WO2014034609A1 - ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用 - Google Patents

ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2014034609A1
WO2014034609A1 PCT/JP2013/072744 JP2013072744W WO2014034609A1 WO 2014034609 A1 WO2014034609 A1 WO 2014034609A1 JP 2013072744 W JP2013072744 W JP 2013072744W WO 2014034609 A1 WO2014034609 A1 WO 2014034609A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
gene
apoptosis
nucleic acid
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/072744
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆至 時野
雅史 井戸川
泰史 佐々木
Original Assignee
北海道公立大学法人札幌医科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 北海道公立大学法人札幌医科大学 filed Critical 北海道公立大学法人札幌医科大学
Publication of WO2014034609A1 publication Critical patent/WO2014034609A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1758—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression inducer containing a p53 family chimeric gene and / or chimeric protein.
  • the tumor suppressor gene p53 encodes a transcription factor related to DNA damage and the like. Cancer-related mutations in p53 are mainly missense mutations in the DNA binding domain. Typically, these mutations express a full-length mutant protein (mutant p53), disabling transactivation of the p53 target gene. In addition to the loss of wild type activity, many p53 mutants inactivate wild type p53 expressed from the remaining wild type alleles and function as dominant negative proteins. Although controversial, the presence of mutant p53 in cancer cells is associated with invasive tumors and is therefore associated with worse prognosis.
  • exogenous p53 inhibits the growth of cancer cells by preventing the progression of the cell cycle and inducing apoptosis.
  • loss of p53 causes not only tumor development but also chemoresistance.
  • reintroduction of wild-type p53 into tumor cells activates the growth inhibitory pathway and increases the sensitivity of tumor cells to chemotherapy.
  • p53 gene therapy has proven effective against several cancers.
  • amplification of MDM2, inactivation by p14ARF mutation, or HPV E6 oncogene in HPV-positive cervical cancer interferes with the growth suppression pathway of p53, thus hindering the effect of p53 gene therapy.
  • the p53 gene family consists of three members, p53, p63 (also known as p51) and p73. In three domains, the N-terminal transcriptional activation domain (TAD), the central core sequence-specific DNA binding domain (DBD), and the C-terminal oligomerization domain (OLD), these families share homology. However, p53 family members show a characteristic pattern of transcriptional and post-transcriptional control. p53 is transcribed extensively at relatively high levels, and the amount of p53 protein in normal cells is mainly controlled by its proteolysis. Degradation of p53 protein is performed via MDM2 which ubiquitinates p53. Phosphorylation of amino acid residues at the N-terminus of p53 does not affect its DNA binding activity, but does affect the affinity for MDM2 and therefore subsequent proteolysis.
  • the structure of p63 is more complicated than the structure of p53.
  • the p63 gene is expressed as multiple isoforms with different N- and C-termini as a result of the use of two different promoters and alternative splicing.
  • the p63 isoform is thought to have one of two N-termini. One is transcriptionally active (TA) and the other is deleted at the N-terminus ( ⁇ N).
  • TA transcriptionally active
  • ⁇ N N-terminus
  • the C-terminus differs between isoforms, and in particular, the p63 ⁇ isoform contains a C-terminal region that rapidly decreases activity. Functional differences between p63 isoforms are due to differential control of alternative promoters and alternative splicing.
  • Non-Patent Document 1 a mutant p53 in which Ser-46 of p53 is substituted with phenylalanine has been reported to induce apoptosis more efficiently in cancer cells than wild-type p53.
  • Non-Patent Document 1 a mutant p53 in which Ser-46 of p53 is substituted with phenylalanine has been reported to induce apoptosis more efficiently in cancer cells than wild-type p53.
  • chimeric genes of the p53 family are also known, and it is known that a transcriptional activity ability superior to that of wild-type p53 can be obtained by recombination of TAD, DBD and OLD of p51, p53 and p73, respectively.
  • Patent Document 1 the usefulness of the chimeric gene and chimeric protein of the p53 family is limited to a specific combination of chimeras, for example, a chimera having a TAD derived from p63 (p51) tends to have a low transcription activity ability. It was.
  • the functions of TAp63 and TAp73 in tumor suppression are unknown, and no data on the effect of inducing apoptosis by chimeric genes and chimeric proteins of the p53 family is described. Therefore, the chimera of the p53 family that can be used for p53 gene therapy has room for improvement for practical use, and development of an antitumor agent excellent in clinical use is required.
  • the present inventors have made extensive studies and TAD, DBD and OLD are p63, p63 and p53-derived chimeras derived from p53 (p63-53O), respectively, which are unexpectedly superior.
  • the present inventors have found that the present invention has an apoptotic effect and that a chimeric protein (SHp53), which is a mutant thereof, specifically activates a specific apoptosis-related gene.
  • SHp53 chimeric protein
  • a chimeric protein and / or a functional variant thereof comprising an N-terminal region containing a transcription activation domain derived from p63 and a DNA binding domain, and a C-terminal region containing an oligomerization domain derived from p53, and / or Alternatively, an expression inducer of at least one gene selected from the group consisting of p53AIP1, CASP10, KCNK3 and PYCARD, which contains a nucleic acid molecule encoding the chimeric protein or a functional variant thereof.
  • the chimeric protein comprises a transcription activation domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 162, a DNA binding domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 166, and an oligomerization domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 198.
  • [4] The gene according to [1] or [2], wherein the chimeric protein comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 and 160 Expression inducer.
  • An apoptosis inducer comprising the gene expression inducer according to any one of [1] to [4].
  • a pharmaceutical composition comprising the gene expression inducer according to any one of [1] to [4].
  • a chimeric protein or functional variant thereof comprising an N-terminal region containing a transcriptional activation domain derived from p63 and a DNA-binding domain, and a C-terminal region containing an oligomerization domain derived from p53, and / or A method for inducing expression of an apoptosis-related gene, comprising administering a nucleic acid molecule encoding the chimeric protein or a functional variant thereof to a cell in vitro or ex vivo.
  • a chimeric protein or a functional variant thereof comprising an N-terminal region containing a transcriptional activation domain derived from p63 and a DNA-binding domain, and a C-terminal region containing an oligomerization domain derived from p53, and / or A method for inducing apoptosis, comprising administering a nucleic acid molecule encoding the chimeric protein or a functional variant thereof to a cell in vitro or ex vivo.
  • An apoptosis inducer comprising a KCNK3 protein and / or a functional variant thereof, and / or a nucleic acid molecule encoding the protein or a functional variant thereof.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of a cell proliferative disease comprising a KCNK3 protein and / or a functional variant thereof, and / or a nucleic acid molecule encoding the protein or a functional variant thereof.
  • a method for inducing apoptosis comprising administering a KCNK3 protein and / or a functional variant thereof and / or a nucleic acid molecule encoding the protein or a functional variant thereof to a cell in vitro or ex vivo.
  • a chimeric protein or a functional variant thereof comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 154, 156, 158 and 160.
  • a nucleic acid construct or vector comprising the nucleic acid molecule according to [14].
  • a composition comprising the nucleic acid molecule according to [15] and / or the nucleic acid construct and / or vector according to [15].
  • TAD, DBD and OLD contain p53 family chimeric genes or chimeric proteins derived from p63, p63 and p53, respectively, and induce expression of apoptosis-related genes. Therefore, it shows an excellent apoptosis-inducing effect in cancer cells and the like.
  • the chimeric gene and chimeric protein of the present invention do not have p63-derived OLD, which is thought to enhance the transcriptional activity ability, and induce apoptosis-related genes more efficiently than wild-type p53.
  • the chimeric gene and chimeric protein of the present invention activate caspase-3 to promote apoptosis, and have excellent antitumor effects even in vivo. Further, since apoptosis is induced more efficiently than wild-type p53, side effects can be suppressed compared to conventional p53 treatment, and clinical usefulness is expected. Furthermore, the gene expression inducer of the present invention can be used for gene therapy, and in such a case, it can be used in combination with other treatment methods such as chemotherapy and radiotherapy.
  • the chimeric gene and chimeric protein of the present invention can induce apoptosis-related genes, and can promote apoptosis, for example, by inducing the expression of p53AIP1 (TP53AIP1).
  • the chimeric gene and chimeric protein of the present invention can also induce the expression of apoptosis-related genes such as CASP10 and PYCARD.
  • the expression of KCNK3 identified this time as a novel apoptosis-related gene can be induced, and cell proliferation can be suppressed by a characteristic gene expression pattern and a novel apoptosis pathway.
  • the chimeric protein of the present invention can efficiently translocate to the nucleus and activate transcription by including a nuclear translocation signal.
  • the chimeric gene and the chimeric protein of the present invention effectively promote apoptosis not only in p53 null cancer cells or wild type cancer cells but also in cancer cells carrying a p53 mutant having a dominant negative effect. Can do. This makes it possible to treat cancer that is resistant to p53 treatment, and can greatly improve conventional p53 gene therapy.
  • FIG. 1 shows a comparison of the apoptotic effect of the Ad-p53 gene family.
  • FIG. 2AB shows an increase in apoptosis induced by the combined use of Ad-p53 and Ad-p63 ⁇ .
  • FIG. 2CD shows an increase in apoptosis induced by the combined use of Ad-p53 and Ad-p63 ⁇ in MKN45 cells.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the p53-p63 hybrid molecule.
  • FIG. 4 shows the intracellular localization of the p53-p63 hybrid.
  • FIG. 5AB shows the cleavage of PARP protein and the activity of caspase-3.
  • FIG. 5CD shows the cleavage of PARP protein and the activity of caspase-3 in MKN45 cells.
  • FIG. 6 shows a flow cytometric analysis of apoptotic cells after adenovirus-mediated expression of p53-p63 hybrid.
  • FIG. 7 shows the therapeutic effect of adenovirus-mediated expression of p53 family members in subcutaneously transplanted human cancer xenografts.
  • FIG. 8 shows the therapeutic effect of adenovirus-mediated expression of p53 family members in MKN45 xenografts.
  • FIG. 9 shows the expression of p53 target and apoptosis-related proteins in human cancer cell lines after adenovirus-mediated transfection of p53-p63 hybrid.
  • FIG. 10 shows efficient transactivation of p53AIP1 by p63-53O hybrid.
  • FIG. 11 is a diagram showing antagonism of p53AIP1 siRNA against induction of apoptosis by p63-53O.
  • 12A-D are diagrams showing strong induction of apoptosis in cancer cells of superhybrid p53.
  • FIG. 12E-G shows strong induction of apoptosis in cancer cells of super hybrid p53.
  • FIG. 13 is a schematic diagram of constructs of p53 (dark gray), p63 ⁇ (light gray), 63-53O, and p53 family hybrid.
  • FIG. 14 shows that the structure of the p53 family hybrid construct was confirmed by PCR and Western blotting.
  • FIG. 15 shows a comparison of apoptosis induction in various cancer cells by p53, p63 ⁇ , p63-53O, and p53 family hybrids.
  • FIG. 16 shows intracellular localization of p53, p63 ⁇ , p63-53O and p53 family hybrid proteins.
  • FIG. 17 shows specific p53AIP1 expression induction by p53, p63 ⁇ , p63-53O and SHp53.
  • FIG. 18A shows gene expression profiling induced by SHp53.
  • 18B-D show gene expression profiling induced by SHp53.
  • FIG. 19 is a diagram showing a gene group specifically induced by SHp53 confirmed by a real-time RT-PCR method.
  • FIG. 20 is a diagram showing a gene group whose expression is specifically induced by SHp53 confirmed by the real-time RT-PCR method.
  • FIG. 21 is a view showing a group of genes specifically induced by SHp53 confirmed by a real-time RT-PCR method.
  • FIG. 22 is a diagram showing control of transactivation of a target gene specific to super hybrid p53.
  • FIG. 23 shows a target gene having a site to which SHp53 specifically binds.
  • FIG. 24 is a diagram showing the induction of apoptosis of super hybrid p53 by controlling the expression of a specific target gene.
  • Enzyme reaction and purification techniques shall be performed according to the manufacturer's specifications, as is commonly done in the art or as described herein.
  • the terms used herein for analytical chemistry, synthetic organic chemistry and medicinal chemistry and medicinal chemistry, as well as their experimental procedures and techniques, are well known and commonly used in the art. Standard techniques shall be used for chemical synthesis, chemical analysis, drug production, formulation and delivery, and treatment of subjects.
  • One aspect of the present invention is a chimeric protein comprising (i) an N-terminal region containing a transcriptional activation domain and a DNA binding domain derived from p63, and a C-terminal region containing an oligomerization domain derived from p53 and / or its It consists of p53AIP1, CASP10, KCNK3, and PYCARD, which contains a functional variant and / or a nucleic acid molecule encoding the chimeric protein or a functional variant thereof (hereinafter sometimes collectively referred to as “chimeric molecule”)
  • An expression inducer or expression-inducing composition for at least one gene selected from the group, (ii) use of the chimeric molecule for the production of the expression-inducing agent or expression-inducing composition, (iii) p53AIP1, At least selected from the group consisting of CASP10, KCNK3 and PYCARD And (iv) an effective amount of said chimeric molecule for inducing the
  • the chimeric protein of the present invention (sometimes referred to as “hybrid protein”) is a chimeric protein of p53 and p63. Therefore, it typically consists of p53 and p63 parts, the N-terminal region of the chimeric protein is composed of a part derived from p63, and the C-terminal region is composed of a part derived from p53.
  • the nucleic acid sequences of human p53 and p63 are accession numbers (accession numbers) NM_000546 and AB016072, respectively, and the amino acid sequences are accession numbers NP_000537 and BAA32592, respectively, and the GenBank database (http: //www.ncbi.nlm.nih available from .gov /).
  • the sequences of p53 and p63 are also shown herein as SEQ ID NOs: 193 and 195 (nucleic acid sequences) and SEQ ID NOs: 194 and 196 (amino acid sequences).
  • P53 and p63 in the present invention may be independently derived from any species, but mammals including humans, monkeys, dogs, cats, cows, horses, mice, rats, guinea pigs, rabbits, pigs, etc. It may be derived from animals, particularly humans. In this specification, unless otherwise specified, the positions of amino acids and bases depend on human p53 and p63, more specifically, the amino acid or base sequences described in SEQ ID NOs: 193 to 196.
  • p53 and p63 a structure containing three functional domains, a transcription activation domain, a DNA binding domain and an oligomerization domain, is conserved among various species.
  • Each domain structure of human p53 and p63 is known (for example, JP 2000-354488, ScoumanneumA. Et al., Cancer Biol Ther. 2005 Nov; 4 (11): 1178-85, Tafmul A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 11; 108 (2): 563-8, Natan E et al., J Mol Biol. 2011 Jun 10; 409 (3): 358-68, Khoury MP & Bourdon JC, Cold Spring Harb Perspect Biol.
  • the transcriptional activation domain of human p63 is typically positions 1 to 59, particularly 1 to 58 of SEQ ID NO: 196, and the DNA binding domain of human p63 is typically positions 124 to 323 of SEQ ID NO: 196, particularly 124-319, even 142-323, 142-321 or 142-319, human p53 oligomerization domains are typically positions 318-363, particularly 318-359, 319 of SEQ ID NO: 194. ⁇ 359, 322 to 359, 319 to 363, 325 to 363, 325 to 355, 326 to 356, or 326 to 355.
  • each domain in other species is known, or it may be determined by alignment with the sequence of a species whose domain structure is known, or experiments using deletion mutants or substitution mutants. it can.
  • the transcriptional activation domain is positions 1 to 58 of SEQ ID NO: 196 (SEQ ID NO: 162)
  • the DNA binding domain is positions 124 to 319 of SEQ ID NO: 196 (SEQ ID NO: 166)
  • the oligomerization domain is a sequence No. 194, positions 322 to 359 (SEQ ID NO: 198).
  • the transcriptional activation domain is positions 1 to 58 of SEQ ID NO: 196 (SEQ ID NO: 162)
  • the DNA binding domain is positions 124 to 319 of SEQ ID NO: 196 (SEQ ID NO: 166)
  • the oligomerization domain is It is positions 319 to 359 of SEQ ID NO: 194 (SEQ ID NO: 178).
  • the chimeric protein of the present invention includes all sequences present in the wild-type p53 and p63 between the three functional domains of the transcriptional activation domain, DNA binding domain and oligomerization domain, and on the C-terminal side of the oligomerization domain. However, it may be included partially or not at all. In one aspect of the invention, it comprises at least 1, for example 1 to 61 amino acids between the DNA binding domain and the oligomerization domain. This amino acid may be derived from p53 or p63, and when it contains two or more amino acids, it may further contain both an amino acid derived from p53 and an amino acid derived from p63.
  • the chimeric protein of the present invention comprises between the DNA binding domain and the oligomerization domain, from p320 position 320 to C-terminal 33 amino acids and / or p53 position 319 to N-terminal. It may contain up to 28 amino acids.
  • the chimeric protein of the present invention comprises (1) an amino acid at positions 305 to 317 of p53, (2) an amino acid at positions 290 to 317 of p53, and (3) an amino acid at p63 between the DNA binding domain and the oligomerization domain.
  • amino acids at positions 320 to 335 Any combination of amino acids at positions 320 to 335, (4) amino acids at positions 320 to 352 of p63, and (5) (1) to (4) (ie, (1) and (3), (1) And (4), (2) and (3), and (2) and (4) in combination).
  • the amino acid (1) or (2) is typically linked to the N-terminus of the oligomerization domain
  • the amino acid (3) or (4) is typically linked to the C-terminus of the DNA binding domain. It is connected.
  • the chimeric protein comprises from the 360th amino acid of p53 to 34 amino acids at the C-terminus of the oligomerization domain, such as, but not limited to, one amino acid at position 360, 360- Three amino acids at position 362 and 34 amino acids at positions 360 to 393 are linked.
  • the chimeric protein comprises at least one amino acid of any of the above between the DNA binding domain and the oligomerization domain and at the C-terminus of the oligomerization domain.
  • the chimeric protein comprises a nuclear translocation signal (NLS) sequence derived from p53 or a partial sequence thereof.
  • the nuclear translocation signal derived from p53 is an amino acid at positions 305 to 321 (SEQ ID NO: 190), and examples thereof include amino acids at positions 319 to 321.
  • the chimeric protein comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 and 160.
  • the chimeric protein consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 and 160.
  • the functional variant of the chimeric protein includes (i) one or more, for example, one or several (for example, 2, 3, 4 or 5) with respect to the amino acid sequence of the chimeric protein of the present invention. And (ii) a full-length amino acid sequence of the chimeric protein of the present invention and 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% A variant having a sequence homology of 95% or more, 98% or more, or 99% or more, and having the function of the chimeric protein, (iii) a stringent nucleic acid molecule encoding the full length of the chimeric protein of the present invention It includes a variant encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under various conditions and having the function of the chimeric protein.
  • stringent conditions refers to parameters well known in the art. Parameters for nucleic acid hybridization are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing (1992) and other standard protocols.
  • the stringent conditions used in this specification are 3.5 ⁇ SSC, Ficoll 0.02%, polyvinylpyrrolidone 0.02%, bovine serum albumin 0.02%, NaH 2 PO 4 25 mM (pH 7 ), Hybridization at 65 ° C. with a hybridization buffer containing 0.05% SDS and 2 mM EDTA.
  • SSC is pH 5 0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate
  • SDS is sodium dodecyl sulfate
  • EDTA is ethylenediaminetetraacetic acid.
  • the membrane to which the DNA has been transferred is washed with 2 ⁇ SSC at room temperature and then with 0.1 to 0.5 ⁇ SSC / 0.1 ⁇ SDS at a temperature up to 68 ° C.
  • stringent hybridization using a commercially available hybridization buffer for example, using ExpressHyb (R) buffer solution (Clontech Corp., Ltd.), may utilize a hybridization and washing conditions described by the manufacturer .
  • Examples of the function of the chimeric protein include induction of expression of at least one gene selected from the group consisting of p53AIP1, CASP10, KCNK3, and PYCARD, induction of apoptosis, suppression of cell proliferation, and the like. Whether or not the chimeric protein has these functions can be confirmed by any known technique, for example, the technique described in the Examples below.
  • the functional variant of the chimeric protein may have one or more, for example, one or several conservative amino acid substitutions.
  • Conservative amino acid substitutions can be determined based on the compatibility of amino acid residues with similar side chains. For example, a group of amino acids having an aliphatic side chain is glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine, a group of neutral amino acids having a hydroxyl group-containing side chain is serine and threonine, and a group of amino acids having an amide-containing side chain.
  • the group is asparagine and glutamine
  • the group of amino acids with aromatic side chains is phenylalanine, tyrosine and tryptophan
  • the group of amino acids with basic side chains is lysine
  • arginine and histidine and has sulfur-containing side chains
  • a group of amino acids is cysteine and methionine.
  • Suitable conservative amino acid substitution groups include, but are not limited to, valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, and asparagine-glutamine.
  • a conservative amino acid substitution is present in at least one of the three functional domains of the transcriptional activation domain, DNA binding domain and oligomerization domain of the chimeric protein, a portion other than the functional domain described above, for example, transcription It may be present between the activation domain and the DNA binding domain, between the DNA binding domain and the oligomerization domain, or on the C-terminal side of the oligomerization domain.
  • one or more mutations eg, amino acid deletions, substitutions, additions, are between the transcriptional activation domain and the DNA binding domain, and between the DNA binding domain and the oligomerization domain. , Present at a location selected from the C-terminal side of the oligomerization domain.
  • the nucleic acid molecule encoding the above chimeric protein or a functional variant thereof can be determined based on the amino acid sequence of the above chimeric protein or a functional variant thereof. For example, for nucleic acid molecules encoding human p53 and p63 chimeric proteins, depending on the human p53 and p63 nucleic acid sequences (SEQ ID NO: 193 and 195), The corresponding nucleic acid sequence can be determined. Specific examples of the nucleic acid molecule include or consist of a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 and 159, for example. Things.
  • the nucleic acid molecule that can be used in the gene expression inducing agent of the present invention is a degenerate product of the above nucleic acid molecule, that is, the nucleic acid molecule differs from the nucleic acid sequence due to the degeneracy of the gene codon but encodes a protein having the same amino acid sequence. Including what to do.
  • the above chimeric molecule induces the expression of at least one gene selected from the group consisting of p53AIP1, CASP10, KCNK3 and PYCARD.
  • Induction of gene expression in the present invention typically means that expression of a transcription product or protein of the gene is increased as compared to the case where wild-type p53 or p63 is introduced.
  • Expression increase in the present invention is 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, 5 times or more, 5.5 times More than 6 times, more than 6 times, more than 6.5 times, more than 7 times, more than 7.5 times, more than 8 times, more than 8.5 times, more than 9 times, more than 9.5 times, or more than 10 times Also good.
  • the above chimeric molecule may further induce the expression of at least one of the genes listed in Tables 7 to 8, for example.
  • the induced gene is AGRN, APOBEC2, AQP3, ARGGAP23, ASB17, BAI1, C15orf52, C3orf45, CACNA1A, CASP10, CDH3, CITED1, CLDN19, COL16A1, DDR1, DLGAP1, DMX1, DDL3D , EGR2, FBP2, FGF1, GAST, GPR89A, GRHL3, GRRP1, HVCN1, IL2RB, IL8RB, ITGA3, KATNAL2, KCNA2, KCNK3, KRT17, KRT34, LHX1, MLL, MYH3, MYH3, MYH3, MYH3 , NPPC, NTF4, p53AIP1, PLCD4, PYCARD, S
  • the chimeric molecule of the present invention can be produced by any method known in the art.
  • the nucleic acid molecule (chimeric gene) encoding the chimeric protein of the present invention is not limited to, for example, an overlap extension method (for example, Heckman KL & Pease LR., Nat Protoc 2007; 2: 924-932, Ogasawara Y et al., J Biol Chem 1994; 269: 29785-29792, etc.) and the like.
  • a hybrid primer comprising a portion complementary to the sequence of the first gene and a portion complementary to the sequence of the second gene, such as, but not limited to, the p63 DNA binding domain and its C
  • the sequence of the portion comprising the portion continuing to the terminal side or the portion complementary to the sequence of the C-terminal portion thereof, the sequence of the portion comprising the oligomerization domain of p53 and the portion continuing to the N-terminal side, or the N-terminal portion thereof
  • a hybrid primer containing a portion complementary to the sequence can be used.
  • the chimeric protein of the present invention is not limited, and for example, a chimeric gene obtained by a known technique is introduced into an appropriate host cell and expressed, and the obtained protein is known by a known technique, for example, one-dimensional or two-dimensional. It can be obtained by purification by a dimensional gel electrophoresis method, a chromatography method such as liquid chromatography, an affinity column method or the like.
  • Introduction of the chimeric molecule of the present invention into cells may be any known introduction method such as, but not limited to, calcium phosphate method, lipofection method, ultrasonic introduction method, electroporation method, particle gun method, virus vector (for example, , An adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, or the like), a microinjection method, or the like can be used.
  • virus vector for example, An adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, or the like
  • a microinjection method or the like
  • the virus titer is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 15 p. f. u. (Plaque forming unit), preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 13 , more preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 11 , and even more preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 be able to.
  • the nucleic acid molecule may be used as a naked nucleic acid or incorporated into various nucleic acid constructs or vectors.
  • any known vector such as a plasmid vector, a phage vector, a phagemid vector, a cosmid vector, or a virus vector can be used.
  • the nucleic acid construct or vector preferably contains at least appropriate transcriptional or translational control sequences derived from, for example, mammalian, microbial, viral, or insect genes.
  • regulatory sequences include sequences that have a regulatory role in gene expression, such as transcription promoters or enhancers, operator sequences for regulating transcription, sequences encoding ribosome binding sites within messenger RNA, and transcription, translation initiation Or an appropriate sequence that regulates transcription termination.
  • the detailed nature of the regulatory sequences required for gene expression may vary depending on the species of organism or cell type, but in general, at least for the initiation of transcription and translation, respectively, such as TATA box, capping sequence, CAAT sequence, etc. It may include 5 'non-transcribed and 5' untranslated sequences involved.
  • such 5 'non-transcriptional control sequences can include a promoter region, including a promoter sequence for transcriptional regulation of operably linked genes.
  • the control sequence may also include an enhancer sequence or a desired upstream activator sequence.
  • the nucleic acid constructs and vectors may optionally include a 5 'leader or signal sequence. The selection and design of appropriate nucleic acid constructs and vectors is within the ability and discretion of those skilled in the art.
  • Particularly useful regulatory sequences include promoter regions from various mammalian, viral, microbial, and insect genes. This promoter region directs the initiation of transcription of the gene of interest and results in the transcription of all DNA containing the gene of interest.
  • Useful promoter regions include CAG promoter, retroviral dLTR promoter, cytomegalovirus (CMV) enhancer / promoter region, RSV LTR promoter, lac promoter, and promoters isolated from adenovirus, but eukaryotic. Any other promoter known to those skilled in the art useful for gene expression in organisms, prokaryotes, viruses, or microbial cells can also be used.
  • promoters that are particularly useful for expressing genes and proteins in eukaryotic cells are derived from mammalian cell promoter and enhancer sequences such as polyoma virus, adenovirus, SV40 virus, and human cytomegalovirus. Includes what is being done. Viral early and late promoters, typically found adjacent to the viral origin of replication of viruses such as SV40, are particularly useful. The selection of a particular useful promoter depends on a variety of other parameters for the cell line and the nucleic acid construct used to express the protein or nucleic acid of interest within the particular cell line. Furthermore, any promoter known to cause the target cell to express the gene at a sufficiently high level useful in the present invention can be selected.
  • a gene can be efficiently expressed in a specific target cell by employing a promoter specific to the target cell (such as a cancer cell).
  • tissue-specific promoter include, but are not limited to, GFAP promoter (spinal cord, hippocampus, linear neuron), MCK promoter (muscle, etc.), NSE promoter (CNS, etc.), desmin promoter (cardiac muscle, skeletal muscle, etc.) ), RhMLV promoter (bone), osteocalcin promoter (bone) and the like (see Howarth JL et al., Cell Biol Toxicol. 2010 Feb; 26 (1): 1-20 etc.).
  • the nucleic acid molecule of the present invention is preferably operably linked to such a regulatory sequence.
  • a nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence means that the nucleic acid and the regulatory sequence are arranged so that the protein encoded by the nucleic acid is appropriately produced by the action of the regulatory sequence. means. More specifically, the coding sequence of the nucleic acid molecule and the control sequence of the nucleic acid construct or vector are linked in such a way that expression or transcription of the coding sequence is under the influence or control of the control sequence. Are “operably” connected.
  • the two DNA sequences result in transcription of the coding sequence as a result of induction by a promoter in the 5 'regulatory sequence, and the two DNA sequences
  • the nature of the linkage between (1) does not result in inducing a frameshift mutation, (2) does not interfere with the ability of the promoter to direct transcription of the coding sequence, or (3) a protein It is “operably linked” if it does not interfere with the ability of the corresponding RNA transcript to be translated into.
  • a promoter region is operably linked to a coding sequence if the promoter region can transcribe its DNA sequence such that the resulting transcript is translated into the desired protein or polypeptide.
  • the “effective amount for inducing the expression of at least one gene selected from the group consisting of p53AIP1, CASP10, KCNK3, and PYCARD” in the present invention introduces the expression of the gene, for example, wild-type p53 or p63. 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, 5 times or more, 5.5 times compared to the case More than 6 times, more than 6.5 times, more than 7 times, more than 7.5 times, more than 8 times, more than 8.5 times, more than 9 times, more than 9.5 times, or more than 10 times Yes, it can be easily determined by comparison with wild type p53 or p63.
  • chimera molecules may be used alone or in combination of one or more.
  • chimeric molecules that can induce the expression of different types of genes By combining chimeric molecules that can induce the expression of different types of genes, more genes can be induced.
  • the gene group induced by the chimeric molecule of the present invention is partially different from that induced by wild-type p53 and p63, but is largely different, so that wild-type p53, p63, Furthermore, it can also be used in combination with p73 (hereinafter sometimes collectively referred to as a wild-type p53 family molecule).
  • the present invention also provides (i) the chimeric molecule or the gene expression inducer described above, or an apoptosis inducer or composition for inducing apoptosis, and (ii) the apoptosis inducer or the composition for inducing apoptosis of the chimeric molecule. (Iii) a chimeric molecule for inducing apoptosis, and (iv) a composition comprising an effective amount of the chimeric molecule for inducing apoptosis. Unless otherwise specified, the present embodiment of the chimeric molecule in this aspect of the present invention is as described above for the gene expression inducer.
  • the gene whose expression is induced by the above chimeric protein and / or functional variant thereof includes an apoptosis-related gene.
  • genes include, but are not limited to, p53AIP1, CASP10, KCNK3, and PYCARD genes.
  • p53AIP1 is known to be an important factor in apoptosis induced by p53 (for example, Oda K et a., Cell. 2000 Sep 15; 102 (6): 849-62), and CASP10 is a cell death. It encodes caspase-10 that initiates apoptosis by inducible signal complex (DISC) (Tibbetts MD MD et al., Nat Nat Immunol 2003; IV 4: 404-409).
  • DISC inducible signal complex
  • PYCARD encodes a CARD-containing apoptosis-related spec-like protein (ASC) and plays an important role in apoptosis, immune response and cancer development (Masumoto J et al., J Biol Chem 1999; 274: 33835-33838).
  • ASC apoptosis-related spec-like protein
  • Induction of apoptosis in the present invention is carried out by introducing the above-described chimeric molecule into a cell, and various known techniques such as DNA fragmentation, binding of annexin V to the cell membrane, change in mitochondrial membrane potential, activation of caspase, PARP It can be evaluated by detecting a phenomenon peculiar to apoptosis such as protein cleavage, measuring the proportion of cells in sub-G1, and TUNEL staining. Induction of apoptosis in the present invention is typically higher than the state where the chimeric molecule is not introduced, and preferably higher than the state where wild-type p53 or p63 is introduced.
  • the degree of increase in apoptosis induction is, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, as compared with a state where no chimeric molecule is introduced or a state where wild type p53 or p63 is introduced. Times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, 5 times or more, 5.5 times or more, 6 times or more, 6.5 times or more, 7 times or more, 7.5 times or more, 8 It may be twice or more, 8.5 times or more, 9 times or more, 9.5 times or more, or 10 times or more.
  • Effective amount for inducing apoptosis is, for example, 1.5 times or more compared to a state in which apoptosis is not introduced or a state in which wild-type p53 or p63 is introduced, 2 times or more, 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, 5 times or more, 5.5 times or more, 6 times or more, 6.5 times or more, 7 times or more, 7.5 times or more, 8 times or more, 8.5 times or more, 9 times or more, 9.5 times or more, or 10 times or more, which can be easily increased by comparison experiments with the above conditions Can be determined.
  • the chimera molecule of the present invention may be used alone or in combination of one or more. By combining chimeric molecules capable of inducing the expression of different types of genes, it is expected that more genes are induced and apoptosis is more strongly induced.
  • the gene group induced by the chimeric molecule of the present invention is largely different from that induced by wild-type p53 and p63, but is almost different in wild-type p53 and p63. Since proapoptotic genes (CASP10, KCNK3, PYCARD, etc.) that are not used can be induced, it is expected to induce apoptosis more strongly when used in combination with wild-type p53 family molecules.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the chimeric molecule or the gene expression inducer.
  • the chimeric molecule or the gene expression inducer is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition because it can induce expression of a specific gene or apoptosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise the above chimeric molecule or the above gene expression inducer and one or more pharmaceutically acceptable surfactants, carriers, diluents and / or excipients. .
  • Pharmaceutically acceptable carriers, diluents and the like are well known in the pharmaceutical arts, e.g., Remington's Pharmaceuticals Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), which is incorporated herein in its entirety. ) Etc.
