WO2014042148A1 - がんマーカーおよびその用途 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a cancer marker, a test method for the risk of cancer using the same, and a test reagent, and further relates to a cancer therapeutic agent and a screening method thereof.
  • cancer has been the top cause of death among Japanese people, and has become the leading cause of death in other countries.
  • Various factors such as genetic factors and environmental factors are related to the occurrence and progression of cancer, but definitive diagnostic and therapeutic methods have not yet been established.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Non-Patent Documents 1 and 2.
  • Tumor markers in pancreatic cancer a European Group on Tumor Markers (EGTM) status report, Ann. 441-447 Hiroyuki Watanabe and three others, “Special issue: Diagnosis and treatment of pancreatic cancer. Is early diagnosis of pancreatic cancer possible? Tumor marker” Surgical treatment, Nagai Shoten, September 2007, Vol. 97, p. 250-257
  • an object of the present invention is to provide a new cancer marker for testing the risk of cancer.
  • the cancer marker of the present invention is a prorenin receptor.
  • the cancer morbidity risk test method of the present invention includes a step of measuring the expression level of a prorenin receptor in a biological sample of a subject.
  • the test reagent of the present invention is a test reagent used for the cancer morbidity risk test method of the present invention and includes a prorenin receptor expression measurement reagent.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention is characterized by containing at least one of a binding substance that binds to the prorenin receptor and an expression inhibitor that suppresses the expression of the prorenin receptor.
  • the cancer treatment method of the present invention comprises a step of administering the cancer therapeutic agent of the present invention to a patient.
  • the screening method of the present invention is a screening method for a candidate substance for cancer treatment, wherein a binding substance that binds to a prorenin receptor or an expression inhibitor that suppresses expression of the prorenin receptor is detected from the test substance. It is selected as a candidate substance for use.
  • the present inventor has found that the expression of prorenin receptor in the living body correlates with the onset of cancer, and has established the present invention. According to the present invention, by measuring the expression level of a prorenin receptor, it is possible to test the cancer risk of a subject.
  • the prorenin receptor is a target for cancer
  • a candidate substance for cancer treatment can also be obtained by screening using the target. Therefore, the present invention is extremely useful in the clinical field and biochemical field.
  • FIG. 1 is a graph showing the concentration of prorenin receptor protein in plasma in Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a graph showing changes in the number of cells over time in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression of prorenin receptor protein in Example 3.
  • FIG. 4 is a graph showing mRNA expression of the prorenin receptor gene in Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression of prorenin receptor protein in Example 4.
  • FIG. 6 is a graph showing mRNA expression of the prorenin receptor gene in Example 4.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression of prorenin receptor protein in Example 5.
  • FIG. 8 is a graph showing mRNA expression of the prorenin receptor gene in Example 5.
  • FIG. 9 is a tissue staining diagram showing the expression of prorenin receptor protein in Example 6.
  • FIG. 10 is a graph showing the cancer volume in Example 7.
  • FIG. 11 is a photograph of a mouse in Example 7.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression of prorenin receptor protein in Example 7.
  • FIG. 13 is a graph showing the volume of cancer in Example 8.
  • FIG. 14 is a photograph showing the expression of prorenin receptor protein in Example 9.
  • FIG. 15 is a photograph showing the expression of prorenin receptor protein in Example 10.
  • FIG. 16 is a graph showing the expression of phosphorylated LRP protein in Example 10.
  • FIG. 17 is a graph showing the expression of active ⁇ -catenin protein and Cylin D1 protein in Example 10.
  • FIG. 18 is a graph showing the proliferation ability of cells in Example 11.
  • FIG. 19 is a dot plot showing the proportion of apoptotic cells in Example 12.
  • FIG. 20 is a histogram showing the proportion of apoptotic cells in Example 12.
  • FIG. 21 is a graph showing the proportion of cells in each cell cycle in Example 12.
  • FIG. 22 is a graph showing the activity of caspase 3 in Example 12.
  • FIG. 23 is a graph showing the concentration of prorenin receptor protein in plasma in Example 13.
  • the cancer marker of the present invention is a prorenin receptor. According to the cancer marker of the present invention, for example, by measuring the expression level of a prorenin receptor in a biological sample of a subject, the subject's cancer risk can be tested.
  • the origin of the prorenin receptor is not particularly limited, and can be appropriately set depending on, for example, the type of the subject.
  • Examples of the origin include humans and non-human animals other than humans, and examples of the non-human animals include mammals such as mice, rats, dogs, monkeys, rabbits, sheep, and horses.
  • Examples of prorenin receptors derived from various animals for example, information registered in existing databases can be referred to.
  • human-derived prorenin receptor is a cDNA, for example, the region 103-1155 (including the codon) in the following base sequence (SEQ ID NO: 5) registered under NCBI accession number NM_005765, as a protein
  • SEQ ID NO: 5 the following amino acid sequence registered under NCBI accession number NP_005756
  • the base sequence of SEQ ID NO: 5 is a sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the prorenin receptor can be used as a cancer marker. Specifically, for example, it can be used as a cancer marker for digestive organ cancer and brain tumor.
  • the gastrointestinal cancer include gastrointestinal cancer and gastrointestinal adenocarcinoma.
  • the gastrointestinal cancer include gastric cancer and colorectal cancer.
  • the brain tumor include glioma, astrocytoma, central nervous system primary malignant lymphoma, and supraspontaneous hemangioma.
  • the cancer marker of this invention becomes a cancer marker of peritoneal cancer, for example. Further, according to the present invention, for example, any of primary cancer and metastatic cancer can be tested.
  • the marker of the present invention may be, for example, a prorenin receptor protein or mRNA transcribed from a prorenin receptor gene.
  • test method for cancer risk includes a step of measuring the expression level of prorenin receptor in a biological sample of a subject.
  • the present invention is characterized by measuring the expression level of a prorenin receptor as a cancer marker, and other processes and conditions are not particularly limited.
  • the possibility of onset of cancer, the presence / absence of onset of cancer (whether or not it has become cancerous), the degree of progression of cancer, the state of prognosis, and the like can be evaluated.
  • target cancer include digestive organ cancer and brain tumor as described above.
  • Examples of the gastrointestinal cancer include gastrointestinal cancer and gastrointestinal cancer.
  • Examples of the gastrointestinal cancer include stomach cancer and colorectal cancer.
  • Examples of the gastrointestinal cancer include pancreas.
  • liver cancer examples of the brain tumor include glioma, astrocytoma, central nervous system primary malignant lymphoma, and supraspontaneous hemangioma.
  • cancer of peritoneal cancer can also be evaluated. Further, according to the present invention, for example, any of primary cancer and metastatic cancer can be tested.
  • examples of the subject include humans, non-human animals other than humans, etc.
  • the non-human animals include, for example, mice, rats, dogs, monkeys, rabbits as described above.
  • Mammals such as sheep and horses.
  • the kind of the biological sample is not particularly limited, and examples thereof include body fluids, body fluid-derived cells, organs, tissues or cells separated from the living body.
  • the body fluid include blood, and specific examples include whole blood, serum, and plasma.
  • the body fluid-derived cells include blood-derived cells, and specifically, blood cells such as blood cells, leukocytes, and lymphocytes.
  • the biological sample can be appropriately determined according to, for example, the type of cancer to be tested.
  • the biological sample is derived from, for example, an organ that can cause cancer to be tested.
  • the organ is, for example, the digestive organs such as the stomach, pancreas, large intestine, and liver, the brain, or the peritoneum.
  • the brain examples include cerebrum, temporal lobe, occipital lobe, cerebellum, basal ganglia, and mesenchymal tissue.
  • tissue or cells derived from the pancreas are preferable.
  • brain-derived tissue or cells are preferred.
  • cancer marker of the present invention for example, cancer in the digestive organs such as the pancreas and the brain such as the cerebrum can be tested by the expression level of the prorenin receptor in the blood.
  • the biological sample is preferably whole blood, serum, or plasma, more preferably serum or plasma.
  • Examples of the expression of the prorenin receptor to be measured include the expression of prorenin receptor gene mRNA and prorenin receptor protein.
  • For the expression for example, only one of the mRNA or the protein or both of the biological sample may be measured. These measuring methods are not particularly limited, and known methods can be employed.
  • Specific examples of the method for measuring mRNA expression include a gene amplification method using a reverse transcription reaction such as reverse transcription (RT) -PCR. Specifically, for example, cDNA is synthesized from mRNA by reverse transcription reaction, and gene amplification is performed using the cDNA as a template.
  • Examples of the method for measuring protein expression include an immunoantibody method, an ELISA method, a flow cytometry, and a Western blot method.
  • the test method of the present invention further includes, for example, comparing the expression level of the prorenin receptor in the biological sample of the subject (hereinafter also referred to as the test biological sample) with a reference value. Including the step of testing the risk of developing cancer.
  • the reference value is not particularly limited, and examples thereof include the expression level of prorenin receptor in healthy subjects, cancer patients, and cancer patients for each advanced stage. In the case of prognosis evaluation, the reference value may be, for example, the expression level of a prorenin receptor after treatment (for example, immediately after treatment) of the same subject.
  • the reference value can be obtained using, for example, a biological sample isolated from a healthy person and / or a cancer patient (hereinafter also referred to as a reference biological sample) as described above.
  • a reference biological sample isolated from the same subject after treatment may be used.
  • the reference value may be measured at the same time as the biological sample of the subject or may be measured in advance. The latter case is preferable because, for example, it is not necessary to obtain a reference value every time the subject biological sample of the subject is measured.
  • the subject biological sample and the reference biological sample of the subject are preferably collected, for example, under the same conditions, and the prorenin receptor is measured under the same conditions.
  • the method for evaluating the risk of cancer of a subject is not particularly limited, and can be determined as appropriate according to the type of the reference value.
  • the expression level of the prorenin receptor in the subject biological sample of the subject is significantly higher than the expression level of the prorenin receptor in the reference biological sample of the healthy subject, the reference biological body of the cancer patient
  • the expression level of the prorenin receptor in the sample is the same (when there is no significant difference), and / or when the expression level of the prorenin receptor is significantly higher than the expression level of the prorenin receptor in the reference biological sample of the cancer patient, It can be evaluated that there is a high risk or risk of getting cancer.
  • the expression level of the prorenin receptor in the subject biological sample of the subject is the same as the expression level of the prorenin receptor in the reference biological sample of the healthy person (when there is no significant difference), the reference of the healthy person If the expression level of prorenin receptor in the biological sample is significantly lower and / or significantly lower than the expression level of prorenin receptor in the reference biological sample of the cancer patient, the subject is It can be evaluated that there is no risk of suffering from or low risk. Further, in the comparison step, the expression level of the prorenin receptor in the subject biological sample of the subject is compared with the expression level of the prorenin receptor in the reference biological sample of the cancer patient for each progression stage, Can assess the degree of cancer progression. Specifically, when the test biological sample of the subject has, for example, the same level of expression as the reference biological sample of any progression stage (when there is no significant difference), the subject is: It can be evaluated that there is a possibility of the progress stage.
  • the evaluation may be made in the same manner as described above, and the expression level of the prorenin receptor in the reference biological sample after treatment of the same subject is used as the reference value. It can also be used and evaluated. As a specific example, when the expression level of the prorenin receptor in the subject biological sample is significantly higher than the reference value, the subject is at risk of recurrence or worsening after the treatment. Can be evaluated.
  • the subject biological sample of the subject when the expression level of the prorenin receptor in the subject biological sample of the subject is the same as the reference value (when there is no significant difference) and / or when the expression level is significantly lower than the reference value, the subject The examiner can evaluate that there is no risk of recurrence or low risk after the treatment.
  • a biological sample of the same subject may be collected over time, and the expression level of prorenin receptor in the biological sample may be compared.
  • the expression level increases with time, it is possible to determine that the possibility of morbidity has increased, and if the expression level decreases with time, the possibility of morbidity has decreased. Judgment such as having healed is possible.
  • the test reagent of the present invention is a test reagent used in the method for testing the risk of morbidity of cancer of the present invention, and includes a prorenin receptor expression measurement reagent.
  • the cancer morbidity risk test method of the present invention can be easily performed.
  • the present invention is characterized in that a cancer risk test is performed based on the measurement of prorenin receptor expression, as long as the expression of the prorenin receptor can be measured, and the type of the expression measurement reagent is particularly limited.
  • the prorenin receptor expression measurement reagent may be, for example, a prorenin receptor protein expression measurement reagent or a prorenin receptor gene mRNA expression measurement reagent.
  • the former includes, for example, a binding substance that binds to a prorenin receptor protein, and a specific example includes an antibody.
  • the test reagent of the present invention further includes, for example, a detection substance that detects the binding between the prorenin receptor protein and the antibody.
  • the detection substance include a combination of a labeled antibody that can be detected against the antibody and a substrate for the label.
