麻风树的遗传转化

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求享有2008年12月15日提交的美国临时专利申请系列号61/122，454 的优先权，该临时专利申请并入本文作为参考。

[0003] 发明背景

[0004] 本发明涉及植物再生和转化领域，尤其涉及用于麻风树属（Jatropha)的再生和转化的方法。更具体地，本发明涉及用于麻风树（Jatropha curcas)植物的再生和转化的方法和培养基组合物。

[0005] 本文中用于说明本发明背景或提供有关实施的补充细节的出版物和其他材料并入本文作为参考，并且为了方便起见分别在文献目录中分组。

[0006] 世界面临着化石燃料供给日益减少和温室作用不断恶化的问题。亟需增加可再生能源的产生和消耗。对于许多国家寻找替代能源来说，生物燃料已经公认为国家的优先项目以满足它们的能源安全需要，同时有助于减少造成温室作用的(X)2排放。对生物燃料的需要导致食物生产的压力增加。例如，为了满足德国政府要求的德国2017年的生物燃料需求，该国的全部农用土地都将用于生长生物能作物，而没有留下土地用于食物生产。为了减轻对土地的这种竞争并满足我们对可再生燃料的需要，亟需利用边缘土地来进行生物能产生。

[0007] 麻风树是属于大戟科的小木本植物。麻风树的数种独特性质使其成为用于生物柴油生产的理想植物。这些性质包括其迅速生长、容易繁殖、种子的低成本、高含油量、短孕育期、广泛的适应性、干旱耐受性和在退化土壤上茁壮成长的能力。此外，其植株大小使种子的收集非常方便(Jones, 1991 ；Sujatha et al. ,2008) „

[0008] 但是，麻风树具有几个缺点，这限制了它的广泛应用。植物的产量受到不利的雄花与雌花比的限制，并且其含油量没有通过育种进行优化。该植物对生物应激如病毒 (Narayanna et al.，2007)、真菌和细菌病原体，和非生物应激特别是寒冷和干旱也是敏感的（http colon www dot jatropha dot org)。在植物的种子和叶子中存在数种毒性组分 (例如蛋白毒素、麻风树毒蛋白和致癌剂佛波酯）给麻风树产业的农民和生物加工工人带来健康危害。

[0009] 改进植物质量性状的传统方法是通过培育优良的基因型。但是，利用分子标记物对遗传多样性的评价公开了当地麻风树（J. curcas)种质中的低附件间 (inter-accessional)变异性(Sujatha et al. ,2008) „因此，亟需诸如遗传转化方法的替代性遗传操作工具来为该作物的遗传改良提供另外的策略。土壤杆菌（Agrobacterium)介导的遗传转化已经成为产生转基因植物的主要选择。但是，很少有报道涉及属于大戟科植物的土壤杆菌介导的转化的应用。唯一报道的用于麻风树属的转化方案（Li et al. ,2008) 在我们手中是无法重复的。

[0010] 因此，亟需转化麻风树的方法以便为该作物种类的遗传改良提供工具。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明涉及用于麻风树属的植物，更具体的是麻风树的再生和土壤杆菌介导的转化的方法。

[0013] 因此，在一方面，本发明通过优化组织培养和枝条（shoot)再生条件提供了有效且可重复的用于麻风树的植物再生方案。这种再生方案已经与土壤杆菌介导的转化联用以产生Ttl转基因麻风树属枝条/植物。本发明还提供了利用Ttl转基因枝条作为接穗和非转基因植株作为根状茎的嫁接步骤的用途。这种嫁接步骤不需要再生的植物在组织培养中产生根，并且显著地缩短了转基因枝条开花和产生T1种子的时间。

[0014] 在一实施方案中，本发明提供了一种用于再生麻风树植物的方法。根据该实施方案，从5-7天龄幼苗的子叶获得外植体。将外植体在愈伤组织形成培养基上培养，所述愈伤组织形成培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-苄氨基嘌呤（6-BA)和1-萘乙酸（NAA)。然后将愈伤组织转移到第一枝条再生培养基，其包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、腺嘌呤、蔗糖以及作为植物激素的6-BA和3-吲哚丁酸（IBA)。将从愈伤组织再生的任何枝条转移到第二枝条再生培养基，其包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-BA、IBA和赤霉酸（GA3)。将不具有再生的枝条的愈伤组织转移到第三枝条再生培养基，其包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-BA和IBA以用于枝条的进一步再生。将已经再生的枝条转移到枝条伸长（elongation)培养基，其包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-BA和GA3以用于伸长和芽增殖。将伸长的枝条转移到生根培养基，其包含MS无机盐、维生素B5、蔗糖和IBA。生根后，将幼苗转移到土壤中。可选的， 可以将伸长的枝条嫁接到麻风树的根状茎。

[0015] 在第二实施方案中，本发明提供了一种用于土壤杆菌介导的麻风树植物转化的方法。根据该实施方案，土壤杆菌介导的麻风树转化利用与上述用于麻风树再生的基本方案相同的基本方案。为了进行转化，首先将外植体与土壤杆菌细胞共培养，然后转移到愈伤组织形成培养基，随后转移到如上所述的枝条再生培养基、枝条伸长培养基和生根培养基。共培养培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖、葡萄糖、乙酰丁香酮以及作为植物激素的6-BA和NAA。愈伤组织形成培养基与用于再生的培养基相同，除了它还包含选择剂和土壤杆菌铲除剂。类似地，枝条再生培养基还包含选择剂和土壤杆菌铲除剂。为了转化，在避光条件下的愈伤组织形成培养基上进行培养。可以将常规选择剂用于土壤杆菌介导的麻风树植物转化。选择剂的实例包括但不限于除草剂BASTA、潮霉素等。