  • the pharmaceutical composition is not limited, and is a gene whose expression is induced by the above-described chimeric molecule, a disease in which induction of apoptosis is useful for its treatment, such as a disease associated with abnormal expression of the gene, cell proliferation It can be used for the treatment of sex diseases. Therefore, the present invention also provides (i) a pharmaceutical composition for the treatment of a disease in which induction of apoptosis is useful, comprising the above-described chimeric molecule or the gene expression inducer, and (ii) induction of apoptosis of the chimeric molecule.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of a disease for which is useful (iii) the chimeric molecule for the treatment of a disease for which the induction of apoptosis is useful, and (iv) of the disease for which the induction of apoptosis is useful It relates to a pharmaceutical composition comprising an effective amount of said chimeric molecule for treatment.
  • the present embodiment of the chimeric molecule in this aspect of the present invention is as described above for the gene expression inducer.
  • cell proliferative diseases include, but are not limited to, benign or malignant tumors, hyperplasia, keloid, Cushing's syndrome, primary aldosteronism, erythema, polycythemia vera, leukoplakia, hyperplastic scar, Includes lichen planus and melanosis.
  • the cell proliferative disorder is cancer.
  • cancer targeted by the present invention examples include, but are not limited to, fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, angiosarcoma, Kaposi sarcoma, lymphangiosarcoma, Sarcomas such as synovial sarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, brain tumor, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, Anal cancer, renal cancer, ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, skin cancer and other cancers, as well as leukemia and malignant lymphoma .
  • cancer includes epithelial malignant tumors and non-epithelial malignant tumors.
  • the cancer in the present invention may be any part of the body, for example, brain, head and neck, chest, limbs, lung, heart, thymus, esophagus, stomach, small intestine (duodenum, jejunum, ileum), large intestine (colon, cecum, appendix).
  • liver pancreas, gallbladder, anus, kidney, ureter, bladder, prostate, penis, testis, uterus, ovary, vulva, vagina, skin, striated muscle, smooth muscle, synovium, cartilage, bone, thyroid , Adrenal glands, peritoneum, mesentery, bone marrow, blood, vascular system, lymph nodes such as lymph nodes, lymph fluid, etc.
  • cancer targeted by the present invention is a cancer composed of cancer cells having mutations in p53.
  • the mutation of p53 include deletion of p53 and amino acid substitution in p53.
  • the amino acid substitution in p53 is not limited.
  • Amino acid substitutions such as G244S, G245S, G245D, M246L, P250L, L257P, D259V, R273C, R273H, V274F, G279E, G279V, G279R, D281N, D281E, R282Q, E286K, etc.
  • Whether or not a cancer cell has the mutation can be determined by analyzing the p53 gene of the cancer cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise other agents useful for treating the target disease, such as antitumor agents, anti-inflammatory agents, vitamins and the like.
  • antitumor agent include, but are not limited to, alkylating agents such as ifosfamide, nimustine (eg, nimustine hydrochloride), cyclophosphamide, dacarbazine, melphalan, ranimustine, gemcitabine (eg, gemcitabine hydrochloride), enocitabine, Cytarabine ocphosphatate, cytarabine preparation, tegafur uracil, tegafur gimeracil oteracil potassium combination drug (eg TS-1), antimetabolite such as doxyfluridine, hydroxycarbamide, fluorouracil, methotrexate, mercaptopurine, idarubicin (eg hydrochloric acid hydrochloride) Idarubicin), epirubicin (eg epi
  • Anti-inflammatory agents include, but are not limited to, steroidal anti-inflammatory agents (prednisolone, beclomethasone, betamethasone, fluticasone, dexamethasone, hydrocortisone, etc.) and nonsteroidal anti-inflammatory agents (acetylsalicylic acid, loxoprofen, acetaminophen, ketoprofen, thiaprofen) Acid, suprofen, tolmethine, carprofen, benoxaprofen, piroxicam, benzidamine, naproxen, diclofenac, ibuprofen, diflunisal, azapropazone, etc., RNAi molecules that suppress the expression of inflammatory cytokines (eg, siRNA, shRNA, ddRNA, miRNA, piRNA, rasiRNA, etc.), substances such as antisense nucleic acids, and / or drugs that suppress the action of inflammatory cytokines, eg , And antibodies to the
  • Vitamins include, but are not limited to, VA (retinol), VB1 (thiamine), VB2 (riboflavin), VB3 (niacin), VB5 (pantothenic acid), VB6 (pyridoxine), VB7 (biotin), VB9 (folic acid), Examples thereof include VB12 (cyanocobalamin), VC (ascorbic acid), VD (calciferol), VE (tocopherol) and VK (phylloquinone), and derivatives and analogs thereof.
  • p53 induces the expression of pro-apoptotic genes, but also induces the expression of apoptosis-suppressing genes.
  • apoptosis-suppressing genes include, but are not limited to, p21 (NM_000389), SFN (Stratifin, 14-3-3 Sigma, NM_006142), Gadd45 (NM_001924), p300 (EP300, NM_001429), BTG2 (TIS21, NM_006763) CAV1 (NM_001753), DUSP5 (NM_004419), EGFR (NM_005228), HGF (SF, NM_000601), MET (NM_000245), PCNA (NM_002592), PLAGL1 (ZAC, BC074814), SESN1 (PA26, AF033120), SH2D1AAP NM_002351), TGFA (NM
  • the dominant negative mutant of the p53 family protein includes, but is not limited to, for example, human p53 having the following mutations: G117E, P152T, T155I, R156P, R175H, P177S, P177F, P177H, H179Y, E180K, R181G, R181H, N239S, S241T, S241F, C242Y, G244S, G245S, G245D, M246L, P250L, L257P, D259V, R273C, R273H, V274F, G279E, G279V, G279R, D281N, D28E 2004, Blagosklonny et al., 2000, Monti et al., 2002).
  • the chimeric molecule when used for induction of gene expression, induction of apoptosis, treatment of cell proliferative disease, etc., by simultaneously suppressing the expression of these apoptosis-suppressing genes and dominant negative mutants, The effect can be increased.
  • the chimeric molecule is a substance that inhibits the expression of the apoptosis-suppressing gene or dominant negative mutant (for example, an RNAi molecule against the apoptosis-suppressing gene or dominant negative mutant (for example, siRNA, shRNA, ddRNA, miRNA, piRNA, substances such as rasiRNA), ribozymes, antisense nucleic acids (including RNA, DNA, PNA, or composites thereof), substances having a dominant negative effect such as dominant negative mutants of apoptosis-inhibiting proteins, or expression thereof Vector).
  • an RNAi molecule against the apoptosis-suppressing gene or dominant negative mutant for example, siRNA, shRNA, ddRNA, miRNA, piRNA, substances such as rasiRNA
  • antisense nucleic acids including RNA, DNA, PNA, or composites thereof
  • substances having a dominant negative effect such as dominant negative mutants of apoptosis-inhibiting proteins, or expression thereof Vector
  • nucleic acid molecules that inhibit the expression of dominant negative mutants of p53 family proteins may target the coding region of the mutant gene, but target its untranslated region, particularly the 3′UTR of p53 family mRNA, While specifically knocking down all endogenous dominant negative proteins, intact chimeric molecules or exogenous wild-type p53 family proteins expressed from the agents or compositions of the present invention that would contain only the coding region Can remain.
  • nucleic acid molecules when two or more kinds of chimeric molecules and / or wild type p53 family molecules are used in combination, two or more kinds of molecules are combined into a single composition. Even if included, they may be included separately in a plurality of compositions and used in combination.
  • nucleic acid molecules two or more nucleic acid molecules can be incorporated into a single nucleic acid construct or vector, or can be prepared as a combination of multiple nucleic acid constructs or vectors each containing one nucleic acid molecule. Good.
  • each nucleic acid molecule may be under the control of a common control sequence or under the control of multiple control sequences of the same type. It may be under the control of different regulatory sequences.
  • this embodiment is useful when nucleic acid molecules are used in combination, in which the effect cannot be obtained unless they are expressed at the same time, or an adverse effect occurs.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be carried on a nucleic acid construct or vector described in WO 2009/125607. This nucleic acid construct and vector can cositronically express a desired gene and a nucleic acid molecule that inhibits the expression of the undesired gene.
  • the above-described chimeric molecule can be used by being supported on various drug delivery carriers.
  • drug delivery carriers include, but are not limited to, polymer nanoparticles, polymer micelles, dendrimers, liposomes, virus nanoparticles, carbon nanotubes and the like (Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1; 14 (5) See 1310-6 etc.). These carriers may be targeted to the desired target cell or target tissue. Targeting can be accomplished by any known technique.
  • it is not limited, for example, passive by making the formulation 50 to 200 ⁇ m in diameter suitable for the expression of EPR (enhanced permeability and retention) effect, particularly 75 to 150 ⁇ m.
  • Targeting CD19, HER2, transferrin receptor, folate receptor, VIP receptor, VEGFR, ⁇ v ⁇ 3, VCAM-1, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2): E128-47, Ranganathan R et al. , Int J Nanomedicine. 2012; 7: 1043-60), RAAG10 (special table 2005-532050), PIPA (special table 2006-506071), KID3 (special table 2007-529197) and other ligands, RGD motif and NGR motif F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68), retinol, retinoic acid What retinoids (WO 2008/120815) and the like can be used techniques such as active targeting for use as a targeting agent.
  • Other targeting methods include, for example, a method using a magnetic carrier such as magnetic nanoparticles (see, for example, Charles L., Oncotarget. 2012 April; (3 (4):-365-370), pH-responsive nanoparticles, etc. (For example, Gao W., Mol Pharm. 2010 December 6; (7 (6): 1913-1920), a method using a fluorescent carrier (for example, Jiang S. et al., J R Soc Interface. 2010 Jan 6; 7 (42): 3-18 etc.), methods using extracellular activation carriers such as extracellular activated nanoparticles (eg, Gullotti E. et al., Mol Pharm. 2009 Jul-Aug; see 6 (4): 1041-1051 etc.).
  • a magnetic carrier such as magnetic nanoparticles
  • a fluorescent carrier for example, Jiang S. et al., J R Soc Interface. 2010 Jan 6; 7 (42): 3-18 etc.
  • extracellular activation carriers such as extracellular activated nanoparticles
  • the agents and compositions of the present invention may be used in various routes including both oral and parenteral, such as, without limitation, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, rectal, intratumoral, intraarterial, portal.
  • dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, etc.
  • Suitable dosage forms include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and injections prepared at the time of use.
  • Formulations for parenteral administration can be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • compositions of the present invention may be supplied in any form, but from the viewpoint of storage stability, for example, a form that can be prepared at the time of use, for example, Alternatively, it may be provided in a form that can be prepared by a doctor and / or pharmacist, nurse, or other paramedical at or near a medical site. Such a form is particularly useful when the agent or composition of the present invention contains components that are difficult to stably store, such as lipids, proteins, and nucleic acids.
  • the agent or composition of the present invention is provided as one or more containers containing at least one of the essential components thereof and is used before use, for example within 24 hours, preferably 3 Prepared within an hour and more preferably immediately before use.
  • reagents, solvents, dispensing devices and the like that are usually available at the place of preparation can be appropriately used.
  • the present invention provides a preparation kit for a composition
  • a preparation kit for a composition comprising one or more containers containing active ingredients that can be contained in the various agents or compositions of the present invention alone or in combination, and such a kit.
  • the necessary components of various agents or compositions provided in the form of may contain instructions describing how to prepare and administer the various agents or compositions of the present invention, such as instructions and electronic recording media such as CDs and DVDs. Good.
  • the kit of this invention may contain all the components for completing the various agents or compositions of this invention, it does not necessarily need to contain all the components. Therefore, the kit of the present invention may not contain reagents and solvents that are usually available at medical sites, experimental facilities, etc., such as sterile water, physiological saline, and glucose solution.
  • One aspect of the present invention relates to a method using the chimeric molecule of the present invention.
  • One embodiment of this one aspect of the present invention relates to a method for inducing gene expression using the chimeric molecule or gene expression inducer of the present invention.
  • the gene expression induction method of the present invention may include a step of introducing the chimeric molecule or gene expression inducer of the present invention into a cell.
  • the specific introduction method is as described above for the gene expression inducer. Examples of genes that can be induced by this method include those listed in Tables 7 to 8.
  • the induced gene is AGRN, APOBEC2, AQP3, ARGGAP23, ASB17, BAI1, C15orf52, C3orf45, CACNA1A, CASP10, CDH3, CITED1, CLDN19, COL16A1, DDR1, DLGAP1, DMX1, DDL3D , EGR2, FBP2, FGF1, GAST, GPR89A, GRHL3, GRRP1, HVCN1, IL2RB, IL8RB, ITGA3, KATNAL2, KCNA2, KCNK3, KRT17, KRT34, LHX1, MLL, MYH3, MYH3, MYH3, MYH3 , NPPC, NTF4, p53AIP1, PLCD4, PYCARD, SEC14 5, SEZ6, SLC47A2, SLCO2B1, SLCO2B1, SRL, STAR, SYTL3, TLX1, TMEM121, TP73, TP73, TTYH
  • the chimeric molecule or gene expression inducer is administered to the cells in an amount effective for gene expression induction.
  • the amount effective for gene expression induction is as described above for the gene expression inducer.
  • the method can be performed in vivo, invitro, or ex vivo. This method can be used for regulating the expression of a specific gene in a target cell.
  • the apoptosis induction method of the present invention may include a step of introducing the chimeric molecule, gene expression inducer or apoptosis inducer of the present invention into a cell.
  • the specific introduction method is as described above for the gene expression inducer.
  • the chimeric molecule or various agents are administered to the cells in an amount effective for inducing apoptosis.
  • the effective amount for inducing apoptosis is as described above for the apoptosis-inducing agent.
  • the method can be performed in vivo, invitro, or ex vivo. This method can be used to induce apoptosis in abnormally proliferating cells such as cancer cells.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for treating a disease using the chimeric molecule or pharmaceutical composition of the present invention.
  • the treatment method of the present invention includes a step of administering the chimeric molecule, various agents or pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • the subject to be administered typically requires treatment with a chimeric molecule or the like of the present invention.
  • the treatment method of the present invention may further comprise a step of identifying a subject in need of treatment with the chimeric molecule, various agents or pharmaceutical composition of the present invention.
  • specific examples of cell proliferative diseases are as described above for the pharmaceutical composition.
  • the chimeric molecule or the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with other agents or treatment methods useful for treating a target disease.
  • p53 mutations or deletions are associated with poor cancer prognosis and resistance to chemotherapy and radiation (Clarke et al., Oncogene 1994; 9: 1767-73, Merritt et al.,. Cancer Res 1994 ; 54: 614-7, Poeta et al., N Engl J Med 2007; 357: 2552-61, Patocs et al., N Engl J Med 2007; 357: 2543-51) Expected to improve cancer sensitivity to therapy and radiation therapy.
  • Agents that can be used in combination with the chimeric molecule or pharmaceutical composition of the present invention in the treatment of disease such as anti-tumor agents, anti-inflammatory agents, vitamins, etc., are as described above for the pharmaceutical compositions.
  • the treatment method of the present invention can be used in combination with physical therapy such as radiation therapy or surgical therapy such as surgery.
  • the effective amount in the treatment method of the present invention is, for example, an amount that reduces the symptoms of the disease or delays or stops the progression of the disease, and preferably an amount that suppresses or cures the disease. In addition, an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred. Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like and a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig, and such a test method is well known to those skilled in the art. . Moreover, the dose of the drug used in the treatment method of the present invention is known to those skilled in the art, or can be appropriately determined by the above-described test or the like.
  • Administration routes include various routes including both oral and parenteral, such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intramedullary, intradental, Sublingual, oral, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and intrauterine routes are included.
  • the frequency of administration varies depending on the properties of the agent and composition used and the conditions of the subject including the above, but for example, many times a day (ie, 2, 3, 4 or 5 times a day), 1 day a day Times, every few days (ie every 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, etc.), every week, every few weeks (ie every 2, 3, 4 weeks, etc.).
  • the term “subject” means any living individual, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • a subject may be healthy or suffer from some disease, but when treatment of a specific disease is intended, typically the subject is suffering from such disease.
  • treatment as used herein also encompasses all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate, or prevent disease. Shall.
  • the term “treatment” encompasses medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or stopping the progression of a disease, regression or disappearance of a lesion, prevention of onset or prevention of recurrence, and the like.
  • the present invention also provides a composition for providing the above-mentioned action comprising the chimeric molecule, use of the chimeric molecule in the production of a composition for providing the action, and the chimera for providing the action. It also relates to a molecule, a composition comprising an effective amount of the chimeric molecule to provide the action, and the use of the chimeric molecule to provide the action.
  • One aspect of the present invention is a novel KCNK3 protein and / or functional variant thereof, and / or a novel nucleic acid molecule encoding the protein or functional variant thereof (hereinafter sometimes collectively referred to as KCNK3-related molecule). Related to various uses.
  • KCNK3 encodes TWIK-related acid-sensitive potassium channel (TASK-1) and is known to be involved in the maintenance of cell membrane potential (Bayliss DA et al., Trends Pharmacol Sci 2008; 29: 566-575, Heitzmann D et al., EMBO J 2008; 27: 179-187, Bautista DM et al., Nat Neurosci 2008; 11: 772-779), prolonged survival after surgery for colorectal cancer patients (Cavalieri D et al., Oncol Res. 2007; 16 (11): 535-48), but the relationship with apoptosis has not been known so far. This time, for the first time, the present inventor has been revealed to be involved in the induction of apoptosis (see Examples).
  • one aspect of the present invention is to provide (i) an apoptosis-inducing agent or an apoptosis-inducing composition containing a KCNK3-related molecule, and (ii) a KCNK3-related molecule of the apoptosis-inducing agent or the composition for inducing apoptosis.
  • a composition comprising (iii) a KCNK3-related molecule for inducing apoptosis, and (iv) an effective amount of a KCNK3-related molecule for inducing apoptosis.
  • nucleic acid sequence and amino acid sequence of KCNK3 are known for various biological species.
  • nucleic acid sequence and amino acid sequence of human KCNK3 are obtained as Genbank accession numbers NM_002246 (SEQ ID NO: 201) and NP_002237 (SEQ ID NO: 202), etc. Is possible.
  • a functional variant of a KCNK3 protein is (i) a mutation of one or more, for example one or several (eg 2, 3, 4 or 5) amino acids in the amino acid sequence of the KCNK3 protein ( (Ii) a mutant having apoptosis-inducing ability, and (ii) a full-length amino acid sequence of KCNK3 protein and 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, A variant having a sequence homology of 95% or more, 98% or more, or 99% or more and having apoptosis-inducing ability, (iii) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule encoding the full length of the KCNK3 protein Mutants encoded by molecules and capable of inducing apoptosis are included.
  • Induction of apoptosis is performed by introducing the above-mentioned mutant into a cell, and various known methods such as DNA fragmentation, binding of annexin V to the cell membrane, change in mitochondrial membrane potential, activation of caspase, cleavage of PARP protein. It can be evaluated by detecting a phenomenon peculiar to apoptosis such as the above, measuring the proportion of cells in sub-G1, and TUNEL staining.
  • the nucleic acid molecule encoding the KCNK3 protein or functional variant thereof can be determined based on the known nucleic acid sequence of the KCNK3 gene (eg, SEQ ID NO: 201 for human KCNK3).
  • the nucleic acid molecule contained in the apoptosis inducer of the present invention is a degenerate product of a nucleic acid molecule based on a known nucleic acid sequence, that is, a protein having the same amino acid sequence as that of the nucleic acid molecule differs from the nucleic acid molecule due to the degeneracy of the gene codon. Including those that code.
  • Various aspects relating to the induction of apoptosis of KCNK3-related molecules are in principle as described above for the chimeric molecules of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides (i) a pharmaceutical composition for the treatment of a disease useful for inducing apoptosis comprising a KCNK3-related molecule, (ii) the treatment of a disease for which inducing apoptosis of a KCNK3-related molecule is useful.
  • a pharmaceutical composition for for the manufacture of a pharmaceutical composition for, (iii) a KCNK3-related molecule for the treatment of a disease in which induction of apoptosis is useful, and (iv) an effective amount for the treatment of a disease in which induction of apoptosis is useful
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a KCNK3-related molecule.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of apoptotic cell proliferative diseases comprising a KCNK3-related molecule.
  • the various aspects of KCNK3-related molecules relating to the treatment of diseases where induction of apoptosis is useful are in principle as described above for the chimeric molecules of the present invention.
  • the apoptosis-inducing method of the present invention may include a step of introducing the KCNK3-related molecule of the present invention or an apoptosis-inducing agent containing the same into a cell.
  • the specific introduction method is as described above for the gene expression inducer containing the chimeric molecule.
  • a KCNK3-related molecule or an apoptosis-inducing agent comprising the same is administered to a cell in an amount effective for inducing apoptosis.
  • the amount effective for inducing apoptosis is as described above for the apoptosis-inducing agent including the chimeric molecule.
  • the method can be performed in vivo, invitro, or ex vivo. This method can be used to induce apoptosis in abnormally proliferating cells such as cancer cells.
  • the treatment method of the present invention may comprise the step of administering to a subject a KCNK3-related molecule, or an agent or pharmaceutical composition comprising the same.
  • the subject to be administered typically requires treatment with a KCNK3-related molecule.
  • Such subjects include, but are not limited to, for example, diseases in which induction of apoptosis is useful for the treatment thereof, such as cell proliferative diseases, etc., diagnosed as having these diseases, or developing these diseases Subject to high risk.
  • the treatment methods of the present invention may further comprise the step of identifying a subject in need of treatment with a KCNK3-related molecule. Specific examples of cell proliferative disorders are as described above for pharmaceutical compositions comprising chimeric molecules.
  • One aspect of the present invention is a chimeric protein or a functional variant thereof comprising an N-terminal region containing a transcriptional activation domain derived from p63 and a DNA binding domain, and a C-terminal region containing an oligomerization domain derived from p53.
  • a nucleic acid molecule encoding the chimeric protein or a functional variant thereof, a nucleic acid construct or vector containing the nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule, and / or It relates to a composition comprising said nucleic acid construct and / or vector.
  • chimeric protein and functional variants thereof and the nucleic acid molecules, nucleic acid constructs, vectors and compositions encoding the same include a chimeric protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152 and a nucleic acid consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 151 As described above for chimeric molecules, except that no molecules are included.
  • a chimeric protein or functional variant thereof comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 154, 156, 158 and 160 Is done.
  • the functional variant of the present invention comprises (i) one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 140, 142, 144, 146, 148, 150, 154, 156, 158 and 160.
  • a variant having, for example, one or several (eg 2, 3, 4 or 5) amino acid mutations (eg conservative amino acid substitutions) and having the function of said chimeric protein (ii) sequence An amino acid sequence selected from the group consisting of the numbers 140, 142, 144, 146, 148, 150, 154, 156, 158 and 160, and 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, A variant having a sequence homology of 95% or more, 98% or more, or 99% or more, and having the function of the chimeric protein, (iii) SEQ ID NOs: 139, 141, 1 3, 145, 147, 149, 153, 155, 157 and 159, encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the nucleic acids, and has the function of the chimeric protein Mutants are included.
  • the present inventor can produce a chimeric protein having a gene expression induction profile different from that of the wild-type p53 family protein by combining transcription activation domains, DNA binding domains and oligomerization domains of different types of p53 family proteins. It became clear. Therefore, the present invention also provides (i) a step of obtaining a chimeric protein comprising a combination of a transcriptional activation domain, a DNA binding domain and an oligomerization domain derived from two or more kinds of p53 family proteins, and (ii) the obtained chimeric protein.
  • the chimeric protein obtained in step (i) is not limited and has, for example, a combination of domains selected from the following table.
  • chimeric protein 1 includes a transcription activation domain derived from p53, a DNA binding domain derived from p53, and an oligomerization domain derived from p63.
  • the gene expression induction profile is obtained by introducing the chimeric protein or a nucleic acid molecule encoding the same into a cell, and determining a gene whose expression is induced after a predetermined time, for example, by the method described in the present application example. It means a combination of genes with increased (induced) and / or genes with decreased expression and / or genes with unchanged expression.
  • the increase or decrease in expression can be determined by comparison with a control cell into which the chimeric protein or the nucleic acid molecule encoding the same is not introduced.
  • Example 1 Cell lines and 11 human cancer cell lines used for cell culture were purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, VA) or the Japanese Collection of Research Bioresources (Osaka, Japan). All cells were cultured under conditions recommended by each depositor.
  • hybrid molecules of p53 and TAp63 ⁇ The pCMV-Tag2 plasmid containing full-length p53 or TAp63 ⁇ is described in Sasaki et al., 2011 and Sasaki et al., 2009.
  • the p53-p63 hybrid was prepared by exchanging the three domains of p53 and TAp63 ⁇ using the overlapping extension method. These genes were constructed in-frame to allow FLAG epitope tagging at the N-terminus. To confirm identity, the cDNA encoding the hybrid molecule was sequenced.
  • the procedure for production, purification and infection of replication-deficient recombinant adenovirus is described in Sasaki et al., 2008.
  • the replication-deficient E1-deleted Ad5 vector pJM17 (Microbix Biosystem) was used as the backbone and the corresponding gene was expressed under the control of the human cytomegalovirus promoter / enhancer and bovine growth hormone polyadenylation signal.
  • Adenovirus titers in plaque forming units (pfu) were determined by plaque formation assay after 293T cell infection.
  • the multiplicity of infection (MOI) is determined by introducing the p. f. u. It was defined as the ratio of the total number.
  • adenovirus titration was performed on two sets of samples.
  • Ad-LacZ bacterial LacZ gene
  • Ad-GFP GFP gene
  • Apoptotic detection cells were seeded in T25 flasks at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / flask. After 24 hours, the cells were incubated with the purified virus in 1 mL of medium containing 1% FCS and gently agitated every 10 minutes. For flow cytometric analysis, cells were harvested by trypsinization and pelleted by centrifugation at various times after infection. Pelleted cells were fixed with 90% cold ethanol, treated with RNase A (500 units / mL), and stained with propidium iodide (50 ⁇ g / mL). Samples were analyzed on a FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson). The experiment was repeated at least 3 times and 50,000 cases were analyzed for each sample. Data was analyzed using the ModFIT program (Becton-Dickinson).
  • TUNEL assay cells were seeded in 4 well chamber slides (Nalge Nunc) at 5 ⁇ 10 4 cells / well. The virus was infected as described above, 24 hours later, fixed with paraformaldehyde for 30 minutes, and a TUNEL reaction was performed using the DeadEnd Fluorometric TUNEL system (Promega) according to the manufacturer's instructions. Nuclei were counterstained with DAPI (Sigma) and mounted on glycerol-gelatin for observation with a fluorescence microscope.
  • Caspase-3 assay kit (BioVision) was used according to the manufacturer's protocol and caspase activity was measured by a colorimetric method. These kits use synthetic tetrapeptides labeled with p-nitroanilide. Briefly, cells are lysed in the lysis buffer included in the kit, the supernatant is collected, incubated at 37 ° C. in a reaction buffer containing dithiothreitol and substrate, and using a microplate reader, Caspase activity was determined by measuring the change in absorbance at 405 nm.
  • Immunoblot analysis was performed as described by Sasaki et al., 2011.
  • the main antibodies used in immunoblotting are as follows.
  • Mouse anti-FLAG monoclonal antibody (mAb) Sigma
  • mouse anti-human p21 mAb EA10, Oncogene Research
  • mouse anti-human MDM2 mAb SMP14, Santa Cruz Biotechnology
  • mouse anti-human PARP mAb BD Pharmingen
  • mouse anti-human caspase-9 mAb BD Transduction Laboratory
  • mouse anti-human caspase-3 mAb BD Transduction Laboratory
  • rabbit anti-human p53AIP1 polyclonal Ab AnaSpec
  • mouse anti-human actin mAb Chemicon
  • RNA total RNA (10 ⁇ g) was separated by electrophoresis on a 1% agarose gel containing 2.2 M formaldehyde and transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Visualization with ethidium bromide was performed to confirm that the RNA was intact and loaded with the same amount and transferred properly. Hybridization was performed as previously described (Sasaki et al., 2009). cDNA probes for p53AIP1 (nucleotides (nt) 345-554) and p21 (nt11-429) were amplified by RT-PCR and sequenced to confirm their identity.
  • RNA was reverse-transcribed with random primers using SuperScript III (Invitrogen). Quantitative RT-PCR was performed using TaqMan® Gene® Expression assay and 7900HT® Real-Time® PCR® System (Applied® Biosystems) according to the manufacturer's protocol.
  • the relative gene expression level was quantified using the ⁇ Ct method, and the expression ratio of the target gene to the constant-expressing housekeeping gene, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), was calculated.
  • the primer / probe set used is as follows. p53AIP1 (Hs00223141_m1) and GAPDH (Hs99999905_m1) Values were normalized to each control and presented as mean ⁇ standard error of 3 independent experiments.
  • ChIP Chromatin immunoprecipitation
  • luciferase assays ChIP was performed using the ChIP Assay Kit (Upstate Biotechnology) as described in Sasaki et al., 2011 and Sasaki et al., 2009.
  • the amount of the p53AIP1 promoter DNA precipitated was determined based on the oligonucleotide (sense strand: 5′-TGGGTAGGGGTGATCTCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 1), antisense strand: 5′-GAGCAGCACAAAAATGGGACTGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 2) straddling the p53 consensus binding site. )).
  • Oligonucleotides specific to the MDM2 promoter (sense strand: 5′-GTTCAGTGGGCAGGTTGAACT-3 ′ (SEQ ID NO: 3), antisense strand: 5′-GCTACAAGCAAGTCGGTGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 4)) were used as positive controls. In any case, amplification was performed in 30 cycles.
  • p53 in the human p53AIP1 gene 5′-TCTCTTGCCCGGGCTTGTCG-3 ′; SEQ ID NO: 5
  • a variant of this sequence 5′-TCTATTTCCCGGGATTTTCG-3 ′; SEQ ID NO: 6
  • the resulting constructs were named pGL3-p53AIP1-PRO and pGL3-p53AIP1-pro-mut, respectively.
  • a 100 bp fragment containing this binding site was cloned into a pGL3-basic vector to produce constructs, which were designated as pGL3-p53AIP1-ba and pGL3-p53AIP1-ba-mut.
  • P53 family member consensus binding sequence within human p21 gene (pGL3-P21, 5′-GAACATGTCCCAACATGTTG-3 ′ (el-Deiry et al., 1993; SEQ ID NO: 7)) and p53 family member consensus binding sequence within the JAG1 gene (PGL3-JAG1, 5'-AGGCTCTTTGTTCAGGCTTGCTCTGTGTGAACCAGACCGTTGTGCTTGGGCT-3 '(Sasaki et al., 2002; SEQ ID NO: 8)) and variants thereof were also synthesized and inserted upstream of the minimal promoter of the pGL3-promoter vector (Promega) The luciferase assay was performed as described in Sasaki et al., 2011 and Sasaki et al., 2009.
  • mice All animals were maintained under pathogen-free conditions and processed according to the guidelines of the Animal Care and Use Committee of Sapporo Medical University.
  • sc subcutaneously
  • Mice were intratumorally administered once daily for 3 or 4 consecutive days with the indicated adenovirus u (in 100 ⁇ PBS).
  • Each treatment group contains 8 mice.
  • V (mm 3) paraffin-embedded tissue sections were deparaffinized in xylene for 5 minutes, rehydrated with gradient ethanol, and fixed with 4% paraformaldehyde. The tissue was permeabilized with proteinase K and then re-fixed with 4% paraformaldehyde. The TUNEL reaction was performed using the DeadEnd Fluorometric TUNEL System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Tissues were counterstained with DAPI. Three different slides were examined for each tumor.
  • FIG. 1 shows a comparison of the apoptotic effects of the Ad-p53 gene family.
  • (Top) Eleven p53 wild-type (wt) and four p53-deficient (del) cancer cell lines were infected with adenoviruses with the indicated MOI for 48 hours, and sub-G1 nuclei in each population were To quantify the percentage, intracellular DNA content was determined by histogram analysis. The experiment was repeated three times and expressed as an average percentage.
  • TUNEL analysis HCT116 cells and NUGC4 cells with wild-type p53 were infected with adenovirus for 48 hours, and apoptosis was subsequently evaluated by TUNEL analysis.
  • TUNEL analysis cells were plated at 5 ⁇ 10 4 cells / well in 4-well chamber slides (Nalge Nunc International, Naperville, IL). After 24 hours, the cells were treated as described above. The TUNEL reaction was performed using the DeadEnd Fluorometric TUNEL system (Promega) according to the manufacturer's instructions. Nuclei were counterstained with DAPI (Sigma) and mounted on glycerol-gelatin for observation with a fluorescence microscope. Shown is the average percentage of TUNEL positive cells.
  • FIG. 2 shows increased induction of apoptosis by the combination of Ad-p53 and Ad-p63 ⁇ .
  • A The synergistic effect of Ad-p53 and Ad-p63 ⁇ in inducing apoptosis was examined. MKN45 cells and SW480 cells were separately infected with 200 MOI of Ad-p53 or Ad-p63 ⁇ , or in combination with two vectors of MOI indicated respectively. Cells were harvested 48 hours after infection and analyzed by flow cytometry. Apoptotic cells form the sub-G1 fraction (%).
  • B MKN45 human gastric cancer cells and SW480 human colon cancer cells were infected with Ad-p53 and / or Ad-p63 ⁇ of the indicated MOI.
  • Apoptosis was analyzed by PARP cleavage 48 hours after infection.
