[0001] [0001]
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrofluidisches Modul zur Analyse dreidimensionaler Strukturen sowie ein System zur Analyse dreidimensionaler Strukturen mit einem solchen mikrofluidischen Modul und ein Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen unter Verwendung eines solchen mikrofluidischen Moduls. The present invention relates to a microfluidic module for analyzing three-dimensional structures as well as a system for analyzing three-dimensional structures with such microfluidic module and a method for analyzing three-dimensional structures using such a microfluidic module. Beispiele der Erfindung beziehen sich insbesondere auf entsprechende Module, Systeme und Verfahren, die zur Analyse organischer Materialen, wie z. B. von Zellverbänden, Gewebeproben, Biopsiematerial, großen Einzellern und/oder Kleinstlebewesen geeignet sind. Embodiments of the invention relate specifically to the respective modules, systems and procedures, which are suitable for the analysis of organic materials, such. As cell aggregates, tissue samples, biopsy material, large individual learning and / or microorganisms.
[0002] [0002]
Die meisten zellbasierten biomedizinischen Studien basieren auf dem Einsatz zweidimensionaler Zellkulturen, die als Monoschicht bzw. Monolayer auf Glas- oder Kunststoffoberflächen kultiviert und untersucht werden. Most cell-based biomedical studies are based on the use of two-dimensional cell cultures which are cultured and analyzed as a single layer or monolayer on glass or plastic surfaces. Für viele Fragestellungen hat sich eine solche Vorgehensweise jedoch als zu artifiziell erwiesen, da die fehlende dreidimensionale Architektur des Gewebes eine zu große Vereinfachung darstellt. For many questions, such an approach has, however, proved to be too artificial, since the lack of three-dimensional architecture of the tissue is an oversimplification. Dies äußert sich z. B. darin, dass Zellen, die in Zell-Monoschichten kultiviert werden, häufig ein verändertes Expressionsmuster von Zelladhäsionsmolekülen und gewebespezifischen Proteinen zeigen, eine veränderte interzelluläre Kommunikation aufweisen und nur noch rudimentär die In-Vivo-Situation widerspiegeln. This is reflected, for. Example is that cells cultured in cell monolayers, often show an altered pattern of expression of cell adhesion molecules and tissue-specific proteins have altered intercellular communication and only rudimentary reflect the in vivo situation. Die Diffusionsverhältnisse und die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sind gänzlich anders als in realen Geweben. The diffusion conditions and the supply of oxygen and nutrients are completely different than in real tissues. 3D-Zellverbände, wie beispielsweise nicht-vaskularisierte multizelluläre Sphäroide (MCS), dh sphärische Zellaggregate aus mehreren Tausend Zellen, gelten heute als das deutlich bessere, wenngleich komplexere Gewebe- und auch Tumormodell und werden als Brückentechnologie zwischen 2D-Zellkulturen und Tierversuchen angesehen. 3D cell aggregates, such as non-vascularized multicellular spheroids (MCS), ie spherical cell aggregates of several thousand cells, are considered today as the much better, although more complex tissue and tumor model and are considered as a bridging technology between 2D cell culture and animal experiments. Diesbezüglich sei beispielsweise auf Pampaloni, F., EG Reynaud, und EH Stelzer, Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(10): S. 839–845 , verwiesen Bei diesem Modell interagieren die Zellen nicht mit einer künstlichen In-Vitro-Oberfläche, sondern ausschließlich mit den im Sphäroid benachbarten Zellen oder dem umgebenden Medium. In this regard, for example, is on Pampaloni, F. Reynaud EG and EH Stelzer, Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8 (10): p 839-845, referenced in this model do not interact with the cells with an artificial in-vitro surface, but only with the neighboring cells in the spheroid or the surrounding medium. Im Inneren des multizellulären Sphäroids bildet sich eine gewebeähnliche Mikroumgebung, die jedoch wegen der fehlenden Vaskularisierung und der alleinigen Versorgung über die Oberfläche lokal sehr verschieden ist. Inside the multicellular spheroid, a tissue-like microenvironment, which is however locally because of the lack of vascularisation and the sole supply over the surface very different forms.
[0003] [0003]
In den vergangenen Jahren haben sich drei grundsätzlich Ansätze zur Untersuchung von Sphäroiden herauskristallisiert. In recent years, three principle approaches to the study of spheroids have emerged.
[0004] [0004]
Der erste Ansatz besteht in der Einführung von Mikroelektroden in das Sphäroid, um durch ortsaufgelöste elektrochemische Detektion die Analytverteilungen, vornehmlich Sauerstoff, zu bestimmen. The first approach is the introduction of micro-electrodes in the spheroid, in order, primarily oxygen to be determined by spatially resolved detection of the electrochemical Analytverteilungen. Diesbezüglich wird auf Kunz-Schughart, LA, et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278(4): S. C765–780 und Schwachhofer, JH, et al., Anticancer Res, 1991. 11(1): S. 273–279 , verwiesen. In this regard, on Kunz-Schughart, LA, et al, Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278 (4): pp. C765-780 and Schwachhofer, JH, et al, Anticancer Res, 1991. 11 (1).: pp 273-279, referred to.
[0005] [0005]
Der zweite Ansatz besteht darin, Sphäroide nach einer schnellen Kryofixierung mithilfe eines Mikrotoms in μm-dicke Scheiben zu schneiden, was als sogenanntes Cryo-Sectioning bezeichnet wird, und die Analytverteilung zweidimensional in den viel besser zugänglichen Schnitten fixierter Proben zu bestimmen. The second approach is to cut spheroids after rapid cryofixation using a microtome in micron-thick slices, which is referred to as so-called cryo-sectioning, and to determine the distribution of species in the two-dimensional fixed much more accessible sections of samples. Unter Einsatz entsprechend spezifischer Enzymreaktionen lässt sich so die Verteilung wichtiger Metabolite im Inneren des Sphäroids bestimmen, wie bei Kunz-Schughart, LA, et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278(4): S. C765–C780 , beschrieben ist. Using according to specific enzyme reactions, the distribution of important metabolites inside the spheroid can thus determine, as Kunz-Schughart, LA, et al, Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278 (4): p. C765-C780 described, is. Durch Anfertigung von Kryoschnitten werden auch ultrastrukturelle, morphologische Untersuchungen an den Zellen im Inneren des multizellulären Sphäroids vorgenommen, um beispielsweise den Vitalzustand der Zellen, beispielsweise hinsichtlich des Vorliegens von Anzeichen von Apoptose oder Nekrose, positionsabhängig zu dokumentieren. Through preparation of cryosections and ultrastructural morphological studies of the cells are made within the multicellular spheroid, for example, the vital status of the cells, for example, for the presence of signs of apoptosis or necrosis, depending on the position to be documented.
[0006] [0006]
Der dritte Ansatz bezieht sich auf integrale nicht analyt-spezifische Ausleseverfahren, wie die elektrochemische Impedanzanalyse, wie sie bei Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369(1): S. 23–29 und Kyle, AH, CT Chan, und AI Minchinton, Biophys J, 1999. 16(5): S. 2640–2648 , beschrieben ist, oder die digitale Holographie, wie sie beispielsweise bei Nolte, DD, et al., J Lab Autom, 2011. 16(6): S. 431–442 und Yu, P., et al., Opt Lett, 2004. 29(1): S. 68–70 , beschrieben ist. The third approach is based on integral non-analyte specific selection procedures, such as electrochemical impedance analysis as in Thielecke, H., A. Mack, and A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369 (1) it: p 23 -29 and Kyle, AH, CT Chan, and AI Minchinton, Biophys J, 1999. 16 (5): pp 2640-2648, describes or digital holography, as described for example in Nolte, DD, et al. J Lab Auto, 2011. 16 (6): 431-442 S. and Yu, P., et al, Opt Lett, 2004. 29 (1):., p 68-70 is described. Solche integralen, nicht analyt-spezifischen Ausleseverfahren werden genutzt, um die innere dielektrische Struktur eines Sphäroids respektive seine dreidimensionale Morphologie zeitaufgelöst und mit hoher Präzision zu verfolgen und eine biologische Antwort auf einen gegebenen Stimulus zu quantifizieren. Such integral, non-analyte-specific selection procedures will be used to temporally resolved the inner dielectric structure of a spheroid, respectively, its three-dimensional morphology and track with high precision and quantify biological response to a given stimulus.