附图说明

[0016] 图1示出本发明的土壤杆菌介导的麻风树属转化方法。左边所列的时间尺度使用生根方案，而右边使用嫁接方案。

[0017] 图2示出用于进行本发明的转化方法的土壤杆菌转化载体。

[0018] 图3A-;3K示出麻风树的转化、再生、开花和出苗。图3A ：麻风树MD5天的幼苗适于转化。图3B:愈伤组织形成和枝条产生。左侧，用不携带任何载体的土壤杆菌接种的子叶。 右侧，用携带含性状基因的载体的土壤杆菌接种的子叶。注意来自外植体的枝条再生。图 3C ：褐色子叶表面上潮霉素抗性愈伤组织和枝条样器官的放大图。图3D ：麻风树的潮霉素抗性枝条的再生。图3E:枝条伸长。图3F:转基因枝条的生根。图3G:转基因麻风树的高生根效率。图3H:土壤中生长的转基因麻风树。图31和图3J:嫁接于非转基因根状茎上的转基因麻风树枝条。白色箭头指示嫁接部位。图I ：转基因麻风树开花和结籽。比例尺表不 IOmm0

[0019] 图4示出hyg-抗性ubi ：GFP麻风树植物的PCR分析。泳道-：野生型麻风树属对照；泳道+ :P1300-GFP的质粒DNA ；泳道#1_#10来自潮霉素抗性麻风树属的枝条叶。

[0020] 图5A-5P示出Ttl植物根部（图5B、图5D)、雄花（图5F、图5H)以及受精后3周T1 种子（图J、图K、图L、图N、图0、图P)中GFP的表达。图A、图C、图E、图G、图I和图M是每种植物器官的野生型对照。比例尺表示2mm。

[0021] 图6示出BASTA-抗性;35S: JcWRIl麻风树植物的PCR分析。泳道M，DNA ladder ；泳道#1-#7来自BASTA抗性麻风树属枝条叶；泳道_，野生型对照；泳道+，pBA002-MYC-JcWRIl 的质粒DNA。

[0022] 图7示出利用抗HA抗体，表达35S:RcFAH12和35S:JcDGATl的转基因麻风树属植物的叶中RcFAH12和JcDGATI水平的蛋白印迹分析。底部：作为上样对照的RUBL(RUBISC0 的大亚基）的考马斯亮蓝染色。

[0023] 发明详述

[0024] 本发明涉及用于麻风树属的植物，更具体的是麻风树的再生和土壤杆菌介导的转化的方法。

[0025] 在一方面，本发明提供了一种用于再生麻风树属植物的方法。根据该实施方案，外植体获得自约5天至约12天龄幼苗的子叶，优选约5-7天龄幼苗。培养在25°C 士2°C和光照下进行，1¾光照（100 μ mol/tfS)/»!避光循环。幼苗在组织培养基中生长。利用常规技术将麻风树的种仁表面灭菌，在避光条件下浸于无菌水中过夜。使不含胚乳的胚在不含激素的发芽培养基上发芽，其中根与培养基接触。发芽培养基包含1/2浓度的MS无机盐、维生素B5和蔗糖。蔗糖浓度为约5% (w/v) 0发芽培养基还可以包含缓冲液。在一实施方案中，缓冲液为约0.5g/L的2-(4-吗啉代）乙磺酸（MES)，pH为约5. 6。发芽培养基用琼脂或植物凝胶（Phytogel)固化。培养在25°C 士 1°C和光照下进行，1¾光照（lOOymol/ m2S) /8h避光循环。

[0026] 将外植体在愈伤组织形成培养基中避光培养约2周至约3周，优选约3周。愈伤组织形成培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-苄氨基嘌呤（6-BA)和1-萘乙酸（NAA)。柠檬酸的浓度为约10mg/L至约 30mg/L，优选约10mg/L。谷氨酰胺的浓度为约150mg/L至约200mg/L，优选约150mg/L。酪蛋白水解物的浓度为约100mg/L。蔗糖的浓度为约3%。6-BA的浓度为约1. 5mg/L。NAA的浓度为约0. 05mg/L。愈伤组织形成培养基优选还包含MgCl2，其浓度为约0. 5g/L至约0. 95g/ L，优选0.5g/L。愈伤组织形成培养基的pH为约5. 8至约6.0。愈伤组织形成培养基用琼脂或植物凝胶（Phytagel)固化，优选植物凝胶，其浓度为约2. 5g/L至约3g/L，优选2. 5g/ L0

[0027] 然后将愈伤组织转移到第一枝条再生培养基，并在光照条件下培养约2周至约3 周，优选约3周。第一枝条再生培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、腺嘌呤、蔗糖以及作为植物激素的6-BA和3-吲哚丁酸（IBA)。柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物和6-BA的浓度与愈伤组织形成培养基中的相同。腺嘌呤的浓度为约ang/ L至约％ig/L，优选约ang/L。IBA的浓度为约0. 05mg/L。第一枝条再生培养基优选还包含 MgCl2,其浓度为约0. 5g/L至约0. 95g/L，优选0. 5g/L。第一枝条再生培养基的pH为约5. 8 至约6. 0。第一枝条再生培养基用琼脂或植物凝胶固化，优选植物凝胶，其浓度为约2. 5g/L 至约3g/L，优选2. 5g/L。

[0028] 将从愈伤组织再生的任何枝条转移到第二枝条再生培养基，并在光照条件下培养约3周至约4周，优选约4周。第二枝条再生培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-BA、IBA和赤霉酸（GA3)。柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、6-BA和IBA的浓度与第一枝条再生培养基中的相同。GA3的浓度为约 0. 05mg/L至约0. 5mg/L，优选约0. 5mg/L。第二枝条再生培养基优选还包含浓度为约0. 5g/ L的MgCl2。第二枝条再生培养基的pH为约5. 8至约6.0。第二枝条再生培养基用琼脂或植物凝胶固化，优选琼脂，其浓度为约6. 5g/L至约7g/L，优选7g/L。