  • C MKN45 human gastric cancer cells were infected with the indicated MOI Ad-p53 and / or Ad-p63 ⁇ . At 48 hours post infection, apoptosis was analyzed by TUNEL analysis. Shown is the average percentage of TUNEL positive cells.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the p53-p63 hybrid molecule. Wild type p53 protein (white) and wild type TAp63 ⁇ protein (black) were aligned at the N-terminus. An arrow shows a joining position. TAD (transactivation domain), DBD (DNA binding domain) and OLD (oligomerization domain) are displayed and the domain structure of each transcript is shown.
  • p63-53O residues from Met1 to Lys352 of TAp63 ⁇ and residues from Lys319 to Asp393 of p53
  • p63-53D residues from Met1 to Ser141 of TAp63 ⁇ , residues from Phe113 to Arg289 of p53 and residues from Lys321 to Pro448 of TAp63 ⁇
  • p53-63T residues from Met1 to Ser141 of TAp63 ⁇ and Phe113 of p53 From Asp393 to Asp393 p53-63O: p53 from Met1 to Pro318 and TAp63 ⁇ from Lys353 to Pro448
  • p53-63D p53 from Met1 to Gly112, TAp63 ⁇ from Phe142 to Arg320 Residues and residues from Lys290 to Asp393 of p53 p63-53T: Residues from Met1 to Gly112 of p53 and Phe142 to Pro4 of TA
  • FIG. 4 shows the intracellular localization of the p53-p63 hybrid.
  • MKN45 cells were transiently transfected with a FLAG-tagged pCMV-Tag2 vector expressing p53, TAp63 ⁇ , p63-53O, p63-53D or p53-63D. After 24 hours, immunofluorescence labeling was performed using FLAG M2 antibody and Alexa488-labeled secondary antibody (green). Nuclei were detected by DAPI staining (blue).
  • FIG. 5 shows the cleavage of PARP protein and the activity of caspase-3.
  • A PARP protein cleavage was detected by immunoblotting. SW480 cells, H1299 cells and MKN45 cells were infected with 100 MOI (SW480 cells and MKN45) or 25 MOI (H1299) adenovirus for 48 hours, and 20 ⁇ g of total protein from these cells was separated by SDS-PAGE. Shown are immunoblots that detect cleaved PARP, caspase-3, caspase-9 and ⁇ -actin.
  • C MKN45 cells were infected with the indicated MOI adenovirus for 48 hours and 20 ⁇ g of total protein was separated by SDS-PAGE. Shown is an immunoblot that detects cleaved PARP, caspase-3 and ⁇ -actin.
  • D MKN45 cells were infected with the indicated MOI adenovirus for 48 hours. Caspase-3 activity was measured 48 hours after infection.
  • FIG. 6 shows flow cytometric analysis of apoptotic cells after adenovirus-mediated expression of p53-p63 hybrid.
  • Cells were infected with the indicated MOI adenovirus.
  • Cells were harvested 48 hours after infection and analyzed by flow cytometry. Three independent experiments were performed and representative data from one experiment were shown. The percentage of sub-G1 cells is shown in the lower panel.
  • FIG. 7 shows the therapeutic effect of adenovirus-mediated expression of p53 family members in human cancer xenografts implanted subcutaneously.
  • SW480 cells (2 ⁇ 10 6 cells per site) were injected subcutaneously into nude mice. When tumors reached 100 mm 3 , mice were injected subcutaneously with recombinant adenovirus for 3 consecutive days. Each group contains 6 mice. Data points represent average tumor size.
  • B A TUNEL assay on SW480 cell xenografts was performed on day 5 after the treatment described in (A). Increased apoptosis was detected in xenografts treated with Ad-p63-53O (green cells). Nuclear DNA was stained with DAPI.
  • FIG. 8 shows the therapeutic effect of adenovirus-mediated expression of p53 family members in MKN45 xenografts.
  • MKN45 cells (2 ⁇ 10 6 cells per site) were injected subcutaneously into nude mice. When tumors reached 100 mm 3, the recombinant adenovirus was injected intratumorally with three consecutive days to mice. Six mice are included in each group. Data points represent mean tumor size.
  • B The TUNEL assay in MKN45 xenografts was performed 5 days after the treatment described in (a). Representative images from each treatment condition are shown. Nuclear DNA was stained with DAPI.
  • FIG. 9 shows the expression of p53 target and apoptosis-related protein in human cancer cell lines after adenovirus-mediated transfection of p53-p63 hybrid.
  • Saos-2 cells, H1299 cells and SW480 cells were infected with 25 MOI adenovirus for 24 hours and 10 ⁇ g of total protein was separated by SDS-PAGE.
  • the levels of p21, MDM2, survivin, cyclin B1, Noxa, Bax, PUMA, JAG1, p55CDC and actin were measured by immunoblotting.
  • the primary antibodies used are as follows.
  • Mouse anti-FLAG monoclonal antibody (mAb) Sigma
  • mouse anti-human p21 mAb EA10, Oncogene Research
  • mouse anti-human MDM2 mAb SMP14, Santa Cruz Biotechnology
  • rabbit anti-human survivin polyclonal antibody S8191, Sigma
  • mouse anti-human Cyclin B1 mAb GNS1, Santa Cruz Biotechnology
  • rabbit anti-human BAX polyclonal Ab P19, Santa Cruz Biotechnology
  • mouse anti-human Noxa Ab 114C307, Oncogene Research
  • rabbit anti-human PUMA polyclonal Ab BD Transduction Laboratory
  • rabbit Anti-human JAG1 polyclonal antibody H-144, Santa Cruz Biotechnology
  • mouse anti-human p55CDC mAb E-7, Santa Cruz Biotechnology
  • mouse anti-human actin mAb Chemicon
  • FIG. 10 shows efficient transactivation of p53AIP1 by the p63-53O hybrid.
  • A Four human cancer cell lines were infected with 50 or 100 MOI adenovirus and cells were harvested 24 hours after infection. Total RNA was extracted and Northern blot was performed. Total RNA (10 ⁇ g) was loaded into each lane and the same filter was rehybridized with human p53AIP1 and p21 cDNA. Ethidium bromide staining of 28S ribosomal RNA (28S) is shown in the lower panel. It is confirmed that an equal amount of RNA has been loaded into each lane.
  • B p63-53O interacts efficiently with p53-RE of the p53AIP1 gene in vivo. ChIP assays were performed as described in “Materials and Methods”.
  • (C) p63-53O efficiently induces the p53AIP1 promoter containing p53-RE.
  • pGL3-p53AIP1-pro In SW480 cells, pGL3-p53AIP1-pro, pGL3-p53AIP1-ba, pGL3-p21 or pGL3-JAG1 and the pCMV-Tag2 control vector, p53, TAp73 ⁇ , TAp63 ⁇ , p63-53O or p63-53D were co-introduced. Luciferase activity was quantified 24 hours after infection as described in Materials and Methods. Error bars represent two standard deviations calculated from three independent experiments.
  • FIG. 11 shows antagonism by p53AIP1 siRNA of apoptosis induction by p63-53O.
  • A Expression of p53AIP1 mRNA was suppressed by siRNA.
  • SW480 cells were infected with control or p53AIP1 siRNA every 24 hours for 3 consecutive days. Suppression of p53AIP1 mRNA was measured by real-time RT-PCR 18 hours after the last siRNA transfection.
  • B SW480 cells were infected with control or p53AIP1 siRNA as described above. Cells were infected with 100 MOI of Ad-GFP or Ad-p63-53O 8 hours prior to the final siRNA transfection. The amount of p53AIP1 protein was measured by immunoblot. Apoptosis was examined by caspase-3 cleavage (upper panel) and caspase-3 activity (lower panel).
  • Example 1 Pro-apoptotic ability of p53 family Gene therapy that restores the function of p53 has been clinically tested for the treatment of human cancer. However, some cancers are resistant to p53. In colorectal cancer cell lines, TAp63 ⁇ and TAp73 ⁇ have the strongest ability to promote apoptosis among all isoforms of p63 and p73. Using adenoviral vectors, p53, TAp63 ⁇ and TAp73 ⁇ were introduced into 56 cancer cell lines and their effects on cell death and apoptosis were compared using flow cytometry.
  • the sub-G1 fraction contains apoptotic cells.
  • apoptosis occurred in response to p53, p73 ⁇ or p63 ⁇ , but about 25% of the cell lines showed at least some resistance to apoptosis induced by p53 family members. .
  • the apoptotic effect of TAp63 was greater than that of wild-type p53 in 15 out of 22 cancer cell lines with endogenous wild-type p53 alleles (68.2%) (Table 2 and FIG. 1).
  • Table 2 shows a comparison of the apoptotic effects of Ad-p53 family genes.
  • MKN45 gastric cancer cells and SW480 colon cancer cells that did not induce apoptosis when p53, p73 ⁇ or p63 ⁇ alone were introduced were treated with 200 MOI of Ad-p53 or Ad-p63 ⁇ or MOI displaying two recombinant adenoviruses, respectively. Infected in combination. Cells were harvested 48 hours after infection and apoptosis was analyzed by flow cytometry, caspase activation and TUNEL assay. A pro-apoptotic synergy was observed in p53 and TAp63 ⁇ gene expression (FIGS. 2A-C).
  • MKN45 xenograft proliferation was significantly suppressed by the combination treatment compared to treatment with Ad-p53 or Ad-p63 ⁇ alone (FIG. 2D).
  • Ad-p53 and Ad-p63 ⁇ were shown to produce a strong antitumor synergistic effect in vitro and in vivo.
  • Example 2 Construction of a p53-p63 hybrid gene To enhance the tumor suppressor activity of the p53 family, a set of hybrid genes was created that utilized differential control of the functions of p53 and p63.
  • the six hybrid proteins consist of three functional domains, each derived from p53 or TAp63 ⁇ .
  • p53-63O is a hybrid protein containing the N-terminal domain and the central domain of p53, and fused in-frame with the C-terminal domain of p63.
  • “P53-63D” A hybrid p53 protein containing a central domain.
  • the composition of the six hybrid proteins is shown in FIG. Among the six hybrids, p63-53D is mainly localized to the cytoplasm because it lacks the typical NLS motif. The other five hybrids mimic p53 and TAp63 ⁇ and localize primarily in the nucleus, consistent with the presence of NLS (FIG. 4). Three hybrid molecules (p53-63O, p63-53D and p63-53T) contain the C-terminal domain of p63 but cannot oligomerize with endogenous mutant or wild-type p53.
  • p53-63T and p63-53D containing the N-terminal domain of p63 will bind to MDM2 and will not undergo proteasomal degradation even though it contains the central DNA binding domain of p53.
  • p53-63D, p53-63T and p63-53O are expressed as p63-63D, because the unique C-termini ( ⁇ , ⁇ and ⁇ ) of different TAp63 isoforms are thought to modulate the transactivation ability of gene expression. It was thought to change the transcriptional activity of.
  • Example 3 Apoptosis profile after adenovirus-mediated expression of p53-p63 hybrids
  • Ad-p53 FLAG-tagged human p53
  • TAp63 ⁇ Ad Recombinant adeno expressing p63 ⁇
  • p53-p63 hybrids Ad-p63-53O, Ad-p63-53D, Ad-p53-63T, Ad-p53-63O, Ad-p53-63D and Ad-p63-53T
  • the relative efficiency of adenovirus-mediated gene delivery was quantified as the percentage of GFP positive cells after Ad-GFP infection at 25-200 MOI. According to the gene transfer efficiency determined by the expression of GFP, each cell line was infected with adenovirus at the appropriate MOI. As shown in FIG. 5A, it was determined whether hybrids were expressed at similar levels in several cancer cell lines such as MKN45 (gastric cancer) and H1299 (lung cancer). Subsequently, induction of apoptosis was analyzed by flow cytometry in a panel of human cancer cell lines. Cells were infected with adenovirus for 48 hours and analyzed for intracellular DNA content. These data are summarized in a histogram showing the percentage of sub-G1 nuclei (apoptotic cells) in a total of 5 ⁇ 10 4 cells per population.
  • Ad-p63-53O induced apoptosis more efficiently than Ad-p53 or Ad-p63 ⁇ in all four cell lines tested (FIG. 6). Induction of apoptosis was analyzed by flow cytometry in 14 cancer cell lines. Ad-p63-53O induced apoptosis in all 14 cell lines tested regardless of p53 wild type, mutant, or deletion status (Table 3).
  • Table 3 shows a comparison of the apoptotic effect between the p53-p63 hybrids.
  • the enzyme PARP involved in DNA repair is cleaved by caspase-3, and the presence of the cleaved PARP (85 kDa, 116 kDa for uncleaved protein) is regarded as a feature of apoptosis.
  • Induction of apoptosis by the p53-p63 hybrid was confirmed by cleavage of PARP and caspase-3 / 9 (FIG. 5A) and caspase-3 activity (FIG. 5B). These observations were consistent with the flow cytometry results.
  • MKN45 cells were also infected with adenovirus for 48 hours at various dilutions from 50 MOI and analyzed for PARP cleavage and caspase-3 activity.
  • the level of PARP cleavage and caspase-3 activity after infection with Ad-p63-53O at 50 MOI was similar to that after infection with Ad-p53 or Ad-p63 ⁇ at 200 MOI (FIG. 5C, D ).
  • Example 4 Therapeutic effect of intratumoral injection of p53-p63 hybrid adenovirus on the growth of subcutaneously transplanted human xenografts
  • the effect of in vivo administration of an adenoviral vector was investigated.
  • Xenografts of human SW480 cells in nude mice were established. When the tumor reached 100 mm 3 , Ad-LacZ, Ad-p53, Ad-p63 ⁇ or Ad-p63-53O was 5 ⁇ 10 9 p. f.
  • Each mouse received 100 ⁇ L intratumoral injections containing u three times and tumor size was monitored.
  • Ad-p63-53O significantly suppressed SW480 xenograft growth (p ⁇ 0.001: FIG. 7A).
  • Ad-p63-53O treatment induced complete tumor regression in 33% (2/6) tumor-bearing mice. This in vivo result correlated with the specificity observed in vitro.
  • two animals from each treatment group were euthanized on the fifth day of treatment and their tumors were collected for in situ TUNEL analysis.
  • Example 5 Efficient Transcriptional Induction of p53AIP1 by Hybrid p63-53O
  • the hybrid p63-53O contains residues from Met1 to Lys352 of TAp63 and Lys319 to Asp393 of p53.
  • the hybrids of the present invention include TAp63 TAD and DBD and p53 OLD.
  • p53 target genes including p21, MDM2, survivin, Noxa, Bax and Puma in specific cancer cells The induction of was examined by immunoblotting ( Figure 9).
  • the p63-53O hybrid induced a subset of p53 target genes in all three cell lines tested, but the degree of induction was not as pronounced as that of p53 or TAp63 ⁇ .
  • p53AIP1 an important target of p53-mediated cell death response, was identified as a candidate gene.
  • the p53AIP1 gene had a reproducibility and at least a 4-fold increase in expression in cells transfected with p63-53O compared to cells transfected with p53 or TAp63 ⁇ .
  • ChIP chromatin immunostaining
  • DNA-protein complexes were immunoprecipitated from formaldehyde cross-linked extracts of SW480 cells infected with Ad-p53, Ad-p63 ⁇ , Ad-p63-53O or Ad-p63-53D using anti-FLAG antibody.
  • the abundance of candidate sequences in the immunoprecipitation complex was quantified by PCR.
  • p63-53O was recruited to the p53AIP1 promoter more efficiently than p53 or TAp63 (top, lane 12).
  • the MDM2 promoter was analyzed as a positive control for the ChIP assay.
  • p53, TAp63 ⁇ and p63-53O were immunoprecipitated with the p53 binding site in the MDM2 promoter (FIG. 10B, bottom row, lanes 8, 10 and 12).
  • a reporter assay was performed.
  • a genomic fragment containing p53-RE in the p53AIP1 gene was cloned upstream of the SV40 minimal promoter in the pGL3 promoter vector (pGL3-p53AIP1-pro) to construct a heterologous reporter vector.
  • pGL3-p53AIP1-pro the pGL3 promoter vector
  • a 100 bp DNA fragment corresponding to p53-RE of the p53AIP1 gene was cloned into a pGL3 basic vector (pGL3-p53AIP1-ba).
  • p63-53O activated both p53AIP1 luciferase reporters, while p53 and TAp63 ⁇ activated p53AIP1 transcription with lower efficiency (FIG. 10C). Furthermore, point mutations in p53-RE of p53AIP1 (pGL3-p53AIP1-pro-mut and pGL3-p53AIP1-ba-mut) abolished transactivation by p63-53O.
  • the p53-RE (pGL3-p21) of p21 or the known TAp63 target JAG1 (pGL3-JAG1) was cloned into the pGL3 promoter vector and a luciferase reporter assay was performed.
  • the luciferase activity of pGL3-p21 was higher in cells co-introduced with p53 than when co-introduced with p63-53O.
  • TAp63 ⁇ and TAp73 ⁇ efficiently activated the JAG1 luciferase reporter (FIG. 10C).
  • Example 6 p53AIP1 siRNA antagonizes the apoptotic effect of p63-53O in order to determine the importance of p53AIP1 in the pro-apoptotic effect of p63-53O in human cancer, in SW480 cells that are relatively resistant to p53-mediated apoptosis, An siRNA that knocks down p53AIP1 expression was used. SiRNA having no sequence homology to any human gene was used as a control, and cells were transfected with siRNA every 24 hours for 3 consecutive days.
  • FIG. 11A real-time RT-PCR demonstrated a decrease in p53AIP1 mRNA in cells transfected with p53AIP1 siRNA.
  • Eight hours after the last transfection cells were infected with Ad-GFP or Ad-p63-53O for 48 hours, and immunoblot and caspase-3 assays were performed.
  • Pretreatment of SW480 cells with p53AIP1 siRNA strongly suppressed p63-53O-mediated induction of p53AIP1 at the protein level (FIG. 11B).
  • p53AIP1 siRNA antagonized the pro-apoptotic effect of p63-53O (FIG. 11B).
  • Example 7 to 10 Cell culture and transfection Human gastric cancer cells (MKN-45), human pancreatic cancer cells (PANC-1), human hepatocellular carcinoma cells (HLF and HuH-7), human colon adenocarcinoma cells (SW48 and SW480) and humans used Osteosarcoma cells (G-292, HOS, Saos-2 and U-2 OS) were purchased from the American Type Culture Collection or Japanese Collection of Research Bioresources. All transfections were performed using Lipofectamine 2000 (Lifetechnologies).
  • Superhybrid p53 (SHp53)) containing 352 amino acids and p53 290-393 amino acids was inserted into pcDNA3.2 / V5 / GW / D-TOPO vector (Lifetechnologies), respectively.
  • adenovirus To produce adenovirus, the cDNA and LacZ gene were introduced into the pAd / CMV / V5-DEST vector (Lifetechnologies). Recombinant adenovirus was purified using Fast-Trap Adenovirus Purification and Concentration Kit (Millipore).
  • Anti-FLAG antibody M2, Sigma
  • anti-caspase-3 antibody 8G10, Cell Signaling
  • anti-PARP-1 antibody H-250, Santa Cruz Biotechnology
  • anti-trimethyl histone H3 (Lys4) H3K4me3) antibody
  • MC315, MILLIPORE anti-actin antibody
  • MAB1501R Millipore
  • HRP-labeled secondary antibody Santa Cruz Biotechnology
  • RT-PCR RT-PCR was performed as previously reported (Kashima et al., 2009). The PCR conditions were 94 ° C for 2 minutes after an initial denaturation step, followed by 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C (CASP10), 59 ° C (CDKN1A), 63 ° C (KCNK3, PYCARD and TP53), 55 ° C (FLAG-TP63 ) Or 55 ° C. (GAPDH) for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds for 26 cycles (CASP10), 25 cycles (CDKN1A), 29 cycles (KCNK3), 35 cycles (PYCARD), 25 cycles (TP53), 18 This includes performing in cycle (FLAG-TP63) or 16 cycles (GAPDH).
  • the primer sequence of the oligonucleotide is as follows. CASP10 sense (5′-GCTGCAGCACCCTCAACTGTACCAAAGAGGGA-3 ′; SEQ ID NO: 12) and antisense (5′-GCAGAGGTCCCTCCAGCATGTTCAGATTATC-3 ′; SEQ ID NO: 13), KCNK3 sense (5′-TACGAGGAGCTGGAGCGCGTCGC # GCGCGCTCGC ') (5'-GATGCCCCAGCAGCGCGTAGAACAT-3 '; SEQ ID NO: 15), PYCARD sense (5'-TCACCGACAAGCTGGTCAGCTTCTAC-3'; SEQ ID NO: 16) and antisense (5'-TCGCGATAAGCGCAGCCCGGGT-3 '; SEQ ID NO: 17), TP53 sense '-CCACTGGATGGGAGAATTTTCACCCTTCAG-3' SEQ ID NO: 18) and antisense (5′-TGGCTCCTTCCCAGCCTGGGCATC-3 ′; SEQ
  • Oligonucleotide primers for CDKN1A have been reported previously (Idogawa et al., 2009). PCR products were visualized by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.
  • Immunofluorescence microscopy was performed as previously reported (Kashima et al., 2009). Briefly, cells were cultured and transfected on 4-well chamber slides. After 24 hours, cells were fixed with 4% paraformaldehyde, incubated with anti-FLAG antibody, and then incubated with Alexa488-labeled secondary antibody. The labeled cells were examined under BZ-8100 (KEYENCE) fluorescence microscope.
  • TaqMan Low Density Array consists of 96 TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) and, as described in Table 4, 93 p53 target genes and 3 endogenous control genes (GUSB, HPRT1 and GAPDH). ), Designed in a 384 well format and spotted on a microfluidic card (4 per assay). The expression of the selected gene was analyzed as LDA according to the manufacturer's instructions.
  • Chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis was performed as previously reported (Suzuki et al.). First, HuH-7 cells were infected with an adenoviral vector. After 24 hours, cells were fixed with 1% formaldehyde for 10 minutes. As described in the SOLiD ChIP-seq manual, ChIP was performed on the chromatin sample using an anti-H3K4me3 antibody, and a large-scale parallel sequence was performed using the SOLiD3 Plus system (Applied Biosystems). Sequence reads that were of poor quality or not uniquely located were excluded from the study.
  • the p53 binding site was predicted by computer using the p53 scanning algorithm (Smeenk et al., 2008).
  • Chromatin immunoprecipitation-PCR To crosslink the protein with DNA, HuH-7 cells were fixed with 1% formaldehyde for 10 minutes 24 hours after adenovirus infection. Chromatin samples were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody at 4 ° C. for 16 hours. ChIP was performed using the MAGnify ChIP system (Lifetechnologies). PCR primers are shown in Table 5.
  • Table 5 shows the primer sequences used and the size of the ChIP-PCR product.
  • Flow cytometry One million cells were cultured in 6 mm plates or T25 flasks and infected with adenovirus. As previously reported (Ogi et al., 2005), cells were subjected to flow cytometry after 48 hours. Data was analyzed using FlowJo software.
  • Caspase-3 activity was measured by a colorimetric assay using a caspase-3 assay kit (Biovision) according to the manufacturer's instructions.
  • FIG . 12 shows the strong induction of apoptosis in cancer cells of superhybrid p53.
  • A Schematic diagram of FLAG-p53 construct (dark gray), FLAG-p63 ⁇ construct (light gray), FLAG-63-53 construct O and FLAG-SHp53 construct.
  • TA transactivation domain
  • DB DNA binding domain
  • OL oligomerization domain.
  • Horizontal bars indicate nuclear translocation signals (NLS).
  • NLS scores were calculated using the PSORT II program and are shown on the right. The arrow indicates the position of the primer used for RT-PCR analysis.
  • SW480 cells were transfected with the vectors shown in FIG. 12A. After 24 hours of transfection, total RNA was isolated and RT-PCR was performed. The FLAG sequence-specific forward primer, TP63 sequence primer and TP53-specific forward and reverse primers indicated in FIG. 12A were used to detect FLAG-TP63 and TP53, respectively.
  • SW480 cells were transfected with the indicated vectors. After 24 hours transfection, whole cell lysates were analyzed by Western blot using the indicated antibodies. * Indicates a non-specific band.
  • D Saos-2 cells were transfected with the indicated vectors. After transfection for 24 hours, immunocytochemistry was performed using an anti-FLAG antibody (green). Nuclei were detected by DAPI staining (blue).
  • E infecting G-292 cells, U-2 OS cells, MKN-45 cells, HLF cells, HOS cells, HuH-7 cells, PANC-1 cells, SW48 cells and SW480 cells with the indicated recombinant adenovirus, Analysis by flow cytometry 48 hours after infection. The percentage of cells in Sub-G1 is shown.
  • FIG. 13 shows a schematic diagram of constructs of p53 (dark gray), p63 ⁇ (light gray), 63-53O, and p53 family hybrid.
  • TA transactivation domain
  • DB DNA binding domain
  • OL oligomerization domain.
  • Horizontal bars indicate nuclear translocation signals (NLS). NLS scores were calculated using the PSORT II program.
  • FIG. 14 shows that the structure of the p53 family hybrid construct was confirmed by PCR and Western blotting.
  • A Schematic diagram of Flag-SHp53 and RT-PCR primer positions (arrows). Dark or light gray bars indicate sequences from p53 and p63, respectively.
  • SW480 cells were transfected with the Flag-tagged construct described in FIG. 13 as indicated. Twenty-four hours after transfection, total RNA was isolated and RT-PCR was performed. In order to detect Flag-TP63, TP53 and Flag-TP53, the Flag sequence-specific forward primer and TP63 sequence primer and TP53-specific forward and reverse primers shown in (A), respectively, were used.
  • C SW480 cells were transfected with the indicated vectors. Twenty-four hours after transfection, whole cell lysates were analyzed by Western blot using the indicated antibodies.
  • FIG. 15 shows a comparison of apoptosis induction in various cancer cells by p53, p63 ⁇ , p63-53O and p53 family hybrids.
  • G-292 cells, Saos-2 cells, MCF-7 cells, MKN-45 cells, U-2 OS cells, HaCaT cells, HOS cells and SW480 cells were infected with the indicated recombinant adenovirus and 48 hours post infection Analyzed by flow cytometry. The percentage of cells in sub-G1 is shown.
  • the TP53 genotype of each cell is shown as WT (wild type), null or MUT (mutant).
  • FIG. 16 shows the subcellular localization of p53, p63 ⁇ , p63-53O and p53 family hybrid proteins.
  • Saos-2 cells were transfected with the indicated vectors. After transfection for 24 hours, immunocytochemistry was performed using an anti-FLAG antibody (green). Nuclei were detected via DAPI staining (blue).
  • FIG. 17 shows specific p53AIP1 expression induction by p53, p63 ⁇ , p63-53O and SHp53.
  • MKN-45 cells, U-2 OS cells, G-292 cells and SW480 cells were infected with the indicated adenoviruses, and 24 hours after infection, gene expression was RT-PCR using primers specific for each gene. Analyzed by: The genotype of TP53 is shown in parentheses.
  • FIG. 18 shows gene expression profiling induced by SHp53.
  • Huh-7 cells were infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-p53, Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53. Total RNA was isolated 24 hours after infection using TRIzol (Lifetechnologies) and induction of p53 target gene was quantified using LDA and normalized with GAPDH. The experiment was performed three times. Mean values and standard deviations are shown.
  • Huh-7 cells were infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-p53 with Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53. Total RNA was isolated 24 hours after infection and gene expression was analyzed using a microarray.
  • the Venn diagram displays the intersection of gene groups identified as being separately controlled by infection with Ad-FLAG-p53, Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53. Gene numbers and typical elevated genes are shown.
  • FIGS. 19 to 21 show a group of genes specifically induced by SHp53 confirmed by the real-time RT-PCR method.
  • MKN-45 cells, U-2 OS cells, G-292 cells, HuH-7 cells and SW480 cells were infected with the indicated adenovirus and gene expression was analyzed by TaqMan LDA 24 hours after infection. The relative level of gene expression was quantified using the ⁇ Ct method, which calculates the expression ratio of the target gene relative to the expression of the housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).
  • GPDH housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Genes specifically induced by Ad-FLAG-SHp53 are shown.
  • the TP53 genotype of each cell is shown in parentheses.
  • the primer / probe sets are shown in Table 4.
  • FIG. 22 shows control of transactivation of a target gene specific for super hybrid p53.
  • A to (C) The positions and sequences (gray bars) of p53BS candidates of CASP10 gene (A), KCNK3 gene (B) and PYCARD gene (C) are shown relative to the transcription start site. Exons and introns are indicated by white boxes or bold bars, respectively. The human and mouse sequences and homology are shown. Matched or mismatched nucleotides compared to the consensus p53 binding sequence (RRRCWWGYYY; SEQ ID NO: 24, R: purine, C: cytosine, W: adenine or thymine, G: guanine, Y: pyrimidine) It shows with. Homology is indicated with an asterisk.
  • Huh-7 cells were infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-p53 with Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53, and anti-FLAG antibody or control IgG was injected 24 hours after infection.
  • the chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed. Specificity targeting ChIP samples and 10% input DNA to regions containing p53BS, CASP10-3090 or +489 (D), KCNK3 + 1269 or +1432 (E) or PYCAD + 1269 or +1432 (F), respectively Amplified with typical primers.
  • FIG. 23 shows a target gene having a site to which SHp53 specifically binds.
  • Huh-7 cells were infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-P53, Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53, and chromatin immunoprecipitation (ChIP) with anti-FLAG antibody or control IgG 24 hours after infection. ) The assay was performed. ChIP samples and 10% input DNA were amplified with specific primers targeted to the region containing p53BS of each gene. p53BS and primer sequences are listed in Table 5.
  • FIG. 24 shows the induction of apoptosis of super hybrid p53 by controlling the expression of specific target genes.
  • HuH-7 cells and SW480 cells were transformed into siRNA specific for CASP10 (siCASP10, A), siRNA specific for KCNK3 (siKCNK3, B) or siRNA specific for PYCARD (siPYCARD, C ) Or control siRNA.
  • siRNA specific for CASP10 siCASP10, A
  • siRNA specific for KCNK3 siRNA specific for KCNK3
  • siRNA specific for PYCARD siPYCARD, C
  • control siRNA Four hours after transfection, cells were infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-p53, Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53.
  • Total RNA was isolated 24 hours after infection and the expression level of each gene was analyzed by RT-PCR (top). 48 hours after infection, the percentage of sub-G1 was analyzed by flow cytometry (bottom).
  • FIG. 14 A schematic diagram of the positions (arrows) of FLAG-SHp53 and RT-PCR primers is shown. Dark or light gray bars indicate sequences from p53 and p63, respectively.
  • B SW480 cells were transfected with the indicated FLAG-tagged construct described in FIG. After 24 hours of transfection, total RNA was isolated and RT-PCR was performed. The FLAG sequence-specific forward primer, TP63 sequence primer and TP53-specific forward and reverse primers shown in FIG. 14 were used to detect FLAG-TP63, TP53 and FLAG-TP53, respectively.
  • C SW480 cells were transfected with the indicated vectors. After transfection for 24 hours, whole cell lysates were analyzed by Western blot using the indicated antibodies.
  • Example 7 Induction of superhybrid p53 in cancer cells A p53-based hybrid gene "63-53O" combining p63 ⁇ TAD and DBD and p53 OLD by screening for novel cancer treatment based on p53 (Fig. 12A) was found to be a powerful tumor suppressor gene. Adenovirus (Ad) -mediated gene transfer of the 63-53O hybrid strongly induced apoptosis both in vitro and in vivo by transactivation of TP53AIP1.
  • the hybrid was named “super hybrid p53 (SHp53)”, and further analysis was performed to evaluate its pro-apoptotic activity.
  • SW480 cells were infected with FLAG-p53, FLAG-p63 ⁇ , FLAG-63-53O or FLAG-SHp53 expression vectors.
  • FLAG-SHp53 mRNA and protein were expressed in the same manner as other genes (FIGS. 12B and 12C), and similar data were obtained in HEK293 cells. The intracellular localization of each protein was analyzed by immunocytochemistry (FIG. 12D).
  • FLAG-p53, FLAG-p63 ⁇ , FLAG-63-53O and FLAG-SHp53 were localized in the nucleus. Consistent with the NLS score, FLAG-SHp53 nuclear translocation was most strongly observed (FIGS. 12A and 12D). The pro-apoptotic effects induced by adenovirus-mediated introduction of these genes tended to be consistent with nuclear translocation and NLS scores (FIGS. 13-16). This suggests that nuclear translocation of the p53 family and hybrid genes is required for proapoptotic function.
  • Ad-FLAG-SHp53 The increase in the sub-G1 fraction, which indicates apoptotic cell death, is induced by Ad-FLAG-SHp53, which can be induced more in most cancer cells than other molecules, regardless of the TP53 genotype. This was revealed by flow cytometric analysis (FIGS. 12E and 15). Expression of TP53AIP1, the target of the 63-53O hybrid, was also induced by Ad-FLAG-SHp53 (FIG. 17), indicating that TP53AIP1 is a common target for 63-53O and SHp53. These data suggest that Ad-SHp53 is a novel and potential target for cancer treatment through pro-apoptotic activity.
  • caspase-3 activity and cleavage of PARP-1 protein were measured (FIG. 12F) and tested in a tumor-forming xenograft model (FIG. 12G).
  • Caspase-3 is activated by cleavage in various apoptotic pathways, and activated caspase-3 cleaves PARP-1. Therefore, cleavage of caspase-3 and PARP-1 is regarded as a feature of apoptosis.
  • the activity of the Ad-FLAG-SHp53 vector was examined in a tumor-forming xenograft model.
  • SW480 and MKN-45 cells were injected subcutaneously into nude mice.
  • adenovirus was injected directly into the tumor on days 1, 2 and 3 (FIG. 12G, arrow).
