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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberWO2013073483 A1
Publication typeApplication
Application numberPCT/JP2012/079182
Publication dateMay 23, 2013
Filing dateNov 9, 2012
Priority dateNov 14, 2011
Also published asCN104271756A, CN104805049A, CN105506036A, CN105647997A, EP2781600A1, EP2781600A4, EP2921558A1, US9365603, US20140296497, US20160194667, WO2013073483A9
Publication numberPCT/2012/79182, PCT/JP/12/079182, PCT/JP/12/79182, PCT/JP/2012/079182, PCT/JP/2012/79182, PCT/JP12/079182, PCT/JP12/79182, PCT/JP12079182, PCT/JP1279182, PCT/JP2012/079182, PCT/JP2012/79182, PCT/JP2012079182, PCT/JP201279182, WO 2013/073483 A1, WO 2013073483 A1, WO 2013073483A1, WO-A1-2013073483, WO2013/073483A1, WO2013073483 A1, WO2013073483A1
InventorsKazunobu Konishi, 一誠 小西, Shinichi Imazu, 晋一 今津, Mayumi Sato, 真弓 佐藤
ApplicantAsahi Kasei Chemicals Corporation, 旭化成ケミカルズ株式会社
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: Patentscope, Espacenet
Method for producing myo-inositol and myo-inositol derivative
WO 2013073483 A1
Abstract
[Problem] To impart significantly improved myo-inositol producing capability, suitable for use in recombinant DNA techniques and synthetic biology methods, to a host microorganism that does not possess an endogenous myo-inositol biosynthesis pathway, such as Escherichia coli. [Solution] Inositol monophosphatase activity is strengthened in a transformant obtained by introducing a myo-inositol biosynthesis pathway into a host microorganism that does not possess an endogenous myo-inositol biosynthesis pathway.
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Claims(23)  translated from Japanese
  1. ミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程: A method of manufacturing a myo-inositol or myo-inositol derivative, the following steps:
    1) 内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体を用意する工程;及び 2) 前記形質転換体の生育及び/又は維持に適した条件下で、該形質転換体と該形質転換体によりミオイノシトールに変換され得る炭素源を接触させる工程を含む、前記製造方法。 1) A transformant of a microorganism that does not express endogenous inositol 1-phosphate synthase, a foreign gene encoding an expressible manner introduced inositol 1-phosphate synthase into the body at least transformant includes, and genetically 換又 to induce activation of overproduction or inositol mono- phosphatase functional inositol mono phosphatase in transformant body to prepare the transformant having a mutation; and 2) the transformation under conditions suitable for growth and / or maintenance of the body, comprising the step of contacting the carbon source that can be converted into myo-inositol by the transformant and the transformant, the above method.
  2. 前記ミオイノシトール誘導体が、下記の構造式: It said myo-inositol derivatives, the following structural formula:
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    で示される化合物である、請求項1に記載の製造方法。 In a compound represented, The method according to claim 1.
  3. 前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、請求項1又は2に記載の製造方法。 The endogenous inositol 1 microorganisms which do not express phosphate synthase is a prokaryotic organism, the method according to claim 1 or 2.
  4. 前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、請求項1ないし3のいずれかに記載の製造方法。 The endogenous inositol 1 microorganisms which do not express phosphate synthase, a microorganism having endogenous inositol mono- phosphatase gene, the production method according to any one of claims 1 to 3.
  5. 前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、請求項1ないし4のいずれかに記載の製造方法。 Any microorganism that does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, Escherichia coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, a bacteria selected from the group consisting of Zymomonas bacteria of claims 1 to 4 production method of crab described.
  6. 前記細菌が大腸菌である、請求項5に記載の製造方法。 Wherein the bacterium is E. coli, the producing method according to claim 5.
  7. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、 Overproduction of the inositol mono phosphatase, with respect to the microorganism,
    a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、 a) I will introduce foreign inositol mono phosphatase gene,
    b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、 b) increase the number of copies of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、 c) I will introduce a mutation in the control region of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、 d) the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene is replaced with high expression of inducible foreign adjustment region, or e) causing the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene deleted,
    ことにより誘導される、請求項1ないし6のいずれかに記載の製造方法。 Induced by, The process according to any one of claims 1 to 6.
  8. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、請求項7に記載の製造方法。 Overproduction of the inositol mono- phosphatase is induced by introducing a foreign inositol mono- phosphatase gene with respect to the microorganisms, and production method of claim 7.
  9. 前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、 Activation of the inositol mono- phosphatase, with respect to the microorganism,
    f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、 f) we will introduce a mutation in the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、 g) replacing some or all of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、 h) deleted the part of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、 i) decreasing the other proteins reducing the inositol mono- phosphatase activity,
    j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、 j) it reduces the formation of compounds that reduce the inositol mono- phosphatase activity,
    ことにより誘導される、請求項1ないし6のいずれかに記載の製造方法。 Induced by, The process according to any one of claims 1 to 6.
  10. 前記炭素源が、前記形質転換体内でグルコース‐6‐リン酸へと変換され得る化合物を含む請求項1ないし9のいずれかに記載の製造方法。 The carbon source, the production method according to any one of claims 1 to 9 comprising a compound which can be converted to glucose-6-phosphate in the transformed body.
  11. 前記炭素源が、D‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、及びD‐グルコースを含有するバイオマスからなる群から選択される1つ以上である、請求項10に記載の製造方法。 The carbon source is D- glucose, sucrose, oligosaccharides, polysaccharides, starch, cellulose, rice bran, one or more selected from the group consisting of biomass containing waste molasses, and D- glucose, 10. The method according to.
  12. 更に、前記炭素源との接触下で生育及び/又は維持された前記形質転換体の培養物中に蓄積したミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体を分離する工程を含む、請求項1ないし11のいずれかに記載の製造方法。 Further comprises the step of separating the myo-inositol or myo-inositol derivative accumulated in culture of the transformant is grown and / or maintained under contact with the carbon source, in any one of claims 1 to 11 The method according.
  13. 内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体。 A transformant of a microorganism that does not express endogenous inositol 1-phosphate synthase comprises an exogenous gene encoding an expressible manner introduced inositol 1-phosphate synthase into the body at least transformant, It said transformant and genetically 換又 to induce activation of overproduction or inositol phosphatase mono functional inositol mono phosphatase in transformant body having a mutation.
  14. 前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、請求項13に記載の形質転換体。 The endogenous inositol 1 microorganisms which do not express phosphate synthase is a prokaryotic organism, the transformant of claim 13.
  15. 前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、請求項13又は14に記載の形質転換体。 Microorganisms which do not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, a microorganism having endogenous inositol mono- phosphatase gene, transformant according to claim 13 or 14.
  16. 前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、請求項13ないし15のいずれかに記載の形質転換体。 Microorganisms which do not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, Escherichia coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria is a bacteria selected from the group consisting of Zymomonas bacteria, any of claims 13 to 15 transformant of crab described.
  17. 前記細菌が大腸菌である、請求項16に記載の形質転換体。 Wherein the bacterium is E. coli, transformant according to claim 16.
  18. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、 Overproduction of the inositol mono phosphatase, with respect to the microorganism,
    a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、 a) I will introduce foreign inositol mono phosphatase gene,
    b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、 b) increase the number of copies of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、 c) I will introduce a mutation in the control region of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、 d) the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene is replaced with high expression of inducible foreign adjustment region, or e) causing the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene deleted,
    ことにより誘導される、請求項13ないし17のいずれかに記載の形質転換体。 Induced by transformant according to any one of claims 13 to 17.
  19. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、請求項18に記載の形質転換体。 The overproduction of inositol mono- phosphatase is induced by introducing a foreign inositol mono- phosphatase gene with respect to the microorganism transformant of claim 18.
  20. 前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、 Activation of the inositol mono- phosphatase, with respect to the microorganism,
    f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、 f) we will introduce a mutation in the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、 g) replacing some or all of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、 h) deleted the part of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
    i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、 i) decreasing the other proteins reducing the inositol mono- phosphatase activity,
    j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、 j) it reduces the formation of compounds that reduce the inositol mono- phosphatase activity,
    ことにより誘導される、請求項13ないし17のいずれかに記載の形質転換体。 Induced by transformant according to any one of claims 13 to 17.
  21. 下記の構造式: The following structural formula:
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    で示される化合物。 The compound represented in.
  22. ミオイノシトールの製造方法であって、請求項21に記載のミオイノシトール誘導体を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、ミオイノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法。 A method for producing a myo-inositol, myo-inositol derivative according to claim 21, a β- glycosidic bonds are degraded by enzymes hydrolyzing reaction can be catalyzed, characterized in that to produce myo-inositol, said method .
  23. 請求項21に記載のミオイノシトール誘導体を含む組成物。 Compositions containing myo-inositol derivative according to claim 21.
Description  translated from Japanese
ミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の製造方法 Production method of myo-inositol and myo-inositol derivatives

本発明は、ミオイノシトールの製造における遺伝子組換技術の応用に関する。 The present invention relates to the application of gene recombination techniques in the manufacture of myo-inositol. 特に、原核微生物の形質転換体を利用したミオイノシトールの工業的製造方法に関する。 In particular, to an industrial method for producing a myo-inositol using a transformant of a prokaryotic microorganism. 更に本発明は、新規ミオイノシトール誘導体及びその製造方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to novel myo-inositol derivative and a method of manufacturing the same.

ミオイノシトールは、多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。 Myo-inositol, because it is an essential material for many of the higher animals, nutrition food, feed, has been widely used as components such as pharmaceuticals. 例えば、ミオイノシトールは、脂肪やコレステロール類の代謝において重要な役割を担っていることが知られており、特に高コレステロール血症等の予防や治療に有効とされている。 For example, myo-inositol are known to play an important role in the metabolism of fats and cholesterols, which are particularly effective in the prevention and treatment of such hypercholesterolemia. 従って、ミオイノシトールの工業的スケールでの製造プロセスについて、多くの改良が提案されてきている。 Therefore, the manufacturing process on an industrial scale of myo-inositol, many improvements have been proposed.

従来、ミオイノシトールは、米糠、コーンスティープリカーなどから直接抽出されていたが、当該抽出方法では、ミオイノシトールの収率が低い上に不純物が多く生成するために、ミオイノシトールの精製が困難であり、生産効率が極めて低かった。 Conventional, myo-inositol, rice bran, had been extracted directly from such as corn steep liquor, in the extraction method, in order to impurities generated many on top of the myo-inositol yield is low, it is difficult to purification of myo-inositol , production efficiency is very low. そこで、ミオイノシトール生産能を有するパン酵母を培養し、当該培養物からミオイノシトールを生成する方法も考案されたが、依然としてその生産性は低く、経済的に成り立たないため工業的に実施されてはいない。 Therefore, we cultured a baker's yeast having a myo-inositol-producing ability, a method of producing a myo-inositol but was designed from the culture, still its productivity is low and it can be industrially carried out because it is not economically hold no.

従って、より効率的にイノシトールを生産する微生物の検索がなされた。 Thus, the search for microorganisms producing more efficiently inositol has been made. 特許文献1は、イノシトールを菌体外に分泌し得るキャンディダ属酵母の発見及びその利用を開示している。 Patent Document 1 discloses the discovery and its use of the genus Candida yeast capable of secreting inositol to extracellular. 特許文献2及び3は、それぞれ、前記キャンディダ属酵母にグルコース代謝拮抗物質及び抗生物質に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。 Patent Documents 2 and 3 each disclose the introduction of mutations that confer resistance to glucose metabolism antagonist and the antibiotic to the genus Candida yeasts. 特許文献4、5及び6もまた、それぞれ、イノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して3級アミン、ヘキサクロロシクロヘキサン及びセチルトリメチルアンモニウム塩に対する耐性を付与する突然変異を導入することで、イノシトールの収率を向上させることを開示している。 Also Patent Documents 4, 5 and 6 also, respectively, by introducing a mutation imparting tertiary amine for the genus Candida yeasts, resistance to hexachlorocyclohexane and cetyl trimethyl ammonium salt having an inositol-producing ability, and inositol It discloses improving the yield. 特許文献7は、同じくイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して6‐ハロゲノ‐6‐デオキシグルコースに対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。 Patent Document 7 also describes the introduction of a mutation imparting resistance to 6-halogeno-6-deoxy-glucose relative to the genus Candida yeast having an inositol-producing ability. 特許文献8も、イノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対してハロゲン化ピルビン酸に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。 Patent Document 8 also discloses the introduction of mutations that confer resistance to halogenated pyruvate respect genus Candida yeast having an inositol-producing ability.

更に、先行技術は、遺伝子組換による酵母の形質転換についても記載している。 Furthermore, the prior art, it also describes the transformation of yeast by genetic recombination. 特許文献9は、一連のミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐1‐リン酸合成酵素が律速反応を担うとの妥当な推論の下で、イノシトール分泌能を有さないキャンディダ属酵母を前記イノシトール‐1‐リン酸合成酵素コード化DNAの単独によって形質転換することで、当該酵母に対してイノシトール生産能を付与できたことを開示している。 Patent Document 9, a series of under the reasonable inference of inositol-1-phosphate synthase to play a rate-limiting reaction in myo-inositol biosynthesis reaction, said the genus Candida yeast that does not have the ability to secrete inositol inositol - By transforming the single 1-phosphate synthase coding DNA, it discloses that it is possible to grant inositol-producing ability for that yeast. 特許文献10は、酵母に対して、グリセロール‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下におかれたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素コード化DNAを単独で導入することにより、該酵母のイノシトール生産性を向上させることを開示している。 Patent Document 10, for the yeasts, by introducing a glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene promoter inositol 1-phosphate synthase encoding DNA that is placed under the control by itself, inositol yeast It discloses that to improve the productivity.