[0029] 将不具有再生的枝条的愈伤组织转移到第三枝条再生培养基，并在光照条件下培养约4周至约5周，优选约4周。第三枝条再生培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、 谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-BA和IBA以用于枝条的进一步再生。 柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、6-BA和IBA的浓度与第一枝条再生培养基中的相同。第三枝条再生培养基优选还包含MgCl2,其浓度为约0. 5g/L至约0. 95g/L，优选0. 5g/L。第三枝条再生培养基的PH为约5. 8至约6. 0。第三枝条再生培养基用琼脂或植物凝胶固化，优选植物凝胶，其浓度为约2. 5g/L至约3g/L，优选2. 5g/L。

[0030] 将在第二枝条再生培养基上再生的枝条转移到枝条伸长培养基，并在光照条件下培养约2周至约3周，优选约2周。枝条伸长培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、 谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖以及作为植物激素的6-BA和GA3以用于伸长和芽增殖。柠檬酸、谷氨酰胺和酪蛋白水解物的浓度与第一枝条再生培养基中的相同。6-BA的浓度为约 0. 3mg/L。GA3的浓度为约0. lmg/L至约0. 5mg/L,优选约0. lmg/L。枝条伸长培养基的pH 为约5. 8至约6. 0。枝条伸长培养基用琼脂或植物凝胶固化，优选琼脂，其浓度为约6. 5g/L 至约7g/L，优选7g/L。

[0031] 将伸长的枝条转移到生根培养基，并在光照条件下培养约3周至约4周，优选约4 周。生根培养基包含MS无机盐、维生素B5、蔗糖和IBA。蔗糖的浓度为约3%。IBA的浓度为约0.07mg/L。生根培养基的pH为约5. 6。生根培养基用琼脂或植物凝胶固化，优选浓度为约2. 2g/L的植物凝胶。生根后，将幼苗转移到土壤中。可选地，可以利用常规技术将伸长的枝条嫁接到麻风树根状茎，以代替转移到生根培养基。

[0032] 在第二方面，本发明提供了一种用于土壤杆菌介导的麻风树植物转化的方法。根据该实施方案，土壤杆菌介导的麻风树转化利用与上述用于麻风树再生的基本方案相同的基本方案。利用诸如电穿孔的常规技术将含有所关注的DNA的载体导入土壤杆菌。在使用前，利用常规技术培养转化的土壤杆菌细胞。根据一种这样的技术，将土壤杆菌细胞接种到添加了卡那霉素和羧苄西林（carbicillin)的LB培养基。卡那霉素的浓度为约25mg/L至约100mg/L，优选约50mg/L。羧苄西林的浓度为约50mg/L至约100mg/L，优选约100mg/L。 使土壤杆菌细胞在^°C，250rpm条件下生长过夜。通过离心收集土壤杆菌细胞，再将其重悬浮于添加了蔗糖、葡萄糖、乙酰丁香酮（AS) ,6-BA和NAA的液体MS培养基中。蔗糖的浓度为约30g/L。葡萄糖的浓度为约10g/L。AS的浓度为约20mg/L。6-BA的浓度为约1. 5mg/ L0 NAA的浓度为约0. 05mg/L至约0. lmg/L，优选约0. lmg/L。

[0033] 为了进行转化，首先将外植体与土壤杆菌细胞共培养，然后转移到愈伤组织形成培养基，随后转移到如上所述的枝条再生培养基、枝条伸长培养基和生根培养基。共培养在避光条件下进行约2-3天。共培养培养基包含MS无机盐、维生素B5、柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物、蔗糖、AS以及作为植物激素的6-BA和NAA。柠檬酸、谷氨酰胺、酪蛋白水解物和蔗糖的浓度与愈伤组织形成培养基中的相同。AS的浓度为约20mg/L。6-BA的浓度为约 1. 5mg/L。NAA的浓度为约0. 05mg/L至约0. lmg/L，优选约0. 05mg/L。共培养培养基还可以包含合适的缓冲液。在一实施方案中，缓冲液为MES。MES的浓度为约0. 5g/L，pH为约5. 0 至约5. 2。

[0034] 用于土壤杆菌介导的麻风树转化的愈伤组织形成培养基与用于再生的愈伤组织形成培养基相同，除了它还包含选择剂和土壤杆菌铲除剂。例如下文所述，选择剂可以为针对包含在转化的土壤杆菌内的标记基因的任何选择剂。在一实施方案中，选择剂为潮霉素，其浓度为约3mg/L至约5mg/L，优选3. 5mg/L。在另一实施方案中，选择剂为草铵膦，其浓度为约lmg/L。土壤杆菌铲除剂可以为任何常规铲除剂，例如头孢噻肟（cefotaxinme) 等。在一实施方案中，土壤杆菌铲除剂为头孢噻肟，其浓度为约100mg/L至约150mg/L，优选 100mg/L。用于土壤杆菌介导的转化的愈伤组织形成培养基上的培养在避光条件下进行约 2周至约3周，优选约3周。

[0035] 然后如上文所述，按照麻风树再生的描述处理愈伤组织，转移到第一枝条再生培养基、第二枝条再生培养基、第三枝条再生培养基、枝条伸长培养基、生根培养基上在光照条件下培养或嫁接。用于土壤杆菌介导的麻风树转化的第一枝条再生培养基与用于再生的第一枝条再生培养基相同，除了它还包含选择剂和土壤杆菌铲除剂。例如下文所述，选择剂可以为针对包含在转化的土壤杆菌内的标记基因的任何选择剂。在一实施方案中，选择剂为潮霉素，其浓度为约:3mg/L至约5mg/L，优选3. 5mg/L。在另一实施方案中，选择剂为草铵膦，其浓度为约lmg/L。土壤杆菌铲除剂可以为任何常规铲除剂，例如头孢噻肟。在一实施方案中，土壤杆菌铲除剂为头孢噻肟，其浓度为约100mg/L至约150mg/L，优选100mg/L。