  • the tumor volume derived from SW480 and MKN-45 injected with Ad-FLAG-SHp53 was smaller than the tumor volume injected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-p53 or Ad-FLAG-p63 ⁇ (FIG. 12G). That is, these results indicate that adenovirus-mediated SHp53 gene transfer is advantageous for p53-resistant cancer patients and can be a novel cancer gene therapy.
  • Example 8 Gene expression profile induced by super hybrid p53
  • target genes specifically regulated by SHp53 were screened.
  • TaqMan-based high-throughput real-time PCR, TaqMan Low Density Array (LDA) was used to examine the expression of 93 known p53 target genes specifically related to apoptosis.
  • TP53WT cells MKN-45 cells and U-2 OS cells
  • null cells G-292 cells
  • mutant cells HuH-7 cells and SW480 cells
  • Ad-FLAG-p53 and Ad-FLAG-SHp53 induced CDKN1A one of the most famous target genes of p53, to the same extent, but in some cancer cells, 18 genes ( APOBEC2, AQP3, CASP10, CST11, EGR2, EGFR, IL2RB, JAG2, KCNA2, PGA5, PLCD4, PYCARD, SLCO2B1, TTYH2, ICAM2, TNXB, TP73 and LRDD) are significantly higher in Ad-FLAG-SHp. Induction was shown (FIGS. 17, 18A, and 19-21).
  • HuH-7 cells infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-p53, Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53 are used for genome-wide screening of genes regulated by SHp53. Analysis was performed using a gene expression microarray (Agilent Technologies) containing 27,958 Entrez gene RNAs and 7,419 lincRNAs. Increased expression of CDKN1A was detected in all cells infected with Ad-FLAG-p53, Ad-FLAG-p63 ⁇ and Ad-FLAG-SHp53, respectively (FIG. 18A). This is consistent with the LDA results (FIG. 21).
  • Table 7 shows Flag-SHp53-specific genes identified by hierarchical clustering analysis.
  • Ad-FLAG-SHp53 has a novel transactivation activity, although the DNA binding domain is derived from p63 ⁇ .
  • a gene that is induced by introduction of Ad-FLAG-SHp53 and has a gene expression level at least 10 times higher than that of Ad-FLAG-p53 or Ad-FLAG-p63 ⁇ Extracted. Sixty-four genes were identified as potential genes that are upregulated by FLAG-SHp53 (FIG. 18C and Table 8).
  • Table 8 shows the putative Flag-SHp53 gene identified by microarray analysis.
  • Table 9 is a list of H3K4me3-labeled genes specifically detected in Ad-Flag-SHp53-introduced cells.
  • p53 binding sites (BS) in these genes were identified in three screening approaches and in psilico using the p53 scanning algorithm (Smeenk et al., 2008). After searching by analysis, it was sorted by two independent criteria as shown in FIG. 18D.
  • the consensus p53BS consists of two copies of a 10 bp motif (RRRCWWGYY; SEQ ID NO: 24) delimited by a 0-21 bp spacer sequence (R: adenine or guanine, C: cytosine, W: adenine or thymine, G: guanine Y: cytosine or thymine).
  • p53BS having a 0-2 base spacer was selected. Furthermore, the location and distance of p53BS from the transcription start site (TSS) helps determine the threshold for accepting any putative p53BS. P53BS in genes is most commonly located in the 5 'promoter-enhancer region or intron 1 of genes, and functional low affinity p53BS in DNA exists only around TSS (Riley et al., 2008) . Therefore, p53BS located between -5 kbp and +10 kbp of the gene TSS was selected.
  • sequence comparison analysis of the human and mouse genomes is useful for searching putative p53BS (Maruyama et al., 2006), and so the conservation between humans and mice in orthologous genes was applied to computer searches. Along with this, two criteria were adapted to identify putative SHp53 target genes.
  • the gene is 1) p53BS located between -5 kbp and +10 kbp of TSS and containing a fully conserved core C / G, 3 mismatches and 2 spacers, and 2) -5 kbp of TSS Located between 10 kbp and had a fully conserved core C / G, 5 or fewer mismatches, and a p53 BS with more than 50% homology between humans and mice in the orthologous gene (FIG. 18C).
  • 133 putative p53BS in 63 SHp53-specific target gene candidates were identified (FIG. 18D and Table 10).
  • Table 10 shows target gene candidates for super hybrid p53.
  • p53BS p53 binding site
  • ChIP + binding
  • ChIP- non-binding
  • LDA TaqMan low density array
  • Example 9 Control of specific target gene transactivation by superhybrid p53
  • HuH -7 cells were infected with Ad-LacZ, Ad-FLAG-P53, Ad-FLAG-p63 ⁇ or Ad-FLAG-SHp53, and ChIP analysis was performed using anti-FLAG antibody.
  • FLAG-SHp53 protein for a DNA fragment containing a p53BS candidate identified by computer prediction in 26 species reported to be involved in cell proliferation and apoptosis Specific interactions were evaluated and confirmed in 19 genes. This suggests that these approaches are reliable in the search for functional p53BS (Table 10, Figure 22 and Figure 23).
  • oligonucleotides containing APOBEC2, CASP10 and PYCARD WTp53BS confirmed by ChIP analysis, or inactive mutants (muts) were added to the luciferase reporter. Cloned upstream of the gene. The resulting construct was then transfected into HuH-7 cells or SW480 cells with TP53 mutation with or without FLAG-SHp53. Unlike the sequence of the mutation, WTp53BS confers responsiveness to FLAG-SHp53 on the reporter construct, resulting in at least a 2-fold increase in luciferase activity compared to mock transfected cells (FIG. 22). As shown in FIG.
  • Example 10 Superhybrid p53 induces apoptosis by controlling the expression of specific target genes because Ad-SHp53 strongly induced apoptosis and transcription of specific target genes in several cancer cells ( FIG. 12A and FIG. 18A), it was considered that the hybrid acquired proapoptotic activity through transactivation of SHp53-specific target genes.
  • SHp53-specific transactivated genes were knocked down and Ad-SHp53-mediated apoptosis was analyzed by flow cytometry.
  • CASP10, KCNK3, and PYCARD were identified as apoptosis responsive genes (FIG. 24).
  • CASP10, KCNK3 or PYCARD was strongly induced by the introduction of Ad-FLAG-SHp53, while RT-PCR analysis showed that these three genes It was demonstrated that the increase in the expression of was inhibited by 50% or more in each siRNA-mediated knockdown cell (FIG. 24, upper panel).
  • Ad-FLAG-SHp53 was significantly suppressed in cells knocked down with CASP10, KCNK3 or PYCARD, whereas apoptosis induced with Ad-FLAG-p53 or Ad-FLAG-p63 ⁇ was not affected by the transfection of (Fig. 24, lower panel).
  • Conway KE, McConnell BB, Bowring CE, Donald CD, Warren ST, Vertino PM.TMS1, a novel proapoptotic caspase recruitment domain protein, is a target of methylation-induced gene silencing in human breast cancers.Cancer Res 2000; 60: 6236-6242. 10. Dotsch V, Bernassola F, Coutandin D, Candi E, Melino G. p63 and p73, the ancestors of p53. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2: a004887.
  • a single recombinant adenovirus expressing p53 and p21-targeting artificial microRNAs efficiently induces apoptosis in human cancer cells.Clin Cancer Res 2009; 15: 3725 -3732. 20. Irwin MS, Kondo K, Marin MC, Cheng LS, Hahn WC, Kaelin WG, Jr. Chemosensitivity linked to p73 function.Cancer Cell 2003; 3: 403-410.
  • CHFR a potential tumor suppressor, downregulates interleukin-8 through the inhibition of NF-kappaB.
  • Kruse JP Gu W. Modes of p53 regulation.Cell 2009; 137: 609-622.
  • Lane DP Cheok CF, Lain S. p53-based cancer therapy. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2: a001222.
  • Levine AJ Tomasini R, McKeon FD, Mak TW, Melino G. The p53 family: guardians of maternal reproduction. Nat Rev Mol Cell Biol 2011; 12: 259-265.
  • Lohrum MA Vousden KH.
  • ASC a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.J Biol Chem 1999; 274: 33835-33838. 29. Menendez D, Inga A, Resnick MA. The expanding universe of p53 targets. Nat Rev Cancer 2009; 9: 724-737. 30. Moll UM, Riou G, Levine AJ. Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: mutation and nuclear exclusion.Proc Natl Acad Sci U S A 1992; 89: 7262-7266.
  • P63 a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. 1998; 2: 305-316. 69. Yang A, McKeon F. P63 and P73: P53 mimics, menaces and more.Nat Rev Mol Cell Biol 2000; 1: 199-207.
  • a p53 family chimeric gene and / or a gene expression inducer containing a chimeric protein of the present invention it is possible to suppress the growth of tumor cells, and to provide a medicament for improving p53 gene therapy. Make it possible.

Abstract

　ｐ５３ファミリーのキメラ分子による遺伝子治療などの提供。　ｐ６３由来の転写活性化ドメインをコードする核酸配列、ｐ６３由来のＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列およびｐ５３由来のオリゴマー化ドメインをコードする核酸配列を含むキメラ遺伝子および／またはキメラタンパク質を含む、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子などの発現誘導剤、アポトーシス誘導剤、医薬組成物。

Description

ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用
　本発明は、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子および／またはキメラタンパク質を含む、遺伝子発現誘導剤などに関する。
　がん抑制遺伝子ｐ５３は、ＤＮＡ損傷などに関連する転写因子をコードする。ｐ５３におけるがんに関連する変異は、主としてＤＮＡ結合ドメインにおけるミスセンス変異である。典型的には、これら変異は全長の変異タンパク質（変異ｐ５３）を発現し、ｐ５３の標的遺伝子のトランス活性化を不能にする。野生型の活性が失われることに加え、多くのｐ５３変異体は、残りの野生型対立遺伝子から発現する野生型ｐ５３を不活性化し、ドミナントネガティブなタンパク質として機能する。議論の余地はあるものの、がん細胞における変異型ｐ５３の存在は侵襲性腫瘍に関連するため、予後の悪化にも関連する。
　外来性のｐ５３の発現は、細胞周期の進行を妨げ、アポトーシスを誘導することによって、がん細胞の増殖を阻害する。多くのがんにおいて、ｐ５３の消失は腫瘍の発達だけではなく、化学療法抵抗性をも引き起こす。したがって、腫瘍細胞への野生型ｐ５３の再導入は、増殖阻害経路を活性化し、腫瘍細胞の化学療法への感受性を増加させる。実際に、ｐ５３遺伝子治療がいくつかのがんに対して効果的であることが証明されている。しかしながら、ＭＤＭ２の増幅、ｐ１４ＡＲＦ変異による不活性化、またはＨＰＶ陽性子宮頸癌におけるＨＰＶ Ｅ６がん遺伝子は、ｐ５３の増殖抑制経路を障害するため、ｐ５３遺伝子治療の効果を妨げる。
　ｐ５３遺伝子ファミリーは、ｐ５３、ｐ６３（別名ｐ５１）およびｐ７３の３つのメンバーからなる。Ｎ末端の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）、中央コアの配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびＣ末端のオリゴマー化ドメイン（ＯＬＤ）の３つのドメインにおいて、これらファミリーは相同性を共有する。しかしながら、ｐ５３ファミリーメンバーは、転写制御および転写後制御の特徴的なパターンを示す。ｐ５３は比較的高レベルで広範に転写され、正常な細胞におけるｐ５３タンパク質の量は、主にそのタンパク分解によって制御される。ｐ５３タンパク質の分解は、ｐ５３をユビキチン化するＭＤＭ２を介して行われる。ｐ５３のＮ末端におけるアミノ酸残基のリン酸化は、そのＤＮＡ結合活性に影響を与えないが、ＭＤＭ２に対する親和性に影響するため、続くタンパク分解に影響を与える。
　ｐ６３の構造は、ｐ５３の構造より複雑である。ｐ６３遺伝子は、２つの異なるプロモーターの使用および選択的スプライシングの結果、Ｎ末端およびＣ末端が異なる複数のアイソフォームとして発現する。ｐ６３アイソフォームは、２つのＮ末端の１つを有すると考えられる。１つは転写活性があり（ＴＡ）、もう１つはＮ末端が欠失している（ΔＮ）。加えて、Ｃ末端はアイソフォーム間で異なり、特に、ｐ６３αアイソフォームは、急激に活性を減少させるＣ末端領域を含む。ｐ６３アイソフォーム間の機能的差異は、選択的プロモーターおよび選択的スプライシングの異なる制御が原因である。
　これまでに、ｐ５３の変異体として、ｐ５３のＳｅｒ－４６をフェニルアラニンで置換した変異ｐ５３が、がん細胞において野生型ｐ５３よりも効率的にアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献１）。また、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子も知られており、ｐ５１、ｐ５３およびｐ７３のＴＡＤ、ＤＢＤおよびＯＬＤをそれぞれ組み換えることにより、野生型ｐ５３よりも優れた転写活性能を獲得し得ることが知られている（特許文献１）。
特開２０００－３５４４８８号
Nakayama et al., Cancer Sci. 2006 Jul;97(7):633-41.
　しかしながら、特許文献１では、ｐ６３（ｐ５１）由来のＴＡＤを有するキメラでは転写活性能が低い傾向にあるなど、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子およびキメラタンパク質の有用性は、特定の組み合わせのキメラに限定されていた。また、腫瘍抑制におけるＴＡｐ６３およびＴＡｐ７３の機能は不明であり、ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子およびキメラタンパク質によるアポトーシス誘導の効果に関するデータも記載されていない。したがって、ｐ５３遺伝子治療に用いられ得るｐ５３ファミリーのキメラは、実用化に向けての改善の余地があり、臨床使用にも優れた抗腫瘍剤の開発が求められる。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、ＴＡＤ、ＤＢＤおよびＯＬＤがそれぞれｐ６３、ｐ６３およびｐ５３由来のｐ５３ファミリーのキメラ（ｐ６３－５３Ｏ）が、予想外にも優れたアポトーシス効果を奏することや、その変異体であるキメラタンパク質（ＳＨｐ５３）が、特定のアポトーシス関連遺伝子を特異的に活性化することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤。
［２］キメラタンパク質が、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む転写活性化ドメイン、配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン、および配列番号１９８のアミノ酸配列を含むオリゴマー化ドメインを含む、［１］に記載の遺伝子発現誘導剤。
［３］キメラタンパク質が核移行シグナルまたはその部分配列を含む、［１］または［２］に記載の遺伝子発現誘導剤。
［４］キメラタンパク質が、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載の遺伝子発現誘導剤。
［５］［１］～［４］のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、アポトーシス誘導剤。
［６］［１］～［４］のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、医薬組成物。
［７］細胞増殖性疾患の処置のための、［６］に記載の医薬組成物。
［８］ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス関連遺伝子の発現誘導方法。
［９］ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
［１０］ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、アポトーシス誘導剤。
［１１］ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、細胞増殖性疾患の処置のための医薬組成物。
［１２］ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
［１３］配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質もしくはその機能的変異体。
［１４］［１３］に記載のキメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子。
［１５］［１４］に記載の核酸分子を含む核酸構築物またはベクター。
［１６］［１５］に記載の核酸分子、および／または、［１５］に記載の核酸構築物および／またはベクターを含む組成物。
　本発明の遺伝子発現誘導剤は、ＴＡＤ、ＤＢＤおよびＯＬＤが、それぞれｐ６３、ｐ６３およびｐ５３由来のｐ５３ファミリーキメラ遺伝子またはキメラタンパク質を含み、アポトーシス関連遺伝子の発現を誘導する。したがって、がん細胞などにおいて、優れたアポトーシス誘導効果を示す。本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、転写活性能を高めると考えられるｐ６３由来のＯＬＤを有さず、野生型ｐ５３よりも効率的にアポトーシス関連遺伝子を誘導する。
　本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、カスパーゼ－３を活性化させてアポトーシスを促進し、in vivoにおいても優れた抗腫瘍効果を奏する。また、野生型ｐ５３よりも効率的にアポトーシスを誘導することから、従来のｐ５３治療よりも副作用を抑えることができ、臨床での有用性が期待される。さらに、本発明の遺伝子発現誘導剤は、遺伝子治療に用いることができ、かかる場合には化学療法や放射線治療などの他の処置法との併用も可能となる。
　本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、アポトーシス関連遺伝子を誘導することができ、例えば、ｐ５３ＡＩＰ１（ＴＰ５３ＡＩＰ１）の発現を誘導することにより、アポトーシスを促進することができる。また、本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、ＣＡＳＰ１０およびＰＹＣＡＲＤなどのアポトーシス関連遺伝子の発現を誘導することもできる。さらに、新規なアポトーシス関連遺伝子として今回同定されたＫＣＮＫ３の発現を誘導することができ、特徴的な遺伝子発現パターンおよび新規なアポトーシス経路によって、細胞増殖を抑制することができる。また、本発明のキメラタンパク質は、核移行シグナルを含むことによって、効率的に核へ移行し、転写を活性化することができる。
　本発明のキメラ遺伝子およびキメラタンパク質は、ｐ５３ヌルがん細胞または野生型がん細胞だけではなく、ドミナントネガティブ効果を有するｐ５３変異体を保持するがん細胞においても、効果的にアポトーシスを促進することができる。これにより、ｐ５３治療に耐性を示すがんの治療が可能となり、従来のｐ５３遺伝子治療を大幅に改善することができる。
図１は、Ａｄ－ｐ５３遺伝子ファミリーのアポトーシス効果の比較を示した図である。 図２ＡＢは、Ａｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの併用によって増加したアポトーシスの誘導を示した図である。 図２ＣＤは、ＭＫＮ４５細胞において、Ａｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの併用によって増加したアポトーシスの誘導を示した図である。 図３は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッド分子の模式図を示した図である。
図４は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドの細胞内局在を示した図である。 図５ＡＢは、ＰＡＲＰタンパク質の切断およびカスパーゼ－３の活性を示した図である。 図５ＣＤは、ＭＫＮ４５細胞におけるＰＡＲＰタンパク質の切断およびカスパーゼ－３の活性を示した図である。 図６は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性発現後のアポトーシス細胞のフローサイトメトリー解析を示した図である。
図７は、皮下に移植されたヒトがんの異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示した図である。 図８は、ＭＫＮ４５異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示した図である。 図９は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性トランスフェクション後のヒトがん細胞株におけるｐ５３標的およびアポトーシス関連タンパク質の発現を示した図である。 図１０は、ｐ６３－５３Ｏハイブリッドによるｐ５３ＡＩＰ１の効率的なトランス活性化を示した図である。
図１１は、ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡのｐ６３－５３Ｏによるアポトーシスの誘導との拮抗を示した図である。 図１２Ａ－Ｄは、スーパーハイブリッドｐ５３のがん細胞におけるアポトーシスの強い誘導を示した図である。 図１２Ｅ－Ｇは、スーパーハイブリッドｐ５３のがん細胞におけるアポトーシスの強い誘導を示した図である。 図１３は、ｐ５３（ダークグレー）、ｐ６３γ（ライトグレー）、６３－５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの模式図である。
図１４は、ｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの構造をＰＣＲ法およびウェスタンブロット法で確認したことを示した図である。 図１５は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３－５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドによる各種がん細胞におけるアポトーシス誘導の比較を示した図である。 図１６は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３－５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドタンパク質の細胞内局在を示した図である。 図１７は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３－５３ＯおよびＳＨｐ５３による特異的ｐ５３ＡＩＰ１発現誘導を示した図である。
図１８Ａは、ＳＨｐ５３により誘導される遺伝子発現プロファイリングを示した図である。 図１８Ｂ－Ｄは、ＳＨｐ５３により誘導される遺伝子発現プロファイリングを示した図である。 図１９は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示した図である。 図２０は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示した図である。
図２１は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示した図である。 図２２は、スーパーハイブリッドｐ５３特異的な標的遺伝子のトランス活性化の制御を示した図である。 図２３は、ＳＨｐ５３が特異的に結合する部位を持つ標的遺伝子を示した図である。 図２４は、特定の標的遺伝子の発現制御によるスーパーハイブリッドｐ５３のアポトーシスの誘導を示した図である。
　本明細書中に別記しないかぎり、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して用いられる用語およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。一般的に、別記のないかぎり、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的な、および専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。かかる文献としては、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology - 4th Ed., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); および Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)などが挙げらる。
　本明細書に引用した刊行物、特許出願、特許などの資料の全ては、その全体を本明細書に援用する。
　酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当該技術分野において通常なされているとおりに、または本明細書に記載のとおりに行うものとする。本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、ならびにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達、ならびに対象の処置に用いるものとする。
　ここで、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に別様に指示しないかぎり、複数の指示対象を含むよう用いることとする。例または別様に示されている場合を除き、本出願で用いる成分、反応条件などを表す全ての数は、全ての場合において用語「約」で修飾されるものと解される。したがって、反対のことが示されないかぎり、この出願に記載の数的パラメーターは近似値であり、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変動し得る。さらに、特に別記しないかぎり、用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的に用いるものとする。
　本発明の一側面は、（ｉ）ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質および／またはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子（以下で、「キメラ分子」と総称することもある）を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤または発現誘導用組成物、（ｉｉ）上記キメラ分子の、前記発現誘導剤または発現誘導用組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するための上記キメラ分子、および（ｉｖ）ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するための有効量の上記キメラ分子を含む組成物に関する。
　本発明のキメラタンパク質（「ハイブリッドタンパク質」と称することもある）は、ｐ５３とｐ６３とのキメラタンパク質である。したがって、典型的にはｐ５３およびｐ６３の部分からなり、キメラタンパク質のＮ末端側領域がｐ６３由来の部分で構成され、Ｃ末端領域がｐ５３由来の部分で構成される。ヒトｐ５３およびｐ６３の核酸配列は、それぞれ、アクセッション番号（受入番号）NM_000546およびAB016072として、アミノ酸配列は、それぞれアクセッション番号NP_000537およびBAA32592として、GenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手できる。ｐ５３およびｐ６３の配列はまた、配列番号１９３および１９５（核酸配列）、配列番号１９４および１９６（アミノ酸配列）として本明細書に示してある。他の動物の配列もまた、公的に利用可能なデータベース、例えばGenBankなどで見出すことができる：NM_001003210（イヌのｐ５３）、NM_001009294（ネコのｐ５３）、XM_545249（イヌのｐ６３）。本発明におけるｐ５３およびｐ６３は、それぞれ独立して、いずれの生物種に由来するものでもよいが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタなどを含む哺乳動物、特にヒトに由来するものであってもよい。本明細書においては、特に別記しない限り、アミノ酸や塩基の位置は、ヒトｐ５３およびｐ６３、より具体的には、配列番号１９３～１９６に記載のアミノ酸または塩基配列に依拠するものとする。
　ｐ５３およびｐ６３において、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインの３つの機能的ドメインを含む構造は種々の生物種間で保存されている。ヒトｐ５３およびｐ６３の各ドメイン構造は既知である（例えば、特開2000-354488、Scoumanne A. et al., Cancer Biol Ther. 2005 Nov;4(11):1178-85、Tafvizi A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 11;108(2):563-8、Natan E et al., J Mol Biol. 2011 Jun 10;409(3):358-68、Khoury MP & Bourdon JC, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Mar;2(3):a000927など）。ヒトｐ６３の転写活性化ドメインは、典型的には配列番号１９６の１～５９位、特に１～５８位、ヒトｐ６３のＤＮＡ結合ドメインは、典型的には配列番号１９６の１２４～３２３位、特に１２４～３１９位、さらには１４２～３２３位、１４２～３２１位もしくは１４２～３１９位、ヒトｐ５３のオリゴマー化ドメインは、典型的には配列番号１９４の３１８～３６３位、特に３１８～３５９位、３１９～３５９位もしくは３２２～３５９位、さらには３１９～３６３位、３２５～３６３位、３２５～３５５位、３２６～３５６位もしくは３２６～３５５位である。他の生物種における各ドメインの位置は知られているか、ドメイン構造が知られている生物種の配列とのアラインメントや、欠失変異体や置換変異体等を用いた実験等により決定することができる。本発明の一態様において、転写活性化ドメインは配列番号１９６の１～５８位（配列番号１６２）、ＤＮＡ結合ドメインは配列番号１９６の１２４～３１９位（配列番号１６６）、およびオリゴマー化ドメインは配列番号１９４の３２２～３５９位（配列番号１９８）である。本発明の別の態様において、転写活性化ドメインは配列番号１９６の１～５８位（配列番号１６２）、ＤＮＡ結合ドメインは配列番号１９６の１２４～３１９位（配列番号１６６）、およびオリゴマー化ドメインは配列番号１９４の３１９～３５９位（配列番号１７８）である。
　本発明のキメラタンパク質は、野生型ｐ５３およびｐ６３における、転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインの３つの機能的ドメインの間、およびオリゴマー化ドメインのＣ末端側に存在する配列を全て含んでも、部分的に含んでも、または、全く含まなくてもよい。本発明の一態様においては、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間に少なくとも１個、例えば、１～６１個のアミノ酸を含む。このアミノ酸はｐ５３由来またはｐ６３由来のものであってよく、２個以上のアミノ酸を含む場合は、さらにｐ５３由来のアミノ酸とｐ６３由来のアミノ酸の両方を含んでいてもよい。より具体的には、本発明のキメラタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間にｐ６３の３２０位からＣ末端側の３３個までのアミノ酸および／またはｐ５３の３１９位からＮ末端側の２８個までのアミノ酸を含んでもよい。例えば、本発明のキメラタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間に、（１）ｐ５３の３０５～３１７位のアミノ酸、（２）ｐ５３の２９０～３１７位のアミノ酸、（３）ｐ６３の３２０～３３５位のアミノ酸、（４）ｐ６３の３２０～３５２位のアミノ酸、（５）（１）～（４）のアミノ酸の任意の組合わせ（すなわち、（１）と（３）、（１）と（４）、（２）と（３）、および、（２）と（４）の組合わせ）を含んでもよい。この場合、（１）または（２）のアミノ酸は、典型的にはオリゴマー化ドメインのＮ末端に連結し、（３）または（４）のアミノ酸は、典型的にはＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に連結している。
　本発明の一態様において、キメラタンパク質は、オリゴマー化ドメインのＣ末端にｐ５３の３６０位からＣ末端側の３４個までのアミノ酸、例えば、限定されずに、３６０位の１個のアミノ酸、３６０～３６２位の３個のアミノ酸、３６０～３９３位の３４個アミノ酸が連結している。本発明の一態様において、キメラタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間、および、オリゴマー化ドメインのＣ末端に、上記のいずれかの少なくとも１個のアミノ酸を含む。本発明の一態様において、キメラタンパク質は、ｐ５３由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）配列またはその一部の配列を含む。ｐ５３由来の核移行シグナルは、３０５～３２１位のアミノ酸（配列番号１９０）であり、その一部としては、例えば、３１９～３２１位のアミノ酸が挙げられる。
　本発明の特定の態様において、キメラタンパク質は、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の特定の態様において、キメラタンパク質は、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
　上記のキメラタンパク質の機能的変異体には、（ｉ）本発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列に対し１個または２個以上、例えば、１個または数個（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸の変異を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉ）本発明のキメラタンパク質の全長アミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉｉ）本発明のキメラタンパク質の全長をコードする核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体などが含まれる。
　本明細書で用いる用語「ストリンジェントな条件」は、当該技術分野で周知のパラメータを指す。核酸のハイブリダイゼーションのためのパラメータは、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)やAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)などの標準的なプロトコルに記載されている。
　具体的には、本明細書で用いるストリンジェントな条件は、３．５×ＳＳＣ、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４　２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％およびＥＤＴＡ２ｍＭを含むハイブリダイゼーションバッファによる、６５℃でのハイブリダイゼーションを意味する。上記成分のうち、ＳＳＣはｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムであり、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡをトランスファーしたメンブレンを、室温にて２×ＳＳＣで、次いで６８℃までの温度にて０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、市販のハイブリダイゼーションバッファ、例えば、ExpressHyb(R)緩衝溶液（Clontech Corp.製）等を用いて、メーカーによって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用してもよい。
　同程度のストリンジェンシーをもたらす、利用可能な他の条件、試薬等があるが、当業者はかかる条件を熟知していると考えられるため、本明細書にはこれらに関する具体的な記載はない。しかしながら、対象となる核酸分子もしくはタンパク質の変異体をコードする核酸が明確に同定されるよう、条件を操作することは可能である。
　前記キメラタンパク質の機能としては、例えば、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導、アポトーシスの誘導、細胞の増殖抑制などが挙げられる。キメラタンパク質がこれらの機能を有するか否かは、任意の既知の技法、例えば、下記の実施例に記載された技法などによって確認することができる。