更に、特許文献11も、メタノール資化性酵母ピシァ・パストリスのイノシトール生産に関するものであり、該酵母にミオイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子を導入することと同時にイノシトールリン酸フォスファターゼ遺伝子を導入することを開示するが、当該追加的なイノシトールリン酸フォスファターゼ遺伝子導入の意義及び効果は明らかにされていない。 Furthermore, Patent Document 11 also relates to inositol production of methylotrophic yeast Pishi~a pastoris, at the same time to introduce inositol phosphate phosphatase gene and the introduction of myo-inositol-1-phosphate synthase gene into yeast it will be disclosed, but the meaning and effect of the additional inositol phosphate phosphatase gene transfer has not been clarified.

従って、上記の酵母に関するいずれの文献も、一連のミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐1‐リン酸合成酵素が律速反応を担うことを前提にしており、ミオイノシトール生合成経路に存在するそれ以外の酵素の重要性を示唆するところはない。 Therefore, none of the literature on the above yeast inositol 1-phosphate synthase in a sequence of myo-inositol biosynthesis reactions are based on the assumption that play a rate-limiting reaction, and the other present in the myo-inositol biosynthesis pathway no place to suggest the importance of enzymes.

一方、大腸菌に代表される原核微生物は、その旺盛な増殖能や発酵管理における様々な優位性により、酵母に比べて極めて魅力的な工業生産用生物である。 On the other hand, prokaryotic microorganisms represented by E. coli, by a variety of advantages in its robust growth ability and fermentation management, is a very attractive industrial production for the organism compared to the yeast. しかしながら、内因性ミオイノシトール生合成経路を持った原核微生物は知られていない。 However, prokaryotic microorganisms that have endogenous myo-inositol biosynthesis pathway is not known.

従って、原核微生物によりミオイノシトールを工業的に生産させるためには、原核微生物宿主内に外来性のミオイノシトール生合成経路を構築することが不可欠である。 Therefore, in order to industrially produce myo-inositol by the prokaryotic microorganism, it is essential to construct an exogenous myo-inositol biosynthesis pathway in a prokaryotic microbial hosts.

具体的に、原核微生物宿主内で機能的なミオイノシトール生合成経路を構築するためには、次の触媒活性が必要である: Specifically, in order to build a functional myo-inositol biosynthesis pathway in prokaryotic microbial hosts is needed following the catalytic activity:
活性1: 適当な炭素源からグルコース‐6‐リン酸を生成させる活性; Activity 1: activity to produce glucose-6-phosphate from a suitable carbon source;
活性2: グルコース‐6‐リン酸をミオイノシトール‐1‐リン酸へ変換する活性、つまり、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素活性;及び 活性3: ミオイノシトール‐1‐リン酸を基質としたフォスファターゼ活性。 Activity 2: Activity to convert glucose-6-phosphate to myo-inositol-1-phosphate, that is, inositol 1-phosphate synthase activity; and activity 3: phosphatase myo-inositol-1-phosphate as a substrate activity.
但し、活性1の生成物であるグルコース‐6‐リン酸は、原核微生物が普遍的に生成する代謝中間体であるので、当該活性を原核微生物に付与することは必須ではない。 However, glucose-6-phosphate is a product of the active one, since prokaryotic microorganism is a metabolic intermediates to generate universally, it is not essential to impart the active prokaryotic microorganisms. また、活性3についても、本発明者らの知る限りにおいて、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐1‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有している。 Moreover, even for activity 3, insofar as the present inventors know, or the majority of prokaryotic microbial host cells suitable for industrial production by conventional genetic 換手 methods, expressing endogenous inositol mono- phosphatase, myo-inositol a-1-phosphate I have a general-purpose mono phosphatase activity that can be a substrate. 他方、活性2について見ると、原核微生物はイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子を有していない例が多い。 On the other hand, looking for activity 2, procaryotic microorganism examples often do not have the inositol-1-phosphate synthase gene. また、前記のとおり、ミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐1‐リン酸合成酵素が律速反応を担うと考えられている。 In addition, as described above, inositol-1-phosphate synthase it is thought to play a rate-limiting reaction in myo-inositol biosynthesis reaction. 従って、原核微生物宿主内で機能的なミオイノシトール生合成経路を構築するためには、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子を該細胞に導入することが必要十分であると考えられてきた。 Therefore, in order to build a functional myo-inositol biosynthesis pathway in a prokaryotic microbial host, inositol-1-phosphate synthase gene has been considered necessary is enough to be introduced into the cell.

実際に、非特許文献1は、大腸菌形質転換体内でのミオイノシトール生産を開示しているが、当該形質転換体にはイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子が導入されているだけである。 Indeed, non-patent document 1 discloses the myo-inositol production in E. coli transformants body, the said transformant is only inositol-1-phosphate synthase gene is introduced.

特許文献12も、大腸菌宿主細胞にイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子のみを導入して形質転換体を作製し、それにより当該形質転換体内に外来性ミオイノシトール生合成経路を構築することを開示している。 Patent Document 12 also discloses that the only inositol-1-phosphate synthase genes in E. coli host cells were introduced to prepare a transformant, thereby constructing an exogenous myo-inositol biosynthesis pathway in the transformed body It has. 但し、当該文献が目的とする最終生成物はD-グルカル酸であり、ミオイノシトールは中間体として生産される。 However, the final product in which the literature is intended is a D- glucaric acid, myo-inositol is produced as an intermediate. 特筆すべきは、該文献も、「我々がsuhB遺伝子または相同のフォスファターゼを過剰発現させなかったこともまた、注目すべきである。しかし、培養産物の中にミオイノシトール‐1‐リン酸は検出されず、一方、ミオイノシトールは蓄積した。従って、我々は、フォスファターゼ活性は、経路を通る代謝の流れ(flux)を制限しないと結論付けた。」(第33頁、第2~5行)と記載している。 Notably, the document is "that we did not overexpress suhB gene or homologous phosphatase, it is also noteworthy. However, myo-inositol-1-phosphate in the culture product detected by no whereas myo-inositol is accumulated. Therefore, we phosphatase activity was concluded not to limit the metabolic flow through the path (flux). "(the pp 33, second to fifth row) It is described.

従って、先行技術は、組換微生物によるミオイノシトール生産におけるイノシトールモノフォスファターゼの決定的な役割を開示も示唆もしてはいない。 Therefore, the prior art does not disclose or suggest a critical role of inositol mono phosphatase in myo-inositol production by set 換微 organisms.

特開平8‐00258号公報 JP-A-8-00258 Publication 特開平8‐38188号公報 JP-A-8-38188 Publication 特開平8‐89262号公報 JP-A-8-89262 Publication 特開平9‐117295号公報 JP-A-9-117295 Publication 特開平10‐42860号公報 JP-A-10-42860 Publication 特開平10‐42882号公報 JP-A-10-42882 Publication 特開平10‐42883号公報 JP-A-10-42883 Publication 特開2000‐41689公報 JP 2000-41689 Publication 特開平9‐220093号公報 JP-A-9-220093 Publication 特開平10‐271995号公報 JP-A-10-271995 Publication 特開2011‐55722号公報 Patent Publication No. 2011-55722 WO2009/145838号パンフレット WO2009 / 145838 pamphlet

J. J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 1999,Vol. 1999, Vol. 121,3799‐3800 121,3799-3800

内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない微生物は、遺伝子組換技術と連携した合成生物学的手法を用いることで、ミオイノシトール生産性を制御しやすいという利点を持つ。 Microorganisms that have no endogenous myo-inositol biosynthesis pathway with the use of synthetic biological techniques in conjunction with genetic recombination techniques, has the advantage of easily controlling the myo-inositol productivity. 殊に大腸菌などの原核微生物宿主は、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たないことに加えて、多くの酵母が有しているイノシトール資化能(分解能)も持たないため、合成生物学的手法の適用をいっそう容易にする。 Particular prokaryotic microbial hosts such as Escherichia coli, in addition to having no endogenous myo-inositol biosynthesis pathway, since many yeast in inositol catabolism that (resolution) neither have had, synthetic biology techniques It wants to further facilitate the application of. また、大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に工業的発酵生産の観点から極めて魅力的であるとともに、遺伝子組換技術の適用における実績、確立した安全性の観点からも利点を有する。 Further, E. coli, along with its is a rapid growth ability and ease of fermentation management therefore very attractive from the point of view of industrial fermentation, results in the application of gene recombination techniques, the advantages in terms of safety has been established a.

従って、本発明が解決しようとする課題は、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物に対し、有意に改善されたミオイノシトール及び関連する誘導体の生産能を付与することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide, with respect to a host microorganism that has no endogenous myo-inositol biosynthesis pathway is to impart an ability to produce significantly improved myo-inositol and related derivatives.

前記のように、これまでのいずれの研究も、ミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐1‐リン酸合成酵素が律速反応を担うことを示唆してきた。 As noted above, none of the studies to date, inositol 1-phosphate synthase has been suggested to play a rate-limiting reaction in myo-inositol biosynthesis reactions. また、いずれの研究も、イノシトールモノフォスファターゼ活性に特別の注意を払うことはなかった。 In addition, any of the research, did not pay special attention to inositol mono phosphatase activity.

しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物内にミオイノシトール生合成経路を導入して得られる形質転換体では、イノシトールモノフォスファターゼ活性が重大な役割を持つことを発見した。 However, surprisingly, the inventors have found that in the transformant obtained by introducing the myo-inositol biosynthesis pathway into the host microorganism does not have endogenous myo-inositol biosynthesis pathway, serious inositol mono- phosphatase activity It was found to have a role. 予期せぬことに、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより、そのような形質転換体のミオイノシトール生産能が大幅に向上した。 Unexpectedly, by strengthening inositol mono- phosphatase activity, myo-inositol-producing ability of such transformants were significantly improved. 更に、本発明者らは、そのような形質転換体の培養物中に新規のミオイノシトール誘導体を発見した。 Furthermore, the present inventors have discovered a novel myo-inositol derivative in culture of such a transformant.
従って、本発明の第1の局面は: Accordingly, a first aspect of the present invention:
(1)ミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程: (1) A method for producing a myo-inositol or myo-inositol derivatives, the following steps:
1) 内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体を用意する工程;及び 2) 前記形質転換体の生育及び/又は維持に適した条件下で、該形質転換体と該形質転換体によりミオイノシトールに変換され得る炭素源を接触させる工程を含む、前記製造方法である。 1) A transformant of a microorganism that does not express endogenous inositol 1-phosphate synthase, a foreign gene encoding an expressible manner introduced inositol 1-phosphate synthase into the body at least transformant includes, and genetically 換又 to induce activation of overproduction or inositol mono- phosphatase functional inositol mono phosphatase in transformant body to prepare the transformant having a mutation; and 2) the transformation under conditions suitable for growth and / or maintenance of the body, comprising the step of contacting the carbon source that can be converted into myo-inositol by the transformant and the transformant, it is the production method.
より特定的には、内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物内に発現可能に導入されたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を有する形質転換体を用いたミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体の製造方法において、前記形質転換体が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する形質転換体であることを特徴とする、前記製造方法である。 More particularly, myo using a transformant having a foreign gene encoding an expressible manner introduced inositol 1-phosphate synthase in the microorganism does not express endogenous inositol 1-phosphate synthase In the manufacturing method of inositol or myo-inositol derivative, characterized in that said transformants, genetic 換又 to induce activation of overproduction or inositol mono- phosphatase functional inositol mono phosphatase is a transformant having a mutation and a is the above method.

前記(1)の培養物中に生産されたミオイノシトール誘導体は新規化合物であり、当該誘導体ではグルコースとミオイノシトールがβ1→4結合していた。 Myo-inositol derivatives produced in the culture of (1) are novel compounds, glucose and myo-inositol had β1 → 4 bonds in the derivative. 従って、本発明の一態様は: Accordingly, one aspect of the present invention:
(2)前記ミオイノシトール誘導体が、下記の構造式: (2) the myo-inositol derivatives, the following structural formula:

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で示される化合物である、上記(1)に記載の製造方法である。 In a compound represented, it is a method according to the above (1).

合成生物学的手法の適用及び発酵生産における原核微生物、特に大腸菌の利点は既に述べた。 Prokaryotic microorganisms in the application and fermentation production of synthetic biology techniques, in particular advantage of E. coli has already been mentioned. 従って、本発明の好適な態様は: Therefore, a preferred embodiment of the present invention:
(3)前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、上記(1)又は(2)に記載の製造方法; (3) a microorganism which does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase is a prokaryotic organism, The production method according to the above (1) or (2);
(4)前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の製造方法; (4) a microorganism which does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, a microorganism having endogenous inositol mono- phosphatase gene, the method according to any one of (1) to (3);
(5)前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の製造方法;及び(6)前記細菌が大腸菌である、上記(5)に記載の製造方法、を含む。 (5) a microorganism which does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, a bacteria selected E. coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, from the group consisting of Zymomonas bacteria, (1) to the production method of any one of (4); a and (6) the bacterium is E. coli, the production method according to the above (5) I including,.

宿主微生物が内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性を有しているか否かに関わらず、該細胞内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることで、該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。 Regardless of whether the host microorganism has an endogenous inositol mono- phosphatase activity, and be to overproduce inositol mono- phosphatase in the cell, it is possible to enhance the inositol mono- phosphatase activity of the cells. 様々な公知の技術を適用して細胞にイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることができる。 It can be made to overproduce inositol mono- phosphatase in the cell by applying various known techniques. 従って、本発明は以下の態様: Accordingly, the present invention relates to the following aspects:
(7)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、 (7) overproduction of the inositol mono- phosphatase, with respect to the microorganism,
a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、 a) I will introduce foreign inositol mono phosphatase gene,
b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、 b) increase the number of copies of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、 c) I will introduce a mutation in the control region of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させることにより誘導される、上記(1)ないし(6)のいずれかに記載の製造方法;及び(8)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記(7)に記載の製造方法、を含む。 d) replacing the adjustment region of the endogenous inositol mono- phosphatase gene with high expressing inducible foreign adjustment region, or e) are derived the adjustment region of the endogenous inositol mono- phosphatase gene by deleting the above (1) to The method according to any one of (6); and (8) overproduction of the inositol mono- phosphatase is induced by introducing a foreign inositol mono- phosphatase gene with respect to the microorganisms according to the above (7) method of manufacturing include,.