[0036] 用于土壤杆菌介导的麻风树转化的第二枝条再生培养基与用于再生的第二枝条再生培养基相同，除了它还包含选择剂和土壤杆菌铲除剂。例如下文所述，选择剂可以为针对包含在转化的土壤杆菌内的标记基因的任何选择剂。在一实施方案中，选择剂为潮霉素， 其浓度为约細g/L至约5mg/L，优选％ig/L。在另一实施方案中，选择剂为草铵膦，其浓度为约lmg/L。土壤杆菌铲除剂可以为任何常规铲除剂，例如头孢噻肟。在一实施方案中，土壤杆菌铲除剂为头孢噻肟，其浓度为约100mg/L至约150mg/L，优选100mg/L。

[0037] 用于土壤杆菌介导的麻风树转化的第三枝条再生培养基与用于再生的第三枝条再生培养基相同，除了它还包含选择剂和土壤杆菌铲除剂。例如下文所述，选择剂可以为针对包含在转化的土壤杆菌内的标记基因的任何选择剂。在一实施方案中，选择剂为潮霉素， 其浓度为约:3mg/L至约5mg/L，优选3. 5mg/L。在另一实施方案中，选择剂为草铵膦，其浓度为约lmg/L。土壤杆菌铲除剂可以为任何常规铲除剂，例如头孢噻肟。在一实施方案中，土壤杆菌铲除剂为头孢噻肟，其浓度为约100mg/L至约150mg/L，优选100mg/L。

[0038] 用于土壤杆菌介导的麻风树转化的枝条伸长培养基和生根培养基与用于再生的枝条伸长培养基和生根培养基相同。

[0039] 插入麻风树属植物的DNA(所关注的DNA)对于转化方法不重要。通常，导入植物的DNA是构建体的一部分。DNA可以是所关注的基因，例如蛋白的编码序列；或者它可以是能够调节基因表达的序列，例如反义序列、正义抑制序列或miRNA序列。构建体通常包含可操作地连接至所关注的DNA的5’端和/或所关注的DNA的3’端的调节区。含有所有这些元件的盒在本文中也称为表达盒。在表达盒构建体中，表达盒还可以含有5’前导序列。调节区（即启动子、转录调节区和翻译终止区）和/或编码信号锚定的多核苷酸对宿主细胞可以是天然的/类似的，或彼此是天然的/类似的。可选地，调节区和/或编码信号锚定的多核苷酸对宿主细胞可以是异源的，或彼此是异源的。参见，美国专利号7，205，453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/0M8616。表达盒还可以含有选择标记基因。参见， 美国专利号7，205, 453和美国专利申请公开号2006/0218670和2006/(^48616。

[0040] 通常，表达盒包含用于选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织。通常，植物选择标记基因通过合适的基因编码抗生素抗性，所述合适的基因包括至少一组编码抗生素壮观霉素抗性的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶 (spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（nptll)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶（hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶（als)基因。或者，植物选择标记基因编码除草剂抗性，如磺酰脲型除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2， 4-二氯苯氧基乙酸Q，4-D)抗性，所述选择标记基因包括编码诸如膦丝菌素或basta的抑制谷氨酰胺合成酶活动的除草剂抗性的基因（例如bar基因）。一般见WO 02/36782、美国专利号7，205，453及美国专利申请公开号2006/0M8616和2007/0143880，以及其中引用的那些参考文献。这个选择标记基因的列表不意味着限制。可以使用任何选择标记基因。

[0041] 大量启动子可用于实施本发明。可以基于期望的结果选择启动子。也就是说，核酸可以与组成型、组织优选型或其他启动子组合以用于在所关注的宿主细胞中表达。这类组成型启动子包括例如，Rsyn7的核心启动子（W0 99/48338和美国专利号6，072，050)； 核心 CaMV35S 启动子(Odell et al.，1985)；稻米肌动蛋白(McElroy et al.，1990)；泛素(Christensen and Quail，1989 禾口 Christensen et al. ,1992) ；pEMU(Last et al., 1991) ；MAS(Velten et al.，1984) ；ALS 启动子（美国专利号 5，659，026)等。其他组成型启动子包括例如，在美国专利号 5，608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785、 5，399，680,5, 268，463和5，608，142中公开的那些启动子。

[0042] 其他启动子包括诱导型启动子，尤其是病原体诱导型启动子。这类启动子包括来自致病相关蛋白（ra蛋白）的那些启动子，其在病原体感染后被诱导；例如，ra蛋白、SAR 蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。其他启动子包括在病原体感染部位或其附近局部表达的那些启动子。在其他实施方案中，启动子可以是创伤诱导型启动子。在其他实施方案中，可以通过应用外源化学调节物以使用化学调控的启动子来调节植物中基因的表达。启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学药品的应用诱导基因表达；或化学抑制型启动子，其中化学药品的应用抑制基因表达。此外，可以使用组织优选型启动子来靶向特定植物组织中所关注的多核苷酸的增强表达。这些启动子中的每一种描述于美国专利号 6，506，962,6, 575，814,6, 972，349 和 7，301，069 以及美国专利申请公开号 2007/0061917 和 2007/0143880。[0043] 在合适情况下，可以优化所关注的DNA以增加在转化的植物中的表达。也就是说， 可以使用植物优选的密码子来合成编码序列以提高表达。本领域提供合成植物优选基因的方法。参见，例如美国专利号5，380，831.5, 436，391和7，205，453以及美国专利申请公幵号 2006/0218670 和 2006/0248616。