[0007] [0007]
Während die genannten ersten und zweiten Ansätze invasiv sind und/oder eine angemessene zeitlich aufgelöste Untersuchung der Sphäroide erlauben, sind die Techniken gemäß dem dritten Ansatz ohne Ortsauflösung (Impedanzanalyse) oder ohne Zugang zum Inneren des Sphäroids (Holographie). During the said first and second approaches are invasive and / or allow a reasonable time-resolved investigation of the spheroids, are the techniques according to the third approach without spatial resolution (impedance analysis), or without access to the inside of the spheroid (holography).
[0008] [0008]
Mithilfe von elektrischem Wechselstrom ist es möglich, nicht-invasiv in das Innere von Geweben oder auch Sphäroiden vorzudringen, um durch Messung ihrer dielektrischen Eigenschaften Rückschlüsse auf Vitalität und Zellstruktur zu ziehen, wie beispielsweise bei Fricke, H. und HJ Curtis, J Gen Physiol, 1935. 18(6): S. 821–836 und Fricke, H. und S. Morse, J Gen Physiol, 1925. 9(2): S. 153–167 , beschrieben ist. Use of alternating electric current, it is possible to non-invasively penetrate into the interior of tissues or spheroids to draw by measuring their dielectric properties of conclusions on vitality and cell structure, such as in Fricke, H. and HJ Curtis, J Gen Physiol, 1935. 18 (6): p 821-836 and Fricke, H. and S. Morse, J Gen Physiol, 1925. 9 (2): p 153-167, is described.
[0009] [0009]
Der Einsatz der Impedanzanalyse zur Untersuchung von Sphäroiden im Wirkstoff-Screening wurde erste durch sehr viel spätere technische Entwicklungen möglich, die es erlauben, einzelne Sphäroide zu untersuchen. The use of impedance analysis for the investigation of spheroids in drug screening was first carried much later technical developments available which allow to study individual spheroids. Hierfür sind in der Literatur im Wesentlichen drei Lösungen beschrieben. For this purpose, three solutions are described in the literature essentially. Die erste Lösung betrifft die Positionierung des Sphäroids an einer Engstelle einer konischen Glaskapillare, wobei mit Elektroden an beiden Enden der Kapillare eine impedanzspektroskopische Untersuchung des Sphäroids möglich wird, wie beispielsweise bei Bartholoma, P., et al., J Biomol Screen, 2005. 10(7): S. 705–714 und Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Biosens Bioelectron, 2001. 16(4–5): S. 261–269 sowie der The first solution concerns the positioning of the spheroid at a narrow point a tapered glass capillary with said electrodes at both ends of the capillary an impedance spectroscopic investigation of the spheroid is possible, such as in Bartholoma, P., et al., J Biomol Screen, 2005. 10 (7): pp 705-714 and Thielecke, H., A. Mack, and A. Robitzki, biosens Bioelectron, 2001. 16 (4-5): p 261-269 and US 2006/0199173 A1 US 2006/0199173 A1 , beschrieben ist. Is described. Eine zweite Lösung besteht in der Platzierung eines Sphäroids auf planaren Elektrodenstrukturen, siehe Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369(1): S. 23–29 . A second solution is the placement of a spheroid on planar electrode structures, see Thielecke, H., A. Mack, and A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369 (1): pp 23-29. Eine dritte Lösung besteht in der Platzierung eines Sphäroids in einer Kavität eines Siliziumchips mit Elektroden, die in die Seitenwände der Kavität integriert sind, siehe Kloss, D., et al., Biosens Bioelectron, 2008. 23(10): S. 1473–1480 und Kloss, D., et al., Lab Chip, 2008. 8(6): S. 879–884 . A third solution consists in the placement of a spheroid in a cavity of a silicon chip having electrodes that are integrated into the side walls of the cavity, see Shapiro, D., et al, Biosens Bioelectron, 2008, 23 (10): p. 1473- . 1480 Kloss, D., et al, Lab Chip, 2008, 8 (6): p 879-884. [0010] [0010]
Die Erfinder haben festgestellt, dass technisch mit dem Kapillaraufbau gemäß der ersten Lösung die Gefahr von Leckströmen an dem Sphäroid vorbei am besten zu eliminieren ist, wobei jedoch eine Parallelisierung von Experimenten im Sinne eines Screenings oder die Kombination mit einer mikroskopischen Analyse technisch schwierig sind. The inventors have found that technically the Kapillaraufbau according to the first solution, the risk of leakage currents of the spheroid is over a day to eliminate, but a parallelization of experiments for the purposes of screening or the combination with a microscopic analysis are technically difficult. Eine solche Parallelisierung oder mikroskopische Analyse könnten mit planaren Elektroden gemäß der zweiten Lösung oder Siliziumchips gemäß der dritten Lösung weitaus besser erreicht werden, wobei hier jedoch eine unter Umständen sehr viel aufwendigere, manuelle Positionierung der Sphäroide hinzutritt. Such parallelism or microscopic analysis could be achieved with planar electrodes according to the second solution or silicon chips according to the third solution much better but here is joined by a possibly much more complex, manual positioning of the spheroids. In allen oben genannten Studien konnte jedoch klar gezeigt werden, dass die elektrische Impedanzanalyse geeignet ist, den Einfluss von verschiedenen Stimulanzien auf die innere Struktur von Sphäroiden zu detektieren. However, it was clearly shown in all of the above studies show that the electrical impedance analysis is capable of detecting the influence of various stimulants on the internal structure of spheroids.
[0011] [0011]
Es besteht weiterhin ein Bedarf nach einem effizienten biomedizinischen Erkenntnisgewinn durch Untersuchungen an Sphäroidmodellen oder anderen 3D-Zellverbänden, wobei bioanalytische Verfahren erforderlich sind, mit denen die Reaktion der Zellverbände oder eine Änderung des inneren chemischen Milieus in Folge eines äußeren Stimulus, beispielsweise eines Toxins oder eines Wirkstoffkandidaten, quantitativ erfasst werden kann. There remains a need for an efficient biomedical knowledge gained through studies of Sphäroidmodellen or other 3D cell aggregates, which bioanalytical methods are required that allow the reaction cell aggregates or a change in the internal chemical environment as a result of an external stimulus, such as a toxin or a drug candidates that can be measured quantitatively. Aus bioanalytischer Sicht ist dabei die Größe der Zellverbände und die gute Abschirmung des inneren Milieus durch die Zellen der Peripherie eine große Herausforderung. For bioanalytical view the size of the cell aggregates and the good shielding of the internal environment of the cells of the periphery is a major challenge. Bislang ist eine angemessene aussagekräftige Untersuchungsmethode für 3D-Zellverbände, wie beispielsweise Sphäroide, mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung nicht verfügbar. So far it is a reasonable meaningful examination method for 3D cell aggregates, such as spheroids, not available simultaneously with high temporal and spatial resolution.
[0012] [0012]
Es existiert somit ein Bedarf nach einer verbesserten Analytik dreidimensionaler Strukturen, beispielsweise dreidimensionaler Zellverbände, wie z. B. multizellulärer Sphäroide, im Hinblick auf eine parallele zeitliche und örtliche Auflösung. There is thus a need for an improved analysis of three-dimensional structures, such as three-dimensional cell aggregates such. As multicellular spheroids, with a view to a parallel temporal and spatial resolution. Das Fehlen einer solchen Analytik ist eine der Limitierungen, die einem noch umfassenderen Einsatz von multizellulären Sphäroiden in der biomedizinischen Forschung und einem besseren grundlegenden Verständnis über Analytverteilung, Analytdynamik und strukturelle Dynamik in multizellulären Sphäroiden entgegensteht. The absence of such analysis is one of the limitations which preclude an even wider use of multicellular spheroids in biomedical research and a better basic understanding of distribution of species, Analytdynamik and structural dynamics in multicellular spheroids.
[0013] [0013]
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine mikrofluidisches Modul, ein System und ein Verfahren zu schaffen, die eine Untersuchung von dreidimensionalen Strukturen mit paralleler zeitlicher und örtlicher Auflösung ermöglichen. The object of the invention is to provide a microfluidic module, a system and method that enable an investigation of three-dimensional structures with parallel temporal and spatial resolution.
[0014] [0014]
Diese Aufgabe wird durch ein mikrofluidisches Modul nach Anspruch 1, ein System nach Anspruch 9 und ein Verfahren nach Anspruch 11 gelöst. This object is achieved by a microfluidic module as claimed in claim 1, a system according to claim 9 and a method according to claim 11.