また、宿主細胞が内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有している場合は、以下の態様によっても該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。 Also, if the host cell has endogenous inositol mono- phosphatase gene may be enhanced inositol mono- phosphatase activity of the cells by the following aspects.
(9)前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、 (9) activation of the inositol mono- phosphatase, with respect to the microorganisms,
f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、 f) we will introduce a mutation in the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、 g) replacing some or all of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、 h) deleted the part of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、又は j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させることにより誘導される、上記(1)ないし(6)のいずれかに記載の製造方法。 i) decreasing the other proteins reducing the inositol mono- phosphatase activity, or j) is derived by reducing the production of compounds that reduce the inositol mono- phosphatase activity, in any of (1) to (6) The method according.

本発明のミオイノシトールの発酵生産においては、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素の基質であるグルコース‐6‐リン酸の生成に適した化合物を含んだ炭素源を培養基材として用いることが好適である。 In myo-inositol in the fermentative production of the present invention, it is preferable to use inositol 1 carbon source containing a compound suitable for the generation of glucose-6-phosphate is the substrate for phosphate synthase as a culture substrate It is there. さらに、本発明の製造方法は、当該炭素源との接触下で生育及び/又は維持された前記形質転換体の培養物からミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体を分離する追加の工程を含んでよい。 Furthermore, the production method of the present invention may comprise the additional step of separating the myo-inositol or myo-inositol derivative from the culture of the growth and / or maintained by the said transformant under contact with the carbon source. 従って、本発明の更なる好適な態様は: Thus, a further preferred embodiment of the present invention:
(10)前記炭素源が、前記形質転換体内でグルコース‐6‐リン酸へと変換され得る化合物を含む上記(1)ないし(9)のいずれかに記載の製造方法; (10) wherein the carbon source, the process according to any one of (1) to (9) containing a compound which can be converted to glucose-6-phosphate by the transformant body;
(11)前記炭素源が、D‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、及びD‐グルコースを含有するバイオマスからなる群から選択される1つ以上である、上記(10)に記載の製造方法;及び(12)更に、前記炭素源との接触下で生育及び/又は維持された前記形質転換体の培養物中に蓄積したミオイノシトール又はミオイノシトール誘導体を分離する工程を含む、上記(1)ないし(11)のいずれかに記載の製造方法、を含む。 (11) wherein the carbon source, it is D- glucose, sucrose, oligosaccharides, polysaccharides, starch, cellulose, rice bran, one or more selected from the group consisting of biomass containing waste molasses, and D- glucose, above (10) The production method according to; and (12) Furthermore, it separates the myo-inositol or myo-inositol derivatives accumulated in the culture of the transformant is grown and / or maintained under contact with the carbon source comprising the step of manufacturing method according to any one of (1) to (11) a.

また、本発明は、前記ミオイノシトールの製造方法に用いるための形質転換体も意図する。 The present invention also contemplates transformants for use in the method for producing a myo-inositol. 従って、本発明の第2の局面は: Thus, the second aspect of the present invention are:
(13)内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物の形質転換体であって、少なくとも該形質転換体内に発現可能に導入されたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を含み、且つ該形質転換体内での機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有する前記形質転換体である。 (13) a foreign gene and a transformant of a microorganism that does not express endogenous inositol 1-phosphate synthase, that encodes an expressible in introduced inositol 1-phosphate synthase into the body at least transformant the it includes, and genetically 換又 to induce activation of overproduction or inositol phosphatase mono functional inositol mono phosphatase in transformant body which is the transformant having a mutation.
より特定的には、内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物内に発現可能に導入されたイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子を有する形質転換体において、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、前記形質転換体である。 More particularly, the transformant having a foreign gene encoding an expressible manner introduced inositol 1-phosphate synthase in the microorganism does not express endogenous inositol 1-phosphate synthase, functional Genetically 換又 that induce activation of overproduction or inositol mono- phosphatase such inositol mono- phosphatase is characterized by having a mutation, which is the transformant.

また、本発明の第1の局面について記載した態様は、本発明の第2の局面についても当てはまる。 Moreover, embodiments described for the first aspect of the invention also apply to the second aspect of the present invention. それらの態様は: Those aspects:
(14)前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が原核生物である、上記(13)に記載の形質転換体; (14) the endogenous inositol 1 microorganisms which do not express phosphate synthase is a prokaryotic organism, the transformant according to (13);
(15)前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する微生物である、上記(13)又は(14)に記載の形質転換体; (15) a microorganism which does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, a microorganism having endogenous inositol mono- phosphatase gene, transformant according to (13) or (14);
(16)前記内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌である、上記(13)ないし(15)のいずれかに記載の形質転換体; (16) a microorganism which does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase, a bacteria selected E. coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, from the group consisting of Zymomonas bacteria, (13) The transformant according to any one of to (15);
(17)前記細菌が大腸菌である、上記(16)に記載の形質転換体; (17) wherein the bacterium is E. coli, the transformant according to (16);
(18)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して、 (18) excess production of the inositol mono- phosphatase, with respect to the microorganism,
a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、 a) I will introduce foreign inositol mono phosphatase gene,
b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、 b) increase the number of copies of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、 c) I will introduce a mutation in the control region of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、 d) the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene is replaced with high expression of inducible foreign adjustment region, or e) causing the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene deleted,
ことにより誘導される、上記(13)ないし(17)のいずれかに記載の形質転換体; The transformant according to any one of differentially, (13) not induced by (17);
(19)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記(18)に記載の形質転換体;及び(20)前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記微生物に対して、 (19) The overproduction of inositol mono- phosphatase is induced by introducing a foreign inositol mono- phosphatase gene with respect to the microorganism The transformant according to (18); and (20) wherein the inositol mono- phosphatase activation of, with respect to the microorganism,
f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、 f) we will introduce a mutation in the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、 g) replacing some or all of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、 h) deleted the part of the endogenous inositol mono- phosphatase gene,
i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、 i) decreasing the other proteins reducing the inositol mono- phosphatase activity,
j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、 j) it reduces the formation of compounds that reduce the inositol mono- phosphatase activity,
ことにより誘導される、上記(13)ないし(17)のいずれかに記載の形質転換体、を含む。 Induced by, and a transformant according to any one of (13) to (17).

本発明の第3の局面は、前記形質転換体の培養物中に生産されることが見出された、新規ミオイノシトール誘導体である。 A third aspect of the present invention, be produced in the culture of the transformant was found, a novel myo-inositol derivative. 従って、本発明は: Accordingly, the present invention is:
(21)下記の構造式: (21) the following structural formula:

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
で示される化合物である。 In a compound represented.

更に、本発明の新規ミオイノシトール誘導体は、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素(EC 3.2.1.21など)により、容易にグルコースとミオイノシトールに分解されることも確認された。 Furthermore, the novel myo-inositol derivatives of the present invention, β- by glycoside bond enzymes that hydrolyze reaction can be a catalyst (such as EC 3.2.1.21), easily confirmed also be broken down into glucose and myo-inositol It has been. 当該酵素分解は、上記(1)で得られた培養物を当該酵素で直接処理すること、当該培養物の粗精製物を当該酵素で処理すること、或いは単離した本発明のミオイノシトール誘導体を当該酵素で処理することのいずれによっても達成できる。 The enzymatic degradation is to process directly the culture obtained in the above (1) by the enzyme, treating the crude product of the culture with the enzyme, or an isolated myo-inositol derivatives of the present invention has It can be accomplished by any of the treatment with the enzyme. 従って、本発明の第4の局面は: Accordingly, a fourth aspect of the present invention:
(22)ミオイノシトールの製造方法であって、上記(21)のミオイノシトール誘導体を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、ミオイノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法である。 (22) A method for producing a myo-inositol, myo-inositol derivatives of the above (21), is decomposed by an enzyme hydrolyzing reaction can catalyze β- glycoside bond, characterized in that to produce myo-inositol, that is the way.

更に、本発明は、本発明の新規ミオイノシトール誘導体を含む組成物を意図する。 Furthermore, the present invention contemplates a composition comprising a novel myo-inositol derivatives of the present invention. 例えば、ミオイノシトールは、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。 For example, myo-inositol, nutritious food, feed, it has been widely used as components such as pharmaceuticals. しかしながら、環境中には、ミオイノシトールを資化する、酵母、バシラス属細菌及び腸内細菌等が存在する。 However, in the environment, to assimilate myo-inositol, yeast, Bacillus bacteria and intestinal bacteria and the like exist. 従って、ミオイノシトールを栄養食品、飼料、医薬品等のための組成物として利用する際には、ミオイノシトールが、その生理的作用を発揮することが求められるときまで、前記のミオイノシトール資化性細菌等から保護されることが好ましい。 Thus, nutritional myo-inositol, feed, when utilized as a composition for such medicaments, until the myo-inositol, it is required to exert its physiological effect, wherein of the myo-inositol-assimilating bacterium and it is preferably protected from such. しかるに、本発明の第5は: However, a fifth of the present invention:
(23)上記(21)のミオイノシトール誘導体を含む組成物である。 (23) a composition comprising myo-inositol derivatives of the above (21).

本発明によれば、微生物培養技術による工業的ミオイノシトール生産の効率化が達成できる。 According to the present invention, the efficiency of industrial myo-inositol produced by the microbial culture technique can be achieved. また、本発明では新規なミオイノシトール誘導体が提供される。 Furthermore, the novel myo-inositol derivatives are provided in the present invention. 本発明の新規なミオイノシトール誘導体は容易にミオイノシトールに変換されるが、ミオイノシトールを資化する微生物等に対して抵抗性である。 While the novel myo-inositol derivatives of the present invention can be easily converted to myo-inositol, it is resistant to microorganisms to assimilate the myo-inositol.

INO1遺伝子のコード領域を示す(配列番号1)。 INO1 shows the coding region of the gene (SEQ ID NO: 1). suhB遺伝子のコード領域を示す(配列番号3)。 shows the coding region of suhB gene (SEQ ID NO: 3). 本発明のミオイノシトール誘導体の生産例を示す。 It shows a production example of myo-inositol derivatives of the present invention. 図中、矢印は、本発明のミオイノシトール誘導体を含む画分を示す。 In the figure, arrows indicate the fractions containing myo-inositol derivatives of the present invention. KS-G(ガードカラム)、Sugar KS-801及びSugar KS-802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結したHPLC(移動相:水、カラム温度:70℃、流速:1mL/min、検出器:RI)で分析した結果である。 KS-G (guard column), Sugar KS-801 and Sugar KS-802 (all trade names, manufactured by Showa Denko Co., Ltd.) HPLC which is connected to (mobile phase: water, column temperature: 70 ℃, flow rate: 1mL / min detector: RI) is a result of analysis by. 本発明のミオイノシトール誘導体の H-NMRスペクトルである。 It is a 1 H-NMR spectrum of myo-inositol derivatives of the present invention. 本発明のミオイノシトール誘導体の13 C-NMRスペクトルである。 It is a 13 C-NMR spectrum of myo-inositol derivatives of the present invention. 本発明のミオイノシトール誘導体のβ‐グルコシダーゼによる分解例を示す。 It shows an exploded example by β- glucosidase of myo-inositol derivatives of the present invention. Shodex Asahipak NH P-50 4E(商品名、昭和電工株式会社製)を用いたHPLC(移動相:水/アセトニトリル=25/75、カラム温度:40℃、流速:0.8mL/min、検出器:RI)による分析結果である。 Shodex Asahipak NH 2 P-50 4E (trade name, manufactured by Showa Denko Co., Ltd.) HPLC using a (mobile phase: water / acetonitrile = 25/75, column temperature: 40 ℃, flow rate: 0.8mL / min, detector : RI) and an analysis result by.

本発明の課題は、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物内にミオイノシトール生合成経路を導入して得られる形質転換体中で、つまり、内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない宿主微生物に当該酵素の外来遺伝子を導入した形質転換体中で、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより解決される。 The object of the present invention is a transformant in which is obtained by introducing the myo-inositol biosynthesis pathway in a host microorganism that has no endogenous myo-inositol biosynthesis pathway, that is, an endogenous inositol 1-phosphate synthase In transformants in which the introduction of foreign genes for the enzyme to a non-expression host microorganism, it is solved by strengthening the inositol mono- phosphatase activity. なお、本明細書において、「外来」ないし「外来性」という用語は、形質転換前の宿主微生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子ないし核酸配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。 In this specification, the term "foreign" to "foreign" is a host microorganism before transformation, if does not have the genes to be introduced by the present invention, the enzyme encoded by the gene If it does not substantially express, and different but which encode the amino acid sequence of the enzyme by gene, if it does not express endogenous enzymatic activity comparable after transformation, introducing a gene or nucleic acid sequences according to the invention into a host It is used to mean to.