[0044] 除非另外指出，本发明的实施使用以下常规技术：化学、分子生物学、微生物学、 重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学，这都在本领域技术范围内。参见，例如 Maniatis et al. ，1982，Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York) ；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， New York) ；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York) ；Ausubel et al. ,1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，包括目前的更新）； Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press, Oxford) ；Russell，1984，Molecular biology of plants :a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y.) ；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes， (Academic Press， New York，1992) ；Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press，New York，1991) ；Harlow and Lane，1988， Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, New York)； Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.1984) ；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984) ；Culture Of Animal Cells (R. I.Freshney, Alan R. Liss, Inc. ,1987) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press， 1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ；the treatise， Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y. ) ；Methods In Enzymology, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds.，Academic Press，London，1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.，1986)； Riott， Essential Immunology,6th Edition， Blackwell Scientific Publications， Oxford, 1988 ；Fire et al.，RNA Interference Technology :From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press，Cambridge，2005 ；Schepers，RNA Interference in Practice，Wiley-VCH,2005 ；Engelke, RNA Interference (RNAi) :The Nuts & Bolts of siRNA Technology，DNA Press,2003 ；Gott,RNA Interference，Editing， and Modification :Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology), Human Press,Totowa,NJ, 2004 ；SohailiGene Silencing by RNA Interference-Technology and Application，CRC，2004。

实施例

[0045] 本发明参考下列实施例进行描述，提供所述实施例是为了说明而不是意图以任何方式限制本发明。使用本领域公知的标准技术或下文具体描述的技术。

[0046] 实施例1材料和方法[0047] 植物材料和培养法：麻风树（L.)MD种子获得自印度尼西亚。除去外种皮后，将种仁用75% (ν/ν)乙醇表面灭菌60秒，随后浸入10% (v/v)H2O2中lh，然后用无菌水淋洗两次，最后于下在避光条件下浸入无菌水中过夜。使不含胚乳的胚在无激素的半浓度 Murashige 和 Skoog 盐（1/2MQ 培养基(Murashige and Skoog, 1962)上发芽，并在组织培养室中于25°C 士 2°C、l^i光照（100 μ mol/tfS)/»!避光循环条件下培养，其中根与培养基接触，所述培养基含有维生素Β5 (Gamborg et al.，1968)、5g/L蔗糖、0. 5g/L2_ (4-吗啉代） 乙磺酸（MES)和 2. 2g/L 植物凝胶（Sigma)，ρΗ 5. 6。

[0048] 培养基：本发明使用的培养基如下所示。

[0049] 培养基I (基础培养基）：使用MS主要盐、MS次要盐和维生素B5、10mg/L柠檬酸、 150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白酶促水解物、3% (w/v)蔗糖、0. 5g/L MgCl2 (只用于含有植物凝胶的培养基）与植物生长调节剂的组合。用IN KOH将培养基I调节为ρΗ 5.8-6.0， 用2.5g/L植物凝胶固化，并在121°C下高压灭菌20分钟。在添加到高压灭菌的培养基之前，将所有植物生长调节剂过滤灭菌。

[0050] 共培养培养基：基础培养基加20mg/L乙酰丁香酮（AS)、0. 5g/L MES、1. 5mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA)和 0. 05mg/L 1-萘乙酸（NAA)，ρΗ 5. 0-5. 2。

[0051] 愈伤组织形成培养基：基础培养基加1. 5mg/L 6_BA、0. 05mg/L NAA、作为植物转化选择剂的3. 5mg/L潮霉素（hyg，A. G scientific, SanDiego, CA)或用于清除土壤杆菌 (Agrobacteria)细胞的 lmg/L 草铵膦(BASTA,Crescent Chemical,NY)和 100mg/L 头孢噻肟（Cef)。

[0052] 枝条再生培养基I ：基础培养基加1. 5mg/L 6_ΒΑ、0· 05mg/L 3-吲哚丁酸(IBA)、 2mg/L腺嘌呤（腺嘌呤半硫酸盐，SIGMA)、3. 5mg/L Hyg或lmg/L草铵膦和Cef 100mg/L。

[0053] 枝条再生培养基II ：基础培养基加1. 5mg/L 6_BA、0. 05mg/L IBA、0. 5mg/L赤霉酸 (GA3) ,4mg/L Hyg或lmg/L草铵膦和lOOmg/L Cef 100，将植物凝胶变为7g/L琼脂。

[0054]枝条再生培养基 III ：基础培养基加 1. 5mg/L 6_BA、0. 05mg/L IBA、3. 5mg/L Hyg 或 lmg/L 草铵膦和 lOOmg/L Cef。

[0055] 枝条伸长培养基：基础培养基加0. 3mg/L 6_BA、0. lmg/L GA3,将植物凝胶变为7g/ L琼脂。

[0056] 生根培养基：MS主要盐、MS次要盐和维生素B5、3%蔗糖、0. 5g/LMES、0. 07mg/L ΙΒΑ、2· 2g/L 植物凝胶，ρΗ5· 6。

[0057]培养基 II ：液体 MS 培养基，添加了 10g/L 葡萄糖、0. 5g/L MES、20mg/L AS、1. 5mg/ L 6-BA、0. lmg/L NAA, pH 5. 0-5. 2。

[0058] RNA提取和分析：将新鲜叶或种子组织（IOOmg)在液氮中研磨，并用植物RNA纯化试剂Gnvitrogen)提取。利用Nanodrop (Thermo，USA)测量RNA浓度。DNase处理和逆转录（RT)反应按照（Qu et al.，2007)所述进行。