  • the latter includes, for example, a reagent that amplifies the mRNA of the prorenin receptor gene by reverse transcription, and a specific example is a primer.
  • the primer can be appropriately designed based on, for example, the gene sequence of the prorenin receptor.
  • the cancer diagnosis method of the present invention includes a step of measuring the expression level of a prorenin receptor in a biological sample of a subject.
  • the cancer diagnostic reagent of the present invention includes a reagent for measuring expression of prorenin receptor.
  • description of the test method and test reagent of the said invention can be used for this invention.
  • the cancer target of the present invention is a prorenin receptor.
  • the present invention uses a prorenin receptor as the cancer target, for example, suppressing the expression of prorenin receptor gene mRNA or prorenin receptor protein, or inhibiting or neutralizing the function of prorenin receptor protein, etc. Can treat cancer.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention contains at least one of a binding substance that binds to a prorenin receptor and an expression inhibitor that suppresses expression of the prorenin receptor.
  • the treatment method of the present invention is a cancer treatment method, comprising the step of administering the cancer treatment agent of the present invention to a patient.
  • the present invention is characterized in that cancer is treated by binding of a binding substance to a prorenin receptor protein or suppression of expression of the prorenin receptor, and the types of the binding substance and the expression suppression substance are not particularly limited.
  • the binding substance and the expression suppressing substance may be used, or both may be used in combination.
  • binding substance examples include low molecular weight compounds, peptides, proteins, nucleic acids and the like, and are preferably antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the binding substance is preferably an antagonist.
  • the antibody is not particularly limited, and can be obtained by a general antibody production method.
  • an antibody against a prorenin receptor protein can be obtained by immunizing an animal using a prorenin receptor protein or a fragment thereof as an antigen and then collecting serum from the immunized animal.
  • the antibody may be, for example, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antigen may be, for example, the full-length amino acid sequence of a prorenin receptor or a partial sequence as described above.
  • the partial sequence include the 200-213th amino acid region (HKHLAKDHSPDLYS: SEQ ID NO: 7) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the human prorenin receptor protein.
  • the binding position of the prorenin receptor protein and the antibody against the prorenin receptor protein is not particularly limited.
  • the binding position is, for example, the 200-213th amino acid region (HKHLAKDHSPDLYS: sequence) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the human prorenin receptor protein. No. 7).
  • the expression suppressing substance examples include a substance that suppresses the transcription of mRNA from the prorenin receptor gene, a substance that cleaves the transcribed mRNA, and a substance that suppresses the translation of the protein from the mRNA.
  • Specific examples include, for example, RNA interference agents such as siRNA, antisense, and ribozyme. Any one kind may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • the administration conditions of the cancer therapeutic agent of the present invention are not particularly limited. For example, depending on the type of cancer disease to be treated, the degree of progression, the age of the patient, etc., the dosage form, administration timing, dosage, etc. are appropriately determined. Can be set. Examples of administration subjects include humans, non-human animals other than humans, and the like. Examples of the non-human animals include mammals such as mice, rats, dogs, monkeys, rabbits, sheep, and horses as described above. It is done.
  • the screening method of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic drug candidate substance, wherein a binding substance that binds to a prorenin receptor or an expression inhibitor that suppresses expression of the prorenin receptor is used for the treatment from a test substance. It is selected as a candidate substance.
  • the present invention is characterized in that the target of a cancer therapeutic drug candidate substance is a prorenin receptor, and other processes and conditions are not particularly limited.
  • binding substance examples include low molecular weight compounds, peptides, proteins, nucleic acids and the like, and are preferably antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the expression suppressing substance examples include a substance that suppresses the transcription of mRNA from the prorenin receptor gene, a substance that cleaves the transcribed mRNA, and a substance that suppresses the translation of the protein from the mRNA.
  • Specific examples include RNA interference agents such as siRNA, antisense, and ribozyme.
  • the step of bringing the test substance into contact with a prorenin receptor for example, the step of bringing the test substance into contact with a prorenin receptor, the process of detecting the binding between the prorenin receptor and the test substance, and the binding to the prorenin receptor Selecting the test substance as the therapeutic drug candidate substance.
  • the method for detecting the binding between the prorenin receptor and the test substance is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of the test substance.
  • the expression to be detected may be, for example, expression of prorenin receptor protein or transcription of mRNA of a prorenin receptor gene.
  • the method for detecting protein expression and mRNA expression is not particularly limited, and known methods can be applied.
  • Example 1 An increase in the concentration of prorenin receptor in the plasma of patients with pancreatic cancer was confirmed.
  • prorenin receptor in plasma was performed according to the protocol using Human soluble (Pro) renin Receptor Assay Kit (Immuno-Biological Laboratories, Inc.).
  • test sample 100 ⁇ L of the test sample was added to a plate to which a capture antibody (anti-Human renin receptor polyclonal rabbit IgG antibody) was bound, and reacted at 4 ° C. overnight. The test sample was removed, and the plate was washed 4 times with the phosphate buffer. Next, 100 ⁇ L of labeled antibody (HRP-labeled anti-Human renin receptor polyclonal mouse IgG antibody) was added to the plate and reacted at 4 ° C. for 60 minutes. The labeled antibody was removed and the plate was washed 5 times with the phosphate buffer.
  • a capture antibody anti-Human renin receptor polyclonal rabbit IgG antibody
  • pancreatic cancer patients with primary metastasis and no metastasis no metastasis
  • FIGS. 1 (A) and (B) are graphs showing the concentration of prorenin receptor in plasma. 1A and 1B, the horizontal axis indicates the type of the test sample, and the vertical axis indicates the concentration of prorenin receptor.
  • PDAC pancreatic cancer
  • FIG. 1 (B) both male and female patients with pancreatic cancer (PDAC) had a significantly increased plasma prorenin receptor concentration compared to normal subjects (Normal).
  • FIG. 1 (B) both the patient without pancreatic cancer metastasis and the patient with pancreatic cancer metastasis have a significant prorenin receptor concentration in plasma compared to healthy subjects. Rose to.
  • PK-1 A 40% confluent human pancreatic cancer cell line PK-1 was cultured in a serum-free medium on a dish at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours.
  • siRNA P
  • RR Life Technologies
  • TM Lipofectamine
  • TM RNAiMAX
  • PK-1 was peeled from the dish using a phosphate buffer (Life Technologies) containing 0.25% trypsin and 1 mmol / L EDTA, and fresh serum-free medium was added. Then, the pellet containing PK-1 was recovered from the medium containing PK-1 by centrifugation. The pellet was suspended in 1 mL of phosphate buffer, and this suspension and 20 ⁇ L of trypan blue solution were mixed and then injected into a hemocytometer to calculate the number of cells per mL. The seeds were seeded so that the number of viable cells was 5 ⁇ 10 5 cells / 10 cm diameter, and human Wnt3a (R & D Systems) for inducing cell proliferation was added at 150 ng / mL. After culturing for 0, 24, 48, and 72 hours, PK-1 was recovered and the number of viable cells was calculated in the same manner. As a control, culture and measurement of the number of viable cells were performed in the same manner except that no siRNA treatment was performed.
  • siRNA (P) RR Sense strand (SEQ ID NO: 8) 5'-UAUAGGGACUUGCUGGGUUCUUCGC-3 ' Antisense strand (SEQ ID NO: 9) 5'-GCGAAGAACCCAGCAAGUCCCUAUA-3 '
  • FIG. 2 is a graph showing the number of cells of the pancreatic cancer cell line when the expression of prorenin receptor is suppressed by RNAi.
  • the control ( ⁇ ) is a control group not treated with siRNA
  • the scramble ( ⁇ ) is a scrambled group treated with scrambled siRNA
  • the siRNA (P) RR ( ⁇ ) is siRNA treated with siRNA (P) RR.
  • P) RR group results.
  • the horizontal axis in FIG. 2 represents the time of stimulation with Wnt3a, and the vertical axis represents the number of cells.
  • the control group and the scramble group showed equivalent cell growth at each treatment time.
  • siRNA (P) RR group cell growth of the pancreatic cancer cell line was suppressed at any of the treatment times compared to both groups. Furthermore, the control group and the scramble group continued to grow up to 72 hours, whereas the siRNA (P) RR group had a decrease in cell number at the peak of 48 hours. From this result, it was found that by suppressing the expression of the prorenin receptor, the growth of the pancreatic cancer cell line can be suppressed, that is, the prorenin receptor is a target for pancreatic cancer.
  • Example 3 Increased expression of prorenin receptor protein and mRNA in metastatic cancer tissues was confirmed.
  • test sample total protein amount 20 ⁇ g
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the membrane after the transfer was blocked using a Blocking buffer (Li-Cor BioSciences).
  • the membrane after blocking was reacted with a 1000-fold diluted anti-rabbit (P) RR polyclonal antibody for 1 hour at room temperature, followed by 2000-fold diluted IRDye (registered trademark) -labeled anti-rabbit IgG antibody (Li-Cor BioSciences). And reacted under the same conditions.
  • P anti-rabbit
  • IRDye registered trademark
  • the expression level of prorenin receptor protein in the test sample was measured using Odyssey (registered trademark) System (Li-Cor BioSciences). Assuming that the expression level of normal liver tissue as a control was 1, the relative expression level of liver and peritoneal metastatic cancer tissues was determined.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of prorenin receptor protein in each tissue.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of the prorenin receptor protein.
  • the expression of prorenin receptor protein in liver and peritoneal metastatic cancer tissues was significantly higher than that in normal liver tissues. From these results, it was found that there is a correlation between metastatic cancer tissue and increased expression of prorenin receptor protein, that is, prorenin receptor protein is a marker for metastatic cancer.
  • RNA of prorenin receptor gene The normal liver tissue (control), metastatic cancer tissue of liver and metastatic cancer tissue of peritoneum collected in the above (1) were used. 1 mL of ISOGEN (Nippon Gene) was added to 2 g of each tissue and homogenized at 4,000 rpm for 5 minutes to prepare a test sample. After adding ethanol to the test sample to precipitate RNA, the RNA was dissolved in RNase free water to prepare an RNA solution. The concentration and OD 260 / OD 280 (purity) of the RNA solution were measured with a spectrophotometer. The RNA solution having an RNA concentration of 300 ng / ⁇ L and a purity of 1.8 or more was used for the following quantitative real-time (qRT) -PCR.
  • ISOGEN Natural Gene
  • cDNA was synthesized from the RNA solution by a conventional method, and then RNA was degraded using RNaseH.
  • RNA was degraded using RNaseH.
  • SYBR registered trademark
  • Green Applied Biosystems
  • Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems
  • the mRNA expression level of the prorenin receptor gene and the ⁇ -actin gene mRNA expression level as an internal standard were measured.
  • the mRNA expression level of the prorenin receptor gene was calculated as a ratio to the mRNA expression level of the ⁇ -actin gene.
  • the following primer sets were used for amplification of the prorenin receptor gene and the ⁇ -actin gene, respectively.
  • Primer set for amplification of prorenin receptor gene (SEQ ID NO: 1) 5'-GGCGTTGGTGGCGGGTGTTT-3 ' (SEQ ID NO: 2) 5'-AGCCCATGGACAATGCAGCCAC-3 ' Primer set for ⁇ -actin gene amplification (SEQ ID NO: 3) 5'-CACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3 ' (SEQ ID NO: 4) 5'-ACGAGCGCGGCGATATCATCATC-3 '
  • FIG. 4 shows the result of the expression level of prorenin receptor gene mRNA in each tissue.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of the mRNA of the prorenin receptor gene relative to the mRNA of the ⁇ -actin gene.
  • the expression of prorenin receptor gene mRNA in the metastatic cancer tissues of the liver and peritoneum was higher than that in normal liver tissues. From these results, it was found that there is a correlation between metastatic cancer tissue and increased expression of prorenin receptor gene mRNA, that is, prorenin receptor gene mRNA is a marker of metastatic cancer.
  • Example 4 Increased expression of prorenin receptor protein and mRNA in gastric cancer tissues was confirmed.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression level of prorenin receptor protein.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of the prorenin receptor protein.
  • FIG. 6 shows the results of the expression level of prorenin receptor gene mRNA in stomach cancer tissue.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of the mRNA of the prorenin receptor gene relative to the mRNA of the ⁇ -actin gene.
  • Example 5 Increased expression of prorenin receptor protein and mRNA in colorectal cancer tissues was confirmed.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression level of prorenin receptor protein.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of the prorenin receptor protein.
  • prorenin receptor gene mRNA Expression of prorenin receptor gene mRNA
  • the expression level of prorenin receptor gene mRNA was determined in the same manner as in Example 3 (2). It was measured. And the average of the expression level was calculated
  • FIG. 8 shows the results of the expression level of prorenin receptor gene mRNA in colorectal cancer tissues.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the relative expression level of the mRNA of the prorenin receptor gene relative to the mRNA of the ⁇ -actin gene.