前述のように、本発明の宿主微生物の、「内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない」との特性は、該宿主細胞内にミオイノシトール生合成経路を新たに構築(つまり、既存の内因性経路の影響がない。)することを可能にするので、合成生物学的手法の適用において極めて魅力的である。 As mentioned above, the characteristics of the host microorganism of the present invention, the "do not express endogenous inositol 1-phosphate synthase" is newly constructed myo-inositol biosynthesis pathway into host cells in (that is, the existing Because of the influence of the intrinsic pathway is not it.) to enable that, it is very attractive in the application of synthetic biology techniques. 例示される原核微生物は:エッシェリシア、シュードモナス、バチルス、ゲオバチルス、メタノモナス、メチロバシラス、メチロフィリウス、プロタミノバクター、メチロコッカス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ザイモモナスおよびリステリア属の細菌である。 Prokaryotic microorganisms that are illustrated: Escherichia, Pseudomonas, Bacillus, Geobacillus, Metanomonasu, Mechirobashirasu, Mechirofiriusu, professional data Mino Arthrobacter, Methylococcus is a Corynebacterium, Brevibacterium, Zymomonas and Listeria bacteria of the genus. 工業的発酵生産において好適な原核微生物の非限定的な例示は、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌を含む。 Non-limiting example of a suitable prokaryotic microorganisms in industrial fermentation production, including E. coli, Bacillus bacteria, bacteria belonging to the genus Corynebacterium, the genus Zymomonas bacteria. 大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に特に好ましい本発明の宿主微生物の例である。 E. coli is an example of a host microorganism of its rapid growth capability and ease of fermentation management therefore particularly preferred the present invention.

また、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、通常の意味での野生型であってよく、或いは、栄養要求性変異株、抗生物質耐性変異株であってもよい。 Further, cell lines that can be used as host cells of the invention can be a wild-type in the usual sense, or, auxotrophic mutant, may be an antibiotic-resistant mutant. 更に、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、上記のような変異に関する各種マーカー遺伝子を有するように既に形質転換されていてもよい。 Furthermore, cell lines can be utilized as host cells of the present invention, already may have been transformed to have a variety of marker genes for mutation as described above. これらの変異や遺伝子は、本発明の形質転換体の作製・維持・管理に有益な性質を提供し得る。 These mutations or genes may provide beneficial properties in the production, maintenance and management of the transformant of the present invention. 好ましくは、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン等の抗生物質に耐性を示す株を用いることにより、本発明のミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の生産を簡便に行うことができる。 Preferably, chloramphenicol, ampicillin, kanamycin, by using a strain resistant to the antibiotic tetracycline or the like, it is possible to perform the production of myo-inositol and myo-inositol derivatives of the present invention conveniently.

合成生物学を指向する本発明においては、宿主細胞において新たなミオイノシトール生合成経路を構築するために、上記の内因性イノシトール‐1‐リン酸合成酵素を発現しない宿主微生物に対して外来イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子を導入する。 In the present invention which is directed to synthetic biology to build a new myo-inositol biosynthesis pathway in a host cell, exogenous inositol to the host microorganism does not express the endogenous inositol 1-phosphate synthase - We will introduce a 1-phosphate synthase gene. イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子は公知であり(例えば、GenBank Accession Nos.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511)、そのいずれも本発明の目的に使用することができる。 Inositol-1-phosphate synthase gene is known (for example, GenBank Accession Nos.AB032073, AF056325, AF071103, AF078915, AF120146, AF207640, AF284065, BC111160, L23520, U32511), used for that any object of the present invention and it can be. 特に、酵母由来のINO1遺伝子(配列番号1)は、よく知られているイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子の例であり、本発明においても好適に使用することができる。 In particular, INO1 gene from yeast (SEQ ID NO: 1) is an example of a well-known inositol-1-phosphate synthase gene, it can also be suitably used in the present invention. 但し、本発明に利用できるイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子は酵母由来のものに限られず、他の真核微生物やそれ以外の生物に由来するものであっても、或いは人工的に合成したものであっても、前記宿主微生物細胞内で実質的なイノシトール‐1‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであればよい。 However, inositol-1-phosphate synthase genes which can be utilized in the present invention is not limited to those derived from yeast, also be derived from another and eukaryotic microorganisms other organisms or artificially synthesized even those, and as long as it can express a substantial inositol 1-phosphate synthase activity in the cells within the host microorganism.

従ってまた、本発明の目的に利用できるイノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子は、前記宿主微生物細胞内で実質的なイノシトール‐1‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。 Thus also inositol-1-phosphate synthase genes that can be utilized for the purposes of this invention, as long as it can express a substantial inositol 1-phosphate synthase activity in the a host microorganism cell, occurs in nature All or mutations that may be, or may have artificially introduced mutations and modifications. 例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン(redundancy)が存在することが知られている。 For example, it is known that extra codon (redundancy) is present in the various codons which code for specific amino acids. そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。 It may utilize alternative codons which are to be eventually translated into the same amino acid at that for the present invention. つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の1セットの類似のDNAオリゴヌクレオチドでコードされ得る。 In other words, the genetic code since it is degenerate, there can be used a plurality of codons to encode a particular amino acid, and therefore the amino acid sequence can be encoded in a similar DNA oligonucleotides of any one set. そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるDNAオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下(例えば、3xSSC、68℃でハイブリダイズし、2xSSC、0.1%SDS及び68℃で洗浄)で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするDNAを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。 Although only the only member of the set is identical to the gene sequence of the native enzyme, suitable stringent conditions even DNA oligonucleotides with mismatches (for example, by hybridizing with 3xSSC, 68 ℃, 2xSSC, 0.1 % SDS can be hybridized to the native sequence in the wash) at and 68 ℃, the identified code to the DNA of the native sequence, can be isolated, can be further utilized in such a gene is also present invention. 特に、ほとんどの生物は特定のコドン(最適コドン)のサブセットを優先的に用いることが知られているので(Gene、Vol.105、pp.61-72、1991等)、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。 In particular, since most organisms are known to use a subset of the particular codon (optimal codon) preferentially (Gene, Vol.105, pp.61-72,1991 etc.), depending on the host microorganism " performing the codon optimization "can be useful in the present invention.

しかして、本発明においても、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルのイノシトール‐1‐リン酸合成酵素活性が得られることを当業者は理解するであろう。 Thus, in the present invention, the inositol-1-by-phosphate synthase gene is introduced into a host microorganism cells as an "expression cassette", a high level is more stable and inositol 1-phosphate synthase activity those skilled in the art that can be obtained will appreciate. 本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。 In the present specification, the term "expression cassette" refers to a nucleotide comprising a nucleic acid sequence that regulates the operably linked transcriptional and translational gene of a nucleic acid or expression subject expression subject. 典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から5'上流にプロモーター配列、3'下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に「発現可能に導入」される。 Typically, the expression cassettes of the present invention, 'promoter sequence upstream, 3' to 5 coding sequence terminator sequence downstream and optionally contains a further condition normal of the operably linked regulatory elements, like that In the case, the gene of a nucleic acid or expression subject expression target is "expression can be introduced" to the host microorganism.

プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、RNAポリメラーゼをDNAに結合させ、RNA合成を開始させるDNA配列と定義される。 Promoter, whether a regulated promoter or a constitutive promoter, a RNA polymerase to bind to DNA, is defined as a DNA sequence that initiates RNA synthesis. 強いプロモーターとはmRNA合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。 Strong promoter is a promoter that initiates mRNA synthesis at high frequency, it is suitably used in the present invention. lac系、trp系、TAC又はTRC系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素(例えば、3-ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸脱水素酵素)、グルタミン酸デカルボキシラーゼA、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。 the lac system, trp system, TAC or TRC system, the major operator and promoter regions of phage λ, the control region of fd coat protein, the glycolytic enzymes (for example, 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydration containing enzymes), glutamate decarboxylase A, promoter for serine hydroxymethyl transferase are available depending on the nature or the like of the host cell. プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。 Besides promoter and terminator sequences, the may be mentioned as examples of other regulatory elements, selection markers, amplification signals, replication origins and the like. 好適な調節配列については、例えば、”Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185”、Academic Press (1990)に記載されている。 For suitable regulatory sequences, for example, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185", is described in Academic Press (1990).

上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のDNA等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。 Expression cassette described above, for example, a plasmid, phage, transposons, and incorporated IS elements, phasmids, cosmids, or to a vector consisting of a linear or cyclic DNA or the like, is inserted into a host microorganism. プラスミドおよびファージが好ましい。 Plasmids and phage are preferred. これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。 These vectors may be one which is autonomously replicating in a host microorganism, and may be replicated chromosomally. 好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11又はpBdCI;桿菌のpUB110、pC194又はpBD214;コリネバクテリウム属のpSA77又はpAJ667などである。 Suitable plasmids are, for example, E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 or pBdCI; and the like genus Corynebacterium of pSA77 or pAJ667; bacilli of pUB110, pC194 or pBD214. これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Cloning Vectors”、Elsevier、1985に記載されている。 Plasmid, etc. can be also used in addition to these, "Cloning Vectors", are described in Elsevier, 1985. ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。 Introduction of the expression cassette into the vector, was cut out by appropriate restriction enzymes, it is possible by conventional methods, including cloning and ligation.

上記ようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。 After the vector having the expression cassette of the present invention in the above so is constructed, as a technique that can be applied when introducing the vector into a host microorganism, for example, coprecipitation, protoplast fusion, electroporation, etc. retroviral transfection cloning and transfection methods of conventional is used for. それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、F. Examples thereof are "Current Protocols in Molecular Biology (Current Protocols in Molecular Biology)", F. Ausubelら、Publ. Ausubel et al., Publ. Wiley Interscience、New York、1997、またはSambrookら、「分子クローニング:実験室マニュアル」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。 Wiley Interscience, New York, 1997 or Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, is described in Cold Spring Harbor, NY, 1989.

驚くべきことに、本発明者らは、内因性ミオイノシトール生合成経路を持たない宿主微生物内にミオイノシトール生合成経路を導入して得られる形質転換体では、イノシトールモノフォスファターゼ活性が重大な役割を持つことを発見した。 Surprisingly, the inventors have, in transformant obtained by introducing the myo-inositol biosynthesis pathway in a host microorganism that has no endogenous myo-inositol biosynthesis pathway, a serious role inositol mono- phosphatase activity It was discovered to have. 前記のように、これまでのいずれの研究も、イノシトールモノフォスファターゼ活性に特別の注意を払うことはなかった。 As noted above, none of the research up to this, did not pay special attention to inositol mono phosphatase activity. しかしながら、予期せぬことに、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより、そのような形質転換体のミオイノシトール生産能が大幅に向上した。 However, unexpectedly, by strengthening inositol mono- phosphatase activity, myo-inositol-producing ability of such transformants were significantly improved. また、そのような形質転換体は、実質的な量で本発明のミオイノシトール誘導体を生産していた。 In addition, such transformants, had produced myo-inositol derivatives of the present invention in a substantial amount.

従って、本発明の一態様は、前記したイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子により形質転換された宿主微生物細胞において、イノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることを包含する。 Accordingly, one aspect of the present invention, in a host microbial cell transformed with a foreign gene encoding an above-inositol 1-phosphate synthase involves allowing overproduce inositol mono- phosphatase.

本発明で意図される、イノシトールモノフォスファターゼとは、イノシトール‐1‐リン酸に対して高い基質特異性を示すものの他にも、広範な基質に対して作用し得るリン酸モノエステル加水分解酵素活性を示すことにより、イノシトール‐1‐リン酸を実質的に加水分解化できるタンパク質を含む。 It contemplated in the present invention, the inositol mono- phosphatase, inositol-1 in addition to the ones that exhibit a high substrate specificity against phosphate, extensive phosphate monoester can act against the substrate hydrolysis activity by showing include proteins that can be substantially hydrolyzed to inositol-1-phosphate. 典型的なイノシトールモノフォスファターゼとしては、例えば、イノシトール‐1‐モノフォスファターゼが知られており、多くの生物由来の当該遺伝子(suhB遺伝子)はGenBank Accession Nos. Typical inositol mono- phosphatase, for example, inositol-1-monomethyl phosphatase are known, the gene (suhB gene) from many organisms GenBank Accession Nos. ZP_04619988、YP_001451848等で公表されている。 ZP_04619988, has been published in YP_001451848 like. 特に、大腸菌由来のsuhB遺伝子(配列番号3:AAC75586(MG1655))の使用は、大腸菌を宿主細胞とする場合に便利である。 In particular, suhB gene from Escherichia coli (SEQ ID NO: 3: AAC75586 (MG1655)) use of, is useful if you want to E. coli as a host cell.

イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子について記載した、変異や修飾及びコドン最適化、並びに発現カセット、プロモーター等のレギュレーター配列及びプラスミド等とそれによる形質転換の説明は、全て本発明のイノシトールモノフォスファターゼ遺伝子について当てはまることを当業者は容易に理解するであろう。 Inositol-1 was described for the phosphoric acid synthase gene, mutation or modification and codon optimized, as well as the expression cassettes, the description of the transformation regulator sequences and plasmids, etc. and by it, such as a promoter, all of inositol mono- phosphatase gene of the present invention Those that are true for skilled in the art will readily understand. 従って、本発明におけるイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産は、外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の発現カセットにより前記宿主微生物を形質転換することにより達成し得ることも明らかである。 Thus, overproduction of inositol mono- phosphatase in the present invention, it is also clear that can be achieved by transforming the host microorganism with the expression cassette of a foreign inositol mono- phosphatase gene.