[0015] [0015]
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung schaffen ein mikrofluidisches Modul zur Analyse dreidimensionaler Strukturen, mit folgenden Merkmalen: Embodiments of the present invention provide a microfluidic module for analyzing three-dimensional structures, with the following features:
einem Modulkörper mit einer Unterseite, die für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist; a module body having a bottom, which is configured for positioning on an object stage of a microscope;
einem in dem Modulkörper gebildeten Kanal, der einen Kanaleinlass, eine Engstelle und einen Kanalauslass aufweist, wobei der Kanal für eine hydrodynamische Positionierung der dreidimensionalen Struktur an der Engstelle beim Durchströmen des Kanals von dem Kanaleinlass zu dem Kanalauslass mit einer Flüssigkeit konfiguriert ist; a space formed in the module body channel having a channel inlet, a throat, and a duct outlet, said duct for a hydrodynamic positioning of the three-dimensional structure at the constriction while flowing through the channel is configured by the channel inlet to the duct outlet with a liquid; und and
einer strömungsmäßig vor der Engstelle an den Kanal angrenzenden ersten Elektrode und einer strömungsmäßig nach der Engstelle an den Kanal angrenzenden zweiten Elektrode, die konfiguriert sind, um impedimetrische Messungen bezüglich der an der Engstelle hydrodynamisch positionierten dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen, a constriction in terms of flow in front of the channel adjacent to the first electrode and an adjacent fluidly after the narrow part of the channel the second electrode, which are configured to allow impedimetric measurements relating to the three dimensional structure at the constriction hydro dynamically positioned,
wobei zumindest Abschnitte des Modulkörpers aus einem lichtdurchlässigen Material gebildet sind und wobei der Modulkörper konfiguriert ist, um eine mikroskopische Untersuchung der an der Engstelle hydrodynamisch positionierten dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen. wherein at least sections of the module body are formed of a light transmissive material, and wherein the module body is configured to allow a microscopic examination at the constriction of the hydrodynamic positioned three-dimensional structure.
[0016] [0016]
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein System zur Analyse dreidimensionaler Strukturen mit einem solchen mikrofluidischen Modul und folgenden Merkmalen: Embodiments of the invention provide a system for analyzing three-dimensional structures with such a microfluidic module and the following features:
einem Fluidkreislauf, der mit dem Kanal fluidisch gekoppelt ist und konfiguriert ist, um den Kanal mit einer Flüssigkeit zu durchströmen, so dass ein dreidimensionaler Körper hydrodynamisch an der Engstelle in dem Kanal positioniert wird; a fluid circuit, which is fluidically coupled with the channel and is configured to flow through the channel with a liquid, so that a three-dimensional body is hydrodynamically positioned at the constriction in the channel;
einem Mikroskop mit einem Objekttisch, wobei das Mikroskop ausgelegt ist, um mikroskopische Aufnahmen der dreidimensionalen Struktur zu machen, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist; a microscope with an object stage, wherein the microscope is designed to make micrographs of the three-dimensional structure, while the three-dimensional structure is positioned hydrodynamically at the constriction; und and
einer Schaltungsanordnung zum Durchführen impedimetrischer Messungen unter Verwendung der ersten und der zweiten Elektrode, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist. a circuit arrangement for performing impedimetric measurements using the first and the second electrode, while the three-dimensional structure at the constriction is hydrodynamically positioned.
[0017] [0017]
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen unter Verwendung eines entsprechenden mikrofluidischen Moduls, mit folgenden Merkmalen: Embodiments of the invention provide a method for analyzing three-dimensional structures using an appropriate microfluidic module, having the following features:
Positionieren des mikrofluidischen Moduls auf dem Objekttisch eines Mikroskops; Positioning the microfluidic module on the object stage of a microscope;
Durchströmen des Kanals mit einer Flüssigkeit, so dass eine dreidimensionale Struktur hydrodynamisch an der Engstelle in dem Kanal positioniert wird; Flowing through the channel with a liquid, so that a three-dimensional structure is hydrodynamically positioned at the constriction in the channel;
Durchführen impedimetrischer Messungen unter Verwendung der ersten und der zweiten Elektrode, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist; Performing impedimetric measurements using the first and the second electrode, while the three-dimensional structure is positioned hydrodynamically at the constriction; und and
Erzeugen mikroskopischer Aufnahmen der dreidimensionalen Struktur, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist. Generating micrographs of the three-dimensional structure, while the three-dimensional structure at the constriction is hydrodynamically positioned.
[0018] [0018]
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen somit Vorrichtungen und Verfahren, die eine Impedanzanalyse und simultan eine Mikroskopie von dreidimensionalen Strukturen, wie z. B. organischem Material, ermöglichen. Embodiments of the invention thus provide apparatus and methods that enable an impedance analysis and simultaneously a microscopy of three-dimensional structures, such. As organic material. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird dabei ein mikrofluidisches Modul verwendet, das einen Modulkörper aufweist, dessen Unterseite für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist. In embodiments of the invention while a microfluidic module is used having a module body, the underside of which is configured for positioning on an object stage of a microscope. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist die Unterseite konfiguriert, um eine stabile, verkippungsfreie Auflage des Moduls auf dem Objekttisch zu ermöglichen. In embodiments of the invention, the base is configured to allow a stable, tilt-free support of the module on the object table. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Unterseite eine ebene Oberfläche aufweisen, so dass das mikrofluidische Modul ohne Weiteres stabil und ohne Verkippungen direkt auf dem Objekttisch platziert werden kann. In embodiments of the invention, the bottom may have a flat surface so that the microfluidic module can be placed easily and stably without tilting directly on the stage. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weist der Kanal eine Engstelle auf, an der eine dreidimensionale Struktur, beispielsweise ein Zellverband, hydrodynamisch platziert werden kann, so dass neben einer einfachen Positionierung der dreidimensionalen Struktur parallel eine Impedanzanalyse und eine Mikroskopie durchgeführt werden können, so dass Untersuchungen mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung möglich sind. In embodiments of the invention, the channel has a constriction, on which a three-dimensional structure, such as a cell cluster, can be hydrodynamically placed so that in addition to a simple positioning of the three-dimensional structure of an impedance analysis and microscopy can be performed in parallel, so that investigations simultaneously are high temporal and spatial resolution possible.
[0019] [0019]
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung erstreckt sich der Kanal zumindest außerhalb der Engstelle zwischen zwei ebenen Flächen und parallel zur Unterseite des Modulkörpers und weist eine Kanalbreite und eine Kanalhöhe auf, wobei an der Engstelle die Kanalbreite und/oder die Kanalhöhe reduziert sind. In embodiments of the invention, the channel extends at least outside the constriction between two flat surfaces and parallel to the underside of the module body and has a channel width and channel height, at the narrow channel width and / or the channel height is reduced. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weist der Kanal bzw. das mikrofluidische Modul an der Engstelle in Strömungsrichtung schräg in Richtung Kanalmitte auf eine Position, an der die dreidimensionale Struktur hydrodynamisch positioniert werden soll, zulaufende Kanalwände auf. In embodiments of the invention, the channel and the microfluidic module at the constriction in the flow direction at an angle towards the center of the channel to a position at which the three-dimensional structure is to be hydrodynamically positioned tapered channel walls. Somit ist es möglich, die dreidimensionale Struktur, beispielsweise den Zellverbund oder multizellulären Sphäroid, sicher an der gewünschten Position hydrodynamisch zu positionieren. Thus, it is possible, the three-dimensional structure, such as the cell or multicellular spheroid composite, securely position hydrodynamically at the desired position.
[0020] [0020]
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann der Modulkörper eine Bodenplatte aufweisen, wobei die erste und die zweite Elektrode durch mit einem leitfähigen Material beschichtete Bereiche der Bodenplatte gebildet sind. In embodiments of the invention, the module body may comprise a bottom plate, wherein the first and the second electrode are formed by coated with a conductive material portions of the base plate. Bei Ausführungsbeispielen kann der Kanal in einem Materialblock gebildet sein, der an der Bodenplatte angebracht ist, wobei Abschnitte der ersten und der zweiten Elektrode an den Kanal angrenzen und wobei der Materialblock Kontaktabschnitte der ersten und der zweiten Elektrode zum elektrischen Kontaktieren der ersten und der zweiten Elektrode freilässt. In embodiments, the channel may be formed in a block of material which is attached to the bottom plate, wherein portions of the first and the second electrode adjacent to the channel, and wherein the block of material contact portions of the first and the second electrode for making electrical contact of the first and the second electrode leaves free. Bei Ausführungsbeispielen kann der Kanal in einer Unterseite des Materialblocks gebildet sein, und der Kanaleinlass und der Kanalauslass können Öffnungen in einer von der Bodenplatte abgewandeten Oberseite des mikrofluidischen Moduls aufweisen. In embodiments, the channel may be formed in a lower surface of the material block, and the channel inlet and the channel outlet may have openings in a side facing away from the base plate top surface of the microfluidic module. Somit ist es bei Ausführungsbeispielen möglich, das mikrofluidische Modul auf einfache Weise herzustellen. Thus, it is possible in embodiments to produce the microfluidic module in a simple manner.