  • Pancreatic duct epithelial tissues including normal epithelial tissues of pancreatic ducts, pancreatic cancer tissues and precancerous lesion sites were collected from 22 patients with pancreatic cancer.
  • paraffin sections were prepared and deparaffinized using 100% xylene and 99.5% ethanol.
  • endogenous peroxidase was inactivated using 100% ethanol and 30% hydrogen peroxide water.
  • the section area of the test sample was surrounded with a liquid blocker (water repellent material), and then washed with phosphate buffered saline (PBS). Subsequently, the test sample was blocked with 10% goat normal serum (trade name: Histofin SAB-PO (R) kit, Nichirei Bioscience) for 15 minutes at room temperature.
  • test sample was reacted with a 4000-fold diluted anti-rabbit (P) RR polyclonal antibody at room temperature for 1 hour and washed with the PBS.
  • P diluted anti-rabbit
  • test sample was reacted with Histfine Simple Stain MAX-PRO (MULTI) (Nichirei Bioscience), an HRP-labeled secondary antibody, for 30 minutes at room temperature.
  • MULTI Histfine Simple Stain MAX-PRO
  • DAB 3,3'-diaminebenzoline
  • the test sample was washed with running water and stained with hematoxylin and eosin (HE).
  • test sample after the staining was washed with running water, dehydrated with 99.5% ethanol and 100% xylene, and fixed.
  • the fixed test sample was encapsulated with marinol, and the expression region of the prorenin receptor stained brown with DAB was observed using an optical microscope.
  • FIG. 9 is a tissue staining diagram showing the expression of prorenin receptor protein in pancreatic tissue.
  • A is a stained view of pancreatic cancer tissue
  • B is a stained view of normal epithelial tissue of the pancreatic duct
  • C includes PanIN-2, which is PanIN in the middle stage. It is a dyeing
  • D is a dyeing
  • the scale bar in (A) to (D) is 100 ⁇ m, and the stained region is shown surrounded by a solid line (for example, regions of arrows X, Y, and Z).
  • FIG. 9 shows a stained view of a tissue derived from one pancreatic cancer patient.
  • pancreatic cancer tissue and PanIN also show the prorenin receptor protein. Expression was rising. From these results, there is a correlation between the formation of PanIN and the onset of pancreatic cancer and the increased expression of prorenin receptor protein, that is, prorenin receptor protein in pancreatic tissue has a high possibility of developing pancreatic cancer. And a marker for pancreatic cancer.
  • Example 7 A human pancreatic cancer cell line treated with siRNA (P) RR was transplanted into nude mice, and the suppression of the growth of the pancreatic cancer cell line in nude mice and a decrease in the expression level of soluble prorenin receptor protein in plasma were confirmed. did.
  • the volume of the cancer was calculated from the following formula. As a control, the volume of cancer was measured in the same manner except that PANC-1 (scrambled group) into which scrambled siRNA was introduced was used instead of siRNA (P) RR.
  • PANC-1 scrambled group
  • P siRNA
  • FIG. 10 shows the volume of the cancer
  • FIG. 11 shows a photograph of the mouse 25 days after the transplantation
  • (A) is a graph showing the volume of the cancer 25 days after the transplantation
  • (B) is a graph showing the volume of the cancer 40 days after the transplantation.
  • 10 (A) and 10 (B) the horizontal axis represents treated siRNA, and the vertical axis represents cancer volume.
  • the volume of cancer derived from the siRNA (P) RR group was significantly higher than the volume of cancer derived from the scrambled group. Declined.
  • FIG. 11A is a photograph of the mouse 25 days after transplantation in the scramble group
  • FIG. 11B is a photograph of the mouse 25 days after transplantation in the si (P) RR group.
  • T the region surrounded by the solid line
  • P siRNA
  • FIG. 12 is a graph showing the relative value of the expression level of prorenin receptor in the plasma 25 days after transplantation.
  • the horizontal axis represents the treated siRNA
  • the vertical axis represents the relative expression level of the prorenin receptor.
  • the relative expression level of the plasma prorenin receptor in the nude mice transplanted with the siRNA (P) RR group is the relative expression level of the prorenin receptor in the plasma of the nude mice transplanted with the scramble group. There was a significant decrease with respect to the amount. From these results, it was found that the expression level of prorenin receptor in plasma can be suppressed by suppressing the expression of cancer prorenin receptor in vivo.
  • Example 8 It was confirmed that cancer growth can be suppressed by administering an anti-prorenin receptor antibody to nude mice transplanted with pancreatic cancer.
  • KLH mussel hemocyanin
  • 150-200 ⁇ g of the antigen protein was immunized at several dozen locations in the rabbit skin 7-10 times every 2 weeks (600-800 ⁇ g / kg body weight). The immunization was first performed using the antigen protein mixed with complete adjuvant, and the second and subsequent times were performed using the antigen protein mixed with incomplete adjuvant.
  • the concentration of the polyclonal anti-human prorenin receptor antibody (clone name: PRR1) in the antiserum was 0.6 ⁇ g / ⁇ L.
  • the homology (alignment score between different species) between the entire amino acid sequence of the human prorenin receptor protein used for the antigen protein and the entire amino acid sequence of the mouse prorenin receptor protein (SEQ ID NO: 10) was 92.29%. there were. From this, it can be said that the human prorenin receptor antibody contained in the antiserum also binds to the mouse prorenin receptor.
  • Mouse prorenin receptor protein (SEQ ID NO: 10) MAVLVVLLFFLVAGALGNEFSILRSPGSVVFRNGNWPIPGDRIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATIMVMVKGVDKLALPAGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRNRLFQENSLLNSLPLNSLSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDELGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLVRKSRTILEAKQENTQSPYNLAYKYNLEYSVVFNLVLWIMIGLALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRID
  • the volume of PK-1 or PANC-1 derived cancer in the upper right flank was measured in the same manner as in Example 7.
  • the volume of cancer was measured in the same manner except that human IgG1 antibody (manufactured by WAKO) was administered in place of the anti-prorenin receptor antibody so as to give 1 mg / kg body weight of the mouse.
  • FIG. 13 (A) is a graph showing the volume of the cancer when transplanted with PK-1
  • (B) is a graph showing the volume of the cancer when transplanted with PANC-1.
  • the horizontal axis shows the number of days after transplantation
  • the vertical axis shows the volume of cancer
  • the black bars in the figure show the anti-prorenin receptor administration group
  • Open bars indicate human IgG1 antibody administration groups.
  • FIGS. 13 (A) and (B) in the nude mice transplanted with either PK-1 or PANC-1, anti-prorenin reception was observed on days 15, 18, 21, 24, and 27 after the transplantation.
  • the volume of cancer in the body administration group decreased with respect to the volume of cancer in the human IgG1 antibody administration group. From these results, it was found that cancer growth in vivo can be suppressed by using an anti-prorenin receptor antibody.
  • Example 9 The expression of prorenin receptor protein in human pancreatic duct epithelial cell line and human pancreatic cancer cell line and the expression of prorenin receptor protein in the culture supernatant of these cell lines were confirmed.
  • HPDE was used as a human pancreatic duct epithelial cell line, and PK-8, PCI-35, BxPC-3, PK-1, PANC-1 and MIAPaCa-2 were used as human pancreatic cancer cell lines.
  • the cell line was cultured in serum-free medium for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium RPMI-1640 (manufactured by Sigma) was used. After the culture, the culture supernatant was collected. Next, 1 mL of the culture supernatant was concentrated using Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane (Millipore) to obtain a concentrated solution containing 20 ⁇ g of total protein. The concentrated solution was used as a culture supernatant sample.
  • the cell line after the culture supernatant was collected was lysed with a lysis buffer.
  • the cell lysate was centrifuged at 12,500 rpm for 10 minutes, and the supernatant was obtained to obtain a cell lysis sample.
  • the expression of prorenin receptor protein and ⁇ -actin protein in the culture supernatant sample and the cell lysis sample was confirmed in the same manner as in Example 3 (1).
  • FIG. 14 (A) is a photograph of a Western blot showing the expression of prorenin receptor protein in the cell lysis sample of the cell line
  • (B) is the prorenin receptor in the culture supernatant sample of the cell line. It is the photograph of the western blot which shows expression of a body protein.
  • the upper side of the photograph shows the cell line
  • the left side of the photograph shows the detected protein.
  • FIG. 14 (A) the expression of prorenin receptor protein was confirmed in the cell lysis samples of any of the cell lines.
  • FIG. 14 (A) the expression of prorenin receptor protein was confirmed in the cell lysis samples of any of the cell lines.
  • prorenin receptor protein was confirmed in the culture supernatant samples of any of the cell lines. From these results, it was confirmed that the prorenin receptor protein was expressed in the human pancreatic duct epithelial cell line, the human pancreatic cancer cell line, and the culture supernatant of these cell lines.
  • siRNA (P) RR was introduced into PK-1 (siRNA (P) RR group). After the introduction, recombinant human Wnt3a was added to 150 ng / mL. Ten minutes after the addition, PK-1 was recovered and dissolved with Lysis Buffer to prepare a test sample. Next, the expression of prorenin receptor protein and ⁇ -actin protein was confirmed in the same manner as in Example 3 (1).
  • an anti-phosphorylated LRP6 antibody (Ser 1490, Cell Signaling Technology) or an anti-LRP6 antibody (clone name: C47E12, Cell Signaling Technology) is used.
  • the expression level of phosphorylated LRP6 protein or LRP6 protein was measured in the same manner as in Example 3 (1) except that it was used.
  • the negative control was the same except that no siRNA was introduced and Wnt3a was not added, the control 1 was the same except that no siRNA was introduced, and the control 2 was replaced with siRNA (P) RR.
  • the expression levels of phosphorylated LRP6 protein and LRP6 protein were measured in the same manner except that scrambled siRNA was introduced.
  • the ratio of the expression level of phosphorylated LRP6 protein to the expression level of LRP6 protein was determined for each sample. And the relative value of the phosphorylated LRP6 expression level ratio in each sample was calculated by setting the phosphorylated LRP6 expression level ratio in the negative control to 1.
  • FIG. 15 shows the expression of prorenin receptor protein and ⁇ -actin protein
  • FIG. 16 shows the relative value of the phosphorylated LRP6 expression level ratio.
  • FIG. 15 is a photograph of a Western blot showing the expression of prorenin receptor protein and ⁇ -actin protein.
  • the lower side of the photograph shows the presence or absence of the treated siRNA and Wnt3a stimulation
  • the left side of the photograph shows the detected protein.
  • the siRNA (P) RR group the expression of prorenin receptor protein was decreased compared to the negative control, control 1 and 2.
  • FIG. 16 is a graph showing the relative value of the phosphorylated LRP6 expression level ratio.
  • the horizontal axis indicates the presence or absence of the treated siRNA and Wnt3a stimulation
  • the vertical axis indicates the relative value of the phosphorylated LRP6 expression level ratio.
  • the relative value of the phosphorylated LRP6 expression level ratio after Wnt3a stimulation decreased with respect to the negative control and the controls 1 and 2. From these results, it was confirmed that the Wnt signal was suppressed by suppressing the expression of the prorenin receptor protein.
  • Example 3 Except for using anti-active ⁇ -catenin antibody (anti-ABC, manufactured by Millipore) or anti-Cyclin D1 antibody instead of anti-prorenin receptor antibody
  • the expression levels of active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein were determined.
  • the negative control was replaced with siRNA (P) RR, but introduced with scrambled siRNA, and Wnt3a was not added.
  • the control was similarly performed except that scrambled siRNA was introduced instead of siRNA (P) RR.
  • the expression levels of active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein were determined. Then, assuming that the expression levels of active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein in the negative control were 1, relative values of the expression levels of active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein in each sample were determined.
  • FIGS. 17 (A)-(C) are graphs showing the relative expression levels of active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein, and (A) is the result using PK-1.
  • (B) shows the results using BxPC-3, and (C) shows the results using PANC-1.
  • 17 (A)-(C) the horizontal axis indicates the presence or absence of treated siRNA and Wnt3a stimulation, the vertical axis indicates the relative expression level, and the black bars in the figure indicate active ⁇ -catenin. The relative expression level of the protein is shown, and the open bar indicates the relative expression level of the Cyclin D1 protein.
  • the siRNA (P) RR group significantly decreased the relative expression levels of active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein relative to the control, and negative control and The relative expression level was similar or less than the negative control.
  • Active ⁇ -catenin protein and Cyclin D1 protein are proteins induced by a Wnt signal. For this reason, it was confirmed from these results that the Wnt signal is suppressed by suppressing the expression of the prorenin receptor protein.
  • PK-1 was seeded in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well.
  • siRNA (P) RR was introduced into PK-1 in the same manner as in Example 2 (siRNA (P) RR group).
  • recombinant human Wnt3a was added at 150 ng / mL and cultured for 48 hours.