更にまた、多くの微生物細胞は本発明で意図されるイノシトールモノフォスファターゼ活性を発現している(つまり、イノシトールモノフォスファターゼ活性をコードする内因性遺伝子を有している)と考えられる。 Furthermore, many microbial cells expressing the inositol mono- phosphatase activity contemplated by the present invention (that is, to have a endogenous gene encoding inositol mono- phosphatase activity) it considered. 従って、本発明におけるイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産は、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる;内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する;内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する;及び内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させることによっても誘導し得る。 Therefore, excess production of inositol mono phosphatase in the present invention, increase the number of copies of the endogenous inositol mono phosphatase gene; introducing mutations into the adjustment region of the endogenous inositol mono phosphatase gene; the adjustment area of the endogenous inositol mono phosphatase gene It can induce also by deleting the adjustment area of and endogenous inositol mono phosphatase gene; the substitution with high expression of inducible foreign adjustment region. 具体的にイノシトールモノフォスファターゼの過剰発現を達成するためには、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を含むか、或いは当該内因性遺伝子のコード化領域に好適な調整領域を付加した発現カセットを含む構築物により前記宿主微生物を形質転換して、当該形質転換体内での当該イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を元の宿主細胞に比べて実質的に増加させるか、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する元の宿主細胞に関して、染色体の変異、付加および欠失を公知の遺伝子組換え技術により実施するか、あるいは、変異剤などを用いて染色体にランダムに変異導入を行うことで達成することができる。 Wherein in order to achieve over-expression of inositol mono- phosphatase specifically include or endogenous inositol mono- phosphatase gene, or a construct containing an expression cassette obtained by adding a suitable adjustment area in the coding region of the endogenous gene The host microorganism is transformed, or substantially increased as compared the number of copies of the inositol mono- phosphatase gene in the transformed body to the original host cell, with respect to the original host cell having an endogenous inositol mono- phosphatase gene chromosome mutations, additions and deletions or carried out by a known genetic engineering technique, or it can be achieved by performing a random mutagenesis in the chromosome by using a mutagenesis agent. イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産の確認には、公知のSDS-PAGE分析法などを用いることができる The confirmation of the overproduction of inositol mono- phosphatase, can be used as the known SDS-PAGE analysis

更に、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための本発明の別の態様は、前記したイノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする外来遺伝子により形質転換された宿主微生物細胞において、イノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導することを含む。 Furthermore, another aspect of the present invention for enhancing the inositol mono- phosphatase activity in a host microorganism cells transformed with a foreign gene which encodes the above-mentioned inositol 1-phosphate synthase, the activity of inositol mono- phosphatase including to induce. その目的のために、1)内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、2)内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、3)内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、4)イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、及び/又は5)イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、といった手法を例示できる。 For that purpose, 1) introducing a mutation in endogenous inositol mono- phosphatase gene, 2) to replace part or all of the endogenous inositol mono- phosphatase gene, 3) deleting the part of the endogenous inositol mono phosphatase gene The deleted cell 4) reduces other proteins reducing the inositol mono- phosphatase activity, and / or 5) reducing the production of compounds that reduce the inositol mono- phosphatase activity, it can be exemplified a technique such.

上記イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための1)~5)の手法に関して、具体的には、イノシトールモノフォスファターゼの遺伝子に変異、付加あるいは欠失を施した後に当該遺伝子をコードするイノシトールモノフォスファターゼの活性を評価することで、イノシトールモノフォスファターゼ活性の強化されたイノシトールモノフォスファターゼを得ることができる。 For methods 1) to 5) to enhance the inositol mono- phosphatase activity, in particular, mutations in the gene of inositol mono- phosphatase and the activity of inositol mono- phosphatase encoding the gene after being subjected to addition or deletion was to evaluate, it is possible to obtain enhanced inositol mono- phosphatase inositol mono- phosphatase activity.

上記のようにして得られる形質転換体、例えば、外来イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子の発現カセット及びイノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の発現カセットを有するベクター(各々の発現カセットは、別個の又は同じベクター上に配置されてよい。)によりトランスフェクトされた形質転換体は、本発明のミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体生産のために、前記形質転換体の生育及び/又は維持に適した条件下で培養及び維持される。 Transformants obtained as described above, for example, exogenous inositol-1 expression cassettes and vectors carrying the expression cassettes of inositol mono- phosphatase gene phosphate synthase gene (each expression cassette, separate or same vector It may be disposed. transformant transfected with), because of myo-inositol and myo-inositol derivatives produced according to the present invention, cultured and maintained under conditions suitable for growth and / or maintenance of the transformant differentially. 各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。 Suitable medium composition, culture conditions for a transformant derived from a variety of host microorganism cell, culturing time are known to those skilled in the art.

培地は、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。 Medium, one or more carbon sources, nitrogen sources, natural containing trace components such as trace elements or vitamins with mineral salts, vitamins, and optionally, a semi-synthetic, may be a synthetic medium. しかし、使用する培地は、培養すべき形質転換体の栄養要求を適切に満たさなければならないことは言うまでもない。 However, the medium to be used is, of course, must properly satisfy the nutritional requirements of the transformant to be cultured. 更に、前記形質転換体と該形質転換体によりミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体に変換され得る炭素源を接触させるために、本発明の培地は、究極的にミオイノシトール生産の基質として利用可能な炭素源、すなわち形質転換体内でグルコース‐6‐リン酸へと変換され得る化合物を含有すべきである。 Further, for contacting a carbon source which can be converted into myo-inositol and myo-inositol derivatives by the transformant and the transformant, the culture medium of the present invention is ultimately carbon sources usable as a substrate for myo-inositol production , that it should contain a compound that may be converted to glucose-6-phosphate by transforming the body. 炭素源は、D‐グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密であり得、更にD‐グルコースを含有するバイオマスであり得る。 Carbon source, D- glucose, sucrose, oligosaccharides, polysaccharides, starch, cellulose, rice bran, obtained a dense waste sugar may be a biomass containing a further D- glucose. 好適なバイオマスとしては、トウモロコシ分解液やセルロース分解液を例示できる。 Suitable biomass, it can illustrate the corn decomposition solution or cellulose degradation solution. また、培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。 Also, culture medium, when the transformant to express a useful additional traits, for example, when it has a resistance marker to the antibiotic, may include the corresponding antibiotic. それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。 Thus, the risk of contamination by bacteria in the fermentation is reduced.

上記、セルロースや多糖類などの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用したミオイノシトール生産に適応させることができる。 Above, if unable deer host microorganism carbon sources such as cellulose and polysaccharides, and by performing a known genetic engineering techniques, such as introducing a foreign gene into the host microorganism, and myo-inositol using these carbon sources It is possible to adapt the production. 外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。 The foreign gene, for example, can be cited such as cellulase gene and amylase gene.

培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。 Culture can be a continuous even batch. また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。 Also, in each case, it may be a form to replenish an additional said carbon source such as at the appropriate time in culture. 更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、pH等を維持しながら継続されるべきである。 Furthermore, culture is suitable temperature, oxygen concentration, should be continued while maintaining the pH, and the like. 一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常15℃~45℃、好ましくは25℃~37℃の範囲である。 Suitable culture temperature of transformants derived from the general microbial host cells, usually 15 ℃ ~ 45 ℃, preferably in the range of 25 ℃ ~ 37 ℃. 宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪(フラスコ培養等)、攪拌/通気(ジャー・ファーメンター培養等)を行う必要がある。 When the host microorganism is aerobic, shaken to ensure proper oxygen concentration in the fermentation (flask culture, etc.), it is necessary to perform agitation / aeration (jar fermenter culturing, etc.). それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。 These culture conditions can be easily set to those skilled in the art.

上記の培養物からミオイノシトールを精製する方法は当業者に公知である。 Method for purifying myo-inositol from the culture are known to those skilled in the art. 原核微生物宿主細胞の形質転換体の場合、ミオイノシトールは培養上清中または菌体内に存在するが、必要であれば培養菌体から抽出してもよい。 When the transformant of a prokaryotic microbial host cell, myo-inositol is present in or in the cells the culture supernatant may be extracted from the cultured cells, if necessary. 培養菌体から抽出する場合、例えば、培養物を遠心分離して上清と菌体を分離し、ホモジナイザーを利用しつつ、界面活性剤、有機溶媒、酵素等により菌体を破壊し得る。 When extracted from the cultured cells, for example, the culture was separated by centrifugation supernatant and bacterial cells, while utilizing a homogenizer, surfactants, organic solvents, and can destroy bacteria by an enzyme or the like. 培養上清、及び場合により菌体抽出液からもミオイノシトールを精製する方法としては、pH調整等によるタンパク質沈澱を利用した除タンパク処理、活性炭を利用した不純物の吸着による除去、イオン交換樹脂等を利用したイオン性物質の吸着による除去を実施した後に、乾燥して得られた固体を、例えば水-エタノール系から再結晶することが挙げられる。 The culture supernatant, and as a method of purifying a myo-inositol from cell extract by case, deproteinization treatment using the protein precipitation by pH adjustment and the like, removal by adsorption of impurities using activated carbon, ion exchange resins After performing the removal by adsorption utilizing the ionic substance, the solid obtained by drying, for example, water - cited be recrystallized from ethanol system. 勿論、製品により目的とされる純度に応じて一部の工程を削除したり、或いはクロマトグラフィーなどの追加の精製工程を実施したりしてもよいことは言うまでもない。 Of course, or, or it is needless to say that the additional purification steps such as chromatography may be performed or delete some of the steps according to the purity that is intended by the product.

更にまた、適切な条件で培養された上記培養物からは、本発明の新規なミオイノシトール誘導体も得ることができる。 Furthermore, from the appropriate the culture which is cultured under conditions, and can also be obtained a novel myo-inositol derivatives of the present invention. 典型的な本発明のミオイノシトール誘導体は、1-4-O-β-D-glucopyranosyl-myo-inositolと称され、以下の構造を有する。 Myo-inositol derivatives of a typical invention is referred to as a 1-4-O-β-D-glucopyranosyl-myo-inositol, and has the following structure.

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005

上記のミオイノシトール誘導体は、本発明の形質転換体を、比較的多量のミオイノシトール(例えば、約30~120g/L程度)を生成させ得る培地内で培養することにより生産させることが有利である。 Myo-inositol derivatives described above, a transformant of the present invention, relatively large amounts of myo-inositol (eg, about 30 ~ 120g / about L) it is advantageous to be produced by culturing in a medium capable of generating a . すなわち、通常、本発明の形質転換体は、本発明のミオイノシトール誘導体に比べて、ミオイノシトールを多量に生産する。 That is, normally, the transformant of the present invention, as compared with myo-inositol derivatives of the present invention, to produce myo-inositol in a large amount. しかしながら、本発明の形質転換体は、下記の実施例で示すように、培地に添加されたグルコースの量に応じて、より多くのミオイノシトールのみならずミオイノシトール誘導体も生産することができるので、そのような培養条件は、本発明のミオイノシトール誘導体を得るのにも適している。 However, the transformant of the present invention, as shown in the examples below, depending on the amount of glucose added to the medium, as more myo-inositol derivatives not myo-inositol only be capable of producing, Such culturing conditions, to obtain a myo-inositol derivative of the present invention are also suitable.

本発明のミオイノシトール誘導体は、ミオイノシトールについて前記した方法に従うことで培養物から粗精製することができる。 Myo-inositol derivatives of the present invention may be a crude purified from the culture by following the methods described above for myo-inositol. 例えば、本発明のミオイノシトール誘導体は、培養上清を活性炭処理し、次にイオン交換樹脂(陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂)で処理することで粗精製することができる。 For example, myo-inositol derivatives of the present invention may be a crude purified by the culture supernatant was treated with activated carbon, then treated with an ion exchange resin (cation exchange resin and anion exchange resin).

しかしながら、上記の粗精製物は、本発明のミオイノシトール誘導体とミオイノシトールの両方を含んでいるので、本発明のミオイノシトール誘導体を単離するには、そこからミオイノシトールを分離する必要がある。 However, crude product described above, because it contains both a myo-inositol derivative and myo-inositol of the present invention, to isolate the myo-inositol derivatives of the present invention, it is necessary to separate the myo-inositol therefrom. 例えば、前記の粗精製した培養液が多量のミオイノシトールを含んでいるような場合には、当該粗精製液を減圧濃縮することでミオイノシトールの一部を析出させて、濾過などにより除去することができる。 For example, when culture was crudely purified in the can, such as including a large amount of myo-inositol, the said crude solution by precipitating a portion of the myo-inositol by concentration under reduced pressure, it is removed by filtration etc. I can. 更に、当該濾液にエタノールを添加すると残りのミオイノシトールを析出(晶析)させることができる。 Furthermore, it is possible to the rest of the myo-inositol is precipitated (crystallized) The addition of ethanol to the filtrate. 従って、エタノールによる晶析を適宜繰り返せば、所望の純度の本発明のミオイノシトール誘導体を得ることができる。 Thus, by repeating appropriate crystallization with ethanol, it is possible to obtain the desired myo-inositol derivatives of the present invention the purity. 或いは、晶析とともに又は単独で、クロマトグラフィー、例えば、SUGAR KS-801及びSUGAR KS-802、並びにShodex Asahipak NH P-50 4E(いずれも商品名で、昭和電工株式会社製。)を用いた分取HPLC等により、本発明のミオイノシトール誘導体とミオイノシトールを別々に得ることができる。 Alternatively, together or alone crystallization, chromatography, for example, SUGAR KS-801 and SUGAR KS-802, and (in both trade names, manufactured by Showa Denko KK.) Shodex Asahipak NH 2 P-50 4E was used by preparative HPLC and the like, it is possible to obtain a myo-inositol derivative and myo-inositol of the present invention separately.