　本発明の一態様において、キメラタンパク質の機能的変異体は、１個または２個以上、例えば１個または数個の保存的なアミノ酸置換を有してもよい。保存的なアミノ酸置換は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基の互換性に依拠して決定することができる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、水酸基含有側鎖を有する中性アミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換グループは、限定されずに、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンなどである。
　保存的なアミノ酸置換は、キメラタンパク質の転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインの３つの機能的ドメインの少なくとも１つに存在しても、上記の機能的ドメイン以外の部分、例えば、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間、オリゴマー化ドメインのＣ末端側に存在してもよい。本発明の一態様において、１個または２個以上の変異、例えば、アミノ酸の欠失、置換、付加は、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間、ＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメインとの間、オリゴマー化ドメインのＣ末端側から選択される個所に存在する。
　上記のキメラタンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸分子は、上述のキメラタンパク質またはその機能的変異体のアミノ酸配列に依拠して決定することができる。例えばヒトのｐ５３およびｐ６３のキメラタンパク質をコードする核酸分子については、ヒトのｐ５３およびｐ６３の核酸配列（配列番号１９３および１９５）に依拠して、キメラタンパク質に含まれるｐ５３およびｐ６３タンパク質の各部分に対応する核酸配列を決定することができる。上記核酸分子の具体的配列としては、例えば、配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７および１５９からなる群から選択される核酸配列を含むか、これからなるものが挙げられる。本発明の遺伝子発現誘導剤に用いることのできる核酸分子は、上記核酸分子の縮重物、すなわち、遺伝子コドンの縮重により上記核酸分子と核酸配列は異なるが、それと同じアミノ酸配列のタンパク質をコードするものを含む。
　上記のキメラ分子は、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導する。本発明における遺伝子発現の誘導とは、典型的には、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した場合と比較して、当該遺伝子の転写産物またはタンパク質の発現上昇をもたらすことをいう。本発明における発現上昇は、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上であってもよい。
　上記のキメラ分子は、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤのほか、例えば、表７～８に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現をさらに誘導してもよい。本発明の一態様において、誘導される遺伝子は、ＡＧＲＮ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＱＰ３、ＡＲＨＧＡＰ２３、ＡＳＢ１７、ＢＡＩ１、Ｃ１５ｏｒｆ５２、Ｃ３ｏｒｆ４５、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＡＳＰ１０、ＣＤＨ３、ＣＩＴＥＤ１、ＣＬＤＮ１９、ＣＯＬ１６Ａ１、ＤＤＲ１、ＤＬＧＡＰ１、ＤＬＸ３、ＤＭＢＸ１、ＤＹＳＦＩＰ１、ＥＧＲ２、ＦＢＰ２、ＦＧＦ１、ＧＡＳＴ、ＧＰＲ８９Ａ、ＧＲＨＬ３、ＧＲＲＰ１、ＨＶＣＮ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＴＧＡ３、ＫＡＴＮＡＬ２、ＫＣＮＡ２、ＫＣＮＫ３、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ３４、ＬＨＸ１、ＭＡＬＬ、ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＬ７、ＮＣＲＮＡ００１７３、ＮＥＦＨ、ＮＥＦＬ、ＮＰＰＣ、ＮＴＦ４、ｐ５３ＡＩＰ１、ＰＬＣＤ４、ＰＹＣＡＲＤ、ＳＥＣ１４Ｌ５、ＳＥＺ６、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＲＬ、ＳＴＡＲ、ＳＹＴＬ３、ＴＬＸ１、ＴＭＥＭ１２１、ＴＰ７３、ＴＰ７３、ＴＴＹＨ２、ＷＮＴ７ＢおよびＺＮＦ３６５からなる群から選択される。
　本発明のキメラ分子は、当該技術分野において既知の任意の手法により製造することができる。本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子（キメラ遺伝子）は、限定されずに、例えば、オーバーラップ伸長法（例えば、Heckman KL & Pease LR., Nat Protoc 2007; 2: 924-932、Ogasawara Y et al., J Biol Chem 1994; 269: 29785-29792など参照）などのＰＣＲを用いた手法で製造することができる。この手法においては、第１の遺伝子の配列に相補的な部分と、第２の遺伝子の配列に相補的な部分とを含むハイブリッドプライマー、例えば、限定されずに、ｐ６３のＤＮＡ結合ドメインとそのＣ末端側に続く部分とを含む部分の配列またはそのＣ末端部分の配列に相補的な部分と、ｐ５３のオリゴマー化ドメインとそのＮ末端側に続く部分とを含む部分の配列またはそのＮ末端部分の配列に相補的な部分とを含むハイブリッドプライマーなどを利用することができる。本発明のキメラタンパク質は、限定されずに、例えば、既知の手法で得たキメラ遺伝子を、適切な宿主細胞に導入して発現させ、得られたタンパク質を既知の手法、例えば、１次元または２次元ゲル電気泳動法や、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、アフィニティカラム法などで精製することなどにより得ることができる。
　本発明のキメラ分子の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。
　ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３～１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５～１×１０１３、より好ましくは１×１０７～１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８～１×１０１０で用いることができる。
　上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。
　遺伝子発現に必要な制御配列の詳細な性質は、生物種または細胞種によって異なってもよいが、一般的には、少なくとも、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、各々転写および翻訳の開始に関与する５’非転写、および５’非翻訳配列を含み得る。特に、かかる５’非転写制御配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含み得る。制御配列はまた、エンハンサー配列か、または所望の上流のアクチベーター配列を含んでもよい。上記核酸構築物およびベクターは、任意に５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切な核酸構築物およびベクターの選択および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内にある。 
　特に有用な制御配列は、種々の哺乳動物、ウイルス、微生物、および昆虫遺伝子由来のプロモーター領域を包含する。このプロモーター領域は、対象となる遺伝子の転写の開始を指令し、そして対象となる遺伝子を含むＤＮＡの全ての転写をもたらす。有用なプロモーター領域は、ＣＡＧプロモーター、レトロウイルスのｄＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサー／プロモーター領域、ＲＳＶのＬＴＲプロモーター、ｌａｃプロモーター、およびアデノウイルスから単離されたプロモーターを包含するが、真核生物、原核生物、ウイルス、または微生物細胞での遺伝子発現に有用な、当業者に公知の他の任意のプロモーターを用いることもできる。 
　真核生物細胞内で、遺伝子およびタンパク質を発現するのにとりわけ有用なその他のプロモーターは、哺乳動物細胞プロモーター配列およびエンハンサー配列、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導されるものを包含する。典型的にはＳＶ４０などのウイルスのウイルス複製起点に隣接して見出される、ウイルスの初期および後期プロモーターが、特に有用である。特定の有用なプロモーターの選択は、その細胞系、および、特定の細胞系内部で対象となるタンパク質または核酸を発現させるために使用する核酸構築物についての、他の様々なパラメータに依存する。さらに、本発明において有用な充分高いレベルで、標的細胞に遺伝子を発現させることが知られている任意のプロモーターを選択することができる。例えば、標的細胞（がん細胞など）に特異的なプロモーターを採用することにより、遺伝子を特定の標的細胞で効率的に発現させることができる。組織特異的プロモーターとしては、限定されずに、例えば、ＧＦＡＰプロモーター（脊髄、海馬、線状体のニューロン）、ＭＣＫプロモーター（筋肉など）、ＮＳＥプロモーター（ＣＮＳなど）、デスミンプロモーター（心筋、骨格筋など）、ＲｈＭＬＶプロモーター（骨）、オステオカルシンプロモーター（骨）等が挙げられる（Howarth JL et al., Cell Biol Toxicol. 2010 Feb;26(1):1-20等参照）。
　本発明の核酸分子は、かかる制御配列と作動可能に連結されていることが好ましい。核酸が制御配列に作動可能に連結されているとは、制御配列の作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生等されるように、該核酸と制御配列とが配置されていることを意味する。より具体的には、核酸分子のコード配列と、核酸構築物やベクターの制御配列とが、当該コード配列の発現または転写が、当該制御配列の影響または支配下にあるように位置される様式で連結されている場合、「作動可能に」連結されている。当該コード配列を機能的なタンパク質に翻訳することが望まれる場合には、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列におけるプロモーターによる誘導の結果、当該コード配列の転写が生じ、また当該２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導する結果とならず、（２）当該コード配列の転写を指示するための当該プロモーターの能力を妨害せず、あるいは（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合には、「作動可能に」連結されている。したがってプロモーター領域は、当該プロモーター領域が、結果として得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列を転写できれば、作動可能にコード配列に連結されていることになる。
　本発明における「ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するための有効量」は、上記遺伝子の発現を、例えば、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した場合と比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上増大させる量であり、野生型ｐ５３またはｐ６３との比較実験などにより容易に決定することができる。
　上記のキメラ分子は、単一の種類を用いても、１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。異なる種類の遺伝子の発現を誘導することができるキメラ分子を組み合わせることで、より多くの遺伝子を誘導することが可能となる。また、実施例に示すとおり、本発明のキメラ分子が誘導する遺伝子群は、野生型ｐ５３およびｐ６３が誘導するものと一部重複するものの、大部分異なっているため、野生型のｐ５３、ｐ６３、さらにはｐ７３（以下、野生型ｐ５３ファミリー分子と総称することもある）などと組み合わせて用いることもできる。
　本発明はまた、（ｉ）上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤を含む、アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物、（ｉｉ）上記キメラ分子の、前記アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスを誘導するための上記キメラ分子、および（ｉｖ）アポトーシスを誘導するための有効量の上記キメラ分子を含む組成物に関する。本発明のこの側面におけるキメラ分子の存在態様などは、特に別記しない限り、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。
　上記のキメラタンパク質および／またはその機能的変異体によって発現誘導される遺伝子には、アポトーシス関連遺伝子が含まれる。かかる遺伝子としては、限定されずに、例えば、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤ遺伝子等が挙げられる。ｐ５３ＡＩＰ１は、ｐ５３が誘導するアポトーシスにおける重要な因子であることが知られており（例えば、Oda K et a., Cell. 2000 Sep 15;102(6):849-62）、ＣＡＳＰ１０は、細胞死誘導シグナル複合体（ＤＩＳＣ）によるアポトーシスを開始するカスパーゼ－１０をコードする（Tibbetts MD et al., Nat Immunol 2003; 4: 404-409）。ＰＹＣＡＲＤは、ＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）をコードし、アポトーシス、免疫応答およびがん発生に重要な役割を担う（Masumoto J et al., J Biol Chem 1999; 274: 33835-33838）。ＫＣＮＫ３はこれまでアポトーシスとの関連性は知られていなかったが、今回本発明者によってアポトーシスの誘導に関与することが初めて明らかとなった。また、上記の核酸分子を細胞に導入することにより種々の細胞においてアポトーシスが誘導されることもこれまで知られていなかったが、本発明者の実験により今回初めて明らかとなった。
　本発明におけるアポトーシスの誘導は、細胞に上記キメラ分子を導入した後、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化、ＰＡＲＰタンパク質の切断などのアポトーシス特有の現象の検出、ｓｕｂ－Ｇ１にある細胞の割合の測定、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。本発明におけるアポトーシスの誘導は、典型的には、上記キメラ分子を導入していない状態よりも高く、好ましくは、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した状態よりも高い。アポトーシス誘導の増大の程度は、例えば、キメラ分子を導入していない状態、あるいは、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した状態と比べ、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上であってもよい。
　本発明における「アポトーシスを誘導するための有効量」は、例えば、アポトーシスを、キメラ分子を導入していない状態、あるいは、野生型ｐ５３またはｐ６３を導入した状態と比べて、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上増大させる量であり、上記状態との比較実験などにより容易に決定することができる。
　本発明のキメラ分子は、単一の種類を用いても、１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。異なる種類の遺伝子の発現を誘導することができるキメラ分子を組み合わせることで、より多くの遺伝子が誘導され、アポトーシスをより強く誘導することが期待される。また、実施例に示すとおり、本発明のキメラ分子が誘導する遺伝子群は、野生型ｐ５３およびｐ６３が誘導するものと一部重複するものの、大部分異なっており、野生型ｐ５３およびｐ６３ではほとんど誘導されないアポトーシス促進性遺伝子（ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３、ＰＹＣＡＲＤなど）を誘導することができるため、野生型ｐ５３ファミリー分子などと組み合わせて用いることで、アポトーシスをより強く誘導することが期待される。
　本発明はまた、上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤を含む医薬組成物に関する。上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤は、特定の遺伝子の発現や、アポトーシスを誘導することができるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。
　上記医薬組成物は、限定されずに、上記のキメラ分子によって発現が誘導される遺伝子や、アポトーシスの誘導がその処置に有用な疾患、例えば、前記遺伝子の発現異常に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などの処置に用いることができる。したがって、本発明はまた、（ｉ）上記のキメラ分子、または上記遺伝子発現誘導剤を含むアポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物、（ｉｉ）上記キメラ分子の、アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための上記キメラ分子、および（ｉｖ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための有効量の上記キメラ分子を含む医薬組成物に関する。本発明のこの側面におけるキメラ分子の存在態様などは、特に別記しない限り、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。
　細胞増殖性疾患としては、限定されずに、例えば、良性腫瘍または悪性腫瘍、過形成症、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、過形成瘢痕、扁平苔癬および黒子症などを含む。本発明の一態様において、細胞増殖性疾患はがんである。
　本発明が対象とするがんとしては、限定されずに、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。なお、本発明では、「がん」は、上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍を含む。本発明におけるがんは、身体の任意の部位、例えば、脳、頭頚部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、肛門、腎、尿管、膀胱、前立腺、陰茎、精巣、子宮、卵巣、外陰、膣、皮膚、横紋筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節等のリンパ系、リンパ液などに存在し得る。
　本発明が対象とするがんの一態様は、ｐ５３に変異を有するがん細胞から構成されるがんである。ｐ５３の変異としては、例えば、ｐ５３の欠失や、ｐ５３におけるアミノ酸置換が挙げられる。ｐ５３におけるアミノ酸置換としては、限定されずに、例えば、ヒトｐ５３における、Ｇ１１７Ｅ、Ｐ１５２Ｔ、Ｔ１５５Ｉ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１７５Ｈ、Ｐ１７７Ｓ、Ｐ１７７Ｆ、Ｐ１７７Ｈ、Ｈ１７９Ｙ、Ｅ１８０Ｋ、Ｒ１８１Ｇ、Ｒ１８１Ｈ、Ｎ２３９Ｓ、Ｓ２４１Ｔ、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｙ、Ｇ２４４Ｓ、Ｇ２４５Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｍ２４６Ｌ、Ｐ２５０Ｌ、Ｌ２５７Ｐ、Ｄ２５９Ｖ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、Ｖ２７４Ｆ、Ｇ２７９Ｅ、Ｇ２７９Ｖ、Ｇ２７９Ｒ、Ｄ２８１Ｎ、Ｄ２８１Ｅ、Ｒ２８２Ｑ、Ｅ２８６Ｋなどのアミノ酸置換が挙げられる（Willis et al., Oncogene 2004; 23:2330-8、Blagosklonny et al., Faseb J 2000; 14:1901-7、Monti et al., Oncogene 2002; 21:1641-8参照）。がん細胞が上記変異を有するか否かは、がん細胞のｐ５３遺伝子を解析することで決定することができる。
　本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤、ビタミンなどをさらに含んでもよい。
　抗腫瘍剤としては、限定されずに、例えば、イホスファミド、ニムスチン（例えば、塩酸ニムスチン）、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン（例えば、塩酸ゲムシタビン）、エノシタビン、シタラビン・オクホスファート、シタラビン製剤、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（例えば、ＴＳ－１）、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン等の代謝拮抗剤、イダルビシン（例えば、塩酸イダルビシン）、エピルビシン（例えば、塩酸エピルビシン）、ダウノルビシン（例えば、塩酸ダウノルビシン、クエン酸ダウノルビシン）、ドキソルビシン（例えば、塩酸ドキソルビシン）、ピラルビシン（例えば、塩酸ピラルビシン）、ブレオマイシン（例えば、塩酸ブレオマイシン）、ペプロマイシン（例えば、硫酸ペプロマイシン）、ミトキサントロン（例えば、塩酸ミトキサントロン）、マイトマイシンＣ等の抗腫瘍性抗生物質、エトポシド、イリノテカン（例えば、塩酸イリノテカン）、ビノレルビン（例えば、酒石酸ビノレルビン）、ドセタキセル（例えば、ドセタキセル水和物）、パクリタキセル、ビンクリスチン（例えば、硫酸ビンクリスチン）、ビンデシン（例えば、硫酸ビンデシン）、ビンブラスチン（例えば、硫酸ビンブラスチン）等のアルカロイド、アナストロゾール、タモキシフェン（例えば、クエン酸タモキシフェン）、トレミフェン（例えば、クエン酸トレミフェン）、ビカルタミド、フルタミド、エストラムスチン（例えば、リン酸エストラムスチン）等のホルモン療法剤、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等の白金錯体、サリドマイド、ネオバスタット、ベバシズマブ等の血管新生阻害剤、Ｌ－アスパラギナーゼなどが挙げられる。
　抗炎症剤としては、限定されずに、ステロイド系抗炎症剤（プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等）や非ステロイド系抗炎症剤（アセチルサリチル酸、ロキソプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チアプロフェン酸、スプロフェン、トルメチン、カルプロフェン、ベノキサプロフェン、ピロキシカム、ベンジダミン、ナプロキセン、ジクロフェナク、イブプロフェン、ジフルニサール、アザプロパゾン等）、炎症性サイトカインの発現を抑制するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、アンチセンス核酸などの物質、および／または炎症性サイトカインの作用を抑制する薬物、例えば、炎症性サイトカインに対する抗体や、炎症性サイトカインの受容体拮抗剤などが挙げられる。
　ビタミンとしては、限定されずに、ＶＡ（レチノール）、ＶＢ１（チアミン）、ＶＢ２（リボフラビン）、ＶＢ３（ナイアシン）、ＶＢ５（パントテン酸）、ＶＢ６（ピリドキシン）、ＶＢ７（ビオチン）、ＶＢ９（葉酸）、ＶＢ１２（シアノコバラミン）、ＶＣ（アスコルビン酸）、ＶＤ（カルシフェロール）、ＶＥ（トコフェロール）およびＶＫ（フィロキノン）、ならびにこれらの誘導体およびアナログなどが挙げられる。
　本発明の遺伝子発現誘導剤、アポトーシス誘導剤、医薬組成物などに関し、ｐ５３は、アポトーシス促進性遺伝子の発現を誘導するが、同時にアポトーシス抑制遺伝子の発現も誘導する。アポトーシス抑制遺伝子としては、例えば、限定されずに、ｐ２１（NM_000389）、ＳＦＮ（ストラチフィン、１４－３－３シグマ、NM_006142）、Ｇａｄｄ４５（NM_001924）、ｐ３００（ＥＰ３００、NM_001429）、ＢＴＧ２（ＴＩＳ２１、NM_006763）、ＣＡＶ１（NM_001753）、ＤＵＳＰ５（NM_004419）、ＥＧＦＲ（NM_005228）、ＨＧＦ（ＳＦ、NM_000601）、ＭＥＴ（NM_000245）、ＰＣＮＡ（NM_002592）、ＰＬＡＧＬ１（ＺＡＣ、BC074814）、ＳＥＳＮ１（ＰＡ２６、AF033120）、ＳＨ２Ｄ１Ａ（ＳＡＰ、NM_002351）、ＴＧＦＡ（NM_003236）、ＰＣＢＰ４（NM_020418）、ＲＲＭ２Ｂ（NM_015713）、ＳＴＥＡＰ３（NM_001008410）、ＡＲＩＤ３Ａ（Ｅ２ＦＢＰ１、NM_005224）、Ｃ１３ｏｒｆ１５（ＲＧＣ３２、NM_014059）、ＣＣＮＧ１（NM_004060）、ＣＣＮＫ（NM_003858）、ＤＤＢ２（NM_000107）、ＤＤＩＴ４（ＲＥＤＤ１、NM_019058）、ＧＭＬ（NM_002066）、ＧＰＸ１（NM_000581）、ＨＲＡＳ（ｃ－Ｈａ－Ｒａｓ、NM_176795）、ＩＢＲＤＣ２（NM_182757）、ＭＥＴ（NM_000245）、ＭＳＨ２（NM_000251）、ＰＬＫ２（ＳＮＫ、NM_006622）、ＲＢ１（NM_000321）、Ｓ１００Ａ２（NM_005978）、ＴＰ５３ｉ３（Ｐｉｇ３、NM_004881）、ＴＲＩＭ２２（Ｓｔａｆ５０、NM_006074）、ＶＣＡＮ（ＣＳＰＧ２、NM_004385）などの細胞周期停止に関与する遺伝子（Riley et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2008;9(5):402-12、特にその補足情報を参照。括弧内の番号は、GenBankアクセッション番号を示す）、ＭＤＭ２（GenBankアクセッション番号：NM_002392、NM_006878、NM_006879、NM_006881、NM_006882）などのユビキチンリガーゼ等が挙げられる。
　また、変異型ｐ５３ファミリータンパク質を有する細胞においては、これがドミナントネガティブ変異体として作用し、上記キメラタンパク質やその機能的変異体の効果を妨げることがある。ｐ５３ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体としては、限定されずに、例えば以下の変異を有するヒトｐ５３が挙げられる：Ｇ１１７Ｅ、Ｐ１５２Ｔ、Ｔ１５５Ｉ、Ｒ１５６Ｐ、Ｒ１７５Ｈ、Ｐ１７７Ｓ、Ｐ１７７Ｆ、Ｐ１７７Ｈ、Ｈ１７９Ｙ、Ｅ１８０Ｋ、Ｒ１８１Ｇ、Ｒ１８１Ｈ、Ｎ２３９Ｓ、Ｓ２４１Ｔ、Ｓ２４１Ｆ、Ｃ２４２Ｙ、Ｇ２４４Ｓ、Ｇ２４５Ｓ、Ｇ２４５Ｄ、Ｍ２４６Ｌ、Ｐ２５０Ｌ、Ｌ２５７Ｐ、Ｄ２５９Ｖ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、Ｖ２７４Ｆ、Ｇ２７９Ｅ、Ｇ２７９Ｖ、Ｇ２７９Ｒ、Ｄ２８１Ｎ、Ｄ２８１Ｅ、Ｒ２８２Ｑ、Ｅ２８６Ｋ（上記Willis et al., 2004、Blagosklonny et al., 2000、Monti et al., 2002参照）。
　したがって、キメラ分子を、遺伝子発現の誘導、アポトーシスの誘導、細胞増殖性疾患の処置などに使用する際に、これらのアポトーシス抑制遺伝子やドミナントネガティブ変異体の発現を同時に抑制することで、キメラ分子の効果を高めることが可能となる。したがって、上記キメラ分子は、上記のアポトーシス抑制遺伝子やドミナントネガティブ変異体の発現を阻害する物質（例えば、アポトーシス抑制遺伝子やドミナントネガティブ変異体に対するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｄＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｒａｓｉＲＮＡなど）、リボザイム、アンチセンス核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む）などの物質、もしくはアポトーシス抑制タンパク質のドミナントネガティブ変異体等のドミナントネガティブ効果を有する物質、またはこれらを発現するベクター）と併用することが可能である。
　ｐ５３ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体の発現を阻害する核酸分子に関し、核酸分子は変異体遺伝子のコード領域を標的としてもよいが、その非翻訳領域、特にｐ５３ファミリーｍＲＮＡの３’ＵＴＲを標的とし、全ての内因性ドミナントネガティブタンパク質を特異的にノックダウンする一方、本発明の剤または組成物から発現される、コード領域だけを含むであろうキメラ分子や、外因性の野生型ｐ５３ファミリータンパク質を無傷のままとすることができる。
　本発明の遺伝子発現誘導剤、アポトーシス誘導剤、医薬組成物などにおいて、２種以上のキメラ分子および／または野生型ｐ５３ファミリー分子を組み合わせて用いる場合、２種以上の分子を単一の組成物に含めても、複数の組成物に別々に含ませ、それらを組み合わせて用いてもよい。例えば、核酸分子であれば、２種以上の核酸分子を単一の核酸構築物またはベクターに組み込んでも、それぞれ１種類ずつの核酸分子を含む複数種の核酸構築物またはベクターの組合わせとして調製してもよい。２種以上の核酸分子を単一の核酸構築物またはベクターに組み込む場合、各核酸分子は共通の制御配列の制御下にあっても、同一種の複数の制御配列の制御下にあっても、複数種の異なる制御配列の制御下にあってもよい。共通の制御配列の制御下にある場合、ある核酸分子は発現するが、別の核酸分子は発現しないといった状況が生じる可能性が少なくなる。したがって、この態様は、同時に発現しないと効果が得られないか、悪影響が生じるような核酸分子を組み合わせて用いる場合に有用である。一態様において、本発明の核酸分子はWO 2009/125607に記載の核酸構築物またはベクターに担持させることができる。この核酸構築物およびベクターは、所望の遺伝子と、望まない遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコシストロニックに発現することができる。
　本発明の種々の態様において、上記のキメラ分子は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。これらの担体は、所望の標的細胞または標的組織に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０～２００μｍ、特に７５～１５０μｍなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＶＥＧＦＲ、αｖβ３、ＶＣＡＭ－１、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47、Ranganathan R et al., Int J Nanomedicine. 2012;7:1043-60）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５－５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６－５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７－５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ－１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）、レチノール、レチノイン酸などのレチノイド（WO 2008/120815）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。
　他の標的化方法としては、例えば、磁性ナノ粒子などの磁性担体を用いる方法（例えば、Charles L., Oncotarget. 2012 April; 3(4): 365-370など参照）、ｐＨ応答性ナノ粒子などのｐＨ応答性担体を用いる方法（例えば、Gao W., Mol Pharm. 2010 December 6; 7(6): 1913-1920など参照）、蛍光担体を用いる方法（例えば、Jiang S. et al., J R Soc Interface. 2010 Jan 6;7(42):3-18など参照）、細胞外活性化ナノ粒子などの細胞外活性化担体を用いる方法（例えば、Gullotti E. et al., Mol Pharm. 2009 Jul-Aug; 6(4): 1041-1051など参照）などが挙げられる。
　本発明の剤や組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
　本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の剤または組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の剤または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
　したがって、本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種剤または組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種剤または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
　本発明の一側面は、本発明のキメラ分子を用いる方法に関する。
　本発明のこの一側面における一態様は、本発明のキメラ分子または遺伝子発現誘導剤を用いる遺伝子発現誘導方法に関する。本発明の遺伝子発現誘導方法は、本発明のキメラ分子または遺伝子発現誘導剤を、細胞内に導入する工程を含んでもよい。具体的な導入方法については、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。本方法で誘導することができる遺伝子としては、例えば、表７～８に記載のものが挙げられる。本発明の一態様において、誘導される遺伝子は、ＡＧＲＮ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＱＰ３、ＡＲＨＧＡＰ２３、ＡＳＢ１７、ＢＡＩ１、Ｃ１５ｏｒｆ５２、Ｃ３ｏｒｆ４５、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＡＳＰ１０、ＣＤＨ３、ＣＩＴＥＤ１、ＣＬＤＮ１９、ＣＯＬ１６Ａ１、ＤＤＲ１、ＤＬＧＡＰ１、ＤＬＸ３、ＤＭＢＸ１、ＤＹＳＦＩＰ１、ＥＧＲ２、ＦＢＰ２、ＦＧＦ１、ＧＡＳＴ、ＧＰＲ８９Ａ、ＧＲＨＬ３、ＧＲＲＰ１、ＨＶＣＮ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＴＧＡ３、ＫＡＴＮＡＬ２、ＫＣＮＡ２、ＫＣＮＫ３、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ３４、ＬＨＸ１、ＭＡＬＬ、ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＬ７、ＮＣＲＮＡ００１７３、ＮＥＦＨ、ＮＥＦＬ、ＮＰＰＣ、ＮＴＦ４、ｐ５３ＡＩＰ１、ＰＬＣＤ４、ＰＹＣＡＲＤ、ＳＥＣ１４Ｌ５、ＳＥＺ６、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＲＬ、ＳＴＡＲ、ＳＹＴＬ３、ＴＬＸ１、ＴＭＥＭ１２１、ＴＰ７３、ＴＰ７３、ＴＴＹＨ２、ＷＮＴ７ＢおよびＺＮＦ３６５からなる群から選択される。
　本方法の一態様において、キメラ分子または遺伝子発現誘導剤は、遺伝子発現誘導に有効な量で細胞に投与される。遺伝子発現誘導に有効な量については、遺伝子発現誘導剤について上記したとおりである。本方法は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。本方法は、標的細胞において特定の遺伝子の発現を調節することなどに用いることができる。
　本発明の別の態様は、本発明のキメラ分子またはアポトーシス誘導剤を用いるアポトーシス誘導方法に関する。本発明のアポトーシス誘導方法は、本発明のキメラ分子、遺伝子発現誘導剤またはアポトーシス誘導剤を、細胞内に導入する工程を含んでもよい。具体的な導入方法については、遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。本方法の一態様において、キメラ分子または各種剤は、アポトーシス誘導に有効な量で細胞に投与される。アポトーシス誘導に有効な量については、アポトーシス誘導剤について上記したとおりである。本方法は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。本方法は、異常に増殖している細胞、例えばがん細胞などでアポトーシスを誘導することなどに用いることができる。
　本発明のさらなる態様は、本発明のキメラ分子または医薬組成物を用いる疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法は、本発明のキメラ分子、各種剤または医薬組成物を対象に投与する工程を含む。投与される対象は、典型的には本発明のキメラ分子等による処置を必要としている。かかる対象としては、限定されずに、例えば、上記のキメラ分子によって発現が誘導される遺伝子や、アポトーシスの誘導がその処置に有用な疾患、例えば、前記遺伝子の発現異常に関連する疾患や、細胞増殖性疾患などを患っているか、これらの疾患を有すると診断されたか、これらの疾患を発症するリスクが高い対象である。したがって、本発明の処置方法は、本発明のキメラ分子、各種剤または医薬組成物による処置を必要としている対象を同定する工程をさらに含んでもよい。細胞増殖性疾患の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。
　本発明の処置方法においては、本発明のキメラ分子または医薬組成物を、対象とする疾患を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することができる。ｐ５３の変異または欠失が、がんの予後不良および化学療法や放射線に対する耐性に関連していることから（Clarke et al., Oncogene 1994; 9:1767-73、Merritt et al., Cancer Res 1994; 54:614-7、Poeta et al., N Engl J Med 2007; 357:2552-61、Patocs et al., N Engl J Med 2007; 357:2543-51）、本発明のキメラ分子により、化学療法や放射線治療に対するがんの感受性が改善することが期待される。疾患の処置において、本発明のキメラ分子または医薬組成物と併用し得る作用物質、例えば、例えば抗腫瘍剤、抗炎症剤、ビタミンなどは、医薬組成物に関して上記したとおりである。また、本発明の処置方法は、放射線治療などの物理療法や外科手術などの外科的治療などと併用することができる。
　本発明の処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
　本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
　投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
　本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
　また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
　今回本発明者により、本発明のキメラタンパク質が、表７に記載の広範な種類の遺伝子を誘導することが明らかになった。したがって、本発明のキメラタンパク質は、これらの遺伝子またはその組合せが誘導する、アポトーシスや細胞増殖阻害以外の作用をもたらすことができる。したがって、本発明はまた、上記キメラ分子を含む、上記作用を提供するための組成物、上記キメラ分子の上記作用を提供するための組成物の製造における使用、上記作用を提供するための上記キメラ分子、上記作用を提供するための有効量の上記キメラ分子を含む組成物、ならびに、上記キメラ分子の上記作用を提供するための使用にも関する。
　本発明の一側面は、ＫＣＮＫ３タンパク質および/またはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸分子（以下、ＫＣＮＫ３関連分子と総称することがある）の新規な用途に関する。ＫＣＮＫ３は、ＴＷＩＫ関連酸感受性カリウムチャンネル（ＴＡＳＫ－１）をコードし、細胞の膜電位の維持などに関与していることが知られており（Bayliss DA et al., Trends Pharmacol Sci 2008; 29: 566-575、Heitzmann D et al., EMBO J 2008; 27: 179-187、Bautista DM et al., Nat Neurosci 2008; 11: 772-779）、結腸直腸がん患者の手術後の生存期間の長さと関連していることが報告されているものの（Cavalieri D et al., Oncol Res. 2007;16(11):535-48）、アポトーシスとの関連性についてはこれまで知られていなかった。今回本発明者によってアポトーシスの誘導に関与することが初めて明らかとなった（実施例参照）。
　したがって、本発明の一態様は、（ｉ）ＫＣＮＫ３関連分子を含む、アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物、（ｉｉ）ＫＣＮＫ３関連分子の、前記アポトーシス誘導剤もしくはアポトーシス誘導用組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスを誘導するためのＫＣＮＫ３関連分子、および（ｉｖ）アポトーシスを誘導するための有効量のＫＣＮＫ３関連分子を含む組成物に関する。
　ＫＣＮＫ３の核酸配列およびアミノ酸配列は種々の生物種について知られており、例えば、ヒトＫＣＮＫ３の核酸配列およびアミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号NM_002246（配列番号２０１）およびNP_002237（配列番号２０２）などとして入手可能である。ＫＣＮＫ３タンパク質の機能的変異体は、（ｉ）ＫＣＮＫ３タンパク質のアミノ酸配列に対し１個または２個以上、例えば、１個または数個（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸の変異（例えば、保存的なアミノ酸置換）を有し、アポトーシス誘導能を有する変異体、（ｉｉ）ＫＣＮＫ３タンパク質の全長アミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、アポトーシス誘導能を有する変異体、（ｉｉｉ）ＫＣＮＫ３タンパク質の全長をコードする核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、アポトーシス誘導能を有する変異体などが含まれる。
　アポトーシスの誘導は、細胞に上記変異体を導入した後、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化、ＰＡＲＰタンパク質の切断などのアポトーシス特有の現象の検出、ｓｕｂ－Ｇ１にある細胞の割合の測定、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。
　ＫＣＮＫ３タンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸分子は、既知のＫＣＮＫ３遺伝子の核酸配列（例えば、ヒトＫＣＮＫ３については配列番号２０１）に依拠して決定することができる。本発明のアポトーシス誘導剤に含まれる核酸分子は、既知の核酸配列に基づく核酸分子の縮重物、すなわち、遺伝子コドンの縮重により上記核酸分子と核酸配列は異なるが、それと同じアミノ酸配列のタンパク質をコードするものを含む。
　ＫＣＮＫ３関連分子のアポトーシス誘導に関する種々の態様は、原則的に本発明のキメラ分子に関して上記したとおりである。
　本発明の別の態様は、（ｉ）ＫＣＮＫ３関連分子を含むアポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物、（ｉｉ）ＫＣＮＫ３関連分子の、アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための医薬組成物の製造のための使用、（ｉｉｉ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のためのＫＣＮＫ３関連分子、および（ｉｖ）アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置のための有効量のＫＣＮＫ３関連分子を含む医薬組成物に関する。ＫＣＮＫ３関連分子を含む、アポトーシス細胞増殖性疾患の処置のための医薬組成物。
　ＫＣＮＫ３関連分子の、アポトーシスの誘導が有用な疾患の処置に関する種々の態様は、原則的に本発明のキメラ分子に関して上記したとおりである。
　本発明の別の態様は、ＫＣＮＫ３関連分子またはこれを含むアポトーシス誘導剤を用いるアポトーシス誘導方法に関する。本発明のアポトーシス誘導方法は、本発明のＫＣＮＫ３関連分子またはこれを含むアポトーシス誘導剤を、細胞内に導入する工程を含んでもよい。具体的な導入方法については、キメラ分子を含む遺伝子発現誘導剤に関して上記したとおりである。本方法の一態様において、ＫＣＮＫ３関連分子またはこれを含むアポトーシス誘導剤は、アポトーシス誘導に有効な量で細胞に投与される。アポトーシス誘導に有効な量については、キメラ分子を含むアポトーシス誘導剤について上記したとおりである。本方法は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。本方法は、異常に増殖している細胞、例えばがん細胞などでアポトーシスを誘導することなどに用いることができる。
