以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号４で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号５で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
  4. 　ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸。
  5. 　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
  6. 　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１～１１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
  7. 　ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、請求項５又は６に記載のタンパク質。
  8. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
  9. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
  10. 　請求項９に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107760610A (zh) * 2017-09-29 2018-03-06 中国科学院南京土壤研究所 一株长孢被孢霉及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101519678B1 (ko) * 2007-07-11 2015-05-12 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 포스파티딘산포스파타아제 동족체 및 그 이용

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08205900A (ja) 1995-02-01 1996-08-13 Kirin Brewery Co Ltd 酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法
WO2001040514A1 (fr) 1999-11-30 2001-06-07 Asahi Breweries, Ltd Procede d'estimation des proprietes de floculation de la levure basse de brasserie
WO2009008466A1 (ja) 2007-07-11 2009-01-15 Suntory Holdings Limited ホスファチジン酸ホスファターゼホモログとその利用
WO2011081135A1 (ja) 2009-12-28 2011-07-07 サントリーホールディングス株式会社 ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6476294B1 (en) * 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
RU2005114507A (ru) * 2002-10-09 2005-10-27 Цзюнь ЛЮ (CA) Секретируемая кислая фосфатаза (sapm), присутствующая только в патогенных микобактериях и селективно экспрессирующая при фагосомальном ph

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08205900A (ja) 1995-02-01 1996-08-13 Kirin Brewery Co Ltd 酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法
WO2001040514A1 (fr) 1999-11-30 2001-06-07 Asahi Breweries, Ltd Procede d'estimation des proprietes de floculation de la levure basse de brasserie
WO2009008466A1 (ja) 2007-07-11 2009-01-15 Suntory Holdings Limited ホスファチジン酸ホスファターゼホモログとその利用
WO2011081135A1 (ja) 2009-12-28 2011-07-07 サントリーホールディングス株式会社 ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biochemistry Experiments vol. 39, Experimental Protocols for Yeast Molecular Genetics", vol. 39, JAPAN SCIENTIFIC SOCIETIES PRESS, pages: 67 - 75
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
"Current Protocols in Molecular Biology", 1994, JOHN WILEY & SONS
"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.", 1995, OXFORD UNIVERSITY
"Methods in Yeast Genetics", 1990, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, pages: 130
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.", 2001, COLD SPRING HARBOR PRESS
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed.", 2001, COLD SPRING HARBOR PRESS
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 10
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
ALTSCHUL ET AL., NUCL. ACIDS. RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 30, 1989, pages 515 - 520
BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1348, 1997, pages 45 - 55
BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. 59, 1995, pages 1221 - 1228
COMPUTERS AND CHEMISTRY, 1993
EMBO J., vol. 24, 2005, pages 1931 - 1941
J. BIOL. CHEM., vol. 273, 1998, pages 14331 - 14338
J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 14, 2006, pages 9210 - 9218
J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 45, 2006, pages 34537 - 34548
J. BIOL. CHEM., vol. 282, no. 51, 2007, pages 37026 - 37035
J. BIOL. CHEM., vol. 284, no. 5, 2009, pages 2593 - 2597
KUNKEL, METHOD ENZYMOL., vol. 85, 1988, pages 2763 - 6
KUNKEL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 488 - 92
KYTE ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 157, 1982, pages 105 - 131
MYCOTAXON, vol. XLIV, no. 2, 1992, pages 257 - 265
PILLAI M.G. ET AL.: "Characterization of triacylglycerol biosynthesis in subcellular fractions of an oleaginous fungus, Mortierella ramanniana var. angulispora.", BIOCHIM.BIOPHYS. ACTA, vol. 1393, no. 1, 31 July 1998 (1998-07-31), pages 128 - 36, XP008131426 *
See also references of EP2738254A4 *
TRENDS BIOCHEM. SCI., vol. 31, no. 12, 2006, pages 694 - 699
WOOTTON; FEDERHEN, COMPUTERS AND CHEMISTRY, 1993
WOOTTON; FEDERHEN: "Analysis of compositionally biased regions in sequence databases", METHODS ENZYMOL., vol. 266, 1996, pages 554 - 71

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107760610A (zh) * 2017-09-29 2018-03-06 中国科学院南京土壤研究所 一株长孢被孢霉及其应用
CN107760610B (zh) * 2017-09-29 2021-01-19 中国科学院南京土壤研究所 一株长孢被孢霉及其应用

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