[0059] 土壤杆菌菌株和载体：通过对麻风树属种子cDNA文库测序来鉴定麻风树 WRINKLE 1 (JcffRI 1)和DGATl序列。JcWRI 1全长cDNA从麻风树种子第一链cDNA产物扩增，所用的两条引物：5，-AATCGGATCCTAATGAAGAGGTCTTCTGCT-3‘ (SEQ ID NO ：1)和 5，-TCATGTTAATT AATCAAACAGAATAGTTACAAGAAA-3 ’ (SEQ ID NO :2)(下划线的核苷酸为酶识别位点）。再将PCR产物插入用BamHI和I3ac I处理的pBAOO2-MYC载体以形成pBA002-MYC-JcffRI 1。JcDGAT 1全长cDNA从麻风树种子第一链cDNA产物扩增，所用的两条弓I 物：5’-CAATATCTAGACCATGACGATTTTGGAGACCACT-3’ (SEQ ID NO ：3)和 5?-TATTAGATCTGGTCT TAATTCAGCATTGCC-3，(SEQ ID NO :4)(下划线的核苷酸为酶识别位点）。再将PCR产物插入用 XbaI 和 BamHI 处理的 pBA002_HA 载体以形成 pBA002-JcDGATl_HA。RcFAHl2 全长 cDNA 从蓖麻子种子第一链cDNA产物扩增，所用的两条引物：5’ -CAATATCTAGACCATGGGAGGTGGTGGTC -3，(SEQ ID NO ：5)和 5’ -TGTAGGATCCGGATACTTGTTCCGGTACCAG-3’ (SEQ ID NO ：6)(下划线的核苷酸为酶识别位点）。再将PCR产物插入用)(bal和BamHI处理的pBA002_HA载体以形成pBA002-RcFAH12-HA。通过电穿孔（BIO-RAD，CA，USA)将载体导入土壤杆菌菌株AGLl。使用转化的土壤杆菌细胞接种液体LB培养基，并在，250rpm条件下生长过夜至最终OD595 =0. 7-1，所述培养基添加了 50mg/L卡那霉素（用于pCAMBIA 1300-GFP)或50mg/L壮观霉素（spectimycin)(用于 pBA002-MYC_WRI 1，pBA002-JcDGATl_HA，pBA002-RcFAH12_HA)和 100mg/L羧苄西林。通过在20°C下以4200rpm离心IOmin来收集土壤杆菌细胞。在共培养前，将细胞沉淀用培养基II重悬浮，并调节至OD595为0. 25-0. 35 (仅土壤杆菌AGL1)。

[0060] 麻风树叶子DNA的分离和基因型分析：将50mg新鲜麻风树叶子在液氮中破碎，并在添加 400yL CTAB 提取缓冲液（IOOmM Tris, pH 8. 0 ；1. 4M NaCl ；20mM EDTA ； 2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB))后在65°C下孵育1小时。用预冷的氯仿提取两次后，将DNA用异丙醇沉淀并通过离心收集。对于潮霉素基因基因型分析，所用的引物为 hyg5 ：5' -CGATGTAGGAGGGCGTGG-3‘ (SEQ ID NO ：7), hyg3 ：5' -ACTTCTACACAGCCATCGGT CC-3，(SEQ ID NO :8)。对于bar基因基因型分析，所用的引物为bar5 :5，-GTCTGCAC CATCGTCAACC-3，(SEQ ID NO ：9), bar3 ：5' -GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3，(SEQ ID NO: 10)。

[0061] 抗体和蛋白凝胶印迹分析：由Yin Zhongcao博士的实验室制备麻风树毒蛋白抗体。按照先前的描述（Qu et al. ,2007)进行蛋白印迹分析。通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离总植物蛋白。使用ECL过氧化物酶偶联的驴抗兔免疫球蛋白G作为二抗。使用ECL蛋白印迹检测试剂（GE healthcare)将免疫反应性条带显影。

[0062] 实施例2麻风树子叶外植体转化

[0063] 图1示出土壤杆菌介导的麻风树属转化方法，其在本实施例中进一步详细描述。 图2示出用于本实施例的土壤杆菌转化载体。

[0064] 共培养：将5-7天龄幼苗的子叶（实施例1 ；图3A)切成小块（5 X 5mm)，并用载有靶表达盒的土壤杆菌细胞（实施例1)在20ml培养基II中于25°C下孵育10-20min。然后将外植体转移到共培养培养基，在22°C下避光保持2-3天。共培养后，将外植体用无菌水淋洗若干次，之后用300mg/L头孢噻肟（cefotaxine)洗涤一次。将子叶组织吸水干燥，这通过将它们置于灭菌的纸垫上以去除过量的表面水完成。

[0065] 潮霉素抗性或草铵膦抗性愈伤组织的选择：共培养后，将外植体接种于愈伤组织形成培养基板上，并转移到避光条件，在25°C 士 1°C下保持3周。未转化和转化的外植体形成愈伤组织（图3B)，而一些在培养时形成愈伤组织（图:3B，右栏；图3C)。当在避光条件下培养时，未转化的外植体通常会变为褐色。

[0066] 枝条再生：将具有新出现的潮霉素抗性或草铵膦抗性愈伤组织的外植体转移到枝条再生培养基I，在25°C、l^i光照（100 μ HioVm2S1Va1避光循环条件下保持3周。本文描述的方法基于通过添加腺嘌呤从转化的愈伤组织的直接枝条诱导。而本文使用术语“再生”来描述从这类转化的愈伤组织的完整植物的再创造（re-creation)。尽管6_BA(6_苄基腺嘌呤）对枝条再生具有类似的作用，但在本文所述方法中其并不用于这一特定步骤。 此外，更高或更低的浓度，过早或过迟的腺嘌呤添加会使枝条再生更困难或异常的发芽 (shooting)。在替代性实施方案中，获得枝条再生的方法包括添加2mg/L加普通6-BA或其他腺嘌呤衍生物，例如2-异戊烯腺嘌呤。在这个时间段中，将从愈伤组织再生的任何枝条 (约40-50% )转移到枝条再生培养基II (图3D)。将不具有再生的枝条的愈伤组织转移到枝条再生培养基III，以用于枝条的进一步培养和再生。