　本発明の別の態様は、ＫＣＮＫ３関連分子を用いた疾患の処置方法に関する。本発明の処置方法は、ＫＣＮＫ３関連分子、またはこれを含む剤もしくは医薬組成物を対象に投与する工程を含んでもよい。投与される対象は、典型的にはＫＣＮＫ３関連分子による処置を必要としている。かかる対象としては、限定されずに、例えば、アポトーシスの誘導がその処置に有用な疾患、例えば、細胞増殖性疾患などを患っているか、これらの疾患を有すると診断されたか、これらの疾患を発症するリスクが高い対象である。したがって、本発明の処置方法は、ＫＣＮＫ３関連分子による処置を必要としている対象を同定する工程をさらに含んでもよい。細胞増殖性疾患の具体例は、キメラ分子を含む医薬組成物に関して上記したとおりである。
　本発明の一側面は、ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質またはその機能的変異体であって、配列番号１５２のアミノ酸配列からなるキメラタンパク質を除くもの、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子、当該核酸分子を含む核酸構築物またはベクター、前記核酸分子、および／または、前記核酸構築物および／またはベクターを含む組成物に関する。キメラタンパク質およびその機能的変異体、およびこれらをコードする核酸分子、核酸構築物、ベクターおよび組成物の種々の態様は、配列番号１５２のアミノ酸配列からなるキメラタンパク質および配列番号１５１の核酸配列からなる核酸分子が含まれないことを除き、キメラ分子について上記したとおりである。
　本発明の一態様において、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質もしくはその機能的変異体が提供される。本発明の機能的変異体は、（ｉ）配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対し１個または２個以上、例えば、１個または数個（例えば、２、３、４または５個）のアミノ酸の変異（例えば、保存的アミノ酸置換）を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉ）配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有し、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体、（ｉｉｉ）配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５３、１５５、１５７および１５９からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ、前記キメラタンパク質の機能を有する変異体などが含まれる。
　今回本発明者により、異なる種類のｐ５３ファミリータンパク質の転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインを組み合わせることで、野生型ｐ５３ファミリータンパク質とは異なる遺伝子発現誘導プロファイルを有するキメラタンパク質を作製できることが明らかとなった。したがって、本発明はまた、（ｉ）２種以上のｐ５３ファミリータンパク質に由来する転写活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびオリゴマー化ドメインを組み合わせてなるキメラタンパク質を得る工程、（ｉｉ）得られたキメラタンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルを決定する工程、（ｉｉｉ）得られたキメラタンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルを、野生型ｐ５３ファミリータンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルと比較する工程、（ｉｖ）野生型ｐ５３ファミリータンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルとは異なる遺伝子発現誘導プロファイルを有するキメラタンパク質を選択する工程を含む、野生型ｐ５３ファミリータンパク質の遺伝子発現誘導プロファイルとは異なる遺伝子発現誘導プロファイルを有するキメラタンパク質の製造方法、スクリーニング方法または探索方法にも関する。
　本発明におけるｐ５３ファミリータンパク質としては、限定されずに、例えば、ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３を含む。したがって、本発明の一態様において、工程（ｉ）で得られるキメラタンパク質は、限定されずに、例えば、下表から選択されるドメインの組合わせを有する。下表において、例えばキメラタンパク質１は、ｐ５３に由来する転写活性化ドメイン、ｐ５３に由来するＤＮＡ結合ドメインおよびｐ６３に由来するオリゴマー化ドメインを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　遺伝子発現誘導プロファイルは、上記キメラタンパク質またはこれをコードする核酸分子を細胞に導入し、所定時間後に発現が誘導された遺伝子を、例えば、本願実施例に記載の手法で決定することによって得られる、発現が上昇した（誘導された）遺伝子および／または発現が低下した遺伝子および／または発現が変わらなかった遺伝子の組合せを意味する。発現の上昇、低下などは、上記キメラタンパク質またはこれをコードする核酸分子を導入しない対照細胞との比較などにより決定することができる。
　以下の例で本発明をより詳細に説明するが、これらの例は例証を目的とするものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
材料と方法（例１～例６）
細胞株および細胞培養
　使用した１１のヒトがん細胞株は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)またはJapanese Collection of Research Bioresources (Osaka, Japan)から購入した。細胞はすべて、各寄託者によって推奨される条件下で培養した。
ｐ５３およびＴＡｐ６３γのハイブリッド分子の構築
　全長のｐ５３またはＴＡｐ６３γを含むｐＣＭＶ－Ｔａｇ２プラスミドは、Sasaki et al., 2011およびSasaki et al., 2009に記載されている。ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドは、オーバーラップ伸長法（overlapping extension method）を用いて、ｐ５３およびＴＡｐ６３γの３つのドメインを入れ替えて作製した。Ｎ末端でのＦＬＡＧエピトープ標識法を可能とするために、これら遺伝子をインフレームで構築した。同一性を確認するために、ハイブリッド分子をコードするｃＤＮＡの配列決定を行った。
　複製欠損型組み換えアデノウイルスの産生、精製および感染の手順は、Sasaki et al., 2008に記載される。複製欠損型Ｅ１欠失Ａｄ５ベクターｐＪＭ１７（Microbix Biosystem）をバックボーンとして用い、対応する遺伝子をヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下で発現させた。プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）でのアデノウイルスの力価を、２９３Ｔ細胞感染後のプラーク形成アッセイによって決定した。感染多重度（ＭＯＩ）を、感染した細胞の総数に対する導入されたｐ．ｆ．ｕ．総数の比として定義した。実験の再現性を確認するために、２組の試料でアデノウイルスの力価測定を行った。細菌のＬａｃＺ遺伝子（Ａｄ－ＬａｃＺ）またはＧＦＰ遺伝子（Ａｄ－ＧＦＰ）を含むコントロールについては、Sasaki et al., 2011、Sasaki et al., 2009およびSasaki et al., 2008に記載のものを使用した。
アポトーシスの検出
　細胞を５×１０５細胞／フラスコの密度でＴ２５フラスコに播種した。２４時間後、１％ＦＣＳを含む培地１ｍＬ中で精製したウイルスとともに細胞をインキュベートし、１０分毎に軽く攪拌した。フローサイトメトリー解析のために、細胞をトリプシン処理によって回収し、感染後に様々な時間で遠心分離することによりペレット化した。ペレット化した細胞を９０％の冷エタノールで固定し、ＲＮａｓｅ　Ａ（５００ユニット／ｍＬ）で処理し、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ）で染色した。試料は、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton-Dickinson）で分析した。実験を少なくとも３回繰り返し、各試料につき５０，０００例を分析した。データは、ＭｏｄＦＩＴプログラム（Becton-Dickinson）を用いて分析した。
　ＴＵＮＥＬアッセイのために、細胞を４ウェルチャンバースライド（Nalge Nunc）に、５×１０４細胞／ウェルで播種した。上述のようにウイルスを感染し、２４時間後にパラホルムアルデヒドで３０分間固定後、製造業者の指示書に従って、DeadEnd Fluorometric TUNEL system (Promega)を用いてＴＵＮＥＬ反応を行った。蛍光顕微鏡で観察するために、核をＤＡＰＩ（Sigma）で対比染色し、グリセロール－ゼラチンにマウントした。
　カスパーゼ－３アッセイキット（BioVision）を、製造業者のプロトコルに従って用い、カスパーゼ活性を比色法により測定した。これらキットは、ｐ－ニトロアニリドで標識した合成テトラペプチドを用いる。簡潔に述べると、キットに含まれる溶解緩衝液中で細胞を溶解し、上清を収集し、ジチオスレイトールおよび基質を含む反応緩衝液にて３７℃でインキュベートし、マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定することによりカスパーゼ活性を決定した。
イムノブロット解析
　イムノブロット解析を、Sasaki et al., 2011に記載のように行った。本実施例において、免疫ブロット法に用いた主要な抗体は以下のとおりである。
マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Sigma）、マウス抗ヒトｐ２１ｍＡｂ（ＥＡ１０、Oncogene Research）、マウス抗ヒトＭＤＭ２ｍＡｂ（ＳＭＰ１４、Santa Cruz Biotechnology）、マウス抗ヒトＰＡＲＰｍＡｂ（BD Pharmingen）、マウス抗ヒトカスパーゼ－９ｍＡｂ（BD Transduction Laboratory）、マウス抗ヒトカスパーゼ－３ｍＡｂ（BD Transduction Laboratory）、ウサギ抗ヒトｐ５３ＡＩＰ１ポリクローナルＡｂ（AnaSpec）、およびマウス抗ヒトアクチンｍＡｂ（Chemicon）
ノーザンブロットおよびリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ
　ノーザンブロット分析のために、２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで、全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に移した。ＲＮＡがインタクトであり、同量でロードされて適切に移されたことを確認するため、エチジウムブロマイドで可視化した。ハイブリダイゼーションを、以前に記載した方法で行った(Sasaki et al., 2009)。ｐ５３ＡＩＰ１（ヌクレオチド（ｎｔ）３４５～５５４）およびｐ２１（ｎｔ１１～４２９）のためのｃＤＮＡプローブを、ＲＴ－ＰＣＲにより増幅し、これらの同一性を確認するために配列決定を行った。
　リアルタイムＰＣＲ用に、全ＲＮＡをSuperScript III（Invitrogen）を用いてランダムプライマーで逆転写した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、製造業者のプロトコルに従って、TaqMan Gene Expressionアッセイおよび7900HT Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて行った。
相対的な遺伝子発現レベルはΔΔＣｔ法を用いて定量し、一定に発現するハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対する標的遺伝子の発現比を計算した。用いたプライマー／プローブのセットは次とおりである。
　ｐ５３ＡＩＰ１（Ｈｓ００２２３１４１＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）
　値をそれぞれのコントロールに対して正規化し、３つの独立した実験の平均値±標準誤差として示した。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびルシフェラーゼアッセイ
　Sasaki et al., 2011およびSasaki et al., 2009に記載のとおり、ＣｈＩＰをChIP Assay Kit(Upstate Biotechnology)を用いて行った。沈殿したｐ５３ＡＩＰ１プロモーターＤＮＡの量を、ｐ５３のコンセンサス結合部位にまたがるオリゴヌクレオチド（センス鎖：５’－ＴＧＧＧＴＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＣＡＣＣ－３’（配列番号１）、アンチセンス鎖：５’－ＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧ－３’（配列番号２））を用いてＰＣＲにより決定した。ＭＤＭ２プロモーターに特異的なオリゴヌクレオチド（センス鎖：５’－ＧＴＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴ－３’（配列番号３）、アンチセンス鎖：５’－ＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴ－３’（配列番号４））をポジティブコントロールとして用いた。いずれの場合においても、３０サイクルで増幅を行った。
ルシフェラーゼアッセイ用に、ｐ５３のヒトｐ５３ＡＩＰ１遺伝子におけるコンセンサス結合配列（５’－ＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧ－３’；配列番号５）およびこの配列の変異型（５’－ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＧ－３’；配列番号６）を合成し、ｐＧＬ３－プロモーターベクター(Promega)における最小プロモーターの上流に挿入した。得られたコンストラクトを、それぞれｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ＰＲＯおよびｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｐｒｏ－ｍｕｔと命名した。また、この結合部位を含む１００ｂｐの断片をｐＧＬ３－ベーシックベクターにクローニングしてコンストラクトをそれぞれ作製し、ｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｂａおよびｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｂａ－ｍｕｔと命名した。
　ヒトｐ２１遺伝子内のｐ５３ファミリーメンバーのコンセンサス結合配列（ｐＧＬ３－Ｐ２１、５’－ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧ－３’(el-Deiry et al., 1993；配列番号７）およびＪＡＧ１遺伝子内のｐ５３ファミリーメンバーのコンセンサス結合配列（ｐＧＬ３－ＪＡＧ１、５’－ＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＴ－３’(Sasaki et al., 2002；配列番号８））ならびにそれらの変異体もまた合成し、ｐＧＬ３－プロモーターベクター(Promega)の最小プロモーターの上流に挿入した。ルシフェラーゼアッセイは、Sasaki et al., 2011およびSasaki et al., 2009に記載されるように行った。
動物モデル
　すべての動物を、病原体フリーの条件下で維持し、札幌医科大学の動物実験委員会(Animal Care and Use Committee of Sapporo Medical University)のガイドラインに従って処理した。株化した腫瘍における治療効果を評価するため、メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに２×１０６個のＳＷ４８０細胞を右側腹部に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したときに、５×１０９ｐ．ｆ．ｕ（１００μＰＢＳ中）の表示したアデノウイルスで、マウスを１日１回、３または４日連続で腫瘍内投与した。各治療群は８匹のマウスを含む。
　それらの６匹のマウスを腫瘍形成のモニタリングに使用した。他の２匹のマウスは、ＴＵＮＥＬ解析のために処置５日後に屠殺した。腫瘍体積を、式：Ｖ（ｍｍ３）＝ａ×ｂ２／２を用いて算出し、ここでａは長径(largest dimension)あり、ｂは短径(perpendicular diameter)である。２つの群の差は、２５日目にStudentｔ検定によって決定した。In vivoにおけるＴＵＮＥＬ解析のために、パラフィン包埋組織切片は、キシレン中で５分間脱パラフィンし、勾配エタノールで再水和し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。プロテイナーゼＫで組織を透過処理した後、４％パラホルムアルデヒドで再固定した。ＴＵＮＥＬ反応は、DeadEnd Fluorometric TUNEL System (Promega)を用いて、製造業者の指示書に従って行った。組織をＤＡＰＩで対比染色した。それぞれの腫瘍について、３つの異なるスライドを調べた。
図面の説明
　図１は、Ａｄ－ｐ５３遺伝子ファミリーのアポトーシス効果の比較を示す。
　（上段）１１種のｐ５３野生型（ｗｔ）および４種のｐ５３欠失（ｄｅｌ）のがん細胞株を、表示のＭＯＩのアデノウイルスで４８時間感染させ、各集団におけるｓｕｂ－Ｇ１の核の割合を定量化するため、細胞内ＤＮＡ含量をヒストグラム解析で決定した。実験を３回繰り返し、平均の百分率で表した。
　（下段）ｐ５３が野生型のＨＣＴ１１６細胞およびＮＵＧＣ４細胞を、４８時間アデノウイルスで感染し、続いてアポトーシスをＴＵＮＥＬ解析で評価した。ＴＵＮＥＬ解析のため、４ウェルチャンバースライドに細胞を５×１０４細胞／ウェルでプレートした(Nalge Nunc International, Naperville, IL)。２４時間後、細胞は上述のとおりに処理した。ＴＵＮＥＬ反応は、製造業者の指示書に従い、DeadEnd Fluorometric TUNEL system(Promega)を用いて行った。核は、ＤＡＰＩ(Sigma)で対比染色し、蛍光顕微鏡で観察するためにグリセロール－ゼラチンにマウントした。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の平均百分率を示す。
　図２は、Ａｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの併用によって増加したアポトーシスの誘導を示す。
　（Ａ）アポトーシス誘導におけるＡｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの相乗的効果を調べた。ＭＫＮ４５細胞およびＳＷ４８０細胞を、別々に２００ＭＯＩのＡｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γで、またはそれぞれ表示したＭＯＩの２つのベクターを併用して感染させた。感染後４８時間で細胞を回収し、フローサイトメトリーによって分析した。アポトーシス細胞はｓｕｂ－Ｇ１画分（％）を形成する。
　（Ｂ）ＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞，およびＳＷ４８０ヒト大腸癌細胞を、表示したＭＯＩのＡｄ－ｐ５３および／またはＡｄ－ｐ６３γで感染させた。感染の４８時間後に、アポトーシスをＰＡＲＰ切断によって分析した。
　（Ｃ）ＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞は、表示したＭＯＩのＡｄ－ｐ５３および／またはＡｄ－ｐ６３γで感染させた。感染後４８時間で、アポトーシスをＴＵＮＥＬ解析によって分析した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の平均百分率を示す。
　（Ｄ）ヒトがんの皮下異種移植片におけるＡｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの併用効果を実証した。ＭＫＮ４５細胞（部位あたり２×１０６個）をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、マウスは５×１０９ｐ．ｆ．ｕ．（ＰＢＳ１００μＬ中）の表示したアデノウイルスで、１日目、２日目、３日目および４日目に１回ずつ、４回直接の腫瘍内注射を受けた。マウスを４つの処置群に無作為に分け、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γでの処置、またはＡｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γでの連続併用処置（１日目および３日目にＡｄ－ｐ５３、および２日目および４日目にＡｄ－ｐ６３γ）をそれぞれ施した。６匹のマウスが各処置群に含まれる。腫瘍形成は３週間まで毎週評価した。
　図３は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッド分子の模式図を示す。野生型ｐ５３タンパク質（白）および野生型ＴＡｐ６３γタンパク質（黒）をＮ末端で並べた。矢印は接合位置を示す。ＴＡＤ（トランス活性化ドメイン）、ＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）およびＯＬＤ（オリゴマー化ドメイン）を表示し、各転写物のドメイン構造を示す。
　ｐ６３－５３Ｏ：ＴＡｐ６３γのＭｅｔ１からＬｙｓ３５２までの残基およびｐ５３のＬｙｓ３１９からＡｓｐ３９３までの残基、
　ｐ６３－５３Ｄ：ＴＡｐ６３γのＭｅｔ１からＳｅｒ１４１までの残基、ｐ５３のＰｈｅ１１３からＡｒｇ２８９までの残基およびＴＡｐ６３γのＬｙｓ３２１からＰｒｏ４４８までの残基
　ｐ５３－６３Ｔ：ＴＡｐ６３γのＭｅｔ１からＳｅｒ１４１までの残基およびｐ５３のＰｈｅ１１３からＡｓｐ３９３までの残基
　ｐ５３－６３Ｏ：ｐ５３のＭｅｔ１からＰｒｏ３１８までの残基およびＴＡｐ６３γのＬｙｓ３５３からＰｒｏ４４８までの残基
　ｐ５３－６３Ｄ：ｐ５３のＭｅｔ１からＧｌｙ１１２までの残基、ＴＡｐ６３γのＰｈｅ１４２からＡｒｇ３２０までの残基およびｐ５３のＬｙｓ２９０からＡｓｐ３９３までの残基
　ｐ６３－５３Ｔ：ｐ５３のＭｅｔ１からＧｌｙ１１２までの残基およびＴＡｐ６３γのＰｈｅ１４２からＰｒｏ４４８までの残基
　水平方向のバーは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を表す。細胞中のタンパク質の核への移行は、ＰＳＯＲＴ ＩＩソフトウェア解析によるＮＬＳスコアとして予測した（右）。
　図４は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドの細胞内局在を示す。ＭＫＮ４５細胞を、ｐ５３、ＴＡｐ６３γ、ｐ６３－５３Ｏ、ｐ６３－５３Ｄまたはｐ５３－６３Ｄを発現するＦＬＡＧタグ化ｐＣＭＶ－Ｔａｇ２ベクターで、一過性にトランスフェクションした。２４時間後、ＦＬＡＧ Ｍ２抗体およびＡｌｅｘａ４８８標識二次抗体（緑）を用いて免疫蛍光標識を行った。核はＤＡＰＩ染色（青）で検出した。
　図５は、ＰＡＲＰタンパク質の切断およびカスパーゼ－３の活性を示す。
　（Ａ）ＰＡＲＰタンパク質の切断は免疫ブロットで検出した。ＳＷ４８０細胞、Ｈ１２９９細胞およびＭＫＮ４５細胞を１００ＭＯＩ（ＳＷ４８０細胞およびＭＫＮ４５）または２５ＭＯＩ（Ｈ１２９９）のアデノウイルスで４８時間感染させ、これら細胞からの２０μｇの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ－３、カスパーゼ－９およびβ－アクチンを検出する免疫ブロットを示す。
　（Ｂ）カスパーゼ－３アッセイキットを用い、製造業者のプロトコルに従ってカスパーゼ－３活性を測定した。ＭＫＮ４５細胞をアデノウイルスで感染させて回収し、感染の４８時間後に溶解した。カスパーゼ－３のペプチダーゼ活性は、ペプチド基質ＤＥＶＤ－ｐＮＡの切断によって測定した。
　（Ｃ）ＭＫＮ４５細胞は、表示したＭＯＩのアデノウイルスで４８時間感染させ、２０μｇの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ－３およびβ－アクチンを検出する免疫ブロットを示す。
　（Ｄ）ＭＫＮ４５細胞は、表示したＭＯＩのアデノウイルスで４８時間感染させた。カスパーゼ－３活性は、感染後４８時間で測定した。
　図６は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性発現後のアポトーシス細胞のフローサイトメトリー解析を示す。細胞を表示したＭＯＩのアデノウイルスで感染させた。感染の４８時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーにより分析した。３つの独立した実験を行い、１つの実験の代表的なデータを示した。ｓｕｂ－Ｇ１細胞の百分率を下段に示す。
　図７は、皮下に移植したヒトがんの異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示す。
（Ａ）ＳＷ４８０細胞（部位当たり２×１０６個）をヌードマウスへ皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、マウスに３日連続で、組み換えアデノウイルスを皮下注射した。各群には６匹のマウスが含まれる。データポイントは、平均の腫瘍サイズを示す。
　（Ｂ）ＳＷ４８０細胞異種移植片におけるＴＵＮＥＬアッセイを、（Ａ）に記載の処置後５日目に行った。アポトーシスの増加が、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏで処置した異種移植片で検出された（緑色の細胞）。核のＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。
　図８は、ＭＫＮ４５異種移植片におけるｐ５３ファミリーメンバーのアデノウイルス媒介性発現の治療効果を示す。
　（ａ）ＭＫＮ４５細胞（部位あたり２×１０６個）をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、マウスに３日間連続で組み換えアデノウイルスを腫瘍内注射した。６匹のマウスが各群に含まれる。データポイントは、平均腫瘍サイズを示す。
　（ｂ）ＭＫＮ４５異種移植片におけるＴＵＮＥＬアッセイは、（ａ）に記載の処置の５日後に行った。各処置条件からの代表的な画像を示す。核のＤＮＡをＤＡＰＩで染色した。
　図９は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性トランスフェクション後のヒトがん細胞株におけるｐ５３標的およびアポトーシス関連タンパク質の発現を示す。Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈ１２９９細胞およびＳＷ４８０細胞は、２５ＭＯＩのアデノウイルスで２４時間感染させ、１０μｇの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ｐ２１、ＭＤＭ２、サバイビン、サイクリンＢ１、Ｎｏｘａ、Ｂａｘ、ＰＵＭＡ、ＪＡＧ１、ｐ５５ＣＤＣおよびアクチンのレベルを、免疫ブロットによって測定した。
　使用した一次抗体は、以下のとおりである。マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）(Sigma)、マウス抗ヒトｐ２１ｍＡｂ(EA10, Oncogene Research)、マウス抗ヒトＭＤＭ２ｍＡｂ(SMP14, Santa Cruz Biotechnology)、ラビット抗ヒトサバイビンポリクローナル抗体(S8191, Sigma)、マウス抗ヒトサイクリンＢ１ ｍＡｂ(GNS1, Santa Cruz Biotechnology)、ラビット抗ヒトＢＡＸポリクローナルＡｂ(P19, Santa Cruz Biotechnology)、マウス抗ヒトＮｏｘａ ｍＡｂ(114C307, Oncogene Research)、ラビット抗ヒトＰＵＭＡポリクローナルＡｂ(BD Transduction Laboratory)、ラビット抗ヒトＪＡＧ１ポリクローナル抗体(H-144, Santa Cruz Biotechnology)、マウス抗ヒトｐ５５ＣＤＣ ｍＡｂ(E-7, Santa Cruz Biotechnology)およびマウス抗ヒトアクチンｍＡｂ(Chemicon)
　図１０は、ｐ６３－５３Ｏハイブリッドによるｐ５３ＡＩＰ１の効率的なトランス活性化を示す。
　（Ａ）４種のヒトがん細胞株を、５０または１００ＭＯＩのアデノウイルスで感染させ、細胞を感染の２４時間後に回収した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを行った。全ＲＮＡ（１０μｇ）を各レーンにロードし、同じフィルターをヒトｐ５３ＡＩＰ１およびｐ２１のｃＤＮＡで再ハイブリダイズした。２８ＳリボソームＲＮＡ（２８Ｓ）のエチジウムブロマイド染色を下段のパネルに示す。等量のＲＮＡが各レーンにロードされたことが確認される。
　（Ｂ）ｐ６３－５３Ｏは、in vivoにおいて、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のｐ５３－ＲＥと効率的に相互作用する。「材料と方法」に記載のようにＣｈＩＰアッセイを行った。
　（Ｃ）ｐ６３－５３Ｏは、ｐ５３－ＲＥを含むｐ５３ＡＩＰ１プロモーターを効率的に誘導する。ＳＷ４８０細胞に、ｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｐｒｏ、ｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｂａ、ｐＧＬ３－ｐ２１またはｐＧＬ３－ＪＡＧ１と、ｐＣＭＶ－Ｔａｇ２コントロールベクター、ｐ５３、ＴＡｐ７３β、ＴＡｐ６３γ、ｐ６３－５３Ｏまたはｐ６３－５３Ｄとを同時導入した。ルシフェラーゼ活性は、「材料と方法」に記載のように、感染の２４時間後に定量した。エラーバーは、３つの独立した実験から計算された２つの標準偏差を表す。
　図１１は、ｐ６３－５３Ｏによるアポトーシス誘導のｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡによる拮抗を示す。
　（Ａ）ｐ５３ＡＩＰ１ ｍＲＮＡの発現は、ｓｉＲＮＡによって抑制された。ＳＷ４８０細胞を、３日連続で２４時間毎にコントロールまたはｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡで感染させた。最後のｓｉＲＮＡトランスフェクションの１８時間後に、ｐ５３ＡＩＰ１ ｍＲＮＡの抑制をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって測定した。
　（Ｂ）上述のとおり、ＳＷ４８０細胞を、コントロールまたはｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡで感染させた。最後のｓｉＲＮＡトランスフェクションの８時間前に、細胞を１００ＭＯＩのＡｄ－ＧＦＰまたはＡｄ－ｐ６３－５３Ｏで感染させた。ｐ５３ＡＩＰ１タンパク質の量を、免疫ブロットによって測定した。アポトーシスは、カスパーゼ－３の切断（上段パネル）およびカスパーゼ－３活性（下段パネル）によって調べた。
例１：ｐ５３ファミリーのアポトーシス促進能
　ｐ５３の機能を回復させる遺伝子治療は、ヒトがん治療用に臨床的に試験されている。しかしながら、いくつかのがんはｐ５３に対して耐性である。大腸癌細胞株において、ＴＡｐ６３γおよびＴＡｐ７３βは、ｐ６３およびｐ７３のすべてのアイソフォームの中で最も強いアポトーシス促進能を有する。アデノウイルスベクターを用いて、ｐ５３、ＴＡｐ６３γおよびＴＡｐ７３βを５６のがん細胞株へ導入し、フローサイトメトリーを用いて細胞死およびアポトーシスに対するそれらの効果を比較した。
　ｓｕｂ－Ｇ１画分（％）は、アポトーシス細胞を含む。いくつかの細胞株では、ｐ５３、ｐ７３βまたはｐ６３γに応じてアポトーシスが生じたが、約２５％の細胞株は、ｐ５３ファミリーメンバーによって誘導されるアポトーシスに対して、少なくとも幾分かの耐性を示した。興味深いことに、ＴＡｐ６３のアポトーシスの効果は、内在性の野生型ｐ５３対立遺伝子を有するがん細胞株２２種のうち１５種（６８．２％）において、野生型ｐ５３のものよりも大きかった（表２および図１）。
　表２は、Ａｄ－ｐ５３ファミリー遺伝子のアポトーシス効果の比較を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　アデノウイルス媒介性導入の４８時間後におけるｓｕｂ－Ｇ１細胞の百分率を示す。実験は３回繰り返され、平均百分率が示される。ｗｔ＝ｐ５３野生型；ｍｕｔ＝ｐ５３変異型；ｄｅｌ＝ｐ５３欠失
　ｐ５３、ｐ７３βまたはｐ６３γを単独で導入してもアポトーシスを誘導しなかったＭＫＮ４５胃癌細胞およびＳＷ４８０大腸癌細胞を、２００ＭＯＩのＡｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γで、または２つの組み換えアデノウイルスをそれぞれ表示したＭＯＩで併用して感染させた。感染の４８時間後に細胞を回収し、アポトーシスをフローサイトメトリー、カスパーゼ活性化およびＴＵＮＥＬアッセイによって分析した。ｐ５３およびＴＡｐ６３γの遺伝子発現において、アポトーシス促進性の相乗作用が観察された（図２Ａ～Ｃ）。
　ヒトがんの異種移植片増殖に対するＡｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの併用処置の効果も調べた。ＭＫＮ４５細胞をヌードマウスに皮下注射して腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、アデノウイルスの腫瘍内直接注射を１日当たり４回、１日目、２日目、３日目および４日目に行った。マウスを４つの処置群に無作為に分け、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γでの処置、またはＡｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γでの連続併用処置（１日目および３日目にＡｄ－ｐ５３、および２日目および４日目にＡｄ－ｐ６３γ）をそれぞれ施した。
　ＭＫＮ４５異種移植片の増殖は、Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γ単独の処置と比較して、併用処置によって有意に抑制された（図２Ｄ）。したがって、Ａｄ－ｐ５３およびＡｄ－ｐ６３γの同時処置により、in vitroおよびin vivoにおいて、抗腫瘍性の強い相乗効果が生じることが示された。
例２：ｐ５３－ｐ６３ハイブリッド遺伝子の構築
　ｐ５３ファミリーの腫瘍抑制活性を増強させるために、ｐ５３およびｐ６３の機能の制御差を利用するハイブリット遺伝子のセットを作製した。６種のハイブリッドタンパク質は、３つの機能的ドメインからなり、各ドメインはそれぞれｐ５３またはＴＡｐ６３γに由来する。例えば、「ｐ５３－６３Ｏ」は、ｐ５３のＮ末端ドメインおよび中央ドメインを含むハイブリッドタンパク質であって、インフレームでｐ６３のＣ末端ドメインを融合させたものであり、「ｐ５３－６３Ｄ」は、ｐ６３の中央ドメインを含むハイブリッドｐ５３タンパク質である。
　６種のハイブリッドタンパク質の組成を図３に示す。６種のハイブリッドの中で、ｐ６３－５３Ｄは、典型的なＮＬＳモチーフを欠失しているため、主に細胞質へ局在する。他の５種のハイブリッドは、ｐ５３およびＴＡｐ６３γを模倣し、ＮＬＳの存在と一致して主に核に局在する（図４）。３種のハイブリッド分子（ｐ５３－６３Ｏ、ｐ６３－５３Ｄおよびｐ６３－５３Ｔ）は、ｐ６３のＣ末端ドメインを含むが、内在性の変異型または野生型のｐ５３とはオリゴマー形成することができない。ｐ６３のＮ末端ドメインを含むｐ５３－６３Ｔおよびｐ６３－５３Ｄは、ｐ５３の中央ＤＮＡ結合ドメインを含むとしても、ＭＤＭ２に結合することや、プロテアソーム分解が起こらないことが予測される。
　最後に、異なるＴＡｐ６３アイソフォームの独特のＣ末端（α、βおよびγ）が、遺伝子発現のトランス活性化能力を調整すると考えられることから、ｐ５３－６３Ｄ、ｐ５３－６３Ｔおよびｐ６３－５３Ｏは、ｐ６３の転写活性を変化させると考えられた。
例３：ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドのアデノウイルス媒介性発現後のアポトーシスプロファイル
　ｐ５３およびＴＡｐ６３γとの比較におけるハイブリッドの抗がん活性を評価するために、ＦＬＡＧタグ化ヒトｐ５３（Ａｄ-ｐ５３）、ＴＡｐ６３γ（Ａｄ－ｐ６３γ）またはｐ５３－ｐ６３ハイブリッド（Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏ、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｄ，Ａｄ－ｐ５３－６３Ｔ、Ａｄ－ｐ５３－６３Ｏ、Ａｄ－ｐ５３－６３ＤおよびＡｄ－ｐ６３－５３Ｔ）を発現する組み換えアデノウイルスベクターを作製した。
　アデノウイルス媒介遺伝子送達の相対的効率は、２５～２００ＭＯＩでのＡｄ－ＧＦＰ感染後のＧＦＰ陽性細胞の割合として定量化した。ＧＦＰの発現によって決定された遺伝子導入効率によれば、各細胞株は適切なＭＯＩでアデノウイルスに感染した。図５Ａに示されるように、ＭＫＮ４５（胃癌）およびＨ１２９９（肺癌）などのいくつかのがん細胞株において、ハイブリッドが同程度で発現しているかどうかを測定した。その後、ヒトがん細胞株のパネルにおいて、アポトーシスの誘導をフローサイトメトリーによって分析した。細胞をアデノウイルスで４８時間感染させた後、細胞内ＤＮＡ含量を分析した。これらデータは、集団あたり合計５×１０４個の細胞において、ｓｕｂ－Ｇ１の核（アポトーシス細胞）の割合を示すヒストグラムにまとめられる。
　Ａｄ－ＧＦＰで感染した細胞株においては、有意なアポトーシス画分は観察されなかった。重要なこととして、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏは、試験した４種の細胞株すべての中で、Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γよりも効率的にアポトーシスを誘導した（図６）。１４の癌細胞株において、フローサイトメトリーによってアポトーシスの誘導を分析した。Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏは、試験した１４の細胞株のすべてにおいて、ｐ５３野生型、変異型、欠失のいずれの状態にも関わらずアポトーシスを誘導した（表３）。
　表３は、ｐ５３－ｐ６３ハイブリッド間におけるアポトーシス効果の比較を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　アデノウイルス媒介性導入の４８時間後におけるｓｕｂ－Ｇ１細胞の百分率を示す。実験は３回繰り返され、平均百分率が示される。ｗｔ＝ｐ５３野生型；ｍｕｔ＝ｐ５３変異型；ｄｅｌ＝ｐ５３欠失
　ＤＮＡ修復に関与する酵素ＰＡＲＰは、カスパーゼ－３によって切断され、切断されたＰＡＲＰ（８５ｋＤａ、未切断タンパク質で１１６ｋＤａ）の存在はアポトーシスの特徴とみなされる。ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドによるアポトーシスの誘導は、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ－３／９の切断（図５Ａ）ならびにカスパーゼ－３活性（図５Ｂ）によって確認された。これら観察は、フローサイトメトリーの結果と一致した。
　また、ＭＫＮ４５細胞を４８時間、５０ＭＯＩからの様々な希釈倍率でアデノウイルスに感染させ、ＰＡＲＰ切断およびカスパーセ－３活性について分析した。Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏを５０ＭＯＩで感染させた後のＰＡＲＰ切断およびカスパーゼ－３活性のレベルは、Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γを２００ＭＯＩで感染させた後のものと同様であった（図５Ｃ、Ｄ）。
例４：皮下に移植したヒト異種移植片増殖に対するｐ５３－ｐ６３ハイブリッドアデノウイルスの腫瘍内注射の治療効果
　アデノウイルスベクターのin vivo投与の効果を調べた。ヌードマウスにおけるヒトＳＷ４８０細胞の異種移植片を樹立した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ｐ５３、Ａｄ－ｐ６３γまたはＡｄ－ｐ６３－５３Ｏを５×１０９ｐ．ｆ．ｕで含む１００μＬの腫瘍内注射を各マウスに３回与え、腫瘍サイズをモニタリングした。
　Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γでの処置と比較して、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏでの処置によって、ＳＷ４８０異種移植片増殖が有意に抑制された（ｐ＜０．００１：図７Ａ）。２５日目のアデノウイルス処置マウスの平均腫瘍体積は、Ａｄ－ｐ５３については３５０ｍｍ３、Ａｄ－ｐ６３γについては３３１ｍｍ３、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏについては１０２ｍｍ３、Ａｄ－ＬａｃＺについては８６９ｍｍ３であった。特に、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏ処置は、腫瘍を有するマウス３３％（２／６）において、完全な腫瘍退縮を誘導した。このin vivoでの結果は、in vitroで観察された特異性と相関した。
　加えて、各処置群由来の動物２匹を処置５日目で安楽死させ、それらの腫瘍をin situ ＴＵＮＥＬ分析用に回収した。Ａｄ－ｐ５３またはＡｄ－ｐ６３γで処置した場合と比較して、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏで処置したＳＷ４８０異種移植片において、アポトーシスの顕著な増加が観察された（図７Ｂ）。ｐ５３－ｐ６３ハイブリッドと同様の治療効果が、ＭＫＮ４５異種移植片において観察された（Ｐ＜０．００１、図８）
例５：ハイブリッドｐ６３－５３Ｏによるｐ５３ＡＩＰ１の効率的な転写誘導
　ハイブリッドｐ６３－５３Ｏは、ＴＡｐ６３のＭｅｔ１からＬｙｓ３５２の残基およびｐ５３のＬｙｓ３１９からＡｓｐ３９３を含む。本発明のハイブリッドは、ＴＡｐ６３のＴＡＤおよびＤＢＤならびにｐ５３のＯＬＤを含む。ｐ６３－５３Ｏハイブリッドのアポトーシス促進活性の上昇が、全般的な転写活性化によるものかどうかを決定するため、特定のがん細胞において、ｐ２１、ＭＤＭ２、サバイビン、Ｎｏｘａ、ＢａｘおよびＰｕｍａを含むｐ５３標的遺伝子の誘導を免疫ブロットによって調べた（図９）。ｐ６３－５３Ｏハイブリッドは、試験した３種の細胞株すべてにおいて、ｐ５３標的遺伝子のサブセットを誘導したが、誘導の度合いはｐ５３またはＴＡｐ６３γのものほど顕著ではなかった。これら結果は、本発明のハイブリッドは、単に一般的なｐ５３標的遺伝子の転写活性の増加によって作用するものではないことを示唆する。
　ハイブリッドｐ６３－５３Ｏによって特異的に制御されるアポトーシス促進性の標的遺伝子を同定するため、Affymetrix Genechip解析が行われ、Ａｄ－ｐ５３、Ａｄ－ｐ６３γまたはＡｄ－ｐ６３－５３ＯでトランスフェクションしたＳａｏｓ－２ヒト骨肉腫細胞の発現パターンを比較した。データはＧＥＯデータベース（ＧＳＥ３５５１２）で入手可能である。ｐ５３媒介の細胞死応答の重要な標的であるｐ５３ＡＩＰ１が、候補遺伝子として同定された。ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子は、ｐ６３－５３Ｏでトランスフェクションした細胞において、ｐ５３またはＴＡｐ６３γでトランスフェクションした細胞と比較して、再現性よく、少なくとも４倍の発現上昇があった。
　ｐ５３ＡＩＰ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて、Ｓａｏｓ－２、Ｈ１２９９、ＤＬＤ１およびＳＷ４８０のヒトがん細胞株のノーザンブロット解析を行った。図１０Ａに示されるように、Ａｄ－ｐ６３－５３Ｏに感染後、試験した細胞株すべてにおいて、ｐ５３ＡＩＰ１の最も強い誘導が観察された。
　次に、in vivoにおいて、ｐ６３－５３Ｏハイブリッドタンパク質が、Oda et al., 2000によって特徴付けられるｐ５３応答エレメント（ｐ５３－ＲＥ）を含むヒトｐ５３ＡＩＰ１プロモーター領域に効率的に結合することができるかを決定するため、クロマチン免疫染色法（ＣｈＩＰ）を使用した。ＣｈＩＰアッセイでは、特定の抗体を用い、結合するゲノムＤＮＡとともにＤＮＡ結合タンパク質を免疫沈降させる。Ａｄ－ｐ５３、Ａｄ－ｐ６３γ、Ａｄ－ｐ６３－５３ＯまたはＡｄ－ｐ６３－５３Ｄで感染したＳＷ４８０細胞を分析した。Ａｄ－ｐ５３、Ａｄ－ｐ６３γ、Ａｄ－ｐ６３－５３ＯまたはＡｄ－ｐ６３－５３Ｄで感染したＳＷ４８０細胞のホルムアルデヒド架橋抽出物から、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＤＮＡ－タンパク質複合体を免疫沈降した。
　免疫沈降複合体内の候補配列の存在量をＰＣＲによって定量化した。図１０Ｂに示されるように、ｐ６３－５３Ｏは、ｐ５３またはＴＡｐ６３よりも効率的にｐ５３ＡＩＰ１プロモーターにリクルートされていた（上段、レーン１２）。ＣｈＩＰアッセイのためのポジティブコントロールとして、ＭＤＭ２プロモーターを分析した。予想通りに、ｐ５３、ＴＡｐ６３γおよびｐ６３－５３Ｏは、ＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３結合部位と共に免疫沈降した（図１０Ｂ、下段、レーン８、１０および１２）。これら結果は、ＳＷ４８０細胞において、ｐ６３－５３Ｏハイブリッドタンパク質が、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターに効率的に結合することを示す。