[0021] [0021]
Bei Ausführungsbeispielen können der Kanaleinlass und der Kanalauslass mit Fluidanschlüssen versehen sein, die konfiguriert sind, um den Kanal an einen externen Fluidkreislauf anzuschließen, um ein Durchströmen des Kanals mit einer Flüssigkeit bewirken zu können. In embodiments of the duct inlet and the duct outlet may be provided with fluid ports which are configured to close the channel to an external fluid circuit, in order to effect a flow through the channel with a liquid. Der Fluidkreislauf kann Teil eines Systems zur Analyse dreidimensionaler Strukturen sein, das ferner ein Mikroskop und eine Schaltunganordnung zum Durchführen impedimetrischer Messungen aufweist. The fluid circuit may be part of a system for analyzing three-dimensional structures, further comprising a microscope and a circuit arrangement for performing impedimetric measurements. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann das System eine Steuerung aufweisen, die ausgelegt ist, um das Mikroskop und die Schaltungsanordnung zu steuern, um die mikroskopischen Aufnahmen und die impedimetrischen Messungen gleichzeitig durchzuführen, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist. In embodiments of the invention the system may comprise a controller adapted to control the microscope and the circuitry to perform the microscopic images and the impedimetric measurements simultaneously, while the three-dimensional structure is positioned hydrodynamically at the constriction. Somit ermöglichen Ausführungsbeispiele auf vorteilhafte Weise eine parallele Auswertung in Form einer Impedanzanalyse und einer simultanen Mikroskopie, so dass eine Untersuchung mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung möglich ist. Thus, embodiments advantageously a parallel evaluation in the form of an impedance analyzer and a simultaneous microscopy, so that an investigation at the same time with high temporal and spatial resolution is possible.
[0022] [0022]
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Flüssigkeit eine Pufferlösung sein und die dreidimensionale Struktur kann ein organisches Material, ein Zellverband, ein Biopsiematerial, eine Gewebeprobe, ein Einzeller und/oder Kleinstlebewesen aufweisen. In embodiments of the invention, the liquid may be a buffer solution and the three-dimensional structure of an organic material, a cell structure, a biopsy material, a tissue sample, a single-celled organisms and / or microorganisms have. Ausführungsbeispiele ermöglichen somit insbesondere die Durchführung bioanalytischer Verfahren, mit denen die Reaktion von Zellverbänden oder die Änderung innerer chemischer Milieus in Folge eines äußeren Stimulus, beispielsweise eines Toxins oder eines Wirkstoffkandidats, quantitativ erfasst werden kann. Embodiments are therefore particularly the implementation of bioanalytical methods by which the reaction of cell groups or the change of internal chemical environment as a result of an external stimulus, such as a toxin or a drug candidate's can be detected quantitatively. Um eine lichtmikroskopische Untersuchung zu ermöglichen, kann die dreidimensionale Struktur Indikatorfarbstoffe, beispielsweise fluoreszente Indikatorfarbstoffe, oder aus Sensormaterial aufgebaute Partikel aufweisen, die mikroskopisch detektierbar und zeitaufgelöst verfolgbar sind. To allow for light microscopic examination, the three-dimensional structure of indicator dyes, such as fluorescent indicator dyes, or particles composed of sensor material may have that are microscopically detectable and time-resolved trackable.
[0023] [0023]
Ausführungsbeispiele der Erfindung resultieren somit aus einer Kombination zweier unterschiedlicher analytischer Ansätze miteinander, was eine Analyse mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung ermöglicht. Embodiments of the invention therefore result from a combination of two different analytical approaches with each other, an analysis with simultaneous high temporal and spatial resolution possible.
[0024] [0024]
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Embodiments of the invention, reference will be explained with more detail to the accompanying drawings. Es zeigen: In the drawings:
[0025] [0025]
1a 1a eine schematische Draufsicht auf ein mikrofluidisches Modul gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung; a schematic plan view of a microfluidic module in accordance with an embodiment of the invention;
[0026] [0026]
1b 1b eine schematische Querschnittansicht des mikrofluidischen Moduls gemäß a schematic cross-sectional view of the microfluidic module in accordance with 1a 1a ; ; und and
[0027] [0027]
2 2 eine schematische Darstellung eines Systems gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. a schematic representation of a system according to an embodiment of the invention.
[0028] [0028]
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung schaffen einen neuartigen mikrofluidischen Chip (MF-Chip) zur Impedanzanalyse und simultanen Mikroskopie für die Untersuchung von einzelnen Zellverbänden, wie z. B. nativen, gelabelten oder mit Sensormaterial beladenen Sphäroiden. Embodiments of the present invention provide a novel microfluidic chip (MF-chip) for impedance analysis and simultaneous microscopy for the study of individual cell groups such. As native, labeled or loaded with sensor material spheroids. Dabei werden Vorteile bekannter Techniken miteinander kombiniert, nämlich die Positionierung eines multizellulären Sphäroids an einer Engstelle eines mikrofluidischen Kanals mit koplanaren Filmelektroden an den Enden des Kanals, so dass eine Parallelisierung von Experimenten sowie eine simultane mikroskopische Untersuchung der Sphäroide technisch sehr leicht möglich wird. Here, advantages of known techniques are combined together, namely the positioning of a multicellular spheroid at a narrow point of a microfluidic channel having coplanar film electrodes at the ends of the channel, so that a parallelization of experiments as well as a simultaneous microscopic examination of the spheroids is technically very easy. Mit Hilfe von analyt-spezfischen, im Sphäroid befindlichen Indikatorfarbstoffen, beispielsweise fluoreszenten Indikatorfarbstoffen oder Partikeln, beispielsweise Nano- oder Mikropartikeln, die in die Sphäroide eingebracht werden, wird die Verteilung von Analyten bzw. Schlüsselmetalboliten in intakten Sphäroiden mikroskopisch detektierbar und zeitaufgelöst verfolgbar. With the help of analyte-SPECIFIC, located in the spheroid indicator dyes, such as fluorescent indicator dyes or particles, such as nanoparticles or microparticles, which are introduced in the spheroids, the distribution of analyte or Schlüsselmetalboliten in intact spheroids microscopically detectable and time-resolved trackable. Durch die nichtinvasive Experimentführung lassen sich lokale Analytkonzentrationen in der Mikroumgebung des Sphäroids erfassen und Änderungen zeitlich verfolgen. The non-invasive experiment leadership, local analyte concentrations maintained in the microenvironment of the spheroid and track changes over time. Auch native Zellverbände, wie z. B. Sphäroide oder Verbände aus Zellen, die fluoreszente Proteine exprimieren oder anderweitig gelabelt sind, sind auf diese Weise einer mikroskopischen Untersuchung zugänglich. Even native cell groups such. As spheroids or associations from cells expressing fluorescent proteins or otherwise labeled, are accessible in this way a microscopic examination. Wie ausgeführt wurde, können mikroskopische Studien durch simultan durchgeführte Impedanzmessungen des unter Beobachtung stehenden Sphäroids begleitet werden, um mit hoher Sensitivität Änderungen der inneren Struktur der dreidimensionalen Struktur (beispielsweise des Sphäroids) zu dokumentieren und gleichzeitig eine Analytverteilung bzw. Änderungen der Analytverteilung im Inneren der Struktur ortsaufgelöst optisch anzuzeigen. As stated, microscopic studies may be accompanied by simultaneously carried out impedance measurements under observation spheroid to document with high sensitivity changes in the internal structure of the three-dimensional structure (for example, the spheroid) and at the same time a distribution of species and changes in the distribution of species within the structure spatially resolved optical display. Das Auslösen apoptischer oder nekrotischer Prozesse lässt sich dadurch beispielsweise mit der damit einhergehenden Analytverteilung in Zusammenhang bringen. The triggering of apoptotic or necrotic processes can be put in context by, for example, with the consequent distribution of species.