  • 100 ⁇ L of water-soluble tetrazolium salt (WST-1) reagent was further added to each well and incubated for 2 hours. And about each well, the light absorbency in 450 nm was measured using the plate reader, and the growth ability was measured.
  • WST-1 water-soluble tetrazolium salt
  • the negative control was the same except that no siRNA was introduced and Wnt3a was not added, the control 1 was the same except that no siRNA was introduced, and the control 2 was replaced with siRNA (P) RR.
  • the proliferation ability was measured in the same manner except that scrambled siRNA was introduced.
  • FIG. 18 are graphs showing relative values of proliferation ability, (A) is the result using PK-1, and (B) is using BxPC-3. This is a result, and (C) is a result using PANC-1.
  • 18A to 18C the horizontal axis indicates the presence or absence of treated siRNA and Wnt3a stimulation, and the vertical axis indicates the relative proliferation ability.
  • the siRNA (P) RR group showed a lower relative growth ability than the negative control, control 1 and 2 did. From these results, it was confirmed that the growth of the human pancreatic cancer cell line was suppressed by suppressing the expression of the prorenin receptor protein.
  • Example 12 It was confirmed that apoptosis was induced by suppressing the expression of prorenin receptor.
  • siRNA (P) RR was introduced into PK-1 (siRNA (P) RR group). After the introduction, recombinant human Wnt3a was added at 150 ng / mL and cultured for 48 hours. Next, the cultured PK-1 was collected by centrifugation, suspended in 0.5 mL of ice-cold 70% ethanol, and stored at ⁇ 20 ° C. for 24 hours. The PK-1 after storage was washed with PBS, suspended in PBS containing 10 mg / mL RNase A (manufactured by Macherey-Nagel), and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Then, staining was performed at 37 ° C. for 30 minutes using PBS containing 1 mg / mL PI (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • the stained PK-1 was washed with PBS, suspended again in PBS, and forward-scattered light (FS), side-scattered light (SS) and DNA were contained using a DNA flow cytometer (manufactured by Beckman Coulter). The amount was measured. Moreover, the ratio of cells in each cell cycle was calculated based on the DNA content. In the same manner except that scrambled siRNA was introduced instead of siRNA (P) RR, the control was performed to measure the forward scattered light (FS), side scattered light (SS), and DNA content, and the cells in each cell cycle The percentage of was calculated. Similarly, the proportion of cells in each cell cycle was calculated for PANC-1.
  • FS forward-scattered light
  • SS side-scattered light
  • DNA DNA flow cytometer
  • FIG. 19 shows a dot plot of FS and SS
  • FIG. 20 shows a histogram of DNA content
  • FIG. 21 shows a graph of the ratio of cells in each cell cycle.
  • FIG. 19 is a dot plot showing the percentage of apoptotic cells.
  • the horizontal axis indicates SS
  • the vertical axis indicates FS
  • the numbers in the figure indicate the proportion of apoptotic cells.
  • the siRNA (P) RR group the proportion of cells occupying the upper right fraction of the quadrant dot plot showing apoptotic cells increased with respect to the control.
  • FIG. 20 is a histogram showing the DNA content.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of PI
  • the vertical axis indicates the number of counts
  • the black histogram in the figure indicates the siRNA (P) RR group
  • the white histogram indicates the control.
  • apoptotic cells having a reduced DNA content indicated by arrows in the figure were observed. In contrast, apoptotic cells were not observed in the control.
  • FIGS. 21A and 21B are graphs showing the ratio of cells in each cell cycle.
  • (A) shows the results using PK-1
  • (B) shows the results using PANC-1.
  • the horizontal axis represents the treated siRNA
  • the vertical axis represents the proportion of cells in each cell cycle.
  • FIGS. 22 (A)-(C) are graphs showing the activity of caspase 3, (A) is the result using PK-1, and (B) is the result using BxPC-3. (C) is the result using PANC-1. 22 (A)-(C), the horizontal axis represents the treated siRNA, and the vertical axis represents the activity of caspase-3. As shown in FIGS. 22 (A)-(C), in any human pancreatic cancer cell line, the activity of caspase 3 that induces apoptosis was higher in the siRNA (P) RR group than in the control. From these results, it was confirmed that caspase 3 that induces apoptosis is activated by suppressing the expression of prorenin receptor protein.
  • Example 13 An increase in the concentration of prorenin receptor in the plasma of brain tumor patients was confirmed.
  • FIG. 23 is a graph showing the concentration of prorenin receptor in plasma.
  • the horizontal axis indicates the type of test sample, and the vertical axis indicates the concentration of prorenin receptor.
  • brain tumor patients (Brain tumor) significantly increased the plasma prorenin receptor concentration compared to healthy individuals (Normal). From these results, it was found that there was a correlation between the onset of brain tumor and the increase in plasma prorenin receptor concentration regardless of gender, and that prorenin receptor in plasma was a marker for brain tumor.
  • the risk of developing cancer can be tested by measuring the expression level of the prorenin receptor.
  • prorenin receptor becomes a cancer target
  • a candidate substance for cancer treatment targeting the prorenin receptor can be obtained.
  • the cancer marker of the present invention is a very useful marker in the clinical field and biochemical field.

Abstract

　がんの罹患危険度を試験するための新たながんマーカーを提供する。　本発明のがんマーカーは、プロレニン受容体である。本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現を測定する方法であり、例えば、さらに、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含む。前記基準値は、健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量またはがん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量であり、前記被検者の発現量が、前記健常者の発現量よりも高い場合、前記がん患者の発現量と同じ場合、前記がん患者の発現量よりも高い場合、前記被検者は、がんに罹患する危険性があると評価できる。

Description

がんマーカーおよびその用途
　本発明は、がんマーカー、それを用いたがんの罹患危険度の試験方法、および試験試薬に関し、さらに、がん治療薬およびそのスクリーニング方法に関する。
　近年、がんは、日本人の死因のトップであり、他の国においても、死因の上位を占めるに致っている。がんの発生および進展には、遺伝的要因、環境的要因等の様々な因子が関連しているが、決定的な診断方法および治療法は、未だ確立されていない。
　がんの中でも、例えば、膵臓がんは、進行が早いため早期発見が難しく、発見時には、周囲のリンパ節および臓器等に転移していることが多い。このように、治療の段階において、がんが進行しているため、例えば、治療が困難であり、外科的手術を行った場合でも予後が悪いとの問題もある。このため、膵臓がんをはじめとする各種がんについて、早期発見を可能とするためのがんマーカーの開発が望まれている（非特許文献１および２）。
Ｄｕｆｆｙ　ＭＪ、他７名、「Ｔｕｍｏｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃａｎｃｅｒ：　ａ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｇｒｏｕｐ　ｏｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｍａｒｋｅｒｓ　（ＥＧＴＭ）　ｓｔａｔｕｓ　ｒｅｐｏｒｔ」、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１０年３月、第２１巻、第３号、ｐ．４４１－４４７ 渡邊　弘之、他３名、「特集　膵癌の診断と治療．膵癌の早期診断は可能か？　腫瘍マーカー」　外科治療、株式会社　永井書店、２００７年９月、第９７巻、ｐ．２５０－２５７
　そこで、本発明は、がんの罹患危険度を試験するための新たながんマーカーの提供を目的とする。
　本発明のがんマーカーは、プロレニン受容体であることを特徴とする。
　本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の試験試薬は、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。
　本発明のがん治療薬は、プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明のがんの治療方法は、前記本発明のがん治療薬を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。
　本発明のスクリーニング方法は、がんの治療用候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とする。
　本発明者は、鋭意研究の結果、生体におけるプロレニン受容体の発現が、がんの発症と相関を示すことを見出し、本発明を確立するに至った。本発明によれば、プロレニン受容体の発現量を測定することによって、被検者のがんの罹患危険度を試験できる。また、本発明において、プロレニン受容体は、がんのターゲットとなることから、前記ターゲットを用いたスクリーニングにより、がんの治療用候補物質を得ることもできる。このため、本発明は、臨床分野および生化学分野において極めて有用である。
図１は、実施例１における血漿中のプロレニン受容体タンパク質の濃度を示すグラフである。 図２は、実施例２における経時的な細胞数の変化を示すグラフである。 図３は、実施例３におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。 図４は、実施例３におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。 図５は、実施例４におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。 図６は、実施例４におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。 図７は、実施例５におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。 図８は、実施例５におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。 図９は、実施例６におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示す組織染色図である。 図１０は、実施例７におけるがんの容積を示すグラフである。 図１１は、実施例７におけるマウスの写真である。 図１２は、実施例７におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。 図１３は、実施例８におけるがんの容積を示すグラフである。 図１４は、実施例９におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示す写真である。 図１５は、実施例１０におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示す写真である。 図１６は、実施例１０におけるリン酸化ＬＲＰタンパク質の発現を示すグラフである。 図１７は、実施例１０における活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｌｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現を示すグラフである。 図１８は、実施例１１における細胞の増殖能力を示すグラフである。 図１９は、実施例１２におけるアポトーシス細胞の割合を示すドットプロットである。 図２０は、実施例１２におけるアポトーシス細胞の割合を示すヒストグラムである。 図２１は、実施例１２における各細胞周期の細胞の割合を示すグラフである。 図２２は、実施例１２におけるカスパーゼ３の活性を示すグラフである。 図２３は、実施例１３における血漿中のプロレニン受容体タンパク質の濃度を示すグラフである。
（がんマーカー）
　本発明のがんマーカーは、前述のように、プロレニン受容体であることを特徴とする。本発明のがんマーカーによれば、例えば、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定することで、前記被検者のがんの罹患危険度を試験できる。