本発明のミオイノシトール誘導体は、β1→4結合を加水分解する能力を有するβ‐グルコシダーゼにより容易に分解されて、対応するモル数のグルコースとミオイノシトールを生成することも確認された。 Myo-inositol derivatives of the present invention, β1 → 4 bonds to and is easily decomposed by β- glucosidase having an ability to hydrolyze, was also confirmed to produce the corresponding number of moles of glucose and myo-inositol. 本発明のミオイノシトール誘導体をβ‐グルコシダーゼ等により酵素的に分解するには、例えば水や緩衝液(酢酸緩衝液、燐酸緩衝液等)による本発明のミオイノシトール誘導体の溶液に対して適当量の酵素を添加し、その酵素反応に適切な条件及び時間にて、該溶液をインキュベーションすればよい。 The enzymatically decomposed by myo-inositol derivatives β- glucosidase or the like of the present invention are, for example, water or a buffer solution (acetate buffer, phosphate buffer, etc.) due to an appropriate amount to the solution of myo-inositol derivatives of the present invention It was added and the enzyme, at appropriate conditions and time for the enzyme reaction, it is sufficient incubation the solution. そのような目的において有利に使用できるβ‐グルコシダーゼは市販されており、そのいずれも使用できるが、例えばアスペルギルス属のカビ由来のCellobiase(SIGMA社)を利用すればよい。 Can advantageously be used β- glucosidase in such purposes are commercially available, but its both can be used, for example, may be utilized the Aspergillus-derived fungi Cellobiase (SIGMA Corp.). 添加する酵素の量は、製造元の指示を参考にしながら、本発明のミオイノシトール誘導体の溶液中の濃度等に基づいて、適宜決定すればよい。 The amount of enzyme to be added, while the manufacturer's instructions as a reference, based on the concentration and the like in a solution of myo-inositol derivatives of the present invention, may be suitably determined. また、反応時のpHは、一般的にはpH4.0~9.0の範囲であるが、要は、使用する酵素の至適pHとすればよい。 Moreover, pH at the reaction is generally in the range of pH4.0 ~ 9.0, short, may be the optimum pH of the enzyme used. また、反応時の温度も、使用する酵素の至適温度範囲とすればよく、例えば、約20~50℃程度の範囲とすればよい。 The temperature of the reaction also, it is sufficient and optimum temperature range of the enzyme to be used, for example, it may be in a range of about 20 ~ 50 ℃. 反応時間は、本発明のミオイノシトール誘導体の分解率を定量的に追跡しつつ、ほぼ全ての本発明のミオイノシトール誘導体がミオイノシトールに変換された時点とすればよい。 The reaction time, the decomposition rate of myo-inositol derivatives of the present invention, while quantitatively track, it may be the time when substantially all of the myo-inositol derivatives of the present invention is converted into myo-inositol.

なお、前記のように、本発明の形質転換体は、典型的な培養条件下では、本発明のミオイノシトール誘導体をミオイノシトールとともに、ミオイノシトールに比べて有意に少ない量で生産するから、むしろ、当該形質転換体の培養物をそのまま前記酵素で処理するか、又は当該培養物を活性炭処理程度で粗精製した後に酵素処理することにより、本発明のミオイノシトール誘導体をミオイノシトールへと変換して、ミオイノシトールの生産性を更に高めることができる。 Incidentally, as described above, the transformant of the present invention, a typical culture conditions, myo-inositol derivatives of the present invention together with the myo-inositol, from a production in an amount significantly less than that myo-inositol, but rather, Either the handle as it is said enzyme Cultures of transformants, or by the cultures are enzyme treatment after crude at about activated carbon treatment, the myo-inositol derivatives of the present invention is converted into myo-inositol, it is possible to further increase the productivity of the myo-inositol. 或いは、本発明のミオイノシトール誘導体を単離した後に、β‐グルコシダーゼにより処理して、ミオイノシトールを得てもよい。 Alternatively, myo-inositol derivatives of the present invention after isolation is treated with β- glucosidase may be obtained myo-inositol. その際に、本発明のミオイノシトール誘導体は、ミオイノシトールを資化することができる偏在菌(酵母、枯草菌、腸内細菌)に対して抵抗性であるから、使用まで(又は、生理作用を発現するときまで)、ミオイノシトールを本発明のミオイノシトール誘導体の形態に保っておくことの利点を当業者は理解するであろう。 In doing so, myo-inositol derivatives of the present invention, uneven distribution bacteria capable of assimilating the myo-inositol (yeast, Bacillus subtilis, enterobacteriaceae) because it is resistant to up to use (or physiological effect until expressing), the skilled person the advantage of advance maintaining the myo-inositol in the form of a myo-inositol derivative of the present invention will be understood.

従って、医薬品、食品、化粧品等の有効成分や機能性成分として用いることも、本発明のミオイノシトール誘導体の潜在的な用途の一つである。 Therefore, it is one of the potential applications of myo-inositol derivatives of the present invention used pharmaceuticals, food, as active ingredients and functional ingredients for cosmetics. つまり、前記のとおりにミオイノシトールは多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。 In other words, myo-inositol as described above because it is an essential material for many of the higher animals, nutrition food, feed, and is widely used as a component of pharmaceutical products. 例えば、ミオイノシトールは、脂肪やコレステロール類の代謝において重要な役割を担っていることが知られており、特に高コレステロール血症等の予防や治療に有効とされている。 For example, myo-inositol are known to play an important role in the metabolism of fats and cholesterols, which are particularly effective in the prevention and treatment of such hypercholesterolemia. そして、本発明のミオイノシトール誘導体は酵素的に分解されて容易にミオイノシトールを生成することから、本発明のミオイノシトール誘導体が生体内で酵素的に分解されてミオイノシトールを産生することを期待して、本発明のミオイノシトール誘導体自体を医薬品等に添加することは、極めて興味深い本発明の利用態様である。 The myo-inositol derivatives of the present invention because it produces a readily myo-inositol is enzymatically degraded, expect that the myo-inositol derivatives of the present invention is to produce enzymatically degraded with myo-inositol in the body Te, the myo-inositol derivative itself of the present invention is added to the drugs, etc. are very interesting use aspect of the present invention.

例えば、本発明のミオイノシトール誘導体を有効成分として含有する医薬組成物は、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、糖衣錠、液剤、又はシロップ剤等の経口投与形態とすることができ、或いは注射剤、点滴剤、坐剤、経皮又は吸収剤などの非経口投与形態とすることも可能である。 For example, pharmaceutical compositions containing myo-inositol derivatives of the present invention as an active ingredient, tablets, powders, granules, capsules, dragees, and may be oral dosage forms such as solutions or syrups, or injections, drops , suppositories, it is possible to the parenteral dosage forms such as transdermal or absorbents. これらの製剤に応じた各種担体が使用される。 Various carriers in accordance with these formulations are used. たとえば、経口剤の担体としては、賦形剤(例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、ソルビトール、各種デンプン、結晶セルロース、粉末セルロース等)、結合剤(例えば、デキストリン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポビドン、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム等)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク等)、流動性促進剤(例えば、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、酸化チタン等)、着色剤を挙げることができる。 For example, carriers for oral preparations, an excipient (eg, lactose, sucrose, glucose, mannitol, erythritol, xylitol, maltitol, sorbitol, various starch, crystalline cellulose, powdered cellulose), binders (for example, dextrin, acacia, sodium alginate, povidone, polyvinyl alcohol, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carmellose sodium, etc.), lubricants (eg, stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate, talc, etc.), fluidity accelerator (for example, hydrated silicon dioxide, light anhydrous silicic acid, titanium oxide, etc.), it can be given a coloring agent.

医薬組成物の投与量は特に限定されないが、例えば、一般的には成人1日あたり0.01~2000mgの有効成分を1回から数回に分けて投与することができる。 But not limited to the dosage of the pharmaceutical composition, for example, generally it can be administered by dividing the active ingredient of 0.01 ~ 2000mg per adult per day from one to several times. 投与頻度は月1回から連日投与が可能であり、好ましくは1回/週から3回/週、又は5回/週、若しくは連日投与である。 The frequency of administration is capable of daily administration from once a month, preferably 3 times / week from 1 times / week, or 5 times / week, or daily administration. 1日投与量、投与期間、及び投与頻度も患者の年齢、体重、身体的健康度、及び治療すべき疾患やその重症度などにより、共に適宜増減させてよい。 Daily dosage, administration period, and age of the frequency of administration is also patient, body weight, physical health, and due to disease and its severity to be treated, it may be both appropriate and decreasing to.

以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。 More of those skilled in the art given the description, the present invention can be implemented sufficiently. 以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, it gives an example for the purpose of further explanation, therefore, the present invention is not limited to this embodiment. なお、本明細書において得に断りのない限りヌクレオチド配列は5'から3'方向に向けて記載される。 Incidentally, the nucleotide sequence unless otherwise noted in the obtained herein is described in the direction 5 'to 3'.

実施例1:プラスミドの構築 1-a)イノシトールモノフォスファターゼ発現カセット 大腸菌株W3110(NBRC 12713)をLB培地中(2ml)で37℃にて振盪培養した。 Example 1: I was a plasmid of building 1-a) inositol mono phosphatase expression cassette E. coli strain W3110 (NBRC 12713) was shaken cultured at 37 ℃ in LB medium (2ml). 培養終了後、培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY-NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。 After completion of the culture, the cells were recovered from the culture medium, Nucleo Spin Tissue (product name, MACHEREY-NAGEL Inc.) Genomic DNA was extracted using. 抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、suhB遺伝子のコード領域(配列番号3)をクローニングした。 and using the extracted genomic DNA as a template, PCR amplified by the following primer (PrimeSTAR Max DNA Polymerase (product name, manufactured by Takara Bio) reaction conditions: 98 ℃ 10sec, 55 ℃ 5sec, 72 ℃ 20sec, 28cycle), of suhB gene It was cloned coding region (SEQ ID NO: 3).

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
得られたsuhBコード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。 suhB coding regions obtained was transferable inserted downstream of a promoter in the following sequence.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
すなわち、プラスミドpNFP-A51(FERM ABP-11515として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2011年10月25日に寄託した。)のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。 That is, (as FERM ABP-11515, was deposited with the October 25, 2011 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary.) Plasmid pNFP-A51 a terminator sequence and the promoter sequence into the multiple cloning site of insertion It was.
導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたsuhBコード領域をライゲーションして、pNFP-A54を構築した。 The suhB coding region cloned in the above downstream of the introduced promoter sequence was ligated to construct pNFP-A54. 構築したpNFP-A54を、塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)により大腸菌AKC-016株(FERM ABP-11512として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。)にトランスフェクトした。 The pNFP-A54 was built, calcium chloride method (Yodosha genetic engineering laboratory notebook on Tamura Takaaki Author, reference) as E. coli AKC-016 strain (FERM ABP-11512 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Microorganisms Depositary in was deposited on April 20, 2011.) I was transfected into. SDS-PAGEにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトールモノフォスファターゼの高発現を確認した。 It confirmed the high expression of inositol mono phosphatase in the soluble fraction of the E. coli by SDS-PAGE.

1-b) イノシトール‐1‐リン酸合成酵素発現カセット 単離した酒精酵母の培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY-NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。 1-b) inositol-1 bacterial cells from the culture solution of phosphoric acid synthase expression cassette isolated alcohol yeast is recovered and extracted Nucleo Spin Tissue (product name, genomic DNA using the MACHEREY-NAGEL Inc.) It was. 抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、INO1遺伝子のコード領域(配列番号1)をクローニングした。 and using the extracted genomic DNA as a template, PCR amplified by the following primer (PrimeSTAR Max DNA Polymerase (product name, manufactured by Takara Bio) reaction conditions: 98 ℃ 10sec, 55 ℃ 5sec, 72 ℃ 20sec, 28cycle), of INO1 gene It was cloned coding region (SEQ ID NO: 1).

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
得られたino1コード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。 ino1 coding regions obtained was transferable inserted downstream of a promoter in the following sequence.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
すなわち、上記プラスミドpNFP-A51のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。 In other words, we had to insert the terminator sequence and the promoter sequence into the multiple cloning site of the plasmid pNFP-A51.
導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたino1コード領域をライゲーションして、pNFP-D78を構築した。 The ino1 coding region cloned in the above downstream of the introduced promoter sequence was ligated to construct pNFP-D78. 構築したpNFP-D78を、塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)により大腸菌AKC-016株(FERM ABP-11512として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。)にトランスフェクトした。 The pNFP-D78 was built, calcium chloride method (Yodosha genetic engineering laboratory notebook on Tamura Takaaki Author, reference) as E. coli AKC-016 strain (FERM ABP-11512 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Microorganisms Depositary in was deposited on April 20, 2011.) I was transfected into. SDS-PAGEにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトール‐1‐リン酸合成酵素の高発現を確認した。 It confirmed the high expression of inositol-1-phosphate synthase in the soluble fraction of the E. coli by SDS-PAGE.

1-c) 形質転換のためのプラスミドの構築 pNFP-D78をSalIで消化し、平滑末端化及び5'末端脱リン酸化した。 1-c) was digested plasmid construct pNFP-D78 for the transformation with SalI, and was blunted and 5 'terminal dephosphorylation. pNFP-A54中のsuhB発現カセットをクローニングして、pNFP-D78にライゲーションした。 by cloning suhB expression cassette in pNFP-A54, and ligated into pNFP-D78. pNFP-D78中のINO1発現カセットと順方向にsuhB発現カセットがライゲーションしていたpNFP-G22を取得した。 INO1 expression cassette and suhB expression cassette in the forward direction in pNFP-D78 is I have to get the pNFP-G22, which has been ligation.