[0029] [0029]
Die The 1a 1a und and 1b 1b zeigen ein Ausführungsbeispiel eines Konzepts eines mikrofluidischen Moduls bzw. Chips zur simultanen impedanzspektroskopischen und mikroskopischen Analyse eines einzelnen Zellverbandes, wie beispielsweise eines multizellulären Sphäroids, in einer zentralen Verengung eines Kanals. show an embodiment of a concept of a microfluidic module or chip for simultaneous impedance spectroscopic and microscopic analysis of a single cell aggregate, such as a multicellular spheroid in a central constriction of a channel. Das Modul weist eine Bodenplatte The module includes a base plate 10 10 auf. on. Auf der Bodenplatte sind abschnittsweise eine erste Elektrode On the bottom plate portion, a first electrode 12 12 und eine zweite Elektrode and a second electrode 14 14 gebildet. formed. An der Bodenplatte ist ein Materialkörper At the bottom plate is a material body 16 16 fixiert, in dem fluidische Strukturen in Form eines Kanals fixed in the fluidic structures in the form of a channel 18 18 mit einem Kanaleinlass with a channel inlet 20 20 und einem Kanalauslass and a duct outlet 22 22 strukturiert sind. are structured. Der Kanal The channel 18 18 weist eine Engstelle has a constriction 24 24 mit einem verringerten Strömungsquerschnitt auf. with a reduced flow cross section. Der verringerte Strömungsquerschnitt der Engstelle The reduced flow cross-section of the constriction 24 24 ist derart, dass eine zu untersuchende dreidimensionale Struktur is such that a three-dimensional structure to be examined 26 26 bei einer Durchströmung des Kanals mit einer Flüssigkeit an der Engstelle at a flow through the channel with a liquid at the constriction 24 24 hängen bleibt. stuck. Wie in den As in the 1a 1a und and 1b 1b gezeigt ist, kann die Verengung durch seitlich in den Kanal vorstehende Abschnitte As shown, the constriction can be obtained by laterally projecting into the channel portions 28 28 und and 30 30 und einen von oben in den Kanal vorstehenden Abschnitt and one from the top of the channel section above 32 32 des Materialblocks the block of material 16 16 gebildet sein. be formed. Wie in How to 1a 1a zu sehen ist, können die Vorsprünge can be seen, the projections may 28 28 und and 30 30 Kanalwände Channel walls 28a 28a und and 30a 30a aufweisen, die schräg auf die Position, an der die Struktur exhibit obliquely to the position at which the structure 26 26 positioniert ist, zulaufen. is positioned to run. Wird der Kanal If the channel 18 18 von einer Flüssigkeit durchströmt, wird somit die Struktur through which a liquid flows, thus the structure 26 26 sicher an der Engstelle positioniert. securely positioned at the throat. Wie in How to 1b 1b zu erkennen ist, ist der Kanal can be seen, the channel 18 18 zumindest im Bereich der Engstelle zwischen zwei parallelen planaren äußeren Flächen des Modulkörpers gebildet. formed at least in the area of the constriction between two parallel planar outer surfaces of the module body. Auf der Unterseite des Abschnitts des Modulkörpers, der die obere planare äußere Fläche bildet, ist die Struktur On the underside of the portion of the module body which forms the upper planar outer surface, the structure 32 32 , die zu Erzeugung der Engstelle , To the generation of the constriction 24 24 von oben in den Kanal from above into the channel 18 18 ragt, gebildet, während auf der Oberseite des Abschnitts des Modulkörpers, der die untere planare äußere Fläche bildet, die Elektroden projecting, formed, while on the upper side of the portion of the module body, which forms the lower planar outer surface, the electrodes 12 12 und and 14 14 gebildet sind. are formed. Auch die Oberseite und Unterseite des Kanals können, mit Ausnahme der Struktur Also, the top and bottom of the channel may, except for the structure 32 32 , in dem Bereich, in dem die zu untersuchende Struktur aufgrund der Engstelle positioniert wird, planar und parallel sein. , In the range in which is positioned to be examined structure due to the constriction, be planar and parallel.
[0030] [0030]
An dieser Stelle sei angemerkt, dass in It should be noted that in 1a 1a der Materialblock the block of material 16 16 durchsichtig dargestellt ist, so dass die jeweiligen darunterliegenden Strukturen in der Draufsicht von is shown transparent so that the respective underlying structures in the plan view of 1a 1a erkennbar bleiben. remain recognizable. Wie in How to 1b 1b zu erkennen ist, weist der Materialblock It can be seen, the block of material 16 16 bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel jeweilige dünne Wandabschnitte auf, die die Fluidikstrukturen definieren. In the illustrated embodiment, respective thin wall portions that define the fluidic structures. Der Materialblock The block of material 16 16 ist derart auf der Bodenplatte is such a way on the bottom plate 10 10 mit den Elektroden with the electrodes 12 12 und and 14 14 fixiert, dass der Kanal fixed in that the channel 18 18 mit Ausnahme des Kanaleinlasses with the exception of the channel inlet 20 20 und des Kanalauslasses and the passage outlet 22 22 abgedichtet ist. is sealed. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann der Materialblock In alternative embodiments, the block of material 16 16 eine massive Struktur aufweisen, in der Ausnehmungen bzw. Öffnungen erzeugt sind, die den Kanal mit Kanaleinlass und Kanalauslass definieren. having a solid structure, are produced in the recesses or openings which define the channel with channel inlet and channel outlet. Der Block ist derart strukturiert, dass nach Fixierung desselben an der Bodenplatte ein mit Ausnahme des Kanaleinlasses und des Kanalauslasses fluiddichter Kanal erzeugt wird. The block is structured such that is generated after fixation thereof to the bottom plate a with the exception of the channel inlet and the passage outlet fluid tight channel.
[0031] [0031]
Der Materialblock The block of material 16 16 kann solche Abmessungen aufweisen, dass nach Fixieren desselben an der Bodenplatte may have such dimensions that after fixing it on the base plate 10 10 Abschnitte Sections 12a 12a und and 14a 14a der Elektroden the electrodes 12 12 und and 14 14 an den Kanal to channel 18 18 angrenzen, während Abschnitte border, while portions 12b 12b und and 14b 14b der Elektroden the electrodes 12 12 und and 14 14 frei bleiben. remain free. Die Abschnitte The sections 12b 12b und and 14b 14b können zur elektrischen Kontaktierung der Elektroden can contribute to the electrical contacting of the electrodes 12 12 und and 14 14 , um eine Impedanzmessung zu ermöglichen, dienen. To enable an impedance measurement, are used.
[0032] [0032]
Eine Strömungsrichtung ist von dem Kanaleinlass A flow direction is from the channel inlet 20 20 zu dem Kanalauslass to the passage outlet 22 22 , so dass die Elektrode , So that the electrode 12 12 (bzw. der Abschnitt (Or the portion 12a 12a derselben) strömungsmäßig vor der Engstelle thereof) in terms of flow before the constriction 24 24 an den Kanal to channel 18 18 angrenzt, während die Elektrode adjacent, while the electrode 14 14 (bzw. der Abschnitt (Or the portion 14a 14a derselben) strömungsmäßig nach der Engstelle thereof) in terms of flow after the constriction 24 24 an den Kanal to channel 18 18 angrenzt. adjacent.
[0033] [0033]
Die Bodenplatte The bottom plate 10 10 weist eine ebene Oberfläche auf, so dass das Modul verkippungssicher und stabil auf einem Objekttisch eines Mikroskops platziert bzw. positioniert werden kann. has a planar surface, so that the module can be stably and verkippungssicher placed or positioned on a stage of a microscope. Bei alternativen Ausführungsbeispielen muss die Unterseite keine ebene Oberfläche aufweisen, sondern kann eine Mehrzahl von voneinander beabstandeten Auflagebereichen aufweisen, durch die das Modul auf dem Objekttisch plaziert werden kann, beispielsweise zwei längliche voneinander beabstandete Auflageflächen oder vier an voneinander beabstandeten Enden des Moduls angeordnete Auflageflächen. In alternative embodiments, the bottom need not have a flat surface but may have a plurality of spaced-apart support regions, through which the module can be placed on the object table, for example two elongate spaced-apart bearing surfaces or four arranged at spaced-apart ends of the module support surfaces.