　プロレニン受容体の由来は、特に制限されず、例えば、被検者の種類によって適宜設定できる。前記由来は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。各種動物由来のプロレニン受容体は、例えば、既存のデータベースに登録されている情報を参照できる。具体例として、ヒト由来プロレニン受容体は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５７６５で登録されている下記の塩基配列（配列番号５）における１０３－１１５５番目の領域（終始コドン含む）、タンパク質として、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５７５６で登録されている下記のアミノ酸配列（配列番号６）があげられる。配列番号５の塩基配列は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列である。
ヒトプロレニン受容体ｃＤＮＡ（配列番号５）
ctggacgagtccgagcgcgtcacctcctcacgctgcggctgtcgcccgtgtcccgccggcccgttccgtgtcgccccgcagtgctgcggccgccgcggcaccatggctgtgtttgtcgtgctcctggcgttggtggcgggtgttttggggaacgagtttagtatattaaaatcaccagggtctgttgttttccgaaatggaaattggcctataccaggagagcggatcccagacgtggctgcattgtccatgggcttctctgtgaaagaagacctttcttggccaggactcgcagtgggtaacctgtttcatcgtcctcgggctaccgtcatggtgatggtgaagggagtgaacaaactggctctacccccaggcagtgtcatttcgtaccctttggagaatgcagttccttttagtcttgacagtgttgcaaattccattcactccttattttctgaggaaactcctgttgttttgcagttggctcccagtgaggaaagagtgtatatggtagggaaggcaaactcagtgtttgaagacctttcagtcaccttgcgccagctccgtaatcgcctgtttcaagaaaactctgttctcagttcactccccctcaattctctgagtaggaacaatgaagttgacctgctctttctttctgaactgcaagtgctacatgatatttcaagcttgctgtctcgtcataagcatctagccaaggatcattctcctgatttatattcactggagctggcaggtttggatgaaattgggaagcgttatggggaagactctgaacaattcagagatgcttctaagatccttgttgacgctctgcaaaagtttgcagatgacatgtacagtctttatggtgggaatgcagtggtagagttagtcactgtcaagtcatttgacacctccctcattaggaagacaaggactatccttgaggcaaaacaagcgaagaacccagcaagtccctataaccttgcatataagtataattttgaatattccgtggttttcaacatggtactttggataatgatcgccttggccttggctgtgattatcacctcttacaatatttggaacatggatcctggatatgatagcatcatttataggatgacaaaccagaagattcgaatggattgaatgttacctgtgccagaattagaaaagggggttggaaattggctgttttgttaaaatatatcttttagtgtgctttaaagtagatagtatactttacatttataaaaaaaaatcaaattttgttctttattttgtgtgtgcctgtgatgtttttctagagtgaattatagtattgacgtgaatcccactgtggtatagattccataatatgcttgaatattatgatatagccatttaataacattgatttcattctgtttaatgaatttggaaatatgcactgaaagaaatgtaaaacatttagaatagctcgtgttatggaaaaaagtgcactgaatttattagacaaacttacgaatgcttaacttctttacacagcataggtgaaaatcatatttgggctattgtatactatgaacaatttgtaaatgtcttaatttgatgtaaataactctgaaacaagagaaaaggtttttaacttagagtagccctaaaatatggatgtgcttatataatcgcttagttttggaactgtatctgagtaacagaggacagctgttttttaaccctcttctgcaagtttgttgacctacatgggctaatatggatactaaaaatactacattgatctaagaagaaactagccttgtggagtatatagatgcttttcattatacacacaaaaatccctgagggacattttgaggcatgaatataaaacatttttatttcagtaacttttccccctgtgtaagttactatggtttgtggtacaacttcattctatagaatattaagtggaagtgggtgaattctactttttatgttggagtggaccaatgtctatcaagagtgacaaataaagttaatgatgattccaaaaaaaaaa
ヒトプロレニン受容体タンパク質（配列番号６）
MAVFVVLLALVAGVLGNEFSILKSPGSVVFRNGNWPIPGERIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATVMVMVKGVNKLALPPGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRKRLFQENSVLSSLPLNSHSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDEIGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLIRKTRTILEAKQAKNPASPYNLAYKYNFEYSVVFNMVLWIMIALALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRMD
　前記プロレニン受容体は、がんマーカーとして使用でき、具体的には、例えば、消化器がんおよび脳腫瘍のがんマーカーとして使用できる。前記消化器がんは、例えば、消化管がんおよび消化腺がんがあげられ、前記消化管がんは、例えば、胃がんおよび大腸がん等があげられ、前記消化腺がんは、例えば、膵臓がんおよび肝臓がん等があげられる。前記脳腫瘍は、例えば、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫があげられる。本発明のがんマーカーは、この他に、例えば、腹膜がんのがんマーカーにもなる。また、本発明によれば、例えば、原発巣のがんおよび転移がんのいずれであっても試験できる。
　本発明のマーカーは、例えば、プロレニン受容体タンパク質でもよいし、プロレニン受容体遺伝子から転写されたｍＲＮＡでもよい。
（がんの罹患危険度の試験方法）
　本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、前述のように、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。
　本発明は、がんマーカーとして、プロレニン受容体の発現量を測定することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限がない。
　本発明の試験方法によれば、例えば、がんの発症の可能性、がんの発症の有無（がん化しているか否か）、がんの進行度および予後の状態等を評価できる。対象となるがんは、前述のように、例えば、消化器がんおよび脳腫瘍があげられる。前記消化器がんは、例えば、消化管がんおよび消化腺がんがあげられ、消化管がんは、例えば、胃がんおよび大腸がん等があげられ、消化腺がんは、例えば、膵臓がんおよび肝臓がんがあげられる。前記脳腫瘍は、例えば、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫があげられる。本発明の試験方法によれば、この他に、例えば、腹膜がんのがんも評価できる。また、本発明によれば、例えば、原発巣のがん、転移がんのいずれであっても試験できる。
　本発明の試験方法において、前記被検者は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、前述のように、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。
　本発明の試験方法において、前記生体試料の種類は、特に制限はされず、例えば、生体から分離した、体液、体液由来細胞、器官、組織または細胞等があげられる。前記体液は、例えば、血液があげられ、具体例として、例えば、全血、血清、血漿等があげられる。前記体液由来細胞は、例えば、血液由来細胞があげられ、具体的には、血球、白血球、リンパ球等の血球細胞があげられる。前記生体試料は、例えば、試験対象のがんの種類に応じて、適宜決定できる。前記生体試料は、例えば、試験対象のがんが発生しうる器官由来である。前記器官は、例えば、胃、膵臓、大腸、肝臓等の前記消化器、脳または、腹膜等である。前記脳は、例えば、大脳、側頭葉、後頭葉、小脳、大脳基底核および間葉組織等である。具体例として、前記試験対象が膵臓がんの場合、膵臓由来の組織または細胞が好ましい。前記試験対象が脳腫瘍の場合、脳由来の組織または細胞が好ましい。また、本発明のがんマーカーによれば、例えば、膵臓等の前記消化器および大脳等の前記脳におけるがんを、血液中のプロレニン受容体の発現量によって試験できる。このため、例えば、患者や医師の負担を軽減できることから、前記生体試料は、全血、血清、または血漿が好ましく、より好ましくは、血清または血漿である。
　測定対象であるプロレニン受容体の発現は、例えば、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡおよびプロレニン受容体タンパク質の発現があげられる。前記発現は、例えば、前記生体試料について、前記ｍＲＮＡまたは前記タンパク質のいずれか一方のみを測定してもよいし、両方を測定してもよい。これらの測定方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例として、前記ｍＲＮＡ発現の測定方法は、例えば、逆転写（Reverse　transcription：ＲＴ）－ＰＣＲ法等の逆転写反応を利用した遺伝子増幅法等があげられる。具体的には、例えば、ｍＲＮＡから逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、前記ｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅する方法である。また、前記タンパク質発現の測定方法は、例えば、免疫抗体法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロット法等があげられる。
　本発明の試験方法は、例えば、さらに、前記被検者の生体試料（以下、被検生体試料ともいう）におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含む。前記基準値は、特に制限されず、例えば、健常者、がん患者および進行ステージごとのがん患者のプロレニン受容体の発現量があげられる。予後の評価の場合、前記基準値は、例えば、同じ被検者の治療後（例えば、治療直後）のプロレニン受容体の発現量であってもよい。
　前記基準値は、例えば、前述のような、健常者および／またはがん患者から単離した生体試料（以下、基準生体試料ともいう）を用いて、得ることができる。また、予後の評価の場合、例えば、同じ被検者から治療後に単離した基準生体試料を用いてもよい。前記基準値は、例えば、前記被検者の被検生体試料と同時に測定してもよいし、予め測定してもよい。後者の場合、例えば、前記被検者の被検生体試料を測定する度に、基準値を得ることが不要となるため、好ましい。前記被検者の被検生体試料と前記基準生体試料は、例えば、同じ条件で採取し、同じ条件でプロレニン受容体の測定を行うことが好ましい。
　前記比較工程において、被検者のがんの罹患危険度の評価方法は、特に制限されず、前記基準値の種類によって適宜決定できる。具体例として、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に高い場合、前記がん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記がん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に高い場合、前記被検者は、がんに罹患する危険性があるまたは危険性が高いと評価できる。また、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合（有意差が無い場合）、前記健常者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に低い場合、および／または、前記がん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に低い場合、前記被検者は、がんに罹患する危険性が無いまたは危険性が低いと評価できる。また、前記比較工程において、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、前記進行ステージごとのがん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と比較することで、がんの進行度を評価できる。具体的には、前記被検者の被検生体試料が、例えば、いずれかの進行ステージの前記基準生体試料と同程度の発現量の場合（有意差がない場合）、前記被検者は、前記進行ステージの可能性があると評価できる。
　前記比較工程において、予後の状態を評価する場合、例えば、前述と同様に評価判断してもよいし、基準値として、同じ被検者の治療後の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を使用して評価することもできる。具体例として、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記基準値よりも有意に高い場合、前記被検者は、前記治療後、再発または悪化の危険性があると評価できる。また、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記基準値と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記基準値よりも有意に低い場合、前記被検者は、前記治療後、再発の危険性が無いもしくは危険性が低いと評価できる。
　本発明においては、例えば、同じ被検者の生体試料を経時的に採取し、前記生体試料におけるプロレニン受容体発現量を比較してもよい。これによって、例えば、経時的に発現量が増加すれば、罹患の可能性が高くなった等の判断が可能であり、経時的に発現量が低下すれば、罹患の可能性が低くなったまたは治癒してきた等の判断が可能である。
（試験試薬）
　本発明の試験試薬は、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。本発明の試験試薬によれば、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法を簡便に行える。本発明は、がんの罹患危険度の試験をプロレニン受容体の発現の測定に基づいて行うことが特徴であり、プロレニン受容体の発現が測定できればよく、前記発現測定試薬の種類は、特に制限されない。前記プロレニン受容体の発現測定試薬は、例えば、プロレニン受容体タンパク質の発現測定試薬でもよく、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現測定試薬でもよい。
　前者は、例えば、プロレニン受容体タンパク質に結合する結合物質があげられ、具体例として、抗体があげられる。この場合、本発明の試験試薬は、例えば、さらに、プロレニン受容体タンパク質と前記抗体との結合を検出する検出物質を含むことが好ましい。前記検出物質は、例えば、前記抗体に対する検出可能な標識化抗体と、前記標識に対する基質等の組合せがあげられる。
　後者は、例えば、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡを逆転写により増幅する試薬があげられ、具体例として、プライマーがあげられる。前記プライマーは、例えば、プロレニン受容体の遺伝子配列に基づいて適宜設計できる。
（がんの診断方法および診断試薬）
　本発明のがんの診断方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。また、本発明のがんの診断試薬は、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。なお、本発明は、前記本発明の試験方法および試験試薬の説明を援用できる。
（がん治療薬およびがん治療方法）
　本発明のがんターゲットは、プロレニン受容体であることを特徴とする。本発明は、プロレニン受容体を前記がんターゲットとし、例えば、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡまたはプロレニン受容体タンパク質の発現を抑制すること、または、プロレニン受容体タンパク質の機能を阻害もしくは中和すること等により、がんを治療できる。
　本発明のがん治療薬は、前述のように、プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、がんの治療方法であって、患者に前記本発明のがん治療薬を投与する工程を含むことを特徴とする。
　本発明は、プロレニン受容体タンパク質への結合物質の結合またはプロレニン受容体の発現抑制によって、がんを治療することが特徴であり、前記結合物質および前記発現抑制物質の種類は、特に制限されない。本発明は、例えば、前記結合物質および前記発現抑制物質の一方を使用してもよいし、両者を併用してもよい。
　前記結合物質は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられ、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片である。前記結合物質は、アンタゴニストが好ましい。
　前記抗体は、特に制限されず、一般的な抗体の製造方法により得ることができる。具体例として、例えば、プロレニン受容体タンパク質またはその断片を抗原とし、動物に免疫した後、前記免疫された動物から血清を回収することにより、プロレニン受容体タンパク質に対する抗体を得ることができる。前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。
　前記抗原は、例えば、前述のように、プロレニン受容体の全長アミノ酸配列でもよいし、部分配列でもよい。前記部分配列は、例えば、前記ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において、２００－２１３番目のアミノ酸領域（HKHLAKDHSPDLYS：配列番号７）があげられる。
　前記プロレニン受容体タンパク質において、前記プロレニン受容体タンパク質と前記プロレニン受容体タンパク質に対する抗体との結合位置は、特に制限されない。前記プロレニン受容体タンパク質が、ヒトプロレニン受容体タンパク質である場合、前記結合位置は、例えば、前記ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において、２００－２１３番目のアミノ酸領域（HKHLAKDHSPDLYS：配列番号７）があげられる。
　前記発現抑制物質は、例えば、プロレニン受容体遺伝子からのｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを切断する物質およびｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質等があげられる。具体例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ干渉剤、アンチセンス、リボザイム等があげられ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　本発明のがん治療薬の投与条件は、特に制限されず、例えば、対象となるがん疾患の種類、進行度、患者の年齢等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、前述のように、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。