[0067] 枝条伸长：4周后，将再生的枝条转移到枝条伸长培养基上以用于伸长和芽增殖 (图 3¾。

[0068] 生根：将长度为约2. 5cm的伸长的枝条根植于生根培养基（图3F)。通常需要超过 1个月来获得如图3F所示的根。我们的生根方案可以提供约45%的高生根效率（图3G)， 并且长度大于IOmm的一个主根可以成功转移到土壤中并获得大于90%的存活率（图3H)。

[0069] 嫁接：还可以将伸长的转基因枝条用作接穗来嫁接到非转基因根状茎。挑选健康和生长旺盛的麻风树植株作为根状茎。将接穗和根状茎切至形成层区，从而来自这两者的韧皮组织会在接合后连接。用封口膜（parafilm)缠绕嫁接接头（joint)，并用胶带固定。 将嫁接的麻风树植株在弱光强度、16h光照（50 μ HioVm2S1) /8h避光循环）和85%湿度条件下保持7天。嫁接到非转基因根状茎上的转基因麻风树枝条示于图31和3J。转基因麻风树植株在温室中表现出正常的开花和结籽（图I)。

[0070] 实施例3转基因麻风树的转化和分析

[0071] 利用本发明方法转化麻风树属以及从转化的细胞再生BASTA或潮霉素 (hygmycin)植株的实施例将在下文详细描述。简单来说，该方法要求提供异源DNA构建体， 其包含植物启动子、编码赋予诸如BASTA或潮霉素耐受性的选择优势的蛋白的DNA序列以及3’非翻译转录终止子区。DNA构建体包含可操作地连接到编码赋予BASTA或潮霉素耐受性的蛋白的DNA编码区的植物启动子，和3’终止信号。优选地，DNA构建体编码额外的所关注的基因。例如，DNA构建体可以包含这样的基因，其表达导致转化的植物中增加的产量或改变的脂肪酸含量。

[0072] 在下面的实例中，从用包含GFP基因的DNA构建体转化的组织获得了表达绿色荧光蛋白（GFP)的潮霉素耐受麻风树属植物。在如下所述的一些实例中，使用这种GFP基因和可以用作容易筛选的标记的其他基因，例如GUS、萤光素酶基因，仅仅因为可以容易地在转化的植物中检测到它们的表型。可以合理的预期通过使用标准分子生物学技术产生的DNA 构建体，可以使用本发明来获得表达几乎任何其他基因的麻风树属植物。在替代性实施方案中，用于获得转化的麻风树属植物的方法涉及两种DNA构建体的共转化，其中一种DNA构建体包含选择标记，例如BASTA或潮霉素耐受标记；而另外一种DNA构建体则包含所关注的基因。

[0073] 潮霉素抗性的推定（PUtative)GFP转基因麻风树属植物的转化和枝条再生根据实施例2描述的方法实现。利用实施例1描述的方法提取潮霉素抗性枝条的基因组DNA。 利用潮霉素基因引物对（SEQ ID NO :7和SEQ ID NO ：8)进行基因型分型。10个事件中的 9个是PCR阳性的，而非转化对照在CK泳道没有表现出条带（图4)。当用紫外光激发转基因麻风树属根时，快速筛选GFP表达（图:3B)。荧光表示，该新导入的GFP表达盒在Ttl麻风树属植物中表达。在ubi:GFP转基因麻风树属开花后，我们检查了花序中的GFP表达。雄花特别是花粉具有一些弱绿色荧光（图5H)。我们还检查了受精后3周的种子中的GFP表达。在整个转基因T1种子中，从外部（图5N，图50)或内部（图5P)可以观察到强GFP表达。这表明在转基因麻风树属的后代种子中GFP也较好地表达。

[0074] 甘油三酯（TAG)是植物将太阳能转化为化学能后主要能量储存形式。但当植物使用糖酵解的变体作为中间产物时，其合成的标准生化途径被认为是相当浪费的。 WRINKLED 1 (WRIl)是AP2/EREB家族的转录因子，其对种子保存过程的更具体方面，特别是糖变体的转录控制转化为TAG具有影响，因此在控制种子油含量方面表现出非常重要的作用。花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的拟南芥（Arabidopsis)WRIl cDNA表达导致种子油含量的10-20%增加。此外，WRINKLED1 cDNA的异位表达导致发育幼苗中甘油三酯的积累（Cernac and Benning，2004)。我们认为，麻风树属WRIl基因在麻风树属中的异位表达会导致更高的含油量。此外，当供应糖时，转基因幼苗可以发育为胚或胚样产油器官，就像脂质反应器，可以为其供应含糖液体底物以用于营养器官中组成型CaMV 35S启动子-驱动的WRIl的强表达。