[0034] [0034]
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung besteht das mikrofluidische Modul somit aus zwei Bestandteilen, die aneinander fixiert sind. In embodiments of the invention thus the microfluidic module consists of two components which are fixed to each other. Ein Bestandteil besteht aus einer Bodenplatte und an derselben angebrachten Elektroden und in dem zweiten Bestandteil sind die Kanalstrukturen gebildet. One component consists of a base plate and at the same electrodes and mounted in the second part of the channel structures are formed. Bei Ausführungsbeispielen ist der Kanal, der die Engstelle aufweist, in einer Unterseite dieses zweiten Bestandteils gebildet, so dass nach Fixierung des zweiten Bestandteils an dem ersten Bestandteil ein mit Ausnahme des Kanaleinlasses und des Kanalauslasses geschlossener Fluidkanal gebildet ist. In embodiments, the channel having the narrow passage formed in a bottom surface of this second component, so that, after fixing the second component to the first component a is formed with the exception of the channel inlet and the passage outlet is closed fluid passage. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann der Modulkörper auf eine beliebige Art und Weise gebildet sein, solange er stabil auf seiner Unterseite abgelegt werden kann, dh solange derselbe für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist. In alternative embodiments, the module body on an arbitrary manner can be formed as long as it can be placed stably on its underside, ie as long as the same is configured for positioning on an object stage of a microscope.
[0035] [0035]
Ein System zur Analyse bzw. ein Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen werden nachfolgend Bezug nehmend auf A system for analysis or a method for analyzing three-dimensional structures are below with reference to 2 2 erläutert. explained. 2 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Systems zur Analyse dreidimensionaler Strukturen, bei dem ein mikrofluidisches Modul shows an embodiment of a system for analyzing three-dimensional structures, in which a microfluidic module 2 2 , wie es beispielsweise oben Bezug nehmend auf die As for example described above with reference to the 1a 1a und and 1b 1b beschrieben wurde, auf einem Objekttisch has been described on an object table 50 50 eines Mikroskops a microscope 52 52 positioniert ist. is positioned. Das Mikroskop The microscope 52 52 kann, wie Fachleuten geläufig ist, eine oder mehrere geeignete Lichtquellen zur Beleuchtung des mikrofluidischen Moduls , as those skilled in the art, one or more appropriate light sources for illumination of the microfluidic module 2 2 bzw. von Abschnitten desselben sowie eine Kamera zur Aufnahme mikroskopischer Aufnahmen des mikrofluidischen Moduls bzw. von Abschnitten desselben aufweisen. or portions thereof, and a camera for capturing microscopic images of the microfluidic module or portions having the same. Das Mikroskop The microscope 52 52 ist mit einer Steuerung is connected to a control 54 54 gekoppelt. coupled. Die Steuerung The control 54 54 ist ferner mit einem Fluidkreislauf is further connected to a fluid circuit 56 56 sowie einer Schaltungsanordnung and a circuit arrangement 58 58 zum Durchführen impedimetrischer Messungen gekoppelt. coupled to perform impedimetric measurements. Die Steuerung The control 54 54 ist ausgelegt, um das Mikroskop is adapted to the microscope 52 52 , den Fluidkreislauf , The fluid circuit 56 56 und die Schaltungsanordnung and the circuit arrangement 58 58 zum Durchführen impedimetrischer Messungen zu steuern. to control for performing impedimetric measurements.
[0036] [0036]
Die Schaltungsanordnung The circuit 58 58 zum Durchführen impedimetrischer Messungen ist über elektrische Zuleitungen for performing impedimetric measurements on electrical leads 60 60 und and 62 62 mit den freiliegenden Abschnitten with the exposed portions 12b 12b und and 14b 14b der ersten und zweiten Elektrode the first and second electrodes 12 12 und and 14 14 verbunden. connected. Der Fluidkreislauf The fluid circuit 56 56 weist Fluidleitungen has fluid lines 66 66 und and 68 68 auf, die über Fluidanschlüsse to, via the fluid ports 70 70 und and 72 72 mit dem Kanaleinlass with the channel inlet 20 20 und dem Kanalauslass and the passage outlet 22 22 fluidisch gekoppelt sind. are fluidly coupled. Der Fluidkreislauf The fluid circuit 56 56 kann ferner eine Pumpeinrichtung aufweisen, um eine Durchströmung des Kanals may further comprise a pumping means for a flow through the channel 18 18 in einer Richtung von dem Kanaleinlass in a direction from the channel inlet 20 20 zu dem Kanalauslass to the passage outlet 22 22 zu ermöglichen. to allow. Der Fluidkreislauf The fluid circuit 56 56 kann ferner ausgebildet sein, um entsprechende, zu untersuchende dreidimensionale Strukturen in den Kanal may further be formed to corresponding three-dimensional structures to be examined in the channel 18 18 einzubringen. introduce.
[0037] [0037]
Im Betrieb des Systems bzw. bei einem Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen wird das mikrofluidische Modul In operation of the system or in a method for analyzing three-dimensional structures is the microfluidic module 2 2 auf dem Objekttisch on the object table 50 50 positioniert und der Kanal positioned and the channel 18 18 wird mit einer Flüssigkeit durchströmt, so dass die dreidimensionale Struktur hydrodynamisch an der Engstelle is flowed through with a liquid, so that the three-dimensional structure hydrodynamically at the constriction 24 24 in dem Kanal in the channel 18 18 positioniert wird. is positioned. Zu diesem Zweck kann der Fluidkreislauf For this purpose, the fluid circuit 56 56 über die Steuerung via the controller 54 54 entsprechend gesteuert werden, um eine Durchströmung des Kanals be controlled according to a flow through the channel 18 18 zu bewirken. to effect. Ist die zu untersuchende dreidimensionale Struktur an der Verengung Is the three-dimensional structure to be examined at the throat 24 24 positioniert, werden impedimetrische Messungen unter Verwendung der ersten und der zweiten Elektrode durchgeführt. positioned, impedimetric measurements are performed using the first and the second electrode. Zu diesem Zweck kann die Schaltungsanordnung For this purpose, the circuit arrangement 58 58 durch die Steuerung by the controller 54 54 entsprechend gesteuert werden. be controlled accordingly. Gleichzeitig werden durch das Mikroskop mikroskopische Aufnahmen der dreidimensionalen Struktur gemacht, wobei das Mikroskop zu diesem Zweck durch die Steuerung Simultaneously micrographs of the three-dimensional structure made by the microscope, the microscope for that purpose by the controller 54 54 entsprechend gesteuert werden kann. can be controlled accordingly. Entsprechende Aufnahmen können zur mikroskopischen Untersuchung der dreidimensionalen Struktur verwendet werden, wobei die Steuerung Corresponding receptacles may be used for microscopic examination of the three-dimensional structure, wherein the controller 54 54 ausgelegt sein kann, um entsprechende mikroskopische Untersuchungen durchzuführen. may be configured to perform corresponding microscopic examinations.
[0038] [0038]
Der mikrofluidische Kanal The microfluidic channel 18 18 weist somit, beispielsweise an zentraler Position, eine Verengung auf, um eine zu untersuchende zweidimensionale Struktur aufnehmen zu können. has thus, for example, in a central position, a constriction to accommodate a two-dimensional structure to be examined can. Bei diesen zu untersuchenden Strukturen kann es sich beispielsweise um organisches Material handeln. In these structures to be examined may, for example, be organic material. Neben Zellverbänden, wie Sphäroiden, ist auch die Untersuchung von Biopsiematerial, anderen Gewebeproben, großen Einzellern und anderen Kleinstlebewesen mit einem solchen Aufbau möglich und technisch umsetzbar. In addition to cell structures, such as spheroids, the examination of biopsy material, other tissue samples, large protozoa and other microorganisms such a construction is possible and technically feasible. Es ist für Fachleute offensichtlich, wie der Querschnitt der an der Engstelle verbleibenden Durchströmungsöffnung für unterschiedliche zu untersuchende Strukturen zu dimensionieren ist, um die Strukturen an der Engstelle in Position zu halten. It is apparent to those skilled, as the cross section at the throat of the remaining flow-through opening has to be dimensioned for different structures to be examined in order to keep the structure in position at the constriction.