（スクリーニング方法）
　本発明のスクリーニング方法は、がん治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とする。本発明は、がん治療薬候補物質のターゲットがプロレニン受容体であることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
　前記結合物質は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられ、好ましくは、抗体もしくはその抗原結合断片である。
　前記発現抑制物質は、例えば、プロレニン受容体遺伝子からのｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを切断する物質およびｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質等があげられる。具体例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ干渉剤、アンチセンス、リボザイム等があげられる。
　本発明の前記結合物質のスクリーニング方法は、例えば、プロレニン受容体に前記被検物質を接触させる工程と、プロレニン受容体と前記被検物質との結合を検出する工程と、プロレニン受容体に結合した前記被検物質を、前記治療薬候補物質として選択する工程とを含む。前記検出工程において、プロレニン受容体と前記被検物質との結合の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記被検物質の種類に応じて、適宜決定できる。
　本発明の前記発現抑制物質のスクリーニング方法は、例えば、プロレニン受容体の発現系に前記被検物質を共存させて、プロレニン受容体を発現させる工程と、前記発現系におけるプロレニン受容体の発現を検出する工程と、プロレニン受容体の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも低い前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程とを含む。前記検出工程において、検出対象の前記発現は、例えば、プロレニン受容体タンパク質の発現でもよいし、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの転写でもよい。前記タンパク質の発現およびｍＲＮＡの発現の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が適用できる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
［実施例１］
　膵臓がん患者の血漿中のプロレニン受容体の濃度上昇を確認した。
　血漿中のプロレニン受容体の測定は、Ｈｕｍａｎ　ｓｏｌｕｂｌｅ　（Ｐｒｏ）ｒｅｎｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（株式会社　免疫生物研究所）を用いて、そのプロトコルに従って行った。まず、健常者男性（ｎ＝９）、健常者女性（ｎ＝３）、膵臓がん患者男性（ｎ＝９）および膵臓がん患者女性（ｎ＝８）の血液から血漿を回収した。これらを、前記キットの希釈液（１％　ＢＳＡおよび５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有リン酸緩衝液）で２倍希釈し、得られた希釈血漿を被検サンプルとした。前記被検サンプル１００μＬを、捕獲抗体（抗Ｈｕｍａｎ　ｒｅｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒポリクローナルラビットＩｇＧ抗体）が結合したプレートに添加し、４℃で一晩反応させた。前記被検サンプルを除き、前記プレートを前記リン酸緩衝液で４回洗浄した。つぎに、前記プレートに、標識抗体（ＨＲＰ標識抗Ｈｕｍａｎ　ｒｅｎｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒポリクローナルマウスＩｇＧ抗体）を１００μＬ添加し、４℃で６０分反応させた。前記標識抗体を除き、前記プレートを前記リン酸緩衝液で５回洗浄した。さらに、前記プレートにＴｅｔｒａ　Ｍｅｔｈｙｌ　Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ含有基質液を１００μＬ添加して発色させた後、０．５ｍｏｌ／Ｌ（１Ｎ）　Ｈ２ＳＯ４で、発色反応を停止した。停止後、プレートリーダーで、前記プレート内の反応液について４５０ｎｍでの吸光度を測定した。他方、前記キットの標準物質（Ｈｕｍａｎ　ｓｏｌｕｂｌｅ　（Ｐｒｏ）ｒｅｎｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を段階希釈し、得られた希釈標準サンプルを用いて、同様に吸光度を測定し、検量線を作成した。そして、前記被検サンプルの吸光度から、前記検量線に基づき、前記血漿中のプロレニン受容体の濃度を測定した。
　また、健常者（ｎ＝２０）、膵臓がんを原発巣とし且つ転移のない膵臓がん患者（転移なし、ｎ＝１１）、および膵臓がんを原発巣とし且つ他臓器への転移がある膵臓がん患者（転移あり、ｎ＝９）から血漿を回収し、同様にして前記血漿中のプロレニン受容体の濃度を測定した。
　この結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示す。図１（Ａ）および（Ｂ）は、血漿中のプロレニン受容体の濃度を示すグラフである。図１（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、前記被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体の濃度を示す。図１（Ａ）に示すように、男性および女性共に、膵臓がん患者（ＰＤＡＣ）は、健常者（Ｎｏｒｍａｌ）と比較して、血漿中のプロレニン受容体の濃度が有意に上昇した。また、図１（Ｂ）に示すように、膵臓がんの転移無しの患者および膵臓がんの転移ありの患者は、いずれも、健常者と比較して、血漿中のプロレニン受容体濃度が有意に上昇した。これらの結果から、転移の有無および性別に関わらず膵臓がんの発症と血漿中のプロレニン受容体濃度上昇との間に相関関係があり、血漿中のプロレニン受容体が、膵臓がんのマーカーとなることがわかった。
［実施例２］
　膵臓がん細胞株のプロレニン受容体の発現を抑制し、前記細胞株の増殖能力を確認した。
　４０％コンフルエントのヒト膵臓がん細胞株ＰＫ－１を、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で２４時間、ディッシュ上の無血清培地中で培養した。次に、前記ＰＫ－１に、プロレニン受容体遺伝子をノックダウンさせる下記のｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはネガティブコントロールであるｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）　ＲＮＡｉＭＡＸ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、そのプロトコルに従って導入した。そして、ｓｉＲＮＡを導入したＰＫ－１を、同条件下で４８時間培養した。培養後、０．２５％トリプシンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記ディッシュからＰＫ－１を剥離し、新たな前記無血清培地を添加した。そして、ＰＫ－１を含む前記培地から、遠心分離によってＰＫ－１を含むペレットを回収した。前記ペレットをリン酸緩衝液１ｍＬに懸濁し、この懸濁液と２０μＬのトリパンブルー液とを混合後、血球計算板に注入し、１ｍＬあたりの細胞数を算出した。生細胞の数が５×１０５細胞／１０ｃｍ径ディッシュとなるように播種し、細胞増殖を誘導するヒトＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１５０ｎｇ／ｍＬで加えた。０、２４、４８、７２時間の培養後、ＰＫ－１を回収し、同様に生細胞の数を算出した。また、コントロールとして、ｓｉＲＮＡ処理を行わない以外は、同様にして培養および生細胞数の測定を行った。
ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ
センス鎖（配列番号８）
　　　５’－UAUAGGGACUUGCUGGGUUCUUCGC－３’
アンチセンス鎖（配列番号９）
　　　５’－GCGAAGAACCCAGCAAGUCCCUAUA－３’
　この結果を図２に示す。図２は、ＲＮＡｉによりプロレニン受容体の発現を抑制したときの、前記膵臓がん細胞株の細胞数を示すグラフである。図２において、コントロール（○）は、ｓｉＲＮＡ無処理のコントロール群、スクランブル（△）は、スクランブルｓｉＲＮＡで処理したスクランブル群、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ（□）は、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲで処理したｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群の結果である。図２の横軸は、Ｗｎｔ３ａで刺激した時間を、縦軸は、細胞数を示す。図２に示すように、コントロール群およびスクランブル群は、各処理時間で同等の細胞増殖を示した。これに対して、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、前記両群に比べて、各処理時間のいずれにおいても、前記膵臓がん細胞株の細胞増殖が抑制された。さらに、コントロール群およびスクランブル群は、７２時間まで増殖し続けたのに対して、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、４８時間をピークに細胞数が減少した。この結果から、プロレニン受容体の発現を抑制することで、膵臓がん細胞株の増殖を抑制できること、つまり、プロレニン受容体が、膵臓がんのターゲットとなることがわかった。
［実施例３］
　転移がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇を確認した。
（１）プロレニン受容体タンパク質の発現
　原発巣が膵臓であるがん患者から、肝臓の正常組織（コントロール）、肝臓の転移がん組織および腹膜の転移がん組織を採取した。各組織２ｇにＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬを添加し、４，０００ｒｐｍで５分間、ホモジェナイズを行い、被検サンプルを作製した。試薬（商品名　Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて、前記被検サンプル中のタンパク質量を測定した。
　前記被検サンプル（総タンパク量２０μｇ）を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動に供し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）メンブレンに転写した。前記転写後の前記メンブレンを、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉ－Ｃｏｒ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロッキングした。前記ブロッキング後の前記メンブレンを、１０００倍希釈した抗ラビット（Ｐ）ＲＲポリクローナル抗体と室温で１時間反応させ、続いて２０００倍希釈したＩＲＤｙｅ（登録商標）標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）と、同条件下で反応させた。前記反応後のメンブレンについて、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ－Ｃｏｒ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、前記被検サンプル中のプロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。コントロールである肝臓の正常組織の発現量を１として、肝臓および腹膜の転移がん組織の発現量の相対値を求めた。
　各組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図３に示す。図３は、各組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現量を示したグラフである。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体タンパク質の相対的発現量を示す。図３に示すように、肝臓および腹膜の転移がん組織は、正常な肝臓組織よりプロレニン受容体タンパク質の発現が、有意に上昇した。これらの結果から、転移がん組織と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、プロレニン受容体タンパク質が、転移がんのマーカーとなることがわかった。
（２）プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現
　前記（１）で採取した肝臓の正常組織（コントロール）、肝臓の転移がん組織および腹膜の転移がん組織を使用した。各組織２ｇにＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）　１ｍＬを添加し、４，０００ｒｐｍで５分間、ホモジェナイズを行い、被検サンプルを作製した。前記被検サンプルにエタノールを加え、ＲＮＡを沈殿させた後、前記ＲＮＡをＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒに溶解し、ＲＮＡ溶液を作製した。分光光度計により、前記ＲＮＡ溶液の濃度およびＯＤ２６０／ＯＤ２８０（純度）を計測した。そして、ＲＮＡ濃度３００ｎｇ／μＬ、純度１．８以上の前記ＲＮＡ溶液を、以下の定量的リアルタイム（ｑＲＴ）－ＰＣＲに使用した。
　逆転写酵素およびランダムプライマーを用い、常法により、前記ＲＮＡ溶液からｃＤＮＡを合成後、ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡを分解した。得られた前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７３００　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、添付のプロトコルに従ってｑＲＴ－ＰＣＲを行い、前記被検サンプル中のプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡ発現量および内部標準であるβ－アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、前記β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対する比として算出した。前記ｑＲＴ－ＰＣＲにおいて、プロレニン受容体遺伝子および前記β－アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。
プロレニン受容体遺伝子増幅用プライマーセット
　　　（配列番号１）5’-GGCGTTGGTGGCGGGTGTTT-3’
　　　（配列番号２）5’-AGCCCATGGACAATGCAGCCAC-3’
β－アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
　　　（配列番号３）5’-CACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’
　　　（配列番号４）5’-ACGAGCGCGGCGATATCATCATC-3’
　各組織のプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を、図４に示す。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡのβ－アクチン遺伝子のｍＲＮＡに対する相対的発現量を示す。図４に示すように、肝臓および腹膜の転移がん組織は、正常な肝臓組織と比較して、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇した。この結果から、転移がん組織と、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現上昇との間に相関があること、つまり、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡが、転移がんのマーカーとなることがわかった。
［実施例４］
　胃がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇を確認した。
（１）プロレニン受容体タンパク質の発現
　胃がん患者４名から、それぞれ胃の正常組織（ｎ＝４）およびがん組織（ｎ＝４）を採取し、前記実施例３（１）と同様にして、プロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
　胃がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図５に示す。図５は、プロレニン受容体タンパク質の発現量を示したグラフである。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体タンパク質の相対的発現量を示す。図５に示すように、胃がん組織（ｎ＝４）では、正常な胃組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体タンパク質の発現が、有意に上昇した。これらの結果から、胃がんの発症と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、胃組織におけるプロレニン受容体タンパク質が、胃がんのマーカーとなることがわかった。
（２）プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現
　前記（１）で採取した胃の正常組織およびがん組織を使用し、前記実施例３（２）と同様にして、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
　胃がん組織のプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を、図６に示す。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡのβ－アクチン遺伝子のｍＲＮＡに対する相対的発現量を示す。図６に示すように、胃がん組織（ｎ＝４）では、正常な胃組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が、上昇した。この結果から、胃がん発症と、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現上昇との間に相関があること、つまり、胃組織におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡが、胃がんのマーカーとなることがわかった。
［実施例５］
　大腸がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇を確認した。
（１）プロレニン受容体タンパク質の発現
　大腸がん患者４名から、大腸の正常組織（ｎ＝４）およびがん組織（ｎ＝４）を採取し、前記実施例３（１）と同様にして、プロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