実施例2:ミオイノシトール生産 2-a) 発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるミオイノシトール生産 実施例1の手順に従って構築したプラスミドpNFP-G22を、大腸菌AKC-016株(FERM ABP-11512として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。)に塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)を用いてトランスフェクトした。 Example 2: plasmid pNFP-G22, which was constructed in accordance with the procedure of myo-inositol production Example 1 by transformants transfected with myo-inositol production 2-a) expression cassette containing plasmid, E. coli AKC-016 strain (FERM ABP-11512 as, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology and was deposited on April 20, 2011 in the Patent Microorganisms Depositary Center.) transfected using calcium chloride method (Yodosha genetic engineering laboratory notebook on Tamura Takaaki al., see) It was. 当該形質転換体をAKC-016-G22株と命名した。 The transformant it was designated as AKC-016-G22 shares.
一方、対照の形質転換は、INO1発現カセットのみを含んだプラスミドpNFP-D78でトランスフェクトして得、当該対照の形質転換体をAKC-016-D78株と命名した。 On the other hand, the transformation of control, and obtained by transfected with plasmid pNFP-D78 that contained only INO1 expression cassette, was a transformant of the contrast was named AKC-016-D78 shares. 得られた各々の形質転換体を、アンピシリン(100mg/L)含有LBプレート上で、37℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。 The resulting respective transformants, ampicillin (100mg / L) containing LB plates, 37 ℃, and cultured for one day, and allowed to form colonies. アンピシリン(100mg/L)を含むLB培地2mLを15mL容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3~5時間、OD(600nm)が0.5程度になるまで180rpmで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。 LB medium 2mL containing ampicillin (100mg / L) was placed in a test tube of 15mL volumes of colonies from the plate was inoculated with a platinum loop, at 37 ℃, 3 ~ 5 hours, OD (600nm) of about 0.5 and it was cultured at 180rpm until to obtain a pre-culture liquid for the main culture it.
250mL容のJar培養装置(機種名 バイオJr.8、バイオット製)に、10g/L、15g/L又は30g/Lのグルコースと、100mg/Lのアンピシリンを含む合成培地(下表)、又はLB培地を100mL入れ、2mLの前培養液を添加し本培養(ミオイノシトール生産試験)を行った。 Jar culture apparatus of 250mL capacity (model name bio Jr.8, made Baiotto) to, 10g / L, and glucose 15g / L or 30g / L, synthetic medium containing ampicillin 100mg / L (table below), or LB Medium was placed 100mL, was subjected to the added main culture The preculture of 2mL (myo-inositol production test). 培養条件は次のとおり;培養温度 30℃;培養pH 6.7;アルカリ添加 10%(重量/容量)アンモニア水;攪拌 1200rpm;通気 0.1vvm。 The culture conditions are as follows; culture temperature 30 ℃; culture pH 6.7; alkali added in an amount of 10% (weight / volume) aqueous ammonia; stirring 1200rpm; ventilation 0.1vvm.

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
上記の培養液を、4℃で、10,000g10分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のミオイノシトール濃度を測定した。 The above culture solution, at 4 ℃, the supernatant was recovered by centrifugation 10,000g 10 minutes before measuring the myo-inositol concentration in the culture supernatant. 具体的に、KS-G(ガードカラム)、Sugar KS-801及びSugar KS-802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結してHPLC(検出器:RI、カラム温度:70℃、流速:1mL/min)を行うことで、培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。 Specifically, KS-G (guard column), Sugar KS-801 and Sugar KS-802 (all trade names, Showa Denko Co., Ltd.) by concatenating the HPLC (detector: RI, column temperature: 70 ℃, flow rate: 1mL / min) and by performing, to quantify the myo-inositol concentration in the culture supernatant. 本発明の形質転換体(AKC-016-G22株)と対照株(AKC-016-D78株)を比較した結果を表2(合成培地)及び表3(LB培地)に示した。 The transformant of the present invention the result of comparison (AKC-016-G22 strain) and control strain (AKC-016-D78 strain) are shown in Table 2 (synthetic medium) and Table 3 (LB medium).
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012

2-b) 発現カセットを染色体上に有する形質転換体によるミオイノシトール生産 本実施例では、更にINO1発現カセット及びsuhB発現カセットの双方を染色体上に有する形質転換体も作製した(大腸菌AKC-018株、FERM ABP-11514として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2011年10月25日に寄託した。)。 2-b) in the myo-inositol production this embodiment according to the transformant having the expression cassette on the chromosome, further transformation having on the chromosome both INO1 expression cassette and suhB expression cassette was also produced (E. coli AKC-018 strain , as FERM ABP-11514, it was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary on October 25, 2011.).
一方、対照の形質転換は、INO1発現カセットのみを染色体上に組み込んで得た(大腸菌AKC-017株、FERM ABP-11513として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2011年10月25日に寄託した。)。 On the other hand, the transformation of control, only INO1 expression cassette was obtained by incorporating into the chromosomal (E. coli AKC-017 strain, as FERM ABP-11513, in October 2011 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary was deposited on the 25th.).
各々の形質転換体を、アンピシリンを含まないLB培地で前培養し、また、アンピシリンを含ませず且つグルコースの添加量を10g/L又は30g/Lとした以外は実施例2-a)と同じ合成培地及びLB培地を用いて、当該形質転換体により実施例2-a)と同様の培養条件下でミオイノシトールを生産させた。 Each of the transformants were precultured in LB medium without ampicillin and also except that the and amount of addition of glucose is not included ampicillin was a 10g / L or 30g / L Example The 2-a) and the same Using a synthetic medium and LB medium and allowed to produce myo-inositol under the same culture conditions as in Example 2-a) by the transformant. 次いで、実施例2-a)と同様の方法により培養上清中のミオイノシトール濃度を定量した。 Then, it was determined myo-inositol concentration in the culture supernatant in the same manner as in Example 2-a). 本発明の形質転換体(AKC-018株)と対照株(AKC-017株)を比較した結果を表4(合成培地)及び表5(LB培地)に示した。 The transformant of the present invention the result of comparison (AKC-018 strain) and control strain (AKC-017 strain) are shown in Table 4 (synthetic medium) and Table 5 (LB medium).

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014

上記実施例2-a)及び2-b)の結果は、大腸菌宿主(対照株)における内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性の存在を確認するものの、合成生物学的手法による従来のミオイノシトール生産において当該活性が十分でなかったことを示した。 Above Example 2-a) and 2-b) of the results, but to confirm the presence of endogenous inositol mono phosphatase activity in E. coli host (control strain), the activity in the conventional myo-inositol production by synthetic biology techniques showed that it was not sufficient. 驚くべきことに、当該宿主におけるイノシトールモノフォスファターゼ活性の亢進は、対照と比較しておよそ1.5~5倍もミオイノシトール生産性を向上させた。 Surprisingly, enhancement of inositol mono- phosphatase activity in the host, was approximately 1.5-5 times increase myoinositol productivity compared to a control. 更に驚くべきことに、イノシトールモノフォスファターゼ活性が亢進させられた微生物において、ミオイノシトール生産量は仕込みグルコース量に正比例して増加した。 Even more surprisingly, in a microorganism inositol mono- phosphatase activity was then increased, myo-inositol production increased in direct proportion to the charged amount of glucose. このことは、従来の技術常識に反して、合成生物学的手法によるミオイノシトール生産において、イノシトールモノフォスファターゼ活性の重要な役割を実証している。 This is contrary to prior art knowledge, the myo-inositol produced by synthetic biology techniques have demonstrated the important role of inositol mono- phosphatase activity.

実施例3:新規ミオイノシトール誘導体 3-a) 新規ミオイノシトール誘導体の生産 本実施例では、実施例2-a)で得た本発明の形質転換体であるAKC-016-G22株による新規ミオイノシトール誘導体の生産を示す。 Example 3: New Mio in the production embodiment of the inositol derivative 3-a) New myo-inositol derivatives and novel myo-inositol by AKC-016-G22 strain is a transformant of the present invention obtained in Example 2-a) It shows the production of derivatives.
アンピシリン(100mg/L)を含むLB培地100mLを500mL容の試験管に入れ、AKC-016-G22株を培養したプレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3~5時間、OD(600nm)が0.5程度になるまで180rpmで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。 LB medium 100mL containing ampicillin (100mg / L) was placed in a test tube of 500mL volume, and colonies from the plates were cultured AKC-016-G22 strain was inoculated a platinum loop, at 37 ℃, 3 ~ 5 hours, OD and it was cultured at 180rpm until (600nm) becomes about 0.5, to obtain a pre-culture liquid for the main culture it.
10L容のJar培養装置(丸菱バイオエンジ社製)に、15g/Lのグルコースと、100mg/Lのアンピシリンを含む下記の合成培地(表6)を3L入れ、60mLの前培養液を添加し本培養を行った。 The Jar culture device of 10L capacity (manufactured Maruhishi Bio Engineering Co.), and glucose 15g / L, the synthesis medium with the following (Table 6) were placed 3L containing ampicillin 100mg / L, was added a pre-culture of 60mL this culture we went. 培養条件は次のとおり培養温度 32℃;培養pH 6.0〔下限〕;アルカリ添加 28%(重量/容量)アンモニア水;攪拌 850rpm;通気 1vvm。 Culture conditions as follows: culture temperature 32 ℃; culture pH 6.0 [lower]; alkali addition 28% (w / v) aqueous ammonia; agitation 850rpm; ventilation 1vvm. 原料となるグルコースフィード溶液(表7)は、培養液中のグルコース濃度が0~5g/Lとなるように適宜添加した。 Glucose feed solution (Table 7) as a raw material, I was appropriately added as the concentration of glucose in the culture solution is 0 ~ 5g / L.

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
培養時間69.5時間後、上記の培養液の一部を、4℃で、10,000g10分間遠心分離して上清を回収した。 After cultivation time 69.5 hours, a part of the culture solution, at 4 ℃, and the supernatant was recovered by centrifugation 10,000g 10 minutes. 上清を、KS-G(ガードカラム)、Sugar KS-801及びSugar KS-802(いずれも商品名、昭和電工株式会社製)を連結したHPLC(移動相:水、カラム温度:70℃、流速:1mL/min、検出器:RI)で分析した結果、ミオイノシトール濃度は102g/Lであった。 The supernatant, KS-G (guard column), Sugar KS-801 and Sugar KS-802 (trade names, manufactured by Showa Denko KK) HPLC of concatenating the (mobile phase: water, column temperature: 70 ℃, flow rate : 1mL / min, detector: RI) As a result of analysis, the myo-inositol concentration was 102g / L.
一方、本発明の新規ミオイノシトール誘導体(1-4-O-β-D-glucopyranosyl-myo-inositol)は、Shodex Asahipak NH P-50 4E(商品名、昭和電工株式会社製)を用いたHPLC(移動相:水/アセトニトリル=25/75、カラム温度:40℃、流速:0.8mL/min、検出器:RI)による分析で、リテンションタイムが17.4分となり(なお、当該分析時のミオイノシトールのリテンションタイムは13分であった。)、前記上清中に0.3g/Lの濃度で含まれていた。 On the other hand, new myo-inositol derivatives of the present invention (1-4-O-β-D-glucopyranosyl-myo-inositol) is, Shodex Asahipak NH 2 P-50 4E (trade name, manufactured by Showa Denko Co., Ltd.) using HPLC (mobile phase: water / acetonitrile = 25/75, column temperature: 40 ℃, flow rate: 0.8mL / min, detector: RI) Analysis by, retention time becomes 17.4 minutes (It should be noted that, at the time of the analysis retention time of myo-inositol was 13 minutes.), it was included at a concentration of 0.3g / L in the supernatant.

3-b) 新規ミオイノシトール誘導体の単離 上記のようにして得た培養液の1000mLを、大型遠心機を用い8,800rpmで20分間遠心後、さらに小型遠心機を用い13,000rpmで5分間遠心した。 3-b) to 1000mL of the culture liquid obtained as isolation aforementioned novel myo-inositol derivatives, after centrifugation for 20 min at 8,800rpm using a large centrifuge, further 13,000rpm using a small centrifuge 5 minutes and centrifuged. 得られた上清から、0.45μmのフィルター(MILLIPORE社 オムニポアメンブレン 型番JHWP09025)を用い、減圧濾過で固形物を濾別した。 from the supernatant obtained, using a 0.45μm filter (MILLIPORE Corp. Omnipore membrane model number JHWP09025), it was filtered off the solids by vacuum filtration. フィルター濾過後の濾液1000mLに活性炭白鷺A(商品名、日本エンバイロケミカルズ社製)を5g添加し、スターラーで30分間撹拌した。 Filtration filtrate activated carbon Shirasagi A (trade name, Nippon Enviro Chemicals Co., Ltd.) to 1000mL after the 5g addition, it was stirred for 30 minutes with a stirrer. その液から、0.45μmのフィルターを用い、減圧濾過で活性炭を濾別した。 From the liquid, using a 0.45μm filter, it was filtered off the activated carbon by vacuum filtration. 活性炭処理後の濾液に陽イオン交換樹脂(オルガノ社製アンバーライトIR120B H 型)を500mL添加し、スターラーで30分間撹拌した。 The filtrate cation exchange resin after the treatment with activated carbon (manufactured by Organo Amberlite IR120B H + form) was added 500mL, and stirred for 30 minutes by a stirrer. その液から、0.45μmのフィルターを用い、減圧濾過で陽イオン交換樹脂を濾別した。 From the liquid, using a 0.45μm filter and filtered off the cation exchange resin by vacuum filtration. 陽イオン交換処理後の濾液に陰イオン交換樹脂(オルガノ社製アンバーライトIRA96SB OH 型)を500mL添加し、スターラーで30分間撹拌した。 Cation exchange treatment after the filtrate to an anion exchange resin (manufactured by Organo, Amberlite IRA96SB OH - form) was added 500mL, and stirred for 30 minutes by a stirrer. その液から、0.45μmのフィルターを用い、減圧濾過で陰イオン交換樹脂を濾別した。 From the liquid, using a 0.45μm filter and filtered off the anion exchange resin by vacuum filtration.