[0039] [0039]
Beispielsweise können der mikrofluidische Kanal und die Engstelle ausgebildet sein, um ein multizelluläres Sphäroid aufnehmen zu können, um integral messbare Parameter zur Beschreibung der physikalischen Beschaffenheit des Sphäroids durch die Erstellung spezieller impedimetrischer Profile bestimmen zu können. For example, the microfluidic channel and the constriction can be designed to accommodate a multicellular spheroid may be able to determine integral measurable parameters describing the physical nature of the spheroid by creating special impedimetric profiles. Beispielsweise können über die an beiden Enden des Kanals eingebrachten Elektroden impedimetrische Messungen entlang des Kanals durchgeführt werden, deren Ergebnis durch die Sphäroid bedeckte Verengung bestimmt wird. For example, impedimetric measurements along the channel can be performed via the electrodes introduced at both ends of the channel, the result of which is determined covered by the spheroid constriction. Die Geometrie des Moduls, dh des Chips, und der Zuleitungen können dabei gewährleisten, dass die mit der zu untersuchenden Struktur, z. B. dem Sphäroid, verschlossene Verengung des Kanals die Gesamtimpedanz des Systems dominiert. The geometry of the module, ie the chip and the leads can ensure thereby that with the structure to be examined, for. Example, dominates the spheroid, sealed constriction of the channel, the total impedance of the system.
[0040] [0040]
Der Kanal ist in einem Modulkörper aus einem transparenten Material gebildet, der auf beiden Seiten parallele Oberflächen aufweisen kann, damit die im Kanal befindlichen Objekte einer hochauflösenden Mikroskopie zugänglich sind. The channel is formed in a module body made of a transparent material which may have parallel surfaces on both sides, so that the objects located in the channel of a high-resolution microscopy are available. Ein beispielhafter Aufbau eines solchen mikrofluidischen Chips zur impedimetrischen Untersuchung von einzelnen Zellverbänden, wie beispielsweise Sphäroiden, wurde oben bezugnehmend auf die An example construction of such a microfluidic chip for impedimetric investigation of individual cell groups, such as spheroids was above with reference to the 1a 1a und and 1b 1b beschrieben. described.
[0041] [0041]
Die Bodenplatte The bottom plate 10 10 eines solchen mikrofluidischen Chips kann aus einem durchsichtigen Material, wie beispielsweise kommerziell erhältlichen Deckgläsern bestehen, die abschnittsweise mit einer Schicht aus leitfähigem Material, wie beispielsweise Gold, Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder leitfähigen Polymeren und Co-Polymeren (wie z. B. Polyanilin, Polypyrol, Polythiophen, PEDOT sowie deren dotierten Varianten) beschichtet sein können. of such a microfluidic chips can be made of a transparent material such as glass coverslips for example, commercially available exist, the sections with a layer of conductive material, such as gold, indium-tin-oxide (ITO) or conductive polymers and co-polymers (such. B . polyaniline, polypyrrole, polythiophene, PEDOT doped and their variants) can be coated. Bei einem Ausführungsbeispiel sind die Elektroden auf der Bodenplatte durch eine ITO-Beschichtung gebildet, wobei ITO optisch transparent bis zu einer Wellenlänge von etwa 350 nm (abhängig vom Trägermaterial), kratzfest, chemisch weitgehend inert und je nach Schichtdicke sehr gut elektrisch leitfähig ist. In one embodiment, the electrodes are formed on the base plate by an ITO coating, ITO is optically transparent to a wavelength of about 350 nm (depending on the substrate), scratch-resistant, substantially chemically inert and, depending on the layer thickness very good electrical conductors. Die Grenzflächenimpedanz von ITO entspricht in guter Näherung der einer ideal polarisierbaren Elektrode. The interfacial impedance of ITO corresponds to a good approximation of an ideal polarizable electrode. Bei der Herstellung eines entsprechenden mikrofluidischen Chips kann zunächst eine vollständig mit einer elektrisch leitfähigen Schicht versehene Bodenplatte bereitgestellt werden, wobei durch Photolithographie und nasschemisches Ätzen (beispielsweise mit Zink/Salzsäure im Fall von ITO) die ITO-Schicht im Zentrum der Bodenplatte (beispielsweise des Deckgläschens) weggeätzt werden kann, so dass nur noch an beiden Längsseiten des Chips eine Beschichtung vorhanden ist, die außerhalb der beiden fluidischen Zugänge zur elektrischen Kontaktierung an die Messelektronik genutzt werden kann. In the manufacture of a corresponding microfluidic chip may initially a completely provided with an electrically conductive layer bottom plate are provided, by photolithography and wet chemical etching (for example, with zinc / hydrochloric acid in the case of ITO), the ITO layer in the center of the bottom plate (for example, the cover slip ) can be etched away, so that only at both longitudinal sides of the chip, a coating is present, which can be used outside the two fluidic approaches to making electrical contact to the measuring electronics.
[0042] [0042]
Der fluidische Kanal inklusive der für das zu untersuchende Material passend dimensionierten Verengung, die aus einem entsprechenden Materialblock gefertigt sind, sind auf der mit den ITO-Elektroden versehenen Bodenplatte fixiert. The fluidic channel including the material to be examined is appropriately sized constriction, which are made of a respective material block is fixed on the ITO electrodes provided with the base plate. Die Impedanzanalyse kann unter Verwendung der Elektroden mithilfe kommerzieller Impedanzanalysatoren erfolgen. The impedance analysis can be performed using commercial impedance analyzers using the electrodes. Zur Durchführung der Messung wird der fertiggestellte Chip beispielsweise mit einer Pufferlösung befüllt, die einen einzelnen multizellulären Zellverband, beispielsweise ein einzelnes Sphäroid, enthält. To carry out the measurement of the finished chip is filled, for example with a buffer solution containing a single multicellular cell structure, such as a single spheroid. Beim hydrostatisch getriebenen Durchströmen des Puffers durch den Kanal wird das Sphäroid bis zur Verengung mitgeführt und dort automatisch hydrodynamisch platziert, so dass ohne jede weitere Manipulation (Mikromanipulation) eine impedanzspektroskopische Untersuchung des Sphäroids möglich ist. When hydrostatically driven flow through the buffer through the channel the spheroid is carried up to the throat and placed there automatically hydrodynamically, so without any further manipulation (micromanipulation) an impedance spectroscopic investigation of the spheroid is possible. Der auf diese Weise positionierte Zellverband wird aufgrund der Geometrie des Chips einer simultanen mikroskopischen Untersuchung zugänglich. The cell assembly positioned in this manner is accessible due to the geometry of the chip simultaneous microscopic examination. Der Zellverband kann beispielsweise ein Farbstofftragendes oder Partikel-tragendes Sphäroid sein, wobei es sich bei dem Farbstoff beispielsweise um fluoreszente Indikatorfarbstoffe und bei den Partikeln beispielsweise um Nano- oder Mikropartikel handeln kann. The cell structure can be for example a dye-supporting or particle-carrying spheroid, which may be, for example, the dye fluorescent indicator dyes and in the particles, for example, nano- or microparticles. Diese Kombination von mikroskopischen Studien mit simultan durchgeführten Impedanzmessungen des unter Beobachtung stehenden Zellverbandes erlaubt mit hoher Sensitivität, dass Änderungen der inneren Struktur des Sphäroids dokumentiert werden, während gleichzeitig die Analytverteilung und/oder Änderungen der Analytverteilungen innerhalb des Zellverbandes ortsaufgelöst optisch bestimmt werden können. This combination of microscopic studies with simultaneously performed impedance measurements under observation cell assembly allows high sensitivity to changes in the internal structure of the spheroid are documented, while spatially resolved distribution of species and / or changes in the Analytverteilungen within the cell assembly can be determined optically.
[0043] [0043]
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung ermöglichen somit vorteilhaft die Kombination zweier analytischer Ansätze miteinander. Embodiments of the present invention thus advantageously allow the combination of two analytical approaches. Auf der Basis von im Zellverband befindlichen Sensormaterial, wie z. B. Farbstoffen oder sensorisch-funktionalisierten, beispielsweise fluoreszierenden Partikeln (z. B. Nano- oder Mikropartikeln), wird in den Zellen des Zellverbandes, beispielsweise des Sphäroids, sowie auch in den Zellzwischenräumen eine ortsaufgelöste kontinuierliche Detektion von Analyten oder anderweitig gelabelten Molekülen ermöglicht, so dass deren Verteilung in dem 3D-Gewebe-Modell mikroskopisch studierbar ist. On the basis of in-cell association sensor material such. As dyes or sensory-functionalized, for example, fluorescent particles (z. B. nano- or microparticles), is in the cells of the cell assembly, for example of the spheroid, and also in the intercellular spaces a spatially resolved continuous detection of analytes or otherwise labeled molecules allows so that their distribution is microscopically be studied in the 3D mesh model. Parallel dazu werden durch label-freie Impedanzmessungen mit hoher zeitlicher Auflösung Veränderungen der dielektrischen Struktur desselben Zellverbandes aufgezeichnet, um Rückschlüsse auf dessen integrale Vitalität sowie beispielsweise einsetzende apoptotische oder nekrotische Prozesse zu ziehen. In parallel, recorded by label-free impedance measurements with high temporal resolution changes the dielectric structure of the same cell assembly to draw conclusions about its integral vitality as well as apoptotic or necrotic example incipient processes. Die Durchführung und Analyse derartiger Impedanzmessungen kann auf an sich bekannte Art und Weise erfolgen. The implementation and analysis of such impedance measurements can be performed in per se known manner.