　大腸がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図７に示す。図７は、プロレニン受容体タンパク質の発現量を示したグラフである。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体タンパク質の相対的発現量を示す。図７に示すように、大腸がん組織（ｎ＝４）では、正常な大腸組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体タンパク質の発現が、有意に上昇した。これらの結果から、大腸がんの発症と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、大腸組織におけるプロレニン受容体タンパク質が、大腸がんのマーカーとなることがわかった。
（２）プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現
　前記（１）で採取した大腸の正常組織およびがん組織について、前記実施例３（２）と同様にして、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。
　大腸がん組織におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を、図８に示す。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡのβ－アクチン遺伝子のｍＲＮＡに対する相対的発現量を示す。図８に示すように、大腸がん組織（ｎ＝４）では、正常な大腸組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が、有意に上昇した。この結果から、大腸がん発症と、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現上昇との間に相関があること、つまり、大腸組織におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡが、大腸がんのマーカーとなることがわかった。
［実施例６］
　膵臓がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現上昇を免疫組織化学染色により確認した。
　膵臓がん患者２２名から、膵管の正常上皮組織、膵臓のがん組織および前がん病変部位（ＰａｎＩＮ）を含む膵管の上皮組織を採取した。これらを被検サンプルとして、パラフィン切片を作製し、１００％キシレンおよび９９．５％エタノールを用いて、脱パラフィン操作を行った。そして、前記被検サンプルについて、１００％エタノールおよび３０％過酸化水素水を用い、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。つぎに、前記被検サンプルの切片領域を、リキッドブロッカー（撥水性物質）で囲った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。続いて、前記被検サンプルを、１０％ヤギ正常血清（商品名　ヒストフィンＳＡＢ－ＰＯ（Ｒ）キット、ニチレイバイオサイエンス）を用い、室温で１５分間、ブロッキングした。
　前記ブロッキング後、前記被検サンプルを、４０００倍希釈した抗ラビット（Ｐ）ＲＲポリクローナル抗体と、室温で１時間反応させ、前記ＰＢＳで洗浄した。つぎに、前記被検サンプルを、ＨＲＰ標識二次抗体であるヒストファイン　シンプルステインＭＡＸ－ＰＲＯ（ＭＵＬＴＩ）（ニチレイバイオサイエンス）と、室温で３０分間反応させた。続いて、前記被検サンプルを前記ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰの発色基質であるＤＡＢ（３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色させた。そして、前記被検サンプルを流水で洗浄し、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で染色した。前記染色後の前記被検サンプルを流水で洗浄し、９９．５％エタノールおよび１００％キシレンで脱水し、固定した。前記固定した前記被検サンプルをマリノールで封入し、ＤＡＢにより茶色に染色されるプロレニン受容体の発現領域を、光学顕微鏡を用いて観察した。
　膵臓組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図９に示す。図９は、膵臓組織における、プロレニン受容体タンパク質の発現を示す組織染色図である。図９において、（Ａ）は、膵臓がん組織の染色図であり、（Ｂ）は、膵管の正常上皮組織の染色図であり、（Ｃ）は、中期のＰａｎＩＮであるＰａｎＩＮ－２を含む膵管上皮組織の染色図であり、（Ｄ）は、後期のＰａｎＩＮであるＰａｎＩＮ－３を含む膵管上皮組織の染色図である。また、（Ａ）－（Ｄ）におけるスケールバーは、１００μｍとし、染色された領域は、実線で囲んで示した（例えば、矢印Ｘ、ＹおよびＺの領域）。
　図９（Ｂ）に示すように、膵管上皮組織（正常）は、茶色の染色がほとんど確認されなかった。一方、図９（Ａ）に示すように、膵臓ガン組織は、実線（Ｘ）で囲んだ領域が茶色に染色された。さらに、図９（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、ＰａｎＩＮ－２およびＰａｎＩＮ－３は、それぞれ実線（Ｙ）または実線（Ｚ）で囲んだ領域が茶色に染色された。つまり、膵臓がん組織およびＰａｎＩＮは、正常な膵管上皮組織と比較して、プロレニン受容体タンパク質の発現が上昇した。なお、図９は、１名の膵臓がん患者由来の組織の染色図を示すが、その他の膵臓がん患者由来の組織においても同様に、膵臓がん組織およびＰａｎＩＮにおいて、プロレニン受容体タンパク質の発現が上昇していた。これらの結果から、ＰａｎＩＮの形成および膵臓がん発症と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、膵臓組織におけるプロレニン受容体タンパク質が、膵臓がんの高い発症可能性を示すマーカー、および膵臓がんのマーカーとなることがわかった。
［実施例７］
　ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲで処理したヒト膵臓がん細胞株をヌードマウスに移植し、ヌードマウスにおける前記膵臓がん細胞株の成長の抑制および血漿中の可溶性プロレニン受容体タンパク質の発現量の低下を確認した。
（１）膵臓がん細胞株の成長
　ＰＫ－１に代えて、ヒト膵臓がん細胞株であるＰＡＮＣ－１を用いた以外は前記実施例２と同様にして、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入し、ｓｉＲＮＡを導入したＰＡＮＣ－１（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）を回収した。つぎに、５×１０５細胞のＰＡＮＣ－１を、５週齢雄ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝７）（日本クレア社製）の右上側腹部に皮下移植した。そして、前記移植後２５および４０日に、前記右上側腹部におけるＰＡＮＣ－１由来のがんの長径および短径を、電気ノギス（アズワン社製）を用いて測定した。前記がんの容積は、下記式から算出した。コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入したＰＡＮＣ－１（スクランブル群）用いた以外は同様にして、がんの容積を測定した。
［式１］
ガン容積（ｍｍ３）＝長径×（短径）２×０．５
　図１０に、前記がんの容積を示し、図１１に、前記移植後２５日目の前記マウスの写真を示す。図１０において、（Ａ）は、前記移植後２５日の前記がんの容積を示すグラフであり、（Ｂ）は、前記移植後４０日の前記がんの容積を示すグラフである。図１０（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、がんの容積を示す。図１０（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記移植後２５および４０日において、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群由来のがんの容積は、スクランブル群由来のがんの容積に対して、顕著に低下した。
　図１１において、（Ａ）は、スクランブル群の移植後２５日目の前記マウスの写真であり、（Ｂ）は、ｓｉ（Ｐ）ＲＲ群の移植後２５日目の前記マウスの写真である。図１１に示すように、前記移植後２５日において、スクランブル群は、実線（Ｔ）で囲んだ領域にがんの形成が確認された。これに対し、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、がんの形成が確認されなかった。これらの結果から、プロレニン受容体の発現を抑制することで、生体内におけるがんの成長を抑制できることがわかった。
（２）プロレニン受容体タンパク質の発現量
　前記移植後２５日の前記ヌードマウスの血液から血漿を採取した。前記血漿中のプロレニン受容体タンパク質の発現量の測定は、前記実施例３（１）と同様にして測定した。つぎに、コントロールの血漿のプロレニン受容体の発現量を１として、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入したＰＡＮＣ－１を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の発現量の相対値を求めた。
　これらの結果を図１２に示す。図１２は、前記移植後２５日の血漿におけるプロレニン受容体の発現量の相対値を示すグラフである。図１２において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、プロレニン受容体の相対的発現量を示す。図１２に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の相対的発現量は、スクランブル群を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の相対的発現量に対して、有意に低下した。これらの結果から、生体内において、がんのプロレニン受容体の発現を抑制することで、血漿中のプロレニン受容体の発現量を抑制できることがわかった。
［実施例８］
　膵臓がんを移植したヌードマウスに抗プロレニン受容体抗体を投与することで、がんの成長を抑制できることを確認した。
（１）抗プロレニン受容体抗体の作製
　前記ヒトプロレニン受容体タンパク質（配列番号６）の２００－２１３番目のポリペプチド（配列番号７）を、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し、抗原タンパク質とした。１５０－２００μｇの前記抗原タンパク質を、２週間毎に７－１０回ウサギ皮内の数十箇所に免疫した（６００－８００μｇ／体重１ｋｇ）。前記免疫は、初回は、完全アジュバントと混合した前記抗原タンパク質を用いて行い、２回目以降は、不完全アジュバントと混合した前記抗原タンパク質を用いて行った。つぎに、前記ポリペプチドに対する抗体価の上昇を確認した後、前記ウサギより全血を採取し、さらに、血清を回収し、これを抗血清とした。前記抗血清におけるポリクローナル抗ヒトプロレニン受容体抗体（クローン名：ＰＲＲ１）の濃度は、０．６μｇ／μＬであった。なお、前記抗原タンパク質に用いたヒトプロレニン受容体タンパク質の全アミノ酸配列とマウスプロレニン受容体タンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１０）との相同性（異種間のアライメントスコア）は、９２．２９％であった。このことから、前記抗血清に含まれる前記ヒトプロレニン受容体抗体は、マウスプロレニン受容体にも結合するといえる。
マウスプロレニン受容体タンパク質（配列番号１０）
MAVLVVLLFFLVAGALGNEFSILRSPGSVVFRNGNWPIPGDRIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATIMVMVKGVDKLALPAGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRNRLFQENSLLNSLPLNSLSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDELGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLVRKSRTILEAKQENTQSPYNLAYKYNLEYSVVFNLVLWIMIGLALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRID
（２）生体内におけるがん細胞の成長抑制
　１×１０６細胞のＰＫ－１またはＰＡＮＣ－１、３０μｌの前記抗血清（前記抗体０．６μｇ／μｌ）および１７０μｌのＰＢＳを混合した。この混合液（全量）を、ヌードマウス（ｎ＝１０）の右上側腹部に移植した。この際、前記マウスの体重１ｋｇあたりの移植量は、前記細胞が５０×１０６細胞であり、前記抗体０．９ｍｇである。つぎに、前記移植後から３日毎に、１０μｌの前記抗血清（前記抗体０．６μｇ／μｌ）を、ＰＫ－１またはＰＡＮＣ－１由来のがん内に投与した、この際、１回の投与における、前記マウスの体重１ｋｇあたりの前記抗体の投与量は、０．３ｍｇである。そして、前記移植後１５、１８、２１、２４および２７日に、前記右上側腹部におけるＰＫ－１またはＰＡＮＣ－１由来のがんの容積を、前記実施例７と同様に測定した。コントロールは、前記抗プロレニン受容体抗体に代えて、マウスの体重１ｋｇあたり１ｍｇとなるように、ヒトＩｇＧ１抗体（ＷＡＫＯ社製）を投与した以外は同様にして、がんの容積を測定した。
　これらの結果を図１３に示す。図１３において、（Ａ）は、ＰＫ－１を移植した際の前記がんの容積を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＰＡＮＣ－１を移植した際の前記がんの容積を示すグラフである。図１３（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、移植後の日数を示し、縦軸は、がんの容積を示し、図中の黒抜きバーは、抗プロレニン受容体投与群を示し、白抜きバーは、ヒトＩｇＧ１抗体投与群を示す。図１３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＰＫ－１およびＰＡＮＣ－１のいずれを移植した前記ヌードマウスにおいても、前記移植後１５、１８、２１、２４および２７日において、抗プロレニン受容体投与群のがんの容積は、ヒトＩｇＧ１抗体投与群のがんの容積に対して低下した。これらの結果から、抗プロレニン受容体抗体を用いることで、生体内におけるがんの成長を抑制できることがわかった。
［実施例９］
　ヒト膵管上皮細胞株およびヒト膵臓がん細胞株におけるプロレニン受容体タンパク質の発現およびこれらの細胞株の培養上清におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を確認した。
　ヒト膵管上皮細胞株として、ＨＰＤＥを、ヒト膵臓がん細胞株として、ＰＫ－８、ＰＣＩ－３５、ＢｘＰＣ－３、ＰＫ－１、ＰＡＮＣ－１およびＭＩＡＰａＣａ－２を用いた。前記細胞株を、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で２４時間、無血清培地中で培養した。前記無血清培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。前記培養後、培養上清を回収した。つぎに、１ｍＬ前記培養上清を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ　ｗｉｔｈ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０　ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、２０μｇの総タンパク質を含む濃縮液を得た。前記濃縮液を培養上清サンプルとした。
　また、前記培養上清回収後の前記細胞株は、Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒで溶解した。前記細胞溶解液を１２，５００ｒｐｍで１０分遠心後、上清を取得し、細胞溶解サンプルとした。そして、前記培養上清サンプルおよび前記細胞溶解サンプルにおけるプロレニン受容体タンパク質およびβ－アクチンタンパク質の発現を、前記実施例３（１）と同様にして確認した。
　これらの結果を図１４（Ａ）および（Ｂ）に示す。図１４において、（Ａ）は、前記細胞株の前記細胞溶解サンプルにおけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真であり、（Ｂ）は、前記細胞株の前記培養上清サンプルにおけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。図１４（Ａ）および（Ｂ）において、写真の上側は、細胞株を示し、写真の左側は、検出したタンパク質を示す。図１４（Ａ）に示すように、いずれの前記細胞株の前記細胞溶解サンプルにおいても、プロレニン受容体タンパク質の発現が確認された。また、図１４（Ｂ）に示すように、いずれの前記細胞株の前記培養上清サンプルにおいても、プロレニン受容体タンパク質の発現が確認された。これらの結果から、前記ヒト膵管上皮細胞株および前記ヒト膵臓がん細胞株およびこれらの細胞株の培養上清において、プロレニン受容体タンパク質が、発現していることが確認された。
［実施例１０］
　プロレニン受容体の発現を抑制することで、Ｗｎｔシグナルが抑制されることを確認した。
（１）リン酸化ＬＲＰ６の発現
　前記実施例２と同様にして、ＰＫ－１にｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入した（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）。前記導入後、１５０ｎｇ／ｍＬとなるように組換えヒトＷｎｔ３ａを加えた。前記添加後１０分に、ＰＫ－１を回収し、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒで溶解し、被検サンプルを調製した。つぎに、実施例３（１）と同様にして、プロレニン受容体タンパク質とβ－アクチンタンパク質の発現を確認した。
　また、前記被検サンプルについて、前記抗プロレニン受容体抗体に代えて、抗リン酸化ＬＲＰ６抗体（Ｓｅｒ　１４９０、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）または抗ＬＲＰ６抗体（クローン名：Ｃ４７Ｅ１２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた以外は、前記実施例３（１）と同様にして、リン酸化ＬＲＰ６タンパク質またはＬＲＰ６タンパク質の発現量を測定した。ネガティブコントロールは、ｓｉＲＮＡを導入せず、またＷｎｔ３ａを加えなかった以外は同様にして、コントロール１は、ｓｉＲＮＡを導入しなかった以外は同様にして、コントロール２は、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、リン酸化ＬＲＰ６タンパク質およびＬＲＰ６タンパク質の発現量を測定した。
　さらに、各サンプルについて、ＬＲＰ６タンパク質の発現量に対するリン酸化ＬＲＰ６タンパク質の発現量の比（リン酸化ＬＲＰ６発現量比）を求めた。そして、ネガティブコントロールにおけるリン酸化ＬＲＰ６発現量比を１として、各サンプルにおけるリン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を算出した。
　図１５に、プロレニン受容体タンパク質およびβ－アクチンタンパク質の発現を示し、図１６に、リン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を示す。図１５は、プロレニン受容体タンパク質およびβ－アクチンタンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。図１５において、写真の下側は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、写真の左側は、検出したタンパク質を示す。図１５に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、ネガティブコントロール、コントロール１および２に対して、プロレニン受容体タンパク質の発現が低下した。