　ｐ６３－５３Ｏの転写増強活性をさらに評価するため、レポーターアッセイを行った。ｐＧＬ３プロモーターベクター（ｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｐｒｏ）中のＳＶ４０最小プロモーターの上流に、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子内のｐ５３－ＲＥを含むゲノム断片をクローニングして、異種レポーターベクターを構築した。また、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子のｐ５３－ＲＥに対応する１００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＧＬ３ベーシックベクター（ｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｂａ）中にクローニングした。
　ｐ６３－５３Ｏは、両方のｐ５３ＡＩＰ１ルシフェラーゼレポーターを活性化したが、ｐ５３およびＴＡｐ６３γは、ｐ５３ＡＩＰ１の転写をより低い効率で活性化した（図１０Ｃ）。さらに、ｐ５３ＡＩＰ１のｐ５３－ＲＥにおける点変異（ｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｐｒｏ－ｍｕｔおよびｐＧＬ３－ｐ５３ＡＩＰ１－ｂａ－ｍｕｔ）は、ｐ６３－５３Ｏによるトランス活性化を消滅させた。
　ｐ２１のｐ５３－ＲＥ（ｐＧＬ３－ｐ２１）または既知のＴＡｐ６３標的であるＪＡＧ１（ｐＧＬ３－ＪＡＧ１）を、ｐＧＬ３プロモーターベクター中へクローニングしてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ｐＧＬ３－ｐ２１のルシフェラーゼ活性は、ｐ５３で同時導入した細胞において、ｐ６３－５３Ｏで同時導入した場合よりも高かった。対照的に、ＴＡｐ６３γおよびＴＡｐ７３βは、ＪＡＧ１ルシフェラーゼレポーターを効率的に活性化した（図１０Ｃ）。これら結果は、ＣｈＩＰデータと併せて、ｐ６３－５３Ｏハイブリッドが効率的にｐ５３ＡＩＰ１をトランス活性化することを示す。
例６：ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡは、ｐ６３－５３Ｏのアポトーシス効果を拮抗する
　ｐ６３－５３Ｏのヒトがんでのアポトーシス促進効果におけるｐ５３ＡＩＰ１の重要性を決定するため、ｐ５３媒介アポトーシスに比較的に耐性のＳＷ４８０細胞において、ｐ５３ＡＩＰ１発現をノックダウンするｓｉＲＮＡを使用した。いずれのヒト遺伝子に対しても配列相同性がないｓｉＲＮＡをコントロールとして使用し、細胞を３日連続で２４時間毎にｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。
　図１１Ａに示されるように、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞において、ｐ５３ＡＩＰ１ ｍＲＮＡの減少を実証した。最後のトランスフェクションから８時間後に、細胞はＡｄ－ＧＦＰまたはＡｄ－ｐ６３－５３Ｏで４８時間感染させ、免疫ブロットおよびカスパーセ－３アッセイを行った。ＳＷ４８０細胞のｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡでの前処理は、ｐ６３－５３Ｏ媒介のｐ５３ＡＩＰ１の誘導をタンパク質レベルで強力に抑制した（図１１Ｂ）。さらに、ｐ５３ＡＩＰ１ ｓｉＲＮＡは、ｐ６３－５３Ｏのアポトーシス促進効果と拮抗した（図１１Ｂ）。
　これら結果は、本発明のハイブリッドタンパク質のアポトーシス効果が、少なくとも部分的に、ｐ５３ＡＩＰ１活性を介することを示唆する。すなわち、本発明のハイブリッドは、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写を効率的に活性化し、アポトーシスを誘導した。
材料と方法（例７～例１０）
細胞培養およびトランスフェクション
　使用したヒト胃癌細胞（ＭＫＮ－４５）、ヒト膵癌細胞（ＰＡＮＣ－１）、ヒト肝細胞癌細胞（ＨＬＦおよびＨｕＨ－７）、ヒト結腸腺癌細胞（ＳＷ４８およびＳＷ４８０）およびヒト骨肉腫細胞（Ｇ－２９２、ＨＯＳ、Ｓａｏｓ－２およびＵ－２ ＯＳ）は、American Type Culture CollectionまたはJapanese Collection of Research Bioresourcesから購入した。トランスフェクションは、すべてLipofectamine 2000(Lifetechnologies)を用いて行った。
プラスミド、組み換えアデノウイルスおよびｓｉＲＮＡ
　それぞれＦＬＡＧタグ化した、ｐ５３、ｐ６３γ(Sasaki et al., 2009)およびｐ５３とｐ６３γとのハイブリッド変異体（ｐ６３γの１～３５１アミノ酸およびｐ５３の３１８～３９３アミノ酸を含む６３－５３Ｏならびにｐ６３γの１～３５２アミノ酸およびｐ５３の２９０～３９３アミノ酸を含むスーパーハイブリッドｐ５３（ＳＨｐ５３））を、それぞれｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５／ＧＷ／Ｄ－ＴＯＰＯベクター(Lifetechnologies)に挿入した。アデノウイルスを産生するために、ｃＤＮＡおよびＬａｃＺ遺伝子をｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５－ＤＥＳＴベクター(Lifetechnologies)へ導入した。Fast-Trap Adenovirus Purification and Concentration Kit (Millipore)を用いて、組み換えアデノウイルスを精製した。
ヒトのＣＡＳＰ１０（５’－ｒＧｒＣＵＵｒＣＵｒＧｒＡＵＵｒＡＵＵｒＧｒＡＵＵｒＣｒＡＴＴ－３’；配列番号９）、ＫＣＮＫ３（５’－ｒＣｒＧＵｒＧＵｒＡｒＣｒＧＵＵＵｒＧｒＣｒＡＵｒＣＵｒＣＵＴＴ－３’；配列番号１０）、ＰＹＣＡＲＤ（５’－ｒＣｒＣｒＧｒＣｒＣｒＧｒＡｒＧｒＧｒＣＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＡｒＡＴＴ－３’；配列番号１１）を標的とするｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡを、ＳＩＧＭＡ社から購入した（ＲＮＡのヌクレオチドを「ｒＮ」で示す。）。
抗体
　実験に使用した抗体は、以下のとおりである。
　抗ＦＬＡＧ抗体(Ｍ２、Sigma)、抗カスパーゼ－３抗体(８Ｇ１０、Cell Signaling)、抗ＰＡＲＰ－１抗体(Ｈ－２５０、Santa Cruz Biotechnology)、抗トリメチルヒストンＨ３（Ｌｙｓ４）（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）抗体(ＭＣ３１５、MILLIPORE)、抗アクチン抗体(ＭＡＢ１５０１Ｒ、Millipore)およびＨＲＰ標識二次抗体(Santa Cruz Biotechnology)
ＲＴ－ＰＣＲ
　ＲＴ－ＰＣＲを、以前に報告したとおりに行った(Kashima et al., 2009)。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分の初期変性ステップ後、９４℃で３０秒、６５℃（ＣＡＳＰ１０）、５９℃（ＣＤＫＮ１Ａ）、６３℃（ＫＣＮＫ３，ＰＹＣＡＲＤおよびＴＰ５３）、５５℃（ＦＬＡＧ－ＴＰ６３）または５５℃（ＧＡＰＤＨ）で３０秒、および７２℃で３０秒をそれぞれ２６サイクル（ＣＡＳＰ１０）、２５サイクル（ＣＤＫＮ１Ａ）、２９サイクル（ＫＣＮＫ３）、３５サイクル（ＰＹＣＡＲＤ）、２５サイクル（ＴＰ５３）、１８サイクル（ＦＬＡＧ－ＴＰ６３）または１６サイクル（ＧＡＰＤＨ）で行うことを含む。
オリゴヌクレオチドのプライマー配列は、以下のとおりである。
　ＣＡＳＰ１０センス（５’－ＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡ－３’；配列番号１２）およびアンチセンス（５’－ＧＣＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＡＧＡＴＴＡＴＣ－３’；配列番号１３）、ＫＣＮＫ３センス（５’－ＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＴＣ－３’；配列番号１４）およびアンチセンス（５’－ＧＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＡＧＡＡＣＡＴ－３’；配列番号１５）、ＰＹＣＡＲＤセンス（５’－ＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣ－３’；配列番号１６）およびアンチセンス（５’－ＴＣＧＣＧＡＴＡＡＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴ　－３’；配列番号１７）、ＴＰ５３センス（５’－ＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＡＧ－３’；配列番号１８）およびアンチセンス（５’－ＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣ－３’；配列番号１９）、ＦＬＡＧ－ＴＰ６３センス（５’－ＣＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡ－３’；配列番号２０）およびアンチセンス（５’－ＧＧＡＣＡＣＧＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＧ－３’；配列番号２１）、ならびにＧＡＰＤＨセンス（５’－ＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴ－３’；配列番号２２）およびアンチセンス（５’－ＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ－３’；配列番号２３）
ＣＤＫＮ１Ａ用のオリゴヌクレオチドプライマーは、以前に報告されている (Idogawa et al., 2009)。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲルの電気泳動によって可視化した。
免疫蛍光顕微鏡
　免疫蛍光顕微鏡は、以前に報告したとおりに行った(Kashima et al., 2009)。簡潔に述べると、細胞を４ウェルチャンバースライド上で培養し、トランスフェクションした。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＦＬＡＧ抗体とともにインキュベートした後、Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体とともにインキュベートした。標識した細胞は、BZ-8100（KEYENCE）蛍光顕微下で調べた。
ＴａｑＭａｎ低密度アレイ
　TaqMan Low Density Array (LDA)は、96 TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)からなり、表４に記載のとおり、９３のｐ５３標的遺伝子および３の内因性コントロール遺伝子（ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨ）を含み、３８４ウェルフォーマットに設計され、マイクロ流体カードにスポットされている（１アッセイあたり４つ）。選択した遺伝子の発現は、ＬＤＡとして製造業者の指示書に従って分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
クロマチン免疫沈降－配列決定解析
　クロマチン免疫沈降－配列決定（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）解析を、以前に報告したとおりに行った(Suzuki et al.)。まず、ＨｕＨ－７細胞をアデノウイルスベクターで感染させた。２４時間後、細胞を１％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。SOLiD ChIP-seq manualに記載のように、クロマチン試料について、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体を用いてＣｈＩＰを行い、SOLiD3 Plus system(Applied Biosystems)を用いて大規模なパラレルシークエンスを行った。質が悪いか、一意的に位置づけられなかった配列の読み込みは、研究から除外した。ピークは、Model-based Analysis for ChIP-seq (MACS) software(Zhang et al., 2008)を用いて同定し、カリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）のゲノムブラウザを用いて可視化した。ゲノム位置は、International Human Genome Sequencing Consortiumによって作成されたＵＣＳＣｈｇ１８(National Center for Biotechnology Information Build 36.1, March 2006)に基づく。
マイクロアレイ解析
　２７，９５８のEntrez gene RNAおよび７，４１９のlarge intergenic non-coding RNA(lincRNA)を、SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (Agilent Technologies)を用いて解析した。マイクロアレイデータは、GeneSpring GX ver. 11 (Agilent Technologies)を用いてさらに解析された。
ｐ５３結合部位の予測
　ｐ５３結合部位は、ｐ５３スキャンアルゴリズム(Smeenk et al., 2008)を用いてコンピューターで予測した。
クロマチン免疫沈降－ＰＣＲ
　タンパク質をＤＮＡと架橋するため、アデノウイルス感染の２４時間後に、ＨｕＨ－７細胞を１０分間１％ホルムアルデヒドで固定した。クロマチン試料を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、４℃で１６時間免疫沈降した。ＣｈＩＰは、MAGnify ChIP system(Lifetechnologies)を用いて行った。ＰＣＲプライマーを表５に示す。
　表５は、使用したプライマー配列およびＣｈＩＰ－ＰＣＲ産物のサイズを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
フローサイトメトリー
　１００万個の細胞を６ｍｍプレートまたはＴ２５フラスコで培養し、アデノウイルスで感染させた。以前の報告のように(Ogi et al., 2005)、細胞を４８時間後にフローサイトメトリーに供した。データは、FlowJo softwareを用いて解析した。
カスパーゼ－３活性の測定
　カスパーゼ－３活性を、caspase-3 assay kit(Biovision)を用い、製造業者の指示書に従って比色定量アッセイにより測定した。
In vivo腫瘍形成アッセイ
　５週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１－ｎｕ／ｎｕマウスにおいて、２×１０６個のＭＫＮ－４５細胞または３×１０６個のＳＷ４８０細胞を１００μＬの無菌ＰＢＳ中に再懸濁し、続いてこれら細胞を２１ゲージの針を用いて動物の側腹部へ注射した。キャリパーを用いて３日毎に腫瘍サイズをモニタリングし、発達する腫瘍の長さ（ｌ）および幅（ｗ）をＶ＝（ｗ２×ｌ）／２の式を用いて体積に変換した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき、１００μＬ当たり５×１０８プラーク形成単位（ｐ.ｆ.ｕ.）の各精製アデノウイルスを、２６ゲージの針を用いて３日間毎日腫瘍内投与した。
図面の説明
　図１２は、スーパーハイブリッドｐ５３のがん細胞におけるアポトーシスの強い誘導を示す。
　（Ａ）ＦＬＡＧ－ｐ５３コンストラクト（ダークグレー）、ＦＬＡＧ－ｐ６３γコンストラクト（ライトグレー）、ＦＬＡＧ－６３－５３コンストラクトＯおよびＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３コンストラクトの模式図。ＴＡ：トランス活性化ドメイン、ＤＢ：ＤＮＡ結合ドメイン、ＯＬ：オリゴマー化ドメイン。水平のバーは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を示す。ＮＬＳスコアを、ＰＳＯＲＴ　ＩＩプログラムを用いて計算し、右側に示した。矢印は、ＲＴ－ＰＣＲ解析に用いたプライマーの位置を示している。
　（Ｂ）ＳＷ４８０細胞に、図１２Ａに記載の表示のベクターをトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。図１２Ａに表示のＦＬＡＧ配列特異的フォワードプライマー、ＴＰ６３配列プライマーならびにＴＰ５３特異的フォワードおよびリバースプライマーを、ＦＬＡＧ－ＴＰ６３およびＴＰ５３をそれぞれ検出するために用いた。
　（Ｃ）ＳＷ４８０細胞を、表示したベクターでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクション後、全細胞のライセートを、表示の抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。＊は、非特異的なバンドを示している。
　（Ｄ）Ｓａｏｓ－２細胞を、表示したベクターでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、抗ＦＬＡＧ抗体（緑）を用いて免疫細胞化学を行った。ＤＡＰＩ染色によって核を検出した（青色）。
　（Ｅ）Ｇ－２９２細胞、Ｕ－２ ＯＳ細胞、ＭＫＮ－４５細胞、ＨＬＦ細胞、ＨＯＳ細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＰＡＮＣ－１細胞、ＳＷ４８細胞およびＳＷ４８０細胞を表示した組み換えアデノウイルスで感染させ、感染の４８時間後にフローサイトメトリーによって分析した。Ｓｕｂ－Ｇ１における細胞の百分率を示す。
　（Ｆ）アデノウイルス感染の４８時間後に、カスパーゼ－３活性ならびにカスパーゼ－３およびＰＡＲＰ－１切断をアッセイした。カスパーゼ－３活性の測定は３回行い、平均値と標準偏差を示す。
　（Ｇ）「材料と方法」に記載されるように、ヌードマウスにＳＷ４８０細胞およびＭＫＮ－４５細胞を皮下注射した。表示のアデノウイルスベクターを、１、２および３日目に腫瘍内に注射した（矢印）。データは、アデノウイルスを注射した５つの独立した腫瘍の平均体積を表している。１日目の体積を１として、各腫瘍の体積を１日目の体積に対する相対値として表す。エラーバーは、標準偏差を示す。
　図１３は、ｐ５３（ダークグレー）、ｐ６３γ（ライトグレー）、６３－５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの模式図を示す。ＴＡ：トランス活性化ドメイン、ＤＢ：ＤＮＡ結合ドメイン、ＯＬ：オリゴマー化ドメイン。水平なバーは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を示す。ＮＬＳスコアをＰＳＯＲＴ　ＩＩプログラムを用いて計算した。
　図１４は、ｐ５３ファミリーハイブリッドのコンストラクトの構造をＰＣＲ法およびウェスタンブロット法で確認したことを示す。
　（Ａ）Ｆｌａｇ－ＳＨｐ５３およびＲＴ－ＰＣＲプライマー位置（矢印）の模式図である。ダークまたはライトグレーのバーは、それぞれｐ５３およびｐ６３由来の配列を示す。
　（Ｂ）ＳＷ４８０細胞は、表示した図１３に記載のＦｌａｇ－タグ化コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。Ｆｌａｇ－ＴＰ６３、ＴＰ５３およびＦｌａｇ－ＴＰ５３を検出するために、それぞれ（Ａ）に表示されるＦｌａｇ配列特異的フォワードプライマーおよびＴＰ６３配列プライマーおよびＴＰ５３特異的なフォワードおよびリバースプライマーを使用した。
　（Ｃ）ＳＷ４８０細胞は、表示したベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全細胞ライセートを、表示した抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。
　図１５は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３－５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドによる各種がん細胞におけるアポトーシス誘導の比較を示す。
　Ｇ－２９２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＭＫＮ－４５細胞、Ｕ－２ ＯＳ細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＨＯＳ細胞およびＳＷ４８０細胞を、表示した組み換えアデノウイルスで感染し、感染の４８時間後にフローサイトメトリーによって解析した。ｓｕｂ－Ｇ１における細胞の百分率を示す。各細胞のＴＰ５３遺伝子型を、ＷＴ（野生型）、ｎｕｌｌまたはＭＵＴ（変異体）として示す。
　図１６は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３－５３Ｏおよびｐ５３ファミリーハイブリッドタンパク質の細胞内局在を示す。
　Ｓａｏｓ－２細胞を、表示のベクターでトランスフェクトした。２４時間トランスフェクションした後、抗ＦＬＡＧ抗体（緑）を用いて免疫細胞化学を行った。核はＤＡＰＩ染色（青）を介して検出した。
　図１７は、ｐ５３、ｐ６３γ、ｐ６３－５３ＯおよびＳＨｐ５３による特異的ｐ５３ＡＩＰ１発現誘導を示す。
　ＭＫＮ－４５細胞、Ｕ－２ ＯＳ細胞、Ｇ－２９２細胞およびＳＷ４８０細胞を、表示のアデノウイルスで感染させ、感染の２４時間後に、各遺伝子に特異的なプライマーを用いて遺伝子発現をＲＴ－ＰＣＲによって解析した。ＴＰ５３の遺伝子型を括弧内に示す。
　図１８は、ＳＨｐ５３により誘導される遺伝子発現プロファイリングを示す。
　（Ａ）Ｈｕｈ－７細胞を、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染させた。全ＲＮＡを、感染２４時間後にＴＲＩｚｏｌ（Lifetechnologies）を用いて単離し、ｐ５３標的遺伝子の誘導はＬＤＡを用いて定量し、ＧＡＰＤＨで正規化した。実験を３回行った。平均値および標準偏差を示す。
　（Ｂ）Ｈｕｈ－７細胞を、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３は、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染した。感染２４時間後、全ＲＮＡを単離し、遺伝子発現はマイクロアレイを用いて分析した。発現上昇した遺伝子を＞１０の比で同定し、解析した。ベン図は、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の感染により、別個に制御されているものとして同定された遺伝子群の交わりを表示する。遺伝子数および典型的な発現上昇した遺伝子を示す。
　（Ｃ）ヒートマップは、階層的クラスタリングにより分析された発現上昇した遺伝子（図１８Ｂ）を示し、ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３特異的に誘導された遺伝子クラスターを同定した（ボックス、表６）。ＳＨｐ５３標的遺伝子を同定するために、模式図に示すように追加のフィルタリングを行った。遺伝子数が表示される。（Ｃ）遺伝子を特異的に制御するＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３における推定ｐ５３の結合部位（ＢＳ）同定のためのストラテジー（Ｄ）Ｈｕｈ－７細胞におけるＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３特異的に発現上昇する遺伝子およびこれらのｐ５３ＢＳの選択のためのフローチャート
　図１９～２１は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法によって確認されたＳＨｐ５３により特異的に発現誘導される遺伝子群を示す。
　ＭＫＮ－４５細胞、Ｕ－２ ＯＳ細胞、Ｇ－２９２細胞、ＨｕＨ－７細胞およびＳＷ４８０細胞を、表示したアデノウイルスで感染させ、遺伝子発現を、感染の２４時間後にＴａｑＭａｎ　ＬＤＡによって解析した。遺伝子発現の相対レベルを、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対する標的遺伝子の発現比率を算出するΔΔＣｔ法を用いて定量した。Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３によって特異的に誘導される遺伝子を示した。各細胞のＴＰ５３遺伝子型を括弧内に示した。プライマー／プローブのセットを、表４に示す。
　図２２は、スーパーハイブリッドｐ５３特異的な標的遺伝子のトランス活性化の制御を示す。
　（Ａ）～（Ｃ）ＣＡＳＰ１０遺伝子（Ａ）、ＫＣＮＫ３遺伝子（Ｂ）およびＰＹＣＡＲＤ遺伝子（Ｃ）のｐ５３ＢＳ候補の位置および配列（灰色のバー）を転写開始部位に相対的に示す。エクソンおよびイントロンを、それぞれ白いボックスまたは太字のバーで示す。ヒトおよびマウスの配列ならびに相同性を示す。コンセンサスｐ５３結合配列（ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ；配列番号２４、Ｒ：プリン、Ｃ：シトシン、Ｗ：アデニンまたはチミン、Ｇ：グアニン、Ｙ：ピリミジン）と比較してマッチした、またはミスマッチしたヌクレオチドを、それぞれ大文字または小文字で示す。相同性をアスタリスクで示す。
　（Ｄ）～（Ｆ）Ｈｕｈ－７細胞をＡｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３は、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染させ、感染の２４時間後に抗ＦＬＡＧ抗体またはコントロールＩｇＧを用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを行った。ＣｈＩＰサンプルおよび１０％のインプットＤＮＡを、ｐ５３ＢＳ、ＣＡＳＰ１０－３０９０または+４８９（Ｄ）、ＫＣＮＫ３+１２６９または+１４３２（Ｅ）またはＰＹＣＡＤ+１２６９または+１４３２（Ｆ）をそれぞれ含む領域を標的にした特異的なプライマーで増幅した。
　（Ｇ）～（Ｉ）ＨｕＨ－７細胞またはＳＷ４８０細胞を、野生型ｐ５３ＢＳ（ＷＴ）または表示した部位が変異した配列（ｍｕｔ）を含むレポーター、またはＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３発現ベクターを有するまたはモック（－）のｐＧＬ３プロモーターの空ベクターでトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて決定した。実験は３回行った。平均値および標準偏差を示す。モックでトランスフェクションした試料を１とした。＊＊Ｐ＜０．０１
　図２３は、ＳＨｐ５３が特異的に結合する部位を持つ標的遺伝子を示す。
　Ｈｕｈ－７細胞を、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－Ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染させ、感染後２４時間で抗ＦＬＡＧ抗体またはコントロールＩｇＧを用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを行った。ＣｈＩＰサンプルおよび１０％のインプットＤＮＡを、各遺伝子のｐ５３ＢＳを含む領域を標的とした特異的なプライマーで増幅した。ｐ５３ＢＳおよびプライマー配列を表５に記載した。
　図２４は、特定の標的遺伝子の発現制御によるスーパーハイブリッドｐ５３のアポトーシスの誘導を示す。（Ａ）～（Ｂ）ＨｕＨ－７細胞およびＳＷ４８０細胞を、ＣＡＳＰ１０に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＳＰ１０、Ａ）、ＫＣＮＫ３に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＫＣＮＫ３、Ｂ）またはＰＹＣＡＲＤに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＹＣＡＲＤ、Ｃ）、またはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション後４時間で、細胞をＡｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染させた。感染の２４時間後に全ＲＮＡを単離し、各遺伝子の発現レベルをＲＴ－ＰＣＲにより解析した（上）。感染の４８時間後に、ｓｕｂ－Ｇ１の百分率をフローサイトメトリーによって分析した（下）。
（Ａ）ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３およびＲＴ－ＰＣＲプライマーの位置（矢印）の模式図を示す。ダークまたはライトグレーのバーは、ｐ５３およびｐ６３に由来する配列をそれぞれ示す。（Ｂ）ＳＷ４８０細胞を、図１３に記載する表示のＦＬＡＧタグ化したコンストラクトでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。図１４に表示のＦＬＡＧ配列特異的フォワードプライマー、ＴＰ６３配列プライマーならびにＴＰ５３特異的フォワードおよびリバースプライマーを、ＦＬＡＧ－ＴＰ６３、ＴＰ５３およびＦＬＡＧ－ＴＰ５３をそれぞれ検出するために用いた。（Ｃ）ＳＷ４８０細胞を、表示したベクターでトランスフェクションした。２４時間トランスフェクションした後、全細胞ライセートを、表示した抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。
例７：がん細胞におけるスーパーハイブリッドｐ５３の誘導
　ｐ５３に基づく新規ながん治療のためのスクリーニングによって、ｐ６３γのＴＡＤおよびＤＢＤならびにｐ５３のＯＬＤを組み合わせたｐ５３ファミリーのハイブリッド遺伝子「６３－５３Ｏ」（図１２Ａ）が、強力な腫瘍抑制遺伝子であることを見出した。６３－５３Ｏハイブリッドのアデノウイルス（Ａｄ）媒介遺伝子導入は、ＴＰ５３ＡＩＰ１のトランス活性化によって、in vitroおよびin vivoの両方においてアポトーシスを強く誘導した。
　６３－５３Ｏハイブリッドのアポトーシス促進活性を増強させるため、一連のハイブリッド遺伝子の誘導体を作製した（図１３、表６および図１４）。いくつかのがん細胞において、ｐ６３γの１～３５２番目のアミノ酸とｐ５３の２９０～３９３番目のアミノ酸を融合したハイブリッドが、ｐ５３、ｐ６３γまたは他のハイブリッド遺伝子と比較して、アポトーシスを強く誘導したことが示された（図１２Ｅおよび図１５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　したがって、当該ハイブリッドを、「スーパーハイブリッドｐ５３（ＳＨｐ５３）」と命名し、そのアポトーシス促進活性を評価するためにさらに分析を行った。ＳＷ４８０細胞を、ＦＬＡＧ－ｐ５３、ＦＬＡＧ－ｐ６３γ、ＦＬＡＧ－６３－５３ＯまたはＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３発現ベクターで感染させた。ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３のｍＲＮＡおよびタンパク質は、他の遺伝子と同様に発現し（図１２Ｂおよび図１２Ｃ）、同様のデータがＨＥＫ２９３細胞においても得られた。各タンパク質の細胞内局在は、免疫細胞化学によって分析した（図１２Ｄ）。
　図１２Ｄに示すように、ＦＬＡＧ－ｐ５３、ＦＬＡＧ－ｐ６３γ、ＦＬＡＧ－６３－５３ＯおよびＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３は、核に局在した。ＮＬＳスコアと一致して、ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の核移行が最も強く観察された（図１２Ａおよび図１２Ｄ）。これら遺伝子のアデノウイルス媒介性導入によって誘導されたアポトーシス促進効果は、核移行およびＮＬＳスコアと一致する傾向にあった（図１３～１６）。これは、ｐ５３ファミリーおよびハイブリッド遺伝子の核移行が、アポトーシス促進機能に必要であることを示唆する。
　アポトーシス性細胞死を示すｓｕｂ－Ｇ１画分の増加は、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３によって誘導され、それはＴＰ５３遺伝子型とは関係なく、ほとんどのがん細胞において他の分子よりも大きく誘導されることが、フローサイトメトリー分析で明らかになった（図１２Ｅおよび図１５）。６３－５３Ｏハイブリッドの標的であるＴＰ５３ＡＩＰ１の発現もまた、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３によって誘導され（図１７）、ＴＰ５３ＡＩＰ１は、６３－５３ＯおよびＳＨｐ５３の共通の標的であることが示された。これらデータは、Ａｄ－ＳＨｐ５３が、アポトーシス促進活性を通じて、がん治療のための新規で潜在的な標的であることを示唆する。
　Ａｄ－ＳＨｐ５３のin vitroおよびin vivoのアポトーシス促進活性を確認するため、カスパーゼ－３活性およびＰＡＲＰ－１タンパク質の切断を測定し（図１２Ｆ）、腫瘍形成の異種移植モデルで試験した（図１２Ｇ）。カスパーゼ－３は、多様なアポトーシス経路における切断によって活性化し、活性化したカスパーゼ－３は、ＰＡＲＰ－１を切断する。したがって、カスパーゼ－３およびＰＡＲＰ－１の切断は、アポトーシスの特徴とみなされる。
　ＭＫＮ－４５、ＨｕＨ－７、ＰＡＮＣ－１およびＳＷ４８０細胞のＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３での感染は、カスパーゼ－３活性およびＰＡＲＰ－１切断の両方を最も大きく増加させた（図１２Ｆ）。これは、アデノウイルス媒介のＳＨｐ５３遺伝子導入が、がん細胞において強くアポトーシスを促進したことを確認するものである。
　さらに、ＳＨｐ５３のin vivoにおける治療上の効果と相関するin vitroでのアポトーシスへの効果を測定するために、腫瘍形成の異種移植モデルにおいて、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３ベクターの活性を調べた。ＳＷ４８０およびＭＫＮ－４５細胞を、ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍体積が一定の大きさに達したとき、アデノウイルスを１日目、２日目および３日目に腫瘍へ直接注射した（図１２Ｇ、矢印）。
　Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３とともに注射したＳＷ４８０由来およびＭＫＮ－４５由来の腫瘍体積は、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３またはＡｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γを注射した腫瘍体積よりも小さかった（図１２Ｇ）。すなわち、これら結果は、アデノウイルス媒介のＳＨｐ５３遺伝子導入が、ｐ５３耐性がん患者に対して有利であり、新規のがん遺伝子治療となり得ることを示す。
例８：スーパーハイブリッドｐ５３によって誘導される遺伝子発現プロファイル
　がん細胞におけるＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３誘導アポトーシスの分子的基盤を明らかにするため、ＳＨｐ５３によって特異的に制御される標的遺伝子をスクリーニングした。最初に、ＴａｑＭａｎに基づくハイスループットリアルタイムＰＣＲであるＴａｑＭａｎ低密度アレイ（Low Density Array；ＬＤＡ）を用いて、特にアポトーシスに関連する９３種の既知のｐ５３標的遺伝子の発現を調べた。ＴＰ５３ＷＴ細胞（ＭＫＮ－４５細胞およびＵ－２ ＯＳ細胞）、ヌル細胞（Ｇ－２９２細胞）および変異細胞（ＨｕＨ－７細胞およびＳＷ４８０細胞）を、Ａｄ－ＬａｃＺ、ＦＬＡＧ－ｐ５３、ＦＬＡＧ－ｐ６３γおよびＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染させ、感染の２４時間後に遺伝子発現レベルを定量した。
　Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３およびＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入では、ｐ５３の最も有名な標的遺伝子の一つであるＣＤＫＮ１Ａがそれぞれ同程度誘導されたが、いくつかのがん細胞において、１８種の遺伝子（ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＱＰ３、ＣＡＳＰ１０、ＣＳＴ１１、ＥＧＲ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＪＡＧ２、ＫＣＮＡ２、ＰＧＡ５、ＰＬＣＤ４、ＰＹＣＡＲＤ、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＴＴＹＨ２、ＩＣＡＭ２、ＴＮＸＢ、ＴＰ７３およびＬＲＤＤ）が、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入によって、有意に高い誘導を示した（図１７、図１８Ａ、および図１９～２１）。
　第二のアプローチでは、ＳＨｐ５３によって制御される遺伝子をゲノムワイドにスクリーニングするため、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染したＨｕＨ－７細胞において、２７，９５８種のＥｎｔｒｅｚ　ｇｅｎｅ　ＲＮＡおよび７，４１９種のｌｉｎｃＲＮＡを含む遺伝子発現マイクロアレイ（Agilent Technologies社）で解析を行った。Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γおよびＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３でそれぞれ感染したすべての細胞において、ＣＤＫＮ１Ａの発現上昇が検出された（図１８Ａ）。これは、ＬＤＡの結果とも一致する（図２１）。
　総遺伝子数だけではなく、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３感染によって特異的に発現上昇した遺伝子数が、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３またはＡｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γ感染によって発現上昇した遺伝子数よりも多かった。これは、ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３が、ＦＬＡＧ－ｐ５３またはＦＬＡＧ－ｐ６３γとは異なるトランス活性化活性を得たことを示唆する（図１８Ｂ）。階層的クラスタリング解析は、ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３特異的に発現上昇した２３８種の遺伝子を同定した（図１８Ｃおよび表７）。
　表７は、階層的クラスタリング解析によって同定されたＦｌａｇ－ＳＨｐ５３特異的に制御される遺伝子を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　興味深いことに、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の感染によって誘導された遺伝子発現のパターンは、ＨｕＨ－７細胞においてそれぞれ異なっていた。これは、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３が、ＤＮＡ結合ドメインはｐ６３γに由来するが、新規なトランス活性化活性を有することを示唆する。ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の推定標的遺伝子群を得るために、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入によって誘導される遺伝子であって、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３またはＡｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γよりも少なくとも１０倍発現量の多い遺伝子を抽出した。ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３によって発現上昇する潜在的な遺伝子として、６４種の遺伝子が同定された（図１８Ｃおよび表８）。
　表８は、マイクロアレイ解析によって同定された推定Ｆｌａｇ－ＳＨｐ５３遺伝子を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　第三のアプローチでは、ＳＨｐ５３特異的に発現上昇する遺伝子をさらにゲノムワイドに同定するために、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染したＨｕＨ－７細胞において、活性型の遺伝子プロモーターを標識する抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体を用いてクロマチン免疫沈降シーケンス（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）解析を行った。ＣｈＩＰ－ｓｅｑ解析は、５７種のＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３特異的なＨ３Ｋ４ｍｅ３標識化ＲｅｆＳｅｑ遺伝子を同定した（表９）。ＴＴＹＨ２を除いて、他の５６種の遺伝子を、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入によって発現上昇する遺伝子候補としてさらに同定した。
　表９は、Ａｄ－Ｆｌａｇ－ＳＨｐ５３導入細胞において特異的に検出されたＨ３Ｋ４ｍｅ３標識化遺伝子のリストである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　ＳＨｐ５３によって転写的に制御され得る遺伝子を同定するために、これら遺伝子におけるｐ５３結合部位（ＢＳ）を３種のスクリーニングアプローチで同定し、ｐ５３スキャンアルゴリズム（Smeenk et al., 2008）を用いてin silico解析で探索した後、図１８Ｄに示すように２つの独立した基準によって選別した。コンセンサスｐ５３ＢＳは、０～２１ｂｐのスペーサー配列で区切られた１０ｂｐのモチーフ（ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ；配列番号２４）の２つのコピーからなる（Ｒ：アデニンまたはグアニン、Ｃ：シトシン、Ｗ：アデニンまたはチミン、Ｇ：グアニン、Ｙ：シトシンまたはチミン）。よく保存されたＣまたはＧを変更することは、ｐ５３に対する応答性を劇的に減少させ得るため (Menendez et al., 2009)、これらコアＣ／Ｇを保存したｐ５３ＢＳを精製した（図１８Ｄ）。スペーサー長のバリエーションが特定のレベルの機能を維持するために重要なメカニズムであることもまた示唆されており、実際、検証されたヒトｐ５３ＢＳのほとんどが、３塩基より小さいスペーサーを有している (Menendez et al., 2009)。
　したがって、０～２塩基のスペーサーを有するｐ５３ＢＳを選択した。さらに、転写開始部位（ＴＳＳ）からのｐ５３ＢＳの位置および距離は、任意の推定ｐ５３ＢＳを受け入れるための閾値を決定するのに役立つ。遺伝子におけるｐ５３ＢＳは、最も一般的には、遺伝子の５’プロモーター－エンハンサー領域またはイントロン１に位置し、ＤＮＡにおける機能的低親和性ｐ５３ＢＳはＴＳＳの周りにのみ存在する (Riley et al., 2008)。したがって、遺伝子のＴＳＳの－５ｋｂｐと＋１０ｋｂｐとの間に位置するｐ５３ＢＳを選択した。
　別のアプローチとして、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの配列比較解析は推定ｐ５３ＢＳの検索に役立つことから (Maruyama et al., 2006)、オーソロガス遺伝子におけるヒトとマウスとの間の保存性をコンピューター検索に適用した。これとともに、推定ＳＨｐ５３標的遺伝子を同定するために２つの基準を適応した。
　遺伝子は、１）ＴＳＳの－５ｋｂｐと＋１０ｋｂｐとの間に位置し、完全に保存されたコアＣ／Ｇ、３以下のミスマッチ、および２以下のスペーサーを含むｐ５３ＢＳ、ならびに２）ＴＳＳの－５ｋｂｐと１０ｋｂｐとの間に位置し、完全に保存されたコアＣ／Ｇ、５以下のミスマッチ、およびオーソロガス遺伝子におけるヒトとマウスとの間の５０％以上の相同性を含むｐ５３のＢＳを有していた（図１８Ｃ）。これらアプローチを使用して、６３種のＳＨｐ５３特異的標的遺伝子候補における１３３箇所の推定ｐ５３ＢＳを同定した（図１８Ｄおよび表１０）。
　表１０は、スーパーハイブリッドｐ５３の標的遺伝子候補を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　略記：ｐ５３ＢＳ、ｐ５３結合部位；ＣｈＩＰ＋、結合；ＣｈＩＰ－、非結合；Ｎ．Ａ．、未評価；ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、クロマチン免疫沈降－配列決定；ＬＤＡ、ＴａｑＭａｎ低密度アレイ
例９：スーパーハイブリッドｐ５３による特定の標的遺伝子トランス活性化の制御
　in silico解析によって予測されたｐ５３ＢＳへ直接結合することによって、これら候補遺伝子がＳＨｐ５３によって転写的に制御されたかを評価するために、ＨｕＨ－７細胞を、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－Ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γまたはＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３に感染させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＣｈＩＰ解析を行った。６３種のＳＨｐ５３特異的標的遺伝子のうち、細胞増殖、アポトーシスに関与していることが報告されている２６種において、コンピューター予測によって同定されたｐ５３ＢＳ候補を含むＤＮＡ断片に対してのＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３タンパク質特異的な相互作用を評価し、１９種の遺伝子において確認がされた。これは、これらアプローチが機能的ｐ５３ＢＳの検索において信頼できるものであることを示唆する（表１０、図２２および図２３）。