陰イオン交換処理後の濾液1000mLについて、エバポレータで70℃、100mbarで水を留去し、4倍に濃縮し250mLとした。 About 1000mL filtrate after the anion exchange treatment, 70 ℃ an evaporator, and water was distilled off at 100mbar, concentrated four-fold and was 250mL. 室温まで自然に冷却した後4℃で保存し、ミオイノシトールを析出させた後、減圧濾過でミオイノシトールを濾別した。 Were stored at 4 ℃ After cooling naturally to room temperature and allowed to precipitate the myo-inositol were filtered off myo-inositol by vacuum filtration. 濾液189mLの組成は、ミオイノシトールが5.83%、及び本発明のミオイノシトール誘導体が0.131%であった(ともに、W/V)。 The composition of the filtrate 189mL, the myo-inositol is 5.83%, and myo-inositol derivatives of the present invention was 0.131% (both, W / V). 室温でこの液にエタノールを189mL添加し、さらにミオイノシトールを析出させた後、減圧濾過でミオイノシトールを濾別した。 Was added 189mL of ethanol at room temperature to this solution, after further precipitating the myo-inositol were filtered off myo-inositol by vacuum filtration. 濾液373mLの組成は、ミオイノシトールが1.41%、及び本発明のミオイノシトール誘導体が0.067%であった。 The composition of the filtrate 373mL, the myo-inositol is 1.41%, and myo-inositol derivatives of the present invention was 0.067%. 更に濾液から、エバポレータ(70℃、100mbar)を用いてエタノールを留去し、ミオイノシトールが8.46%で、本発明のミオイノシトール誘導体が0.401%の水溶液62mLを得た。 Further from the filtrate, the evaporator (70 ℃, 100mbar) by using the ethanol was distilled off, in myo-inositol 8.46%, myo-inositol derivatives of the present invention was to obtain a 0.401% aqueous solution 62mL. これにさらに室温でエタノールを186mL添加し、ミオイノシトールを析出させた後、減圧濾過でミオイノシトールを濾別した。 This further 186mL adding ethanol at room temperature, was allowed to precipitate myo-inositol was filtered off myo-inositol by vacuum filtration. 濾液244mLの組成は、ミオイノシトールが0.33%、及び本発明のミオイノシトール誘導体が0.100%であった。 The composition of the filtrate 244mL, the myo-inositol is 0.33%, and myo-inositol derivatives of the present invention was 0.100%. 濾液から、エバポレータ(70℃、100mbar)を用いてエタノールと水を留去し、ミオイノシトールが3.30%、及び本発明のミオイノシトール誘導体が0.998%の溶液を、24mLを得た。 From the filtrate, the evaporator (70 ℃, 100mbar) and ethanol was distilled off and water using a myo-inositol 3.30%, and the solution myo-inositol derivatives of 0.998% of the present invention, was obtained 24mL.

上記の溶液中に、ミオイノシトール及び本発明のミオイノシトール誘導体とは別の物質(構造は未同定。)であり、両者からの分離が困難な複数の不純物の存在が認められたので、種々の精製方法を検討した結果、酵素処理が有効であった。 The above solution, a separate material from the myo-inositol derivatives of myo-inositol and the present invention (structure unidentified.), And since there separation is difficult to more impurities from both observed, various As a result of considering the purification method, enzyme treatment was effective. すなわち、上記のミオイノシトール及び本発明のミオイノシトール誘導体の混合液500μLに対して、150mMのBis-Tris(pH7.0)バッファーの300μLと、100UN/mLのα-Glucosidase(Sigma-Aldrich社製、Bacillus stearothermophilus由来)の200μLを添加し、インキュベーター(AS ONE SI-300C)を用いて、反応温度40℃、1,200rpmで撹拌しながら22時間反応を行った。 That is, the mixture 500μL of myo-inositol derivative of the above myo-inositol and the present invention, 150mM of Bis-Tris (pH7.0) and 300μL of buffer, 100UN / mL of α-Glucosidase (Sigma-Aldrich Corp., It was added 200μL of Bacillus stearothermophilus origin), using incubator (AS ONE SI-300C), reaction temperature 40 ℃, was carried out with stirring 22 hours at 1,200rpm. 反応後、HPLC分析により、前記の不純物の1つが分解されたことを確認した。 After the reaction, by HPLC analysis, one of the impurities was confirmed that it was degraded. その後、反応液を99℃のドライブロックバス(SIBATA製 BI-1200)で5分間加温し、酵素を失活させた。 Then, the reaction mixture was warmed for 5 minutes at 99 ℃ drive lock bus (SIBATA made BI-1200), to inactivate the enzyme. 反応済みの液を遠心分離後、上清を0.45μmのフィルターを用い濾過した。 After the reacted liquid centrifugation, the supernatant was filtered using a 0.45μm filter. 濾液を凍結乾燥させた後、水を加え5mLの水溶液とした。 After freeze-drying the filtrate to obtain a solution of water was added 5mL. この液500μLにさらに150mMの Bis-Tris(pH7.0)バッファーの300μLと、100UN/mLのβ-Glucosidase(オリエンタル酵母工業株式会社製、アーモンド由来)の200μLを添加し、インキュベーターを用いて反応温度40℃、1,200rpmで撹拌しながら、0.5時間の短時間での反応を行った。 Further and 300μL of 150mM Bis-Tris (pH7.0) buffer for the liquid 500μL, 100UN / mL of β-Glucosidase (Oriental Yeast Co., almond-derived) was added 200μL of, and reaction temperature using an incubator 40 ℃, while stirring at 1,200rpm, and the reaction was carried out in a short time of 0.5 hours. 反応後、HPLC分析により、もう1つの不純物が分解されたことを確認した。 After the reaction, by HPLC analysis, it was confirmed that another one of the impurities are decomposed. その後、反応液を99℃のドライブロックバスで5分間加温し、酵素を失活させた。 Thereafter, the reaction solution was heated for 5 minutes at drive lock bus of 99 ℃, it was to inactivate the enzyme. 遠心分離後、上清を0.45μmのフィルターを用い濾過した。 After centrifugation, the supernatant was filtered using a 0.45μm filter. 濾液を凍結乾燥させた後、水を加えて、本発明のミオイノシトール誘導体を約0.99%含む水溶液(2.5mL)とした。 After freeze-drying the filtrate, water was added to prepare a solution (2.5mL) containing myo-inositol derivatives of the present invention about 0.99%.

上記の酵素分解による精製後の水溶液を用いて、1回の打込み量を10μLとし、200回のHPLC分取を行った。 Using an aqueous solution after purification by the enzymatic degradation, once the ejection amount is set to 10μL, it was subjected to preparative HPLC 200 times the fraction. 分取の際のHPLC条件は以下のとおりであった: HPLC conditions for preparative were as follows:
カラム:Shodex Asahipak NH P-50 4E、 Column: Shodex Asahipak NH 2 P-50 4E,
移動相:水/アセトニトリル=25/75 Mobile phase: water / acetonitrile = 25/75
流速:0.8mL/min Flow rate: 0.8mL / min
温度:40℃ Temperature: 40 ℃
検出器:RI Detector: RI
オートサンプラ:島津SIL-20A形 全量試料注入式 Auto sampler: Shimadzu SIL-20A form the total amount of sample injection formula

HPLC分取後のサンプルから、エバポレータ(70℃、100mbar)によりアセトニトリルを留去し、さらに凍結乾燥により水も留去して、本発明のミオイノシトール誘導体の乾燥固形物を得た(収量:19mg)。 The sample after preparative HPLC fraction, an evaporator (70 ℃, 100mbar) and acetonitrile was evaporated by, further distilling off water also by freeze drying to obtain a dry solid product of myo-inositol derivatives of the invention (yield: 19mg ).

3-c) 新規ミオイノシトール誘導体の構造決定 実施例3-b)で分取した化合物を、以下のNMR分析によって構造決定した。 The 3-c) the compound was fractionated by new myo-inositol derivative of structure determination Example 3-b), it was structured determined by the following NMR analysis.
装置 :Avance600(Bruker Biospin社製) Equipment: Avance600 (Bruker Biospin Co., Ltd.)
プローブ :クライオプローブ( 13 C高感度) Probe: cryo-probe (13 C high sensitivity)
測定温度 :18℃(試料劣化防止と H-NMRの際に水シグナルを移動させるため、全て291K(18℃)とした。) Measurement temperature: 18 ℃ (for moving the water signal upon sample degradation prevention and 1 H-NMR, all was 291K (18 ℃).)
溶媒: :D O(ALDRICH社製) Solvent:: D 2 O (manufactured by ALDRICH Corp.)
内部標準 :TSP Internal standard: TSP
H観測周波数:600.13MHz 1 H observation frequency: 600.13MHz
13 C観測周波数:150.92MHz 13 C observation frequency: 150.92MHz
測定結果及びピークの帰属は以下のとおりであった。 Measurement results and the peak assignments of was as follows. なお、表中、ピーク番号の「GH-1」とは、グルコース残基の1位水素であることを示す。 In the table, the "GH-1" of the peak number, to indicate that it is a 1-position hydrogen of the glucose residue. また「IH-1」とは、ミオイノシトール残基の1位水素であることを示す。 Also as "IH-1" indicates that it is a 1-position hydrogen of the myo-inositol residues. 他も同様である。 The other is also the same.

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
また、ピークの帰属は、COSY、CH-COSY、HMBC、J分解二次元NMRにより確認した。 In addition, the peaks, it was confirmed COSY, CH-COSY, HMBC, by J decomposition two-dimensional NMR.

3-d) 新規ミオイノシトール誘導体の酵素分解 実施例3-b)で分取した化合物を、アスペルギルス属のカビ由来のβ‐グルコシダーゼである、Cellobiase(SIGMA社)により分解した。 The 3-d) compounds was fractionated by novel enzymatic degradation embodiment of myo-inositol derivative 3-b), it is a fungal origin of β- glucosidase of Aspergillus and was decomposed by Cellobiase (SIGMA Corp.). 具体的に、当該化合物を、400μLの150mM Bis‐Tris緩衝液(pH=7.0)に、6mg/mlの濃度で溶解した。 Specifically, the compound, 400μL of 150mM Bis-Tris buffer (pH = 7.0), it was dissolved at a concentration of 6mg / ml. 当該溶液に、25U/mLのCellobiaseを100μL加え、40℃で22時間までインキュベート(1200rpm、Bioshaker M・BR022、TAITEC社)して反応させた。 To the solution was added 100μL the Cellobiase of 25U / mL, incubated for up to 22 hours at 40 ℃ (1200rpm, Bioshaker M BR022, TAITEC, Inc.) was to react. 反応0時間、3時間、22時間目に反応液をサンプリングし、HPLC(カラム:Shodex Asahipak NH P-50 4E(商品名)、移動相:水/アセトニトリル=25/75、流速:0.8mL/min、カラム温度:40℃、検出器:RI)で反応状況を確認した。 The reaction 0 h, 3 h, sampling the reaction liquid to 22 hours, HPLC (Column: Shodex Asahipak NH 2 P-50 4E (trade name), mobile phase: water / acetonitrile = 25/75, flow rate: 0.8mL / min, column temperature: 40 ℃, detector: I the reaction was confirmed situation in RI).

図6に示した結果のとおり、反応開始から3時間目には、本発明のミオイノシトール誘導体がほとんど分解して、対応する量のグルコースとシロ‐イノシトールが生成した。 As the results shown in Figure 6, in the third hour from the beginning of the reaction, the myo-inositol derivatives of the present invention are hardly decomposed, the corresponding amount of glucose and white - inositol was generated. また、反応開始から22時間後には、本発明のミオイノシトール誘導体は完全に分解していた。 In addition, the 22 hours after the start of the reaction, myo-inositol derivatives of the present invention has been completely decomposed. このことから、本発明のミオイノシトール誘導体が、β‐グルコシダーゼにより容易に分解されることが判った。 Therefore, myo-inositol derivatives of the present invention was found to be easily decomposed by β- glucosidase. また、本酵素実験からも、本発明のミオイノシトール誘導体の構造決定の正しさが確認された。 Also, from the enzyme experiment, the correctness of the structure determination of myo-inositol derivatives of the present invention was confirmed.

本発明は、ミオイノシトール及びその誘導体の工業的発酵生産に利用できる。 The present invention can be utilized for industrial fermentative production of myo-inositol and derivatives thereof.

Patent Citations
Cited PatentFiling datePublication dateApplicantTitle
WO2009145838A2Apr 3, 2009Dec 3, 2009Massachusetts Institute Of TechnologyCellular production of glucaric acid
WO2011063304A1 *Nov 19, 2010May 26, 2011Opx Biotechnologies, Inc.Methods, systems, and compositions for microbial bio-production of biomolecules using syngas components, or sugars, as feedstocks
JP2000041689A Title not available
JP2011055722A Title not available
JPH08258A Title not available
JPH0838188A Title not available
JPH0889262A Title not available
JPH1042860A Title not available
JPH1042882A Title not available
JPH1042883A Title not available
JPH09117295A Title not available
JPH09220093A Title not available
JPH10271995A Title not available
US20040209337 *May 4, 2004Oct 21, 2004Frost John WSynthesis of 1,2,3,4-tetrahydroxybenzenes from biomass-derived carbon
Non-Patent Citations
Reference
1"Cloning Vectors", 1985, ELSEVIER
2"Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", vol. 185, 1990, ACADEMIC PRESS
3F. AUSUBEL ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1997, WILEY INTERSCIENCE
4GENE, vol. 105, 1991, pages 61 - 72
5 *GORIN,P.A. ET AL.: "Formation of 0-beta-D- glucopyranosyl- and 0-P-beta-galactopyranosyl-myo- inositols by glycosyl transfer", CANADIAN JOURNAL OF CHEMISTRY, vol. 43, no. 8, 1965, pages 2259 - 64, XP055137230
6 *HOPF,H. ET AL.: "0-beta-D-glucopyranosyl-(1-1)-myo- inositol (glucinol) in higher plants", ZEITSCHRIFT FUER PFLANZENPHYSIOLOGIE, vol. 100, no. 3, 1980, pages 189 - 95, XP008171682
7J. AM. CHEM. SOC., vol. 121, 1999, pages 3799 - 3800
8SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
9 *SATO,M. ET AL.: "Synthesis of glucosyl-inositol using a CGTase, isolation and characterization of the positional isomers, and assimilation profiles for intestinal bacteria", BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 14, no. 8, 1992, pages 659 - 64, XP055128711
10 *See also references of EP2781600A4
11 *WATANABE,Y. ET AL.: "Absolute configuration of 4-a-D-glucopyranosyl-myo-inositol, enzymatic transglycosylation product", JOURNAL OF CARBOHYDRATE CHEMISTRY, vol. 12, no. 6, 1993, pages 685 - 692, XP008171679
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