　図１６は、リン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を示すグラフである。図１６において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、縦軸は、リン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を示す。図１６に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、ネガティブコントロール、コントロール１および２に対して、Ｗｎｔ３ａ刺激後のリン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値が低下した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、Ｗｎｔシグナルが抑制されることが確認された。
（２）活性型β－カテニンおよびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１の発現
　前記（１）と同様にして、被検サンプルを調製した。つぎに、前記被検サンプルについて、抗プロレニン受容体抗体に代えて、抗活性型β－カテニン抗体（ａｎｔｉ－ＡＢＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）または抗Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１抗体を用いた以外は、前記実施例３（１）と同様にして、活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現量を求めた。ネガティブコントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入し、Ｗｎｔ３ａを加えなかった以外は、コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現量を求めた。そして、前記ネガティブコントロールにおける活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現量を１として、各サンプルにおける活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現量の相対値を求めた。
　また、ＢｘＰＣ－３およびＰＡＮＣ－１についても同様にして、活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現量の相対値を求めた。
　これらの結果を図１７（Ａ）－（Ｃ）に示す。図１７において、（Ａ）－（Ｃ）は、活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の発現量の相対値を示すグラフであり、（Ａ）は、ＰＫ－１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＢｘＰＣ－３を用いた結果であり、（Ｃ）は、ＰＡＮＣ－１を用いた結果である。図１７（Ａ）－（Ｃ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、縦軸は、相対的発現量を示し、図中の黒抜きバーは、活性型β－カテニンタンパク質の相対的発現量を示し、白抜きバーは、Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の相対的発現量を示す。
　図１７（Ａ）－（Ｃ）に示すようにｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、コントロールに対して、活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質の相対的発現量が有意に低下し、ネガティブコントロールと同程度またはネガティブコントロール未満の相対的発現量となった。活性型β－カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ　Ｄ１タンパク質は、Ｗｎｔシグナルによって誘導されるタンパク質である。このため、これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、Ｗｎｔシグナルが抑制されることが確認された。
［実施例１１］
　５×１０４細胞／ウェルとなるよう６ウェルプレートにＰＫ－１を播種した。つぎに、前記実施例２と同様にして、ＰＫ－１にｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入した（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）。前記導入後、１５０ｎｇ／ｍＬとなるように組換えヒトＷｎｔ３ａを加え、４８時間培養した。前記培養後、さらに、１００μＬの水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－１）試薬を各ウェルに添加し、２時間インキュベートした。そして、各ウェルについて、プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、増殖能力を測定した。ネガティブコントロールは、ｓｉＲＮＡを導入せず、またＷｎｔ３ａを加えなかった以外は同様にして、コントロール１は、ｓｉＲＮＡを導入しなかった以外は同様にして、コントロール２は、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、増殖能力を測定した。
　さらに、ネガティブコントロールにおける増殖能力を１として、各サンプルにおける増殖能力の相対値を求めた。また、ＢｘＰＣ－３およびＰＡＮＣ－１についても同様にして、増殖能力の相対値を求めた。
　これらの結果を図１８に示す。図１８において、（Ａ）－（Ｃ）は、増殖能力の相対値を示すグラフであり、（Ａ）は、ＰＫ－１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＢｘＰＣ－３を用いた結果であり、（Ｃ）は、ＰＡＮＣ－１を用いた結果である。図１８（Ａ）－（Ｃ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、縦軸は、相対的増殖能力を示す。
　図１８（Ａ）－（Ｃ）に示すように、いずれのヒト膵臓がん細胞株においても、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、ネガティブコントロール、コントロール１および２に対して、相対的増殖能力が低下した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、ヒト膵臓がん細胞株の増殖が抑制されることが確認された。
［実施例１２］
　プロレニン受容体の発現を抑制することで、アポトーシスが誘導されることを確認した。
（１）アポトーシス細胞の測定
　前記実施例２と同様にして、ＰＫ－１にｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入した（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）。前記導入後、１５０ｎｇ／ｍＬとなるように組換えヒトＷｎｔ３ａを加え、４８時間培養した。つぎに、培養後のＰＫ－１を遠心して回収し、０．５ｍＬの氷冷７０％エタノールに懸濁し、－２０℃で２４時間保存した。前記保存後のＰＫ－１をＰＢＳで洗浄後、１０ｍｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅ　Ａ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社製）含有ＰＢＳに懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。そして、１ｍｇ／ｍＬ　ＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）含有ＰＢＳを用いて、３７℃で３０分間、染色した。
　前記染色後のＰＫ－１をＰＢＳで洗浄後、再度ＰＢＳで懸濁し、ＤＮＡフローサイトメーター（ベックマン　コールター社製）を用いて、前方散乱光（ＦＳ）、側方散乱光（ＳＳ）およびＤＮＡ含有量を測定した。また、前記ＤＮＡ含有量に基づき、各細胞周期の細胞の割合を算出した。コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、前方散乱光（ＦＳ）、側方散乱光（ＳＳ）およびＤＮＡ含有量を測定し、各細胞周期の細胞の割合を算出した。また、ＰＡＮＣ－１についても同様にして、各細胞周期の細胞の割合を算出した。
　図１９に、ＦＳおよびＳＳのドットプロットを示し、図２０に、ＤＮＡ含有量のヒストグラムを示し、図２１に、各細胞周期の細胞の割合のグラフを示す。図１９は、アポトーシス細胞の割合を示すドットプロットである。図１９において、横軸は、ＳＳを示し、縦軸は、ＦＳを示し、図中の数字は、アポトーシス細胞の割合を示す。図１９に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、コントロール対して、アポトーシス細胞を示す４分割のドットプロットの右上画分を占める細胞の割合が増加した。
　図２０は、ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。図２０において、横軸は、ＰＩの蛍光強度を示し、縦軸は、カウント数を示し、図中の黒抜きヒストグラムは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群を示し、白抜きヒストグラムは、コントロールを示す。図２０に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、図中の矢印で示すＤＮＡ含有量の低下したアポトーシス細胞が観察された。これに対し、コントロールでは、アポトーシス細胞が観察されなかった。
　図２１（Ａ）および（Ｂ）は、各細胞周期の細胞の割合を示すグラフである。図２１において、（Ａ）は、ＰＫ－１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＰＡＮＣ－１を用いた結果である。図２１（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、各細胞周期の細胞の割合を示す。
　図２１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、いずれのヒト膵臓がん細胞株においても、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、コントロールに対して、アポトーシス細胞であるＳｕｂＧ１基の細胞の割合が増加した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、ヒト膵臓がん細胞株のアポトーシスが誘導されることが確認された。
（２）カスパーゼ３の活性化の測定
　前記（１）と同様にして、ＰＫ－１を培養し、回収した。カスパーゼ３の活性の測定は、ＡＰＯＰＣＹＴＥ（Ｋｉｔ名：Ｃａｓｐａｓｅ－３　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、Ｍｅｄｉｃａｌ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、そのプロトコルに従って行った。コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ　ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、カスパーゼ３の活性を測定した。また、ＢｘＰＣ－３およびＰＡＮＣ－１についても同様にして、カスパーゼ３の活性を測定した。
　これらの結果を図２２（Ａ）－（Ｃ）に示す。図２２において、（Ａ）－（Ｃ）は、カスパーゼ３の活性を示すグラフであり、（Ａ）は、ＰＫ－１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＢｘＰＣ－３を用いた結果であり、（Ｃ）は、ＰＡＮＣ－１を用いた結果である。図２２（Ａ）－（Ｃ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、カスパーゼ３の活性を示す。図２２（Ａ）－（Ｃ）に示すように、いずれのヒト膵臓がん細胞株においても、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、コントロールに対して、アポトーシスを誘導するカスパーゼ３の活性が上昇した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、アポトーシスを誘導するカスパーゼ３が活性化することが確認された。
［実施例１３］
　脳腫瘍患者の血漿中のプロレニン受容体の濃度上昇を確認した。
　健常者男性（ｎ＝４）、健常者女性（ｎ＝２）、脳腫瘍患者男性（ｎ＝５）および脳腫瘍患者女性（ｎ＝１０）の血液から血漿を回収した。これらを、前記実施例１と同様にして、前記血漿中のプロレニン受容体の濃度を測定した。
　この結果を図２３に示す。図２３は、血漿中のプロレニン受容体の濃度を示すグラフである。図２３において、横軸は、前記被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体の濃度を示す。図２３に示すように、男性および女性共に、脳腫瘍患者（Ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ）は、健常者（Ｎｏｒｍａｌ）と比較して、血漿中のプロレニン受容体の濃度が有意に上昇した。これらの結果から、性別に関わらず脳腫瘍の発症と血漿中のプロレニン受容体濃度上昇との間に相関関係があり、血漿中のプロレニン受容体が、脳腫瘍のマーカーとなることがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１２年９月１１日に出願された日本出願特願２０１２－１９９５０８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　以上のように、本発明によれば、プロレニン受容体の発現量を測定することによって、がんの罹患危険度を試験できる。また、プロレニン受容体は、がんのターゲットとなることから、本発明のスクリーニング方法によれば、プロレニン受容体をターゲットとした、がん治療用候補物質を得ることができる。このため、本発明のがんマーカーは、臨床分野、生化学分野において、極めて有用なマーカーとなる。

Claims (26)

  1. プロレニン受容体であることを特徴とするがんマーカー。
  2. 消化器がんマーカーまたは脳腫瘍マーカーである、請求項１記載のがんマーカー。
  3. 前記消化器がんマーカーが、膵臓がんマーカー、胃がんマーカー、大腸がんマーカーおよび肝臓がんマーカーからなる群から選択された少なくとも１つのがんマーカーである、請求項２記載のがんマーカー。
  4. 前記脳腫瘍マーカーが、グリオーママーカー、アストロサイトーママーカー、中枢神経系原発悪性リンパ腫マーカーおよび海綿上血管腫マーカーからなる群から選択された少なくとも１つのがんマーカーである、請求項２記載のがんマーカー。
  5. 被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする、がんの罹患危険度を試験する方法。
  6. 前記がんが、消化器がんまたは脳腫瘍である、請求項５記載の試験方法。
  7. 前記消化器がんが、膵臓がん、胃がん、大腸がんおよび肝臓がんからなる群から選択された少なくとも１つである、請求項６記載の試験方法。
  8. 前記脳腫瘍が、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項６記載の試験方法。
  9. さらに、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含み、前記基準値が、健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量またはがん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量である、請求項５から８のいずれか一項に記載の試験方法。
  10. 前記試験工程において、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合または、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合に、前記被検者は、がんに罹患する危険性があるとする、請求項９記載の試験方法。
  11. 前記生体試料が、血液である、請求項５から１０いずれか一項に記載の試験方法。
  12. 前記生体試料が、消化器または脳由来の試料である、請求項５から１０のいずれか一項に記載の試験方法。
  13. 前記消化器が、膵臓、胃、大腸および肝臓からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１２記載の試験方法。
  14. 前記脳が、大脳、側頭葉、後頭葉、小脳、大脳基底核および間葉組織からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１２記載の試験方法。
  15. プロレニン受容体の発現量が、そのｍＲＮＡの発現量およびタンパク質の発現量の少なくとも一方である、請求項５から１４のいずれか一項に記載の試験方法。
  16. 請求項５から１５のいずれか一項に記載のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする試験試薬。
  17. 前記発現測定試薬が、プロレニン受容体タンパク質に結合する物質、およびプロレニン受容体と前記結合物質との結合を検出する検出試薬を含む、請求項１６記載の試験試薬。
  18. 前記発現測定試薬が、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡを逆転写により増幅する試薬である、請求項１６記載の試験試薬。
  19. プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とするがん治療薬。
  20. 前記結合物質が、プロレニン受容体に対する抗体である、請求項１９記載のがん治療薬。
  21. 前記発現抑制物質が、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制する物質、発現したｍＲＮＡを切断する物質および発現したｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１９記載のがん治療薬。
  22. 請求項１９から２１のいずれか一項に記載のがん治療薬を、患者に投与する工程を含むことを特徴とするがんの治療方法。
  23. がんの治療用候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法。
  24. プロレニン受容体に前記被検物質を接触させる工程、プロレニン受容体と前記被検物質との結合を検出する工程、およびプロレニン受容体に結合した前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程を含む、請求項２３記載のスクリーニング方法。
  25. プロレニン受容体の発現系に前記被検物質を共存させて、プロレニン受容体を発現させる工程、前記発現系におけるプロレニン受容体の発現を検出する工程、およびプロレニン受容体の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも低い前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程とを含む、請求項２３記載のスクリーニング方法。
  26. 前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
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