[0075] 我们克隆了麻风树属WRIl的全长cDNA(JcWRI 1)，其从麻风树属种子RT-PCR产物 PCR扩增，这使用了用于源自麻风树属种子cDNA文库测序的JcWRIl克隆序列的PCR引物 (SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2)。全长 JcWRIl cDNA 序列示于 SEQ ID N0:11。构建了具有受CaMV 35S启动子控制的JcWRIl cDNA的过表达载体（pBA002_MYC-JcWRIl)，并将其转化入土壤杆菌AGLl菌株。可以利用MYC标签抗体来检测预计的6 XMYC标签融合WRIl。BASTA 抗性的推定JcWRIl过表达转基因麻风树属植物的转化和枝条再生根据实施例2描述的方法实现。利用实施例1描述的方法提取潮霉素抗性枝条的基因组DNA。利用BASTA基因引物对（SEQ ID NO :9和SEQ ID NO=IO)进行基因型分析。我们测试的所有事件都是PCR阳性的，而非转化对照在CK中没有表现出条带（图6)。

[0076] 植物和动物二酰甘油酰基转移酶（DGAT)负责将新生脂肪酸包装入TAG，其随后在从内质网出芽（bud off)的油体中积累。已经证实植物1型DGAT(DGATl)基因对于种子的含油量有重要贡献，这通过过表达和突变下调研究均得到证实（Zou et al.，2999 Jako et al.，2001)。我们认为，麻风树属DGATl基因在麻风树属中的异位表达会导致更高水平的含油量。

[0077] 我们根据DGATl克隆序列，利用PCR引物(SEQ ID NO ：3和SEQ ID NO ：4),从麻风树属种子RT-PCR产物克隆了全长麻风树属DGATl cDNA。全长JcDGAT 1 cDNA序列示于SEQ ID NO :13ο构建具有受CaMV 35S启动子控制的JcDGATl cDNA的过表达载体 (pBA002-JcDGATl-HA)，并将其转化入土壤杆菌AGLl菌株。可以利用HA标签抗体来检测预计的3XHA标签融合DGAT1。BASTA抗性的推定JcDGATl转基因麻风树属植物的转化和枝条再生根据实施例2描述的方法实现。利用实施例1描述的方法，通过基于HA抗体的蛋白印迹证实了 35S-JcDGATl表达（图7)。在3个转基因麻风树属泳道的2条泳道中可以观察到HA特异性条带。

[0078] 在植物来源的工业原料的许多情况和应用中可以使用植物油（和它们的衍生物）。与不可再生的石油相比，可再生的性质使得它们对于环境关注是个问题的全损耗应用的许多工业应用特别具有吸引力。蓖麻（Ricinus communis)油在运输、化妆品和医药以及制造工业中有很多应用。蓖麻油含有超过90%的蓖麻油酸，其是单不饱和的18碳脂肪酸。 它是不寻常的，因为它在第十二碳上具有羟基功能团。这个功能团造成蓖麻油酸（和蓖麻油)不寻常的极性(http colon en dot wikipedia dot org slash wiki slash Castor— oil)。一种特定的酶：脂肪酸羟化酶12(FAH12)负责加入羟基以代替正常的FAD2功能来在第十二碳上引入不饱和带（van de Loo et al.，1995)。与缺乏羟基的其他种子油相比， 蓖麻油的价格更高。尽管对蓖麻油的需求广泛，但是该作物的种植受到限制，这是由于毒素 (蓖麻毒蛋白）和变应原性蛋白的存在，因此蓖麻油的成本是比较高的。转基因外源FAH12 可以在拟南芥种子中产生羟基蓖麻油（Lu et al.，2006)。我们认为，蓖麻子FAH12基因在麻风树属中的异位表达会弓I起蓖麻油的产生。

[0079] 我们根据FAH12 CDS序列，利用PCR引物（SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6)，从蓖麻子种子RT-PCR产物克隆了全长蓖麻子FAH12 cDNA (RcFAHl2)。全长RcFAHl2 cDNA序列示于SEQ ID NO :15ο构建了具有受CaMV 35S启动子控制的RcFAH12 cDNA的过表达载体 (pBA002-RcFAH12-HA)，并将其转化入土壤杆菌AGLl菌株。可以利用HA标签抗体来检测预计的3XHA标签融合RcFAH12。BASTA抗性的推定RcFAH12转基因麻风树属植物的转化和枝条再生根据实施例2描述的方法实现。利用实施例1描述的方法，通过基于HA抗体的蛋白印迹证实了 35S-RcFAH12表达。在7个转基因麻风树属泳道的5条泳道中可以观察到HA 特异性条带（图7)。两个泳道#2和#5，具有非常高的FAH12-HA融合表达蛋白水平。

[0080] 在描述本发明的背景（尤其是所附权利要求的背景）下，术语“一个（a)”和“一个（an)”及“这个（the)”以及类似的所指对象的使用应理解为包括单数和复数，除非在本文中另外指出或根据背景明显抵触。除非另作说明，术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有” 应理解为开放式的术语（即，表示“包括但不限于”）。除非本文另外指出，本文数值范围的描述仅旨在作为分别涉及属于所述范围中的每个单独值的简写方法，每个单独值被包括进说明书就如同它是在本文中单独描述的。例如，如果公开了范围10-15，那么11、12、13和 14也被公开。本文描述的所有方法可以按照任何合适的顺序进行，除非本文另外指出，或另外根据背景明显抵触。除非另有要求，本文提供的任何和所有实例或示例性语言（如，“例如”）的使用仅仅是为了更好地说明本发明，而不是为了给本发明的范围做出限制。说明书中没有语言应理解为指示任何未要求的要素是实施本发明必需的。

[0081] 应理解本发明的方法和组合物可以并入各种形式的实施方案，本文只公开了其中一些。本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知用于实施本发明的最佳方式。在阅读上述说明书后，这些实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。本发明人预期有经验的技术人员酌情使用这样的变化，并且本发明人认为可以在除本文的具体描述之外实施本发明。因此，本发明包括适用法律许可的所附权利要求中叙述的主题的所有修饰和等同物。此外，本发明包括上述元素以其所有可能变化的任何组合，除非本文另外指出，或根据背景明显抵触。

[0082] 文献目录

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