[0044] [0044]
Ausführungsbeispielen der Erfindung ermöglichen somit eine Kombination von ortsaufgelösten, spezifisch-chemischen Information von Zellverbänden mit integral messbaren Parametern der physikalischen Beschaffenheit der Zellverbände. Embodiments of the invention thus allow for a combination of spatially resolved, specific chemical information of cell assemblies with integral measurable parameters of the physical nature of the cell aggregates. Somit können die Vorteile bekannter Techniken durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise und insbesondere das neuartige mikrofluidische Modul miteinander kombiniert werden. Thus, the advantages of known techniques by the procedure of the invention, and particularly the novel microfluidic module can be combined. Ein einzelner Zellverband, beispielsweise ein Sphäroid, wird an einer Engstelle eines mikrofluidischen Kanals mit koplanaren Filmelektroden an den Enden des Kanals positioniert, so dass eine Parallelisierung von Experimenten sowie eine simultane mikroskopische Untersuchung der Zellverbände möglich wird. A single cell structure, for example, a spheroid is positioned at a narrow point of a microfluidic channel having coplanar film electrodes at the ends of the channel, so that a parallelization of experiments, as well as a simultaneous microscopic examination of the cell groups is possible. An einem mit einer Kamera ausgestatteten Mikroskop bietet sich die Möglichkeit, Filme oder Zeitraffer-Aufnahmen durchzuführen, wodurch beispielsweise die Änderungen der Morphologie, der Struktur oder der Analytverteilung innerhalb der Probe sichtbar gemacht werden können. At one equipped with a camera microscope provides the ability to perform time-lapse movies, or, for example, making changes in the morphology, structure or distribution of species within the sample can be made visible.
[0045] [0045]
Ausführungsbeispiele des mikrofluidischen Moduls können aus beliebigen geeigneten Materialien erzeugt werden, die ausreichend optisch transparent sind, um eine mikroskopische Erfassung einer in dem Modul angeordneten dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen. Embodiments of the microfluidic module can be produced from any suitable materials which are sufficiently optically transparent to allow a microscopic detection of a module arranged in the three-dimensional structure. Beispielsweise können die Bestandteile des mikrofluidischen Moduls aus einem geeigneten Glas, aus geeigneten Polymermaterialien, aus geeigneten Halbleitermaterialien, wie z. B. Silizium, und dergleichen bestehen. For example, the components of the microfluidic module may be made of a suitable glass, suitable polymeric materials of suitable semiconductor materials, such. As silicon, and the like. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann beispielsweise der Materialblock, in dem der Kanal gebildet ist, durch Strukturieren einer Siliziumscheibe gebildet werden. In embodiments of the invention, for example, the block of material, in which the channel is formed, are formed by patterning a silicon wafer. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann das mikrofluidische Modul oder Bestandteile desselben durch Kunststoffspritzguss hergestellt werden, wobei die für die Impedanzmessung erforderlichen Elektroden eingegossen werden können. In alternative embodiments, the microfluidic module or components thereof can be manufactured by plastic injection molding, wherein the information necessary for the impedance measurement electrodes can be poured.
[0046] [0046]
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen somit ein mikrofluidisches Modul bzw. einen Mikrofluidik-Chip zur simultanen mikroskopischen und impedimetrischen Untersuchung von dreidimensionalen Strukturen, die hydrodynamisch positioniert und kontinuierlich untersucht werden können. Embodiments of the invention thus provide a microfluidic module or a microfluidic chip for simultaneous microscopic and impedimetric investigation of three-dimensional structures that can be hydrodynamically positioned and continuously studied. Bei den zu untersuchenden Strukturen kann es sich insbesondere um lebende Zellverbände (nativ, gelabelt bzw. Sensormaterial in Form von Partikeln und/oder Farbstoffen beinhaltend) handeln. In the investigated structures can be in particular to living cell groups (native, labeled or sensor material in the form of particles and / or dyes including) act. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung können insbesondere technische Anwendung im Medizinbereich finden. Embodiments of the present invention may find particular industrial application in the medical field. Multizelluläre Sphäroide werden wegen der verbesserten Modellierung der In-Vivo-Situation vorteilhaft als Testobjekte in der Tumorforschung, dem Wirkstoff-Screening und der Toxizitätsprüfung eingesetzt und liefern in anerkannter Weise relevante biomedizinische Informationen. Multicellular spheroids are advantageously used because of the improved modeling of the in vivo situation as test subjects in cancer research, drug screening and toxicity testing and provide relevant biomedical information in approved manner. Die multizellulären Sphäroide können heutzutage nach unterschiedlichen Verfahren in großer Zahl und guter Reproduzierbarkeit aus verschiedenen Zelllinien hergestellt werden, so dass ihr Einsatz auch im Hochdurchsatz-Screening möglich geworden ist, wobei diesbezüglich auf Kunz-Schughart, LA, et al., J Biomol Screen, 2004. 9(4): S. 273–285 , verwiesen wird. The multicellular spheroids can now be produced by various processes in large numbers and good reproducibility from various cell lines, so that their use has become possible even in high-throughput screening, where this regard Kunz-Schughart, LA, et al., J Biomol Screen, 2004. 9 (4): p 273-285, is directed.
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Ein weiteres technisches Anwendungsgebiet ist die Untersuchung von Zellverbänden, wie Biopsieproben, anderen Gewebestücken, Einzellern und Kleinstlebewesen, wobei wertvolle Informationen in der biomedizinischen Forschung und der Diagnostik geliefert werden können, beispielsweise bei der Untersuchung von entzündlich verändertem Gewebe oder Tumoren. Another technical field of application is the study of cell groups, such as biopsy specimens, other fabric items, protozoa and microorganisms, with valuable information can be provided in biomedical research and diagnostics, for example in the study of inflammatory changed tissue or tumors. Auch für die Grundlagenforschung ist eine Anwendung des beschriebenen mikrofluidischen Moduls von erheblicher Bedeutung, da mithilfe der multiparametrischen, bioanalytischen Untersuchung Zellverbände, wie z. B. 3D-Sphäroidmodelle unter dem Einfluss verschiedener chemischer oder biologischer Stimulanzien studiert werden können. Even for basic research is an application of microfluidic module of considerable importance described as using multiparametric, bioanalytical study cell groups, such as B. 3D Sphäroidmodelle can be studied under the influence of various chemical or biological stimulants such.. Neben dem neuen biomedizinischen Erkenntnisgewinn ist es auch denkbar, dass biologische Untersuchungsmaterialien, wie beispielsweise multizelluläre Organismen oder Proben aus dem Tier- und Pflanzenreich oder andere, impedimetrisch untersuchbare Objekte, Materialien und Proben analysiert werden können. Besides the new biomedical knowledge gain, it is also conceivable that biological specimens such as multicellular organisms or samples from the animal and plant kingdoms, or other impedimetrisch examinable objects, materials and samples can be analyzed.
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Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine entsprechende Vorgehensweise durch eine entsprechende Ausgestaltung der Auflagefläche eines Mikrofluidik-Chips, wobei die zu untersuchende dreidimensionale Struktur, beispielsweise das Sphäroid, zwischen zwei planaren Flächen hydrodynamisch platziert werden kann, die aus optisch transparenten Materialien bestehen, so dass eine simultane zeit- und ortsaufgelöste Messung möglich wird. The present invention allows a corresponding procedure by a suitable design of the bearing surface of a microfluidic chip, said to be examined three-dimensional structure, such as the spheroid, between two planar surfaces can be hydrodynamically placed consisting of optically transparent materials so that a simultaneous time - and is spatially resolved measurement possible.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION
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