　さらに、これらｐ５３ＢＳが転写制御に関与し得るかどうかを決定するために、ＣｈＩＰ解析によって確認されたＡＰＯＢＥＣ２、ＣＡＳＰ１０およびＰＹＣＡＲＤのＷＴｐ５３ＢＳを含むオリゴヌクレオチド、または非活性型変異体（ｍｕｔ）を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングした。その後、得られたコンストラクトを、ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３有りまたは無しで、ＴＰ５３変異を有するＨｕＨ－７細胞またはＳＷ４８０細胞にトランスフェクションした。変異の配列とは異なり、ＷＴｐ５３ＢＳは、レポーターコンストラクトにＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３に応答性を与え、これは、モックトランスフェクションした細胞と比較しても少なくとも２倍のルシフェラーゼ活性の増加となる（図２２）。図１８Ａに示すように、これら遺伝子のＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３特異的な誘導が、リアルタイムＰＣＲによって確認された（図１８Ａ）。つまり、これら知見は、ゲノムワイドなスクリーニングによって同定されたＳＨｐ５３特異的に発現上昇した遺伝子のほとんどが、ｐ５３ＢＳに直接結合することによって転写的に制御され得ることを示唆する（表１０）。
例１０：スーパーハイブリッドｐ５３は特定の標的遺伝子の発現を制御することによりアポトーシスを誘導する
　いくつかのがん細胞において、Ａｄ－ＳＨｐ５３がアポトーシスおよびを特定の標的遺伝子の転写を強く誘導したことから（図１２Ａおよび図１８Ａ）、ハイブリッドが、ＳＨｐ５３特異的標的遺伝子のトランス活性化を介してアポトーシス促進活性を獲得したと考えた。この考えを評価するために、ＳＨｐ５３特異的にトランス活性化した遺伝子をノックダウンし、フローサイトメトリーでＡｄ－ＳＨｐ５３媒介アポトーシスを解析した。
　ＨＵＨ－７細胞、ＳＷ４８０細胞を、Ａｄ－ＬａｃＺ、ＡＤ－ＦＬＡＧ－ｐ５３、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ６３γまたはＡＤ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で感染した後、ヒトＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３、ＳＥＺ６、ＳＬＣＯ２ＢもしくはＰＹＣＡＲＤを含むＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３特異的に制御された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。ＳＥＺ６またはＳＬＣＯ２Ｂとは異なり、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤがアポトーシス応答性遺伝子として同定された（図２４）。コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞における他のアデノウイルスと比較して、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３またはＰＹＣＡＲＤがＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入によって強く誘導された一方で、ＲＴ－ＰＣＲ分析は、これらの３種の遺伝子の発現上昇が、各ｓｉＲＮＡ媒介のノックダウン細胞において５０％以上阻害されたことを実証した（図２４、上段）。
　ＰＹＣＡＲＤ遺伝子には、エクソン１、２および３ならびにエクソン１および２からなる２種の選択的スプライシングバリアントがあるところ、短い型の発現がＡｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入によって有意に誘導された。これは、ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３が、短い型のＰＹＣＡＲＤのみをトランス活性化することを示唆する。コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞において、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３の導入によって誘導されたアポトーシス性細胞死を示すｓｕｂ－Ｇ画分における増加は、Ａｄ－ＬａｃＺ、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３またはＡｄ－ＦＬＡＧ－６３γのものより大きく、図１２Ｅと一致する（図１２Ｅおよび図２４、下段）。Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３で誘導されるアポトーシスは、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３またはＰＹＣＡＲＤをノックダウンした細胞において有意に抑制されたが、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ｐ５３またはＡｄ－ＦＬＡＧ－ｐ６３γで誘導されるアポトーシスは、これらｓｉＲＮＡのトランスフェクションによっては影響を受けなかった（図２４、下段）。これらデータは、Ａｄ－ＦＬＡＧ－ＳＨｐ５３は、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤなどのアポトーシス促進性遺伝子を介してアポトーシスを誘導することを示唆する。
参考文献
1. Bautista DM, Sigal YM, Milstein AD, Garrison JL, Zorn JA, Tsuruda PR et al. Pungent agents from Szechuan peppers excite sensory neurons by inhibiting two-pore potassium channels. Nat Neurosci 2008; 11: 772-779.
2. Bayliss DA, Barrett PQ. Emerging roles for two-pore-domain potassium channels and their potential therapeutic impact. Trends Pharmacol Sci 2008; 29: 566-575.
3. Bode AM, Dong Z. Post-translational modification of p53 in tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2004; 4: 793-805.
4. Brosh R, Rotter V. When mutants gain new powers: news from the mutant p53 field. Nat Rev Cancer 2009; 9: 701-713.
5. Brown CJ, Lain S, Verma CS, Fersht AR, Lane DP. Awakening guardian angels: drugging the p53 pathway. Nat Rev Cancer 2009; 9: 862-873.
6. Calabro V, Mansueto G, Parisi T, Vivo M, Calogero RA, La Mantia G. The human MDM2 oncoprotein increases the transcriptional activity and the protein level of the p53 homolog p63. J Biol Chem 2002; 277: 2674-2681.
7. Cavalieri D, Dolara P, Mini E, Luceri C, Castagnini C, Toti S et al. Analysis of gene expression profiles reveals novel correlations with the clinical course of colorectal cancer. Oncol Res 2007; 16: 535-548.
8. Cheok CF, Verma CS, Baselga J, Lane DP. Translating p53 into the clinic. Nat Rev Clin Oncol; 8: 25-37.
9. Conway KE, McConnell BB, Bowring CE, Donald CD, Warren ST, Vertino PM. TMS1, a novel proapoptotic caspase recruitment domain protein, is a target of methylation-induced gene silencing in human breast cancers. Cancer Res 2000; 60: 6236-6242.
10. Dotsch V, Bernassola F, Coutandin D, Candi E, Melino G. p63 and p73, the ancestors of p53. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2: a004887.
11. el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy DB, Parsons R, Trent JM et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993; 75: 817-825.
12. Flores ER, Sengupta S, Miller JB, Newman JJ, Bronson R, Crowley D et al. Tumor predisposition in mice mutant for p63 and p73: evidence for broader tumor suppressor functions for the p53 family. Cancer Cell 2005; 7: 363-373.
13. Fujiwara T, Grimm EA, Mukhopadhyay T, Zhang WW, Owen-Schaub LB, Roth JA. Induction of chemosensitivity in human lung cancer cells in vivo by adenovirus-mediated transfer of the wild-type p53 gene. Cancer Res 1994; 54: 2287-2291.
14. Ghioni P, Bolognese F, Duijf PH, Van Bokhoven H, Mantovani R, Guerrini L. Complex transcriptional effects of p63 isoforms: identification of novel activation and repression domains. Mol Cell Biol 2002; 22: 8659-8668.
15. Goh AM, Coffill CR, Lane DP. The role of mutant p53 in human cancer. J Pathol 2011; 223: 116-126.
16. Heckman KL, Pease LR. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc 2007; 2: 924-932.
17. Heitzmann D, Derand R, Jungbauer S, Bandulik S, Sterner C, Schweda F et al. Invalidation of TASK1 potassium channels disrupts adrenal gland zonation and mineralocorticoid homeostasis. EMBO J 2008; 27: 179-187.
18. Ho J, Benchimol S. Transcriptional repression mediated by the p53 tumour suppressor. Cell Death Differ 2003; 10: 404-408.
19. Idogawa M, Sasaki Y, Suzuki H, Mita H, Imai K, Shinomura Y et al. A single recombinant adenovirus expressing p53 and p21-targeting artificial microRNAs efficiently induces apoptosis in human cancer cells. Clin Cancer Res 2009; 15: 3725-3732.
20. Irwin MS, Kondo K, Marin MC, Cheng LS, Hahn WC, Kaelin WG, Jr. Chemosensitivity linked to p73 function. Cancer Cell 2003; 3: 403-410.
21. Kaghad M, Bonnet H, Yang A, Creancier L, Biscan JC, Valent A et al. Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. Cell 1997; 90: 809-819.
22. Kamijo T, Zindy F, Roussel MF, Quelle DE, Downing JR, Ashmun RA et al. Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product p19ARF. Cell 1997; 91: 649-659.
23. Kashima L, Toyota M, Mita H, Suzuki H, Idogawa M, Ogi K et al. CHFR, a potential tumor suppressor, downregulates interleukin-8 through the inhibition of NF-kappaB. Oncogene 2009; 28: 2643-2653.
Kruse JP, Gu W. Modes of p53 regulation. Cell 2009; 137: 609-622.
Lane DP, Cheok CF, Lain S. p53-based cancer therapy. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2: a001222.
24. Levine AJ, Tomasini R, McKeon FD, Mak TW, Melino G. The p53 family: guardians of maternal reproduction. Nat Rev Mol Cell Biol 2011; 12: 259-265.
25. Lohrum MA, Vousden KH. Regulation and activation of p53 and its family members. Cell Death Differ 1999; 6: 1162-1168.
Lunghi P, Costanzo A, Mazzera L, Rizzoli V, Levrero M, Bonati A. The p53 family protein p73 provides new insights into cancer chemosensitivity and targeting. Clin Cancer Res 2009; 15: 6495-6502.
26. Machado-Silva A, Perrier S, Bourdon JC. p53 family members in cancer diagnosis and treatment. Semin Cancer Biol 2010; 20: 57-62.
27. Maruyama R, Aoki F, Toyota M, Sasaki Y, Akashi H, Mita H et al. Comparative genome analysis identifies the vitamin D receptor gene as a direct target of p53-mediated transcriptional activation. Cancer Res 2006; 66: 4574-4583.
28. Masumoto J, Taniguchi S, Ayukawa K, Sarvotham H, Kishino T, Niikawa N et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem 1999; 274: 33835-33838.
29. Menendez D, Inga A, Resnick MA. The expanding universe of p53 targets. Nat Rev Cancer 2009; 9: 724-737.
30. Moll UM, Riou G, Levine AJ. Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: mutation and nuclear exclusion. Proc Natl Acad Sci U S A 1992; 89: 7262-7266.
31. Muller M, Schleithoff ES, Stremmel W, Melino G, Krammer PH, Schilling T. One, two, three--p53, p63, p73 and chemosensitivity. Drug Resist Updat 2006; 9: 288-306.
32. Nemunaitis J, Swisher SG, Timmons T, Connors D, Mack M, Doerksen L et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in sequence with cisplatin to tumors of patients with non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 609-622.
33. Nunez G, Benedict MA, Hu Y, Inohara N. Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. Oncogene 1998; 17: 3237-3245.
34. Oda K, Arakawa H, Tanaka T, Matsuda K, Tanikawa C, Mori T et al. p53AIP1, a potential mediator of p53-dependent apoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53. Cell 2000; 102: 849-862.
35. Ogasawara Y, McCormack FX, Mason RJ, Voelker DR. Chimeras of surfactant proteins A and D identify the carbohydrate recognition domains as essential for phospholipid interaction. J Biol Chem 1994; 269: 29785-29792.
36. Ogi K, Toyota M, Mita H, Satoh A, Kashima L, Sasaki Y et al. Small interfering RNA-induced CHFR silencing sensitizes oral squamous cell cancer cells to microtubule inhibitors. Cancer Biol Ther 2005; 4: 773-780.
37. Ohtsuka T, Ryu H, Minamishima YA, Macip S, Sagara J, Nakayama KI et al. ASC is a Bax adaptor and regulates the p53-Bax mitochondrial apoptosis pathway. Nat Cell Biol 2004; 6: 121-128.
38. Oliner JD, Pietenpol JA, Thiagalingam S, Gyuris J, Kinzler KW, Vogelstein B. Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumour suppressor p53. Nature 1993; 362: 857-860.
39. Osada M, Ohba M, Kawahara C, Ishioka C, Kanamaru R, Katoh I et al. Cloning and functional analysis of human p51, which structurally and functionally resembles p53. Nat Med 1998; 4: 839-843.
40. Oshima Y, Sasaki Y, Negishi H, Idogawa M, Toyota M, Yamashita T et al. Antitumor effect of adenovirus-mediated p53 family gene transfer on osteosarcoma cell lines. Cancer Biol Ther 2007; 6: 1058-1066.
41. Pietsch EC, Sykes SM, McMahon SB, Murphy ME. The p53 family and programmed cell death. Oncogene 2008; 27: 6507-6521.
Ramachandran K, Miller H, Gordian E, Rocha-Lima C, Singal R. Methylation-mediated silencing of TMS1 in pancreatic cancer and its potential contribution to chemosensitivity. Anticancer Res; 30: 3919-3925.
42. Rikhof B, Corn PG, El-Deiry WS. Caspase 10 levels are increased following DNA damage in a p53-dependent manner. Cancer Biol Ther 2003; 2: 707-712.
43. Riley T, Sontag E, Chen P, Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9: 402-412.
44. Rossi M, De Laurenzi V, Munarriz E, Green DR, Liu YC, Vousden KH et al. The ubiquitin-protein ligase Itch regulates p73 stability. EMBO J 2005; 24: 836-848.
45. Roth JA, Nguyen D, Lawrence DD, Kemp BL, Carrasco CH, Ferson DZ et al. Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer. Nat Med 1996; 2: 985-991.
46. Sasaki Y, Ishida S, Morimoto I, Yamashita T, Kojima T, Kihara C et al. The p53 family member genes are involved in the Notch signal pathway. J Biol Chem 2002; 277: 719-724.
47. Sasaki Y, Morimoto I, Ishida S, Yamashita T, Imai K, Tokino T. Adenovirus-mediated transfer of the p53 family genes, p73 and p51/p63 induces cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cell lines: potential application to gene therapy of colorectal cancer. Gene Ther 2001; 8: 1401-1408.
48. Sasaki Y, Negishi H, Idogawa M, Suzuki H, Mita H, Toyota M et al. Histone deacetylase inhibitor FK228 enhances adenovirus-mediated p53 family gene therapy in cancer models. Mol Cancer Ther 2008; 7: 779-787.
49. Sasaki Y, Negishi H, Idogawa M, Yokota I, Koyama R, Kusano M et al. p53 negatively regulates the hepatoma growth factor HDGF. Cancer Res 2011; 71: 7038-7047.
50. Sasaki Y, Negishi H, Koyama R, Anbo N, Ohori K, Idogawa M et al. p53 family members regulate the expression of the apolipoprotein D gene. J Biol Chem 2009; 284: 872-883.
51. Scheffner M, Huibregtse JM, Vierstra RD, Howley PM. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell 1993; 75: 495-505.
52. Serber Z, Lai HC, Yang A, Ou HD, Sigal MS, Kelly AE et al. A C-terminal inhibitory domain controls the activity of p63 by an intramolecular mechanism. Mol Cell Biol 2002; 22: 8601-8611.
53. Smeenk L, van Heeringen SJ, Koeppel M, van Driel MA, Bartels SJ, Akkers RC et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Res 2008; 36: 3639-3654.
54. Stott FJ, Bates S, James MC, McConnell BB, Starborg M, Brookes S et al. The alternative product from the human CDKN2A locus, p14(ARF), participates in a regulatory feedback loop with p53 and MDM2. Embo J 1998; 17: 5001-5014.
55. Strano S, Dell'Orso S, Di Agostino S, Fontemaggi G, Sacchi A, Blandino G. Mutant p53: an oncogenic transcription factor. Oncogene 2007; 26: 2212-2219.
56. Suzuki H, Takatsuka S, Akashi H, Yamamoto E, Nojima M, Maruyama R et al. Genome-wide Profiling of Chromatin Signatures Reveals Epigenetic Regulation of MicroRNA Genes in Colorectal Cancer. Cancer Res; 71: 5646-5658.
57. Swisher SG, Roth JA, Nemunaitis J, Lawrence DD, Kemp BL, Carrasco CH et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanced non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 763-771.
58. Thanos CD, Bowie JU. p53 Family members p63 and p73 are SAM domain-containing proteins. Protein Sci 1999; 8: 1708-1710.
59. Tibbetts MD, Zheng L, Lenardo MJ. The death effector domain protein family: regulators of cellular homeostasis. Nat Immunol 2003; 4: 404-409.
60. Tsuchiya N, Izumiya M, Ogata-Kawata H, Okamoto K, Fujiwara Y, Nakai M et al. Tumor suppressor miR-22 determines p53-dependent cellular fate through post-transcriptional regulation of p21. Cancer Res; 71: 4628-4639.
61. Vinyals A, Peinado MA, Gonzalez-Garrigues M, Monzo M, Bonfil RD, Fabra A. Failure of wild-type p53 gene therapy in human cancer cells expressing a mutant p53 protein. Gene Ther 1999; 6: 22-33.
62. Virmani A, Rathi A, Sugio K, Sathyanarayana UG, Toyooka S, Kischel FC et al. Aberrant methylation of TMS1 in small cell, non small cell lung cancer and breast cancer. Int J Cancer 2003; 106: 198-204.
63. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Surfing the p53 network. Nature 2000; 408: 307-310.
64. Vousden KH, Lu X. Live or let die: the cell's response to p53. Nat Rev Cancer 2002; 2: 594-604.
65. Waldman T, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B. Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature 1996; 381: 713-716.
66. Waldman T, Zhang Y, Dillehay L, Yu J, Kinzler K, Vogelstein B et al. Cell-cycle arrest versus cell death in cancer therapy. Nat Med 1997; 3: 1034-1036.
67. Xu J, Reumers J, Couceiro JR, De Smet F, Gallardo R, Rudyak S et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol; 7: 285-295.
68. Yang A, Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming MD, Dotsch V et al. p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol Cell 1998; 2: 305-316.
69. Yang A, McKeon F. P63 and P73: P53 mimics, menaces and more. Nat Rev Mol Cell Biol 2000; 1: 199-207.
70. Ying H, Chang DL, Zheng H, McKeon F, Xiao ZX. DNA-binding and transactivation activities are essential for TAp63 protein degradation. Mol Cell Biol 2005; 25: 6154-6164.
71. Zhang Y, Liu T, Meyer CA, Eeckhoute J, Johnson DS, Bernstein BE et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol 2008; 9: R137.
　以上に述べたとおり、本発明のｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子および／またはキメラタンパク質を含む遺伝子発現誘導剤などによって、腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、ｐ５３遺伝子治療を改善する医薬などの提供を可能とする。

Claims (16)

  1. 　ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、ｐ５３ＡＩＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＫＣＮＫ３およびＰＹＣＡＲＤからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現誘導剤。
  2. 　キメラタンパク質が、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む転写活性化ドメイン、配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＤＮＡ結合ドメイン、および配列番号１９８のアミノ酸配列を含むオリゴマー化ドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子発現誘導剤。
  3. 　キメラタンパク質が核移行シグナルまたはその部分配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子発現誘導剤。
  4. 　キメラタンパク質が、配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子発現誘導剤。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、アポトーシス誘導剤。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子発現誘導剤を含む、医薬組成物。
  7. 　細胞増殖性疾患の処置のための、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス関連遺伝子の発現誘導方法。
  9. 　ｐ６３由来の転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含むＮ末端側領域と、ｐ５３由来のオリゴマー化ドメインを含むＣ末端側領域とを含むキメラタンパク質もしくはその機能的変異体、および／または、前記キメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
  10. 　ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および／または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、アポトーシス誘導剤。
  11. 　ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む、細胞増殖性疾患の処置のための医薬組成物。
  12. 　ＫＣＮＫ３タンパク質および／もしくはその機能的変異体、および/または、前記タンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子を、in vitroまたはex vivoで細胞に投与すること含む、アポトーシス誘導方法。
  13. 　配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５４、１５６、１５８および１６０のいずれかのアミノ酸配列を含む、キメラタンパク質もしくはその機能的変異体。
  14. 　請求項１３に記載のキメラタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸分子。
  15. 　請求項１４に記載の核酸分子を含む核酸構築物またはベクター。
  16. 　請求項１４に記載の核酸分子、および／または、請求項１５に記載の核酸構築物および／またはベクターを含む組成物。
PCT/JP2013/072744 2012-08-27 2013-08-26 ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用 WO2014034609A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012187062A JP2015226468A (ja) 2012-08-27 2012-08-27 ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用
JP2012-187062 2012-08-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014034609A1 true WO2014034609A1 (ja) 2014-03-06

Family

ID=50183421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/072744 WO2014034609A1 (ja) 2012-08-27 2013-08-26 ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2015226468A (ja)
WO (1) WO2014034609A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000354488A (ja) * 1999-04-09 2000-12-26 Yoji Igawa ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパク

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000354488A (ja) * 1999-04-09 2000-12-26 Yoji Igawa ｐ５３ファミリーのキメラ遺伝子及びキメラタンパク

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASHIMOTO S ET AL.: "Role of p53 in human chondrocyte apoptosis in response to shear strain", ARTHRITIS RHEUM., vol. 60, 2009, pages 2340 - 2349 *
LIU C ET AL.: "Protective effects of TASK-3 (KCNK9) and related 2P K channels during cellular stress", BRAIN RES., vol. 1031, 2005, pages 164 - 173 *
OHTSUKA T ET AL.: "ASC is a Bax adaptor and regulates the p53-Bax mitochondrial apoptosis pathway", NAT CELL BIOL., vol. 6, 2004, pages 121 - 128 *
RIKHOF B ET AL.: "Caspase 10 levels are increased following DNA damage in a p53- dependent manner", CANCER BIOL THER., vol. 2, 2003, pages 707 - 712 *
SASAKI Y ET AL.: "A novel approach to cancer treatment using structural hybrids of the p53 gene family", CANCER GENE THER., vol. 19, November 2012 (2012-11-01), pages 749 - 756 *
YUICHIRO OSHIMA ET AL.: "p53/p63 Chimera Idenshi o Mochiita Kotsunikushu ni Taisuru Idenshi Chiryo no Kisoteki Kenkyu", J JPN ORTHOP ASSOC., vol. 80, 2006, pages 948 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015226468A (ja) 2015-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. The BET family in immunity and disease
Tang et al. The proto-oncogene tyrosine protein kinase Src is essential for macrophage-myofibroblast transition during renal scarring
Hao et al. LncRNA-Safe contributes to cardiac fibrosis through Safe-Sfrp2-HuR complex in mouse myocardial infarction
US9662314B2 (en) Compounds and methods for the treatment of muscular disease, and related screening methods
Tang et al. LncRNA GAS5 regulates vascular smooth muscle cell cycle arrest and apoptosis via p53 pathway
WO2020081556A2 (en) Non-canonical swi/snf complex and uses thereof
WO2015005473A1 (ja) がんの治療への応答性を予測する方法
Saifudeen et al. A role for p53 in terminal epithelial cell differentiation
Brocardo et al. Adenomatous polyposis coli protein regulates the cellular response to DNA replication stress
Wang et al. LncRNA SNHG7 promotes cardiac remodeling by upregulating ROCK1 via sponging miR-34-5p
JP2000516207A (ja) Ｐ５３媒介抑制への感受性を増強させるためのｄｎａ修復のダウンレギュレーション
JP2009114103A (ja) 抗癌剤耐性癌において抗癌剤増強作用を有する癌細胞死誘導剤
Yamamoto et al. Cancer-related genes and ALS
JP7211936B2 (ja) 細胞死のバイオマーカー
US11116851B2 (en) Anti-cancer and anti-inflammatory therapeutics and methods thereof
Zhan et al. LncRNA-6395 promotes myocardial ischemia-reperfusion injury in mice through increasing p53 pathway
Yu et al. LncRNA PEG11as aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury after ischemic stroke through miR-342-5p/PFN1 axis
WO2014034609A1 (ja) ｐ５３ファミリーキメラ分子およびその使用
Zhang et al. The long non-coding RNA SNHG12 functions as a competing endogenous RNA to modulate the progression of cerebral Ischemia/Reperfusion injury
Sasaki et al. A novel approach to cancer treatment using structural hybrids of the p53 gene family
WO2019180664A1 (en) Method for preventing or modulating fibrosis and fibrotic response associated with the integrated stress response
JP5630769B2 (ja) アポトーシス誘導剤
CA2523517C (en) Bcl2l12 polypeptide activators and inhibitors
JP2021520845A (ja) マイクロペプチドとその使用
US20120015374A1 (en) Enigma-mdm2 interaction and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13833898

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13833898

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP